JP2004531208A

JP2004531208A - 情報伝達アプタマーのｉｎｖｉｔｒｏ選択

Info

Publication number: JP2004531208A
Application number: JP2002537905A
Authority: JP
Inventors: エリントン，アンドリュー，ディ．; ラジェインドラン，マンジュラ; ジャベリイ，スーレイ，ディパックマール
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2004-10-14
Also published as: AU2002232561A1

Abstract

本発明は情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法を提供するものであって、上記方法はヌクレオチドがランダムに挿入されており、前記ヌクレオチドが非対称的モル比を有しているＤＮＡのプールを合成するステップと、上記ＤＮＡプールを増幅させるステップと、蛍光ラベルされたヌクレオチドを用いて前記増幅されたＤＮＡからＲＮＡプールを転写するステップと、蛍光ラベルされたＲＮＡプールを親和性カラムに入れて、上記蛍光ラベルされたＲＮＡプールから高親和性蛍光ＲＮＡ分子を取り出すステップと、上記高親和性蛍光ＲＮＡ分子からｃＤＮＡプールを得るステップと、蛍光ＲＮＡ分子上で増幅及び選択ステップを繰り返し、上記蛍光ＲＮＡ分子をクローンして情報伝達アプタマーをつくりだすステップとで構成されている。ＤＮＡ分子で構成される情報伝達アプタマーも選択される。リガンドを結合させた場合に起きる通常の変化を上記情報伝達アプタマーの蛍光強度の変化に変換する情報伝達アプタマーも提供される。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的には生化学及び核酸化学の分野に関するものである。より具体的には、本発明は１個から３個までの蛍光ラベルされた同一のヌクレオチドを含むＲＮＡ核酸結合種のｉｎｖｉｔｒｏ選択に関するものである。
【０００２】
（関連技術の説明）
広範囲の標的物と結合する核酸結合種（アプタマー）はランダム配列群から容易に選択される^３−６。選択されたアプタマーはアミノ酸^７のような単純な分子あるいは赤血球細胞膜^８のような複雑な分子を認識することができる。アプタマーに化学的に修飾された塩基を組み込むとその安定性が大幅に向上し、血清あるいは尿サンプルを使った同一アッセイでのアプタマーの利用を潜在的に適合化する。
【０００３】
分子識別を直接光信号に変換できる試薬不要のバイオセンサーは多様な分析に用いられるセンサー・アレイの開発を可能にする。多能性核酸結合種であるアプタマーは容易に選択されるが、バイオセンサーとしての利用に適合させることは難しい。選択された核酸結合種（アプタマー）をバイオセンサーとして機能させるために適合化すれば、多数の診断学上の利用がさらに可能になる^１，２。
【０００４】
アプタマーを用いた初歩的なバイオセンサーのいくつかの例が既に開発されている。蛍光ラベルされたアプタマーとキャピラリー電気泳動法をレーザー誘起蛍光法（ＣＥ−ＬＩＦ）と組み合わせたものが溶液中のＩｇＥ及びトロンビンの高感度検出に用いられている。ガラス基板上に固定化したラベル付き抗トロンビン・アプタマーはエヴァネセント波誘起蛍光異方性の変化を追跡することによって溶液中のトロンビンを検出することができる^１０。ラベル付き抗ＣＤ４アプタマーはヒトＣＤ４を発現するマウスのＴ細胞を染色するために用いられる^１１。ラベル付き抗ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）アプタマーはビーズ上のヒト好中球エラスターゼ検出において抗抗ヒト好中球エラスターゼ抗体と同程度に効果的である^１２。
【０００５】
しかし、これらの分析法は本質的には抗体を使って既に開発された方法の模倣であり、一般に洗浄またはその他の分離技術の後の結合を間接的に読み出した情報に頼るものである。対照的に、検体の存在を直接示すことができる分子はバイオセンサーとして有用であることが益々明らかになってきている^１３。例えば、その結合部位端部を蛍光色素でラベルされた大腸菌リン酸結合蛋白質の突然変異体^１４は無機リン酸塩結合の際に蛍光発光の大幅な増加を示した^１５。同様にラベル付けされたマルトース結合蛋白質は溶液中のマルトースを定量的に検出し^１６、ラベル付けされたグルコース結合蛋白質はグルコースを検出する^１７。受容体及び供与体のフルオロフォア双方のｃＡＭＰ依存蛋白質キナーゼへの接合体はｃＡＭＰによって蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が変調されるセンサーを生み出した^１８。
【０００６】
小さな分子と結合するアプタマーはそれらの同系のリガンドと相互作用するときに配座変化を受けることが示されてきた^{１９，２０}。配座変化を受けることが既知の領域でアプタマーに導入されたレポーターフルオロフォアは結合後の蛍光強度の変化につながることがある。しかし、フルオロフォアのそのような導入は、恐らくは立体障害または配座均衡の摂動によって結合エネルギーの大きな損失を招くことがある。
【０００７】
機能性核酸は限定された化学的性質を持つ４つのモノマーしか含まず、ヌクレオチドは共依存であるというＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ両博士の発見に基づいて核酸の構造は概ね決定されていることを考慮すると、結合種及び触媒が任意のヌクレオチドで実質的に使い果たされたランダム配列プールから選択できるのは驚くべきことである。しかしながら、Ｒｏｇｅｒｓ及びＪｏｙｃｅ^２２はシチジンを欠失したリボザイムはＢａｒｔｅｌＣｌａｓｓＩリガーゼの連続放出後選択可能であることを示した。アプタマー及びリボザイムはヌクレオチドの１つで使い果たされたプールから選択される一方、明らかに機能性の代価は化学的性質と構造が失われることで支払われる。シチジンを欠失したリボザイムはシチジンを含むリボザイムと比較しておよそ１００倍から１０，０００倍反応が遅い。
【０００８】
そのため、リガンド結合と蛍光による情報伝達の間での明らかな不一致を減少させることは有益である。蛍光性ヌクレオチドの少数の同一残基のみを含む情報伝達アプタマーをつくりだす選択法は当初からそのような手段を提供している。これらの選択された情報伝達アプタマーはアプタマーの広範な分子識別特性を情報伝達と結びつけるものである。
【０００９】
先行技術は情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法を欠いている点で不十分である。本発明はこの分野における長年のニーズと願望を成就するものである。
【００１０】
（発明の要約）
