JP2004526446A - Mammalian α-helix protein-53 - Google Patents

Abstract

The present invention relates to polynucleotides and polypeptides for mammalian α-helix-53 (Zalpha53). The polypeptides and polynucleotides that encode them are hormonal and can be used to modulate the function of the immune system. The invention also includes antibodies to the Zalpha53 polypeptide. Antagonists to Zalpha53 are used to treat inflammation and inflammation-related diseases.

Description

【００５７】
【表１】

【００５８】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【００５９】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２、３、２０又は２１）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【００６０】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。
【００６１】
ＦＡＳＴＡ 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【００６２】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは４〜６であり得る。
【００６３】
本発明は、配列番号２，３、２０又は２１のアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。
【００６４】
従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような比を用いて、類似する方法により決定される。
【００６５】
変異体Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド及び実質的に相同のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【００６６】
従って、本発明は、配列番号２，３、２０又は２１のその対応する領域に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、及びより好ましくは９９％又はそり以上の同一性である配列を含んでなる２０〜３０個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Ｘａ因子分解部位を含む。
【００６７】
【表２】

【００６８】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体（及び１又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質）を提供する。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示されるようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫グロブリン−Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド融合体は、種々のマルチマーＺａｌｐｈａ５３類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子（例えばコラーゲン）に対してそれらを標的化するためにＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドに融合され得る。
【００６９】
例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又はタンパク質が、標的細胞の表面上の受容体に特異的に結合するリガンドにＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドを融合せしめることによって、予定された細胞型に標的化され得る。この場合、ポリペプチド及びタンパク質は、治療又は診断目的のために標的化され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： １−９， １９９６を参照のこと。
【００７０】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。
【００７１】
アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【００７２】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【００７３】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
【００７４】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Ｚａｌｐｈａ５３アミノ酸により置換され得る。
【００７５】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。
【００７６】
また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−５７０８， １９９６を参照のこと。リガンド−受容体相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ など．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２， １９９２； Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４， １９９２； Ｗｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４， １９９２を参照のこと。
【００７７】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【００７８】
開示されるＺａｌｐｈａ５３ ＤＮＡ及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡが、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【００７９】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【００８０】
本明細書において論じられた方法を用いて、当業者は、野生型Ｚａｌｐｈａ５３タンパク質の性質を保持する、配列番号２、３、２０又は２１の種々のポリペプチドフラグメントを同定し、そして／又は調製することができる。
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。
【００８１】
タンパク質生成
本発明のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、生物学的に活性のフラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は次の文献に開示される：Ｓａｍｂｒｏｏｌ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌ など．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｓ．， ＮＹ， １９８７。
【００８２】
一般的に、本発明のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
【００８３】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、Ｚａｌｐｈａ５３の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばｔ−ＰＡ ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、Ｚａｌｐｈａ５３ ＤＮＡ配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【００８４】
他方では、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌路中に他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリペプチドを提供する。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、分泌路中い追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペプチドにアミノ末端的に融合される。そのような構造体は、当業界において知られている多くの用途を有する。例えば、それらの新規の分泌シグナル配列融合構造体は、通常分泌されないタンパク質、例えば受容体の活性成分の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。
【００８５】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性ＤＮＡを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｃｅｌｌ １４ ： ７２５， １９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７ ：６０３， １９８１； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２； ４５６， １９７３），エレクトロポレーション（ Ｎｅｕｍａｎｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． １： ８４１−８４５， １９８２ ）； ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ −Ｎｅｌｓｏｎ など．， Ｆｏｃｕｓ １５： ７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ など．，Ｆｏｃｕｓ １５： ８０， １９９３ ）を包含する。
【００８６】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばｌｅｖｉｎｓｏｎ など．， アメリカ特許第４，７１３，３３９ 号； Ｈａｇｅｎ など．， アメリカ特許第４，７８４，９５０ 号； Ｐａｌｍｉｔｅｒ など．， アメリカ特許第 ４，５７９，８２１ 号； 及びＲｉｎｇｏｌｄ， アメリカ特許第 ４，６５６，１３４ 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １０３１４ ）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １５７３ ； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏ． ３６： ５９−７２， １９７７ ）、及びチャイニーズ ハムスター卵巣（例えば ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ６１ ）細胞系を包含する。
【００８７】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばＳＶ−４０ 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第４，９５６，２８８ 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 ４，５７９，８２１ 号及び第 ４，６０１，９７８ 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【００８８】
薬物選択は一般的に、外来性ＤＮＡが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。
【００８９】
増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４， ＣＤ８，クラスＩ ＭＨＣ、胎盤アルカリホスファターゼが、ＦＡＣＳ分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【００９０】
他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒなど．、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （ Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ） １１： ４７−５８， １９８７ により再考されている。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏ など．，アメリカ特許第５，１６２，２２２号；及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号により公開される。昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染され得る。
【００９１】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡは、２種の方法の１つにより、ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子コード配列の代わりにバキュロウィルスゲノム中に挿入される。第１の方法は、野生型ＡｃＮＰＶと、ＡｃＮＰＶ配列を端に有するＺａｌｐｈａ５３を含むトランスファーベクターとの間の相同ＤＮＡ組換えの従来の方法である。適切な昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞が野生型ＡｃＮＰＶにより感染され、そしてＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子プロモーター、ターミネーター及びフランキング配列に作用可能に連結されるＺａｌｐｈａ５３ポリヌクレオチドを含んで成るトランスファーベクターによりトランスフェクトされる。
【００９２】
Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， １９９４； 及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， Ｅｄ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９５を参照のこと。昆虫細胞内の天然組換えは、ポリヘドリンプロモーターにより駆動されるＺａｌｐｈａ５３を含む組換えバキュロウィルスをもたらすであろう。組換えウィルスストックは、当業界において通常使用される方法により製造される。
【００９３】
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ （ Ｌｕｃｋｏｗ， ＶＡ， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６−７９， １９９３ ） により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。このシステムは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ （ ＴＭ ）キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）として市販されている。このシステムは、“ｂａｃｍｉｄ” と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃＩ （ＴＭ ） （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を利用する。
【００９４】
ＰＦａｓｔＢａｃｌ^ＴＭ トランスファーベクターは、興味ある遺伝子、この場合、Ｚａｌｐｈａ５３の発現を誘導するためにＡｃＮＰＶポリヒドリンプロモーターを使用する。しかしながら、ｐＦａｓｔＢａｃｌ^ＴＭは相当の程度まで修飾され得る。前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Ｐｃｏｒ， ｐ６．９又はＭＰプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【００９５】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のＺａｌｐｈａ５３分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチＭｅｌｉｔｔｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ） 又はバキュロウィルスｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）は、生来のＺａｌｐｈａ５３分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【００９６】
