JP2004532619A - 細胞内シグナル伝達カスケードに関与する新規なヒト遺伝子ret16の同定およびクローニング - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、新規な完全長ヒトRET16遺伝子およびそのコードされたポリペプチド生成物(TNF刺激されたヒト肺微細血管内皮細胞で発現される)の同定およびクローニングに関する。本発明はさらに、RET16のオーソログ(orthologs)、およびRET16ポリヌクレオチド配列およびそのコードされた生成物の細胞内シグナル伝達カスケードにおける細胞シグナル伝達分子としての推定の役割に関する。本発明はまた、炎症および炎症性疾患、状態、または障害が関与する、および/または制御できない細胞の増殖、たとえば癌、腫瘍、新生物などが関与する治療剤および方法におけるRET16ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそのモデュレーターの使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
炎症性疾患の発生は、循環血球、たとえば白血球が内皮を通って組織中に浸潤することを特徴とする。この「ゲートウエイ(gateway)」機能を媒体する多くの重要な事象が内皮細胞で起こる。内皮細胞はレセプターやケモカインを発現し、これらレセプターやケモカインは白血球を順につなぎ、活性化させ、強固に付着させ、内皮細胞接合間に遊出させる。このプロセスは腫瘍壊死因子(TNF)などの初期炎症メディエーターの産生によって開始される。
【0003】
この一連のレセプターおよびケモカインの発現の協同(coordinated)刺激は、転写因子、キナーゼおよびスカフォードタンパク質を含む細胞内シグナル伝達分子によって媒体される。これらシグナル伝達分子はシグナル伝達カスケードを形成し、該カスケードは炎症プロセスの発生の「マスタースイッチ」である。NF−κBなどのこのカスケードの成員は知られている。TNF活性化内皮で差別的に発現される遺伝子の分析は、上記「マスタースイッチ」カスケードの成員の同定の手助けとなりうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、TNF−アルファ活性化ヒト内皮細胞で発現されるRET16遺伝子を提供するものであり、該遺伝子のコードされた産物は細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達分子として機能すると考えられる。細胞シグナル伝達カスケードにおいて役割を果たす分子は、炎症因子、たとえばサイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ロイコトリエンなどへの細胞応答に関与している。さらに、RET16は細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達タンパク質の候補として、様々な細胞増殖関連疾患または障害に関与していると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、RET16と称する新たに発見されたヒト遺伝子およびそのコードされた産物を提供するものであり、該RET16はTNF−アルファで刺激されたヒト微細血管内皮細胞で発現されることがわかった。本発明によれば、RET16は細胞シグナル伝達タンパク質としての機能を有する細胞質タンパク質である。
【0006】
本発明の一つの側面は、配列番号1に示すRET16ポリヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、配列番号1の相補鎖、または配列番号1の変異体を含むポリヌクレオチド配列をも提供する。さらに、本発明は、中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下で配列番号1のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列にも関する。
【0007】
本発明の他の側面は、配列番号1のポリヌクレオチドによってコードされ配列番号2のアミノ酸配列を有するRET16ポリペプチド、または機能性のまたは生物学的に活性なその部分を提供する。本発明に従い、単離され実質的に純粋なRET16タンパク質が提供される。
【0008】
本発明のさらなる側面は、ヒトRET16オープンリーディングフレームcDNAの単離したポリヌクレオチド配列(1532bp;配列番号3)および該オープンリーディングフレームヒトRET16によってコードされ配列番号4に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、または機能性のまたは生物学的に活性なその部分を提供する。単離した実質的に純粋なRET16タンパク質またはポリペプチド、たとえば配列番号4が提供される。また、本発明に従い、ベクター中にクローニングした1532bpのヒトRET16(RET16.1とも称する)オープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列を、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC;10801ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア20110−2209)にATCC受託番号PTA−3161にて2001年3月7日に寄託してある。クローニングしたRET16変異体cDNA、すなわちRET16.2およびRET16.3を含むベクターもまた、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC;10801ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア20110−2209)にATCC受託番号PTA−3161にて2001年3月7日に寄託してある。従って、本発明はATCC受託番号PTA−3161を含むRET16 cDNA核酸配列を提供する。
【0009】
本発明のさらなる側面は、配列番号3の相補鎖、またはその変異体を含むポリヌクレオチド配列を提供する。さらに、本発明は、中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下で配列番号3のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列にも関する。さらに、ヒトRET16の630bpの部分核酸配列(配列番号5)が提供される。
【0010】
本発明の他の側面は、RET16の変異体を提供する。本発明に従い、単離したRET16.2変異体ポリヌクレオチド(配列番号12)およびコードされたそのアミノ酸配列(配列番号13)が提供される。さらに、単離したRET16.3変異体ポリヌクレオチド(配列番号14)およびコードされたそのアミノ酸配列(配列番号15)が提供される。これら配列の部分または断片、好ましくは機能性のまたは生物学的に活性な部分または断片も提供される。
【0011】
本発明のさらなる特色は、ヒトRET16タンパク質のマウスおよびラットオーソログを提供する。本発明に従い、配列番号6はマウスRET16オーソログのポリヌクレオチド配列を示す。配列番号7は、配列番号6によってコードされるマウスRET16ポリペプチドオーソログのアミノ酸配列を示す。配列番号8はラットRET16オーソログの部分ポリヌクレオチド配列を示し、配列番号9は配列番号8によってコードされるラットRET16オーソログの部分ポリペプチド配列のアミノ酸配列を示す。
【0012】
本発明の他の特色は、好ましくはヒトRET16のRET16ポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはコードされたRET16ポリペプチド、またはその断片または部分を含む組成物を提供する。また、少なくとも1のRET16ポリペプチド、または機能的なその部分を含む医薬組成物であって、薬理学的に許容しうるビヒクル、たとえば担体、賦形剤、または希釈剤をも含む医薬組成物も本発明により提供される。
【0013】
本発明のさらなる側面は、コードされたRET16ポリペプチドのN末端、C末端または内部での欠失ポリペプチドおよびこれら欠失ポリペプチドを含む組成物を提供する。これら欠失ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。欠失ポリペプチドの免疫原および/または抗原性エピトープとしての使用は本明細書においてさらに記載する。
【0014】
本発明のさらなる側面は、RET16.1、RET16.2、RET16.3およびマウスRET16の結果として得られるコードされたポリペプチドに加えて、RET16.1、RET16.2、RET16.3および最初の開始コドンを欠くRET16マウスオーソログのポリヌクレオチド配列を提供する。さらに詳細には、配列番号1のヌクレオチド151〜1575に対応するポリヌクレオチド、および配列番号2のアミノ酸2〜476に対応するポリペプチドが提供される;配列番号12のヌクレオチド114〜1262に対応するポリヌクレオチド、および配列番号13のアミノ酸2〜384に対応するポリペプチドが提供される;配列番号14のヌクレオチド139〜1641に対応するポリヌクレオチド、および配列番号15のアミノ酸2〜502に対応するポリペプチドが提供される;および配列番号6のヌクレオチド19〜1443に対応するポリヌクレオチド、および配列番号7のアミノ酸2〜475に対応するポリペプチドが提供される。RET16.1、RET16.2、RET16.3およびマウスRET16コード配列を含む組換えベクター、およびここで記載のベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
【0015】
本発明の他の側面は、RET16核酸配列のアンチセンス、好ましくはヒトRET16核酸配列に対するアンチセンス、並びにRET16核酸分子またはアンチセンス分子のオリゴヌクレオチド、断片、または部分を提供する。ヒトRET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその部分または断片を含む発現ベクターおよび宿主細胞もまた提供される。
【0016】
本発明のさらに他の側面は、配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片の製造方法であって、工程(a)本発明によるヒトRET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも機能的な断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で培養し、ついで(b)該ポリペプチドを宿主細胞から回収することを含む方法を提供する。
【0017】
本発明のさらなる特色は、治療剤および診断剤として使用するための、RET16ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的に結合する抗体およびその結合フラグメントを提供する。
【0018】
本発明のさらに他の特色は、RET16ポリペプチド、好ましくはヒトRET16ポリペプチドに結合および/または変調する因子または分子、たとえばインヒビター、他の細胞内シグナル伝達分子およびアンタゴニストのスクリーニング方法、並びにモデュレーター、とりわけインヒビターおよびアンタゴニスト、とりわけ本明細書に記載のスクリーニング法によって得られるものを提供する。また、RET16と1またはそれ以上の他の細胞シグナル伝達タンパク質との相互作用、たとえば結合相互作用のインヒビターまたはアクチベーターのスクリーニング方法も提供される。
【0019】
本発明の他の側面は、本発明のRET16ポリペプチド、たとえば配列番号2、配列番号4、配列番号13、または配列番号15の実質的に精製したアンタゴニストまたはインヒビターを提供する。この点に関し、制限されない一例として、本発明のRET16ポリペプチドのアミノ酸配列、たとえば配列番号2、配列番号4、配列番号13、または配列番号15の全てまたは免疫原性および/または抗原性の部分を含むポリペプチドに結合する精製した抗体が提供される。
【0020】
本発明のさらに他の側面は、本発明のRET16ポリペプチド、たとえば配列番号2、配列番号4、配列番号13、または配列番号15の実質的に精製したアゴニストまたはアクチベーターを提供する。
【0021】
本発明の他の側面は、本明細書に記載の細胞シグナル伝達カスケードに関与するRET16ポリヌクレオチドおよびそのコードされたポリペプチドの発現に関連する障害または疾患の診断および/またはスクリーニングに使用するための、RET16核酸配列、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体を提供する(たとえば図9を参照)。
【0022】
本発明の他の側面は、RET16関連疾患の検出および/またはRET16関連疾患または障害の治療または処置への患者の応答のモニターのためのRET16プローブまたはプライマーを提供する。プローブまたはプライマーの配列は、本明細書に記載のRET16の核酸配列またはアミノ酸配列を含む。
【0023】
本発明の他の特色は、本明細書に記載のRET16ポリヌクレオチドおよびそのコードされたポリペプチドの異所性または制御されない細胞発現と関連する障害のスクリーニングおよび診断用キットを提供する。そのようなキットは、ヒトRET16アレルのヌクレオチド配列の決定に用いることができる。キットは、増幅ベースのアッセイ、核酸プローブアッセイ、タンパク質核酸プローブアッセイ、抗体アッセイ、またはこれらアッセイの組み合わせの試薬および指示を含んでいてよい。
【0024】
他の側面において本発明は、生物学的試料中のRET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法であって、工程(a)配列番号2または配列番号4をコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖を生物学的試料中の核酸物質にハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を生成させ、ついで(b)該ハイブリダイゼーション複合体を検出することを含み、その際、該複合体の存在が生物学的試料中のRET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関することを特徴とする方法を提供する。核酸物質は、ハイブリダイゼーションの前に複製連鎖反応によってさらに増幅することができる。
【0025】
本発明のさらに他の側面は、本明細書にさらに記載する種々のRET16関連疾患、障害、または状態の遺伝的素因、罹病性および/または処置または治療への応答の検出方法を提供する。
【0026】
本発明のさらなる側面、特色および利点は、発明の詳細な説明を読み、添付の図面と関連させて考慮したときに一層よく理解されるであろう。
【0027】
本発明を種々の側面でより完全に記載するため、以下の定義を提供する。これら定義は手引きおよび解明に有用であることを意図したものであって、開示した本発明およびその態様を限定することを意図するものではない。
【0028】
定義
RET16ポリペプチド(またはタンパク質)とは、単離し、好ましくは実質的に精製したRET16タンパク質のアミノ酸配列をいい、本発明に従ってヒトcDNAライブラリー源から単離されるが、あらゆる種、好ましくは哺乳動物(マウス、ラット、非ヒト霊長類を含む)、最も好ましくはヒトから、および様々な採取源(天然、合成、半合成、または組換えを含む)から得ることができる。実際、本発明は、さらに詳細には、(i)完全長のヒトRET16転写物のヒトRET16ポリヌクレオチド配列(配列番号1)およびコードされたヒトRET16ポリペプチド配列(配列番号2)(図1〜3);(ii)ヒトRET16オープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列(配列番号3)およびコードされたヒトRET16ポリペプチド配列(配列番号4);(iii)マウスRET16ポリヌクレオチド配列(配列番号6)およびコードされたマウスRET16アミノ酸配列(配列番号7)(図5および6)および;(iv)ラットRET16オーソログの部分核酸配列(配列番号8)およびコードされたラットRET16アミノ酸配列(配列番号9)(図13〜14)を提供する。本明細書に記載したRET16ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの機能性の断片および部分もまた本発明に包含される。
【0029】
アゴニスト(たとえば、アクチベーター)とは、RET16ポリペプチドまたは機能性のその断片に結合したときに、RET16ポリペプチドの作用を増大または作用の持続を延ばす分子をいう。アゴニストとしては、RET16ポリペプチドに結合してその作用を変調するタンパク質、核酸、炭水化物その他の分子が挙げられる。アンタゴニスト(たとえば、インヒビター)とは、RET16ポリペプチドまたは機能性のその断片に結合したときに、RET16ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性の量または作用の持続を低減または排除する分子をいう。アンタゴニストとしては、RET16ポリペプチドの作用および/または機能を低減、低下または排除するタンパク質、核酸、炭水化物、抗体その他の分子が挙げられる。
【0030】
本明細書において「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド(たとえば、cDNA、DNA、RNA)、およびその断片または部分、およびゲノムまたは合成由来のDNAまたはRNAをいい、一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表す。制限されない例として、断片としては、長さが約10〜60ヌクレオチドよりも長い、好ましくは約20〜60ヌクレオチドである核酸配列が挙げられ、好ましくは少なくとも70〜100ヌクレオチドである断片が挙げられ、これはまた長さが少なくとも1000ヌクレオチドまたはそれ以上であってもよい。プローブまたはプライマーとして使用する核酸は、本明細書に記載のものと長さが異なっていてよい。
【0031】
同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、その断片または部分をいい、天然または合成分子をいう。アミノ酸配列断片は、一般に長さが約4または5〜約35、好ましくは約5〜約15または25アミノ酸であり、最適にはRET16ポリペプチドの生物学的活性または機能を保持している。しかしながら、目的に応じて一層大きなアミノ酸断片、たとえば約15〜約50または60アミノ酸の断片を使用可能であることが理解されるであろう。
【0032】
本明細書において天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に対して「アミノ酸配列」という場合、「アミノ酸配列」などの術語、たとえば「ポリペプチド」や「タンパク質」は、該アミノ酸配列を指称したタンパク質分子に関係する完全で天然のアミノ酸配列に限定することを意図するものではない。さらに、RET16ポリペプチドおよびRET16タンパク質なる術語は、本発明のRET16核酸配列のコードされた生成物をいうものとして、しばしば相互に交換可能に用いられる。
【0033】
RET16ポリペプチドの変異体は、1またはそれ以上のアミノ酸が変化したアミノ酸配列をいう。変異体は「保存された」変化を有していてよく、その場合はたとえばロイシンをイソロイシンで置換する場合のように置換されるアミノ酸は類似の構造的または化学的特性を有する。より稀には、変異体は「保存されない」変化、たとえばグリシンのトリプトファンによる置換を有していてよい。より少ない変異としては、アミノ酸欠失または挿入、およびその両者が挙げられる。機能的な生物学的または免疫学的活性を損なうことなくどのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失できるかを決定する手引きは、当該技術分野でよく知られたコンピュータープログラム、たとえばDNASTARソフトウエアを用いて見出すことができる。
【0034】
アレルまたはアレル配列は、RET16核酸配列の別の形態である。アレルは、核酸配列中の少なくとも1の変異の結果生じ、変化したmRNAまたはポリペプチド(その構造または機能は変化しているかまたは変化していない)を生成する。天然のものか組換えのものかに拘わらず、いかなる遺伝子もアレル形を有しないか、または1または多くのアレル形を有し得る。アレルに生じる一般的な変異による変化は、一般にヌクレオチドの天然の欠失、付加または置換に帰する。これら変化の各々は、所定の配列において単独で、または他の変化とともに、1回またはそれ以上生じる。
【0035】
RET16ポリペプチドをコードする変化した核酸配列は、同じまたは機能的に同等のRET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドという結果となる異なるヌクレオチドの欠失、挿入および/または置換を含む核酸配列を包含する。変化した核酸配列はさらに、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの多型を包含する;そのような多型は、特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出することができてもよいしまたは検出できなくともよい。コードされたタンパク質はまた、サイレントな変化を生成し、本発明の機能的に同等のRET16タンパク質という結果となるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含んでいてよい。RET16タンパク質の生物学的活性または機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、ハイドロフォビシティー、ハイドロフィリシティー、および/または両親媒性の性質の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行うことができる。たとえば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリシンおよびアルギニンが含まれ、類似のハイドロフィリシティー値を有する非電荷の極性頭部基を有するアミノ酸にはロイシン、イソロイシンおよびバリン;グリシンおよびアラニン;アスパラギンおよびグルタミン;セリンおよびトレオニン;およびフェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【0036】
「ペプチド核酸」(PNA)とは、アミノ酸残基のペプチド骨格(リシンで終わる)に連結したオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)を含むアンチセンス分子またはアンチジーン因子(anti-gene agent)をいう。PNAは一般に、アミノ酸残基に連結した少なくとも5ヌクレオチドのオリゴを含む。これら小さな分子は、核酸の相補鎖に結合することによって転写の伸長を停止させる(P. E. Nielsenら、1993, Anticancer Drug Des., 8: 53-63)。PNAは、ポリエチレングリコール処理して(pegylated)細胞内での寿命を延ばすことができ、該細胞で相補的な一本鎖DNAおよびRNAに優先的に結合する。
【0037】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー(「オリゴ」)とは、典型的に少なくとも約6ヌクレオチドから約60ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約8〜10ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが少なくとも約12ヌクレオチド、たとえば約15〜35ヌクレオチド、または約15〜25ヌクレオチド、または約20〜35ヌクレオチドの連続したヌクレオチドを好ましくは含む核酸配列をいい、典型的にたとえばPCR増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたはマイクロアレイにおいてプローブまたはプライマーとして用いることができる。オリゴヌクレオチドなる語は、当該技術分野で一般に定義されるプライマー、プローブまたはアンプリマーなる語と実質的に同等であることが理解されるであろう。また、より長いオリゴヌクレオチドプローブ、またはプローブの混合物、たとえば縮重プローブを、より長く一層複雑な核酸配列、たとえばゲノムDNAを検出するのに用いることができることも当業者には理解されるであろう。そのような場合、プローブは少なくとも20〜200ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30〜100ヌクレオチド、さらに好ましくは50〜100ヌクレオチドを含んでいてよい。
【0038】
増幅とは核酸配列のさらなるコピーの産生をいい、一般に複製連鎖反応(PCR)法を用いて行うことができる。PCR法は当該技術分野でよく知られている(D. W. DieffenbachおよびG. S. Dveksler, 1995, PCR Primer, a Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、プレインビュー、ニューヨークを参照)。
【0039】
マイクロアレイは、基体上、たとえば紙、ナイロン、または他のタイプのメンブレン;フィルター;チップ;ガラススライド;または他のタイプの適当な固体支持体上に合成した別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアレイである。
【0040】
アンチセンスとは、特定のDNAまたはRNA配列に相補的なヌクレオチド配列および核酸配列を含む組成物をいう。「アンチセンス鎖」なる語は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖を参照する際に用いる。アンチセンス(すなわち相補的な)核酸分子としてはPNAが挙げられ、合成および転写を含むいかなる方法によっても製造することができる。細胞内に導入されると、相補的なヌクレオチドは細胞によって産生された天然の配列に結合して二本鎖を形成し、これが転写かまたは翻訳のいずれかを妨害する。「マイナス」の表示がアンチセンス鎖を参照して時々用いられ、「プラス」はセンス鎖を参照して時々用いられる。
【0041】
コンセンサスとは、一連の関連するDNA、RNA、またはタンパク質の配列の各位置での塩基またはアミノ酸の最も共通した選択を反映する配列をいう。特に良好な一致を示す領域は、しばしば保存された機能性のドメインを表している。
【0042】
欠失とは、ヌクレオチド配列かまたはアミノ酸配列のいずれかにおける変化をいい、1またはそれ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の不在という結果となるものをいう。対照的に、挿入(「付加」ともいう)とは、天然分子と比較して1またはそれ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の付加という結果となるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化をいう。置換とは、1またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置き換えをいう。
【0043】
誘導体核酸分子とは、コードされたRET16ポリペプチドをコードするまたはコードされたRET16ポリペプチドに相補的な核酸の化学的修飾をいう。そのような修飾としては、たとえば、水素原子のアルキル、アシル、またはアミノ基による置換が挙げられる。核酸誘導体は、天然分子の必須の生物学的および/または機能的な特徴を保持したポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレングリコール処理(pegylation)、またはそれが由来するポリペプチドの生物学的および/または機能的または免疫学的活性を保持する同様のプロセスによって修飾したものである。
【0044】
「生物学的に活性な」(すなわち機能性の)とは、天然分子の構造的、制御的、または生化学的な機能を有するタンパク質またはポリペプチドまたはそのペプチド断片をいう。同様に、「免疫学的に活性な」とは、天然、組換えまたは合成のRET16またはそのオリゴペプチドが適当な動物または細胞において特異的な免疫応答を引き起こす能力、たとえば抗体を産生させ、特定の抗体に結合する能力をいう。
【0045】
ハイブリダイゼーションとは、核酸の鎖が相補鎖に塩基対形成により結合するプロセスをいう。
【0046】
「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的なGおよびC塩基間および相補的なAおよびT塩基間の水素結合の形成により2つの核酸配列間で生成する複合体をいう。水素結合は塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化することができる。2つの相補的な核酸配列は、逆平行の立体配置で水素結合を形成する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成することができ(たとえば、C0tまたはR0t分析)、または溶液に存在する一方の核酸配列と固体支持体(たとえば、メンブレン、フィルター、チップ、ピン、またはガラススライド、または細胞またはその核酸を付着した他の適当な基体)上に固定化した他方の核酸配列との間で形成することができる。
【0047】
ストリンジェンシーまたはストリンジェントな条件とは、核酸組成、塩および温度によって定められるハイブリダイゼーションの条件をいう。これら条件は当該技術分野でよく知られており、試料中の同一または関連するポリヌクレオチド配列を同定および/または検出すべく変更することができる。低い、中くらいまたは高いストリンジェンシーを含む様々な等価な条件は、配列の長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)、反応環境(溶液中または固相基体上に固定化)、標的核酸の性質(DNA、RNA、塩基組成)、塩の濃度および他の反応成分(たとえば、ホルムアミド、デキストラン硫酸および/またはポリエチレングリコール)の存在または不在および反応温度(プローブの融解温度より約5℃低い温度から融解温度より約20℃〜25℃低い温度の範囲内)などの因子に依存する。1またはそれ以上の因子を変化させることにより、以前の条件とは異なるが同等の条件(低いかまたは高いストリンジェンシー)を生成することができる。
【0048】
当業者には理解されるであろうように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは同一または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更することができる。熟練した実施者によってさらに評価されるであろうように、Tmは幾つかのパラメータ、たとえばハイブリッドまたはプローブのヌクレオチド数の長さ、またはハイブリダイゼーション緩衝液の成分および条件などに依存して、当該技術分野で知られた等式により近似することができる(たとえば、T. Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1982およびJ. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989;Current Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、Vol. 1, “Preparation and Analysis of DNA”、John Wiley and Sons, Inc., 1994-1995、補遺26,29,35および42;pp. 2.10.7-2.10.16;G. M. WahlおよびS. L. Berger(1987; Methods Enzymol. 152: 399-407);およびA. R. Kimmel, 1987; Methods of Enzymol. 152: 507-511を参照)。一般的な手引きとして、Tmは配列ホモロジーが1%下がる毎に約1℃〜1.5℃下がる。また、一般にハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は最初は低いストリンジェンシーの条件下で行い、ついで異なる、しかしより高いストリンジェンシーで洗浄する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、たとえば高い、中くらい、または低いストリンジェンシーへの言及は、一般にそのような洗浄条件に関する。
【0049】
それゆえ、制限されない例として、高いストリンジェンシーとは、0.018M NaCl中、約65℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう(すなわち、ハイブリッドが0.018M NaCl中、約65℃で安定でないなら、それは高いストリンジェンシー条件下で安定ではないであろう)。高いストリンジェンシー条件は、たとえば、50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE(食塩水 リン酸ナトリウム EDTA)(1×SSPE緩衝液は0.15M NaCl、10mM Na2HPO4、1mM EDTAを含む)、(または150mM NaCl、15mMクエン酸Na3・2H2O、pH7.0を含む1×SSC緩衝液)、0.2%SDS中、約42℃でハイブリダイゼーションし、ついで1×SSPE(または食塩水 クエン酸ナトリウム、SSC)および0.1%SDS中、少なくとも約42℃、好ましくは約55℃、さらに好ましくは約65℃の温度にて洗浄することにより提供することができる。
