JP2004532978A - 受容体活性を検出する自動化された方法 - Google Patents
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Abstract
インビトロおよびインビボでのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性を検出する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供するステップを含む。複数の複合タンパク質の各々は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成される。複数の複合タンパク質は、少なくとも１個の細胞の細胞質内に実質的に均等に分布される。少なくとも１個の細胞の第一の画像は、検出可能な分子から放出されるエネルギーの量を検出し、エネルギーの量に対応する値を保存することによって得られる。少なくとも１個の細胞を、アゴニストで処理する。少なくとも１個の細胞の第二の画像を得る。第一の画像および第二の画像を比較し、エンドサイトーシス小胞および／またはエンドソームにおける複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出する。
Description
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府に支援された研究開発についての主張］
本研究は、米国国立衛生研究所により授与された交付番号第HL61365号の下に米国政府によって支援された。米国政府は、本発明に所定の権利を有しうる。
【０００２】
本発明は、インビトロおよびインビボでのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性を検出する方法に関する。本発明は、ＧＰＣＲ調節経路を活性化する化合物を同定する方法、およびＧＰＣＲのリガンドを同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモンまたはリガンドの結合を細胞内シグナルに変換する細胞表面タンパク質である。ＧＰＣＲは、全ての動物、昆虫、および植物で見られる。ＧＰＣＲシグナル伝達は、光伝達と、嗅覚と、神経伝達と、血管緊張と、心拍出と、消化と、痛みと、体液および電解質の平衡化とを含む種々の生理学的機能を調節する上できわめて重要な役割を果たす。それらは、種々の生理学的機能に関与するが、ＧＰＣＲは、多数の共通構造特性を共有する。それらは、交互に細胞内および細胞外ループによって架橋される７つの膜ドメインと、可変長の細胞内カルボキシル末端尾部とを含む。
【０００４】
ＧＰＣＲによって制御される生理学的反応の規模は、ＧＰＣＲシグナル伝達とシグナル終結との間の平衡に関連する。ＧＰＣＲのシグナル伝達は、アレスチンと呼ばれる細胞内タンパク質のファミリーによって制御される。アレスチンは、活性化ＧＰＣＲ（アゴニストで活性化されたもの、および特にＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化されたものを含む）に結合する。
【０００５】
ＧＰＣＲを含む受容体は、リガンド、ホルモン、および高い特異性を有する医薬品に結合するので、歴史的に、医薬品の発見および薬剤の標的であった。今日使用されている医薬のほぼ５０パーセントは、ＧＰＣＲを標的とする、またはＧＰＣＲと直接相互作用する。例えば、Jurgen Drews(2000年)「医薬品発見：歴史的予測(Drug Discovery:A Historical Perspective)」、Science 287巻:1960-1964頁参照。
【０００６】
数百のヒトＧＰＣＲしか知られていないが、数千のＧＰＣＲが、ヒトゲノムに存在すると推定されている。これらの公知ＧＰＣＲのうちの多くは、機能またはリガンドと関連づけられていないオーファン受容体である。
【０００７】
共にBarakらに対する米国特許第5,891,646号および第6,110,693号で開示されるようなＧＰＣＲ活性を解析する１つの方法は、ＧＰＣＲを発現する細胞と、アレスチンおよび検出可能な分子の複合体(conjugate)とを使用する。
【０００８】
したがって、正確で、解釈するのが容易であるＧタンパク質共役型受容体の活性を検出する方法を提供する必要性がある。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の１つの態様によると、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法が提供される。本方法は、ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供するステップを含む。前記複数の複合タンパク質の各々は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成される。前記複数の複合タンパク質は、前記少なくとも１個の細胞の細胞質内に実質的に均等に分布される。前記少なくとも１個の細胞の第一の画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの量を検出し、該エネルギーの量に対応する値を保存することによって得られる。前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理する。前記少なくとも１個の細胞の第二の画像を得る。前記第一の画像および前記第二の画像を比較し、前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出する。局在は、エンドサイトーシス小胞および／またはエンドソームで起こりうる。
【００１０】
本発明の別の態様によると、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法が提供され、ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質が提供される。前記複数の複合タンパク質の各々は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成される。前記複数の複合タンパク質は、前記少なくとも１個の細胞の細胞質中に実質的に均等に分布される。前記少なくとも１個の細胞の第一のデジタル画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって得られる。該第一のデジタル画像は、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成される。それぞれの強度値は、該配列での画素の位置に対応した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づく。前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理する。前記少なくとも１個の細胞の第二のデジタル画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって得られる。該第二のデジタル画像は、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成される。それぞれの強度値は、該配列での画素の位置に対応した検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づく。前記第一のデジタル画像および前記第二のデジタル画像を比較し、前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出する。局在は、エンドサイトーシス小胞および／またはエンドソームで起こりうる。前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在は、検出可能な分子から放出されるエネルギーの見掛けの強度の変化であって、前記複数の画素の少なくともいくつかの値を増加させる変化によって検出される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様によると、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法が提供される。ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供する。前記複数の複合タンパク質の各々は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成される。前記複数の複合タンパク質は、前記少なくとも１個の細胞の細胞質中に実質的に均等に分布される。前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理する。前記少なくとも１個の細胞のデジタル画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって得られる。該デジタル画像は、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成される。それぞれの強度値は、該配列中の画素の位置に対応した検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づく。前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在は、エンドサイトーシス小胞および／またはエンドソームで検出されうる。前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在は、検出可能な分子から放出されるエネルギーの見掛けの強度における変化であって、閾値強度より大きい値を有する前記複数の画素の少なくともいくつかが生じる変化によって検出される。
【００１２】
本明細書に使用される場合、語句「含む」または「含むこと」は、開示された特徴、ステップ、または構成要素の存在を特定するために使用されるが、１つまたはそれ以上の他の特徴、ステップ、構成要素、またはそれらの群の存在または追加を排除しないことを重要視すべきである。
【００１３】
本発明の目的および利点は、図面と共に以下に詳述される説明を読むことによって理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ＧＰＣＲ経路の活性を検出する自動化されたスクリーニング方法が提供される。本方法は、ＧＰＣＲ経路のレベルが変化したかどうかを測定するために使用することができる。本方法は、ＧＰＣＲ活性について化合物および／または溶液をスクリーニングする、都合がよく、現実的な時間で、高容積の方法を提供する。
【００１５】
本方法は、試験化合物の活性を迅速で簡単に測定するために、試験化合物にさらした前後における細胞の走査の相対的な強度の全般的な比較を提供する利益を提供する。試験化合物の例としては、リガンドである可能性があるもの、アゴニストである可能性があるもの、アンタゴニストである可能性があるもの、および脱感作剤である可能性があるものが挙げられる。本方法は、検出可能な分子の位置、および特定の特異的な細胞構造に対する検出可能な分子の接近に関して画像の定性的な分析を必要としない。本方法は、特定の細胞構造の領域の決定、または細胞核内のいかなる測定をも必要としない。本方法によると、自動化された工程による化合物の迅速なスクリーニングが促進される。
【００１６】
特に限定されるものではないが、本方法を使用しうる分析の例として、米国特許第5,891,646号および第6,110,693号、および2001年11月5日に出願された米国特許出願第09/993,844号で開示されるものが挙げられる。それらの開示は、それらの全体を参照して本明細書に組み込まれる。特に限定されるものではないが、本方法を使用できる分析の別の例として、蛍光共鳴エネルギー交換（ＦＲＥＴ）を使用する分析、およびAngers,S.、Salahpour,A.、Joly,E.、Hilairet,S.、Chelsky、「生物発光共鳴エネルギー変換（ＢＲＥＴ）を使用した生きた細胞でのβ２−アドレナリン作動性受容体二量体化(β2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence resonance energy transfer (BRET))」、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 97年、7巻:3684-3689頁に開示される生物発光共鳴エネルギー交換（ＢＲＥＴ）技術を使用する分析が挙げられる。
【００１７】