さらに、トランスファーベクターは発現されたＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端でエピトープ標識、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕ エピトープ標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． など．， Ｐｅｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ７９５２−６， １９８５）。当業界において知られている技法を用いて、Ｚａｌｐｈａ５３を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａ についてスクリーンされる。
【００９７】
組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ が、通常の技法を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）細胞、例えばＳｆ９ 細胞をトランスフェクトするために使用される。Ｚａｌｐｈａ５３を発現する組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者において通常使用される方法により製造される。
【００９８】
組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， ＡＳＭ Ｐｒｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９４を参照のこと。もう１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に由来するＨｉｇｈ ＦｉｖｅＯ^ＴＭ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である（アメリカ特許第５，３００，４３５号）。市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。
【００９９】
適切な培地は、Ｓｆ９細胞のためには、ＳＦ９００ＩＩ^ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），又はＥＳＴ ９２１^ＴＭ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）； 及びＴ． ｎｉ 細胞のためには、Ｅｘ−ＣｅｌｌＯ４０５^ＴＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｚａ， ＫＳ）又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯ^ＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）である。細胞は、約２〜５×１０^５個の細胞〜１〜２×１０^６個の細胞の接種密度から増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、０．１〜１０，より典型的にはほぼ３の感染の多重度（ＭＣＩ）で添加される。組換えウィルス−感染された細胞は典型的には、感染後１２〜７２時間で、組換えＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドを生成し、そして培地中にそれを、種々の効率を伴って分泌する。
【０１００】
培養物は通常、感染後４８時間で収穫される。遠心分離が、培地（上清液）から細胞を分離するために使用される。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドを含む上清液は、微小孔、通常０．４５μｍの孔サイズのフィルターを通して濾過される。使用される方法は一般的に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ． Ｄ．， 前記； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． など．， 前記；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， 前記）。上清液からのＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成され得る。
【０１０１】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） を包含する。外因性ＤＮＡによりＳ． セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０１０２】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【０１０３】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０１０４】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【０１０５】
組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４５０， ＷＯ９７／１７４５１、ＷＯ９８／０２５３６及びＷＯ９８／０２５６５に開示される。Ｐ．メタノリカの形質転換に使用するためのＤＮＡ分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、Ｐ．メタノリカ遺伝子、例えばＰ．メタノリカ アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１又はＡＵＧ２）のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、及びカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものを包含する。
【０１０６】
宿主染色体中へのＤＮＡの組み込みを促進するためには、宿主ＤＮＡ配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ． ４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１及びＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０１０７】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、Ｐ．メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ，好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電場の強さ、及び１〜４０ｍ秒、最も好ましくは約２０ｍ秒の時定数（ｒ）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０１０８】
原核宿主細胞、例えば細菌Ｅ．コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化される外来性ＤＮＡ配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記を参照のこと）。細菌、例えばＥ．コリにおいてＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。
【０１０９】
次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１１０】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
【０１１１】
Ｐ．メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地において、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーションを提供される。Ｐ．メタノリカのための好ましい培養培地は、ＹＥＰＤ（２％Ｄ−グルコース、２％のＢａｃｔｏ^ＴＭペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）， １％のＢａｃｔｏ^ＴＭ 酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）， ０．００４％のアデニン及び０．００６％のＬ−ロイシン）である。
【０１１２】
本発明のもう１つの態様は、本発明のＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのエピトープ−担持部分を含んで成るペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピオ−プは、本発明の免疫原性又は抗原性エピトープである。抗体が結合できるタンパク質の領域は、“抗原性エピトープ”として定義される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ， Ｈ． Ｍ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３９９８−４００２ （１９８４） を参照のこと。
【０１１３】
抗原性エピトープ（すなわち、抗体が結合できるタンパク質分子の領域を含む）を担持するペプチド又はポリペプチドの選択に関しては、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、その部分的に模倣されるタンパク質と反応する抗血清を通常誘発できることは、当業界において良く知られている。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ， Ｊ．Ｇ． など． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９： ６６０−６６６ （１９８３） を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発できるペプチドは、タンパク質の主要配列においてときおり表され、一組の単純な化学規則により特徴づけられ得、そして損なわれていないタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫エピトープ）にも、又はアミノ又はカルボキシル末端にも制限されない。極端に疎水性であるペプチド及び６又はそれよりも少ない残基のそれらのペプチドは一般的に、模倣されたタンパク質に結合する抗体の誘発において無効果であり；より長い可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含むそれらのペプチドが通常効果的である。
【０１１４】
本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的ニ結合する、抗体、例えばモノクローナル抗体を生ぜしめるためにも使用され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸内に含まれる、少なくとも９及び好ましくは１５〜約３０個のアミノ酸を含む。しかしながら、本発明のアミノ酸配列の大きな部分、すなわち本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の３０〜５０個のアミノ酸、又はその全体の長さまでのいずれかの長さ及び全体の長さのアミノ酸を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、タンパク質と反応する抗体を誘発するためにも有用である。
【０１１５】
好ましくは、エピトープ−担持のペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒における実質的な溶解性を提供するために選択され（すなわち、前記配列は比較的親水性の残基を含み、そして疎水性残基は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。配列列挙に示されるポリペプチドのすべては、本発明に従って使用される抗原性エピトープを含む。本発明はまた、本明細書に記載されるＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。
【０１１６】
そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る（例えば、Ｇｅｙｓｅｎなど．，前記を参照のこと）。アメリカ特許第４，７０８，７８１号（１９８７）は、所望するタンパク質の免疫原性エピトープを担持するペプチドをいかにして同定するかをさらに記載する。
【０１１７】
タンパク質単離
本発明のポリペプチドを８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、９９．９％以上の純度であり、そして感染性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０１１８】
発現された組換え体Ｚａｌｐｈａ５３ ポリペプチド（又はキメラＺａｌｐｈａ５３ ポリペプチド）は、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましい。
【０１１９】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−Ｓｅｐｈａｒｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０１２０】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８を参照のこと。
【０１２１】
本発明のポリペプチドは、それらの性質の活用により単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される（ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３： １−７， １９８５）。ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。
【０１２２】
他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， （ ｅｄ．）， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ｐｐ． ５２９−３９）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０１２３】
さらに、当業界において記載される方法に従って、ポリペプチド融合又はハイブリッドＺａｌｐｈａ５３タンパク質が、本発明のＺａｌｐｈａ５３の領域又はドメインを用いて構成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， 前記；Ａｌｔｓｃｈｕｌ など．， 前記；Ｐｉｃａｒｄ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ５１１−５， １９９４）。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在せいを変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【０１２４】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべてが、本発明のＺａｌｐｈａ５３と、もう１つのファミリーメンバーからのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。
【０１２５】
そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：分泌シグナル配列、及びこのファミリーにおける有意なドメイン又は領域。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知のファミリーのタンパク質と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【０１２６】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学的合成により調製され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドはモノマー又はマルチマーであり；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペギレート化されても又はペギレート化されなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を包含しても又はしなくても良い。
【０１２７】
ポリペプチドの化学的合成
ポリペプチド、特に本発明のポリペプチドはまた、排他的固相合成、部分固相法、フラグメント縮合、又は従来の溶液方法により合成され得る。ポリペプチドは、好ましくは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９， １９６３により記載のようにして、固相ペプチド合成により調製され得る。
【０１２８】
アッセイ
本発明の分子の活性は、種々のアッセイを用いて測定され得る。精子におけるステロイド形成、精子形成、ＬＨ及びＦＳＨ生成、及び視床下部におけるＧｎＲＨの変化が特に興味あるものである。そのようなアッセイは、当業界において良く知られている。
【０１２９】