【0050】
中くらいのストリンジェンシー条件とは、制限されない例として、50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE(またはSSC)、0.2%SDS中、42℃(から約50℃)でハイブリダイゼーションすることができ、ついで0.2×SSPE(またはSSC)および0.2%SDS中、少なくとも約42℃、好ましくは約55℃、さらに好ましくは約65℃の温度にて洗浄することのできる条件をいう。
【0051】
低いストリンジェンシー条件とは、制限されない例として、10%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、6×SSPE(またはSSC)、0.2%SDS中、42℃でハイブリダイゼーションすることができ、ついで1×SSPE(またはSSC)および0.2%SDS中、少なくとも約45℃、好ましくは約50℃の温度にて洗浄することのできる条件をいう。
【0052】
さらなるストリンジェンシー条件についてはT. Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1982)を参照のこと。低い、中くらいおよび高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション/洗浄条件は、熟練した実施者によく知られ実施されている種々の成分、緩衝液および温度を用いて変えることができることが理解されなければならない。
【0053】
相補的なまたは相補性とは、許容される塩および温度の条件下での塩基形成によるポリヌクレオチドの天然の結合をいう。たとえば、配列「A−G−T」は相補的配列「T−C−A」に結合する。2つの一本鎖分子間での相補性は「部分的」であってよく、その場合は核酸の一部のみが結合し、あるいは一本鎖間に全体にわたる相補性が存在するときには相補性は完全なものである。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間でのハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意の影響を及ぼす。このことは、PNA分子のデザインおよび使用の場合と同様、増幅反応(核酸鎖間の結合に依存する)において特に重要である。
【0054】
ホモロジーとは相補性の程度をいう。部分的な配列ホモロジーまたは完全なホモロジーがあり、完全なホモロジーは同一性、たとえば100%同一性と同等である。同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する部分的に相補的な配列は、機能的な用語「実質的に相同な」を用いて表す。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低いストリンジェンシー条件下、ハイブリダイゼーションアッセイ(たとえば、サザーンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど)を用いて調べることができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低いストリンジェンシー条件下、完全に相同な配列またはプローブの標的配列への結合(すなわち、ハイブリダイゼーション)と競合または抑制するであろう。にも拘わらず、低いストリンジェンシーの条件は非特異的な結合を可能にはしない;低いストリンジェンシー条件では、2つの配列の結合が互いに特異的な(すなわち、選択的な)相互反応である必要がある。非特異的な結合の欠如は、相補性の部分的な程度さえも欠いている(たとえば、約30%未満の同一性)第二の標的配列を用いることによって試験することができる。非特異的な結合の不在下、プローブは第二の非相補的な標的配列にハイブリダイズしないであろう。
【0055】
当業者であれば、当該技術分野で知られているにように、たとえばCLUSTALWコンピュータープログラム(J. D. Thompsonら、1994, Nucleic Acids Research, 2(22): 4673-4680)またはFASTDB(Brutlagら、1990, Comp. App. Biosci., 6: 237-245)に基づくものなどのアルゴリズムを用いて配列間のパーセント同一性を決定する方法を知っているであろう。FASTDBアルゴリズムは典型的にその計算において配列の内部のマッチングしない欠失または付加(すなわち、ギャップ)を考慮していないが、このことは%同一性を過度に評価するのを避けるべく人為的に補正することができる。しかしながら、CLUSTALWはその同一性の計算においてギャップを考慮に入れている。
【0056】
BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズム(Altschulら、1977, Nuc. Acids Res., 25: 3389-3402およびAltschulら、1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410)もまた当業者に利用できる。核酸配列用のBLASTNプログラムは、デフォールトとしてワードレンクス(wordlength;W)11、エクスペクテーション(expectation;E)10、M=5、N=4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォールトとしてワードレンクス(W)3、およびエクスペクテーション(E)10を使用する。BLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 10915)は、アラインメント(B)50、エクスペクテーション(E)10、M=5、N=4、および両鎖の比較を使用する。
【0057】
所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物とは、広く該所定のポリヌクレオチド配列を含むあらゆる組成物をいう。組成物は乾燥した調合物または水性の溶液を包含する。RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列(配列番号1または配列番号3)またはその断片を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとしてまたはプライマーとして用いることができる。プローブおよびプライマーは凍結乾燥した形態で貯蔵することができ、炭水化物などの安定化剤と混合することができる。ハイブリダイゼーションではプローブは、塩(たとえば、NaCl)、界面活性剤(たとえば、SDS)および他の成分(たとえば、デンハルト溶液、粉乳、サケ精子DNAなど)を含む水溶液中で用いることができる。
【0058】
「実質的に精製した」とは、核酸配列またはアミノ酸配列をその天然環境から種々の手段により除去、すなわち単離または分離し、天然の状態では結合していた他の成分を少なくとも60%含まない、好ましくは75%〜85%含まない、最も好ましくは90%またはそれ以上含まないことをいう。
【0059】
試料または生物学的試料の語は、その最も広義で解釈されることを意図する。RET16タンパク質をコードする核酸またはその断片、またはRET16タンパク質自体を含むと思われる生物学的試料としては、体液、細胞または組織からの抽出物、細胞から単離した染色体(たとえば、中期染色体のスプレッド(spread))、オルガネラ、または細胞から単離した膜、細胞、ゲノムDNA(溶液中のもの、またはサザーン分析のように固相支持体に結合したもの)、RNA(溶液中のもの、またはノーザン分析のように固相支持体に結合したもの)、cDNA(溶液中のもの、または固相支持体に結合したもの)などの核酸、組織、組織プリントなどが挙げられる。
【0060】
形質転換とは、外来DNAがレシピエント細胞に入り変化させるプロセスをいう。形質転換は、当該技術分野でよく知られた種々の方法を用いて天然または人為的な条件下で行うことができる。形質転換は、異種核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する既知の方法に依存して行うことができる。この方法は、形質転換すべき宿主細胞の種類に基づいて選択し、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクチン、および部分衝撃(partial bombardment)が挙げられるが、これらに限られるものではない。そのような「形質転換した」細胞には、挿入DNAが自己複製プラスミドとしてかまたは宿主染色体の一部として複製できる安定に形質転換した細胞が含まれる。形質転換した細胞にはまた、挿入DNAまたはRNAを限られた期間のみ一過性に発現する細胞も含まれる。
【0061】
「ミメチック」とは、その構造をRET16タンパク質またはその部分の構造に関する知見に基づいて開発した分子をいい、そのようなものとしてRET16タンパク質の作用の一部または全てを奏することができる。
【0062】
タンパク質に関連して「部分」(「所定のタンパク質の部分」のように)とは、該タンパク質の断片またはセグメント、たとえばペプチドをいう。断片は、サイズが4または5アミノ酸残基のものから全体のアミノ酸配列から1のアミノ酸を差し引いたものまでの範囲にわたる。それゆえ、「配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列の少なくとも部分を含む」タンパク質は、完全長のRET16ポリペプチド、および完全長のRET16の断片またはセグメントを包含する。
【0063】
抗体とは、完全な分子並びにエピトープまたは抗原決定基に結合することのできるFab、F(ab')2、Fvなどのフラグメントをいう。RET16ポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチド、または目的とする小さなペプチドを含むまたは免疫用抗原として組換えにより調製した断片を用いて調製することができる。動物の免疫に使用するポリペプチドまたはオリゴペプチドは、RNAの転移(transition)から得るかまたは化学的に合成することができ、所望なら担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。ペプチドに化学的に結合させるために一般に使用される担体としては、ウシ血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、およびチログロブリンが挙げられる。ついで、結合したペプチドを用いて動物(たとえば、マウス、ラット、またはウサギ)を免疫する。
【0064】
「ヒト化」抗体とは、ヒト抗体に一層近似させるために非抗原結合領域のアミノ酸を置換しながら元々の抗原結合能は保持している抗体分子をいい、たとえばC. L. Queenらの米国特許第5,585,089号に記載されている。
【0065】
抗原決定基とは、特定の抗体と接触する分子の部分(すなわち、エピトープ)をいう。タンパク質またはタンパク質の断片を用いて宿主動物を免疫する場合、該タンパク質の多くの領域が該タンパク質上の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発することができる;これら領域または構造を抗原決定基という。抗原決定基は、抗体への結合に対して完全な抗原(すなわち、免疫応答を誘発するのに用いた免疫原)と競合することができる。
【0066】
「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質またはペプチドと結合性分子、たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、または抗体との相互作用をいう。相互作用は、結合性分子によって認識されるタンパク質の特定の構造(たとえば、抗原決定基またはエピトープ、または構造的な決定基)の存在に依存する。たとえば、抗体がエピトープ「A」に特異的であるなら、標識した「A」および該抗体を含む反応液中のエピトープA(または遊離の非標識のA)を含むタンパク質の存在は、標識したAの該抗体への結合を低減させるであろう。
【0067】
「ポリヌクレオチドの発現と相関関係がある」とは、配列番号1または配列番号2と類似のリボ核酸の存在のノーザン分析による検出が、試料中のRET16ポリペプチドをコードするmRNAの存在を示し、それによって該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関関係があることをいう。
【0068】
配列番号1または配列番号2のポリヌクレオチドにおける変更には、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列におけるあらゆる変更が含まれ、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出できる欠失、挿入、および点変異が含まれる。この定義に含まれるのは、RET16ポリペプチドをコードするゲノムDNAの変更の検出(たとえば、配列番号1または配列番号3にハイブリダイズすることのできる制限断片長多型のパターンの変化により)、配列番号1または配列番号3の選択した断片がゲノムDNAの試料にハイブリダイズできないこと(たとえば、アレル特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用い)、およびRET16タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座へのハイブリダイゼーションのような不適切または予期しないハイブリダイゼーション(たとえば、中期染色体スプレッドへの蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)を用い)である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0069】
本発明は、RET16ポリヌクレオチドおよびコードしたポリペプチドに関する。特に本明細書で記載しているのはRET16(本明細書ではRET16.1ともいう)および変異体RET16.2およびRET16.3である。「RET16」との言及はすべて、特に断らない限り、RET16(RET16.1)、RET16.2およびRET16.3に適用されるものとする。
【0070】
本明細書に記載する新規なRET16遺伝子は、TNF刺激したヒト肺微細血管内皮細胞で発現され、アップレギュレーションされることがわかった。本発明に従い、TNF刺激したヒト肺微細血管内皮細胞で発現されたRNAを分析して、細胞制御事象に関与すると思われる遺伝子産物を同定した。静止細胞をTNF−アルファで1時間刺激し、該細胞からRNAを単離した。単離したRNAから、当業者に知られ用いられている常法を用いて相補的DNA(cDNA)を製造した。微細血管内皮細胞をTNF−アルファで刺激した後にアップレギュレーションされたcDNAを、サブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて同定した(実施例1参照)。このアプローチで同定したポリヌクレオチドcDNAを、以下に記載するようにシグナル伝達カスケードでの可能な役割について評価した。
【0071】
従って、本明細書に記載のRET16遺伝子の役割をアンチセンス戦略を用いて特徴付けた(実施例5および6参照)。この目的のため、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、TNF−アルファで刺激した。RET16 RNAを抑制できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNA発現を妨害できるオリゴを選択すべく評価した。最も活性なRET16遺伝子アンチセンスは、下記配列:
UGCACAUGCCGCCAAGGAGCCAUCU(配列番号16)
を有する11587オリゴであることがわかった。この11587オリゴはトランスフェクションした細胞の表面上のE−セレクチンタンパク質のアップレギュレーションを抑制したので、RET16の細胞シグナル伝達カスケードでの役割が示唆された(実施例6および図9)。RET16遺伝子のRNAレベルの低減は、細胞内でのRET16タンパク質レベルを低減させると推定される。それゆえ、細胞内でのRET16タンパク質レベルの低減はTNF−アルファシグナル伝達カスケードを妨害でき、細胞表面でのE−セレクチンの発現の低減という結果となった。
【0072】
実施例6に記載し、図9に示すように、RET16ポリヌクレオチドに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドはTNF−刺激したHMVEC細胞でのE−セレクチン発現の有意の抑制という結果となった。これら結果は、RET16が直接かまたは間接的にE−セレクチン発現を少なくとも変調していることを意味している。好ましくは、これら結果は、RET16がE−セレクチン(多くの炎症性疾患と関連していることが当該技術分野で知られている)の正のモデュレーターを表していることを示している。それゆえ、以下にさらに検討するように、RET16のアンタゴニストは炎症性疾患の治療、予防、および/または改善に有用である。
【0073】
さらに、本発明に従えば、RET16に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドはまたV−cam発現の抑制という結果となった。これら結果は、RET16が直接かまたは間接的にV−cam発現を少なくとも変調していることを意味している。好ましくは、これら結果は、RET16がV−camの正のモデュレーターを表していることを示している。
【0074】
E−セレクチンは炎症状態の正のマーカーを表しており(D. J. Lefer, 2000, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 40: 283-94; A. BlannおよびM. Seigneur, 1997, Clin. Hemorheol. Microcirc., 17(1): 3-11)、種々の細胞および組織細胞型の細胞外膜上で発現されるE−セレクチンが増大している。この関係は、血管内皮細胞上で循環白血球の細胞ローリング(rolling)を変調するうえで果たしているE−セレクチンの役割によって媒体される。可溶形態のE−セレクチンおよびV−camの発現もまた、炎症性疾患と関係している(A. J. GearingおよびW. Newman, 1993, Immunol. Today, 14(10): 506-12)。最近の研究は、E−セレクチンおよびV−camの発現が喘息の発症、特に重篤な喘息の発症と関係することを示している(A. Hamzaouiら、2001, Am. J. Inflamm., 10(6): 339-42)。
【0075】
さらに、E−セレクチンは若年性特発性関節炎の発症と関係していることが示されている(C. Y. Chenら、2002, Ann. Rheum. Dis., 61(2): 167-70)。E−セレクチンはまた、腫瘍細胞の造血性転移の発生と関係付けられている(K. Itoら、2001, J. Gastroenterol., 36(12): 823-9);E−セレクチンは、高インスリン血症および2型糖尿病の発症と関係付けられている(B. R. Winkelmannら、2001, Curr. Med. Res. Opin., 17(2): 132-4;およびG. Targherら、2001, Diabetes Care, 24(11): 1961-6);E−セレクチンは、アテローム性動脈硬化症および心血管性疾患と関係付けられている(E. Demerathら、2001, Ann. Hum. Biol., 28(6): 664-78);E−セレクチンおよびV−camは、一般におよび特に結腸癌の腫瘍の進行および転移と関係付けられている(D. Alexiouら、2001, Eur. J. Cancer, 37(18): 2392-7);E−セレクチンは、ヴェーゲナー肉芽腫症の発症と関係付けられている(N. Ohtaら、2001, Auris. Nasus. Larynx., 28(4): 311-4);E−セレクチンおよびV−camは、幹細胞移植の合併症の発症と関係付けられている(Y. Matsudaら、2001, Bone Marrow Transplant., 27(9): 977-82);E−セレクチンおよびV−camは、サラセミアの発症と関係付けられている(D. S. Kyriakouら、2001, Ann. Hematol., 80(10): 577-83);E−セレクチンは、アテローム性動脈硬化症の発症と関係付けられている(C. M. Ballantyne, 2001, Clin. Cardiol., 24(8補遺): III 13-7);E−セレクチンは、自己免疫疾患の発症と関係付けられている(R. W. McMurray, 1996, Semin. Arthritis. Rheum., 25(4): 215-33);E−セレクチンは、アテローム性動脈硬化症、虚血−再潅流障害、急性肺障害、慢性関節リウマチ、および移植拒絶の発症と関係付けられている(M. P. Bevilacquaら、1994, Ann. Rev. Med., 45: 361-78);およびE−セレクチンは、アレルギー性炎症の発症と関係付けられている(C. H. Smithら、1993, Am. Rev. Respir. Dis., 148(6 Pt2): S75-8)。それゆえ、RET16ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、RET16の断片またはアンタゴニストも含めて、上記障害の治療、予防、および/または改善に有用である。
【0076】
E−セレクチンの多型形態もまた幾つかの疾患および障害と関係付けられている。たとえば、A561C E−セレクチン多型は、全身性エリテマトーデスと関係付けられている(Magadmiら、2001, J. Rheumatol., 28(12): 2650-2);E−セレクチンS128R多型は、冠状動脈石灰化と関係付けられている(D. L. Ellsworthら、2001, J. Mol. Med., 79(7): 390-8);およびさらなるE−セレクチン多型が、虚血性心疾患の発症と関係付けられている(F. Andreottiら、2002, Heart., 87(2): 107-12)。それゆえ、RET16ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、RET16の断片またはアンタゴニストも含めて、上記障害の治療、予防、および/または改善に有用である。
【0077】
本発明は、その態様の一つにおいて、図2および3に示す配列番号2のアミノ酸配列または図4Bに示す配列番号4のアミノ酸配列を含むヒトRET16ポリペプチドに関する。RET16ポリペプチド産物は長さが476アミノ酸である(配列番号2、図2)。ヒトRET16ポリペプチドは、図10Eに示すようにPodospora anserina Het−e−1タンパク質の部分と31%の同一性、およびThermomonospora curvata PKWAタンパク質の部分と33%の同一性を有する。さらに、本明細書に記載するようにヒトRET16の完全長マウスオーソログおよび部分ラットオーソログが同定された。たとえば、図5および6は、それぞれマウスRET16オーソログ核酸配列(配列番号6)およびコードされたアミノ酸配列(配列番号7)を示す。図13は部分ラットRET16オーソログの核酸配列(配列番号8)を示し、図14は部分ラットRET16オーソログのコードされたアミノ酸配列(配列番号9)を示す。
【0078】
RET16アミノ酸配列は、SEQWEB GCGにおいてMOTIFSプログラムを用いて他の既知のタンパク質と共通する幾つかの配列モチーフを含んでいることがわかった。MOTIFSは、PROSITEディクショナリーに記載されている規則的な発現パターンについてタンパク質配列を探索することによってタンパク質モチーフを調べる。RET16は、アミノ酸位置150、365、460に3つの潜在的なアスパラギングリコシル化部位を含んでいる。さらに、RET16アミノ酸配列は、潜在的な環状アデノシン一リン酸(アミノ酸441および442)、カゼインキナーゼII(アミノ酸7、38、136、159、164、184、194、268、333、および370)、およびプロテインキナーゼC(アミノ酸33、38、128、136、175、439、462)リン酸化部位を含んでいる。
【0079】
RET16アミノ酸配列を用い、他のタンパク質ドメインについてPFAM−HMMデータベースを探索した。PFAM−HMMデータベースはタンパク質ファミリーおよびドメインのコレクションであり、多彩なタンパク質アラインメントを含んでいる(A. Batemanら、1999, Nucleic Acids Research, 27: 260-262)。1つのステリルアルファモチーフ(SAM)ドメインに加え、7つの潜在的なWD40、ベータ−トランスデューシン(G−ベータ)リピートが同定された(図7)。
【0080】
ベータ−トランスデューシン(G−ベータ)は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質;膜貫通レセプターによって生成されたシグナルの伝達の媒介体として作用する)の3つのサブユニット(アルファ、ベータ、およびガンマ)の一つである。構造的にはG−ベータは8つの約40残基のタンデムリピートからなり、各リピートは中央にTrp−Aspモチーフを含んでいる(このタイプのリピートは、しばしばWD−40リピートと呼ばれる)。そのような繰返しセグメントは、他の多数のタンパク質(G−ベータ様ペプチド、酵母STE4、MSI1、CDC4、CDC20、MAK11、PRP4、PWP1およびTUP1、粘菌AAC3およびコロニン(coronin)、およびショウジョウバエGrouchoタンパク質を含む)にも存在することが示されている。これらタンパク質内のリピートの数は、5(PRP4、TUP1、およびGroucho)から8(G−ベータ、STE4、MSI1、AAC3、CDC4、PWP1など)にわたる。G−ベータおよびG−ベータ様タンパク質ではリピートは配列の全体の長さにわたって分布するが、他のタンパク質ではリピートは、N末端、中央、またはC末端部分に含まれる(E. J. Neerら、1994, Nature, 371: 297-300)。
【0081】
ステリルアルファモチーフ(SAM)ドメインは、多くの生物学的プロセスに関与する広範な様々なタンパク質に存在する推定のタンパク質相互作用モデュールである。約70残基のSAMドメインが様々な真核生物に認められる。SAMドメインは、低い結合親和性でだがホモおよびへテロオリゴマー形成し、特定のタンパク質−タンパク質相互作用を媒体することが示されている。構造的分析は、SAMドメインが2つの大きな界面とともに小さな5ヘリックスの束にて配置されることを示している。EphチロシンキナーゼEphB2のSAMドメインの場合は、これら界面はそれぞれ二量体を形成できる。これら2つの別個の結合表面の存在は、SAMドメインが伸長した重合構造をを形成できることを示唆している(D. Stapletonら、1999, Nature Struct. Biol., 6: 44-49)。
【0082】
Incyte Genomics Lifeseq Goldデータベースを用い、RET16の予備的発現分析を行った。Incyteデータベースでの電子ノーザンによれば(テンプレートID 158923.9;クローンID 3111127)、RET16遺伝子配列は56のcDNAライブラリーで同定された。RET16遺伝子を発現することがわかったこれらライブラリーを図12に示す。特に興味がもたれることには、RET16は幾つかの腫瘍組織(腎臓、前立腺、下垂体、食道、卵巣、膀胱、肺、結腸、パラガングリオン、副腎、肝臓、子宮、および膵臓組織からのものを含む)で発現されることがわかった。さらに、RET16は以下の疾患状態からの組織で発現されることがわかった:ハンチントン病、白血病、胆石症、癲癇、慢性潰瘍性大腸炎、アルツハイマー病、およびリンパ球性甲状腺炎。特に注目すべきことに、RET16は、20%の煙で20時間処理した気管支上皮細胞、CD3抗体で処理したCD4+Tリンパ球、1μMの5−アザ−2'−デオキシシチジンで処理したK−562慢性骨髄性白血病前駆細胞株、およびIL−5で処理した臍帯単核球で発現されることがわかった。
【0083】
本発明の他の態様は、ヒトRET16(huRET6)遺伝子のマウスオーソログ、すなわちmuRET16を包含する。huRET16のマウスオーソログを同定するため、huRET16のコード配列を用いてマウスESTデータベース[ベーシックローカルアラインメントサーチツール(BLAST)分析を行うために当業者に利用できる]を探索した。以下のマウスESTが同定された:AU035693、AA118718、AA204608、W41056、AW146018、AI450495、AI875443、AI316544、AW494796、AW146018およびBE983890。muRET16核酸配列(配列番号6)は、huRET16と80%の同一性を有する。コードされたmuRET16アミノ酸配列(配列番号7)は、huRET16と82.5%の同一性(86.5%の類似性)を有する。muRET16は7つの予測されたWDリピートおよび1のSAMドメインを有し、全て>10のスコアを有する。
【0084】
RET16のカルボキシル末端は、1.78e−23のヒドンマルコフモデル(Hidden Markov Model)E値に基づいて決定されるように、Uボックスドメインを含む。RET16のUボックスドメインとタンパク質PRP19のUボックス(S. C. Chengら、1993, Mol. Cell. Biol., 13(3): 1876-82)とのホモロジーおよびコンセンサス残基のアラインメントを図21に示す(保存された残基の注釈はAravindおよびKoonin, 2001, Current Biology, 10(4): R132-R134から改変した)。PRP19は、Uボックスに加えてWD40リピートを含むプレmRNAスプライシング因子である。
【0085】
UFD2を典型例とするUボックスドメイン含有タンパク質は、E3ユビキチン結合反応を媒体する(AravindおよびKoonin、上掲)。E3ユビキチンリガーゼは、E2ユビキチンリガーゼから基質タンパク質へのユビキチンの移転に参画する。最近の刊行物は、一連のUボックス含有タンパク質のユビキチンリガーゼ活性に関する強力な証拠を提供している(たとえば、Hatakeyamaら、2001, J. Biol. Chem., 276(35): 33111-33120; Murataら、2001, EMBO, 21(121): 1133-1138; Meachemら、2001, Nature Cell Biology, 3: 100-105;およびPringaら、2001, J. Biol. Chem., 276(22): 19617-19623)。再構成アッセイにおいて、Uボックス含有タンパク質は、E1およびE2ユビキチンリガーゼの存在下でE3ユビキチンリガーゼ活性を提供した。さらに、Uボックスの欠失、またはUボックスタンパク質中の重要な保存された残基の変異は、ユビキチンリガーゼ活性を廃棄した(Hatakeyamaら、2001、上掲)。UボックスユビキチンリガーゼはHECTまたはRINGフィンガーE3と構造的に異なっており、基質タンパク質のポリユビキチン化を触媒できる能力によって機能的に識別することができる。
【0086】
細胞中の多彩な重要な制御タンパク質がユビキチンの添加によって修飾される。ユビキチン化タンパク質のプロテオソーム分解は、細胞周期、分化、免疫応答および折り畳みを間違えたタンパク質のクリアランスなどの多くの細胞事象を制御している。RET16は、そのUボックスドメインの観点から(Uボックスはユビキチン化、とりわけE3ユビキチン結合反応を媒体するタンパク質の特徴である)、ユビキチンリガーゼとして特徴付けられる。
【0087】
E3ユビキチンリガーゼ活性を決定するため、Hatakeyamaら、2001(上掲)、Murataら、2001(上掲)およびMeachemら、2001(上掲)に記載のアッセイを行うことができる。ユビキチンリガーゼ活性に必要なユビキチンリガーゼタンパク質中のアミノ酸を同定するため、部位特異的突然変異誘発を用いることができる。さらに、Uボックスの全てまたは一部の欠失を行ってユビキチンリガーゼ活性を媒体するうえでのUボックスのUボックスの役割を確認することができる。欠失したまたは変異したUボックスを含むRET16をコードするポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクションし、発現されたRET16タンパク質の細胞内での機能的役割を明らかにすることができる。この同じアプローチは、ユビキチンリガーゼの細胞での基質を単離および同定するうえでも利用できる。
【0088】