本発明は情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法において；特定の非対称的モル比を有するヌクレオチドのランダム・インサートをＤＮＡが有するようにＤＮＡプールを合成するステップと；上記ＤＮＡプールを増幅させるステップと；前記増幅されたＤＮＡからＲＮＡプールを転写するステップにおいて、上記ＲＮＡ転写で用いられるヌクレオチドが蛍光ラベルされていることを特徴とするステップと；上記蛍光ラベルされたＲＮＡプールを親和性カラムに入れて、上記蛍光ラベルされたＲＮＡプールから高親和性蛍光ＲＮＡ分子を取り出すステップと；上記高親和性蛍光ＲＮＡ分子からｃＤＮＡプールを得るステップと；上記高親和性蛍光ＲＮＡ分子上で増幅と選択を繰り返し、上記蛍光ＲＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップ；で構成されている方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法において；ＤＮＡがヌクレオチドのランダム・インサートを有し、前記ヌクレオチドが非対称的モル比を有しているＤＮＡプールを合成するステップと；ＤＮＡ増幅で用いられる１つのヌクレオチドが１つ以上のレポーター分子によってラベルされていることを特徴とする上記ＤＮＡプールを増幅するステップと；上記増幅されたＤＮＡから上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡを単離するステップと；上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡのプールを高親和性ラベルＤＮＡ分子が上記ラベルされたＤＮＡプールから取り出される親和性カラムに入れるステップと；上記親和性カラム上で上記高親和性ラベルＤＮＡプールを保持するためにステップ（ａ）から（ｄ）までを繰り返すステップと；そして、上記保持されたラベルＤＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップ；で構成されている方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の実施の形態では、１つのリガンドに結合する際の配座変化を上記情報伝達アプタマーのＲＮＡ配列に組み込まれる蛍光ラベルされたヌクレオチドの蛍光強度における変化に変換する情報伝達アプタマーを提供する。さらに、蛍光レベルされたヌクレオチドはＤＮＡ情報伝達アプタマーに組み込まれてもよい。
【００１３】
本発明の１つの好ましい実施の形態では、フルオレセインを含んだＲＮＡ抗アデノシン情報伝達アプタマーを提供する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明による１つの実施の形態で、情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法において；ヌクレオチドが特定の非対称的モル比を有するヌクレオチドのランダム・インサートを有するＤＮＡのＤＮＡプールを合成するステップと；上記ＤＮＡプールを増幅させるステップと；上記ＲＮＡ転写で用いられるヌクレオチドが蛍光ラベルされるように前記増幅されたＤＮＡからＲＮＡプールを転写するステップと；上記蛍光ラベルされたＲＮＡプールを親和性カラムに入れて、上記蛍光ラベルされたＲＮＡプールから高親和性蛍光ＲＮＡ分子を取り出すステップと；上記高親和性蛍光ＲＮＡ分子からｃＤＮＡプールを得るステップと；上記高親和性蛍光ＲＮＡ分子上で増幅と選択を繰り返し、上記選択された蛍光ＲＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップ；で構成されている方法を提供する。
【００１５】
この実施の形態の１つの態様において、ＲＮＡ増幅に使われるヌクレオチドは化学的に修飾されてもよい。好ましくは、そのＤＮＡはＡ：Ｃ：Ｇ：Ｔのモル比が３：３：２：０．３８で非対称的な５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有している。蛍光ラベルは蛍光色素でもよく、上記蛍光ラベルされたヌクレオチドは転写が行われる間ＲＮＡに組み込まれる特定のヌクレオチドに付加される。蛍光色素の代表例はフルオレセイン、カスケード・ブルー、及びローダミン・グリーンである。好ましくは、蛍光ＲＮＡはその蛍光ＲＮＡが情報伝達アプタマーである蛍光ラベルを有する約１個から３個のヌクレオチドを含んでいる。本発明の好適な実施の形態では、１個から３個のフルオレセインを含んだウリジンを含んでいる選択された情報伝達アプタマーが提供される。
【００１６】
本発明による別の実施の形態では、ＤＮＡ情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法において；ＤＮＡがヌクレオチドのランダム・インサートを有し、前記ヌクレオチドが非対称的モル比を有しているＤＮＡプールを合成するステップと；ＤＮＡ増幅で用いられる１つのヌクレオチドが１つ以上のレポーター分子によってラベルされていることを特徴とする上記ＤＮＡプールを増幅するステップと；上記増幅されたＤＮＡから上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡを単離するステップと；上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡのプールを高親和性ラベルＤＮＡ分子が上記ラベルされたＤＮＡプールから取り出される親和性カラムに入れるステップと；上記親和性カラム上で上記高親和性ラベルＤＮＡプールを保持するためにステップ（ａ）から（ｄ）までを繰り返すステップと；そして、上記保持されたラベルＤＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップ；で構成されている方法を提供する。
【００１７】
この実施の形態の１つの態様において、ＤＮＡ増幅に使われるヌクレオチドは化学的に修飾されてもよい。好ましくは、そのＤＮＡはＡ：Ｃ：Ｇ：Ｔのモル比が３：３：２：０．３８で非対称的な５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有している。蛍光ラベルは蛍光色素でもよく、特定のヌクレオチドあるいはプライマーに付加され、上記蛍光ラベルされたヌクレオチドは増幅の間、ＤＮＡに組み込まれる。蛍光色素の代表例はフルオレセイン、カスケード・ブルー、及びローダミン・グリーンである。好ましくは、蛍光ＤＮＡはその蛍光ＤＮＡが情報伝達アプタマーである蛍光ラベルを有する約１個から３個のヌクレオチドを含んでいる。
【００１８】
本発明によるさらに別の実施の形態では、選択された情報伝達アプタマーがＲＮＡまたはＤＮＡの核酸結合種（アプタマー）から成り、そのアプタマーは約１個から３個の蛍光ラベルされた同一のヌクレオチドを含んでいる。選択された情報伝達アプタマーは、１つのリガンドに結合する際の配座変化を情報伝達アプタマーに組み込まれた蛍光色素の蛍光強度の変化に変換する。
【００１９】
本発明の１つの好ましい実施の形態では、上記情報伝達アプタマーはフルオレセインを含んだ抗アデノシンＲＮＡアプタマーである。
【００２０】
ここで用いられる『アプタマー』または『選択された核酸結合種』とは、非修飾あるいは化学的に修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡなどである。選択の方法は逆転写（ＲＴ）あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるアフィニティークロマトグラフィー及び増幅法である。
【００２１】
ここで用いられる『情報伝達アプタマー』とは、レポーター分子を有するアプタマーなどであり、好ましくはそのアプタマーのリガンドとの相互作用の結果生じる配座変化の際に上記レポーター分子が特異的な信号、好ましくは蛍光強度の変化をもたらすような方法でヌクレオチドに付加する蛍光色素を有するアプタマーなどである。