本発明のタンパク質は、精子生成を高めるために有用である。Ｚａｌｐｈａ５３は、培養された細胞を用いてインビトロで、又は適切な動物モデルに本発明の分子を投与することによってインビボで測定され得る。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３トランスフェクトされた（又は同時トランスフェクトされた）発現宿主細胞が、アルギン酸塩環境下で包埋され、そして受容体動物中に注入（移植）され得る。アルギネート−ポリ−Ｌ−リシン微小封入、透過性膜封入及び拡散チャンバーは、トランスフェクトされた哺乳類細胞又は一次哺乳類細胞を捕獲するための手段として記載されている。
【０１３０】
それらのタイプの非免疫原性“封入”又は微小環境は、微小環境への栄養物ノトランスファーを可能にしそして又は、捕獲された細胞により分泌され又は開放されるタンパク質及び他の高分子の環境バリアーを通して受容体動物への拡散を可能にする。最も重要なことには、カプセル又は微小環境は、受容体動物の免疫応答から外来性の包埋された細胞をマスクし、そして遮断する。そのような微小環境は、注入される細胞の寿命を、数時間又は数日（裸細胞）から数週間（包埋された細胞）まで拡張することができる。
【０１３１】
アルギン酸塩糸は、包埋された細胞を生成するための単純且つ迅速な手段を提供する。アルギン酸塩糸を生成するために必要とされる材料は、容易に手に入れることができそして比較的安価である。製造されると、そのアルギン酸塩糸は、インビトロで、及びその糸を用いて得られるデータに基づいて、インビボで、比較的強く且つ耐久性がある。そのアルギン酸塩糸は容易に操作でき、そしてその方法論は多くの調製のために評価できる。典型的な方法においては、３％のアルギン酸塩が、無菌水において調製され、そして滅菌濾過される。アルギン酸塩糸の調製の直前、アルギン酸塩溶液が再び濾過される。約５０％の細胞懸濁液（１ｍｌ当たり約５×１０^５個〜約５×１０^７個の細胞を含む）が３％アルギン酸塩溶液と共に混合される。
【０１３２】
１ｍｌのアルギン酸塩／細胞懸濁液が、約 １５分間にわたって、１００ｍＭの滅菌濾過されたＣａｃｌ_２ 溶液中に押し出され、“糸（Ｔｈｒｅａｄ）”が形成される。次に、押し出された糸は、５０ｍＭのＣａｃｌ_２の溶液に移され、そして次に２５ｍＭのＣａｃｌ_２の溶液に移される。次に、糸が、脱イオン水によりすすがれ、その後、ポリ−Ｌ−リシンの０．０１％溶液においてインキュベートすることによって糸を被覆する。最後に、糸は乳酸塩化されたリンガー溶液によりすすがれ、そして注射器（針のない）中に溶液から抜き取られる。次に大きな孔の針がその注射器につけられ、そして糸が最少量の乳酸塩化されたリンガー溶液において受容体中の腹腔内注入される。
【０１３３】
本発明のタンパク質をアッセイするための別のインビボアプローチは、ウィルス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種拡散の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｔ． Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと）。
【０１３４】
アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ ｉ ）アデノウィルスは比較的大きなＤＮＡ挿入体を適応せしめることができ；（ ｉｉ ）高い力価に増殖され得；（ ｉｉｉ ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ ｉｖ ）異なったプロモーターを含む多数の利用できるベクターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【０１３５】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種ＤＮＡのより大きな挿入体（７ｋｂまでの）が適応され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞（ヒト２９３細胞系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。
【０１３６】
損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。アデノウィルス供給システムがＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう（そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
【０１３７】
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使用され得る。アデノウィルス感染された非−２９３細胞を、その細胞が急速に分裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を生成することができる。たとえば、ＢＨＫ細胞は、細胞工場において集密性まで増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルス ベクターに暴露される。
【０１３８】
次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。他方では、アデノウィルス ベクター感染された２９３Ｓ細胞が、有意な量のタンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として又は懸濁培養において増殖せしめられ得る（ Ｇａｒｎｉｅｒ など．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： １４５−５５， １９９４ を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞培養物の上清液から反復して単離され得る。感染された２９３Ｓ細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得られる。
【０１３９】
アゴニスト及びアンタゴニスト：
Ｚａｌｐｈａ５３について観察される組織分布の観点から、アゴニスト（例えば、天然のリガンド／基質／補因子／等）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。Ｚａｌｐｈａ５３アゴニストとして同定される化合物は、免疫系又は精子形成を刺激するために有用である。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３及びアゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の成分として有用であり、そして細胞培養に通常使用される血清を置換するために、単独で、又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。
【０１４０】
アンタゴニスト：
アンタゴニストはまた、リガンド−受容体相互作用の部位を特徴づけるための研究試薬としても有用である。Ｚａｌｐｈａ５３のアンタゴニストはまた、下記により詳細に論じられるように炎症をダウン−レギュレートするためにも使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３活性のインヒビター（Ｚａｌｐｈａ５３アンタゴニスト）は、抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体及び可溶性Ｚａｌｐｈａ５３受容体、並びに他のペプチド及び非ペプチド剤（例えば、リボザイム）を包含する。
【０１４１】
Ｚａｌｐｈａ５３はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するためにも使用され得る。試験化合物は、Ｚａｌｐｈａ５３の活性を阻害する化合物を同定するために、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれらのアッセイの他に、サンプルが、受容体結合又はＺａｌｐｈａ５３−依存性細胞応答の刺激／阻害を測定するよう企画された種々のアッセイにより、Ｚａｌｐｈａ５３活性の阻害について試験され得る。例えばＺａｌｐｈａ５３−応答性細胞系は、Ｚａｌｐｈａ５３−刺激された細胞経路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフェクトされ得る。このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そして一般的に、アッセイできるタンパク質、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子に作用可能に連結されるＺａｌｐｈａ５３−ＤＮＡ応答要素を含むであろう。
【０１４２】
ＤＮＡ応答要素は、サイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、ホルモン応答要素（ＨＲＥ）、インスリン応答要素（ＩＲＥ）（Ｎａｓｒｉｎ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ５２７３−７， １９９０）及び血清応答要素（ＳＲＥ）（Ｓｈａｗ など．， Ｃｅｌｌ ５６： ５６３−７２， １９８９）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。サイクリックＡＭＰ応答要素は、Ｒｏｅｓｔｌｅｒ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３ （１９）： ９０６３−６， １９８８及びＨａｂｅｎｅｒ， Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ４ （８）： １０８７−９４， １９９０に再考される。ホルモン応答要素は、Ｂｅａｔｏ， Ｃｅｌｌ ５６： ３３５−４４ｌ， １９８９に再考される。候補体化合物、溶液、混合物又は抽出物は、レポーター遺伝子発現のＺａｌｐｈａ５３刺激の低下により明らかなように、標的細胞に対するＺａｌｐｈａ５３ の活性を阻害する能力について試験される。
【０１４３】
このタイプのアッセイは、細胞表面受容体に結合するＺａｌｐｈａ５３を直接的にブロックする化合物、及びレポーターリガンド結合に続く細胞経路における工程をブロックする化合物を検出するであろう。他方では、化合物又は他のサンプルが、検出できるラベル（例えば^１２５Ｉ、 ビオチン、ホースラディシュ ペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣ、及び同様のもの）により標識されるＺａｌｐｈａ５３を用いて、受容体へのＺａｌｐｈａ５３結合の直接的なブロッキングについて試験され得る。このタイプのアッセイにおいては、受容体へのラベルされたＺａｌｐｈａ５３の結合を阻害する試験サンプルの能力は、二次アッセイを通して確かめられ得る阻害活性の表示である。結合アッセイ内に使用される受容体は、細胞受容体、又は単離され、固定された受容体であり得る。
【０１４４】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、２種の領域ドメインを含み、そして可変領域を欠いている、免疫グロブリンＨ鎖不変領域、典型的にはＦｃフラグメントとの融合体として発現され得る。そのような融合体を調製するための方法は、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示される。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここでＦｃ部分はお互いジスルフィド結合され、そして２つの非−Ｉｇポリペプチドはお互い密接に接近して配列される。このタイプの融合体は、リガンドを親和性精製するために使用され得る。アッセイへの使用のためには、キメラが、Ｆｃ領域を通して支持体に結合され、そしてＥＬＩＳＡ形式で使用される。
【０１４５】
Ｚａｌｐｈａ５３リガンド−結合ポリペプチドはまた、リガンドの精製のためにも使用され得る。ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、又は使用の条件下で安定する同様の材料のビーズ上に同定される。
【０１４６】
固体支持体にポリペプチドを連結するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形成され、そしてリガンドを含む流体がカラムを通して１又は複数回、通され、リガンドの受容体ポリペプチドへの結合を可能にされる。次に、リガンドは、塩濃度、カオトロピック（グアニジンＨＣｌ）、又はｐＨの変化を用いて溶離され、リガンド−受容体結合が破壊される。
【０１４７】
リガンド−結合受容体（又は抗体、相補体／抗相補体対の１つのメンバー）、又はその結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され得る。そのような受容体、抗体、相補体／抗相補体対のメンバー、又はフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５： ２２９−４０， １９９１ 及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３４： ５５４−６３，１９９３により開示される。
【０１４８】
受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は相補体／抗相補体対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。
【０１４９】
リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスカチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２， １９４９）及び熱量測定アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３： ５４５−４８， １９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： ８２１−２５， １９９１）を包含する。
【０１５０】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドはまた、Ｚａｌｐｈａ５３エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペピチド又はそのフラングメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するために抗原（免疫原）として作用する。適切な抗原は、配列番号２〜１８及び２０−３７によりコードされるＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドである。この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載のようにして、単離され得る。
【０１５１】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など．， （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５； Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； 及びＨｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｇ．Ｒ．， Ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８２ を参照のこと。
【０１５２】
当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。
【０１５３】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばＺａｌｐｈａ５３又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）_２及びＦａｂタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。
【０１５５】
非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（ｃｌｏａｋｉｎｇ）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。
【０１５６】
本明細書において有用な抗体を生成し又は選択するための他の技法は、Ｚａｌｐｈａ５３タンパク質又はペプチドへのリンパ球インビトロ暴露、及びファージ又は類似するベクターにおける抗原表示ライブラリーの選択（例えば、固定された又はラベルされたＺａｌｐｈａ５３タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。可能性あるＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０１５７】
それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。そのようなランダム ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号；Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。
【０１５８】
ランダムペプチド表示ライブラリーは、Ｚａｌｐｈａ５３に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるＺａｌｐｈａ５３配列を用いてスクリーンされ得る。Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合タンパク質”は、細胞を標識するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に接合され得る。
【０１５９】