RET16ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、RET16ポリペプチド(配列番号2または配列番号4)をコードするヒトRET16核酸配列(配列番号1または配列番号3)、および特にTNF−活性化内皮において一般に炎症プロセス、細胞活性化、または制御されない細胞増殖に関与する他の細胞シグナル伝達成員とのRET16の相互作用のアンタゴニストまたはインヒビターをスクリーニングする方法における、RET16ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはその組成物の使用を包含する。
【0089】
本発明はさらに、本発明によるRET16核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9%同一である単離核酸またはポリペプチド分子を包含する。さらに詳細には、本発明は、配列番号12の配列と少なくとも82.0%同一であるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド、またはその断片;配列番号12の配列と少なくとも68.2%同一であるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド、またはその断片;および配列番号14の配列と少なくとも93.1%同一であるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド、またはその断片を包含する。さらに、本発明は、細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドまたはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号13の配列と少なくとも82%の配列同一性を有するもの;および細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドまたはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号15の配列と少なくとも95.0%の配列同一性を有するものを包含する。本発明はさらに、配列番号13に示す配列と少なくとも82%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離したおよび/または実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;および配列番号15に示す配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離したおよび/または実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質を包含する。
【0090】
さらに本発明に包含されるのは、炎症および細胞炎症プロセスと関連する、または細胞増殖または細胞活性化プロセスと関連する障害または疾患の診断、治療または予防法における、RET16核酸配列およびRET16ポリペプチド、またはRET16核酸またはアミノ酸配の全てまたは部分と相互作用する分子の使用である。さらに、RET16遺伝子およびポリペプチドは、RET16と関連し、レセプター活性化、刺激、または制御されない細胞増殖によって駆動される炎症プロセスや細胞内シグナル伝達事象の発生に関係するマスタースイッチと関与しうるシグナル伝達カスケードのための重要なシグナルを提供する細胞シグナル伝達分子を決定するのに有用である。
【0091】
本発明に従い、ヒトRET16タンパク質をコードする核酸を、まずTNF−アルファ刺激したヒト肺微細血管内皮細胞からサブトラクションcDNAライブラリーで同定した。完全長のRET16遺伝子を、実施例1に記載するようにIncyteおよびパブリックESTデータベースから利用できるクローン配列を伸長することにより単離した。
【0092】
その1態様において、本発明は、図2および3に示す配列番号2のアミノ酸配列および図4Bに示す配列番号4のオープンリーディングフレームアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ヒトRET16ポリペプチドは長さが476アミノ酸である。図10A〜図10Eは、RET16と他の幾つかのタンパク質、すなわちPodospora anserina植物不適合(vegetable incompatibility)タンパク質Het−E−1の部分;Thermomonospora curvata推定セリン/トレオニンキナーゼPWKAの部分;RET16マウスオーソログ、および部分RET16ラットオーソログとの構造上の類似性を描写するものである。
【0093】
RET16ポリペプチドの変異体もまた本発明により包含される。1つの側面では、RET16変異体は、本明細書に記載するアミノ酸配列(配列番号2または配列番号4)と少なくとも75〜80%、好ましくは少なくとも85〜90%、さらに好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、これはRET16ポリペプチドの少なくとも1の生物学的、免疫学的、または他の機能的な特性または活性を保持している。最も好ましいのは配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する変異体である。RET16のアミノ酸配列は、以下の3つのうちの1またはそれ以上に類別することができる:置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体。そのような変異体は、典型的にカセットまたはPCR突然変異誘発、または当業者によく知られた他の方法を用い、RET16タンパク質をコードするDNAにおいてヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発を行って変異体をコードするDNAを生成することによって調製する。その後、このDNAを本明細書に記載するように組換え細胞培養液で発現させる。約100〜150残基までを有する変異体RET16タンパク質断片は、常法を用いてインビトロ合成により調製できる。2つの変異体RET16.2およびRET16.3を本明細書に記載する[実施例2;図16(マルチプルシークエンスアラインメント);図18(エクソン構造);図19Aおよび19B(それぞれ変異体RET16.2のポリヌクレオチド配列(配列番号12)およびアミノ酸配列(配列番号13));および図20Aおよび20B(それぞれ変異体RET16.3のポリヌクレオチド配列(配列番号14)およびアミノ酸配列(配列番号15))を参照;]。
【0094】
アミノ酸配列変異体は、該変異体の前もって決定した性質、すなわちRET16タンパク質アミノ酸配列の天然のアレルまたは種間変異とは異なったものにする特性によって特徴付けることができる。修飾した特性を有する変異体を選択することもできるけれども、変異体は典型的に天然のアナログのものと同じ性質の生物学的活性を示す。アミノ酸配列の変異を導入する部位または領域は前もって決定することができるが、変異自体は前もって決定する必要がない。たとえば、所定の部位での変異の実行を最適にするため、標的コドンまたは領域でランダム突然変異誘発を行い、発現されたRET16変異体を所望の活性の最適の組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するDNA中の前もって決定した部位で置換変異を行う方法はよく知られており、たとえばM13プライマー突然変異誘発およびPCR突然変異誘発がある。変異体のスクリーニングはRET16タンパク質活性のアッセイを用いて行い、たとえば結合ドメインの変異については競合結合試験を行うことができる。
【0095】
アミノ酸置換は典型的に単一の残基のものである;挿入は、通常1〜20アミノ酸のオーダーであるが、相当長い挿入も許容しうる。欠失は約1〜約20残基の範囲であるが、幾つかの場合には欠失は一層長いものであってもよい。
【0096】
置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせを用い、最終的なRET16誘導体とすることができる。一般に、これら変化は、分子の変化を最小にするために幾つかのアミノ酸にのみ影響を及ぼす。しかしながら、ある場合には一層長い変化も許容しうる。RET16タンパク質の特性において小さな変化を望むか請け負う場合には、置換は一般に下記表1に従って行う。
【0097】
表1
【表1】
【0098】
表1に示すものよりも保存的でない置換を選択することにより、機能または免疫学的な同一性において実質的な変化を生じさせる。たとえば、変化させる領域のポリヌクレオチド骨格の構造、たとえばアルファらせん、またはベータシート構造;標的部位の分子のハイドロフォビシティー;または側鎖の嵩張りに一層有意に影響を及ぼす置換を行うことができる。一般にポリペプチドの特性を最も大きく変化させると予測される置換は、(a)親水性残基、たとえばセリンまたはトレオニンを疎水性残基、たとえばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンで置換(またはこの逆);(b)システインまたはプロリンを他の残基で置換(またはこの逆);(c)正の荷電の側鎖を有する残基、たとえばリシン、アルギニンまたはヒスチジンを負の荷電の残基、たとえばグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換(またはこの逆);または(d)嵩張った側鎖を有する残基、たとえばフェニルアラニンを側鎖を有しない残基、たとえばグリシンで置換(またはこの逆)するものである。
【0099】
RET16変異体は通常は天然のアナログと同じ性質の生物学的活性または機能を示し、同じ免疫応答を誘起するが、必要に応じてRET16タンパク質の特性を修飾した変異体もまた選択できる。あるいは、変異体はRET16タンパク質の生物学的活性が変化するようにデザインすることができる。
【0100】
他の態様において、本発明はRET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。従って、RET16ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いてRET16タンパク質を発現する組換え分子を製造することができる。特別の態様において、本発明は、図1および図4Aにそれぞれ示す配列番号1および配列番号3の核酸配列を含むRET16ポリヌクレオチド、および配列番号6の核酸配列を含むヒトRET16のマウスオーソログ;並びに配列番号8の核酸配列を含むヒトRET16のラットオーソログを包含する。さらに詳細には、本発明は、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC;10801ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア20110−2209)にATCC受託番号PTA−3161にて2001年3月7日に寄託してある、クローニング完全長オープンリーディングフレームのヒトRET16 cDNA(1532bp;RET16.1ともいう)を提供する。
【0101】
好ましい態様において、本発明は、その結果得られたRET16.1のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号1のヌクレオチド151〜1575に対応するポリヌクレオチド、および配列番号2のアミノ酸2〜476に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、RET16.1コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【0102】
他の好ましい態様において、本発明は、その結果得られたRET16.2のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号12のヌクレオチド114〜1262に対応するポリヌクレオチド、および配列番号13のアミノ酸2〜384に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、RET16.2コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【0103】
他の好ましい態様において、本発明は、その結果得られたRET16.3のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号14のヌクレオチド139〜1641に対応するポリヌクレオチド、および配列番号15のアミノ酸2〜502に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、RET16.3コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【0104】
他の好ましい態様において、本発明は、その結果得られたマウスRET16のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号6のヌクレオチド19〜1443に対応するポリヌクレオチド、および配列番号7のアミノ酸2〜475に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、マウスRET16コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【0105】
当該技術分野における熟練した実施者には評価されるであろうように、遺伝暗号の縮重は本発明のRET16ポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列を生じる結果となる。これらの配列の幾つかは、既知のおよび天然の遺伝子のヌクレオチド配列とは最小のホモロジーしか有しない。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づいた組み合わせを選択することにより作製できるヌクレオチド配列の可能な全ての変化物を包含する。これら組み合わせは、天然のRET16のヌクレオチド配列に適用されるように標準トリプレット遺伝コードに従って作製し、そのような全ての変化物は個別に開示されるものと考えなければならない。
【0106】
RET16ポリペプチドおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適当に選択したストリンジェンシーの条件下で天然のRET16ポリペプチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズできるのが好ましいが、RET16ポリペプチドまたはその誘導体をコードするが実質的に異なるコドン使用頻度のヌクレオチド配列を製造するのが有利である。コドンの選択は、特定の原核または真核宿主細胞において、該宿主細胞、たとえば植物細胞または酵母細胞または両生類細胞によって利用される特定コドンの使用頻度に従い、ペプチド/ポリペプチドの発現速度を増大させるように行うことができる。コードされるアミノ酸配列を変えることなくRET16ポリペプチドおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変える他の理由としては、天然の配列から生成する転写物に比べてより望ましい特性、たとえばより長い半減期を有するmRNA転写物を産生することが挙げられる。
【0107】
本発明はまた、RET16ポリペプチドおよびその誘導体をコードするDNA配列またはその部分を完全に合成化学により製造することを包含する。製造後、合成した配列を当業者によく知られ実施されている試薬を用いて多くの利用できる発現ベクターおよび細胞系のいずれにも挿入することができる。さらに、合成化学を用いてRET16ポリペプチドまたはその断片をコードする配列に変異を導入することができる。
【0108】
また、本発明により包含されるのは、配列番号1または配列番号3に示すものなどのRET16の特許請求したヌクレオチド配列に様々なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は典型的に核酸結合複合体またはプローブの融解温度(Tm)に基づくものであり(G. M. WahlおよびS. L. Berger, 1987; Methods Enzymol., 152: 399-407およびA. R. Kimmel, 1987; Methods of Enzymol., 152: 507-511を参照)、定めたストリンジェンシーにて用いることができる。たとえば、本発明に包含されるのは、配列番号1または配列番号3のRET16核酸配列およびRET16ポリペプチドをコードする配列の縮重である他の配列に中くらいのストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる配列、である(たとえば、制限されない例として、2×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA、pH8.0のプレ洗浄溶液、および50℃のハイブリダイゼーション条件、5×SSC、一夜)。
【0109】
本発明の他の態様において、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片(ペプチド)は、適当な宿主細胞中でRET16ポリペプチドまたはその断片またはその機能的等価物の発現を指令する組換えDNA分子に用いることができる。遺伝コードがもともと縮重しているため、実質的に同じかまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を製造することができ、これら配列もRET16タンパク質を発現させるのに用いることができる。
【0110】
当業者により評価されるであろうように、天然に存在しないコドンを有するRET16ポリペプチドコードヌクレオチド配列を製造することは有利である。たとえば、特定の原核または真核宿主細胞に好まれるコドンを選択し、タンパク質の発現速度を増大させたり、または所望の特性、たとえば天然の配列から生成する転写物よりも長い半減期を有する組換えRNA転写物を製造することができる。
【0111】
本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および/または発現を修飾する改変(これらに限られるものではない)を含む様々な理由からRET16ポリペプチドコード配列を変化させるため、当該技術分野で一般に知られた方法を用いて遺伝子操作することができる。ランダムフラグメント形成(fragmentation)および遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとのPCR再アセンブリーによるDNAシャフリングを用いてヌクレオチド配列を遺伝子操作することができる。たとえば、部位特異的突然変異誘発を用いて、新たな制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドンの優先性の変化、スプライス変異体の作製、または変異の導入などを行うことができる。
【0112】
本発明の他の態様において、RET16ポリペプチドをコードする天然の、修飾した、または組換えの核酸配列またはその断片を、融合タンパク質をコードする異種配列にライゲートすることができる。たとえば、RET16活性または結合のインヒビターまたはモデュレーターをペプチドライブラリーでスクリーニングするには、市販の抗体により認識できるキメラRET16タンパク質をコードするのが有用である。融合タンパク質はまた、RET16タンパク質を異種残基部分から開裂および精製できるようにRET16タンパク質コード配列と異種タンパク質配列との間に開裂部位を含むように遺伝子操作することができる。
【0113】
従って、本発明は、細胞シグナル伝達カスケードに関与し、配列番号1、3、5、6、8、12または14に示す核酸配列または遺伝子コードの重複の結果、配列番号1、3、5、6、8、12または14の配列の縮重核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質を包含する。そのような融合タンパク質はさらに、配列番号2、4、7、9、13または15のアミノ酸配列の全てまたは部分、または配列番号2、4、7、9、13または15に示す配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、および第二のタンパク質のアミノ酸配列を含んでいてよい。
【0114】
他の態様において、RET16産物の機能を妨害するインヒビター化合物、またはRET16産物の機能を刺激するアクチベーター化合物を同定するのに、リガンド結合アッセイが有用である。そのようなアッセイは、タンパク質の機能が不明であっても有用である。これらアッセイは、特定の標的分子、たとえばタンパク質やペプチドへの被験化合物の結合を検出すべくデザインする。検出には結合を直接測定することが含まれる。あるいは、結合の間接的な表示として、タンパク質構造の安定化、または生物学的機能の妨害または促進が含まれる。有用なリガンド結合アッセイの制限されない例を以下に詳記する。
【0115】
結合タンパク質の検出および単離に有用な1つの方法は、Pharmacia Biosensorによって開発され、製造業社のプロトコール(LKB Pharmacia,スウェーデン)に記載されているBiomolecular Interaction Assay(BIAcore)システムである。BIAcoreシステムは、アフィニティー精製した抗GST抗体を用いてGST−融合タンパク質をセンサーチップに固定化する。このセンサーは、屈折率の変化を検出する最適の現象である表面プラズモン共鳴を利用している。従って、目的とするタンパク質、たとえば本発明のRET16ポリペプチドまたはその断片をチップ上に固定化し、被験化合物をチップに通す。結合は屈折率の変化(表面プラズモン共鳴)により検出する。
【0116】
異なるタイプのリガンド結合アッセイは、米国特許第4,568,649号に記載されているようにシンチレーション近似アッセイ(scintillation proximity assays;SPA)を含む。現在開発中のこのアッセイの変法では、シャペロニン(chaperonin)を用いて折り畳まれたタンパク質と折り畳まれていないタンパク質とを識別する。標識したタンパク質をSPAビーズに付着させ、被験化合物を加える。ついで、ビーズを穏やかな変性条件、たとえば熱、SDSへの暴露などに供し、精製した標識シャペロニンを加える。もしも被験化合物が標的タンパク質に結合しておれば標識シャペロニンは結合しないであろう;逆に被験化合物が結合していなければ、該タンパク質はいくらかの変性を受け、シャペロニンは結合するであろう。他のタイプのリガンド結合アッセイでは、ミトコンドリアターゲティングシグナルを含むタンパク質を単離したミトコンドリアにインビトロで移入させる(Hurtら、1985, EMBO J., 4: 2061-2068; EilersおよびSchatz, 1986, Nature, 322: 228-231)。ミトコンドリア移入アッセイでは、特定の標的タンパク質をコードする核酸をミトコンドリア移入シグナルをコードする配列の下流に挿入した発現ベクターを構築する。キメラタンパク質を合成し、該キメラタンパク質が被験化合物の不在下および存在下で単離ミトコンドリア中に移送されることができるか否かについて試験する。標的タンパク質に結合する被験化合物は、それが単離ミトコンドリア中にインビトロで取り込まれるのを抑制するに違いない。
【0117】
本発明に従って用いるのに適した他のタイプのリガンド結合アッセイは、酵母2ハイブリッド系である(FieldsおよびSong, 1989, Nature, 340: 245-246)。酵母2ハイブリッド系は、酵母S. cerevisiaeのGAL4タンパク質の特性を利用している。GAL4タンパク質は、ガラクトースの利用に関与する酵素をコードする遺伝子の発現に必要な転写アクチベーターである。GAL4タンパク質は、2つの分離できる機能的に必須のドメインからなっている:すなわち、特定のDNA配列(UASG)に結合するN末端ドメイン;および酸性領域を含むC末端ドメイン(転写を活性化するのに必要である)。両ドメインを含む天然のGAL4タンパク質は、酵母菌体がガラクトース培地で増殖するときに転写の強力なアクチベーターである。N末端ドメインはDNAに配列特異的に結合するが、転写を活性化することはできない。C末端ドメインは活性化領域を含むが、UASGに配置できないので転写を活性化することができない。2ハイブリッド系では、2つのハイブリッドタンパク質の系がGAL4の部分を含む:(1)タンパク質「X」に融合したGAL4 DNA結合ドメイン;および(2)タンパク質「Y」に融合したGAL4活性化領域。タンパク質XとYとがタンパク質−タンパク質複合体を形成し、GAL4ドメインの近接性を再構築できれば、UASGによって制御される遺伝子の転写が起こる。それぞれ相互作用タンパク質XおよびYを含む2つのハイブリッドタンパク質の生成が、UASGの活性化領域をその通常の作用部位にもってくることを可能にする。
【0118】
Fodorら、1991, Science, 251: 767-773に記載された結合アッセイもまた有用であり、これは固相基体上に合成した複数の所定のポリマーに対する被験化合物の結合親和性を試験することを含む。本発明によるRET16ポリペプチドまたはその部分に結合する化合物は、治療用組成物に使用するための薬剤として有用な可能性がある。
【0119】
他の態様において、RET16ポリペプチドをコードする配列は、その全体または一部を当該技術分野でよく知られた化学的方法を用いて合成することができる(たとえば、M. H. Caruthersら、1980, Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 215-223およびT. Horn, Tら、1980, Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 225-232を参照)。別法として、タンパク質自体を化学的方法を用いて製造してRET16ポリペプチドまたはその断片または部分のアミノ酸配列を合成することができる。たとえば、ペプチド合成は種々の固相法(J. Y. Robergeら、1995, Science, 269: 202-204)を用いて行うことができ、たとえばABI 431A Peptide Synthesizer(PE Biosystems)を用いて自動合成を達成することができる。
【0120】
新たに合成したペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー(たとえば、T. Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles、WH Freeman and Co.、ニューヨーク、ニューヨーク)により、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、または当該技術分野でよく知られた他の精製法により実質的に精製することができる。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングにより確認することができる(たとえば、エドマン分解法;Creighton、上掲)。さらに、RET16ポリペプチドまたはその部分のアミノ酸配列は、直接合成の際におよび/または化学合成法を他のタンパク質からの配列またはその部分と組み合わせて変化させて変異体ポリペプチドを製造することができる。
【0121】
ヒトRET16タンパク質の発現
生物学的に活性な/機能性のRET16ポリペプチドまたはペプチドを発現するため、RET16ポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター、たとえば挿入したコード配列の転写および翻訳に必要な配列を含むベクターに挿入することができる。RET16ポリペプチドをコードする配列および適当な転写および翻訳調節配列を含む発現ベクターを構築するため、当業者によく知られ実施されている方法を用いることができる。これら方法としては、インビトロ組換えDNA法、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような方法は、J. Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、プレインビュー、ニューヨークおよびF. M. Ausubelら、1989, Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨークに記載されている。
【0122】
様々な発現ベクター/宿主系を利用してRET16ポリペプチドをコードする配列を含ませ発現させることができる。そのような発現ベクター/宿主系としては、これらに限られるものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物;酵母または真菌発現ベクターで形質転換した酵母または真菌;ウイルス発現ベクター(たとえば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;ウイルス発現ベクター(たとえば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)およびタバコモザイクウイルス(TMV))または細菌発現ベクター(たとえば、TiまたはpBR322プラスミド)で形質転換した植物細胞系;または動物細胞系が挙げられる。使用した宿主細胞は本発明を限定するものではない。
【0123】
「調節配列」または「制御配列」とは、ベクターの非翻訳領域、たとえばエンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域(宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う)である。そのような配列は、その強度および特異性において様々であってよい。使用するベクター系および宿主に応じて、適当な転写および翻訳配列(構成的および誘導性プロモーターを含む)を幾つ用いてもよい。たとえば、細菌系にクローニングする場合は、BLUESCRIPTファージミド(Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア)またはPSPORT1プラスミド(Life Technologies)のハイブリッドlacZプロモーターなどを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に用いることができる。植物細胞のゲノムに由来する(たとえば、熱ショック、RUBISCO;および貯蔵タンパク質遺伝子)または植物ウイルスに由来する(たとえば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列)プロモーターまたはエンハンサーをベクターにクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子に由来するまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。RET16をコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成する必要がある場合は、SV40またはEBVに基づくベクターを適当な選択マーカーとともに用いることができる。
【0124】
細菌系では、発現されたRET16産物に使用する意図に応じて多くの発現ベクターを選択することができる。たとえば、抗体を誘起するために多量の発現タンパク質を必要とする場合は、融合タンパク質の高レベルの発現を指令し、該融合タンパク質を容易に精製できるベクターを用いることができる。そのようなベクターとしては、これらに限られるものではないが、BLUESCRIPT(Stratagene)(RET16ポリペプチドまたはそのペプチドをコードする配列をアミノ末端Metおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの7残基の配列とインフレームでライゲートし、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにすることができる);pINベクター(たとえば、G. Van HeekeおよびS. M. Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 264: 5503-5509を参照)などの多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。pGEXベクター(Promega、マジソン、ウイスコンシン)もまたグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後に遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で製造したタンパク質は、目的とするクローニングポリペプチドを所望によりGST残基から放出できるように、ヘパリン、トロンビン、または第XA因子プロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインすることができる。
【0125】
酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHなどの構成的および誘導性のプロモーターを含む多くのベクターを用いることができる(概説として、F. M. Ausubelら、上掲、およびGrantら、1987, Methods Enzymol., 153: 516-544を参照)。
【0126】