脱感作と称される工程により、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）は、例えば、カルボキシル末端尾部で、ＧＰＣＲの細胞内ドメインをリン酸化する。多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端尾部は、第７の膜間ドメインの末端の印となる、保存されたＮＰＸＸＹ部分の直後に始まる（すなわち、ＮＰＸＸＹ部分に続くものが、ＧＰＣＲのカルボキシル末端尾部である）。カルボキシル末端尾部は、比較的長い（およそ十から百個までのアミノ酸）、比較的短い（およそ十個のアミノ酸）、または実質的に存在しない（およそ十個未満のアミノ酸）でありうる。本明細書において使用される場合、「カルボキシル末端尾部」は、３つの変異体全て（比較的長い、比較的短い、または実質的に存在しないのいずれか）を意味するべきである。
【００１８】
リン酸化の後、アレスチンタンパク質は、ＧＲＫリン酸化受容体と会合し、受容体をそれと共役したＧタンパク質から分離させる。特に限定されるものではないが、語句「アレスチン」は、アレスチンの天然の変異体および操作された変異体の全てのタイプを指し、視覚アレスチン(visual arrestin)（しばしば、アレスチン１と称される）、β−アレスチン１（しばしば、アレスチン２と称される）、およびβ−アレスチン２（しばしば、アレスチン３と称される）を含むことが分かる。リン酸化ＧＰＣＲとアレスチンの相互作用は、ＧＰＣＲシグナル伝達を終結し、シグナル伝達をしない脱感作受容体を生じる。
【００１９】
脱感作ＧＰＣＲに結合したアレスチンは、エンドサイトーシスのためのクラスリン被覆小窩に対してＧＰＣＲを標的化する。ＧＰＣＲとアレスチンの相互作用の安定性により、ＧＰＣＲの脱リン酸化、再利用および再感作の速度が決定されうる。ＧＰＣＲが、アレスチンに対して増強された親和性を有すると、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体は、無傷の状態となり、エンドソームに内在化される。
【００２０】
ＧＰＣＲ活性を監視するために、インビボまたはインビトロの環境を利用できる。どちらの環境でも、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を利用する。語句「検出可能な分子」は、特に限定されるものではないが、蛍光、リン発光、および生物発光および放射性崩壊を含む、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、放射性、および光学的手段により検出することができるあらゆる分子を意味する。特に限定されるものではないが、検出可能な分子として、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ロダミン複合抗体等が挙げられる。検出可能な分子として、放射性アイソトープ、エピトープタグ、親和性標識、酵素、発光基、化学発光基等が挙げられる。検出可能な分子として、他の分子との相互作用する作用として直接的または間接的に検出される分子が挙げられる。
【００２１】
ＧＦＰとして、自然の起源から単離できる、または遺伝子操作されうる種々の自然に存在する形態のＧＦＰ、および人工的に改変されたＧＦＰが挙げられる。ＧＦＰは当分野で既知である。例えば、米国特許第5,625,048号、第5,777,079号、および第6,066,476号参照。ＧＦＰは、自然の源から単離された、または遺伝子操作された他の蛍光タンパク質と容易に相互交換でき、特に限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、紫外線励起性蛍光タンパク質、またはその間の任意の波長のものを含むことは当分野では十分に知られている。
【００２２】
試験化合物、試験溶液および試験条件に細胞をさらした後に、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体の位置の変化を検出するように本方法を設計する。
【００２３】
インビボでの環境では、ＧＰＣＲを発現し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を含有する１個またはそれ以上の細胞を供する。検出可能な分子に結合したアレスチンを検出および監視することができる。アレスチンの位置は、例えば、細胞質中に均等に分布、細胞膜に集中、および／またはエンドサイトーシス小胞中に局在したものを、検出することができる。アゴニストによる刺激に対する反応では、アレスチンのＧＰＣＲに対する接近、および他のあらゆる細胞構造に対する接近を監視することができる。例えば、アゴニスト刺激に対する反応では、アレスチンを、細胞膜のＧＰＣＲの近傍で、および／またはエンドサイトーシス小胞中でＧＰＣＲと共局在したものを検出することができる。
【００２４】
インビトロの環境では、アレスチン結合部位およびアゴニスト結合部位を有する１個またはそれ以上のＧＰＣＲをその上に設けられている基質を供し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との１つまたはそれ以上の複合体を含有する緩衝溶液を供する。ＧＰＣＲは、アレスチン結合部位がアレスチンにさらされ、アゴニスト結合部位がアゴニストに接近可能なように、基質上に配置されうる。ＧＰＣＲおよびアレスチンは、全細胞から得ることができ、精製後、インビトロにおける分析で使用することができる。ＧＰＣＲは、アレスチン結合部位およびアゴニスト結合部位を有し、多層または二層の脂質小胞中に支持されうる。ＧＰＣＲを支持する小胞を基質上に設け、アレスチン結合部位がアレスチンにさらされ、受容体結合部位がアゴニストに接近可能なように、ＧＰＣＲを脂質小胞で支持し、基質上に設ける。その基質は、改変ＧＰＣＲを設けることができる任意の人工基質でよく、特に限定されるものではないが、ガラス、プラスチック、ダイアモンド、セラミックス、半導体、シリカ、光ファイバー、生物適合性モノマー、生物適合性重合体、重合体ビーズ（有機および無機重合体を含む）等が含まれる。
【００２５】
アレスチンの位置を、インビトロの環境で検出および監視できる。アゴニストによる刺激に対する反応では、アレスチンの再局在化を検出できる。例えば、アゴニストによる刺激に対する反応では、アレスチンは、基質上のＧＰＣＲの近傍で検出され得て、アレスチンは、区分化することが検出できるなどである。
【００２６】
［ＧＰＣＲ］
本方法は、アゴニストの結合がアレスチンタンパク質の会合に関連する、任意の膜受容体タンパク質を用いて利用することができる。本発明に使用しうる既知のＧＰＣＲの、例示であって、限定的なものではないリストが、表１に含まれる。構造の類似性およびリガンドに基づいて、受容体を古典的区分に従って分類する。本発明に使用できるＧＰＣＲとしては、公知のＧＰＣＲ、未知またはオーファンＧＰＣＲ、およびキメラまたは改変ＧＰＣＲが挙げられる。ＧＰＣＲは、機能および／またはリガンドが未知である場合、「未知またはオーファンＧＰＣＲ」であると考えられる。改変ＧＰＣＲとして、カルボキシル末端尾部に１つまたはそれ以上の改変、細胞内ループ中および／または膜間領域の細胞質末端での、好ましくはカルボキシル末端尾部での改変を有するＧＰＣＲが挙げられる。
【００２７】
例として、公知の受容体についての３つの主要なＧＰＣＲのクラスを同定した。クラスＡ受容体、クラスＢ受容体、およびカルボキシル末端尾部が実質的には存在しない受容体。受容体は、ＨＥＫ−２９３細胞におけるラットβアレスチン２との相互作用および親和性に基づいて、クラス分けされ、カルボキシル末端尾部のアミノ酸残基およびカルボキシル末端尾部の長さに基づいて推定することができる。クラスＢ受容体は、米国特許第5,891,646号、およびOakleyらの「Ｇタンパク質共役型受容体についての視覚アレスチン、βアレスチン１、およびβアレスチン２の異なる親和性が、２つの主要なクラスの受容体を明確に描写する(Differential Affinities of Visual Arrestin, sArrestin1, and sArrestin2 for G Protein-coupled Receptors Delineate Two Major Classes of Receptors)」、Journal of Biological Chemistry、275巻22号、17201-17210頁、2000年6月2日（これらの内容は、全体を参照して本明細書に組み込まれる。）に開示されるような条件下で、ＨＥＫ−２９３細胞においてラットβアレスチン２をエンドソームに引き寄せるようにカルボキシル末端尾部に適切に配置された、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊（クラスター）を有するＧＰＣＲである。クラスＡ受容体は、クラスＢ受容体について上で記述された条件下で、ＨＥＫ−２９３細胞においてラットβアレスチン２をエンドソームに引き寄せないようにカルボキシル末端尾部に適切に配置された、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊を有しないＧＰＣＲである。カルボキシル末端尾部が実質的に存在しない受容体としては、例えば、嗅覚および味覚受容体が挙げられる。
【００２８】
表２は、公知の受容体の、例示であって、限定的なものではないリストであってそれらのカルボキシル末端尾部のアミノ酸配列と適切な分類を含む。クラスＢ受容体の例については、リン酸化部位の塊として機能しうる残基は、太字イタリック体で示される。
【００２９】
本発明では、改変ＧＰＣＲが好ましい。改変ＧＰＣＲとして、そのカルボキシル末端尾部に適切に配置された１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊を有するＧＰＣＲが挙げられる。リン酸化部位のこれらの塊は、好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端尾部に配置されるセリンおよびトレオニン残基である。これらの塊は、カルボキシル末端尾部ドメイン内でそれらの位置に顕著に保存され、アゴニスト依存的なリン酸化の一次部位として働く。アミノ酸の塊は、２つの内の２つ、３つの内の２つ、３つの内の３つ、４つの内の３つ、４つの内の４つ、５つの内の４つ、５つの内の５つ等の連続なアミノ酸の位置を占有しうる。したがって、安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するアミノ酸の塊は、「リン酸化部位の塊」である。
【００３０】
カルボキシル末端尾部に適切に配置された１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊を含む改変ＧＰＣＲは、アレスチンについて増大した親和性を有し、アゴニストによる刺激の後、エンドソーム内のアレスチンと共局在する。これらの改変ＧＰＣＲは、アゴニストによる刺激の後およそ３０分以内にアレスチンをエンドソームに引き寄せる。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸部位の塊は、アレスチンについて増大された親和性を有するために、ＧＰＣＲについてのＧＰＣＲ尾部内に適切に配置されなければならない。
【００３１】
改変ＧＰＣＲは、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊が、カルボキシル末端尾部内に適切に配置されるように構築されうる。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊が、適切にカルボキシル末端尾部内に正確に配置されるように、共に融合して、改変ＧＰＣＲを形成するものであるポリペプチド部分を選択する。替わりの方法では、改変ＧＰＣＲを作成するために、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊が、カルボキシル末端尾部内に適切に配置されるように、個々の点突然変異の位置を選択することもできる。
【００３２】
［細胞］
特に限定されるものではないが、本発明に有用な細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および動物細胞を含む真核生物および原核生物の細胞が挙げられる。特に限定されるものではないが、適切な動物細胞としては、HEK細胞、HeLa細胞、COS細胞、U208細胞、および種々の原始哺乳類細胞が挙げられる。組織の全体に、または特定の臓器または組織型内で、アレスチンと検出可能な分子の複合体を発現する動物モデルは、公知または未知のＧＰＣＲリガンドの細胞の標的を研究する上で有用である可能性がある。
【００３３】
本発明に有用な細胞としては、公知のＧＰＣＲ、公知のＧＰＣＲの変異体、未知のＧＰＣＲ、未知のＧＰＣＲの変異体、改変ＧＰＣＲ、改変ＧＰＣＲの変異体、およびそれらの組合せを発現するものが挙げられる。ＧＰＣＲを発現する細胞は、その細胞膜内に機能的な受容体としてＧＰＣＲを含むものである。その細胞は、ＧＰＣＲを自然に発現できてもよく、またはＧＰＣＲを発現するために遺伝子操作されていてもよい。当業者は、遺伝子操作の分野で標準的な分子生物学的技術によって、ＧＰＣＲを発現するために、細胞を遺伝子操作することができることを容易に理解する。