【００２２】
ここで用いられる『リガンド』とは、情報伝達アプタマーと結合するあらゆる分子などである。
【００２３】
ここで用いられる『付加した』とは、情報伝達アプタマーを含んでいるＲＮＡが転写される間の蛍光ラベルされたヌクレオチドの組み込みなどを意味している。
【００２４】
ここで用いられる『ＰＣＲ』とは、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５及び第４，６８３，２０２の主題であるポリメラーゼ連鎖反応、及び現在既知となっている本分野のその他の進展を意味する。
【００２５】
ここで用いられる『塩基』とは、デオキシリボ核酸及びリボ核酸の両方を意味する。以下の略語、即ち、『Ａ』はアデニン及びそのデオキシリボース誘導体、『Ｔ』はチミン、『Ｕ』はウリジン、『Ｇ』はグアニン及びそのデオキシリボース誘導体、『Ｃ』はシトシン及びそのデオキシリボース誘導体、が用いられる。本分野の通常の当業者であれば、本発明による方法を最適化するためこれらの塩基が修飾あるいは誘導されることを容易に理解するであろう。
【００２６】
表１は本発明による選択された情報伝達アプタマーに関する詳細な情報を提供する。
【００２７】
【表１】

【００２８】
本発明は、情報伝達アプタマーが約１個から３個の蛍光された同一のヌクレオチドを含んでいる情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法に関するものである。さらに、本発明は、情報伝達アプタマーが１つのリガンドに結合する際の配座変化を情報伝達アプタマーに組み込まれた蛍光ヌクレオチドの蛍光強度の変化に変換するような情報伝達アプタマーに関するものである。
【００２９】
アプタマーはリガンドに誘導された配座変化を受ける。アプタマーを情報伝達アプタマーに転化するため、レポーター分子がアプタマーに導入される。レポーター分子は配座変化の結果としてその場所での化学的環境の変化を感知し、その結果配座変化の信号を出してリガンド結合が起きる。
【００３０】
情報伝達アプタマーを生成するため、蛍光またはその他のレポーターが未処理のランダム配列プールに導入される。例えば、蛍光レポーターを持つヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを用いるプールに導入される。同様に、レポーターを含んでいる蛍光レポーターまたはヌクレオチドを持つプライマーをＤＮＡプールに導入することができる。アプタマーは標的分子と結合する能力に基づいてそのようなプールから選択される。選択されたアプタマーは必然的に蛍光レポーターの存在に順応する。アプタマーはリガンドに誘導された配座変化を受けるので、存在する蛍光レポーターもその場所での化学的環境の変化を受け、それに応じて配座変化の信号を出す。
【００３１】
蛍光またはその他のレポーターが選択後アプタマーに導入されると、アプタマーの結合またはその他の機能を損なうことがある。しかしながら、結合またはその他の機能が損なわれたそれらのアプタマーはｉｎｖｉｔｒｏ選択の過程で失われ、機能的に蛍光レポーターを取り込めるアプタマーだけがその群の中に残るので、蛍光レポーターの選択前の導入によって、その蛍光レポーターが選択後にアプタマーの結合またはその他の機能を損なわないアプタマーの選択が可能である。
【００３２】
【実施例】
以下の実施例は本発明の様々な実施の形態を説明する目的で示されるものであり、いかなる意味でも本発明の限定を意味しない。
【００３３】
実施例１
材料
情報伝達アプタマーの特異性をテストするために使われるアガロース親和性レジン及びＡＴＰの誘導体をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。フルオレセイン−１２−ＵＴＰをＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。別のフルオレセイントＵＴＰ接合体、カスケード・ブルー−７−ＵＴＰ、テキサス・レッド−５−ＵＴＰ及びローダミン・グリーン−５−ＵＴＰをＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。
【００３４】
実施例２
蛍光測定
全ての蛍光測定値はＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（ＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）からのＳｅｒｉｅｓ２発光分光計で得た。実験サンプルは対応する色素の最大励起（フルオレセインλ_ｅｘ４９４ｎｍ、ローダミン・グリーン５０５ｎｍ、及びカスケード・ブルー４００ｎｍ）で励起し、蛍光強度は対応する最大放射（フルオレセインλ_ｅｘ５２１ｎｍ、ローダミン・グリーン５３３ｎｍ、及びカスケード・ブルー４２０ｎｍ）で測定した。１ｍｌのアプタマー溶液を蛍光計セル（ＳｔａｒｎａＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ａｔａｓｃａｄｅｒｏ，ＣＡ）にピペットで取り、種々の濃度のリガンド溶液を少量添加した。
【００３５】
実施例３
蛍光応答曲線
蛍光アプタマー（５０ｎＭ）を結合緩衝液中で熱的に均衡させた。平均して、８個の読み出しが得られ、アプタマーの最初の蛍光強度を確立した。結合緩衝液中で種々の濃度のＡＴＰ溶液を２μｌずつ加えていった。ＡＴＰ添加時の蛍光変化をプロットした。データ表現を標準化するため、任意のＡＴＰ濃度（Ｆ_Ｘ−Ｆ_０）における蛍光変化を飽和ＡＴＰ濃度（Ｆ_１００−Ｆ_０）における蛍光変化で割った。そのデータはプログラムＫａｌｅｉｄｏｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いる以下の方程式と一致した：Ｙ＝ＡＸ／（Ｘ＋Ｂ）；ここで、Ｙ＝任意のＡＴＰ濃度における蛍光の相対的増加、（Ｆ_Ｘ−Ｆ_０）／（Ｆ_１００−Ｆ_０）；Ｘ＝ＡＴＰ濃度；Ａ＝飽和ＡＴＰ濃度における蛍光の増加、（Ｆ_１００−Ｆ_０）；Ｂ＝見かけの乖離定数（Ｙ＝０．５ＡにおけるＡＴＰ濃度）。
【００３６】
実施例４
蛍光ＲＮＡプールの調製
シグナルが大きく、バックグラウンドは小さい情報伝達アプタマーを生成するため、各結合種には少数の蛍光残基だけが存在しなければならない。もし多数の蛍光残基が存在すると、その多くは局所的な配座変化には影響されず、バックグラウンドに本来備わっている蛍光が表われ、情報伝達アプタマーの識別はより困難になり、その結果全体としてのシグナルの大きさが減少する。
【００３７】
従って、Ｕ残基が少なく表われる（Ａ、Ｃ、及びＧが３３．１％、Ｕが６％）ように５１個の残基ランダム配列領域を非対称にしたＲＮＡ分子（Ｎ５１）のプールを生成する（図１Ａ）。その結果生じるＲＮＡ群はその群の主要部分が１分子あたり３個か４個のウリジンしか含まない（Ｙ＝［５１！／（（Ｘ！）（５１−Ｘ）！）］（０．０６）^Ｘ（０．９４）^{（５１−Ｘ} ^）、ここで、Ｙ＝その群の部分、Ｘ＝１分子あたりのウリジンの数）２項分布で記述される。最近Ｃを欠いたリボザイム^２２の選択により、機能性核酸分子が４種類の塩基のうち１つを欠いたプールから潜在的に選択可能であり、従って、抗アデノシン・アプタマーをＵが少ないプールから選択可能であることが証明されている。
【００３８】