植物発現ベクターが望ましく、使用する場合には、RET16ポリペプチドをコードする配列の発現は多くのプロモーターのいずれによっても駆動することができる。たとえば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独またはTMVからのオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる(N. Takamatsu, 1987, EMBO J., 6: 307-311)。あるいは、RUBISCOの小サブユニット、または熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを用いることができる(G. Coruzziら、1984, EMBO J., 3: 1671-1680; R. Broglieら、1984, Science, 224: 838-843;およびJ. Winterら、1991, Results Probl. Cell Differ. 17:85-105)。これら構築物は、直接DNA形質転換または病原体媒体トランスフェクションにより植物細胞に導入することができる。そのような方法は、多くの一般に利用できる概説に記載されている(たとえば、S. HobbesまたはL. E. Murry, In: McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill、ニューヨーク、ニューヨーク、pp. 191-196を参照)。
【0127】
昆虫系を用いてRET16ポリペプチドを発現することもできる。たとえば、そのような1つの系として、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)をSpodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeで外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いる。RET16ポリペプチドをコードする配列をポリヘドリン遺伝子などの該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。RET16ポリペプチドがうまく挿入しておればポリヘドリン遺伝子は不活化され、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが産生される。ついで、組換えウイルスを用いてたとえばS. frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeを感染させることができ、この中でRET16ポリペプチドを発現させることができる(E. K. Engelhardら、1994, Proc. Nat. Acad. Sci., 91: 3224-3227)。
【0128】
哺乳動物宿主細胞では多くのウイルスベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、RET16ポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび3連のリーダー配列を含むアデノウイルス転写/翻訳複合体にライゲートすることができる。感染した宿主細胞でRET16ポリペプチドを発現できる生きたウイルスを得るため、ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域を用いることができる(J. LoganおよびT. Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 3655-3659)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【0129】
特定の開始シグナルを用いてRET16ポリペプチドをコードする配列の一層効率的な翻訳を達成することもできる。そのようなシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。RET16ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクターに挿入する場合には、さらに転写または翻訳調節シグナルは必要ない。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入する場合には、外来の翻訳調節シグナル(ATG開始コドンを含む)を提供しなければならない。さらに、全挿入物の翻訳を確実にするため、開始コドンは正しい読取り枠になければならない。異種翻訳配列および開始コドンは、天然および合成の両者とも様々な起源のものであってよい。発現の効率は、文献記載のもののような(D. Scharfら、1994, Results Probl. Cell Differ., 20: 125-162)、使用した特定の細胞系に適したエンハンサーを含めることによって促進することができる。
【0130】
さらに、宿主細胞株は、挿入配列の発現を変調したり発現タンパク質を所望の仕方でプロセシングする能力について選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾としては、これらに限られるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)、およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」形を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳みおよび/または機能を容易にするために用いることができる。そのような翻訳後活性のための特別の細胞機構および特徴的なメカニズムを有する種々の宿主細胞(たとえば、COS、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびW138)が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC;10801ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア20110−2209)から利用でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にすべく選択することができる。
【0131】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには安定した発現が好ましい。たとえば、RET16タンパク質を安定に発現する細胞株を、ウイルスの複製起点および/または内生の発現配列および選択マーカー遺伝子を同じかまたは別個のベクター上に含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターを導入後、選択培地に切り換える前に細胞を富んだ細胞培養培地で1〜2日間増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在が導入配列を首尾よく発現している細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換した細胞の耐性クローンは、その細胞のタイプに適した組織培養法を用いて増殖させることができる。
【0132】
形質転換した細胞株を回収するため、幾つの選択系も用いることができる。これらとしては、これらに限られるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV TK)(M. Wiglerら、1977, Cell, 11: 223-32)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(I. Lowyら、1980, Cell, 22: 817-23)遺伝子が挙げられ、これらはそれぞれtk−細胞またはaprt−細胞で用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択の基礎として用いることができる;たとえば、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr(M. Wiglerら、1980, Proc. Natl. Acad. Sic., 77: 3567-70);アミノグリコシドのネオマイシンおよびG−418に対する耐性を付与するnpt(F. Colbere-Garapinら、1981, J. Mol. Biol., 150: 1-14);およびそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するalsまたはpat(Murry、上掲)。さらなる選択遺伝子が記載されている、たとえば、トリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるtrpB、またはヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるhisD(S. C. HartmanおよびR. C. Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8047-51)。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のGUS、およびルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンなどのマーカーのような可視性のマーカーの使用が一般的になってきており、これらマーカーは形質転換体を同定するのみならず、特定のベクター系に帰せられる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するうえでも広く用いられている(C. A. Rhodesら、1995, Methods Mol. Biol., 55: 121-131)。
【0133】
マーカー遺伝子発現の存在/不在は目的遺伝子が存在することをも示唆するものであるが、目的とする所望の遺伝子の存在および発現は確認する必要がある。たとえば、RET16核酸配列ポリペプチドがマーカー遺伝子配列内に挿入されていると、RET16ポリペプチドをコードする配列を含む組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。あるいは、マーカー遺伝子はRET16ポリペプチドをコードする配列とタンデムに単一のプロモーターの制御下に配置することができる。誘発または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデム遺伝子の同時発現を示す。
【0134】
あるいは、RET16ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、RET16ポリペプチド産物を発現する宿主細胞は、当業者に知られた様々な方法により同定することができる。これら方法としては、これらに限られるものではないが、核酸またはタンパク質の検出および/または定量のための、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ法(メンブレン、溶液、またはチップベースの方法を含む)が挙げられる。
【0135】
好ましくは、RET16ポリペプチドは発現後に実質的に精製する。RET16タンパク質は、試料中に他のどのような成分が存在しているかにより、当業者に知られ実施されている様々な仕方で単離または精製することができる。標準的な精製法としては、電気泳動法、分子生物学的方法、免疫学的方法およびクロマトグラフィー法(イオン交換クロマトグラフィー、疎水性アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相HPLCクロマトグラフィーを含むが、これらに限られるものではない)が挙げられる。たとえば、RET16タンパク質は、標準的な抗RET16抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク質濃度と組み合わせた限外濾過およびダイアフィルトレーション法を用いることもできる。適当な精製法の一般的な手引きとしては、R. Scopes, 1982, Protein Purification, Springer-Verlag、ニューヨークを参照。熟練した実施者には理解されるであろうように、必要な精製の程度はRET16タンパク質の使用目的により変わりうる;場合によっては精製が必要ないこともあるであろう。
【0136】
組換え製造に加え、RET16ポリペプチドの断片は固相法を用いた直接ペプチド合成により製造できる(J. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154)。タンパク質合成は、手動法を用いるかまたは自動化により行うことができる。自動合成は、たとえば、ABI 431A Peptide Synthesizer(PE Biosystems)を用いて達成することができる。RET16の様々な断片を別々に化学合成し、ついで化学法を用いて組み合わせることにより完全長の分子を生成することができる。
【0137】
ヒトRET16ポリヌクレオチドの検出
RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーションにより、またはRET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは部分または断片を用いた増幅により検出することができる。核酸増幅ベースのアッセイは、RET16ポリペプチドをコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを使用することにより、RET16ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAを含む形質転換体を検出することを含む。
【0138】
広範な様々な標識およびコンジュゲート法が当業者に知られ、用いられており、様々な核酸およびアミノ酸アッセイに用いることができる。RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを生成する手段としては、オリゴ−標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識ヌクレオチドを用いたPCR増幅が挙げられる。あるいは、RET16ポリペプチドまたはその部分または断片をコードする配列を、mRNAプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることができる。そのようなベクターは当該技術分野で知られ市販されており、T7、T3、またはSP(6)および標識ヌクレオチドなどの適当なRNAポリメラーゼを加えることによりインビトロでRNAプローブを合成するのに用いることができる。これら方法は、様々な市販のキット(たとえば、Amersham Pharmacia Biotech, PromegaおよびU. S. Biochemical Corp.)を用いて行うことができる。使用できる適当なリポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、または色原体、並びに基質、補因子、インヒビター、マグネチック粒子などが挙げられる。
【0139】
ヒトRET16ポリペプチド−産生、検出、単離
RET16タンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその断片で形質転換した宿主細胞は、該タンパク質の細胞培養からの発現および回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用した配列および/またはベクターに依存して分泌されるかまたは細胞内に含まれている。当業者には理解されるであろうように、RET16タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通したRET16タンパク質の分泌を指令するシグナル配列を含むようにデザインすることができる。
【0140】
RET16タンパク質をコードする核酸配列を可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させるため、他の構築を用いることができる。そのような精製を容易にするドメインとしては、これらに限られるものではないが、固定化した金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモデュールなどの金属キレート形成ペプチド;固定化した免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン;およびFLAGS伸長/アフィニティー精製系(Immunex Corp.、シアトル、ワシントン)で利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインとRET16タンパク質との間に第XA因子やエンテロキナーゼに特異的なもの(Invitrogen、サンジエゴ、カリフォルニア)などの開裂可能なリンカー配列を含めることを精製を容易にするために用いることができる。1つのそのような発現ベクターは、RET16コード配列とチオレドキシンに先行する6ヒスチジン残基またはエンテロキナーゼ開裂部位をコードする核酸とを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、J. Porathら、1992, Prot. Exp. Purif., 3: 263-281に記載されているようにIMAC(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)での精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からの精製手段を提供する。融合タンパク質の産生に適したベクターの論考については、D. J. Krollら、1993, DNA Cell Biol., 12: 441-453を参照。
【0141】
プラスミドベクターに含まれ発現されるものよりも大きなDNA断片を送達するため、ヒト人工染色体(HAC)を用いることができる。HACは、サイズが10K〜10MのDNA配列を含むことができ、安定な有糸分裂による染色体分離および保持に必要な全ての配列を含む線状の微小染色体である(J. J. Harringtonら、1997, Nature Genet., 15: 345-355を参照)。6〜10MのHACを構築し、治療目的のために通常の送達手段(たとえば、リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、またはベシクル)により送達する。
【0142】
タンパク質に特異的なポリクローナル抗体かまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いてRET16ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコールが当該技術分野で知られ、実施されている。例としては、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性化セルソーティング(FACS)が挙げられる。RET16ポリペプチド上の2つの相互に妨害しないエピトープと反応性のモノクローナル抗体を用いた2部位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる。これらおよび他のアッセイは、R. Hamptonら、1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press、セントポール、ミネソタおよびD. E. Maddoxら、1983; J. Exp. Med., 158: 1211-1216の刊行を代表として当該技術分野に記載されている。
【0143】
抗ヒトRET16抗体およびその使用
精製したRET16タンパク質またはその断片は、抗体を産生するため、または医薬または他の化合物、とりわけ小さな分子のライブラリーをスクリーニングしてRET16に特異的に結合するものを同定するのに用いることができる。そのような抗体は本発明のRET16ポリペプチドのアンタゴニストまたはインヒビターとして有用であり、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換えにより製造したものであってよい。
【0144】
RET16ポリペプチドまたはその免疫原性のペプチド断片に特異的な抗体は、当該技術分野で長く知られ通常用いられている方法を用いて製造することができる。そのような抗体としては、これらに限られるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーによって製造されるフラグメントが挙げられる。中和抗体(すなわち、二量体形成を抑制する抗体)は治療用に使用するのに特に好ましい。
【0145】
抗体を産生するには、種々の宿主(ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、ヒトその他を含む)をRET16ポリペプチドまたは免疫原性の特性を有するそのペプチド断片またはオリゴペプチドを注射して免疫することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を増大させることができる。適当なアジュバントの制限されない例としては、フロイントの(不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムやシリカなどの金属ゲル、および表面活性物質、たとえばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、KLH、およびジニトロフェノールが挙げられる。ヒトに典型的に使用するアジュバントとしては、BCG(bacilli Calmette Guerin)およびCorynebacterium parvumnが挙げられる。
【0146】
好ましくは、RET16ポリペプチドに対する抗体を誘発するのに使用するペプチド、断片またはオリゴペプチド(すなわち、免疫原)は、少なくとも5つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも7〜10のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。また、免疫原は天然のタンパク質のアミノ酸配列の部分と同一であるのが好ましい;免疫原はまた、小さな天然分子の全アミノ酸配列を含んでいてよい。ペプチド、断片またはオリゴペプチドは、単一のエピトープまたは抗原決定基または複数のエピトープを含んでいてよい。RET16アミノ酸の短いストレッチを他のタンパク質のアミノ酸(たとえば、KLH)と融合させ、このキメラ分子に対して抗体を産生させる。
【0147】
RET16ポリペプチドまたはその免疫原性の断片に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供するあらゆる方法を用いて製造することができる。これら方法としては、これらに限られるものではないが、ハイブリドーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法、およびEBV−ハイブリドーマ法が挙げられる(G. Kohlerら、1975, Nature, 256: 495-497; D. Kozborら、1985, J. Immunol. Methods, 81: 31-42; R. J. Coteら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030;およびS. P. Coleら、1984, Mol. Cell Biol., 62: 109-120)。モノクローナル抗体の産生は当該技術分野でよく知られており、日常的に用いられている。
【0148】
さらに、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術である、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライスして適当な抗原特異性と生物学的活性とを備えた分子を得ることを用いることができる(S. L. Morrisonら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855; M. S. Neubergerら、1984, Nature, 312: 604-608;およびS. Takedaら、1985, Nature, 314: 452-454)。あるいは、当該技術分野で知られた方法を用いて一本鎖抗体を産生するために記載された技術を採用し、RET16ポリペプチドに特異的な一本鎖抗体を生成することができる。関連した特異性を有するが異なるイディオタイプ組成の抗体は、ランダムコンビネーション免疫グロブリンライブラリーからの鎖シャフリングにより生成することができる(D. R. Burtonら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11120-3)。抗体はまた、文献に開示されているように(R. Orlandiら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3833-3837およびG. Winterら、1991, Nature, 349: 293-299)、リンパ球集団におけるインビボ産生で誘発することにより、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生することができる。
【0149】
RET16ポリペプチドに特異的な結合部位を含む抗体フラグメントを生成することもできる。たとえば、そのようなフラグメントとしては、これらに限られるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生成することのできるF(ab')2フラグメントおよびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって生成することのできるFabフラグメントが挙げられる。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とすることができる(W. D. Huseら、1989, Science, 254, 1275-1281)。
【0150】
所望の特異性を有する抗体を同定するため、様々なイムノアッセイを用いてスクリーニングすることができる。確立した特異性を有するポリクローナル抗体かまたはモノクローナル抗体を用いた競合結合または免疫放射測定アッセイのための多数のプロトコールが当該技術分野でよく知られている。そのようなイムノアッセイは、典型的にRET16ポリペプチドとその特異的な抗体との間での複合体の生成を測定することを含む。2つの相互に妨害しないRET16ポリペプチドエピトープと反応性のモノクローナル抗体を用いた2部位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる(Maddox、上掲)。
【0151】
治療剤/処置
本発明の1つの態様において、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片または相補鎖は治療目的に用いることができる。1つの側面において、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスは、RET16 mRNAの転写を妨害することが望ましい状況で用いることができる。とりわけ、本明細書の実施例4に記載するように、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換またはトランスフェクションすることができる。かくして、相補的な分子を用いてヒトRET16ポリヌクレオチドおよびポリペプチド活性を変調し、または遺伝子機能の制御を達成することができる。そのような技術は今や当該技術分野でよく知られており、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコード領域または非コード領域の種々の位置からセンスまたはアンチセンスのオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドまたは一層大きな断片をデザインすることができる。
【0152】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス、または他の様々な細菌プラスミド由来の発現ベクターを、ヌクレオチド配列を標的生物、組織または細胞集団に送達するのに用いることができる。RET16ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な核酸配列を発現する組換えベクターを構築するため、当業者によく知られた方法を用いることができる。これら技術は、J. Sambrookら、上掲およびF. M. Ausubelら、上掲にともに記載されている。
【0153】
RET16ポリペプチドをコードする遺伝子は、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより作り出す(turned off)ことができる。そのような構築物は、翻訳できないセンスまたはアンチセンス配列を細胞中に導入するのに用いることができる。そのようなベクターは、DNAに組み込まれなくとも、内生のヌクレアーゼにより不能にされるまでRNA分子を転写し続けることができる。一過性の発現は、非複製ベクターでは1ヶ月またはそれ以上、適当な複製配列をベクター系の一部に含めるようにデザインされておれば一層長い期間持続しうる。
【0154】
遺伝子発現の修飾は、RET16ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域、5'領域、または制御領域(たとえば、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、およびイントロン)に対するアンチセンス分子または相補的核酸配列(DNA、RNA、またはPNA)をデザインすることにより得ることができる。転写開始部位からのオリゴヌクレオチド、たとえば開始部位から−10と+10との間の位置からのオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、抑制は「三本鎖らせん」塩基対形成法を用いて達成できる。三本鎖らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合に充分なほど二本鎖らせんが開く能力を抑制するゆえに有用である。三本鎖DNAを用いた近年の治療の進歩は記載されている(たとえば、J. E. Geeら、1994, In: B. E. HuberおよびB. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co.、マウントキスコ、ニューヨークを参照)。アンチセンス分子または相補的配列はまた、転写物がリボソームに結合するのを妨害することによってmRNAの翻訳を阻止すべくデザインすることもできる。
【0155】
リボザイム、すなわち酵素的mRNA分子もまたRNAの特異的開裂を触媒するのに用いることができる。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的な標的RNAへの配列特異的なハイブリダイゼーションと、それに続く内ヌクレオチド鎖分解的開裂を含む。適当な例としては、RET16ポリペプチドをコードする配列内ヌクレオチド鎖分解的開裂を特異的かつ有効に触媒することのできる遺伝子操作により調製したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が挙げられる。
【0156】
リボザイム開裂部位(以下の配列を含む:GUA、GUU、およびGUC)について可能性のあるRNA標的分子をスキャニングすることにより、該標的RNA分子内の特異的なリボザイム開裂部位をまず同定する。同定されたら、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、オリゴヌクレオチドを機能できなくさせ得る二次構造の特徴について評価することができる。候補標的の適切さはまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性(accessibility)を試験することによって評価することができる。
【0157】
本発明による相補的リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子の合成のための当該技術分野で公知の方法により調製することができる。そのような方法としては、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法、たとえば固相ホスホルアミダイト化学合成法が挙げられる。別法として、RNA分子はヒトRET16をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写により生成することができる。そのようなDNA配列をT7やSPなどの適当なRNAポリメラーゼプロモーターを有する広範なベクター中に導入することができる。あるいは、相補的なRET16 RNAを構成的かまたは誘導性に合成するcDNA構築物を細胞株、細胞、または組織に導入することができる。
【0158】
RNA分子は、細胞内での安定性および半減期を増大すべく改変することができる。可能な改変としては、これらに限られるものではないが、分子の5'末端および/または3'末端へのフランキング配列の付加、または分子の骨格内での(ホスホジエステル結合の代わりに)ホスホルアミダイトまたは2'O−メチルの使用が挙げられる。この概念はPNAの生成に元々あるものであり、イノシン、キューオシン、およびワイブトシンなどの非伝統的な塩基、並びにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および内生のエンドヌクレアーゼによって容易に認識されない同様の修飾形を含めることによってこれら分子の全てに拡張することができる。