それらの結合タンパク質はまた、分析方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。結合タンパック質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断アッセイにも使用され得る。それらの結合タンパク質はまた、Ｚａｌｐｈａ５３結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、Ｚａｌｐｈａ５３ “アンタゴニスト”として使用することができる。
【０１６０】
抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合することが決定された。第１に、本明細書に置ける抗体は、それらが１０^６Ｍ^−１又はそれ以上、好ましくは１０^７Ｍ^−１又はそれ以上、より好ましくは１０^８Ｍ^−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０^９Ｍ^−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を有するＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ．， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０−６７２， １９４９）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０１６１】
第２に、抗体は、それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差−反応しない場合、有意に結合することが決定される。抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、Ｚａｌｐｈａ５３を検出するが、しかし既知の関連するポリペプチドでない場合、関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、オルト体、タンパク質ファミリーのメンバー（例えば、ＩＬ−１６）である同じ種からのタンパク質、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド及び非−ヒトＺａｌｐｈａ５３である。
【０１６２】
さらに、抗体は、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３に対して生ぜしめられた抗体は、不溶性マトリックスに付着される関連するポリペプチドに吸着され；Ｚａｌｐｈａ５３に対して特異的な抗体は、適切な緩衝液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。
【０１６３】
そのようなスクリーニングは、既知の密接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など． （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５）。特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知られている。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ （ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９３； Ｇｅｔｚｏｆｆなど．， Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： １−９８， １９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ．Ｗ． （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， １９９６； Ｂｅｎｊａｍｉｎ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： ６７−１０１， １９８４を参照のこと。
【０１６４】
当業者に知られている種々のアッセイが、Ｚａｌｐｈａ５３タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｅｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８ に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体のＺａｌｐｈａ５３ タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０１６５】
Ｚａｌｐｈａ５３に対する抗体は、Ｚａｌｐｈａ５３を発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製によりＺａｌｐｈａ５３を単離するために；Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学のマーカーとして可溶性Ｚａｌｐｈａ５３を検出し又は定量化するために；ＦＡＣＳ を使用する分析方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗−インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロでＺａｌｐｈａ５３介在性活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。
【０１６６】
適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。さらに、Ｚａｌｐｈａ５３又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性されたＺａｌｐｈａ５３又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る。
【０１６７】
生物活性接合体
本明細書に記載される抗体又はポリペプチドはまた、薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチド又は抗体は、対応する抗−相補的分子（例えば、それぞれ受容体又は抗原）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。より特定には、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体、又はその生物活性フラグメント又は一部は、検出可能又は細胞毒性分子に結合され、そして抗−相補的分子を発現する、細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。
【０１６８】
適切な検出可能分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばＩ−１３１、レニウム−１８８又はイットニウム−９０（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ−ト成分により間接的に結合される）を包含する。
【０１６９】
ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は細胞毒性分子は相補的／抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメンバーはポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビオチン／ストレプタビジンが典型的な相補的／抗相補的対である。
【０１７０】
もう１つの態様においては、ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞又は組織を処理するために）のために使用され得る。他方では、ポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型に向けるために適切である。ドメインのみの融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そのようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能／細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。
【０１７１】
もう１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３−サイトカイン融合タンパク質又は抗体−サイトカイン融合タンパク質は、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体が過剰増殖性血液及び骨髄細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、血液及び骨髄癌）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（一般的には、Ｈｏｒｎｉｃｋなど．， Ｂｌｏｏｄ ８９： ４４３７−４４４７， １９９７を参照のこと）。
【０１７２】
記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。適切なＺａｌｐｈａ５３ポリペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＭ）を包含する。
【０１７３】
さらにもう１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３ポチペプチド又は抗−Ｚａｌｐｈａ５３抗体が血管細胞又は組織を標的化する場合、そのようなポリペプチド又は抗体は、再狭窄を低めるために、放射性核種、及び特にβ線発光放射性核種により接合され得る。そのような治療アプローチは、放射性治療を管理する臨床医にほとんど危険性を与えない。例えば、患者のステントを入れられた血管中に、必要とされる放射線用量が供給されるまで、配置されるイリジウム−１９２含浸されたリボンは、血管における低められた組織増殖、及びプラシーボリボンを受けた対照グループよりも大きな管腔を示した。さらに、血管再生及びステント血栓症は、処理グループにおいて有意に低かった。類似する結果が、本明細書に記載されるように、放射性核種を含む生物活性接合体の標的化により予測される。
【０１７４】
本明細書に記載される生物活性ポリペプチド又は抗体接合体は、静脈内、動脈内又は管内供給され得、又は作用の意図された部位に局部的に導入され得る。
【０１７５】
ポリヌクレオチド／ポリペプチドの使用
本発明の分子は、精子形成、ステロイド形成、精巣分化、及び視床下部−下垂体−生腺軸調節制御に関係する受容体、又は免疫系の受容体を同定し、そして単離するために使用され得る。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドがカラム上に固定され、そして膜調製物がそのカラム上に通される（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ など．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９２）。
【０１７６】
タンパク質及びペプチドはまた、放射性ラベルされ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ｖｏｌ． １８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， ｅｄ．， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ７２１−７３７）、又は光親和性ラベルされ（Ｂｒｕｎｎｅｒ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２： ４８３−５１４， １９９３及びＦｅｄａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｎａｃｏｌ． ３３： １１７６−１１８０， １９８４）、そして特定の細胞−表面タンパク質が同定され得る。
本発明の分子は、生殖システム及び免疫学的システムの疾患を試験するために有用であろう。
【０１７７】
遺伝子療法
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｚａｌｐｈａ５３活性を高め、又は阻害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異誘発されたＺａｌｐｈａ５３遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子が哺乳類の細胞中に導入され得る。１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドをコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベクターは、弱毒化された又は欠陥ＤＮＡウィルス、例えばヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１７８】
ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好ましい。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ など．， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２： ３２０−３０， １９９１）、弱毒化されたアデノウィルス ベクター、例えばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄａｔ など． （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０： ６２６−３０， １９９２） により記載されるベクター、及び欠陥アデノ−関連ウィルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： ３０９６−１０１， １９８７； Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３： ３８２２−２８，１９８９）。
【０１７９】
もう１つの態様においては、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レトロウィルスベクターに導入され得る：Ａｎｄｅｒｓｏｎ など．， アメリカ特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ など．， Ｃｅｌｌ ３３： １５３， １９８３； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２： １１２０， １９８８； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第５，１２４，２６３ 号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ など．， ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９５／０７３５８ 号；及びｋｕｏ など．， Ｂｌｏｏｄ ８２： ８４５−５２， １９９３。
【０１８０】
他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−１７， １９８７； 及びＭａｃｋｅｙ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−３１， １９８８）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。
【０１８１】
特定細胞へのリポソームの分子標的化は、１つの領域の利点を表す。特定細胞へのトランスフェクションの方向づけが１つの領域の利点を表すことは明白である。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０１８２】
身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子治療のための裸ＤＮＡベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入され得る（例えば、Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ９６３−７， １９９２； Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４６２１−２４， １９８８）。
【０１８３】
アンチセンス方法は、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子転写を阻害するために、例えばインビボでの細胞増殖を阻害するために使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３−コードのポリヌクレオチドのセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１又は１９に示されるようなポリヌクレオチド）は、Ｚａｌｐｈａ５３−コードのｍＲＮＡに結合し、そしてそのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう企画される。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養物又は対象において、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチド−コードの遺伝子の発現を阻害するために使用される。
【０１８４】