具体的には、５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有する１０２−ｍｅｒＤＮＡプール（Ｎ５１；５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＡＣＧＡＣ−−−Ｎ_５１−−−ＡＧＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＣ（配列識別番号Ｎｏ．１））（図１Ａ）が合成された。各々のＮはモル比が３：３：２：０．３８Ａ：Ｃ：Ｇ：ＴホスホルアミダイトのＡ、Ｃ、Ｇ及びＴの混合物である。１本鎖ＤＮＡプールを標準的手順^３３に従って脱保護、精製、ＰＣＲ増幅した。その結果生じたＤＮＡプールの１０％のみが増幅可能であった。蛍光ＲＮＡプールは、ＵＴＰの代わりに１ｍＭのＦ−１２−ＵＴＰを使ったＴ７Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅｉｎｖｉｔｒｏ転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて２本鎖ＤＮＡプールから転写された。ｄｓＤＮＡテンプレートを除去するためのデオキシリボヌクレアーゼ消化の後、蛍光ラベルされたＲＮＡを１０％のポリアクリルアミド・ゲル上で精製し、０．３ＭのＮａＣｌ溶液中で３７℃の温度で一晩抽出し、エタノール沈殿した。そのプールを１５μｌのＨ_２Ｏ中で再懸濁し、その後０．０２５ｍｌｃｍ^−１ μｇ^−１の吸光係数を用いるＡ_２６０の測定によって計量した。これは非蛍光核酸^３４の標準吸光係数であり、フルオレセインがヌクレオチドとよく似た２６０（２１，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）に近似する吸光係数を有するため採用した。従って、少量のフルオレセイン・ラベルの添加は核酸プールの全体としての吸光係数をそれほど損なわないはずである。
【００３９】
実施例５
蛍光ラベルされたＲＮＡアプタマーのｉｎｖｉｔｒｏ選択
蛍光ラベルされた抗アデノシン・アプタマーの選択は抗アデノシン・アプタマーのもともとの選択と本質的に同じ方法で行われる^２３。最初のＲＮＡプールは約２×１０^１４個の塩基を含んでいる。結合緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ_２）中で３分間６５℃の温度で熱変性させ、室温で均衡させた後、そのプールを０．５ｍｌのアガロース・カラムに通し、カラム・マトリクスに結合するそれらの種を除去する。次に、そのプール（選択の過程の間４−３０μｇの範囲にある）をＡＴＰ−アガロース親和性カラムに入れ（ＡＴＰはそのＣ８を通り抜け、ジアミノヘキシル・リンカーを経て臭化シアン活性アガロースと結合する）、１０分間均衡させる。カラム内のＡＴＰ濃度は２．３ｍＭであり、親和性カラムの体積は選択の過程の間０．２ｍｌから１ｍｌの範囲内にあった。そのカラムを１５から４００カラム体積の結合緩衝液と展開することによって低親和性結合種を除去した。高親和性種は５ｍＭのＡＴＰを含む０．４から３ｍｌの結合緩衝液中のカラムから抽出した。エタノール沈殿による濃縮の後、生成された蛍光ＲＮＡ分子の濃縮プールをｃＤＮＡプールに逆転写し、ＰＣＲで増幅し、次のラウンドのための蛍光ＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ転写によって生成した。最後の３ラウンドで、先ずそのプールをネガティブ選択として０．５ｍｌのＧＴＰアガロース・カラムに通した。選択と増殖を１１ラウンド行った後、蛍光ＲＮＡプールの１／３がＡＴＰアガロース・カラム上に保持され、８カラム体積を抽出した。初期のラウンドではそのプールの１％未満を特異的に保持、抽出した。さらに、転写プロセスの間化学的に修飾されたヌクレオチドを使うことによって転写による蛍光ＲＮＡの生成が可能である。
【００４０】
ラウンド１１からのアプタマーをＴＯＰＯＴＡクローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使ってクローニングし、２４個のアプタマーの配列をＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍＥＸＣＥＬＩＩキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使って配列決定した。平均すると、選択された１配列に付き２．２５個のウリジンが存在し、修飾された塩基の取り込みに対する選択が殆ど、あるいは全く起こらなかったことを示している。アプタマーは配列の類似度に基づいて５つのファミリーと２つの分離物に容易に分類された（図１Ｃ）。ファミリー１及び２は６残基塩基モチーフ、ＣＡＧＡＡＧ（配列識別番号Ｎｏ．１６）を共有すると見られる。図１ＢはＳａｓｓａｎｆａｒ及びＳｚｏｓｔａｋによって選択された最小の抗アデノシン・アプタマーを示す^２３。
【００４１】
Ｒａｆ１７はヌクレオチドの１つの中でかなり使い果たされたプールから選択されたアプタマーの最初の例である。このプール（ファミリー４、図１Ｃ）からのその他のアプタマーはウリジン残基を含んでいない。Ｃのないプールに残ったウリジンは両方のプリンとペアになり、Ｕが少ないプールに残ったシチジンはアデノシンでなく主としてグアノシンと対になることから、機能性核酸がＣではなくＵが使い果たされたプールから選択されたことはとりわけ有望である。これらの結果はさらに、核酸レプリケータ及び触媒の最初の展開に遺伝子情報の完全な相補は必要でなかったという可能性を示している^{２４，１５}。
【００４２】
実施例６
情報伝達機能のためのアプタマーのスクリーニング
フルオレセインを含んだＲＮＡの最後のプールは情報伝達能力をわずかに示す。その６００ｎＭのプールをＡＴＰ２ｍＭの存在下で均衡させると、７％の相対フルオレセインの増加を示した。配列の異なるファミリーの代表例を２００μＭのＡＴＰの存在下で情報伝達について分析した（図１Ｄ）。ファミリー１からのアプタマーのみが有意でポジティブな情報伝達能力（蛍光の増加）を示し、ｒａｆ１７が最良の情報伝達アプタマーであった。ファミリー５からの１つのアプタマー及び１つの分離物であるｒａｆ１２８は若干のネガティブな情報伝達能力
（蛍光の減少）を示した。
【００４３】
実施例７
情報伝達残基のマッピング
アプタマーｒａｆ１７及びｒａｆ１５の両方ともアデノシンが存在するというシグナルを出すが、後者は前者よりウリジン残基を１つ多く含む。この比較によってｒａｆ１５及びその他のファミリー１メンバー内の３’−ｍｏｓｔウリジン残基はバックグラウンド蛍光に寄与するが、情報伝達には不必要であることが示唆される。このことはｒａｆ１７（相対蛍光の２２％増加）がｒａｆ１５（相対蛍光の１５％増加）よりわずかに大きな情報伝達能力を示すという事実から支持される。
【００４４】