【００３４】
［複合体］
本発明の方法で、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を利用する。
【００３５】
特に限定されるものではないが、視覚アレスチン、βアレスチン１およびβアレスチン２を含む、自然に生じる変異体および遺伝子操作された変異体の両方の全ての形態のアレスチンを、本発明に使用しうる。カルボキシル末端尾部に増強された親和性部分を有する本発明のＧＰＣＲ（自然に生じるものおよび改変されたもの）は、検出可能なレベルまで、全ての形態のアレスチンと相互作用しうる。
【００３６】
特に限定されるものではないが、アレスチンと複合化させるために使用されうる検出可能な分子として、分光学的、光化学的、放射性、生化学的、免疫化学的、電気的、および光学的手段（特に限定されるものではないが、生物発光、リン光、および蛍光を含む）によって検出可能である分子が挙げられる。これらの検出可能な分子は、生物学的に適合した分子であるべきであり、ＧＰＣＲ系と相互作用するアレスチンの能力を傷つけるべきでない。また、ＧＰＣＲ系とのアレスチンの相互作用は、検出されるべき検出可能な分子の能力を損なうべきでない。好ましい検出可能な分子は、光学的に検出可能な分子であり、化学的に、機械的に、電気的に、または放射活性的に励起され、蛍光、リン光、または生物発光を放出しうるような光学的に検出可能なタンパク質を含む。光学的に検出可能な分子として、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ホタル・ルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、フルオレセイン、テキサス・レッド、およびロダミン複合抗体が挙げられる。さらに好ましい検出可能な分子は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む蛍光タンパク質のような生得的な蛍光分子である。
【００３７】
検出可能な分子は、Barakら(米国特許第5,891,646号および第6,110,693号)に記述される方法によってアレスチンタンパク質と複合化しうる。検出可能な分子は、前末端で、後末端で、または中間の点で、アレスチンと複合化しうる。好ましくは、検出可能な分子は、細胞内で合成されることのできる分子である。アレスチンと検出可能な分子との複合体が、細胞内で産生されるように、細胞を、ＤＮＡに形質導入できる。当業者が容易に理解するように、細胞は、遺伝子操作の分野で標準的な分子生物学的技術によって、アレスチンと検出可能な分子との複合体を発現するために、遺伝子操作されうる。
【００３８】
［検出の方法］
検出の方法は、アレスチンタンパク質と複合化した検出可能な分子の分布および／または位置を決定するために使用されうる。したがって、検出の方法は、使用される検出可能な分子または複数分子によって変化しうる。検出の方法は、アレスチンタンパク質の細胞内の位置、またはＧＰＣＲとのアレスチンタンパク質の相互作用、例えば、細胞膜でのアレスチンの濃度、またはエンドサイトーシス小胞でのＧＰＣＲとのアレスチンの共局在を決定するために使用されうる。当業者は、使用される検出可能な（複数の）分子に適切な検出方法を容易に修正できる。
【００３９】
検出可能な分子は、使用される検出可能な分子によって、エネルギーを放出し、反射し、および／または吸収する。明瞭にする目的のために、語句「放出」を本明細書に使用するが、特に指定されない限り、「反射」および「吸収」を含むと解釈されるべきである。使用される検出器および検出方法は、放出されるエネルギーの型を識別および記録するのに適しているべきである。利用される検出器は、例えば、単独光検出器または電荷結合素子列(charge-coupled device array)を用いて、一連で、または平行して、逐一、細胞の画像を写しうる。検出器のこのような構成は、当分野に公知である。
【００４０】
検出方法は、検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度を測定するための検出器を含んでもよく、検出器の操作を制御し、受けたシグナルの分析を行うコンピュータ制御装置に有効に結合されうる。制御装置は、好ましくは、検出器から受けたシグナルの分析を行うコンピュータプログラム製品を含む。コンピュータプログラム製品は、検出方法で使用するために特に書き込まれうるか、または検出方法で使用するために、改良した商業的に入手可能なプログラムでありうる。
【００４１】
光学的に検出可能な分子については、蛍光、生物発光、またはリン光が、測定および記録されうるあらゆる光学的方法を使用しうる。例えば、蛍光を測定するための１つまたはそれ以上の光検出器を使用することができ、これらの光検出器は、コンピュータ制御装置に有効に結合されうる。電荷結合素子列も使用することができ、コンピュータ制御装置に有効に結合されうる。
【００４２】
好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰと複合化させることができ、アレスチン−ＧＦＰ複合体は、共焦点顕微鏡によって観察されることができる。
【００４３】
［ＧＰＣＲ経路の活性を検出する自動化された方法］
図１は、本発明の１つの態様により受容体活性を検出する方法の流れ図である。アゴニストである可能性があるもので処理する前に、検出可能な分子に結合したアレスチンは、細胞質中に均等に分布してものとして検出されうる。検出可能な分子は、エネルギーを放出し、それにより第一の画像を作成しうる。細胞を、利用される検出方法によって走査し、細胞の画像を作成する。アゴニストを用いた処理前の細胞の画像は、検出可能な分子が細胞質中に平等に、均質に分布されることを示す。
【００４４】
検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度を測定し、デジタルフォーマットに変換し、画素として表すことができる。例えば、その画像は、各画素の位置および強度によって描くことができる。所定の強度での画素を定量でき、画素についての平均強度を計算できる。デジタル画像を、ビデオ画面で再表示することができる。
【００４５】
試験化合物で処理した後、さらに、細胞を、利用される検出方法によって走査し、その細胞の第二の画像を作成する。細胞の第二の画像を、デジタル画像に変化し、前と同様に分析できる。
【００４６】
エンドサイトーシス小胞に局在する検出可能な分子から放出される強力なエネルギーによって、検出器が飽和するのを防止するために、検出器の感度を減少させることが有益な場合がある。認識することができるように、検出器の感度は、多数の方法で減少させることができ、例えば、検出器でエネルギーを阻害するフィルターを使用すること、または検出器に関連する増幅率を減少させることでできる。
【００４７】
試験化合物がアゴニストである場合、それにより検出可能な分子は、細胞質の全領域中に均等に分布される代わりに、特定の小さな領域に集中しうる。試験化合物がアゴニストでない場合、それにより検出可能な分子の分布は、実質的に変化しない。
【００４８】
例えば、アゴニストで細胞を処理した後、アレスチンは、細胞膜のＧＰＣＲの近傍で検出でき、および／またはエンドサイトーシス小胞でＧＰＣＲと共局在しうる。検出可能な分子は、小さな領域に集中しうるので、検出可能な分子から得られるエネルギーは集中し、著しく増加した強度のものになる。強度の見掛けの増加は、検出可能な分子の小さな領域への再局在によるものであり、各検出可能な分子により産生されるエネルギーの強度の本質的な変化によるものではない。
【００４９】
小胞に集中する検出可能な分子から得られるエネルギーは、ＧＰＣＲ経路の活性化を容易に示すために使用されうる。したがって、これらの濃度の検出可能な分子の陽性で、容易な同定が望ましい。上に説明されるとおり、細胞質に均等に分布される検出可能な分子は、均質な希釈エネルギーの放出を示す。対して、エンドサイトーシス小胞に集中する検出可能な分子は、いっそう強いエネルギーの放出を示す。
【００５０】
図２は、本発明の別の態様により受容体活性を検出する方法の流れ図である。細胞質に均等に分布される検出可能な分子から得られるエネルギーの放出に基づいて、平均強度を得ることができ、この平均強度から、閾値強度を設定できる。閾値強度は、細胞質中に均等に分布される検出可能な分子から得られるエネルギーの放出（すなわち、バックグランド放出）を排除するが、しかし例えばエンドサイトーシス小胞に共局在する検出可能な分子から得られるエネルギーの放出（すなわち、標的となる放出）は排除しないように設定されうる。例えば、閾値強度は、対照細胞（すなわち、アゴニストで処理されない細胞）における全エネルギーの放出の平均強度に、例えば、標準偏差の２倍（９５パーセンタイル(percentile)）または標準偏差の３倍（＞９９パーセンタイル）のような決められた数の標準偏差を足したものでありうる。閾値強度を決定する方法は、閾値が、できるだけ多くの標的放出の検出を可能にする一方で、できるだけ多くのバックグランドの放出を排除するように設定される限り制限されない。
【００５１】
試験化合物で処理される細胞の群よりむしろ、対照群の細胞の第一の画像を取ることができることを強調すべきである。例えば、特定の細胞株が、どのくらいの量の複合タンパク質を発現するかが決定されると、この情報は、その細胞株についての平均強度を決定するために使用することができる。その細胞株についての平均強度は、続く実験での閾値強度を設定するために使用することができる。
【００５２】
閾値強度を設定した後、閾値強度より大きいエネルギーの放出を識別し、定量することができる。識別されたエネルギーの放出は、コンピュータメモリーを用いてタグ付けされる、または識別されたエネルギーの放出は、関連した画素を、特徴的な色、例えば、マゼンタに変化させることによって、コンピュータにより作成される画像で区別することができる。コンピュータにより作成された画像は、閾値強度の、またはそれより大きいエネルギーの放出を有するその画像の部分を識別（例えば、マゼンタによって）した後、ビデオ画面上に再表示することができる。
【００５３】
閾値強度の、またはそれより大きいエネルギーの放出に対応する画素は、画素の総数に対する割合として、または好ましくは閾値強度より大きい画素の重み付けした合計として、絶対数（すなわち、それらは計数されうる）によって定量されることができる。重み付けは、多様な方法で付与されうる。例えば、閾値強度より上の各画素は、それのそれぞれの強度値によって重み付けされうる。閾値強度より大きいエネルギーの放出の数は、ＧＰＣＲが活性化されたかどうか、およびどの程度活性化されたかを決定するために使用することができる。例えば、閾値より大きい大量のエネルギーの放出は、活性化を示しうる。閾値強度より大きいエネルギーの放出の数は、ＧＰＣＲが不活化されたかどうか、およびどの程度不活化されたかを決定するためにも使用することができる。例えば、閾値より大きい非常に少ないエネルギーの放出は、不活化を示しうる。
【００５４】
閾値強度より大きいエネルギーの放出の数は、多様な方法で活性化を示すために使用されうる。例えば、活性化を指示するために、閾値より大きい多数のエネルギーの放出または割合が設定されうる。この設定数または割合を超過した場合、ＧＰＣＲ経路が活性化されたことを決定しうる。さらに、対照（すなわち、未処理）細胞および処理細胞での閾値より大きいエネルギーの放出の数と比較でき、処理細胞の放出が、対照細胞の放出を超過する数を設定しうる。この設定数を超過する場合、ＧＰＣＲ経路を活性化したと決定しうる。
【００５５】
例として、本発明の自動化された方法では、ＧＰＣＲを発現し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を含有する１つまたはそれ以上の細胞を供する。検出可能な分子から得られるエネルギーの放出の相対的強度に基づいて、細胞の画像を作成する検出の方法によって、細胞を走査する。画像をデジタル化でき、エネルギーの放出の相対的強度を、画素強度値に変換することができる。エネルギーの放出の強度を用いて、ＧＰＣＲ経路の活性化または不活化を検出しうる。例えば、計算された閾値強度より大きい相当な量のエネルギーは、ＧＰＣＲ経路の活性化を示しうる。同様に、計算された閾値強度より大きいエネルギーの量における著しい減少は、ＧＰＣＲ経路の不活化を示しうる。
【００５６】
例えば、第一の画像の平均強度は、第一の画像から直接、または第一の配列の画素を解析することのいずれによっても計算することができる。閾値強度は、細胞質中に均等に分布される検出可能な分子から得られるエネルギーの放出を排除するが、しかし、エンドサイトーシス小胞中の検出可能な分子から得られるエネルギーの放出を排除しないように、例えば、第一の画像におけるエネルギーの放出の平均強度（試験化合物または溶液に曝される前）に標準偏差の２倍または３倍を足したものに設定することができる。この閾値強度より大きいエネルギーの放出を識別し、定量することができる。エネルギーの放出を識別するために、関連する画素を、コンピュータメモリーを用いてタグ付けでき、またはコンピュータにより作成した画像において、画素を、特徴的な色、例えば、マゼンタに変化させることができる。画像は、閾値強度より大きい画素のものを識別（例えば、マゼンタにより）した後に、ビデオ画面に再表示することができる。閾値強度より大きい画素は、重み付けされた総計として定量されうる。