本発明はまた、診断に使用できるであろう試薬を提供する。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子、Ｚａｌｐｈａ５３ ＤＮＡ又はＲＮＡを含んで成るプローブ、又はその副配列は、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子が染色体１０上に依存するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（ＲＦＬＰ）分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記；Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記；Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８： ２５５−６５， １９９５）。
【０１８５】
Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子を発現するよう構築されたトランスジェニックマウス、及び“ノックアウトマウス”（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１０８３， １９９２ ）として言及される、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子機能の完全な不在を示すマウスはまた、当業者により生成され得る（Ｌｏｗｅｌｌなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６： ７４０−４２， １９９３ ）。それらのマウスは、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質をインビボシステムにおいて研究するために使用される。
【０１８６】
染色体位置決定
Ｚａｌｐｈａ５３が、染色体１０に対してマッピングされた。放射腺ハイブリッドマッピングは、哺乳類染色体の高い解像度の連続地図を構成するために開発された体細胞遺伝子技法である（Ｃｏｘなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０； ２４５−５０， １９９０）。遺伝子配列の部分的又は完全な知識は、染色体放射線ハイブリッドマッピングパネルによる使用のために適切なＰＣＲプライマーの企画を可能にする。完全なヒトゲノムをカバーする放射線ハイブリッドマッピングパネル、例えばＳｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ ＲＨパネル及びＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ ＲＨパネルは市販されている（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）。
【０１８７】
それらのパネルは、遺伝子、配列−標識された部位（ＳＴＳ）、及び興味ある領域内の他の非多型現象及び多型現象マーカーの急速な、ＰＣＲに基づく染色体位置決定及び整列を可能にする。これは、興味ある新しく発見された遺伝子と前にマッピングされたマーカーとの間を直接的に比例する物理的距離の確立を包含する。遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばＹＡＣ， ＢＡＣ又はｃＤＮＡクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照。
【０１８８】
配列標識された部位（ＳＴＳ）はまた、染色体位置決定のために独立的に使用される。ＳＴＳは、ヒトゲノムにおいてユニークであるＤＮＡ配列であり、そして特定の染色体又は染色体の領域のための参照点として使用され得る。ＳＴＳは、すべての他のゲノム配列の存在下でこの部位を特異的に検出するためにポリメラーゼ鎖反応に使用される一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより定義される。ＳＴＳは、ＤＮＡ配列に単独で基づかれているので、それらは電子データベース、例えばＤａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅｓ （ｄｂＳＴＳ）、ＧｅｎＢａｎｋ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）内に完全に記載され得、そしてそれらの短いゲノムランドマークＳＴＳ配列内に含まれるマッピングデータにより、興味ある遺伝子配列を調べられ得る。
【０１８９】
医薬使用のためには、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口、特に静脈又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤は、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと組合してＺａｌｐｈａ５３タンパク質を含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【０１９０】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９^ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示される。治療用量は、一般的に、０．１〜１００μｇ／ｋｇ患者の体重／日、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与され得、又は慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。タンパク質の投与は、処理されるべき疾病に依存して、皮下、腹腔内又は直腸であり得る。
【０１９１】
組織発現及び使用
Ｚａｌｐｈａ５３は、推定上のシグナルペプチドリーダー配列及びαヘリックス構造を有する新規ポリペプチドを提供する。この遺伝子は、４個のヘリックス束のサイトカインファミリーのメンバーであることを示す二次構造を有する分泌されたポリペプチドをコードすることができる。他方では、このポリペプチドは、他の生物学的機能に関連する他の活性、例えば酵素活性、細胞膜との結合、又はキャリヤータンパク質としての機能を有することができる。
【０１９２】
Ｚａｌｐｈａ５３ の使用
Ｚａｌｐｈａ５３は、免疫無防備状態にされた哺乳類、好ましくはヒト、例えば化学療法を受けたことがある癌患者、ＡＩＤＳ患者及び年配の人に投与され得る。これは、彼らの免疫系を刺激するであろう。Ｚａｌｐｈａ５３はまた、ワクチンの投与の前、投与と共に又は投与の後、投与されるべきワクチンアジュバントとして使用され得る。Ｚａｌｐｈａ５３はまた、腫瘍を攻撃する免疫系を刺激するためにも投与され得る。
【０１９３】
Ｚａｌｐｈａ５３ のアンタゴニストの使用
Ｚａｌｐｈａ５３に対するアンタゴニスト、例えば抗体、可溶性受容体又は小分子アンタゴニストが、炎症応答を緩和するために、哺乳類、好ましくはヒトに投与され得る。Ｚａｌｐｈａ５３に対するアンタゴニスト、例えば抗体は、炎症関連の疾病、例えば動脈硬化性心疾患（Ｐａｕｌｓｓｏｎ， Ｇ． など．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．， ２０： １０−１７ （２０００））、炎症性腸疾患、クローン病、リウマチ様関節炎及び膵炎を有する患者を処理するために使用され得る。
【０１９４】
Ｚａｌｐｈａ５３ ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体の教育学的キットの利用性
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、さらに、遺伝学及び分子生物学、タンパク質化学、及び抗体生成及び分析に関連する実験用実習キットにおいて教育用用具として有用であろう。その独得のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、Ｚａｌｐｈａ５３の分子は、試験のための標準として、又は“未知”として使用され得る。
【０１９５】
例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリヌクレオチドは、Ｚａｌｐｈａ５３が発現されるべき遺伝子である、融合構造体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構造体をいかにして調製するかを学生に教授するために；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を決定するために；組成におけるＺａｌｐｈａ５３ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ及びＤＮＡ位置を決定するために（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；そして核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドを同定するために、補助体として使用され得る。
【０１９６】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドは、抗体の調製；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定；発現された合計のタンパク質に対する割合としての発現されたＺａｌｐｈａ５３ポリペプチドの重量の決定；ペプチド分解部位の同定；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリング；アミノ酸配列分析；及び生来の及び標識されたタンパク質の生物学的活性（すなわち、受容体結合、シグナルトランスダクション、増殖及び分化）のインビトロ及びインビボでのモニターリングのための補助体として使用され得る。
【０１９７】
Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、質量分析学、コンホメーション、特にジスルフィド結合の位置を決定するために、円ニ色性を、原子の立体構造を詳細に決定するために、Ｘ−線結晶学を、溶液におけるタンパク質の構造を表すために、核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、Ｚａｌｐｈａ５３ポリペプチドを含むキットが、学生の分析熟練を開発するために与えられ得る。アミノ酸配列は教授によって知られており、すなわちタンパク質は学生の熟練を決定し、又は熟練を進行せしめるための試験として学生に与えられるので、教授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか否かを知るであろう。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、Ｚａｌｐｈａ５３の教育的利用はそれ自体ユニークであろう。
【０１９８】
Ｚａｌｐｈａ５３に対して特異的に結合する抗体は、Ｚａｌｐｈａ５３を精製するために親和性カラムクロマトグラフィーをいかにして調製し、抗体をコードするポリペプチドをいかにしてクローニングし、そしていかにして配列決定するか、及び従って、ヒト適合された抗体をいかにして企画するかを学生に教授するための実習として使用され得る。次に、Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、分子生物学の技術における熟練の学生による獲得を可能にするために、試薬会社によりパッケージングされ、そして大学により市販されている。
【０１９９】
個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は、実験実習における学生のためにユニークな挑戦及び学習経験を創造する。Ｚａｌｐｈａ５３遺伝子、ポリペプチド又は抗体を含むそのような教育キットは、本発明の範囲内にあると思われる。
本発明は、次の非制限的例によりさらに例示される。
【０２００】
実施例
例１ Ｚａｌｐｈａ５３ のクローニング
Ｚａｌｐｈａ５３ ｃＤＮＡを、精巣ｃＤＮＡライブラリーにおいて発見した。マラソンｃＤＮＡを、マラソン−Ｒｅａｄｙ^ＴＭ キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて製造し、そしてクラスリンプライマーＺＣ２１１９５ ＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＧ（配列番号３８）及びＺＣ２１１９６ ＣＡＴＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴ（配列番号３９）によりＱＣ試験し、そして次に、クラスリンバンドの強度に基づいて希釈した。パネルサンプルの性質を確かめるために、性質調節（ＱＣ）についての３種の試験を行った：
【０２０１】
（１）ライブラリーのために使用されるＲＮＡ性質を評価するために、内部ｃＤＮＡを、個々のｃＤＮＡライブラリーのためのベクター配列に対して特異的であるベクターオリゴヌクレオチドによるＰＣＲにより平均挿入体サイズについて試験し；
（２）パネルサンプルにおけるｃＤＮＡの濃度の標準化を、５’ベクターオリゴヌクレオチドＺＣ１４，０６３ ＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴ（配列番号４０）及び３’αチューブリン特異的オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ１７，５７４ ＧＧＴＲＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＣ（配列番号４１）、又は３’Ｇ３ＰＤＨ特異的オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ１７，６００ ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号４２）を用いて、十分な長さのαチューブリン又はＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡを増幅するための標準ＰＣＲ方法により達成し；そして
【０２０２】
（３）サンプルを、可能性あるリボソーム又はミトコンドリアＤＮＡ汚染について調べるために配列決定に送った。パネルを、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）陽性対照サンプルを包含する９６−ウェル形で組立てた。個々のウェルは、約０．２−１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。
【０２０３】
ＰＣＲ反応を、オリゴヌクレオチドＺＣ３７１９５ ＣＴＣＣＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＴＣ（配列番号４３）及びＺＣ３７１９４ ＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＣ（配列番号４４）、ＴａＫａＲａＥｘＴａｇ^ＴＭ （ＴＡＫＡＲＡ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｊａｐａｎ） 及びＲｅｄｉｌｏａｄ色素（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて構成した。増幅を次の通りに行った：９４℃で２分（１サイクル）、９４℃で３０秒、５７．０℃で３０秒及び７２℃で３０秒（３５サイクル）、続いて、７２℃で５分（１サイクル）。約１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準アガロースゲル電気泳動にゆだねた。約２７２ｂｐの正しく推定されるＤＮＡフラグメントが、４種の精巣サンプルにおいて観察された。
【０２０４】
精巣ｃＤＮＡ及び精巣１ＫライブラリープールについてのＤＮＡフラグメントを、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ） を用いて、その製造業者の説明書に従って、切除し、そして精製した。精巣１Ｋライブラリープールについてのフラグメントを、それが実際、Ｚａｌｐｈａ５３であるが、しかし３６ｂｐの挿入を有したことを示すために配列決定により確かめた。
【０２０５】
前述から、本発明の特徴の態様が例示目的のために記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発明は、付随する請求の範囲を除いて限定されない。[0001]
Background of the Invention:
Inflammation is usually a localized response to trauma or microbial invasion that destroys, dilutes, or isolates harmful agents and damaged tissue. It is characterized by the conventional signs of pain, fever, redness, swelling and loss of function in the acute form. Microbiologically, it is a complex series of phenomena, such as dilation of arterioles, capillaries and venules, and increased permeability and blood flow, exudation of fluids, such as plasma proteins, and leukocytes into areas of inflammation. Including movement.