ｒａｆ１７（図２Ａ）内の残り２つのフルオレセインを含むウリジン残基のどちらが情報伝達に必要か判定するため、位置５２のウリジンをシチジンで（ｒａｆ１７−Ｕ５２Ｃ）、あるいは位置６１のウリジンをシチジンで（ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃ）置換するｒａｆ１７の変異体を構成した。Ｕ５２Ｃの置換はＡＴＰ依存の蛍光変化を何ら示さず、一方Ｕ６１Ｃの置換はシグナルを発するだけでなく、母体分子であるｒａｆ１７よりもわずかに大きなＡＴＰ依存の蛍光変化を実際に示す（図２Ｂ）。これは情報伝達に無関係なフルオロフォアが除去されると、情報伝達が向上するという仮定に一致する。ｒａｆ１７はＲＦＵの最大変化が５６％を示し、ＡＴＰに対する見かけのＫ_ｄは２２３μＭ±２０μＭである。ｒａｆ１７−Ｕ６１ＣはＲＦＵの最大変化が７５％を示し、ＡＴＰに対する見かけのＫ_ｄは１６５μＭ±１０μＭのＫ_ｄである（図２Ｂ）。全般に、異なるアプタマー及び変異体による結果は、フルオレセインを含む位置５２のウリジンが情報伝達のためのファミリー１のアプタマーに必要とされる唯一の残基であることを示す。さらに、情報伝達は明らかに同系リガンドがないときのフルオレセインの消滅によるものである。アプタマーがリボヌクレアーゼで消化されるとき、その最大蛍光強度はＡＴＰ飽和濃度の存在下でのもともとのアプタマーの蛍光強度に等しい。
【００４５】
他にどの残基が情報伝達にとって重要かに関する仮定を構築するため、アプタマーｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃの予想される二次構造（図２Ａ）を調べた。単一のウリジンは恒常領域から離れて、マルチ・アーム接合部と見られる部位に発生する。アプタマー（ｒａｆ１７）の不完全な異形は殆どの恒常領域が除去される場所に生成され、一方でマルチ・アーム接合部を支持する長い、予想されたステムが残る。ｒａｆ１７は情報伝達活性（図２Ｂ）を支持する。事実、情報伝達活性は向上し、ＲＦＵの最大変化は８１％であった。見かけのＫ_ｄは１７５μＭ±５μＭで、母体アプタマーｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃと本質的に同じであった。さらに、マルチ・アーム接合部の一部が除去されたｒａｆ１７の不完全型はシグナルを出さなかった（データ図示せず）。
【００４６】
Ｕが少ない抗アデノシン情報伝達アプタマーは、Ｓａｓｓａｎｆａｒ及びＳｚｏｓｔａｋによって選択され^２３、ＢｕｒｋｅとＧｏｌｄ^２６及びＢｕｒｇｓｔａｌｌｅｒとＦａｍｕｌｏｋ^２７によってそれぞれ独立に選択された標準抗アデノシン・アプタマーＡＴＰ−４０−１よりもおよそ２００倍多いＡＴＰの対する見かけのＫ_ｄを有していた。しかし、その選択された情報伝達アプタマーは相当する特異性の喪失がないように見える。これらの結果はアプタマーの特異性が個々のリガンドとの水素結合あるいは塩橋の形成または喪失というよりは、結合ポケットの構造に本来備わっている立体構造の制約が主として起因することと一致する。
【００４７】
実施例８
情報伝達の特異性
アプタマーｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃの特異性を評価するため、蛍光シグナルの相対変化を種々のアデノシン誘導体及びその他のヌクレオチドの存在下でモニターした。これらのデータは図３Ａに示され、ＡＴＰ存在下での蛍光変化に標準化されている。そのアプタマーは核塩基または糖（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、アデノシン、ＮＡＤ）のいずれかを損なわない任意のアデノシン誘導体の存在下でシグナルを出す。しかしながら、核塩基または糖がアデノシンと異なる大部分の誘導体はシグナルを出さないか、フルオロフォアをわずかに消滅させる。唯一の例外はＮ６−メチル・アデノシン及び２’ｄＡＴＰで、若干のポジティブな情報伝達能力を示す。興味深いことに、２’デオキシアデノシンはシグナルを出さない。５’リン酸塩の存在は通例認識と情報伝達を強化すると思われ、ＡＴＰ及びＡＤＰはＡＭＰ及びアデノシンよりもよくシグナルを出すので、アプタマーは２’ｄＡＴＰと２’デオキシアデノシンを識別しているのであろう。
【００４８】
情報伝達アプタマー及びＳａｓｓａｎｆａｒとＳｚｏｓｔａｋによって選択された抗アデノシン・アプタマー（ＡＴＰ−４０−１）^２３の両方がアデノシン・ヌクレオチドの塩基と糖の部分を主に認識する。しかし、ポジティブな情報伝達の基準に基づくと、ｒａｆ１７ｂ情報伝達アプタマーの特異性は４つの残基全てを等量含むプールから選択された抗アデノシン・アプタマーの特異性と等しいか、あるいはそれよりも良好である（図３Ｂ）。‘Ｕが豊富な’ＡＴＰ−４０−１もアデニン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、及び７−デアザアデノシンを交差認識し、一方‘Ｕが少ない’ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃはそれらを交差認識しない。逆に、ｒａｆ１７−Ｕ６１ＣもＮ６−メチル・アデノシンを認識するが、ＡＴＰ−４０−１はそれを認識しない。
【００４９】
選択された情報伝達アプタマーが複雑な混合物の存在下でリガンドを計量するために十分特異的かどうか判定する必要があった。ｒａｆ１７の蛍光強度の変化をＡＴＰ濃度をＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ（図４Ａ）のバックグラウンドまたは１％コウシ血清（図４Ｂ）のバックグラウンドに対して変化させながら判定した。
【００５０】
両方の場合で、情報伝達アプタマーはＡＴＰの存在及び濃度に追従した。しかし、これら２つの環境内での情報伝達アプタマーの見かけのＫ_ｄはかなり違っており、他のヌクレオチド存在下での見かけのＫ_ｄは１２７μＭ±３μＭであったのに対して、血清内の見かけのＫ_ｄは２１２μＭ±７μＭであった。環境が異なると非リガンドで消滅型の情報伝達アプタマーを異なる程度に安定化または不安定化すると見られる。実際には、複雑な混合物内の分析的計量にはその他の多くの分析技術と同様に標準曲線の利用が必要であろう。
【００５１】
実施例９
選択された情報伝達アプタマーは一般にリガンド認識を蛍光強度の変化につなぐことが可能である
ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃがシグナルを出す仕組みは未知であるが、Ｕ５２は化学環境のリガンド依存変化を受けるようである。もしそうならば、２つの可能性がある。リガンド依存の配座変化がＦ−１２−Ｕに依存しているか、またはリガンド依存の配座変化とはＦ−１２−Ｕと無関係であるかである。
【００５２】
これらの可能性を調べるために、アプタマーを他のＵＴＰ類似体、即ち、カスケード・ブルー−７−ＵＴＰ、ローダミン・グリーン−５−ＵＴＰ、及びテキサス・レッド−５−ＵＴＰで転写した。光学的性質の明らかな差異は別にして、これらの類似体はフルオロフォアとヌクレオチドの間のアルキル・アミノ・スペーサーの全長も異なっていた（スペーサー内の原子数は類似体の名称の中に示される。例えば、カスケード・ブルー−７−ＵＴＰは色素とヌクレオチドの間に７個の原子を持つ）。
【００５３】
ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃをテキサス・レッド（ｒａＴＲ７ｂ）で転写するとシグナルを出さないラベルされたアプタマーが生じる。しかし、注目すべきことに、Ｆ−１２−ＵＴＰの代わりにカスケード・ブルー（ｒａＣＢ７ｂ）、及びローダミン・グリーン（ｒａＲＧ７ｂ）を使った転写は情報伝達アプタマーを生み出した（図５Ａ及び５Ｂ）。ｒａＣＢ７ｂに対するＲＦＵの最大増加量は１６０％で、見かけのＫ_ｄは１８８μＭ±１５μＭである。ｒａＲＧ７ｂに対するＲＦＵの計算上の最大増加量は２２０％で、ＡＴＰに対する見かけのＫ_ｄは５７１μＭ±３９μＭである。いずれのアプタマーも最大５００μＭまでのＧＴＰの存在下ではシグナルを出さない。