【0159】
細胞または組織中にベクターを導入する多くの方法が利用でき、インビボ、インビトロ、およびイクスビボに使用するのに同等に適している。イクスビボ療法のため、ベクターを患者から採取した幹細胞中に導入し、自家移植のためにクローン的に増殖させて同じ患者に戻すことができる。トランスフェクションによるおよびリポソーム注射による送達は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて行うことができる。
【0160】
本発明の他の態様において、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補鎖、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターを、炎症性疾患または障害および/または制御されない細胞増殖、過剰活性または刺激に関連する疾患または障害を治療または予防すべく個体に投与することができる。様々な特殊化したオリゴヌクレオチド送達法、たとえば、RNAおよびDNA送達のための単ラメラリポソーム中の包括および再構成センダイウイルスエンベロープを用いることができる(Aradら、1986, Biochem. Biophys. Acta., 859: 88-94)。
【0161】
他の態様において、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的配列、またはベクターを、他の適当な治療剤とともに投与することができる。組み合わせ療法に使用する適当な治療剤の選択は、通常の製薬原理に従って当業者により行うことができる。治療剤の併用は、相乗的に作用して上記の様々な障害を治療または予防することができる。このアプローチを用いれば各薬剤を一層低投与量で使用して治療効果を達成することができ、それゆえ副作用の可能性を低減することができる。
【0162】
上記の治療法はいずれも、たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を含む、そのような治療を必要とするあらゆる個体に適用することができる。
【0163】
スクリーニング法
RET16タンパク質および核酸は、炎症性障害、たとえば、活性化したおよび/または過剰活性の細胞(たとえば、T細胞、B細胞、内皮細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞および好酸球)が関与する障害を治療するための潜在的な使用について、RET16生物活性を変調する候補の生物活性剤のスクリーニングアッセイに用いることができる。さらに、RET16タンパク質およびコードする核酸、並びにRET16活性または機能を変調する生物活性剤は、細胞活性化を制御する方法においてエフェクターとして用いることができる。
【0164】
RET16ポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、相互作用性の分子によって変調することができる。本明細書において「変調」とは、RET16の生物活性を変えること、すなわちアゴニストによるなどで、増大、強化、または促進するか、またはアンタゴニストによるなどで、低減、抑制、または阻止することを意味する。好ましい態様において、RET16の生物活性は抑制される。RET16はTNF−アルファによって刺激された細胞で発現され、炎症応答に関与する因子であり候補ユビキチンリガーゼであることから、細胞内シグナル伝達において役割を果たし、または炎症プロセスの発生のマスタースイッチの一部として働くことができる。従って、RET16は、細胞シグナル伝達カスケードにおけるその機能または発現のアンタゴニストまたはインヒビターをスクリーニングするための標的として用いることができる。
【0165】
本発明の他の態様において、RET16タンパク質および核酸は、過剰活性化したB細胞および/またはT細胞によって引き起こされうる疾患、たとえば自己免疫疾患の治療、並びにサイトカイン、および炎症を促進、加速、または悪化させる因子を産生する細胞、たとえば白血球、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、好酸球、多形核白血球などが関与する炎症性疾患、または種々の体組織における細胞傷害の治療のための潜在的な使用について、RET16の生物活性を変調する候補生物活性剤を同定および検出するためのスクリーニングアッセイに用いることができる。細胞内シグナル伝達カスケードのマスタースイッチをアップレギュレーション、刺激、またはその他で関与しうる炎症性疾患の制限されない例としては、関節炎(慢性関節リウマチおよび若年性慢性関節炎の両者);乾癬;喘息;虚血−再潅流;臓器または組織移植の拒絶;慢性閉塞性肺疾患;炎症性胃腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎を含む);亜急性(inacute)呼吸障害症候群;全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および嚢胞性線維症が挙げられる。RET16を変調する生物活性剤を使用できる他の疾患または障害としては、自己免疫疾患、癌、腫瘍および新生物、および様々な組織、とりわけRET16の発現が認められない組織での細胞の制御されない増殖と関連する他の疾患が挙げられる(たとえば、図7A〜図7Dを参照)。
【0166】
一般にそのようなスクリーニング法を行うに際しては、RET16ポリペプチドを、隔離した試料受容領域を有する不溶性の支持体(たとえば、マイクロタイタープレート、アレイなど)に非拡散的に結合させる。適当な不溶性支持体の基準は、ポリペプチドを結合できる限りいかなる組成からなっていてもよいこと、可溶性の物質から容易に分離できること、および他の面ではスクリーニング法の全体と適合できることである。そのような支持体の表面は固体または多孔性であってよく、いかなる都合のよいサイズまたは形状であってよい。適当な不溶性支持体の例としては、マイクロタイター、プレート、アレイ、メンブレンおよびビーズが挙げられる。これらは典型的にガラス、プラスチック(たとえば、ポリスチレン)、多糖、ナイロンまたはニトロセルロースで作る。マイクロタイタープレートおよびアレイは特に都合がよい、なぜなら少量の試薬および試料を用いて多数のアッセイを同時に行うことができるからである。ポリペプチドを結合させる特定の仕方は、本発明の試薬および方法全体と適合でき、ペプチドの活性が保持され、非拡散性である限り、重要ではない。
【0167】
好ましい結合法としては、抗体の使用(これは、その結合タンパク質へのRET16の結合を妨害してはならない)、「粘着性」またはイオン性の支持体への直接結合、化学的架橋などが挙げられる。ポリペプチドの結合後、過剰の未結合物質を洗浄により取り除く。ついで、必要なら試料受容領域をウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインまたは他の無害/非反応性のタンパク質とともにインキュベートしてブロッキングすることができる。
【0168】
候補生物活性剤をアッセイに加える。新規の結合剤としては、特異的な抗体、化学ライブラリーのスクリーニングで同定した天然に存在しない結合剤、ペプチドアナログなどが挙げられる。特に興味が持たれるのは、ヒトの細胞に対して低い毒性を有する剤のスクリーニングアッセイである。この目的のために広範な様々なアッセイを用いることができ、たとえば、標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のためのイムノアッセイなどが挙げられる。本明細書で使用する「薬剤」なる語は、RET16タンパク質の生物活性を直接または間接に変える能力を有するあらゆる分子、たとえばタンパク質、オリゴペプチド、小さな有機分子、多糖、ポリヌクレオチドなどをいう。一般に、複数のアッセイ混合物を種々の濃度の剤で平行して行って、種々の濃度に対する異なる応答を得る。典型的に、これら濃度のうちの1つは負の対照、すなわちゼロの濃度、または検出レベル以下である。
【0169】
候補薬剤は、典型的には有機分子、好ましくは分子量が100を超えて約10,000ダルトン未満、好ましくは約2000〜5000ダルトン未満(制限されない例として)の小さな有機化合物であるが、多くの化学クラスを包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、とりわけ水素結合に必要な官能基を含み、典型的に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの官能化学基を含む。候補薬剤はしばしば、環式炭素またはへテロ環式構造および/または芳香族または多芳香族構造(上記官能基の1またはそれ以上で置換)を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、その構造的アナログまたはその組み合わせを含む生体分子にも見出される。
【0170】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む様々な採取源から得られる。たとえば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、広範な様々な有機化合物および生体分子のランダムなおよび指令した合成を利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを利用できるかまたは容易に生成できる。さらに、天然または合成により生成したライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変できる。既知の薬理学的剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指令したまたはランダムな化学的修飾に供して構造的なアナログを生成することができる。
【0171】
候補生物活性剤のRET16ポリペプチドへの結合の決定は、当該技術分野で実施されている多くの仕方で行うことができる。1つの側面において、候補生物活性剤を標識し、結合を直接決定する。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合は、1またはそれ以上の分子を標識に供し、その際、該標識は直接または間接に検出しうるシグナルを生成することができる。種々の標識には、放射性同位元素、蛍光および化学ルミネセンス化合物、特異的結合分子、粒子、たとえばマグネチック粒子などが含まれる。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのペアが挙げられる。特異的結合成員については、相補的な成員を通常、公知の方法に従って検出を可能とする分子で標識する。幾つかの態様では1のみの成員を標識する。あるいは、1を超える成員を異なる標識で標識することができる;たとえば、RET16ポリペプチドを1の蛍光団で標識し、候補薬剤を他の蛍光団で標識することができる。
【0172】
1つの態様において、候補生物活性剤を標識する。標識した候補生物活性剤をRET16ポリペプチドとともに結合を形成するのに充分な時間(もしも存在するなら)インキュベートする。インキュベーションは最適な活性を容易にする温度、典型的に4℃〜40℃で行うことができる。インキュベーション時間は最適活性のために選択するが、迅速な高処理量スクリーニングを容易にすべく最適化することもできる。典型的に0.1〜1時間で充分である。過剰の試薬は一般に取り除くかまたは洗浄して除く。標識成分の存在または不在を検出して結合を決定し指示する。
【0173】
様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。そのような試薬としては、これらに限られるものではないが、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、および/または非特異的なまたはバックグラウンドの相互反応を低減することのできる、塩、中性タンパク質、たとえばアルブミン、界面活性剤などが挙げられる。さらに、アッセイの効率を他の仕方で改善する試薬、たとえば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などを用いることができる。さらに、本方法における成分の混合物は、必要な結合を提供するいかなる順で加えることもできる。
【0174】
キットが本発明の態様として含まれ、該キットは被験化合物をスクリーニングするのに必要な試薬を入れた容器を含む。試験のデザインおよび化合物の種類に応じて、そのようなキットはヒトRET16ポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアッセイを実施する教示を含んでいてよい。
【0175】
分子進化による本発明のRET16タンパク質の生物学的活性/機能的特徴の促進
知られた大抵の生物学的に活性なタンパク質の多くは生体内でのその特別の機能について極めて有効ではあるが、トランスジェニック、治療的、薬理学的、および/または工業的な応用には望ましくないものにする特徴または特性を有する。これら特徴または特性のなかでも短い半減期が最も顕著な問題であり、これはタンパク質レベルでもタンパク質のmRNAレベルでも存在する。たとえば、半減期を延ばすことができることは、遺伝子療法、トランスジェニック動物の生成、バイオプロセシング、タンパク質の製造および精製でのタンパク質の使用、およびとりわけ化学モデュレーターとしてのタンパク質の使用に際して特に重要である。それゆえ、タンパク質の一般的な工業的および薬理学的応用に加えて動物由来の疾患の治療用の治療剤としての応用を促進する特徴を有する単離タンパク質の新規な変異体を同定することの必要性が存在する。
【0176】
それゆえ、本発明の1つの側面に従い、本発明たとえばRET16ポリヌクレオチドおよび/またはタンパク質の特定の特徴を指令(directed)分子進化により促進する能力が提供される。そのような促進は、制限されない例として、以下のような利点がある:キットにおける必須成分としての本発明の有用性;本発明の物理的な貢献、たとえばその溶解度、構造、またはコドン最適化;本発明の特定の生物学的活性、たとえば関連酵素活性、タンパク質の酵素動力学、タンパク質のKi、Kcat、Km、Vmax、Kd;タンパク質−DNA結合活性;アンタゴニスト/抑制活性(直接または間接の相互作用を含む);アゴニスト活性(直接または間接の相互作用を含む);タンパク質の抗原性(たとえば、タンパク質の抗原性の可能性を増大または低減するのが望ましい);タンパク質の免疫原性;タンパク質がそれ自体または他のタンパク質と二量体、三量体、またはマルチマーを形成する能力;および本発明の抗原性としての効力(疾患または疾患状態の予防的処置として、または標的疾患遺伝子に対するエフェクターとしてのその後の使用を含む)。さらに、タンパク質の特定の特徴を促進する能力はまた、特徴付けられた酵素の特徴を最初に特徴付けられた活性とは全く関係のない活性に変えることに応用できる。本発明の他の望ましい促進は個々のタンパク質に特異なものであり、それゆえ当該技術分野でよく知られており、本発明により包含されるであろう。
【0177】
たとえば、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、その基質との結合後に構成的に活性なものにすることができる。あるいは、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、基質結合の不在下で構成的に活性なものにすることができる。さらに他の例として、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、ユビキチンリガーゼ酵素活性化に通常必要とされる制御因子および/または条件(たとえば、基質結合、リン酸化、コンホメーションの変化など)の全てよりも少ないもので活性化されうる。そのようなユビキチンリガーゼ酵素は、本明細書に記載した使用のなかでもとりわけ、ユビキチンリガーゼ酵素モデュレーターを同定するためのスクリーニングに有用である。あるいは、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、変化した基質特異性、および/または促進されたユビキチンリガーゼ酵素活性を有していてよい。あるいは、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、低減したユビキチンリガーゼ酵素活性を有していてよい。
【0178】
指令進化は幾つかの工程からなる。第一の工程は、目的とする遺伝子またはタンパク質についての変異体のライブラリーを確立する。ついで、最も重要な工程は同定すべき活性を備えた変異体を選択することである。スクリーニングのデザインは最も重要である、というのはスクリーニングは有用でない変異体を排除するに充分なほど選択的でなければならないが全ての変異体を排除してしまうほど厳格であってはならないからである。ついで、最後の工程は、その前のスクリーニングからの最良の変異体を用いて上記工程を繰返すことである。ついで、各連続サイクルは、たとえばスクリーニングの厳格さを増大させるなど必要に応じて改変することができる。
【0179】
DNAシャフリング反応を行うため、種々の反応条件を用いることができる。しかしながら、たとえばPNASUSA, 91: 10747 (1994)に記載されているように、DNAシャフリングの特別の反応条件が提供されている。簡単に説明すると、DNAシャフリング反応に供すべきDNA基質を調製する。調製は、DNAを単に混入細胞物質、化学物質、緩衝液、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド、RNAなどから精製する形態であってよく、DNA精製キット、たとえばQiagen, Inc.やPromega, Corp.によって提供されるものなどを使用することができる。
【0180】
DNA基質が精製されたら、DNアーゼI消化に供する。約2〜4μgのDNA基質を100μlの50mMトリス−HCl、pH7.4/1mM MgCl2中の0.0015単位/μlのDNアーゼI(Sigma)で室温にて10〜20分間消化する。ついで、得られた10〜50bpのDNA断片を、低融点アガロースゲル(2%)の電気泳動および/またはDE81イオン交換紙(Whatman)に供して精製する。あるいは、DNA断片の精製は、適当な分子量カットオフのMicroconコンセントレーター(Amicon)を用いて行うことができ、または当該技術分野で知られた他の方法に加えてオリゴヌクレオチド精製カラム(Qiagen)を用いることができる。DE81イオン交換紙を用いる場合は、1M NaClを用いて10〜50bp断片を紙から溶離し、ついでエタノール沈殿させる。
【0181】
ついで、得られた精製断片を、PCR混合物(2mMの各dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mMトリス・HCL、pH9.0および0.1%Triton X-100を含有)中に10〜30ng/μlの最終断片濃度にて再懸濁することによってPCRアセンブリー反応に供する。この時点ではプライマーは加えない。Taq DNAポリメラーゼ(Promega)を100μlの反応混合物当たり2.5単位にて用いる。94℃で60秒、94℃で30秒、50〜55℃で30秒および72℃で30秒のPCRプログラムを30〜45サイクル、ついで72℃で5分間をMJ Research(ケンブリッジ、マサチューセッツ)PTC−150サーモサイクラーを用いて行う。
【0182】
アセンブリー反応が完了後、ついでプライマーなしで得られた生成物を08μmの各プライマーを含むPCR混合物(アセンブリー反応に用いたのと同じ緩衝液混合物を使用)に入れ、この混合物を15サイクルのPCR(94℃で30秒、50℃で30秒および72℃で30秒)に供する。好ましいプライマーは、シャフリング反応に用いたポリヌクレオチドの核酸配列に対応するものである。そのようなプライマーは、当該技術分野で知られ本明細書でも言及している方法を用いて修飾した核酸塩基対からなっていてよいし、またはさらなる配列(すなわち、制限部位の付加、特定の塩基対の変異などのため)を含んでいてもよい。かくして得られたシャフリングし、アセンブリーし、増幅した生成物は当該技術分野でよく知られた方法(たとえば、Qiagen PCR精製キット)を用いて精製し、ついで引き続き適当な制限酵素を用いてクローニングすることができる。
【0183】
今日まで多くのDNAシャフリングの改変法が刊行されているが、そのような改変法は当業者にはよく理解されており、本発明により包含される。DNAシャフリング法はまた、Zhaoら、1997, Nucl. Acid Res., 25(6): 1307-1308に記載されている方法を用いて所望のレベルの突然変異誘発を得るために改変することもできる。
【0184】
上記のように、ランダム化したプールが生成されたら、ついで所望の特性を有する変異体を同定すべく特定のスクリーニングに供することができる。変異体が同定されたら、ついで変異体に対応するDNAをDNA基質として用いて他のDNAシャフリングを開始することができる。このシャフリング、目的とする最適変異体の選択、および再シャフリングのサイクルを、最終的な変異体が得られるまで繰返すことができる。DNAシャフリング法を用いて生成した変異体を同定するのに適用するモデルスクリーニングの例は、以下の刊行物に見出すことができる:J. C. Mooreら、1997, J. Mol. Biol., 272: 336-347; F. R. Crossら、1998, Mol. Cell. Biol., 18; 2923-2931;およびA. Crameriら、1997, Nat. Biotech., 15: 436-438。
【0185】
DNAシャフリングには幾つかの利点がある。第一に、DNAシャフリングは有益な変異を用いる。DNAシャフリングは、スクリーニングと組み合わせると最良の変異の組み合わせの発見を可能とし、最良の組み合わせが集団中の全ての変異を含んでいることを想定しない。第二に、組換えが点変異と同時に生じる。小断片DNAプールから完全長遺伝子を合成することをDNAポリメラーゼに強いることの効果は、バックグラウンドの突然変異誘発率という結果となる。厳格な選択法と組み合わせると、酵素活性は野生型の酵素に比べて16000倍まで増大させることができた。本質的に、バックグラウンドの突然変異誘発は遺伝子変動性(genetic variability)を生成し、この遺伝子変動性に対して組換えは酵素活性を促進すべく作用する。
【0186】
組換えの第三の特徴は、有害な変異を除去するために用いることができることである。上記で検討したように、ランダム化のプロセスの際に各々の有益な変異について少なくとも1またはそれ以上の中立または抑制的な変異が生じうる。そのような変異は、アセンブリー反応中に前の選択から選択した変異体のランダムサイズの断片に加えて過剰の野生型ランダムサイズ断片を加えることによって除去することができる。つぎの選択の際に、ポリヌクレオチド/ポリペプチド/酵素の殆どの活性変異体の幾つかは抑制的変異体を失っているに違いない。
【0187】
最後に、組換えは平行したプロセシングを可能にする。このことは極めて有利である、というのはタンパク質を一層望ましいものにする複数の特徴(たとえば、溶解性、活性など)が存在しやすいからである。1を超える望ましい特徴または特性を一度にスクリーニングすることはますます困難であるので、分子進化の他の方法は抑制的となりやすい。しかしながら、組換えを用いれば種々の特性について最良の代表的変異体のランダム化断片を組み合わせ、ついで複数の特性を一度に選択することができる。
【0188】
DNAシャフリングはまた、特定の宿主における免疫原性を低減するために本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに適用することができる。たとえば、DNAシャフリング法を用いて本発明の特定の変異体を生成し、単離することができる。そのような変異体は、その新規な固有の構造ゆえに宿主において高度に免疫原性であるかもしれないが、所望の特徴の全てを有していることができる。詳細には、所望の特徴はポリペプチドに非天然の構造を有するようにさせ、この構造がもはや「自己の」分子としては認識されず「外来のもの」として認識され、かくして新規な変異体に向けられた宿主の免疫応答を活性化することになる。そのような問題は、たとえば、天然タンパク質の生体異物オーソログの遺伝子配列のコピーを新規な変異体遺伝子の遺伝子配列とともにDNAシャフリングの1またはそれ以上のサイクルに含めることによって克服することができる。オーソログと新規な変異体DNAとのモル比はしかるべく変えることができる。理想的には、その結果得られる同定したハイブリッド変異体は、生体異物タンパク質を宿主の免疫系から回避させるコード配列の少なくとも幾つかと、所望の特徴を付与する元々の新規な変異体のコード配列とを含んでいる。
【0189】
同様に、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの進化にDNAシャフリング法を適用することを包含し、その際、DNAシャフリングの1またはそれ以上のサイクルは、遺伝子鋳型DNAに加えて既知のアレル配列をコードするオリゴヌクレオチド、最適化コドン配列、既知の変異体配列、既知のポリヌクレオチド多型配列、既知のオーソログ配列、既知のホモログ配列、付加的な相同配列、付加的な非相同配列、他の種からの配列、およびこれらのあらゆる組み合わせを含む。
【0190】
上記方法に加え、ある種の場合にこの観点から適用でき、または望ましい多くの関連する方法がある。これら方法の代表例は、PCT出願WO98/31700およびWO98/32845(参照のため本明細書に引用する)に記載されている方法である。さらに、PCT出願WO98/13485、WO98/13487、WO98/27230.WO98/31837、およびA. Crameriら、1997, Nat. Biotech., 15: 436-438にそれぞれ記載されているように、遺伝子療法、タンパク質工学、変異体を含む全細胞の進化、または本発明のポリヌクレオチドを含む全酵素経路の進化に使用するための理想的な変異体を生成するため、本発明のポリヌクレオチド配列に関連法を適用することもできる。
【0191】
「DNAシャフリング」法を本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに適用するさらなる方法は、その提唱された適用も含めて米国特許第5,605,793号;PCT出願WO95/22625;PCT出願WO97/20078;PCT出願WO97/35966;およびPCT出願WO98/42832に見出すことができる。PCT出願WO00/09727はとりわけDNAシャフリングを除草剤選択的作物の同定に適用する方法を提供しており、これを本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに適用することができる。さらに、PCT出願WO00/12680は、植物種に検出可能な表現型特性を付与するポリヌクレオチド配列を生成、改変、適合、および最適化する方法および組成物を提供している。上記の各出願は、全ての目的のためその全体を本明細書に引用する。
【0192】
医薬組成物
本発明のさらなる態様は、RET16核酸、コードされたポリペプチド、またはペプチド、RET16ポリペプチドに対する抗体、またはそのフラグメント、RET16ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのミメチック、アゴニスト(たとえば、アクチベーター)、またはアンタゴニスト(たとえば、インヒビター)を含む、生理的に許容しうるおよび薬理学的に許容しうる組成物を包含する。本発明にはまた、上記治療用の使用および効果のために、薬理学的または生理的に許容しうる組成物を薬理学的に許容しうる担体、希釈剤、または賦形剤とともに投与することが包含される。組成物は単独または少なくとも1の他の薬剤、たとえば安定化化合物と組み合わせて投与することができ、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含む(これらに限られるものではない)滅菌した生体適合性の薬理学的担体中にて投与することができる。組成物は、単独または他の薬剤、医薬、ホルモン、または生物応答調節剤と組み合わせて患者に投与することができる。
【0193】
本発明に使用する医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、くも膜下、脳室内、皮内、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、膣内、または直腸内手段を含む(これらに限られるものではない)多くの経路で投与することができる。
【0194】
医薬組成物は、活性成分(すなわち、RET16核酸、またはポリペプチド、またはその機能性の断片)に加えて適当な薬理学的に許容しうる担体または賦形剤(活性成分を薬理学的に使用できる調製物にプロセシングするのを容易にする補助剤を含む)を含んでいてよい。製剤化および投与の技術に関するさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.、イーストン、ペンシルベニア)の最新版に記載されている。
【0195】
経口投与用の医薬組成物は、当該技術分野でよく知られた薬理学的に許容しうる担体を用い、経口投与に適した剤型にて製剤化することができる。そのような担体は、患者が摂取するために錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー、懸濁剤などに製剤化することを可能にする。
【0196】
経口使用のための医薬製剤は、活性成分を固形賦形剤と組み合わせ、得られた混合物を任意に破砕し、ついで所望なら適当な補助剤を加えた後に顆粒混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。適当な賦形剤は、炭水化物または炭水化物充填剤、たとえば糖(ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む);トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物からのデンプン;セルロース、たとえばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム;ガム(アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含む)、およびゼラチンやコラーゲンなどのタンパク質である。所望なら、崩壊剤または可溶化剤、たとえば架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸、または生理学的に許容しうるその塩、たとえばアルギン酸ナトリウムを加えることができる。
【0197】
糖衣錠コアを生理学的に適したコーティング、たとえば濃縮した糖溶液(アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタンを含んでいてよい)、ラッカー(lacquer)溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物とともに用いることができる。染料または色素を製品の識別のため、または活性成分の量(すなわち、投与量)を特徴付けるために錠剤または糖衣錠のコーティングに加えることができる。
【0198】
経口で使用できる医薬製剤としては、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル剤、並びにゼラチンおよびコーティング(グリセリンまたはソルビトールなど)で作られた軟計量カプセル剤が挙げられる。プッシュフィットのカプセル剤は、活性成分を充填剤または結合剤(ラクトースやデンプンなど)、滑沢剤(タルクやステアリン酸マグネシウムなど)、および任意に安定化剤と混合して含んでいてよい。軟カプセル剤では、活性化合物は適当な液体(脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなど)中に安定化剤とともにまたは安定化剤なしで溶解または懸濁する。
【0199】
腹腔内投与に適した医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液(ハンク液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水など)中で製剤化する。水性の注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、たとえばカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当に油状の注射懸濁液として調製できる。適当な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルやトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。任意に、懸濁液はまた、高度に濃縮した溶液の調製を可能とすべく、適当な安定化剤または化合物の安定性を増大する薬剤を含んでいてよい。
【0200】
局所または鼻内投与のためには、特定のバリヤーを透過性にするのに適した浸透剤または透過剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は当該技術分野で一般に知られている。