【００５７】
試験化合物または溶液に曝される前後に、閾値より大きい画素の数を比較することは、試験化合物または溶液が、アゴニストであるか、またはそれを含むかどうかを決定するために使用されうる。例えば、試験化合物または溶液が、アゴニストであるか、それを含む場合、アゴニストに曝された後の閾値より大きい画素の数は顕著に増大しうる。
【００５８】
本発明の自動化された方法は、ＧＰＣＲのアンタゴニストの活性について試験化合物および試験溶液をスクリーニングするためにも使用しうる。ＧＰＣＲを発現し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を含有する１つまたはそれ以上の細胞を供する。その細胞の第一の画像を作成する検出の方法によって、細胞を走査する。
【００５９】
細胞を、試験化合物または試験溶液にさらし、さらに公知のアゴニストにさらす。さらに、細胞の第二の画像を作成する検出の方法によって、細胞を走査する。第一および第二の画像を第一および第二の組の画素として捕捉する、または第一および第二の組の画素に変換さることができる。第一および第二の設定の画素の強度を測定しうる。上に記載されたように、第一および第二の設定の画素の強度は、ＧＰＣＲ経路が活性化されたかどうかを決定するために使用することができる。例えば、試験化合物がアンタゴニストである場合、ＧＰＣＲ経路の活性化が遮断される。
【００６０】
試験化合物または溶液、およびアゴニストに曝す前後における、閾値より大きいシグナルの数の比較は、試験化合物または溶液が、アンタゴニストであるか、またはそれを含むかどうかを決定するために使用することができる。例えば、試験化合物または溶液が、アンタゴニストであるか、またはそれを含む場合、それによりアゴニスト、および試験化合物または溶液に曝される前後において、閾値より大きいエネルギーの放出の数は、アゴニストにより予測されるときの増加と異なり、適正に一定なままでありうる。
【００６１】
本発明は、限定するためのものでないことが意図される以下の例示の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６２】
［実施例：アゴニストに仲介されるバーＧＦＰの移転の測定］
アゴニストに仲介されるバーＧＦＰ（βａｒｒ−ＧＦＰ）キメラの、細胞質ゾルからエンドサイトーシス小胞への移転を、二重安定性細胞株（バーＧＦＰおよびＶ２Ｒに安定なもの）、例えば、HEK-293細胞またはCOS細胞を使用して研究した。これらの細胞に、Ｖ２Ｒ受容体およびバーＧＦＰ複合体のｃＤＮＡを含むプラスミドを形質導入させた。
【００６３】
ＧＦＰの蛍光を検出する共焦点顕微鏡を使用して、細胞を評価した（図３ａおよび３ｂ）。ザイツのレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM-510)を用い、単線の励起（４８８ｎｍ）を使用して、画像を順次撮影した。
【００６４】
アゴニストの不在下では、バーＧＦＰは、図３ａにおける均質なバーＧＦＰの蛍光によって示されるとおり、Ｖ２Ｒを発現する細胞の細胞質中に均等に分布して検出される。アルギニン・ベソプレシンの添加（ＡＶＰ、ミズーリー州セントルイスのシグマ・ケミカルズから得られる）により、細胞質から原形質膜の受容体へのバーＧＦＰの迅速な再局在化が促進された。アゴニストにさらに長期間さらすと（すなわち、３０分後）、バーＧＦＰは、エンドサイトーシス小胞に再局在化される（図３ｂ）。
【００６５】
共焦点顕微鏡画像の上部の図３ａおよび３ｂは、標準の感度で取られたが、エンドサイトーシス小胞に局在する検出可能な分子から放出される強いエネルギーは、検出器を飽和させた（すなわち、画素として捕捉された発光強度のプロットを取ることを試みた場合、その強度は、目盛りから外れた）。図４ａおよび４ｂは、それらが、エンドサイトーシス小胞に共局在するバーＧＦＰによって検出器が飽和するのを防止するために、感度を減少させて撮られたことを除き、それぞれ、図３ａおよび３ｂと同一である。図４ａおよび４ｂは、エンドサイトーシス小胞中にバーＧＦＰが集中することで、対照細胞の細胞質で観察される蛍光強度よりいっそう大きな蛍光強度を示すスポットが生じることを示す。
【００６６】
飽和していない画像（図４ａおよび４ｂでのもの）を使用して、エネルギーの放出を画素として捕捉した。データを分析するために、ウインドウズの3.0.6版用のコンピュータプログラムＩＰラボ(Scanalytics,Inc.、バージニア州フェアーファックス(Fairfax,VA))を使用した。格子を発生させながら、画素の位置および強度を描いた。対照細胞を使用して、画素数対画素強度の棒グラフを作成した。対照細胞中の画素の平均強度を計算し、標準偏差を計算した。
【００６７】
平均細胞強度に標準偏差の３倍を足したもの（＞９９パーセンタイル）として、閾値強度を計算した。対照と処理画像（それぞれ、図５Ａおよび５ｂ）の両方で、閾値より大きい強度を示す画素はマゼンタ色で示された。対照細胞は、非常に少量のマゼンタ色の画素を有した。対照的に、アゴニストで処理された細胞（処理細胞）は、多くのマゼンタ色の画素を有した。図５ｂの処理細胞におけるマゼンタ色の画素は、図４ｂにおけるエンドサイトーシス小胞を含むバーＧＦＰに密接に対応する。
【００６８】
対照細胞と処理細胞との両方で、閾値より大きい画素が集計された。図６は、対照細胞および処理細胞の両方における閾値より大きい画素を図示する。標識対照細胞を示す第一の曲線は、対照細胞を使用して求められた画素数対画素強度を示すグラフである。標識小胞を示す第二の曲線は、処理および対照細胞の両方において、閾値より大きい画素を示し、したがって、処理細胞での小胞に対応する。閾値を、対照細胞の平均細胞強度に標準偏差の３倍を足したもの（＞９９パーセンタイル）に設定した。
【００６９】
図７は、対照および処理細胞についての閾値強度より大きい画素の数のグラフである。処理細胞において閾値より大きい画素の数は、対照細胞のもののおよそ１２０倍である。このデータは、アゴニストを添加し、バーＧＦＰがエンドサイトーシス小胞に移転されたことを示すために使用されうる。
【００７０】
本発明の種々の修飾および改変が、本発明の範囲および概念から逸脱することなしに、当業者に明らかになる。これらのおよび他の代わりの実施の形態は、特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【００７１】
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【表１Ｃ】
【００７２】
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【表２Ｅ】
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、本発明による受容体活性を検出する方法の流れ図である。
【図２】図２は、本発明による受容体活性を検出する別の方法の流れ図である。
【図３】図３ａおよび３ｂは、バーＧＦＰ融合タンパク質とＶ２Ｒ（ＧＰＣＲ）とを安定に発現する細胞におけるバーＧＦＰ蛍光の共焦点顕微鏡画像である。 図３ａは、アゴニストにより処理する前（対照）である。 図３ｂは、３７℃において、アゴニストにより３０分間処理した後である。
【図４】図４ａおよび４ｂは、それらが、検出器が飽和するのを防止するために、検出器の感度を減少させて撮られたことを除き、図３ａおよび３ｂと同一である。
【図５】図５ａおよび５ｂは、明るく陰影を付けられた領域として現れている、閾値強度（ここで、＞９９パーセンタイル以内のものとして計算される）より大きい画素を有する、減少させた強度で取られた共焦点顕微鏡画像を示す。 図５ａは、対照群のものである。 図５ｂは、処理細胞のものである。
【図６】図６は、画素数対画素強度を表す棒グラフである。
【図７】図７は、対照および処理細胞において、閾値強度より大きい画素の数を表すグラフである。
【０００１】
［連邦政府に支援された研究開発についての主張］
本研究は、米国国立衛生研究所により授与された交付番号第HL61365号の下に米国政府によって支援された。米国政府は、本発明に所定の権利を有しうる。
【０００２】
本発明は、インビトロおよびインビボでのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性を検出する方法に関する。本発明は、ＧＰＣＲ調節経路を活性化する化合物を同定する方法、およびＧＰＣＲのリガンドを同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモンまたはリガンドの結合を細胞内シグナルに変換する細胞表面タンパク質である。ＧＰＣＲは、全ての動物、昆虫、および植物で見られる。ＧＰＣＲシグナル伝達は、光伝達と、嗅覚と、神経伝達と、血管緊張と、心拍出と、消化と、痛みと、体液および電解質の平衡化とを含む種々の生理学的機能を調節する上できわめて重要な役割を果たす。それらは、種々の生理学的機能に関与するが、ＧＰＣＲは、多数の共通構造特性を共有する。それらは、交互に細胞内および細胞外ループによって架橋される７つの膜ドメインと、可変長の細胞内カルボキシル末端尾部とを含む。
【０００４】
ＧＰＣＲによって制御される生理学的反応の規模は、ＧＰＣＲシグナル伝達とシグナル終結との間の平衡に関連する。ＧＰＣＲのシグナル伝達は、アレスチンと呼ばれる細胞内タンパク質のファミリーによって制御される。アレスチンは、活性化ＧＰＣＲ（アゴニストで活性化されたもの、および特にＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化されたものを含む）に結合する。
【０００５】
ＧＰＣＲを含む受容体は、リガンド、ホルモン、および高い特異性を有する医薬品に結合するので、歴史的に、医薬品の発見および薬剤の標的であった。今日使用されている医薬のほぼ５０パーセントは、ＧＰＣＲを標的とする、またはＧＰＣＲと直接相互作用する。例えば、Jurgen Drews(2000年)「医薬品発見：歴史的予測(Drug Discovery:A Historical Perspective)」、Science 287巻:1960-1964頁参照。
【０００６】
数百のヒトＧＰＣＲしか知られていないが、数千のＧＰＣＲが、ヒトゲノムに存在すると推定されている。これらの公知ＧＰＣＲのうちの多くは、機能またはリガンドと関連づけられていないオーファン受容体である。
【０００７】
共にBarakらに対する米国特許第5,891,646号および第6,110,693号で開示されるようなＧＰＣＲ活性を解析する１つの方法は、ＧＰＣＲを発現する細胞と、アレスチンおよび検出可能な分子の複合体(conjugate)とを使用する。
【０００８】
したがって、正確で、解釈するのが容易であるＧタンパク質共役型受容体の活性を検出する方法を提供する必要性がある。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の１つの態様によると、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法が提供される。本方法は、ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供するステップを含む。前記複数の複合タンパク質の各々は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成される。前記複数の複合タンパク質は、前記少なくとも１個の細胞の細胞質内に実質的に均等に分布される。前記少なくとも１個の細胞の第一の画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの量を検出し、該エネルギーの量に対応する値を保存することによって得られる。前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理する。前記少なくとも１個の細胞の第二の画像を得る。前記第一の画像および前記第二の画像を比較し、前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出する。局在は、エンドサイトーシス小胞および／またはエンドソームで起こりうる。
【００１０】