【００５４】
選択された情報伝達アプタマー内の少数のウリジンは機能上重要である。かなり異なるウリジン色素接合体がｒａｆ１７による情報伝達を支持できるという事実は結合及び配座変化は単一の残ったウリジン残基と強く結びついていることを示唆する。フルオレセインが選択が進行する間化学物質へのＡＴＰ結合に貢献する機会をどんな核塩基、糖、またはリン酸ジエステルとも同じくらい多く有したことを考えるとこれはいささか驚くべきことである。より長いスペーサー・アームを持つ修飾されたヌクレオチド（Ｆ−１２−ＵＴＰ及びカスケード・ブルー−７−ＵＴＰ）は、より短いスペーサー・アームを持つ修飾されたヌクレオチド（ローダミン・グリーン−５−ＵＴＰ、及びテキサス・レッド−５−ＵＴＰ）よりも結合を邪魔することが少ない。このような長さの明らかな相互関係もやはりウリジン残基自体の結合及び情報伝達における中心的な重要性を示している。
【００５５】
実施例１０
選択され、スクリーニングされた情報伝達アプタマーの感受性及び反応性
情報伝達アプタマーを設計するには三次元分子構造の詳細な知識が必要であり、利用する前に綿密に合成及び分析されなければならないが、選択されスクリーニングされた情報伝達アプタマーでは構造や配列の予測も必要なく、センサー成分として即時に利用できる。さらに、選択された情報伝達アプタマーは設計された情報伝達アプタマーよりも感受性がよい。残基Ａ１３がアクリジン・ラベルで置換される見かけのＫ_ｄ及びＡＴＰ−４０−１誘導体は３４０±７０μＭであるが、ｒａｆ１７の基礎量Ｋ_ｄは１７５±５μＭである。選択された情報伝達アプタマーは反応性も非常に優れている（図６）。アクリジン共役ＡＴＰ−４０−１は２８±２％^２１という相対蛍光のアデノシン依存の最大の増加を有し、一方選択されスクリーニングされた情報伝達アプタマーは最大７倍までの相対蛍光の増加を有する。Ａ１３がフルオレセインで置換されたアプタマーは情報伝達能力を示さなかったので、異なるフルオロフォアが情報伝達アプタマーの選択（フルオレセイン）よりも、情報伝達アプタマーの設計（アクリジン）に利用されたという事実はそのような比較の有効性を限定するものではない^２１。
【００５６】
実施例１１
蛍光ラベルされたＲＮＡ情報伝達アプタマーのｉｎｖｉｔｒｏ選択
対応する蛍光ラベルされたＤＮＡ情報伝達アプタマーは蛍光ラベルされたＲＮＡ情報伝達アプタマーとして提供される通り、ＤＮＡ最終生成物を説明するためわずかに修飾することで、上記の方法を用いて容易にｉｎｖｉｔｒｏで選択できることは明らかである。これらのＤＮＡアプタマーは修飾されていない、あるいは化学的に修飾されたいずれかのヌクレオチドを組み込んでもよい。非対称のモル比を持つヌクレオチドのランダム・インサートを用いるＤＮＡプールが合成され、その後増幅される。そのＤＮＡの増幅は１つ以上のレポーター分子を含んでいるプライマーあるいは１つ以上のレポーター分子を含んでいるヌクレオチドのいずれかを経て完成される。１本鎖ＤＮＡはその増幅されたＤＮＡから単離され、ＤＮＡアプタマーの特異的結合種が選択され、その後増幅される。
【００５７】
実施例１２
診断用試薬としての情報伝達アプタマー
アプタマーのｉｎｖｉｔｒｏ選択は種々の標的に向けたレセプターを生成するためのきわめて容易で確固とした方法であることが証明されてきた。現在アプタマーは、抗体が以前そう証明されたのと殆ど同じように普遍的なレセプターであると考えられている。しかし、抗体とは異なり、アプタマーは溶液中での同系リガンドとの相互作用を即座に伝える、合成が容易な診断用試薬に転換される^{１，２，２８}。
【００５８】
１つのアプタマーに導入された１つの蛍光レポーターは強度、異方性、寿命、波長及びスペクトルの性質の変化を生み出すことができた。特に、同じ情報伝達アプタマーが多数の異なる蛍光色素を収容できるという事実は異なる波長での分析に必要な仕組みや装置での情報伝達アプタマーの応用にとって好ましいことである。蛍光の性質を調節する複数の蛍光または分子は同一のアプタマーに導入され、強度、異方性、寿命、波長及びスペクトルの性質の協調的変化を受けることができる。さらに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変化も可能である。
これらの特徴に基づき、情報伝達アプタマー選択のための処理能力の高い方法をさらに開発することは多数の非核酸検体を検出できるセンサー・アレイの開発を可能にする。特に、例えば、技術の有益な組み合わせはビーズ上での情報伝達アプタマーの化学合成及びこれらのビーズを光ファイバーケーブル^{２９，３０}またはエッチングされたマイクロウェル^{３１，３２}に直接導入することが含まれるであろう。
【００５９】
本明細書では以下の参考文献を引用した。
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２７．Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ，Ｐ．＆Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＲＮＡ−ａｐｔａｍｅｒｓｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｆａｃｔｏｒｓｂｙｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄＥｎｇｌ．３３，１０８４−１０８７（１９９４）．
２８．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ，Ｊ．，Ｊｈａｖｅｒｉ，Ｓ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ：ａｐｔａｍｅｒｓａｎｄａｐｔａｚｙｍｅｓＰｒｏｃ．ＳＰＩＥ−ＩｎｔＳｏｃＯｐｔＥｎｇ．３８５８，１２６−１３４（１９９９）．
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３２．Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ａｎａｌｙｔｅｔｏｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｅｎｓｏｒｓＰｒｏｃＳＰＩＥ−ＩｎｔＳｏｃＯｐｔＥｎｇ．３６０２（ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｅｎｓｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩＶ），２２０−２３１（１９９９）．
３３．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．，Ｂｅｌｌ，Ｓ．，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｐｏｏｌｓｆｏｒＩｎＶｉｔｒｏＳｅｌｅｃｔｉｏｎ，９．２．１−２３ＩｎＰｒｅｓｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，１９９９）．
３４．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆＤＮＡａｎｄＲＮＡｗｉｔｈＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ａ，３Ｄ．１−８（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，１９９６）