【0201】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で知られた仕方で、たとえば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣生成、すりつぶし、乳濁化、カプセル化、包括、または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。
【0202】
医薬組成物は塩の形態で提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む(これらに限られるものではない)多くの酸を用いて製剤化することができる。酸は、対応の遊離塩基形態と比べて水性溶媒、または他のプロトン性溶媒中で溶解度が高い傾向がある。他の場合において、好ましい製剤は以下のいずれかまたは全てを含む凍結乾燥粉末であってよく:1〜50mMヒスチジン、0.1%〜2%ショ糖、および2〜7%マンニトール(4.5〜5.5のpH範囲)、使用前に緩衝液と混合する。医薬組成物を調製後、適当な容器に入れ、指示した条件の処置について表示することができる。RET16生成物の投与のためには、そのような表示としては投与の量、頻度、および方法が挙げられる。
【0203】
本発明に使用するのに適した医薬組成物は、意図した目的を達成するのに有効な量で活性成分を含む組成物を包含する。有効な投与量または量の決定は、充分に当業者がなし得る範囲である。いずれの化合物についても、治療学的に有効な量は、たとえば新生物細胞を用いた細胞培養アッセイにて、または動物モデル(通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタ)にて最初に評価することができる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するのにも用いることができる。ついで、そのような情報を用いてヒトの投与に有用な投与量および投与経路を決定するのに外挿することができる。
【0204】
治療学的有効量とは、症状または状態を改善、低減、または除去する、活性成分、たとえばRET16ポリペプチド、または活性なその断片、RET16ポリペプチドに対する抗体、RET16ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの量をいう。治療の有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準医薬手順、たとえばED50(集団の50%において治療学的に有効な投与量)およびLD50(集団の50%に致死的な投与量)により決定することができる。治療効果に対する毒性効果の投与量の比は治療指数であり、ED50/LD50の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験で得られたデータは、ヒトに使用する投与量の範囲を決定するのに用いる。医薬組成物中に含まれる好ましい投与量は、毒性が殆どまたは全くなしのED50を含む循環濃度の範囲である。投与量は、使用した剤型、患者の感受性、および投与経路に応じて上記範囲内で変わるであろう。
【0205】
正確な投与量は、個々の必要な治療と関連した因子を考慮した実施者によって決定されるであろう。投与量および投与は、活性成分の充分なレベルを与えるよう、または所望の作用を保持するよう、調節する。考慮に入れる因子としては、個々の疾患状態の重篤さ、患者の一般的健康状態、年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および頻度、薬剤の併用、反応の感受性、および治療に対する耐性/応答が挙げられる。一般的な手引きとして、長期間作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて3〜4日ごと、1週間ごと、または2週間ごとに投与することができる。
【0206】
通常の投与量は、投与経路に応じて0.1〜100,000μgから合計約1gまでの範囲であってよい。特定の投与量および送達方法に関する手引きは文献に記載されており、一般に当該技術分野の実施者に利用できる。当業者であればヌクレオチドについてはタンパク質またはそのインヒビターとは異なる製剤を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
【0207】
アッセイおよび診断
本発明の他の態様において、RET16タンパク質に特異的に結合する抗体は、RET16ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現(または過剰発現)を特徴とする状態または疾患の診断、RET16ポリペプチド、またはそのアゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターで処置した患者をモニターするアッセイに用いることができる。診断目的に有用な抗体は、治療法に使用するために上記に記載したのと同じ仕方で調製することができる。RET16ポリペプチドの診断アッセイとしては、抗体および標識を利用してヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出物中のタンパク質を検出する方法が挙げられる。抗体は改変してまたは改変せずに用いることができ、共有結合によるかまたは非共有結合のいずれかによりリポーター分子に結合することにより標識することができる。当該技術分野で知られた広範な様々なリポーター分子を用いることができ、その幾つかは本明細書に記載してある。
【0208】
RET16ポリペプチドを測定するためのELISA、RIAおよびFACSを含む幾つかのアッセイプロトコールが当該技術分野で知られており、RET16ポリペプチド発現の変化したまたは異常なレベルを診断するための基礎を提供する。RET16ポリペプチド発現の正常なまたは標準の値は、正常な哺乳動物主体、好ましくはヒトから採取した体液または細胞抽出物をRET16ポリペプチドに対する抗体と複合体を生成するのに適した条件下で混合することにより確立される。標準的な複合体生成の量は、種々の方法により定量することができる;測光手段が好ましい。患者試料、対照試料、および生検組織からの疾患試料で発現されるRET16ポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と患者の値との間の偏差は疾患を診断するパラメータを確立する。
【0209】
本発明の他の態様に従い、RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを診断目的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNAおよびDNA分子、およびPNAが挙げられる。ポリヌクレオチドは、RET16ポリヌクレオチドの発現(または過少もしくは過剰発現)が疾患と相関関係を有する生検組織におけるRET16コード核酸配列の発現を検出および定量するのに用いることができる。診断アッセイは、RET16の不在、存在、および過剰発現を識別するため、および本発明の治療法の際にRET16ポリヌクレオチドレベルの制御をモニターするのに用いることができる。
【0210】
関連する側面において、RET16ポリペプチドまたは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することのできるPCRプローブとのハイブリダイゼーションを、RET16ポリペプチドをコードする核酸配列を同定するのに用いることができる。プローブの特異性、すなわちそれが高度に特異的な領域、たとえば5'調節領域中の約8ないし10または12または15の連続したヌクレオチドからできているのか、またはより特異的でない領域、たとえば特に3'非コード領域からできているのかという点、およびハイブリダイゼーションまたは増幅の厳格さは、プローブがRET16ポリペプチドをコードする天然の配列、そのアレル、または関連配列のみを同定するか否かを決定するであろう。
【0211】
プローブはまた関連配列の検出に用いることもでき、RET16ポリペプチドをコードするヌクレオチドの少なくとも50%、好ましくは80%以上を含んでいるのが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAであってよく、配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列から、またはプロモーター、エンハンサー配列、および天然RET16タンパク質のイントロンを含むゲノム配列からのものであってよい。
【0212】
RET16ポリペプチドをコードするDNAの特定のハイブリダイゼーションプローブを製造する方法は、RET16ポリペプチド、またはRET16誘導体をコードする核酸配列のmRNAプローブ産生用ベクターへのクローニングを含む。そのようなベクターは当該技術分野で知られており、市販されており、適当なRNAポリメラーゼおよび適当な標識ヌクレオチドを加えることによりインビトロでRNAプローブを合成するのに用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のデテクター/リポーター基、たとえば32Pや35Sなどの放射性核種、またはアビジン/ビオチン結合系によりプローブに結合したアルカリホスファターゼなどの酵素標識により標識することができる。
【0213】
RET16ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、患者生検からの流体または組織を用い、サザーンまたはノーザン分析、ドットブロット、または他のメンブレンベースの方法;PCR法;またはディップスティック、ピン、ELISAまたはチップアッセイに用いてRET16の状態、たとえばRET16のレベルまたは過剰発現を検出し、または変化したRET16発現を検出することができる。そのような定性的または定量的方法は当該技術分野でよく知られている。
【0214】
特別の側面において、RET16ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、種々の炎症性疾患、新生物または癌、とりわけ上記に記載したものの活性化または誘発を検出するアッセイに有用である。RET16ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は標準法により標識することができ、ハイブリダイゼーション複合体を生成するのに適した条件下で患者からの流体または組織試料に加えることができる。適当なインキュベーション時間の後、試料を洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。生検試料または抽出試料におけるシグナルの量が比較対照試料からのものに比べて有意に変わっておれば、該ヌクレオチド配列は試料中に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズしたのであり、試料中のRET16ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在または変化したレベルは関連する疾患の存在を示している。そのようなアッセイはまた、動物実験、臨床試験、または個々の患者の処置のモニタリングにおける特定の治療処置計画の有効性を評価するのに用いることもできる。
【0215】
RET16の発現と関連する疾患の診断の基礎を与えるため、正常なまたは標準の発現プロフィルを確立する。このことは、正常な主体(動物かまたはヒト)から採取した体液または細胞抽出物を、RET16ポリペプチドをコードする配列またはその断片とハイブリダイゼーションまたは増幅に適した条件下で混合することにより達成することができる。標準ハイブリダイゼーションの定量は、正常な主体から得た値を既知の実質的に精製したポリヌクレオチドを使用した実験で得られた値と比較することにより行うことができる。正常な主体から得た標準値を、疾患の症状を有する患者からの試料から得た値と比較することができる。標準値と主体(患者)の値との偏差を用いて疾患の存在を確立する。
【0216】
疾患が確立され、治療プロトコールが開始されたら、ハイブリダイゼーションアッセイを規則的に繰返して患者における発現レベルが正常個体で観察される発現レベルに近づいているか否かを評価することができる。連続したアッセイで得た結果は、数日から数ヶ月にわたる期間での治療の有効性を示すのに用いることができる。
【0217】
癌に関しては、個体からの生検組織中の異常な量の転写物の存在は、疾患の発症の素因を示すことがあり、急性の臨床徴候の出現前に疾患を検出する手段を提供することができる。このタイプの一層明確な診断は、健康の専門家が予防的手段またはより早期の攻撃的処置を採用することを可能とし、それによって癌の発生またはさらなる進行を防ぐことができる。
【0218】
RET16ポリペプチドをコードする核酸配列からデザインしたオリゴヌクレオチドの他の診断的用途は、PCRの使用を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、化学的に合成し、酵素を用いて生成し、または組換え源から生成することができる。オリゴマーは好ましくは2つのヌクレオチド配列を含み、1つはセンス方向(5'から3'方向)のものであり、他はアンチセンス方向(3'から5'方向)のものであって、特定の遺伝子または状態の同定に最適な条件下で用いる。同じ2つのオリゴマー、オリゴマーのネステッドセット、またはオリゴマーの縮重プールでさえも、密接に関連したDNAまたはRNA配列の検出および/または定量のためにより厳格でない条件下で用いることができる。
【0219】
RET16の発現を定量するのに適した方法としては、ヌクレオチドの放射性標識またはビオチン化、対照核酸の同時増幅、および実験結果を外挿する標準曲線が挙げられる(P. C. Melbyら、1993, J. Immunol. Methods, 159: 235-244;およびC. Duplaaら、1993, Anal. Biochem., 229-236)。複数の試料の定量スピードは、目的オリゴマーを種々の希釈で提示し、分光測光応答または比色応答が迅速な定量を与えるELISA形態のアッセイを行うことにより加速することができる。
【0220】
本発明の他の態様において、本明細書に記載するRET16ポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチド、またはより長い断片は、マイクロアレイにおいて標的として用いることができる。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターしたり(転写像を生成する)、遺伝子変異体、変異および多型を同定するのに用いることができる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝子ベースでの理解、疾患の診断、および治療剤の開発およびその活性のモニターに用いることができる。特別の態様において、マイクロアレイは、WO95/11995(Cheeら);D. J. Lockhartら、1996, Nature Biotechnology, 14: 1675-1680;およびM. Schenaら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 10614-10619に記載された方法に従って調製および使用することができる。マイクロアレイはさらにP. Lalらの米国特許第6,015,702号に記載されている。
【0221】
本発明のさらなる態様において、RET16ポリペプチドをコードすっる核酸配列はまた、天然のゲノム配列のマッピングに有用なハイブリダイゼーションプローブを生成するのに用いることもできる。配列は、C. M. Price, 1993, Blood Rev., 7: 127-134およびB. J. Trask, 1991, Trends Genet., 7: 149-154に概説されているように、特定の染色体、染色体の特定の領域、または人工染色体構築物(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌PI構築物、または単一染色体cDNAライブラリーにマッピングすることができる。
【0222】
本発明の他の態様において、RET16ポリペプチド、その触媒的または免疫原性の断片またはオリゴペプチドは、様々な医薬スクリーニング法のいずれにおいても化合物のライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。そのようなスクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離の状態、固相支持体に付着、細胞表面上に生成、または細胞内に位置していてよい。RET16ポリペプチドまたはその部分と試験した薬剤との結合複合体の生成は、当該技術分野で通常実施され上記に記載した方法を用いて測定することができる。
【0223】
使用できる医薬スクリーニングの他の方法は、WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対する適した結合親和性を有する化合物の高処理量スクリーニングを提供する。この方法では、RET16タンパク質に適用する場合、多数の異なる小さな被験化合物を固相基体、たとえばプラスチックピンまたは他の表面上に合成する。被験化合物をRET16ポリペプチドまたはその断片と反応させ、洗浄する。ついで、結合したRET16ポリペプチドを当該技術分野で知られた方法により検出する。上記医薬スクリーニング法に使用するため、精製したRET16ポリペプチドをプレート上に直接コーティングすることもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固相支持体上に固定化することができる。
【0224】
所定のタンパク質、すなわちRET16タンパク質に結合することのできる小さな分子の検出または同定を含む他のスクリーニングおよび小分子(たとえば、医薬)検出アッセイが本発明により包含される。特に好ましいのは、高処理量スクリーニング法に適したアッセイである。そのような結合ベースのスクリーニングまたは検出アッセイでは、機能的なアッセイは一般に必要ではない。必要なのは、標的タンパク質、好ましくは実質的に精製したもの、および該タンパク質標的への結合についてスクリーニングまたはアッセイすべき化合物(たとえば、リガンド、医薬、小分子)のライブラリーまたはパネルだけである。好ましくは、標的タンパク質に結合する大抵の小分子は、該タンパク質の機能性の領域または部位に優先的にかつ一層高い親和性にて結合するため、何らかの仕方で活性を変調させるであろう。
【0225】
そのようなアッセイの例は、Pantolianoらの米国特許第6,020,141号および同第6,036,920号に記載されている(J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20(8)をも参照)蛍光ベース熱シフトアッセイ(3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.、3DP、エクソン、ペンシルベニア)である。このアッセイは、タンパク質−医薬またはリガンド複合体の熱変性曲線を分析することにより、発現され好ましくは精製したRET16ポリペプチドに結合する小分子(たとえば、医薬、リガンド)の検出を結合決定基の親和性に基づいて可能にする。この方法で決定した医薬または結合分子は、所望なら本明細書に記載した方法などの方法によりさらにアッセイして、該分子が標的タンパク質の機能または活性に影響を及ぼすあるいは変調するか否かを決定することができる。
【0226】
本発明のさらなる態様において、競合医薬スクリーニングアッセイを用いることができ、この場合、RET16ポリペプチドに結合することのできる中和抗体がRET16ポリペプチドへの結合に対して被験化合物と特異的に競合する。この方法では、これら抗体を用い、RET16ポリペプチドと1またはそれ以上の抗原決定基が共通するペプチドの存在を検出することができる。
【0227】
トランスジェニックおよびノックアウト
本発明はさらに、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を含むヒトRET16をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスを包含する。
【0228】
組換えタンパク質を産生するのに有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、それに必要な発現ベクターおよびトランスジェニック動物を生成する技術と同様、熟練した実施者によく知られている。一般に、トランスジェニック動物は組換え発現ベクターを含んでいるが、該組換え発現ベクターでは、ヒトRET16をコードする核酸配列が組織特異的なプロモーターに作動可能に連結して含まれており、それによってコード配列が該特異的組織でのみ発現される。たとえば、組織特異的なプロモーターは哺乳動物細胞特異的なプロモーターであってよく、かくして発現された組換えタンパク質は動物の乳から回収する。
【0229】
ヒトRET16をコードする核酸分子を含むトランスジェニック動物、とりわけトランスジェニックマウスは、RET16の過剰発現をインビボで調べる動物モデルとして、並びに医薬評価、およびRET16の活性を抑制または変調するのに有効な化合物、たとえば炎症性障害、疾患、または状態を治療するための化合物を探索する活動に使用することができる。当業者であれば、標準技術、たとえばWagnerの米国特許第4,873,191号(1989年10月10日発行)およびLederの米国特許第4,736,866号(1988年4月12日発行)に教示されているものを用い、ヒトRET16を生成するトランスジェニック動物を産生し、該動物を医薬評価や新規発見プロジェクトに用いることができる。
【0230】
本発明の他の側面は、ノックアウトマウスおよびその使用方法に関する。とりわけ、よく知られた方法を用いて動物に導入した変異した非機能性のRET16遺伝子についてホモ接合性であるトランスジェニックマウスを生成することができる。ノックアウトマウスは機能性のRET16を産生しないため、RET16の機能を調べるのに有用である。さらに、ノックアウトマウスは、RET16を欠く動物における被験化合物の効果を調べるアッセイに用いることができる。たとえば、RET16を欠くマウスは、RET16インヒビターが動物に作用を及ぼすか否か、どのようにして、またどの程度作用を及ぼすかを決定するのに用いることができ、それゆえ該分子の活性を抑制することに関連する懸念に対処することができる。
【0231】
遺伝的に欠失した「ノックアウト」マウスを生成する方法はよく知られており、M. R. Capecchi, 1989, Science, 244: 1288-1292およびP. Liら、1995, Cell, 80: 401-411に開示されている。たとえば、マウス(またはヒト)RET16 cDNAクローンを用いてマウスRET16ゲノムクローンを単離することができる。ゲノムクローンを用い、マウス中のRET16遺伝子を相同組換えにより破壊することのできるRET16ターゲティング構築物を調製できる。ターゲティング構築物はRET16遺伝子の非機能性の部分を含んでおり、これが天然のマウス遺伝子の機能性の部分の代わりにを挿入される。非機能性の挿入は、一般に、RET16の活性領域をコードするエクソン中の挿入を含む。ターゲティング構築物は、正および負の両選択のためのマーカーを含んでいてよい。正の選択マーカーは該マーカーを含んでいない細胞の選択的排除を可能とし、一方、負の選択マーカーは該マーカーを含む細胞の排除を可能とする。
【0232】
たとえば、第一の選択マーカーは正のマーカーであって、該マーカーを含む細胞の生存を可能にするであろう。ある場合には、第一の選択マーカーはネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子であり、これをRET16遺伝子のコード配列中において該遺伝子を非機能性にする一方、同時に構築物を選択的にすることができる。抗生物質遺伝子は、天然配列と組み換えることのできる相同領域内にある。それゆえ、相同組換えの後、非機能性の遺伝子配列および抗生物質耐性遺伝子配列が取り込まれるであろう。ノックアウトマウスは、炎症関連障害を調べたりこれら障害を治療する化合物をスクリーニングするためのモデルとして用いることができる。
【0233】
ターゲティング構築物はまた、負の選択マーカーである第二の選択マーカーをも含んでいる。負の選択マーカーを有する細胞は排除されるであろう。第二の選択マーカーは、組換え領域の外側にある。それゆえ、全構築物が細胞内に存在しておれば両マーカーが存在するであろう。もしも構築物が天然の配列と組換えを起こせば、第一の選択マーカーはゲノム中に取り込まれ、第二のマーカーは失われるであろう。単純ヘルペスウイルスチミンキナーゼ(HSV tk)遺伝子は負の選択マーカーの例であり、これを第二のマーカーとして用いてこれを含む細胞を排除することができる。HSV tk遺伝子を有する細胞はガンシクロビアの存在下で選択的に殺される。
【0234】
細胞をターゲティング構築物でトランスフェクションし、ついで第一の選択マーカーの存在および第二の選択マーカーの不在について選択する。ついで、構築物/DNAを胚盤胞段階に注射し、偽妊娠のメスに移植する。組換え遺伝子をその生殖細胞に移すことのできるキメラ子孫を選択し、交配し、その子孫を組換え遺伝子のへテロ接合性キャリヤについて調べる。ついで、へテロ接合性の子孫の交配を用いてRET16欠失ノックアウトマウスを構成する完全にホモ接合性の子孫を生成することができる。
【0235】
本発明の他の態様は、RET16ポリヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド、その断片、またはそれに対する抗体の使用方法を包含する。さらに詳細には、そのような方法は、試料中のポリヌクレオチド配列に特異的に結合する分子または化合物を精製するために該ポリヌクレオチドを使用する方法を含む。そのような方法は、本発明のRET16ポリヌクレオチドを特異的結合を可能とする条件下で混合し;RET16ポリヌクレオチドと試料中の分子または化合物との特異的結合を検出し;結合したポリヌクレオチドを回収し;ついで該ポリヌクレオチドを該分子または該化合物から分離し、それによって精製した分子または化合物を得ることを含む。
【0236】
本発明による他の方法は、細胞シグナル伝達タンパク質、たとえばRET16の活性を変調することのできる候補化合物をスクリーニングことに関し、被験化合物、たとえばアンタゴニストまたはアゴニストをRET16タンパク質、またはその機能性の断片を発現する細胞または組織と接触させ、ついで細胞シグナル伝達カスケードに関与するRET16タンパク質の活性を変調する被験化合物を候補変調化合物として選択することを含む。そのような方法において、RET16細胞シグナル伝達カスケードタンパク質活性は、第二の細胞内細胞シグナル伝達タンパク質の相互作用ドメインへの結合であってよい。
【0237】
本発明によって包含される他の方法は、RET16細胞シグナル伝達タンパク質またはその断片に結合することのできる候補化合物のスクリーニングに関し、被験化合物を、(i)本発明によるRET16細胞シグナル伝達タンパク質を発現する細胞または組織、または(ii)その単離タンパク質と接触させ、ついでRET16細胞シグナル伝達タンパク質に結合する被験化合物を選択することを含む。
【0238】
本発明の他の方法は、RET16タンパク質と第二の細胞シグナル伝達タンパク質との結合を促進、増大、または加速させる化合物を同定するための化合物のスクリーニング法である。そのような方法は、被験化合物の存在下または不在下、本発明によるRET16タンパク質を該タンパク質と結合または会合する第二のシグナル伝達分子と、結合を可能とする条件下で接触させ、ついで被験化合物の存在下での結合レベルを被験化合物の不在下での結合レベルと比較することにより、第二の細胞シグナル伝達分子へのRET16タンパク質の結合レベルが促進、増大または加速されたか否かを決定することを含む。上記方法は高処理量スクリーニングにより行うのに適していることが評価されるであろう。
【0239】
実施例
以下の実施例は本発明を説明するために提供されるのであって、本発明を限定することを意図するものではない。これら実施例は、使用した従来法、たとえばベクターの構築、cDNAのそのようなベクター中への導入、または得られたベクターの適当な宿主への導入などの詳細な記載は含んでいない。そのような方法は当業者によく知られており、多くの刊行物、たとえばSambrook, FritschおよびManiatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、米国に記載されている。
【0240】
実施例1
方法
A.ヒトRET16完全長ORFコード配列の単離
RET16の予測されるコード配列を含むクローンを、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)で6時間処理したヒト微細血管内皮細胞(HMVEC)から逆転写/複製連鎖反応(RT/PCR)を用いて単離した。以下の条件を用い、3つのプライマーセット(各400nMの最終濃度)を用いて1532bp配列を増幅した:
JNF346(5'−TCACCTGCGCGGCACGTGACCC−3')(配列番号17);
JNF493(5'−TTTACTTTTGGTGTGTCTCCAGCC−3')(配列番号18);
JNF494(5'−TTACTTTTGGTGTGTCTCCAGCCATCTATTGATGGC−3')(配列番号19)、
250μlの反応液中の200μM dNTP、1×アドバンテージ2ポリメラーゼPCR緩衝液、1×アドバンテージ2ポリメラーゼ、および2.0μl DNA。94℃で30秒、68℃で30秒、および72℃で2分の実験サイクルを35サイクル行った。反応完了後、6.0μlの負荷染料を加え、臭化エチジウムを含む1.2%アガロースゲルでのゲル電気泳動により全反応を分離した。〜1.6kbのサイズのバンドをゲルから切り出し、QIAgenゲル抽出キット(QIAgen、バレンシア、カリフォルニア)を用いて精製した。この断片をpTAdvクローニングベクター(Clontech、パロアルト、カリフォルニア)にライゲートし、標準法を用いてシークエンシングした。RET16pTAdv Endo 01は、予測されたRET16コード配列に対応する1532bp配列を含んでいる。
【0241】
RET16ポリペプチドをコードする核酸配列は、TNF−アルファ刺激したヒト肺微細血管内皮細胞(HMVEC)からのサブトラクションライブラリーからまず同定した。このサブトラクションクローン配列は、630bpの部分cDNA配列(配列番号5;図4Cに示す)をコードしていた。コンセンサス配列(配列番号1;図1および図3)は、以下の重複および/または拡張核酸配列から得た:Incyteクローン2552523(LUNGTUT06)、4632828(GBLADIT02)、1687704(PROSTUT10)、2674742(KIDNNOT19)、およびパブリックESTクローンAI187875(testis)。
【0242】
B.マウスRET16遺伝子オーソログの同定
ヒトRET16遺伝子のマウスオーソログを同定するため、huRET16のコード配列を用いて上記マウスESTデータベースに対して探索した。幾つかのマウスESTが同定された。それらは以下のとおりである:AU035693、AA118718、AA204608、W41056、AW146018、AI450495、AI875443、AI316544、AW494796、AW146018およびBE983890。muRET16核酸配列は、huRET16と80%の同一性を有している。muRET16アミノ酸配列は、huRET16と82.5%同一である(86.5%の類似性)。muRET16は7つの予測されたWDリピートおよび1つのSAMドメインを有しており、全てスコアは>10であった。
【0243】
C.ヒトRET16遺伝子のゲノム構成
RET16遺伝子配列を含むゲノムクローンを同定した。クローンhRPK.35 A 1(ジーンバンクAN AC006501)を用いてRET16のエクソン−イントロン境界を解読した(図18)。RET16は11のエクソン断片からなっている。エクソン1はヌクレオチド1〜123からなる。エクソン2はヌクレオチド124〜545からなる。エクソン3はヌクレオチド546〜730からなる。エクソン4はヌクレオチド731〜823からなる。エクソン5はヌクレオチド824〜917からなる。エクソン6はヌクレオチド918〜951からなる。エクソン7はヌクレオチド952〜992からなる。エクソン8はヌクレオチド993〜1099からなる。エクソン9はヌクレオチド1100〜1279からなる。エクソン10はヌクレオチド1280〜1420からなる。エクソン11はヌクレオチド1421〜1810からなる。エクソン11の次にはポリAテールが続く。ポリアデニル化部位(AATAA)は1795〜1799に位置する。AC006501によれば、イントロン1〜イントロン10は、それぞれ長さが3489、2755、4123、3750、11859、1824、80、1382、7683、および12181ヌクレオチドである。
【0244】
D.細胞培養のためのHMVEC
単一のドナーからのヒト肺微細血管内皮細胞の一次培養を、Clontech(サンジエゴ、カリフォルニア)から得た。提供されたプロトコールに従い、細胞を内皮細胞増殖対置−キット(CC−3202)中、5%ウシ血清アルブミン(Hyclone、ローガン、ユタ)とともに増殖させた。細胞をトリプシン処理により継代した。細胞をまずT−25組織培養フラスコに接種し、約90%のコンフルエンシーに達した後、ついでT−225組織培養フラスコに1.2×106細胞/フラスコにて継代した。細胞が約90%のコンフルエンシーに達するまで増殖したら、T−225フラスコに1.8×106細胞/mlにて継代し、接種した。正常な増殖条件のため、培地を48時間ごとに交換した。