本発明の別の態様によると、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法が提供され、ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質が提供される。前記複数の複合タンパク質の各々は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成される。前記複数の複合タンパク質は、前記少なくとも１個の細胞の細胞質中に実質的に均等に分布される。前記少なくとも１個の細胞の第一のデジタル画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって得られる。該第一のデジタル画像は、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成される。それぞれの強度値は、該配列での画素の位置に対応した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づく。前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理する。前記少なくとも１個の細胞の第二のデジタル画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって得られる。該第二のデジタル画像は、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成される。それぞれの強度値は、該配列での画素の位置に対応した検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づく。前記第一のデジタル画像および前記第二のデジタル画像を比較し、前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出する。局在は、エンドサイトーシス小胞および／またはエンドソームで起こりうる。前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在は、検出可能な分子から放出されるエネルギーの見掛けの強度の変化であって、前記複数の画素の少なくともいくつかの値を増加させる変化によって検出される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様によると、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法が提供される。ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供する。前記複数の複合タンパク質の各々は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成される。前記複数の複合タンパク質は、前記少なくとも１個の細胞の細胞質中に実質的に均等に分布される。前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理する。前記少なくとも１個の細胞のデジタル画像は、前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって得られる。該デジタル画像は、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成される。それぞれの強度値は、該配列中の画素の位置に対応した検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づく。前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在は、エンドサイトーシス小胞および／またはエンドソームで検出されうる。前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在は、検出可能な分子から放出されるエネルギーの見掛けの強度における変化であって、閾値強度より大きい値を有する前記複数の画素の少なくともいくつかが生じる変化によって検出される。
【００１２】
本明細書に使用される場合、語句「含む」または「含むこと」は、開示された特徴、ステップ、または構成要素の存在を特定するために使用されるが、１つまたはそれ以上の他の特徴、ステップ、構成要素、またはそれらの群の存在または追加を排除しないことを重要視すべきである。
【００１３】
本発明の目的および利点は、図面と共に以下に詳述される説明を読むことによって理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ＧＰＣＲ経路の活性を検出する自動化されたスクリーニング方法が提供される。本方法は、ＧＰＣＲ経路のレベルが変化したかどうかを測定するために使用することができる。本方法は、ＧＰＣＲ活性について化合物および／または溶液をスクリーニングする、都合がよく、現実的な時間で、高容積の方法を提供する。
【００１５】
本方法は、試験化合物の活性を迅速で簡単に測定するために、試験化合物にさらした前後における細胞の走査の相対的な強度の全般的な比較を提供する利益を提供する。試験化合物の例としては、リガンドである可能性があるもの、アゴニストである可能性があるもの、アンタゴニストである可能性があるもの、および脱感作剤である可能性があるものが挙げられる。本方法は、検出可能な分子の位置、および特定の特異的な細胞構造に対する検出可能な分子の接近に関して画像の定性的な分析を必要としない。本方法は、特定の細胞構造の領域の決定、または細胞核内のいかなる測定をも必要としない。本方法によると、自動化された工程による化合物の迅速なスクリーニングが促進される。
【００１６】
特に限定されるものではないが、本方法を使用しうる分析の例として、米国特許第5,891,646号および第6,110,693号、および2001年11月5日に出願された米国特許出願第09/993,844号で開示されるものが挙げられる。それらの開示は、それらの全体を参照して本明細書に組み込まれる。特に限定されるものではないが、本方法を使用できる分析の別の例として、蛍光共鳴エネルギー交換（ＦＲＥＴ）を使用する分析、およびAngers,S.、Salahpour,A.、Joly,E.、Hilairet,S.、Chelsky、「生物発光共鳴エネルギー変換（ＢＲＥＴ）を使用した生きた細胞でのβ２−アドレナリン作動性受容体二量体化(β2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence resonance energy transfer (BRET))」、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 97年、7巻:3684-3689頁に開示される生物発光共鳴エネルギー交換（ＢＲＥＴ）技術を使用する分析が挙げられる。
【００１７】
脱感作と称される工程により、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）は、例えば、カルボキシル末端尾部で、ＧＰＣＲの細胞内ドメインをリン酸化する。多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端尾部は、第７の膜間ドメインの末端の印となる、保存されたＮＰＸＸＹ部分の直後に始まる（すなわち、ＮＰＸＸＹ部分に続くものが、ＧＰＣＲのカルボキシル末端尾部である）。カルボキシル末端尾部は、比較的長い（およそ十から百個までのアミノ酸）、比較的短い（およそ十個のアミノ酸）、または実質的に存在しない（およそ十個未満のアミノ酸）でありうる。本明細書において使用される場合、「カルボキシル末端尾部」は、３つの変異体全て（比較的長い、比較的短い、または実質的に存在しないのいずれか）を意味するべきである。
【００１８】
リン酸化の後、アレスチンタンパク質は、ＧＲＫリン酸化受容体と会合し、受容体をそれと共役したＧタンパク質から分離させる。特に限定されるものではないが、語句「アレスチン」は、アレスチンの天然の変異体および操作された変異体の全てのタイプを指し、視覚アレスチン(visual arrestin)（しばしば、アレスチン１と称される）、β−アレスチン１（しばしば、アレスチン２と称される）、およびβ−アレスチン２（しばしば、アレスチン３と称される）を含むことが分かる。リン酸化ＧＰＣＲとアレスチンの相互作用は、ＧＰＣＲシグナル伝達を終結し、シグナル伝達をしない脱感作受容体を生じる。
【００１９】
脱感作ＧＰＣＲに結合したアレスチンは、エンドサイトーシスのためのクラスリン被覆小窩に対してＧＰＣＲを標的化する。ＧＰＣＲとアレスチンの相互作用の安定性により、ＧＰＣＲの脱リン酸化、再利用および再感作の速度が決定されうる。ＧＰＣＲが、アレスチンに対して増強された親和性を有すると、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体は、無傷の状態となり、エンドソームに内在化される。
【００２０】
ＧＰＣＲ活性を監視するために、インビボまたはインビトロの環境を利用できる。どちらの環境でも、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を利用する。語句「検出可能な分子」は、特に限定されるものではないが、蛍光、リン発光、および生物発光および放射性崩壊を含む、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、放射性、および光学的手段により検出することができるあらゆる分子を意味する。特に限定されるものではないが、検出可能な分子として、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ロダミン複合抗体等が挙げられる。検出可能な分子として、放射性アイソトープ、エピトープタグ、親和性標識、酵素、発光基、化学発光基等が挙げられる。検出可能な分子として、他の分子との相互作用する作用として直接的または間接的に検出される分子が挙げられる。
【００２１】
ＧＦＰとして、自然の起源から単離できる、または遺伝子操作されうる種々の自然に存在する形態のＧＦＰ、および人工的に改変されたＧＦＰが挙げられる。ＧＦＰは当分野で既知である。例えば、米国特許第5,625,048号、第5,777,079号、および第6,066,476号参照。ＧＦＰは、自然の源から単離された、または遺伝子操作された他の蛍光タンパク質と容易に相互交換でき、特に限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、紫外線励起性蛍光タンパク質、またはその間の任意の波長のものを含むことは当分野では十分に知られている。
【００２２】
試験化合物、試験溶液および試験条件に細胞をさらした後に、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体の位置の変化を検出するように本方法を設計する。
【００２３】
インビボでの環境では、ＧＰＣＲを発現し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を含有する１個またはそれ以上の細胞を供する。検出可能な分子に結合したアレスチンを検出および監視することができる。アレスチンの位置は、例えば、細胞質中に均等に分布、細胞膜に集中、および／またはエンドサイトーシス小胞中に局在したものを、検出することができる。アゴニストによる刺激に対する反応では、アレスチンのＧＰＣＲに対する接近、および他のあらゆる細胞構造に対する接近を監視することができる。例えば、アゴニスト刺激に対する反応では、アレスチンを、細胞膜のＧＰＣＲの近傍で、および／またはエンドサイトーシス小胞中でＧＰＣＲと共局在したものを検出することができる。
【００２４】
インビトロの環境では、アレスチン結合部位およびアゴニスト結合部位を有する１個またはそれ以上のＧＰＣＲをその上に設けられている基質を供し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との１つまたはそれ以上の複合体を含有する緩衝溶液を供する。ＧＰＣＲは、アレスチン結合部位がアレスチンにさらされ、アゴニスト結合部位がアゴニストに接近可能なように、基質上に配置されうる。ＧＰＣＲおよびアレスチンは、全細胞から得ることができ、精製後、インビトロにおける分析で使用することができる。ＧＰＣＲは、アレスチン結合部位およびアゴニスト結合部位を有し、多層または二層の脂質小胞中に支持されうる。ＧＰＣＲを支持する小胞を基質上に設け、アレスチン結合部位がアレスチンにさらされ、受容体結合部位がアゴニストに接近可能なように、ＧＰＣＲを脂質小胞で支持し、基質上に設ける。その基質は、改変ＧＰＣＲを設けることができる任意の人工基質でよく、特に限定されるものではないが、ガラス、プラスチック、ダイアモンド、セラミックス、半導体、シリカ、光ファイバー、生物適合性モノマー、生物適合性重合体、重合体ビーズ（有機および無機重合体を含む）等が含まれる。
【００２５】
アレスチンの位置を、インビトロの環境で検出および監視できる。アゴニストによる刺激に対する反応では、アレスチンの再局在化を検出できる。例えば、アゴニストによる刺激に対する反応では、アレスチンは、基質上のＧＰＣＲの近傍で検出され得て、アレスチンは、区分化することが検出できるなどである。