【００６０】
本明細書で述べられた特許または刊行物のいずれもが本発明が関連する当業者の水準を示している。また、これらの特許及び刊行物は、個々の刊行物が言及によって組み込まれることが具体的、個別的に示されていたのと同じ程度に、言及されることによって本明細書に組み込まれる。
【００６１】
この分野の当業者であれば、本発明がその目的を成就し、上に述べられたともに本発明に内在する目標と利点を達成するため好適であることを容易に理解するであろう。本実施例は本明細書に述べられた方法、手順、治療、分子、及び特定の化合物と共に現在のところ好ましい実施の形態の代表例であり、典型であり、本発明の範囲を限定することは意図していない。本発明の変形及びその他の利用は請求項の範囲で定義されているような本発明の精神の範囲内に含まれる本分野での当業者にとっては容易に想起できるものである。
【図面の簡単な説明】
本発明の特徴、利点及び目的などが達成され、詳細に理解されるために、本発明のより詳しい説明が添付図面で明示される本発明のいくつかの実施の形態を参照することによって得られるであろう。これらの図面は本明細書の一部を構成している。しかしながら、添付図面は本発明の好適な実施の形態を明示するためのものであり、従って、それらの範囲を限定するものと考えてはならない。
【図１Ａ】選択に用いられるＲＮＡプールの配列を示す図。このプールの５１個のヌクレオチドのランダム配列領域は非対称的である（Ａ、Ｃ、及びＧは３３．１％、Ｕは６％）。ウリジン残基はＦ−１２−Ｕによって完全に置換される。
【図１Ｂ】Ｓａｓｓａｎｆａｒ及びＳｚｏｓｔａｋ^２３によって選択された最小の抗アデノシン・アプタマーを示す図。
【図１Ｃ】クローンされたアプタマーから５１個のヌクレオチド・ランダム領域の配列を示す図。同一のクローンの番号は括弧内に示されている。下線を引いた残基はファミリー１及びファミリー２の配列で共有される６個のヌクレオチド・モチーフを示す。
【図１Ｄ】情報伝達アプタマーのスクリーンを示す図。２００ｍＭのＡＴＰの存在下でのアプタマー（１００ｎＭ）の情報伝達能力が示されている。
【図２Ａ】情報伝達アプタマーｒａｆ１７、ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃ、及びｒａｆ１７ｓの予想される二次構造を示す図。恒常領域の残基は太字で示されている。Ｆ−１２−Ｕ残基はハイライトされている。
【図２Ｂ】情報伝達アプタマーの応答曲線を示す図。設定された多数のデータが反応式Ｙ＝ＡＸ／（Ｘ＋Ｋ_ｄ）を用いた曲線に適合した。曲線の下の表は計算によるカーブ・フィット・パラメータ及び飽和状態での相対蛍光単位（ＲＦＵ）の変化を示す。
【図３Ａ】ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃ（２１ｎＭ）の情報伝達特異性を示す図。アプタマーｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃの情報伝達について２００μＭのリガンド存在下で分析した。異なるリガンドに対するＲＦＵの変化はＡＴＰと共にＲＦＵの変化へ標準化されることが示されている。
【図３Ｂ】ＡＴＰ−４０−１^２０で報告された結合特異性とｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃのポディブな情報伝達特異性の比較図。
【図４】他のヌクレオチドの存在下（図４Ａ）及び１％血清の存在下（図４Ｂ）での情報伝達アプタマーの応答曲線を示す図。図４Ａでは、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰの等モル溶液が種々の濃度で情報伝達アプタマーｒａｆ１７ｓと混合された。図４Ｂでは、情報伝達アプタマーｒａｆ１７ｓが種々の量のＡＴＰと混合された。図中の符号や意味は図２と同様である。
【図５】情報伝達アプタマーｒａＣＢ７ｂ（図５Ａ）及びｒａＲＧ７ｂ（図５Ｂ）の応答曲線を示す図。設定された重複データは曲線に適合した。曲線の下の表は計算によるカーブ・フィット・パラメータを示す。
【図６】選択された情報伝達アプタマーであるｒａｆ１７ｓ、及び設計された情報伝達アプタマーであるＲＮＡ−１３−ＡＣ^２１の応答曲線を示す図。

Claims

情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法において、
（ａ）ヌクレオチドがランダムに挿入されており（ランダム・インサート）、前記ヌクレオチドが非対称的モル比を有しているＤＮＡのプールを合成するステップと、
（ｂ）上記ＤＮＡプールを増幅させるステップと、
（ｃ）前記増幅されたＤＮＡからＲＮＡプールを転写するステップにおいて、上記ＲＮＡ転写で用いられるヌクレオチドが１つ以上のレポーター分子によってラベルされていることを特徴とするステップと、
（ｄ）上記ラベルされたＲＮＡプールを親和性カラムに入れて、上記ラベルされたＲＮＡプールから高親和性ラベルＲＮＡ分子を取り出すステップと、
（ｅ）上記高親和性ラベルＲＮＡ分子からｃＤＮＡプールを得るステップと、
（ｆ）上記親和性カラム上で上記高親和性ラベルＲＮＡプールを保持するためにステップ（ａ）から（ｅ）までを繰り返すステップと、そして
（ｇ）上記保持されたラベルＲＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップと
で構成されていることを特徴とする方法。
ＲＮＡ転写で用いられる上記ヌクレオチドが化学的に修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
上記ＤＮＡが５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有していることを特徴とする請求項１記載の方法。
上記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１に示される配列を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
上記非対称的モル比が３：３：２：０．３８Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔホスホルアミダイトであることを特徴とする請求項１記載の方法。
上記高親和性ラベルＲＮＡプールの概ね３分の１が上記親和性カラム上で保持されるまでステップ（ａ）から（ｅ）が繰り返されることを特徴とする請求項１記載の方法。
上記親和性カラムがＡＴＰアガロース親和性カラムであることを特徴とする請求項１記載の方法。
上記レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいは上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
上記蛍光が１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が形成される蛍光色素であることを特徴とする請求項８記載の方法。
上記蛍光色素がフルオレセイン、カスケード・ブルー、テキサス・レッド及びローダミン・グリーンで構成される群から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