[0002]
Diseases characterized by inflammation are a significant cause of morbidity and mortality in humans. Usually, inflammation occurs as a protective response to invasion of the host by exogenous, especially microbial, substances. Responses to mechanical trauma, toxins and neoplasia can also result in an inflammatory response. Leukocyte accumulation and subsequent activation is a central phenomenon in the pathogenesis of most forms of inflammation. Loss of inflammation puts the host at risk. Hyperinflammation caused by abnormal recognition of the host tissue as an exogenous substance or prolonged inflammatory processes may include diabetes, arteriosclerosis, cataract, reperfusion injury and cancer, post-infection syndromes such as infectious meningitis, rheumatism, It can lead to fever and various inflammatory diseases such as rheumatic diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.
[0003]
The afferentness of the inflammatory response in these various disease processes makes its regulation a major factor in the prophylactic control or cure of human disease. Thus, there is a need to discover cytokines that contribute to inflammation and inflammation-related diseases, so that antagonists, eg, antibodies, can be administered to down regulate cytokines to improve inflammation.
[0004]
Description of the invention:
Introduction
The present invention addresses this need by providing novel polypeptides and related compositions and methods, and antagonists thereof. In one aspect, the invention provides an isolated polynucleotide encoding a mammalian cytokine designated Zalpha53. The data indicate that cytokines are involved in the inflammatory response. Thus, antagonists of Zalpha53 can be used to reduce inflammation, especially coronary heart disease, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, Crohn's disease and inflammatory bowel disease.
[0005]
Two variants have been discovered. The first variant is SEQ ID NO: 1 and 2. The polypeptide has a signal sequence extending from amino acid residue 1 to amino acid residue 25. The mature polypeptide is SEQ ID NO: 3. Zalpha53 polypeptides have four alpha helices, A, B, C and D. Helix A extends from amino acid residue 28 to amino acid residue 43 and is also represented by SEQ ID NO: 4. Helix B extends from amino acid residue 74 to amino acid residue 88, and is also represented by SEQ ID NO: 5. Helix C of SEQ ID NO: 2 extends from amino acid residue 91 to amino acid residue 106 and is also represented by SEQ ID NO: 6. Helix D extends from amino acid residue 147 to amino acid residue 162 and is represented by SEQ ID NO: 7.
[0006]
The second variants are SEQ ID NOs: 10 and 20. The polypeptide of SEQ ID NO: 20 has a signal sequence extending from amino acid residue 1 to amino acid residue 25. The mature polypeptide is SEQ ID NO: 21. Polypeptides also have four alpha helices, A, B, C, and D. Helix A extends from amino acid residue 28 to amino acid residue 43 of SEQ ID NO: 20 and is also represented by SEQ ID NO: 28. Helix B extends from amino acid residue 61 to amino acid residue 76 of SEQ ID NO: 20, and is also represented by SEQ ID NO: 29. Helix C extends from amino acid residue 79 to amino acid residue 95 of SEQ ID NO: 20, and is also represented by SEQ ID NO: 30. Helix D extends from amino acid residue 135 of SEQ ID NO: 20 to amino acid residue 150B, and is also represented by SEQ ID NO: 31.
[0007]
In a second aspect of the present invention, there is provided an expression vector comprising (a) a transcription promoter; (b) a DNA segment encoding a Zalpha53 polypeptide; and (c) a transcription terminator (wherein the promoter, DNA segment and terminator are used). Are operably linked).
In a third aspect of the present invention there is provided a cultured prokaryotic or eukaryotic cell expressing a protein polypeptide encoded by said DNA segment, wherein said expression vector is integrated as disclosed above. .
[0008]
In a further aspect of the invention, there is provided a chimeric polypeptide consisting essentially of a first portion and a second portion linked by a peptide bond. The first portion of the chimeric polypeptide comprises: (a) a Zalpha53 polypeptide; (b) an allelic variant of Zalpha53; and (c) a protein potipeptide that is at least 90% identical to (a) or (b). Consists essentially of The second portion of the chimeric polypeptide consists essentially of another polypeptide, for example, an affinity tag. In one aspect, the affinity label is an immunoglobulin Fc polypeptide. The invention also provides an expression vector encoding the chimeric polypeptide, and a host cell transfected to produce the chimeric polypeptide.
[0009]
In a further aspect of the invention there is provided an antibody that specifically binds to a Zalpha53 polypeptide as disclosed above, and also an anti-idiotype antibody that neutralizes an antibody to a Zalpha53 polypeptide.
[0010]
A further aspect of the invention relates to a peptide or polypeptide having the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of a Zalpha53 polypeptide having the above amino acid sequence. Peptides or polypeptides having the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of a Zalpha53 polypeptide of the invention are those peptides or polypeptides having at least 9, preferably at least 15 and more preferably at least 30-50 amino acids. Epitope-bearing polypeptides of any length up to and including the entire amino acid sequence of the polypeptides of the invention described above are also encompassed by the invention. Examples of such epitope-bearing regions are SEQ ID NOs: 2-18 and 20-37. Also provided are another polypeptide or any of those polypeptides fused to a carrier molecule.
[0011]
The teachings of all references cited herein are fully incorporated herein by reference.
Before describing the present invention in detail, the following terms may be helpful in understanding the present invention:
[0012]
An “affinity label” is a polypeptide that can be bound to a second polypeptide to provide for purification or detection of the second polypeptide, or to provide a site for binding of the second polypeptide to a substrate. Used herein to indicate a segment. Primarily, antibodies or any peptide or protein for which other specific binding agents are available can be used as an affinity label.
[0013]
Affinity labels are of the poly-histidine type, i.e. protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), glutathione S transferase (Smits and John Jones). 67; 31, 1988), Glu-Glu affinity label (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985), substance P, namely Flag^TM Peptides (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-1210, 1988), streptavidin binding peptides, or other antigenic epitopes or binding domains. Generally, Ford et al. , Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Affinity labels for DNA codes can be obtained from commercial suppliers (eg, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Haven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA).
[0014]
The term "allelic variant" is used herein to indicate any of a plurality of alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. Allelic variation naturally occurs through mutation, and can result in phenotypic polymorphisms within a population. Gene mutations can be silent (no change in the encoded polypeptide) or may encode polypeptides having altered amino acid sequence. The term allelic variant is also used herein to indicate the protein encoded by the allelic variant of a gene.
[0015]
The terms "amino-terminal" and "carboxyl-terminal" are used herein to indicate position within a polypeptide. Where the context allows, those terms are used with reference to a particular sequence or portion of a polypeptide to indicate accessibility or relative position. For example, certain sequences located at the carboxyl terminus of a subject sequence in a polypeptide are located adjacent to the carboxyl terminus of the subject sequence, but are not required at the carboxyl terminus of the complete polypeptide.