【００２６】
［ＧＰＣＲ］
本方法は、アゴニストの結合がアレスチンタンパク質の会合に関連する、任意の膜受容体タンパク質を用いて利用することができる。本発明に使用しうる既知のＧＰＣＲの、例示であって、限定的なものではないリストが、表１に含まれる。構造の類似性およびリガンドに基づいて、受容体を古典的区分に従って分類する。本発明に使用できるＧＰＣＲとしては、公知のＧＰＣＲ、未知またはオーファンＧＰＣＲ、およびキメラまたは改変ＧＰＣＲが挙げられる。ＧＰＣＲは、機能および／またはリガンドが未知である場合、「未知またはオーファンＧＰＣＲ」であると考えられる。改変ＧＰＣＲとして、カルボキシル末端尾部に１つまたはそれ以上の改変、細胞内ループ中および／または膜間領域の細胞質末端での、好ましくはカルボキシル末端尾部での改変を有するＧＰＣＲが挙げられる。
【００２７】
例として、公知の受容体についての３つの主要なＧＰＣＲのクラスを同定した。クラスＡ受容体、クラスＢ受容体、およびカルボキシル末端尾部が実質的には存在しない受容体。受容体は、ＨＥＫ−２９３細胞におけるラットβアレスチン２との相互作用および親和性に基づいて、クラス分けされ、カルボキシル末端尾部のアミノ酸残基およびカルボキシル末端尾部の長さに基づいて推定することができる。クラスＢ受容体は、米国特許第5,891,646号、およびOakleyらの「Ｇタンパク質共役型受容体についての視覚アレスチン、βアレスチン１、およびβアレスチン２の異なる親和性が、２つの主要なクラスの受容体を明確に描写する(Differential Affinities of Visual Arrestin, sArrestin1, and sArrestin2 for G Protein-coupled Receptors Delineate Two Major Classes of Receptors)」、Journal of Biological Chemistry、275巻22号、17201-17210頁、2000年6月2日（これらの内容は、全体を参照して本明細書に組み込まれる。）に開示されるような条件下で、ＨＥＫ−２９３細胞においてラットβアレスチン２をエンドソームに引き寄せるようにカルボキシル末端尾部に適切に配置された、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊（クラスター）を有するＧＰＣＲである。クラスＡ受容体は、クラスＢ受容体について上で記述された条件下で、ＨＥＫ−２９３細胞においてラットβアレスチン２をエンドソームに引き寄せないようにカルボキシル末端尾部に適切に配置された、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊を有しないＧＰＣＲである。カルボキシル末端尾部が実質的に存在しない受容体としては、例えば、嗅覚および味覚受容体が挙げられる。
【００２８】
表２は、公知の受容体の、例示であって、限定的なものではないリストであってそれらのカルボキシル末端尾部のアミノ酸配列と適切な分類を含む。クラスＢ受容体の例については、リン酸化部位の塊として機能しうる残基は、太字イタリック体で示される。
【００２９】
本発明では、改変ＧＰＣＲが好ましい。改変ＧＰＣＲとして、そのカルボキシル末端尾部に適切に配置された１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊を有するＧＰＣＲが挙げられる。リン酸化部位のこれらの塊は、好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端尾部に配置されるセリンおよびトレオニン残基である。これらの塊は、カルボキシル末端尾部ドメイン内でそれらの位置に顕著に保存され、アゴニスト依存的なリン酸化の一次部位として働く。アミノ酸の塊は、２つの内の２つ、３つの内の２つ、３つの内の３つ、４つの内の３つ、４つの内の４つ、５つの内の４つ、５つの内の５つ等の連続なアミノ酸の位置を占有しうる。したがって、安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するアミノ酸の塊は、「リン酸化部位の塊」である。
【００３０】
カルボキシル末端尾部に適切に配置された１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊を含む改変ＧＰＣＲは、アレスチンについて増大した親和性を有し、アゴニストによる刺激の後、エンドソーム内のアレスチンと共局在する。これらの改変ＧＰＣＲは、アゴニストによる刺激の後およそ３０分以内にアレスチンをエンドソームに引き寄せる。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸部位の塊は、アレスチンについて増大された親和性を有するために、ＧＰＣＲについてのＧＰＣＲ尾部内に適切に配置されなければならない。
【００３１】
改変ＧＰＣＲは、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊が、カルボキシル末端尾部内に適切に配置されるように構築されうる。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊が、適切にカルボキシル末端尾部内に正確に配置されるように、共に融合して、改変ＧＰＣＲを形成するものであるポリペプチド部分を選択する。替わりの方法では、改変ＧＰＣＲを作成するために、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位の塊が、カルボキシル末端尾部内に適切に配置されるように、個々の点突然変異の位置を選択することもできる。
【００３２】
［細胞］
特に限定されるものではないが、本発明に有用な細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および動物細胞を含む真核生物および原核生物の細胞が挙げられる。特に限定されるものではないが、適切な動物細胞としては、HEK細胞、HeLa細胞、COS細胞、U208細胞、および種々の原始哺乳類細胞が挙げられる。組織の全体に、または特定の臓器または組織型内で、アレスチンと検出可能な分子の複合体を発現する動物モデルは、公知または未知のＧＰＣＲリガンドの細胞の標的を研究する上で有用である可能性がある。
【００３３】
本発明に有用な細胞としては、公知のＧＰＣＲ、公知のＧＰＣＲの変異体、未知のＧＰＣＲ、未知のＧＰＣＲの変異体、改変ＧＰＣＲ、改変ＧＰＣＲの変異体、およびそれらの組合せを発現するものが挙げられる。ＧＰＣＲを発現する細胞は、その細胞膜内に機能的な受容体としてＧＰＣＲを含むものである。その細胞は、ＧＰＣＲを自然に発現できてもよく、またはＧＰＣＲを発現するために遺伝子操作されていてもよい。当業者は、遺伝子操作の分野で標準的な分子生物学的技術によって、ＧＰＣＲを発現するために、細胞を遺伝子操作することができることを容易に理解する。
【００３４】
［複合体］
本発明の方法で、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を利用する。
【００３５】
特に限定されるものではないが、視覚アレスチン、βアレスチン１およびβアレスチン２を含む、自然に生じる変異体および遺伝子操作された変異体の両方の全ての形態のアレスチンを、本発明に使用しうる。カルボキシル末端尾部に増強された親和性部分を有する本発明のＧＰＣＲ（自然に生じるものおよび改変されたもの）は、検出可能なレベルまで、全ての形態のアレスチンと相互作用しうる。
【００３６】
特に限定されるものではないが、アレスチンと複合化させるために使用されうる検出可能な分子として、分光学的、光化学的、放射性、生化学的、免疫化学的、電気的、および光学的手段（特に限定されるものではないが、生物発光、リン光、および蛍光を含む）によって検出可能である分子が挙げられる。これらの検出可能な分子は、生物学的に適合した分子であるべきであり、ＧＰＣＲ系と相互作用するアレスチンの能力を傷つけるべきでない。また、ＧＰＣＲ系とのアレスチンの相互作用は、検出されるべき検出可能な分子の能力を損なうべきでない。好ましい検出可能な分子は、光学的に検出可能な分子であり、化学的に、機械的に、電気的に、または放射活性的に励起され、蛍光、リン光、または生物発光を放出しうるような光学的に検出可能なタンパク質を含む。光学的に検出可能な分子として、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ホタル・ルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、フルオレセイン、テキサス・レッド、およびロダミン複合抗体が挙げられる。さらに好ましい検出可能な分子は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む蛍光タンパク質のような生得的な蛍光分子である。
【００３７】
検出可能な分子は、Barakら(米国特許第5,891,646号および第6,110,693号)に記述される方法によってアレスチンタンパク質と複合化しうる。検出可能な分子は、前末端で、後末端で、または中間の点で、アレスチンと複合化しうる。好ましくは、検出可能な分子は、細胞内で合成されることのできる分子である。アレスチンと検出可能な分子との複合体が、細胞内で産生されるように、細胞を、ＤＮＡに形質導入できる。当業者が容易に理解するように、細胞は、遺伝子操作の分野で標準的な分子生物学的技術によって、アレスチンと検出可能な分子との複合体を発現するために、遺伝子操作されうる。
【００３８】
［検出の方法］
検出の方法は、アレスチンタンパク質と複合化した検出可能な分子の分布および／または位置を決定するために使用されうる。したがって、検出の方法は、使用される検出可能な分子または複数分子によって変化しうる。検出の方法は、アレスチンタンパク質の細胞内の位置、またはＧＰＣＲとのアレスチンタンパク質の相互作用、例えば、細胞膜でのアレスチンの濃度、またはエンドサイトーシス小胞でのＧＰＣＲとのアレスチンの共局在を決定するために使用されうる。当業者は、使用される検出可能な（複数の）分子に適切な検出方法を容易に修正できる。
【００３９】
検出可能な分子は、使用される検出可能な分子によって、エネルギーを放出し、反射し、および／または吸収する。明瞭にする目的のために、語句「放出」を本明細書に使用するが、特に指定されない限り、「反射」および「吸収」を含むと解釈されるべきである。使用される検出器および検出方法は、放出されるエネルギーの型を識別および記録するのに適しているべきである。利用される検出器は、例えば、単独光検出器または電荷結合素子列(charge-coupled device array)を用いて、一連で、または平行して、逐一、細胞の画像を写しうる。検出器のこのような構成は、当分野に公知である。
【００４０】
検出方法は、検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度を測定するための検出器を含んでもよく、検出器の操作を制御し、受けたシグナルの分析を行うコンピュータ制御装置に有効に結合されうる。制御装置は、好ましくは、検出器から受けたシグナルの分析を行うコンピュータプログラム製品を含む。コンピュータプログラム製品は、検出方法で使用するために特に書き込まれうるか、または検出方法で使用するために、改良した商業的に入手可能なプログラムでありうる。
【００４１】
光学的に検出可能な分子については、蛍光、生物発光、またはリン光が、測定および記録されうるあらゆる光学的方法を使用しうる。例えば、蛍光を測定するための１つまたはそれ以上の光検出器を使用することができ、これらの光検出器は、コンピュータ制御装置に有効に結合されうる。電荷結合素子列も使用することができ、コンピュータ制御装置に有効に結合されうる。
【００４２】
好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰと複合化させることができ、アレスチン−ＧＦＰ複合体は、共焦点顕微鏡によって観察されることができる。
【００４３】
［ＧＰＣＲ経路の活性を検出する自動化された方法］
図１は、本発明の１つの態様により受容体活性を検出する方法の流れ図である。アゴニストである可能性があるもので処理する前に、検出可能な分子に結合したアレスチンは、細胞質中に均等に分布してものとして検出されうる。検出可能な分子は、エネルギーを放出し、それにより第一の画像を作成しうる。細胞を、利用される検出方法によって走査し、細胞の画像を作成する。アゴニストを用いた処理前の細胞の画像は、検出可能な分子が細胞質中に平等に、均質に分布されることを示す。
【００４４】
検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度を測定し、デジタルフォーマットに変換し、画素として表すことができる。例えば、その画像は、各画素の位置および強度によって描くことができる。所定の強度での画素を定量でき、画素についての平均強度を計算できる。デジタル画像を、ビデオ画面で再表示することができる。