【0245】
E.RNA単離のためのHMVEC細胞処理
HMVEC細胞のサブコンフルエントな(すなわち、90%コンフルエント)T−225フラスコを、培地を除いてフラスコ当たり40mlの培地に調節した。フラスコの幾つかを10ng/mlのTNF−アルファで1時間、6時間および24時間処理し;他のフラスコは対照としてTNF−アルファで処理しなかった。TNF−アルファ処理した細胞を未処理の細胞と比較した。TNF−アルファを添加する時点では培地を交換しなかった。
【0246】
F.RNAの単離
HMVEC細胞の処理フラスコをトリプシンで簡単に処理した(フラスコ当たり10mlのトリプシン)。ウシ血清アルブミンを50%の最終濃度で添加することによりトリプシン処理を終了させ、フラスコをPBS、pH7.4(Gibco、グランドアイランド、ニューヨーク)で濯いだ。フラスコからのプールした細胞およびPBS濯ぎ液をプールし、10分間遠心分離し(534×g)、細胞ペレットをPBSに再浮遊し、再度遠心分離にかけた。上澄み液を除去し、細胞ペレットをRNA単離に用いた。ポリA+RNAをFast Track 2.0TM(Invitrogen、カールスバード、カリフォルニア)を用いて直接単離した。
【0247】
G.サブトラクションライブラリーの構築
PCRセレクトcDNAサブトラクションキットTM(Clontech、パロアルト、カリフォルニア)を用い、製造業社のプロトコールに従って未処理のHMVECポリA+RNA(テスター)および1時間TNF処理したHMVECポリA+RNA(ドライバー)からサブトラクションライブラリーを生成した。10の二次PCR反応を組み合わせ、2%アガロースゲル上で泳動した。約0.3kb〜10kbの範囲の断片をQIAgenゲル抽出キット(QIAgen、バレンシア、カリフォルニア)を用いてゲル精製し、TAクローニングベクターpCR2.1(Invitrogen)に挿入した。TOP10F’コンピテント大腸菌(Invitrogen)を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを入れたLBプレート上にプレーティングした。クローンを単離し、同様の濃度のアンピシリンを含むLBブロスで増殖させた。プラスミドを標準法に従ってシークエンシングした。
【0248】
H.多組織ノーザンプロトコール
多組織ノーザンブロット(MTN)をClontech(パロアルト、カリフォルニア)から入手した。使用したMTNは、ヒトMTN(#7760−1)、ヒトMTNII(#7759−1)、ヒトMTNIII(#7767−1)、およびヒト癌細胞株MTN(#7757−1)であった、
【0249】
メンブレンをExpressHybハイブリダイゼーション溶液(Clontech)で68℃にて1時間プレハイブリダイズし、ついで以下のように調製した32P標識プローブと2時間ハイブリダイズした:元々の単離RET16サブトラクションクローンをEcoRI制限エンドヌクレアーゼ(Life Technologies、ゲイサーズバーグ、メリーランド)で消化した。540bpの部分cDNA断片を、ランダムプライムド標識キット(Roche Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ)を用い、製造業社の教示に従って32P−dCTPで標識した。放射性プローブを、2×106カウント/分/ml(ハイブリダイゼーション溶液)の比活性にて加えた。
【0250】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを低ストリンジェンシー溶液(2×SSC/0.05%SDS)とともに室温で30分間連続振盪し、溶液を2回交換することによって洗浄した。ついで、メンブレンを高ストリンジェンシー溶液(0.1×SSC/0.1%SDS)で室温にて30分間洗浄した(溶液を1回交換)。メンブレンを強化スクリーンとともにX線フィルムに−70℃にて10日間暴露した(図7A〜7D)。
【0251】
実施例2
huRET16の別のスプライス変異体
RET16(本明細書ではRET16.1ともいう)の2つの別のスプライス形、すなわちRET16.2およびRET16.3を同定した。RET16.2はPCR増幅を用いてTNF−α処理したヒト微細血管内皮細胞から単離した。簡単に説明すると、RET16の完全長のコード配列のクローニングを試みるなかで、1500bpのRET16アンプリマーに加えてより小さなサイズの第二のバンドを増幅した。この第二のアンプリマーは、1300bpよりもわずかに小さく移動した。両断片をpTAdv TAクローニングベクターにクローニングし、シークエンシングした。RET16からのエクソン断片を第二のアンプリマー配列(RET16.2という;RET16のスプライス変異体)とアラインメントした。RET16.2では4つのエクソンが欠失していることがわかった。これらエクソンはエクソン5〜8であり、WDリピート#6および#7に対応する。RET16.2のcDNAクローンは、ブダペスト条約の規定に従い、ATCCに受託番号PTA−3161にて2001年3月7日に寄託してある。従って、本発明はATCC受託番号PTA−3161を含むRET16.2 cDNA核酸配列を提供する。
【0252】
第二のRET16スプライス変異体(RET16.3)を、Incyteクローン同定ナンバー3111127(Incyte Genomics、パロアルト、カリフォルニア)で同定した。クローン3111127をシークエンシングしたところ余分のエクソン断片(9X)を含むことがわかった。このエクソンはエクソン9とエクソン10との間に挿入されている。このエクソンのアミノ酸配列は極めて疎水性である。RET16.3変異体のアミノ酸配列をSEQ−WEBで分析したところ、膜貫通ドメインの存在が示された。この余分のエクソンはまたSAMドメインを破壊する。RET16.3スプライス変異体のcDNAクローンは、ブダペスト条約の規定に従い、ATCCに受託番号PTA−3161にて2001年3月7日に寄託してある。また、本発明はATCC受託番号PTA−3161を含むRET16.3 cDNA核酸配列を提供する。
【0253】
A.RET16 . 2核酸配列の同定(図19Aおよび19B)
ヒトRET16(RET21.1)について記載したように、RET16の予測されるコード配列を含むクローンを、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)で6時間処理したヒト微細血管内皮細胞(HMVEC)から逆転写/複製連鎖反応(RT/PCR)を用いて単離した。以下の条件を用い、3つのプライマーセット(各400nMの最終濃度)を用いて1532bp配列を増幅した:
JNF346(5'−TCACCTGCGCGGCACGTGACCC−3')(配列番号17);
JNF493(5'−TTTACTTTTGGTGTGTCTCCAGCC−3')(配列番号18);
JNF494(5'−TTACTTTTGGTGTGTCTCCAGCCATCTATTGATGGC−3')(配列番号19)、
250μlの反応液中の200μM dNTP、1×アドバンテージ2ポリメラーゼPCR緩衝液、1×アドバンテージ2ポリメラーゼ、および2.0μl DNA。94℃で30秒、68℃で30秒、および72℃で2分の実験サイクルを35サイクル行った。反応完了後、6.0μlの負荷染料を加え、臭化エチジウムを含む1.2%アガロースゲルでのゲル電気泳動により全反応を分離した。1.6kbのRET16.1転写物に加え、1.3kbのRET16.2転写物をゲルから切り出し、QIAgenゲル抽出キット(QIAgen、バレンシア、カリフォルニア)を用いて精製した。この断片をpTAdvクローニングベクター(Clontech、パロアルト、カリフォルニア)にライゲートし、標準法を用いてシークエンシングした。変異体RET16.2(RET16pTAdv Endo 03)(配列番号12)は、予測されたRET16コード配列に対応する1272bp配列を含んでいることがわかったが、エクソン−イントロン構造の分析はエクソン5〜8の欠失を明らかにした。RET16.2の導き出したアミノ酸配列は配列番号13に示してある。
【0254】
B.RET16 . 3核酸配列の同定(図20Aおよび20B)
5'ESTをIncyte ESTデータベースから同定し、Incyte Genomics(パロアルト、カリフォルニア)から購入した。このクローンを製造業社のプロトコールに従って調製し、シークエンシングした。クローンID3111127内に含まれる配列はRET16(RET16.1ともいう)に対応することがわかったが、エクソン9とエクソン10との間にさらなる断片が存在していた。このエクソンは78ヌクレオチド長であり、配列の読取り枠を変更せず、付加的な23アミノ酸残基をタンパク質配列に付加する。この配列は極めて疎水性である。このIncyte 3111127挿入は長さが1908bpである。この変異体は本明細書ではRET16.3と称し、その導かれたアミノ酸配列は配列番号15に示してある。
【0255】
実施例3
RT−PCRによるヒトRET16組織発現分析
RET16の組織発現を分析するため、多組織cDNAパネルをClontech Laboratories(パロアルト、カリフォルニア)から購入し、複製連鎖反応に用いた。簡単に説明すると、各組織からの1.0μlのcDNAを以下の試薬を含む24μlの反応混合物に加えた:0.4μMの各プライマー、200μMのdNTP、1×アドバンテージポリメラーゼ緩衝液(Clontech)、および1×アドバンテージポリメラーゼ(Clontech)。プライマー配列は、JNF232(5'−GGCAGATGCTAGTCTCAGGG−3')(配列番号20)およびJNF233(5'−GGGATTTAACCTTGGTCCTG−3')(配列番号21)であった。PCR反応を94℃で30秒、63℃で30秒、および72℃で30秒のサイクルを35サイクル行った。PCR産物を2.0%アガロースゲル上のゲル電気泳動により分離し、DNAを臭化エチジウム染色により視覚化した。発現の結果を図11に示す。
【0256】
実施例4
HMVEC細胞のトランスフェクション
トランスフェクションの前日にHMVEC細胞を3.5×105細胞/ウエルにて6ウエルプレートにプレーティングした。細胞を組織培養フラスコ中、37℃にて5%CO2でインキュベートした。この接種の結果、トランスフェクションの当日には85〜90%コンフルエントのウエルという結果となった。遠心分離はすべて15mlのポリスチレン管(VWR、カタログ#21008−212)かまたは50mlのポリスチレン管(Costar-Corning、カタログ#25339−50)で行った。OptiMEMIで25μg/mlに希釈することによりオリゴフェクチンG(Sequitur, Inc.、ナチック、マサチューセッツ)の10×ストックをまず調製した。ついで、OptiMEMI 1ml当たり12.5mlのオリゴフェクチンGを加えた。脂質の希釈ストックを室温で15分間静置した。
【0257】
OptiMEMI 1ml当たり10μlのオリゴマー(Sequitur, Inc.)を加えることにより、OptiMEMI中の各オリゴマーの10×ストック(1μM)を調製した。等容量のオリゴマーおよび脂質の10×溶液を混合し、5×混合物とした。室温で15分間インキュベートすることにより、オリゴマーと脂質とで複合体を生成させた。ついで、オリゴマー/脂質複合体を、5%FBSを含有する4容量のHMVEC完全増殖培地(Clonetics、サンジエゴ、カリフォルニアからのEGMブレット(bullet)キット培地)を加えることにより1×に希釈した。ついで、培地を細胞(低継代数HMVEC、Clonetics)から吸引し、適当なオリゴマー/脂質複合体と置換した(6ウエルプレートについて、1.5〜2mlのトランスフェクション培地をウエル当たり用いた)。
【0258】
細胞をトランスフェクション培地で15〜18時間インキュベートした。ついで、TNF−α(R & D systems、ミネアポリス、ミネソタ)を直接、増殖培地に加えることにより、細胞を10ng/mlのTNF−αで6時間刺激した。オリゴマーの取り込みを、蛍光オリゴマーの取り込みにより顕微鏡で評価した。細胞の生存性を細胞死染色分析(Sequitur, Inc.)により評価した。ついで、細胞をRNA単離およびTaqMan分析のために回収した。
【0259】
実施例5
RET16遺伝子発現のアンチセンス抑制
この実施例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(オリゴマーまたは「オリゴ」)を用いてRET16発現の抑制を決定する実験を行った。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドベースまたはキメラデオキシリボヌクレオチド/リボヌクレオチドベースのものであり、以下に記載してある。オリゴヌクレオチドの合成は、米国特許第5,849,902号(参照のためその全体を本明細書に引用する)に本質的に記載されている化学を用いて行った。
【0260】
アンチセンスオリゴマーは以下のとおりであった:
11587:5'−UGCACAUGCCGCCAAGGAGCCAUCU−3'(配列番号16)および
11590:5'−GCACUUUACUACGCAGUCCUAGAGA−3'(配列番号22)。11587および11590アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RET16ポリヌクレオチド(配列番号1)にハイブリダイズするのみならず、2つのRET16スプライス変異体ポリヌクレオチド、すなわちRET16.2(配列番号12)およびRET16.3(配列番号14)にもハイブリダイズする。
【0261】
HMVEC細胞を、2.5μg/mlのオリゴフェクチンGと複合体を生成した100nM(最終濃度)のアンチセンスオリゴマー(11587)または対照オリゴマー(11591:AGAGAUCCUGACGCAUCAUUUCACG)(配列番号23)でトランスフェクションした。トランスフェクション開始の4時間後、実施例4に記載のようにトランスフェクション培地を細胞から吸引し、完全増殖培地で置換した。トランスフェクション開始の18時間後、細胞をTNF−アルファ(10ng/ml)で6時間刺激した。刺激後、細胞をグアニジニウム緩衝液で溶解し、全RNAを溶解液から単離した。
【0262】
実施例6
TNF−α刺激したHMVEC細胞:E−セレクチン発現のELISA検出
アンチセンスオリゴでトランスフェクションした細胞(実施例5参照)を上記増殖条件(実施例3参照)により24ウエルプレートで維持した。培地を交換することなく細胞を10ng/mlのTNF−アルファで6時間処理した。
【0263】
処理期間の後、培地を除去し、プレートを4℃PBS(Gibco BRL、グランドアイランド、ニューヨーク)で2回洗浄し、細胞をPBS中の0.5%グルタルアルデヒドで4℃にて10分間固定した。ついで、プレートを穏やかに軽く叩いて固定溶液を除去し、20mM EDTAを含むPBS中の3%ヤギ血清(200μl;ブロッキング緩衝液)を加えた。ついで、プレートを軽く叩き、ビオチン化抗E−セレクチン(R & D Systems、ミネアポリス、ミネソタ)をブロッキング緩衝液中に0.25μg/mlにて37℃で1時間加えた。ウエルを冷PBSで4回洗浄した。ついで、ブロッキング緩衝液中の100μl/ウエルのストレプトアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ(1:4000希釈;Vector Labs SA-5004)を加え、ついで37℃で1時間インキュベートした。ついで、ウエルを冷PBSで4回洗浄した。
【0264】
ついで、100μlのTMB発色試薬(Sigma T8540)を加え、発色完了後、100μlの1N H2SO4で反応を停止させた。発色試薬を96ウエルプレートに移した後、マルチウエルプレートリーダーでOD450を読み取った。
【0265】
実施例7
相補的ポリヌクレオチド
RET16タンパク質コード配列に相補的なアンチセンス分子または核酸配列、またはその部分を用い、天然のRET16の発現を低減または抑制させる。約15〜35塩基対を含むアンチセンスまたは相補的オリゴヌクレオチドの使用を記載してあるが、本質的に同じ手順がより小さなまたは大きな核酸配列断片にも用いることができる。RET16タンパク質のコード配列に基づくオリゴヌクレオチド、たとえば図1および図4A、または配列番号1または配列番号3に示すものを用いて天然のRET16の発現を抑制する。相補的オリゴヌクレオチドは、典型的に最も独特の5'配列からデザインし、コード配列へのプロモーターの結合を妨害することにより転写を抑制するか、またはRET16タンパク質コード転写物へのリボソームの結合を妨害することにより翻訳を抑制するのに用いる。
【0266】
配列番号1または配列番号3のシグナルおよび5'配列の適当な部分を用い、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図2または図4に示すポリペプチドのシグナルまたは5'コード配列に翻訳する領域にまたがる約15〜35ヌクレオチドのいずれかを含んでいる。適当なオリゴヌクレオチドのデザインは、OLIGO4.06ソフトウエアおよびRET16タンパク質コード配列(配列番号1、配列番号3および配列番号5)を用いて行う。幾つかの目的のためには、マウスRET16核酸配列(配列番号6)またはラットRET16核酸配列(配列番号8)を用いることができる。
【0267】
実施例8
ノーザン分析
ノーザン分析は遺伝子の転写物の存在を検出するのに用い、特定の細胞または組織型からのRNAを結合したメンブレンへの標識ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを含む(J. Sambrookら、上掲を参照)。BLAST(S. F. Altschul, 1993, J. Mol. Rvol., 36: 290-300およびS. F. Altschulら、1990, J. Mol. Evol., 215: 403-410)を用いた類似のコンピューター法を用い、ジーンバンクやLIFESEQデータベース(Incyte Pharmaceuticals)などのヌクレオチドデータベース中の同一または関連する分子をサーチする。この分析は、複数のメンブレンベースのハイブリダイゼーションを行うものに比べて遥かに迅速で労力も少なくてすむ。さらに、コンピューターサーチの感度を変更して、特定のマッチングが正確な(同一の)または相同のものとして分類できるかを決定することができる。
【0268】
サーチの基礎はプロダクトスコア(product score)であり、以下の定義による:(%配列同一性×最大BLASTスコア)/100。プロダクトスコアは、2つの配列間の類似性の程度および配列マッチングの長さの両者を考慮する。たとえば、40のプロダクトスコアではマッチングは1〜2%の誤差内で正確であろう;70のプロダクトスコアでは正確であろう。相同な分子は、通常、15〜40のプロダクトスコアを示すものを選択することにより同定するが、より低いスコアも関連分子を同定することができる。ノーザン分析の結果は、RET16をコードする転写物が存在するライブラリーのリストとして報告される。存在量およびパーセント存在量も報告される。存在量はcDNAライブラリー中に示される特定の転写物の回数を直接反映しており、パーセント存在量は存在量をcDNAライブラリーで調べた配列の総数で除したものである。
【0269】
実施例9
マイクロアレイ
マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドを生成するため、たとえば配列番号1または配列番号3をコンピューターアルゴリズム(ヌクレオチド配列の3'末端から開始する)を用いて調べる。アルゴリズムは、遺伝子に独特であり、ハイブリダイゼーションに適した範囲のGC含量を有し、ハイブリダイゼーションを妨害する予測された二次構造を欠く所定の長さのオリゴマーを同定する。アルゴリズムは、長さが20ヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチド、すなわち20−merを同定する。各配列の中央の1のヌクレオチドを変えたオリゴヌクレオチドのマッチングしたセットを生成する。このプロセスを各遺伝子についてマイクロアレイで繰返し、蛍光または放射性ヌクレオチドの存在下で20−merの二重のセットを合成し、基体の表面に配置する。基体がシリコンチップの場合は、光照射(light-directed)化学プロセスを沈着に用いる(WO95/11995、M. Cheeら、)。
【0270】
あるいは、化学カップリング法およびインクジェットデバイスを用いてオリゴマーを基体表面上に合成する(WO95/25116、J. D. Baldeschweilerら)。他の別法として、ドット(またはスロット)ブロットと類似の「グリッド化(gridded)」アレイを用い、たとえば真空システム、または熱、UV、機械的、または化学的な結合法を用いてcDNA断片またはオリゴヌクレオチドを基体表面上に配置および結合する。典型的なアレイは手で、または利用できる材料および装置を用いて製造することができ、8ドット、24ドット、96ドット、384ドット、1536ドット、または6144ドットのグリッドを含んでいてよい。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去し、検出デバイスを用いて放射能または蛍光のレベルおよびパターンを決定する。検出デバイスは、X線フィルムのように簡単なものであっても、光スキャニング装置のように複雑なものであってもよい。スキャニングした蛍光像を調べ、マイクロアレイ中の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度および相対的な存在量/発現レベルを決定する。
【0271】
実施例10
特異的抗体を用いた天然のRET16タンパク質の精製
天然のまたは組換えのRET16ポリペプチドを、RET16ポリペプチドまたはそれに由来するペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗RET16ポリペプチド抗体を活性なクロマトグラフィー樹脂、たとえばCNBr活性化SEPHAROSE(Amersham Pharmacia Biotech)に共有結合させることにより構築する。結合後、製造業社の指示に従って樹脂をブロッキングし、洗浄する。
【0272】
RET16ポリペプチドを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、カラムをRET16ポリペプチドの優先的な吸着が可能な条件下(たとえば、界面活性剤の存在下の高イオン強度の緩衝液)で洗浄する。カラムを抗体/RET16ポリペプチド結合を破壊する条件下(たとえば、pH2〜3の緩衝液、または尿素やチオシアン酸イオンなどの高濃度のカオトロピック剤)で溶出し、RET16ポリペプチドを回収する。
【0273】
実施例11
RET16タンパク質と相互作用する分子の同定
RET16または生物学的に活性なその断片を125I Bolton-Hunter試薬(Boltonら、1973, Biochem. J., 133: 529)で標識する。マルチウエルプレートのウエル中に前もってアレイに並べた候補分子を標識RET16ポリペプチドとともにインキュベートし、洗浄し、標識RET16ポリペプチド−候補分子の複合体を有するウエルをアッセイする。濃度の異なるRET16ポリペプチドを用いて得たデータを用い、候補分子とRET16ポリペプチドとの数、親和性および結合の値を計算する。
【0274】
RET16ポリペプチドと相互作用するタンパク質、ペプチドまたは他の分子を同定するのに適した他の方法としては、本明細書に記載する酵母2ハイブリッド系などのリガンド結合アッセイが挙げられる。
【0275】
実施例12
本発明のRET16 . 1、RET16 . 2またはRET16 . 3ポリペプチドに対応するN末端またはC末端欠失変異体の製造方法
本明細書に記載のように、本発明は、本発明のRET16.1、RET16.2またはRET16.3ポリペプチドに対応するN末端またはC末端欠失変異体(N末端およびC末端欠失の組み合わせに加えて)の生成を包含する。そのような変異体を生成するために多くの方法が当業者に利用できる。そのような方法としては、PCR増幅と遺伝子クローニング法との組み合わせが挙げられる。分子生物学の当業者であれば、本明細書に提供するまたは言及する方法、および/または標準法として当該技術分野で知られた他の方法により、本発明の各欠失変異体を容易に生成できるであろうが、以下に例示の方法を記載する。
【0276】
簡単に説明すると、完全長RET16.1、RET16.2、またはRET16.3ポリペプチド配列をコードする単離cDNAクローンを用い、配列番号1、配列番号12、または配列番号14の所望の5'および3'位に由来する約15〜25ヌクレオチドの適当なプライマーをデザインしてPCR増幅することができ、引き続き意図するN末端および/またはC末端欠失変異体をクローニングすることができる。そのようなプライマーは、たとえば、5'および3'プライマーのためにそれぞれ開始コドンおよび停止コドンを含んでいてよい。そのようなプライマーはまた、増幅後の欠失変異体のクローニングを容易にするために制限部位を含んでいてもよい。さらに、プライマーはまた、たとえばフラグ−タグ配列、コザック配列、または本明細書で検討および/または言及する他の配列などの付加的な配列を含んでいてよい。
【0277】
以下に代表的なPCR増幅条件を記載するが、当業者であれば効率的な増幅のために他の条件が必要であり、用いることができることを評価するであろう。100μlのPCR反応混合物を、10ngの鋳型DNA(すなわち、RET16.1、RET16.2、またはRET16.3のcDNAクローン)、200μMの4dNTP、1μMのプライマー、0.25UのTaq DNAポリメラーゼ(PE)、および標準Taq DNAポリメラーゼ緩衝液を用いて調製することができる。典型的なPCRサイクル条件は以下のとおりである:
20〜25サイクル:45秒、93℃
2分、50℃
2分、72℃
1サイクル: 10分、72℃
PCRの最後の伸長工程の後、5UのKlenow断片を加え、30℃で15分間インキュベートすることができる。
【0278】
断片をNotIおよびSalI制限酵素で消化後、同様に消化しておいた適当な発現および/またはクローニングベクター(たとえば、とりわけpSport1)に断片をクローニングすることができる。当業者であれば、他のプラスミドも同様に置換することができ、ある場合には望ましいことを評価するであろう。消化した断片およびベクターをDNAリガーゼを用いてライゲートし、ついで本明細書に記載したおよび/または当該技術分野で知られた方法を用いてコンピテントな大腸菌細胞を形質転換する。
【0279】
付加的なN末端欠失変異体を増幅するための5'プライマー配列は、下記式を参照して決定することができる:
(S+(X*3))から((S+(X*3))+25)
[式中、「S」はRET16.1、RET16.2またはRET16.3遺伝子(すなわち、配列番号1、配列番号12、または配列番号14)の開始コドンの最初のヌクレオチド位置に等しく、「X」は意図するN末端欠失変異体の最もN末端側のアミノ酸に等しい]。第一の項は、配列番号1、配列番号12、または配列番号14のセンス鎖に対応する5'プライマーの開始5'ヌクレオチド位置を提供し、第二の項は5'プライマーの終了3'ヌクレオチド位置を提供する。プライマーの対応するヌクレオチド位置が決定されたら、たとえば配列の5'末端に適用可能な制限部位配列を付加することにより最終的なヌクレオチド配列を生成することができる。ここで記載したように、5'プライマーへの他の配列の付加は、ある場合には望ましいし、および/または用いることができる(たとえば、コザック配列など)。
【0280】
付加的なN末端欠失変異体を増幅するための3'プライマー配列は、下記式を参照して決定することができる:
(S+(X*3))から((S+(X*3))−25)
[式中、「S」はRET16.1、RET16.2またはRET16.3遺伝子(配列番号1、配列番号12、または配列番号14)の開始コドンの最初のヌクレオチド位置に等しく、「X」は意図するN末端欠失変異体の最もC末端側のアミノ酸に等しい]。第一の項は、配列番号1、配列番号12、または配列番号14のアンチセンス鎖に対応する3'プライマーの開始5'ヌクレオチド位置を提供し、第二の項は3'プライマーの終了3'ヌクレオチド位置を提供する。プライマーの対応するヌクレオチド位置が決定されたら、たとえば配列の5'末端に適用可能な制限部位配列を付加することにより最終的なヌクレオチド配列を生成することができる。ここで記載したように、3'プライマーへの他の配列の付加は、ある場合には望ましいし、および/または用いることができる(たとえば、コザック配列など)。当業者であれば、PCR増幅を最適化するために上記ヌクレオチド位置の改変を使用できることを評価するであろう。
【0281】
本発明のC末端欠失変異体を増幅するための5'および3'プライマー配列を同定するに際して、上記の同じ一般式を用いることができる。さらに、本発明のN末端およびC末端欠失変異体の組み合わせを増幅するための5'および3'プライマー配列を同定するに際しても、上記の同じ一般式を用いることができる。当業者であれば、PCR増幅を最適化するために上記ヌクレオチド位置の改変を使用できることを評価するであろう。
【0282】
あるいは、本発明の好ましいポリペプチドは、たとえば、配列番号2、配列番号13、または配列番号15のRET16.1、RET16.2またはRET16.3ポリペプチドの内部領域に対応するポリペプチド配列(たとえば、NおよびCの両末端RET16.1、RET16.2、またはRET16.3ポリペプチド欠失の組み合わせ)を包含する。たとえば、内部領域は、式:アミノ酸NXからアミノ酸CX[ここでNXは、RET16.1、RET16.2、またはRET16.3(配列番号2、配列番号13、または配列番号15)のN末端欠失ポリペプチドアミノ酸であり、CXは、RET16.1、RET16.2、またはRET16.3(配列番号2、配列番号13、または配列番号15)のC末端欠失ポリペプチドアミノ酸である]により定義することができる。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。本発明はまた、これらポリペプチドの本明細書に記載する免疫原および/または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【0283】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、公開されたPCT出願および論説、書籍、参照文献、参照マニュアルおよび要約の内容は、本発明が関連する技術分野の状態を一層完全に記載するためにその全体を参照のため本明細書に引用する。
【0284】
上記に記載した主題には本発明の範囲および精神から逸脱することなく種々の改変をなすこことができるので、上記の記載に含まれる、または添付の特許請求の範囲に定める主題は全て本発明を説明するにすぎないものと解釈されることを意図している。上記の教示に照らして本発明の多くの改変および変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0285】
【図1】図1は、予測されたヒトRET16転写物の完全長配列を含む、本発明のヒトRET16 DNAの1818bpポリヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。図1の核酸配列(配列番号1)は、本明細書において配列番号3として示す1532bpのヒトRET16オープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列(図4A)並びにさらなる3'および5'配列を含む。RET16のコード配列(CDS)は配列番号1のヌクレオチド148〜ヌクレオチド1575に含まれる。
【0286】
【図2】図2は、配列番号1のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列(配列番号2)を示す。RET16、すなわちRET16.1の予測される分子量は52.8キロダルトン(Kd)である。
【0287】
【図3】図3は、ヒトRET16ポリヌクレオチドコード配列(配列番号1)および1818bpのヒトRET16配列の導かれるアミノ酸配列(配列番号2)の両者を示す。図に示すように、コード配列は配列番号1のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド位置番号148〜150のATG(メチオニン)開始コドンから始まる。
【0288】
【図4】図4Aは、配列番号3のヒトRET16オープンリーディングフレーム(ORF)ポリヌクレオチド配列を示す。図4Bは、配列番号3のORFポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのヒトRET16アミノ酸配列(配列番号4)を示す。図4Cは、ヒトRET16 cDNAの630塩基対の部分核酸配列(配列番号5)を示す。
【0289】
【図5】図5は、マウス由来のRET16ポリヌクレオチド配列、すなわちマウスRET16オーソログ(配列番号6)を示す。マウスRET16のコード配列(CDS)は、配列番号6のヌクレオチド19〜ヌクレオチド1443に含まれる。
【0290】