[0016]
The term "complement / anti-complement pair" refers to non-identical components that, under appropriate conditions, form a stable pair that are non-covalently associated. For example, biotin and avidin (or streptavidin) are the prototype members of a complement / anti-complement pair. Other exemplary complement / anti-complement pairs include receptor / ligand pairs, antibody / antigen (or hapten or epitope) pairs, sense / antisense polynucleotide pairs, and the like. If subsequent dissociation of the complement / anti-complement pair is desired, the complement / anti-complement pair is preferably <10⁹M^-1Has a binding affinity of
[0017]
The term "complement of a polynucleotide molecule" is a polypeptide molecule having a complementary base sequence and an opposite orientation as compared to a reference sequence. For example, the sequence 5'ATGCACGGGG 3 'is complementary to 5'CCCGTGCAT 3'.
The term "contig" refers to a polynucleotide having a series of contiguous identical or complementary sequences to another polynucleotide. A contiguous sequence is said to "overlap" a length of a polynucleotide sequence in the entire polynucleotide, or along a portion thereof. For example, representative contigs for the polynucleotide sequence 5'-ATGGCTTAGCTT-3 'are 5'-TAGCTTgagtct-3' and 3'-gtcgacTACCCGA-5 '.
[0018]
The term "degenerate nucleotide sequence" refers to a sequence of nucleotides (as compared to a control polynucleotide encoding a polypeptide) that includes one or more degenerate codons. Degenerate codons contain different triplets of nucleotides, but encode the same amino acid residue (ie, GAU and GAC triplets each encode Asp).
[0019]
The term "expression vector" is used to indicate a linear or circular DNA molecule comprising a segment encoding a polypeptide of interest operably linked to an additional segment that provides for its transcription. Such additional segments include promoter and terminator sequences and one or more origins of replication, one or more selectable markers, enhancers, polyadenylation signals, and the like. Expression vectors generally can be derived from plasmid or viral DNA, or can include elements of both.
[0020]
The term "isolated" when applied to a polynucleotide removes the polynucleotide from its natural genetic environment and, therefore, has no other extraneous or undesired coding sequences, and 5 shows that it exists in a form suitable for use in a specifically constructed protein production system. Such isolated molecules are those that have been separated from their natural environment and include cDNA and genomic clones. An isolated DNA molecule of the present invention does not contain other genes which are not normally involved, but can contain naturally occurring 5 'and 3' untranslated regions, such as promoters and terminators. Identification of relevant regions will be apparent to those of skill in the art (see, for example, Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).
[0021]
An "isolated" polypeptide or protein is a polypeptide or protein that is found under conditions other than its native environment, such as conditions separate from blood and animal tissue. In a preferred form, the isolated polypeptide is substantially free of other polypeptides, especially other polypeptides of animal origin. It is preferred to supply the polypeptide in a highly purified form, ie, 95% unnatural purity, more preferably 99% or more. As used in this context, the term "isolated" excludes the presence of the same polypeptide in other physical forms, such as a dimer form or other glycosylated or derivatized form do not do.
[0022]
"Operably linked" when applied to a DNA segment is that said segments function cooperatively for their intended purpose, for example, transcription is initiated at the promoter, and through the coding segment. Indicates that it is arranged to proceed to the terminator.
The term "orthology" refers to a polypeptide or protein from one species that is the functional counterpart of a polypeptide or protein from a different species. Sequence differences between ortho-forms are the result of specification.
"Paralogs" are distinct but structurally related proteins produced by an organism. Para bodies appear to occur through gene duplication. For example, α-globin, β-globin and myoglobin are paraboloids of each other.
[0023]
"Polynucleotide" is a single- or double-stranded polymer of deoxyribonucleotide or ribonucleotide bases read from the 5 'end to the 3' end. Polynucleotides include RNA and DNA, and can be isolated from natural sources, synthesized in vitro, or prepared from a combination of natural and synthetic molecules. Polynucleotide sizes are expressed as base pairs (abbreviation "bp"), nucleotides ("nt"), or kilobases ("kb"). Here, the latter two terms describe polynucleotides that are single-stranded or double-stranded.
[0024]
When the term is applied to double-stranded molecules, it will be used to indicate the overall length and will be understood to be equivalent to the term "base pairs". It is understood by those skilled in the art that the two strands of a double-stranded polynucleotide differ slightly in length, and that their ends differ as a result of enzymatic degradation; Cannot be paired. Such unpaired ends do not exceed 20 nt in length.
[0025]
A “polypeptide” is a polymer of amino acid residues linked by peptide bonds, whether produced naturally or synthetically. Polypeptides of up to about 10 amino acid residues are commonly referred to as "polypeptides".
The term "promoter" is used herein to indicate that portion of a gene that contains DNA sequences that provide for the binding of RNA polymerase and initiation of transcription. Promoter sequences are usually, but not necessarily, found in the 5 'non-coding region of a gene.
[0026]
A “protein” is a macromolecule that comprises one or more polypeptide chains. Proteins can also contain non-peptidic components, such as carbohydrate groups. Carbohydrates and other non-peptide substituents will be added by the cell in which the protein is produced, and will vary with the cell type. Proteins are defined herein by their amino acid backbone; substituents, such as carbohydrate groups, are generally not specified, but can nevertheless be present.
[0027]
The term “receptor” refers to a cell-associated protein that binds to a bioactive molecule (ie, “ligand”) and mediates the effect of the ligand on the cell. Membrane-bound receptors are characterized by a multi-peptide structure comprising an extracellular ligand-binding domain and, typically, an intracellular effector domain involved in signal transduction. Binding of the ligand to the receptor results in a conformational change in the receptor that causes an interaction between the effector domain and other molecules in the cell.
[0028]
This interaction induces a change in cellular metabolism. Metabolic phenomena linked to receptor-ligand interactions include gene transcription, phosphorylation, dephosphorylation, increased AMP production, cellular calcium metabolism, membrane lipid metabolism, cell attachment, inositol lipid hydrolysis, and phosphorylation. It involves hydrolysis of lipids. Generally, receptors are membrane-bound, cytosolic or nuclear; monomers (eg, thyroid stimulating hormone receptor, β-adrenergic receptor), or multimers (eg, PDGF receptor, growth hormone receptor, IL-3 receptor, GM-CSF receptor, G-CSF receptor, erythropoietin receptor and IL-6 receptor).
[0029]
The term "secretory signal sequence" refers to a DNA sequence that encodes a polypeptide ("secreted peptide") that directs a larger polypeptide as a component of a larger polypeptide through the secretory pathway of the cell in which it is synthesized. . The larger polypeptide is normally degraded to remove secreted peptides during transit through the secretory tract.
[0030]
The term “splice variant” is used herein to indicate an alternative form of RNA transcribed from a gene. Splice mutations occur naturally in the transcribed RNA molecule, or through the use of alternative splicing sites between normally low, but separately transcribed RNA molecules, and some transcribed from the same gene. mRNA can be provided. Splice variants can encode polypeptides having an altered amino acid sequence. The term splice variant is also used herein to indicate the protein encoded by the splice variant of mRNA transcribed from the gene.
[0031]
It will be appreciated that the molecular weight and length of the polymer as determined by inaccurate analytical methods (eg, gel electrophoresis) are approximate. Where such a value is expressed as “about” X or “approximately” X, it will be understood that the stated value of X is exactly ± 10%.
[0032]
Zalpha53 Expression of
Expression of the Zalpha53 gene is found only in testis. This pattern of expression suggests that Zalpha53 plays a general role in growth and exerts key regulatory controls on testicular differentiation, hypothalamus-pituitary-gonad axis, and gonadal steroidogenesis and spermatogenesis I do.
[0033]
The progression of testicular hormone formation is divided into early and late stages, and the latter relies on the activation of functionally determined Leydig cell precursors by luteinizing hormone (LH). However, the factors that control the initial steps in this process remain unknown and are described in Huhtaniemi, Reprod. Fertil. Dev. 7: 1025-1035 (1995) suggest that Zalpha53 can be responsible for the activation of non-steroidogenic, non-LH responsive precursor cells.