【００４５】
試験化合物で処理した後、さらに、細胞を、利用される検出方法によって走査し、その細胞の第二の画像を作成する。細胞の第二の画像を、デジタル画像に変化し、前と同様に分析できる。
【００４６】
エンドサイトーシス小胞に局在する検出可能な分子から放出される強力なエネルギーによって、検出器が飽和するのを防止するために、検出器の感度を減少させることが有益な場合がある。認識することができるように、検出器の感度は、多数の方法で減少させることができ、例えば、検出器でエネルギーを阻害するフィルターを使用すること、または検出器に関連する増幅率を減少させることでできる。
【００４７】
試験化合物がアゴニストである場合、それにより検出可能な分子は、細胞質の全領域中に均等に分布される代わりに、特定の小さな領域に集中しうる。試験化合物がアゴニストでない場合、それにより検出可能な分子の分布は、実質的に変化しない。
【００４８】
例えば、アゴニストで細胞を処理した後、アレスチンは、細胞膜のＧＰＣＲの近傍で検出でき、および／またはエンドサイトーシス小胞でＧＰＣＲと共局在しうる。検出可能な分子は、小さな領域に集中しうるので、検出可能な分子から得られるエネルギーは集中し、著しく増加した強度のものになる。強度の見掛けの増加は、検出可能な分子の小さな領域への再局在によるものであり、各検出可能な分子により産生されるエネルギーの強度の本質的な変化によるものではない。
【００４９】
小胞に集中する検出可能な分子から得られるエネルギーは、ＧＰＣＲ経路の活性化を容易に示すために使用されうる。したがって、これらの濃度の検出可能な分子の陽性で、容易な同定が望ましい。上に説明されるとおり、細胞質に均等に分布される検出可能な分子は、均質な希釈エネルギーの放出を示す。対して、エンドサイトーシス小胞に集中する検出可能な分子は、いっそう強いエネルギーの放出を示す。
【００５０】
図２は、本発明の別の態様により受容体活性を検出する方法の流れ図である。細胞質に均等に分布される検出可能な分子から得られるエネルギーの放出に基づいて、平均強度を得ることができ、この平均強度から、閾値強度を設定できる。閾値強度は、細胞質中に均等に分布される検出可能な分子から得られるエネルギーの放出（すなわち、バックグランド放出）を排除するが、しかし例えばエンドサイトーシス小胞に共局在する検出可能な分子から得られるエネルギーの放出（すなわち、標的となる放出）は排除しないように設定されうる。例えば、閾値強度は、対照細胞（すなわち、アゴニストで処理されない細胞）における全エネルギーの放出の平均強度に、例えば、標準偏差の２倍（９５パーセンタイル(percentile)）または標準偏差の３倍（＞９９パーセンタイル）のような決められた数の標準偏差を足したものでありうる。閾値強度を決定する方法は、閾値が、できるだけ多くの標的放出の検出を可能にする一方で、できるだけ多くのバックグランドの放出を排除するように設定される限り制限されない。
【００５１】
試験化合物で処理される細胞の群よりむしろ、対照群の細胞の第一の画像を取ることができることを強調すべきである。例えば、特定の細胞株が、どのくらいの量の複合タンパク質を発現するかが決定されると、この情報は、その細胞株についての平均強度を決定するために使用することができる。その細胞株についての平均強度は、続く実験での閾値強度を設定するために使用することができる。
【００５２】
閾値強度を設定した後、閾値強度より大きいエネルギーの放出を識別し、定量することができる。識別されたエネルギーの放出は、コンピュータメモリーを用いてタグ付けされる、または識別されたエネルギーの放出は、関連した画素を、特徴的な色、例えば、マゼンタに変化させることによって、コンピュータにより作成される画像で区別することができる。コンピュータにより作成された画像は、閾値強度の、またはそれより大きいエネルギーの放出を有するその画像の部分を識別（例えば、マゼンタによって）した後、ビデオ画面上に再表示することができる。
【００５３】
閾値強度の、またはそれより大きいエネルギーの放出に対応する画素は、画素の総数に対する割合として、または好ましくは閾値強度より大きい画素の重み付けした合計として、絶対数（すなわち、それらは計数されうる）によって定量されることができる。重み付けは、多様な方法で付与されうる。例えば、閾値強度より上の各画素は、それのそれぞれの強度値によって重み付けされうる。閾値強度より大きいエネルギーの放出の数は、ＧＰＣＲが活性化されたかどうか、およびどの程度活性化されたかを決定するために使用することができる。例えば、閾値より大きい大量のエネルギーの放出は、活性化を示しうる。閾値強度より大きいエネルギーの放出の数は、ＧＰＣＲが不活化されたかどうか、およびどの程度不活化されたかを決定するためにも使用することができる。例えば、閾値より大きい非常に少ないエネルギーの放出は、不活化を示しうる。
【００５４】
閾値強度より大きいエネルギーの放出の数は、多様な方法で活性化を示すために使用されうる。例えば、活性化を指示するために、閾値より大きい多数のエネルギーの放出または割合が設定されうる。この設定数または割合を超過した場合、ＧＰＣＲ経路が活性化されたことを決定しうる。さらに、対照（すなわち、未処理）細胞および処理細胞での閾値より大きいエネルギーの放出の数と比較でき、処理細胞の放出が、対照細胞の放出を超過する数を設定しうる。この設定数を超過する場合、ＧＰＣＲ経路を活性化したと決定しうる。
【００５５】
例として、本発明の自動化された方法では、ＧＰＣＲを発現し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を含有する１つまたはそれ以上の細胞を供する。検出可能な分子から得られるエネルギーの放出の相対的強度に基づいて、細胞の画像を作成する検出の方法によって、細胞を走査する。画像をデジタル化でき、エネルギーの放出の相対的強度を、画素強度値に変換することができる。エネルギーの放出の強度を用いて、ＧＰＣＲ経路の活性化または不活化を検出しうる。例えば、計算された閾値強度より大きい相当な量のエネルギーは、ＧＰＣＲ経路の活性化を示しうる。同様に、計算された閾値強度より大きいエネルギーの量における著しい減少は、ＧＰＣＲ経路の不活化を示しうる。
【００５６】
例えば、第一の画像の平均強度は、第一の画像から直接、または第一の配列の画素を解析することのいずれによっても計算することができる。閾値強度は、細胞質中に均等に分布される検出可能な分子から得られるエネルギーの放出を排除するが、しかし、エンドサイトーシス小胞中の検出可能な分子から得られるエネルギーの放出を排除しないように、例えば、第一の画像におけるエネルギーの放出の平均強度（試験化合物または溶液に曝される前）に標準偏差の２倍または３倍を足したものに設定することができる。この閾値強度より大きいエネルギーの放出を識別し、定量することができる。エネルギーの放出を識別するために、関連する画素を、コンピュータメモリーを用いてタグ付けでき、またはコンピュータにより作成した画像において、画素を、特徴的な色、例えば、マゼンタに変化させることができる。画像は、閾値強度より大きい画素のものを識別（例えば、マゼンタにより）した後に、ビデオ画面に再表示することができる。閾値強度より大きい画素は、重み付けされた総計として定量されうる。
【００５７】
試験化合物または溶液に曝される前後に、閾値より大きい画素の数を比較することは、試験化合物または溶液が、アゴニストであるか、またはそれを含むかどうかを決定するために使用されうる。例えば、試験化合物または溶液が、アゴニストであるか、それを含む場合、アゴニストに曝された後の閾値より大きい画素の数は顕著に増大しうる。
【００５８】
本発明の自動化された方法は、ＧＰＣＲのアンタゴニストの活性について試験化合物および試験溶液をスクリーニングするためにも使用しうる。ＧＰＣＲを発現し、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との複合体を含有する１つまたはそれ以上の細胞を供する。その細胞の第一の画像を作成する検出の方法によって、細胞を走査する。
【００５９】
細胞を、試験化合物または試験溶液にさらし、さらに公知のアゴニストにさらす。さらに、細胞の第二の画像を作成する検出の方法によって、細胞を走査する。第一および第二の画像を第一および第二の組の画素として捕捉する、または第一および第二の組の画素に変換さることができる。第一および第二の設定の画素の強度を測定しうる。上に記載されたように、第一および第二の設定の画素の強度は、ＧＰＣＲ経路が活性化されたかどうかを決定するために使用することができる。例えば、試験化合物がアンタゴニストである場合、ＧＰＣＲ経路の活性化が遮断される。
【００６０】
試験化合物または溶液、およびアゴニストに曝す前後における、閾値より大きいシグナルの数の比較は、試験化合物または溶液が、アンタゴニストであるか、またはそれを含むかどうかを決定するために使用することができる。例えば、試験化合物または溶液が、アンタゴニストであるか、またはそれを含む場合、それによりアゴニスト、および試験化合物または溶液に曝される前後において、閾値より大きいエネルギーの放出の数は、アゴニストにより予測されるときの増加と異なり、適正に一定なままでありうる。
【００６１】
本発明は、限定するためのものでないことが意図される以下の例示の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６２】
［実施例：アゴニストに仲介されるバーＧＦＰの移転の測定］
アゴニストに仲介されるバーＧＦＰ（βａｒｒ−ＧＦＰ）キメラの、細胞質ゾルからエンドサイトーシス小胞への移転を、二重安定性細胞株（バーＧＦＰおよびＶ２Ｒに安定なもの）、例えば、HEK-293細胞またはCOS細胞を使用して研究した。これらの細胞に、Ｖ２Ｒ受容体およびバーＧＦＰ複合体のｃＤＮＡを含むプラスミドを形質導入させた。
【００６３】
ＧＦＰの蛍光を検出する共焦点顕微鏡を使用して、細胞を評価した（図３ａおよび３ｂ）。ザイツのレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM-510)を用い、単線の励起（４８８ｎｍ）を使用して、画像を順次撮影した。
【００６４】
アゴニストの不在下では、バーＧＦＰは、図３ａにおける均質なバーＧＦＰの蛍光によって示されるとおり、Ｖ２Ｒを発現する細胞の細胞質中に均等に分布して検出される。アルギニン・ベソプレシンの添加（ＡＶＰ、ミズーリー州セントルイスのシグマ・ケミカルズから得られる）により、細胞質から原形質膜の受容体へのバーＧＦＰの迅速な再局在化が促進された。アゴニストにさらに長期間さらすと（すなわち、３０分後）、バーＧＦＰは、エンドサイトーシス小胞に再局在化される（図３ｂ）。
【００６５】
共焦点顕微鏡画像の上部の図３ａおよび３ｂは、標準の感度で取られたが、エンドサイトーシス小胞に局在する検出可能な分子から放出される強いエネルギーは、検出器を飽和させた（すなわち、画素として捕捉された発光強度のプロットを取ることを試みた場合、その強度は、目盛りから外れた）。図４ａおよび４ｂは、それらが、エンドサイトーシス小胞に共局在するバーＧＦＰによって検出器が飽和するのを防止するために、感度を減少させて撮られたことを除き、それぞれ、図３ａおよび３ｂと同一である。図４ａおよび４ｂは、エンドサイトーシス小胞中にバーＧＦＰが集中することで、対照細胞の細胞質で観察される蛍光強度よりいっそう大きな蛍光強度を示すスポットが生じることを示す。
【００６６】
飽和していない画像（図４ａおよび４ｂでのもの）を使用して、エネルギーの放出を画素として捕捉した。データを分析するために、ウインドウズの3.0.6版用のコンピュータプログラムＩＰラボ(Scanalytics,Inc.、バージニア州フェアーファックス(Fairfax,VA))を使用した。格子を発生させながら、画素の位置および強度を描いた。対照細胞を使用して、画素数対画素強度の棒グラフを作成した。対照細胞中の画素の平均強度を計算し、標準偏差を計算した。
【００６７】
平均細胞強度に標準偏差の３倍を足したもの（＞９９パーセンタイル）として、閾値強度を計算した。対照と処理画像（それぞれ、図５Ａおよび５ｂ）の両方で、閾値より大きい強度を示す画素はマゼンタ色で示された。対照細胞は、非常に少量のマゼンタ色の画素を有した。対照的に、アゴニストで処理された細胞（処理細胞）は、多くのマゼンタ色の画素を有した。図５ｂの処理細胞におけるマゼンタ色の画素は、図４ｂにおけるエンドサイトーシス小胞を含むバーＧＦＰに密接に対応する。
【００６８】
対照細胞と処理細胞との両方で、閾値より大きい画素が集計された。図６は、対照細胞および処理細胞の両方における閾値より大きい画素を図示する。標識対照細胞を示す第一の曲線は、対照細胞を使用して求められた画素数対画素強度を示すグラフである。標識小胞を示す第二の曲線は、処理および対照細胞の両方において、閾値より大きい画素を示し、したがって、処理細胞での小胞に対応する。閾値を、対照細胞の平均細胞強度に標準偏差の３倍を足したもの（＞９９パーセンタイル）に設定した。