【図6】図6は、マウスRET16 cDNAのポリヌクレオチド配列(配列番号6)によってコードされるマウスRET16ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号7)を示す。マウスRET16の予測された分子量は51.8Kdである。
【0291】
【図7】図7A〜7Dは、RET16遺伝子に対応する部分cDNAでプローブした10日間の多組織ノーザン(MTN)を示す(実施例1Hを参照)。1.8kb転写物が幾つかの組織で検出された。図7Aは、ヒトMTNブロットの結果を示し、全ての組織でRET16転写物が種々のレベルで検出された。図7Aでは、発現は腎臓、膵臓および心臓で最も高く、胎盤、骨格筋および肝臓では一層低い発現レベルが観察され、肺および脳ではさらに低いレベルが観察された。図7Bは、ヒトMTNブロットIIの結果を示し、全ての組織でRET16転写物が種々のレベルで検出された。図7Bでは、発現は精巣で最も高く、卵巣、前立腺および脾臓では一層低い発現レベルが観察され、胸腺、小腸、結腸および末梢血白血球ではさらに低いレベルが観察された。図7Cは、ヒトMTNブロットIIIの結果を示し、殆どの組織でRET16転写物が検出された。図7Cでは、発現は甲状腺で最も高く、胃、脊髄、リンパ節、気管および副腎では一層低い発現レベルが観察された。RET16転写物は骨髄では実質的に検出できなかったが、より大きな約2.4kb転写物は骨髄で検出された。図7Dは、ヒト癌細胞株MTNブロットの結果を示し、幾つかの腫瘍株でRET16転写物が検出された。図7Dでは、発現はバーキットリンパ腫細胞株RAJIで最も高く、黒色腫細胞株G−361および慢性骨髄性白血病細胞株K−562では一層低い発現レベルが観察され、HeLa S3、リンパ芽球性白血病MOLT−4および結腸直腸腺癌SW480細胞株ではさらに低いレベルが観察された。前骨髄性白血病HL−60細胞株および肺癌腫A549細胞株では検出しうる発現は観察されなかった。
【0292】
【図8】図8は、アンチセンスオリゴマーを用いたRET16発現の抑制の結果を示す。図8に示してあるのは、GAPDH mRNA発現に正規化した後のRET16 mRNA発現のレベルである。各棒グラフは、3回のトランスフェクションの平均±標準偏差を示す。対照オリゴマー(76.6%)と比べてオリゴマー11587では強い抑制が観察された(実施例5参照)。
【0293】
【図9】図9は、アンチセンスE−セレクチンおよびアンチセンスRET16オリゴヌクレオチドのトランスフェクションによるE−セレクチンタンパク質発現の抑制がTNF刺激HMVEC細胞に及ぼす影響を決定するために行った試験の結果を示す。細胞を、実施例6に記載するようにアンチセンスまたは対照のオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。ついで、細胞をTNF−アルファで6時間刺激し、E−セレクチンの細胞表面発現をELISAアッセイにより決定した(実施例6参照)。図9では、棒グラフはHVECの表面上でのE−セレクチンの相対発現を示す。
【0294】
【図10】図10A〜図10Eは、ヒトRET16アミノ酸配列と他の既知のおよび新たに提供された配列との種々のアラインメントを示す。配列残基間の垂直の線はアミノ酸の同一を示す。配列残基間の2つの点はアミノ酸の類似を示す。配列残基間の1つの点はアミノ酸の非類似を示す。PileUpをSEQ-WEB GCG、Blosum62スコアリングマトリックス、ギャップ生成ペナルティ(gap creation penalty)8、およびギャップ伸長ペナルティ(gap extension penalty)2で行ってマルチプルシークエンスアラインメントを生成した。当業者には理解されるであろうように、PileUpはFengおよびDoolittle(1987, J. Mol. Evol., 25: 351-360)のプログレッシブアラインメントの簡略化を用いてマルチプルシークエンスアラインメントを生成する。使用した方法はHigginsおよびSharpによって記載されたもの(1989, CABIOS, 5: 151-153)に似ている。特に、図10Aは、配列番号2または配列番号4からのヒトRET16アミノ酸配列の一部(上段)とPodospora anserinaのHet−E−1アミノ酸配列の一部(配列の下段)との配列アラインメントを示す。het−e−1遺伝子によってコードされるPodospora anserinaベータトランスデューシン様タンパク質の刊行されたアミノ酸配列を配列番号10として提供してある。図10Bは、配列番号2または配列番号4からのヒトRET16アミノ酸配列の一部(上段)とThermomonospora curvataのPKWAアミノ酸配列の一部(配列の下段)との配列アラインメントを示す。Thermomonospora curvata PKWA(pkwA)遺伝子(受託番号AF115313)の刊行されたアミノ酸配列を配列番号11として提供してある。図10Cは、ヒトRET16アミノ酸配列(配列番号2または配列番号4)(上段)とマウスRET16アミノ酸配列(配列番号7)(下段)との配列アラインメントを示す。図10Dは、ヒトRET16アミノ酸配列(配列番号2または配列番号4)(上段)とラットRET16アミノ酸配列(配列番号9)(下段)との配列アラインメントを示す。図10Eは、ヒトRET16アミノ酸配列(配列番号2または配列番号4)(上段)とPodospora anserinaのHet−E−1アミノ酸配列(中段);およびThermomonospora curvataのPKWAアミノ酸配列(配列番号11)(配列の下段)とのマルチプルシークエンスアラインメントを示す。
【0295】
【図11】図11は、様々な組織採取源からのヒトRET16転写物の逆転写複製連鎖反応(RT−PCR)増幅を示す(実施例3)。
【0296】
【図12】図12は、ヒト(hu)RET16発現を示す電子ノーザンを示す。「クローンカウント」は列記した組織ライブラリー(Incyteデータベース)中のRET16クローンのランダムな分析でRET16配列が出現する回数を指しており、それによってRET16遺伝子が列記した組織で発現されたことが確認される。
【0297】
【図13】図13は、ラットから単離した部分RET16ポリヌクレオチド配列(配列番号8)、すなわちヒトRET16遺伝子のラットオーソログを示す。
【0298】
【図14】図14は、ラットRET16 cDNA配列のポリヌクレオチド配列(配列番号8;図13参照)によってコードされるラットRET16の部分ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号9)を示す。
【0299】
【図15】図15は、図10A〜図10Eに記載したPileUpプログラムを用いた、ヒト(配列番号2または配列番号4)、マウス(配列番号7)およびラット(配列番号9)のRET16アミノ酸配列のマルチプルシークエンスアラインメントを示す。濃い陰影の部分は3つの全てのオーソログでの保存を示し、一方、淡い陰影の部分は2つのオーソログ間での保存を示す。ラットのRET16は部分的なポリペプチド配列のみであることに注意。ヒトRET16はマウスRET16(muRET16)と82.5%同一であり、部分的なラットRET16(rRET16)と92.9%同一である。muRET16は部分的なrRET16と98.5%同一である。
【0300】
【図16】図16は、RET16.1、RET16.2、RET16.3スプライス変異体ポリペプチド配列のマルチプルシークエンスアラインメントを示す。淡く陰影を付して囲んだ部分は、RET16.2で欠失しているアミノ酸(RET16.1の見当たらないエクソン5〜8である)を示す。濃い陰影を付して囲んだ部分は、RET16.3には存在するが他のRET16配列には存在しないさらなるアミノ酸を示す。
【0301】
【図17】図17は、ヒトRET16(配列番号2または配列番号4)およびマウスRET16(配列番号7)ポリペプチド配列中のWDドメインおよびSAMドメインのアラインメントを示す。図示するように、淡い陰影の領域はWDリピートを示し、濃い陰影の領域はSAMドメインを示す。同一の残基は囲んだ領域によって示してある。
【0302】
【図18】図18は、ヒトRET16(RET16.1とも称する)、およびRET16.2およびRET16.3スプライス変異体のエクソン構造を示す。
【0303】
【図19】図19Aおよび図19Bは、ヒトRET16.2スプライス変異体のポリヌクレオチド配列(配列番号12)およびコードされたアミノ酸配列(配列番号13)を示す(実施例2)。ヒトRET16.2のコード配列(CDS)は、配列番号12のヌクレオチド111〜ヌクレオチド1262に含まれる。RET16.2の予測された分子量は42.7Kdである。
【0304】
【図20】図20Aおよび図20Bは、ヒトRET16.3スプライス変異体のポリヌクレオチド配列(配列番号14)およびコードされたアミノ酸配列(配列番号15)を示す(実施例2)。ヒトRET16.3のコード配列(CDS)は、配列番号14のヌクレオチド136〜ヌクレオチド1641に含まれる。RET16.3の予測された分子量は55.6Kdである。
【0305】
【図21】図21は、本発明のRET16のUボックスドメイン(配列番号24)とタンパク質PRP19のUボックスドメイン(配列番号25)とのコンセンサス残基のアラインメントを示す。図21に示す保存されたコンセンサス残基の注釈は、AravindおよびKoonin, 2002, Current Biology, 10(4): R132-R134から改変してある。
Claims (20)
- 以下よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド:
(a)細胞内シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、またはその機能性の断片であって、該ポリペプチドが配列番号2、配列番号4および配列番号7よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を含むもの;
(b)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号6および配列番号8よりなる群から選ばれた配列を含む単離ポリヌクレオチド;
(c)細胞シグナル伝達カスケードに関与するシグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号2または配列番号4の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するもの;
(d)(i)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号6および配列番号8よりなる群から選ばれた配列;(ii)遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号6および配列番号8よりなる群から選ばれた配列からの核酸配列縮重物;または(iii)これらに相補的な核酸配列、を有する核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド;
(e)ヒトRET16ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(f)配列番号1のヌクレオチド151〜1575を含み、配列番号2マイナス開始コドンのアミノ酸2〜476に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(g)配列番号1のヌクレオチド148〜1575を含み、開始コドンを含む配列番号2のアミノ酸1〜476に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(h)配列番号12と少なくとも82.0%同一のヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド;
(i)ヒトRET16.2ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(j)配列番号12のヌクレオチド114〜1262を含み、配列番号13マイナス開始コドンのアミノ酸2〜384に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(k)配列番号12のヌクレオチド111〜1262を含み、開始コドンを含む配列番号13のアミノ酸1〜384に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(l)ヒトRET16.3ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(m)配列番号14のヌクレオチド139〜1641を含み、配列番号15マイナス開始コドンのアミノ酸2〜502に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(n)配列番号14のヌクレオチド136〜1641を含み、開始コドンを含む配列番号15のアミノ酸1〜502に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(o)マウスRET16ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(p)配列番号6のヌクレオチド22〜1443を含み、配列番号4マイナス開始コドンのアミノ酸2〜475に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(q)配列番号6のヌクレオチド19〜1443を含み、開始コドンを含む配列番号7のアミノ酸1〜475に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(r)ATCC受託番号PTA−3161の核酸配列を有する、(a)から(q)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(s)(a)から(r)のいずれかに記載のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド;
(t)相補的な核酸配列が、(a)から(r)のいずれかから選ばれる核酸配列を含む変性した二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、単離ポリヌクレオチド;
(u)中くらいのストリンジェンシーの条件が、0.2×SSPEまたはSSCおよび0.2%SDS中、約42℃〜約50℃の温度で洗浄することを含む、(t)に記載の単離ポリヌクレオチド;
(v)高いストリンジェンシーの条件が、0.018M NaCl中、約65℃で安定なハイブリッドを生成する核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にするものである、(t)に記載の単離ポリヌクレオチド;
(w)細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号13の配列と少なくとも82%の配列同一性を有するもの;
(x)細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号15の配列と少なくとも95%の配列同一性を有するもの;
(y)番号12の配列と少なくとも68.2%の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片;および
(z)番号14の配列と少なくとも93.1%の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項3に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 以下よりなる群から選ばれるポリペプチド配列を含む実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質:
(a)配列番号2または配列番号4に示す配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;
;
(b)配列番号2または配列番号4に示す配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;
(c)配列番号2または配列番号4に示す配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;
(d)細胞シグナル伝達カスケードに関与し、ATCC受託番号PTA−3161の核酸配列によりコードされる、単離および実質的に精製したヒト細胞シグナル伝達タンパク質;
(e)配列番号7または配列番号9に示す配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;
(f)配列番号7または配列番号9に示す配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;
(g)細胞シグナル伝達カスケードに関与し、配列番号1または配列番号3に記載の核酸配列、または遺伝子コードの縮重の結果として配列番号1または配列番号3からの核酸配列縮重物を有するポリヌクレオチドによりコードされる、実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;
(h)配列番号7または配列番号9に示すアミノ酸配列を有する、実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;
(i)配列番号2のアミノ酸2〜476を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜476が配列番号2マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(j)配列番号13のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(k)ATCC受託番号PTA−3161の核酸配列によってコードされる単離RET16.2変異体タンパク質;
(l)配列番号12のポリヌクレオチド配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(m)配列番号13のアミノ酸2〜384を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜384が配列番号13マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(n)配列番号15のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(o)ATCC受託番号PTA−3161の核酸配列によってコードされる単離RET16.3変異体タンパク質;
(p)配列番号14のポリヌクレオチド配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(q)配列番号15のアミノ酸2〜502を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜502が配列番号15マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(r)配列番号7のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるRET16タンパク質;
(s)配列番号6のポリヌクレオチド配列によってコードされるRET16タンパク質;
(t)配列番号7のアミノ酸2〜475を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜475が配列番号7マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(u)配列番号13に示す配列と少なくとも82%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;および
(v)配列番号15に示す配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質。 - 請求項5に記載のタンパク質またはポリペプチド、またはその抗原性エピトープに特異的に結合する、精製した抗体。
- 細胞シグナル伝達カスケードに関与するタンパク質の製造方法であって、工程:
(a)請求項4に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、ついで
(b)該ポリペプチドを宿主細胞培養液から回収する
ことを含む方法。 - 生物学的試料中の細胞シグナル伝達カスケードタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその断片を検出する方法であって、工程:
(a)請求項1に記載のポリヌクレオチドを生物学的試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによってハイブリダイゼーション複合体を生成させ、ついで
(b)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、その際、該複合体の検出はユビキチン結合酵素をコードするポリヌクレオチド、またはその断片の該生物学的試料中の存在と相関関係を有する
ことを含む方法。 - 分子または化合物のライブラリーを細胞シグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでスクリーニングして、該ライブラリー中に該ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する少なくとも1の分子または化合物を同定する方法であって、
(a)請求項1に記載のポリヌクレオチドを被験分子または化合物のライブラリーと特異的な結合が可能な条件下で混合し、ついで
(b)特異的な結合を検出し、それによって該ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する被験分子または化合物を同定する
ことを含む方法。 - 細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達タンパク質の活性を変調することのできる候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被験化合物を請求項5に記載のタンパク質を発現する細胞または組織と接触させ、ついで
(b)候補変調化合物として、細胞シグナル伝達カスケードに関与するタンパク質の活性を変調する被験化合物を選択する
ことを含む方法。 - 請求項5に記載のタンパク質を炎症関連疾患または障害を治療するのに有効な量にて投与することを含む、炎症関連疾患または障害の治療方法。
- 該疾患または障害が、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、乾癬、喘息、虚血−再潅流、多発性硬化症、臓器または組織移植の拒絶、慢性閉塞性肺疾患、炎症性胃腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、亜急性呼吸障害症候群、全身性エリテマトーデス、嚢胞性線維症、自己免疫疾患、癌、腫瘍および新生物よりなる群から選ばれる、請求項11に記載の方法。
- ヒト細胞シグナル伝達タンパク質が第二の細胞シグナル伝達タンパク質に結合するのを抑制または妨害する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被験化合物の存在下または不在下、請求項5に記載の細胞シグナル伝達タンパク質を該タンパク質が結合または会合する第二の細胞シグナル伝達分子と結合が可能な条件下で接触させ、ついで
(b)該被験化合物の存在下での結合レベルを該被験化合物の不在下での結合レベルと比較することによって、該細胞シグナル伝達タンパク質と該第二の細胞シグナル伝達分子との結合レベルが低減または抑制されたか否かを決定する
ことを含む方法。 - プロテインキナーゼによる細胞シグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化を抑制する化合物の同定方法であって、
(a)請求項5に記載の細胞シグナル伝達カスケードタンパク質を、32P−ガンマ−ATPを含む反応緩衝液中、該細胞シグナル伝達タンパク質の固相基体への結合を可能とする条件下で該基体に結合させ、
(b)被験化合物の存在下または不在下でプロテインキナーゼを加え、ついで
(c)該被験化合物の不在下で観察されるリン酸化レベルと比較して、該被験化合物の存在が該細胞シグナル伝達カスケードタンパク質に取り込まれる32P標識の量の低減という結果となるか否かを決定し、それによって細胞シグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化を抑制する被験化合物を同定する
ことを含む方法。 - 以下よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド:
(a)ヒトRET16ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド151〜1575からなり、配列番号2マイナス開始コドンのアミノ酸2〜476に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(c)配列番号1のヌクレオチド148〜1575からなり、開始コドンを含む配列番号2のアミノ酸1〜476に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(d)ヒトRET16.2ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(e)配列番号12のヌクレオチド114〜1262からなり、配列番号13マイナス開始コドンのアミノ酸2〜384に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(f)配列番号12のヌクレオチド111〜1262からなり、開始コドンを含む配列番号13のアミノ酸1〜384に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(g)配列番号12と少なくとも68.2%同一のヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド;
(h)ヒトRET16.3ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(i)配列番号14のヌクレオチド139〜1641からなり、配列番号15マイナス開始コドンのアミノ酸2〜502に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(j)配列番号14のヌクレオチド136〜1641からなり、開始コドンを含む配列番号15のアミノ酸1〜502に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(k)配列番号14と少なくとも93.1%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる単離ポリヌクレオチド;
(l)マウスRET16ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(m)配列番号6のヌクレオチド22〜1443からなり、配列番号4マイナス開始コドンのアミノ酸2〜475に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(n)配列番号6のヌクレオチド19〜1443からなり、開始コドンを含む配列番号7のアミノ酸1〜475に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド;
(o)(a)から(n)のいずれかに記載のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド;
(p)相補的な核酸配列が、(a)から(o)のいずれかから選ばれる核酸配列を含む変性した二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、単離ポリヌクレオチド;
(q)中くらいのストリンジェンシーの条件が、0.2×SSPEまたはSSCおよび0.2%SDS中、約42℃〜約50℃の温度で洗浄することを含む、(p)に記載の単離ポリヌクレオチド;
(r)高いストリンジェンシーの条件が、0.018M NaCl中、約65℃で安定なハイブリッドを生成する核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にするものである。(p)に記載の単離ポリヌクレオチド;
(s)細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号13の配列と少なくとも82%の配列同一性を有するもの;
(t)細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号15の配列と少なくとも95%の配列同一性を有するもの;
(u)番号12の配列と少なくとも68.2%の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片;および
(v)番号14の配列と少なくとも93.1%の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片。 - 請求項15に記載の単離核酸分子を含む組換えベクター。
- 請求項16に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
- 以下よりなる群から選ばれるポリペプチド配列からなる実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質:
(a)配列番号2のアミノ酸2〜476からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜476が配列番号2マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(b)配列番号13のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(c)ATCC受託番号PTA−3161の核酸配列によってコードされる単離RET16.2変異体タンパク質;
(d)配列番号12のポリヌクレオチド配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(e)配列番号13のアミノ酸2〜384からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜384が配列番号13マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(f)配列番号15のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(g)ATCC受託番号PTA−3161の核酸配列によってコードされる単離RET16.3変異体タンパク質;
(h)配列番号14のポリヌクレオチド配列によってコードされるRET16変異体タンパク質;
(i)配列番号15のアミノ酸2〜502からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜502が配列番号15マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(j)配列番号7のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるRET16タンパク質;
(k)配列番号6のポリヌクレオチド配列によってコードされるRET16タンパク質;
(l)配列番号7のアミノ酸2〜475からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸2〜475が配列番号7マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの;
(m)配列番号13に示す配列と少なくとも82%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質;および
(n)配列番号15に示す配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質。 - 該疾患または障害が、TNF−α経路の異所性の活性化と関連する障害、異所性の細胞移動と関連する障害、異所性の細胞増殖と関連する障害、異所性の細胞転移と関連する障害、喘息、若年性特発性関節炎、腫瘍細胞の造血性転移、高インスリン血症、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心血管性疾患、腫瘍の進行、転移、直腸癌、ヴェーゲナー肉芽腫症、幹細胞移植合併症、サラセミア、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血−再潅流障害、急性肺障害、慢性関節リウマチ、移植拒絶、全身性エリテマトーデス、冠状動脈石灰化、虚血性心、およびアレルギー性炎症よりなる群から選ばれる、請求項11に記載の方法。
- 配列番号1、配列番号12、または配列番号14から選ばれるRET16ポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスRET16オリゴヌクレオチド。
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