上記蛍光色素ヌクレオチド結合体が蛍光色素ウリジン５’−３リン酸結合体であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
上記蛍光色素ウリジン５’−３リン酸結合体がフルオレセイン−１２−ＵＴＰ、カスケード・ブルー−７−ＵＴＰ、テキサス・レッド−５−ＵＴＰ及びローダミン・グリーン−５−ＵＴＰで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
上記情報伝達アプタマーがｒａｆ１５、ｒａｆ１７、ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃ、ｒａｆ１７−Ｕ５２Ｃ、ｒａｆ１７ｓ、ｒａｆ１３４、ｒａｆ１１０、ｒａｆ１１１、ｒａｆ１８、ｒａｆ１３３、ｒａｆ１１７、ｒａｆ１１４、ｒａｆ１２０、ｒａｆ１２６、ｒａｆ１２８、ｒａｃｂ７ｂ、及びｒａｒｇ７ｂで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
請求項１記載の方法によって選択される情報伝達アプタマー。
情報伝達アプタマーが１つ以上のレポーター分子を含む１つのＲＮＡ核酸結合種（アプタマー）で構成されることを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいは上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項１５記載の情報伝達アプタマー。
上記蛍光が１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が上記情報伝達アプタマー内に形成される蛍光色素であることを特徴とする請求項１６記載の情報伝達アプタマー。
上記蛍光色素ヌクレオチド結合体が蛍光色素ウリジン５’−３リン酸結合体であることを特徴とする請求項１７記載の情報伝達アプタマー。
上記情報伝達アプタマーがｒａｆ１５、ｒａｆ１７、ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃ、ｒａｆ１７−Ｕ５２Ｃ、ｒａｆ１７ｓ、ｒａｆ１３４、ｒａｆ１１０、ｒａｃｂ７ｂ、及びｒａｒｇ７ｂで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
上記リガンドがアデノシン５’−３リン酸であることを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
上記情報伝達アプタマーが１つのリガンドに結合したときの配座変化を上記情報伝達アプタマーに組み込まれたレポーター分子の分光学的性質における変化に変換することを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
上記分光学的性質が蛍光の強度、異方性、寿命、波長及び蛍光共鳴エネルギー移動で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１記載の情報伝達アプタマー。
情報伝達アプタマーをｉｎｖｉｔｒｏで選択する方法において、
（ａ）ヌクレオチドがランダム・インサートされ、前記ヌクレオチドが非対称的モル比を有しているＤＮＡのプールを合成するステップと、
（ｂ）上記ＤＮＡ増幅で用いられる１つのヌクレオチドが１つ以上のレポーター分子によってラベルされていることを特徴とする上記ＤＮＡプールを増幅するステップと、
（ｃ）上記増幅されたＤＮＡから上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡを単離するステップと、
（ｄ）高親和性ラベルＤＮＡ分子が上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡプールから取り出される親和性カラムに上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡプールを入れるステップと、
（ｅ）上記親和性カラム上で上記高親和性ラベルＤＮＡプールを保持するためにステップ（ａ）から（ｄ）までを繰り返すステップと、そして
（ｆ）上記保持されたラベルＤＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップと
で構成されていることを特徴とする方法。
上記ＤＮＡ増幅で用いられる上記ヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
上記ＤＮＡが５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有していることを特徴とする請求項２３記載の方法。
上記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１に示される配列を有することを特徴とする請求項２５記載の方法。
上記非対称的モル比が３：３：２：０．３８Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔホスホルアミダイトであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
上記親和性カラムがＡＴＰアガロース親和性カラムであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
上記レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいは上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
上記蛍光が１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が形成されるような蛍光色素であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
上記蛍光色素がフルオレセイン、カスケード・ブルー、テキサス・レッド及びローダミン・グリーンで構成される群から選択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
請求項２３記載の方法によって選択される情報伝達アプタマー。
情報伝達アプタマーが１つ以上のレポーター分子を含む１つのＤＮＡ核酸結合種（アプタマー）で構成されることを特徴とする請求項３２記載の情報伝達アプタマー。
レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいは上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項３３記載の情報伝達アプタマー。
上記蛍光が１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が上記情報伝達アプタマー内に形成されるような蛍光色素であることを特徴とする請求項３４記載の情報伝達アプタマー。
上記リガンドがアデノシン５’−３リン酸であることを特徴とする請求項３２記載の情報伝達アプタマー。
上記情報伝達アプタマーが１つのリガンドに結合するときの配座変化を上記情報伝達アプタマーに組み込まれたレポーター分子の分光学的性質における変化に変換することを特徴とする請求項３２記載の情報伝達アプタマー。
上記分光学的性質が蛍光の強度、異方性、寿命、波長及び蛍光共鳴エネルギー移動で構成される群から選択されることを特徴とする請求項３７記載の情報伝達アプタマー。