【００６９】
図７は、対照および処理細胞についての閾値強度より大きい画素の数のグラフである。処理細胞において閾値より大きい画素の数は、対照細胞のもののおよそ１２０倍である。このデータは、アゴニストを添加し、バーＧＦＰがエンドサイトーシス小胞に移転されたことを示すために使用されうる。
【００７０】
本発明の種々の修飾および改変が、本発明の範囲および概念から逸脱することなしに、当業者に明らかになる。これらのおよび他の代わりの実施の形態は、特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【００７１】
【表１Ａ】
【表２Ａ】
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、本発明による受容体活性を検出する方法の流れ図である。
【図２】図２は、本発明による受容体活性を検出する別の方法の流れ図である。
【図３】図３ａおよび３ｂは、バーＧＦＰ融合タンパク質とＶ２Ｒ（ＧＰＣＲ）とを安定に発現する細胞におけるバーＧＦＰ蛍光の共焦点顕微鏡画像である。 図３ａは、アゴニストにより処理する前（対照）である。 図３ｂは、３７℃において、アゴニストにより３０分間処理した後である。
【図４】図４ａおよび４ｂは、それらが、検出器が飽和するのを防止するために、検出器の感度を減少させて撮られたことを除き、図３ａおよび３ｂと同一である。
【図５】図５ａおよび５ｂは、明るく陰影を付けられた領域として現れている、閾値強度（ここで、＞９９パーセンタイル以内のものとして計算される）より大きい画素を有する、減少させた強度で取られた共焦点顕微鏡画像を示す。 図５ａは、対照群のものである。 図５ｂは、処理細胞のものである。
【図６】図６は、画素数対画素強度を表す棒グラフである。
【図７】図７は、対照および処理細胞において、閾値強度より大きい画素の数を表すグラフである。
Claims (21)
- Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法であって、
ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供するステップであって、該複数の複合タンパク質の各々が、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成され、該複数の複合タンパク質が、該少なくとも１個の細胞の細胞質内に実質的に均等に分布されるステップと、
前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの量を検出することによって前記少なくとも１個の細胞の第一の画像を得て、該エネルギーの量に対応する値を保存するステップと、
前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理するステップと、
前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの量を検出することによって前記少なくとも１個の細胞の第二の画像を得て、該エネルギーの量に対応する値を保存するステップと、
前記第一の画像および前記第二の画像を比較し、エンドサイトーシス小胞およびエンドソームの少なくとも１つにおける前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出するステップと
を含む方法。 - 前記少なくとも１個の細胞の第二の画像を得るステップが、前記細胞質に均等に分布した検出可能な分子から放出されるエネルギーが排除されるように、閾値強度を設定するステップを含む請求項１の方法。
- 前記閾値強度が、前記細胞質に均等に分布した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーをできるだけ排除し、エンドサイトーシス小胞中の前記検出可能な分子から放出されるエネルギーをできるだけ排除しないように設定される請求項２の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中で放出される全エネルギーの平均強度に標準偏差の２倍を足したものに設定される請求項２の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中で放出される全エネルギーの平均強度に標準偏差の３倍を足したものに設定される請求項２の方法。
- 前記試験化合物が、アゴニストである可能性があるもの、またはアンタゴニストである可能性があるものである請求項１の方法。
- Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法であって、
ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供するステップであって、該複数の複合タンパク質の各々が、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成され、該複数の複合タンパク質が、該少なくとも１個の細胞の細胞質内に実質的に均等に分布されるステップと、
前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって前記少なくとも１個の細胞の第一のデジタル画像を得るステップであって、該第一のデジタル画像が、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成され、それぞれの強度値が、該配列における画素の位置に対応した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づいているステップと、
前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理するステップと、
前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって前記少なくとも１個の細胞の第二の画像を得るステップであって、該第二のデジタル画像が、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成され、それぞれの強度値が、該配列における画素の位置に対応した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づいているステップと、
前記第一のデジタル画像および前記第二のデジタル画像を比較し、エンドサイトーシス小胞およびエンドソームの少なくとも１つにおける前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出するステップであって、前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在が、検出可能な分子から放出されるエネルギーの見掛けの強度の変化であって、前記複数の画素の少なくともいくつかの値を増加させる変化により検出されるステップと
を含む方法。 - Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法であって、
ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供するステップであって、該複数の複合タンパク質の各々が、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成され、該複数の複合タンパク質が、該少なくとも１個の細胞の細胞質内に実質的に均等に分布されるステップと、
前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理するステップと、
前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって前記少なくとも１個の細胞のデジタル画像を得るステップであって、該デジタル画像が、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成され、それぞれの強度値が、該配列における画素の位置に対応した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づいているステップと、
エンドサイトーシス小胞およびエンドソームの少なくとも１つにおける前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出するステップであって、前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在が、検出可能な分子から放出されるエネルギーの見掛けの強度の変化であって、閾値強度より大きい値を有する前記複数の画素の少なくともいくつかが生じる変化により検出されるステップと
を含む方法。 - 前記少なくとも１個の細胞のデジタルの画像を得るステップが、前記細胞質に均等に分布した検出可能な分子から放出されるエネルギーが排除されるように、閾値強度を設定するステップを含む請求項８の方法。
- 前記閾値強度が、前記細胞質に均等に分布した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーをできるだけ排除し、エンドサイトーシス小胞中の前記検出可能な分子から放出されるエネルギーをできるだけ排除しないように設定される請求項９の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中の検出可能な分子から放出される全エネルギーの平均強度に基づいて設定される請求項８の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中の検出可能な分子から放出される全エネルギーの平均強度に標準偏差の２倍を足したものに設定される請求項１１の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中の検出可能な分子から放出される全エネルギーの平均強度に標準偏差の３倍を足したものに設定される請求項１１の方法。
- 試験化合物が、アゴニストである可能性があるもの、またはアンタゴニストである可能性があるものである請求項８の方法。
- Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を検出する方法であって、
ＧＰＣＲを発現する少なくとも１個の細胞および複数の複合タンパク質を供するステップであって、該複数の複合タンパク質の各々が、アレスチンタンパク質と検出可能な分子とを複合化させることによって形成され、該複数の複合タンパク質が、該少なくとも１個の細胞の細胞質内に実質的に均等に分布されるステップと、
前記少なくとも１個の細胞を、試験化合物で処理するステップと、
前記検出可能な分子から放出されるエネルギーを検出および測定することによって前記少なくとも１個の細胞のデジタル画像を得るステップであって、該デジタル画像が、それぞれの強度値を各々有する複数の画素の配列から形成され、それぞれの強度値が、該配列における画素の位置に対応した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーの強度に基づいているステップと、
検出可能な分子から放出されるエネルギーの見掛けの強度における変化であって、閾値強度より大きい値を有する前記複数の画素の少なくともいくつかが生じる変化により前記複数の複合タンパク質の少なくともいくつかの局在を検出するステップと
を含む方法。 - 前記少なくとも１個の細胞のデジタル画像を得るステップが、前記細胞質に均等に分布した検出可能な分子から放出されるエネルギーが排除されるように、閾値強度を設定するステップを含む請求項１５の方法。
- 前記閾値強度が、前記細胞質に均等に分布した前記検出可能な分子から放出されるエネルギーをできるだけ排除し、エンドサイトーシス小胞中の前記検出可能な分子から放出されるエネルギーをできるだけ排除しないように設定される請求項１６の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中の検出可能な分子から放出される全エネルギーの平均強度に基づいて設定される請求項１５の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中の検出可能な分子から放出される全エネルギーの平均強度に標準偏差の２倍を足したものに設定される請求項１８の方法。
- 前記閾値強度が、対照細胞中の検出可能な分子から放出される全エネルギーの平均強度に標準偏差の３倍を足したものに設定される請求項１８の方法。
- 前記試験化合物が、アゴニストである可能性があるもの、またはアンタゴニストである可能性があるものである請求項１５の方法。
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