[0034]
When Leydig cell differentiation occurs, the production of steroid hormones in the testis depends on the secretion of gonadotropins, LH and follicle-stimulating hormone (FSH) by the pituitary. LH stimulates the production of testosterone by Leydig cells, and spermatogenesis is dependent on both FSH and high testicular testosterone concentrations. LH and FSH secretion is under the control of gonadotropin releasing hormone (GnRH) produced in the hypothalamus. Kaufman, The neuro endocrine regulation of male reproduction. In: Male Infertility. Clinical Investigation, Cause Evaluation and Treatment. , FH Comaire, ed. , Pp 29-54 (Chapman and Hall, London, 1996). Since testicular products have been shown to regulate LH and FSH production, this suggests that Zalpha53 regulates hormone production by the hypothalamus.
[0035]
It is well known that steroidogenesis and spermatogenesis occur in two different cellular compartments of the testis, and Leydig and Sertoli cells are responsible for the former and the latter, respectively. Saez, Endocrin. Rev .. 15: 574-626 (1994). The individual activities of those cell types appear to be regulated by other secreted products. Sertoli cell-derived tumor necrosis factor-a, fibroblast growth factor, interleukin-1, transforming growth factor-B, epidermal growth factor / transforming growth factor-a, activin, inhibin, insulin-like growth factor-1 , Platelet-derived growth factors, endothelin and arginine-vasopressin have all been shown to regulate Leydig cell function. Seez, Endocrin. Rev .. 15: 574-626 (1994). Thus, Zalpha53 can control or regulate the activity of one or more of those genes.
[0036]
In men, aging is associated with a progressive decline in testicular function. These changes are clinically evident with reduced fertility, fertility, and libido, indicating relative testicular defects. Vermeulen, Ann. Med. 25: 531-534 (1993); Puget et al. , Horm. Res. 43: 104-110 (1995). Hormone replacement therapy in elderly men is not currently recommended, but it suggests that new therapies for male menopause are very valuable.
[0037]
Polynucleotide
The present invention also provides polynucleotide molecules, such as DNA and RNA molecules, that encode a Zalpha53 polypeptide disclosed herein. One skilled in the art will readily recognize that, in light of the degeneracy of the genetic code, considerable sequence variation is possible between those polynucleotide molecules.
A polynucleotide, generally a cDNA sequence, of the present invention encodes a polypeptide according to the present invention. The cDNA sequence encoding a polypeptide of the invention is composed of a series of codons, each amino acid residue of the polypeptide is encoded by a codon, and each codon is composed of three nucleotides. Amino acid residues are encoded by their respective codons, as follows.
[0038]
Alanine (Ala) is encoded by GCA, GCC, GCG or GCT;
Cysteine (Cys) is encoded by TGC or TGT;
Aspartic acid (Asp) is encoded by GAC or GAT;
Glutamic acid (Glu) is encoded by GAA or GAG;
Phenylalanine (Phe) is encoded by TTC or TTT;
Glycine (Gly) is encoded by GGA, GGC, GGG or GGT;
Histidine (His) is encoded by CAC or CAT;
Isoleucine (Ile) is encoded by ATA, ATC or ATT;
Lysine (Lys) is encoded by AAA or AAG;
Leucine (Leu) is encoded by TTA, TTG, CTA, CTC, CTG or CTT;
[0039]
Methionine (Met) is encoded by ATG;
Asparagine (Asn) is encoded by AAC or AAT;
Proline (Pro) is encoded by CCA, CCC, CCG or CCT;
Glutamine (Gln) is encoded by CAA or CAG;
Arginine (Arg) is encoded by AGA, AGG, CGA, CGC, CGG or CGT; Serine (Ser) is encoded by AGC, AGT, TCA, TCC, TCG or TCT;
Threonine (Thr) is encoded by ACA, ACC, ACG or ACT;
Valine (Val) is encoded by GTA, GTC, GTG or GTT;
Tryptophan (Trp) is encoded by TGG; and
Tyrosine (Tyr) is encoded by TAC or TAT.
[0040]
According to the present invention, where the polynucleotide is claimed as described herein, what is claimed is the sense strand, the antisense strand, and the sense and antisense strands annealed together by their respective hydrogen bonds. It should be understood that the DNA is double stranded with the antisense strand. A messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of the invention and encoded by a cDNA described herein is also claimed. mRNA encodes a polypeptide using the same codons as those defined herein, except that each thymine nucleotide (T) is replaced by a uracil nucleotide (U).
[0041]
One skilled in the art will also appreciate that different species exhibit "alternative codon usage." Generally, Grantham, et al. , Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, et al. , Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson, et al. , Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean and Fiera, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. et al. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. As used herein, the term "alternative codon usage" or "alternative codon" refers to the possible codons that are most frequently used in certain types of cells and thus encode individual amino acids. Technical term referring to protein translation codons that favor one or a few representatives (see Table 2).
[0042]
For example, the amino acid threonine (Thr) is encoded by ACA, ACC, ACG, or ACT, but in mammalian cells, ACC is the most commonly used codon; in other species, for example, insect cells In yeast, viruses, or bacteria, different Thr codons are preferred. Alternative codons for a particular species can be introduced into a polynucleotide of the invention by various methods known in the art. For example, the introduction of alternative codon sequences into recombinant DNA enhances the production of the protein by rendering it more efficient in a particular cell type or species. Sequences containing selection codons can be tested for expression in various species, and tested for functionality as disclosed herein.
[0043]
In a preferred embodiment of the invention, the isolated polypeptide will hybridize under stringent conditions to a similarly sized region of SEQ ID NO: 1 or 19, or a sequence complementary thereto. . Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. below the defined ionic strength and thermal melting point (Tm) for a particular sequence. Tm is the temperature (under defined ionic strength pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. Typical stringent conditions are those where the salt concentration is up to about 0.03 at pH 7 and the temperature is at least about 60 ° C.
[0044]
As indicated above, the isolated polynucleotides of the present invention include DNA and RNA. Methods for preparing DNA and RNA are well known in the art. Generally, RNA is isolated from tissues or cells that produce large amounts of Zalpha53 RNA. Such tissues and cells have been identified by Northern blot (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980) and are discussed below.
[0045]
Total RNA can be prepared by guanidinium Hcl extraction, followed by isolation by centrifugation on a CsCl gradient (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poly (A)⁺  RNA is prepared from total RNA using the method of Aviv and Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412, 1972). Complementary DNA (cDNA) can be prepared using known methods by poly (A)⁺  Prepared from RNA. On the other hand, genomic DNA can be isolated. Next, a polynucleotide encoding a Zalpha53 polypeptide is identified and isolated, for example, by hybridization or polymerase chain reaction.
[0046]
Full-length clones encoding Zalpha53 polypeptides can be obtained by conventional cloning methods. Complementary DNA (cDNA) clones are preferred, except for some uses (eg, expression in transgenic animals), using genomic clones or modifying cDNA clones to include at least one genomic intron. Is preferred. Methods for preparing cDNA and genomic clones are well-known and within the level of ordinary skill in the art, and the sequences disclosed herein for probing or sensitizing libraries. Or a partial use thereof. The expression library can be probed with antibodies to Zalpha53, receptor fragments, or other specific binding partners.
[0047]
The polynucleotide of the present invention can also be synthesized using a DNA synthesizer. Currently, the method of choice is the phosphoramidite method. When chemically synthesized double-stranded DNA is required for the synthesis of a gene or gene fragment, the individual complementary strands are produced separately. The generation of short genes (60-80 bp) is technically straightforward and can be achieved by synthesis of complementary strands and subsequently their annealing. However, for the production of longer genes (greater than 300 bp), a specific method is desirable because the coupling efficiency of individual cycles during chemical DNA synthesis is rarely 100%. To overcome this problem, synthetic genes (double-stranded) are assembled in a controlled fashion from single-stranded fragments that are 20-100 nucleotides in length.
[0048]
Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, DC 1994); , Annu. Rev .. Biochem. 53: 323-56, 1984 and Climie et al. , Proc. Natl. Acad. Sa. USA 87: 633-7, 1990.
[0049]
The invention further provides counterpart ligands and polynucleotides from other species (ortho-forms). These species include, but are not limited to, mammals, birds, amphibians, reptiles, fish, insects and other vertebrate and invertebrate species. Of particular interest are Zalpha53 polypeptides from other mammalian species, such as mice, pigs, sheep, cows, dogs, cats, horses, and other primate ligands. The orthoform of human Zalpha53 polypeptide can be cloned using the information and compositions provided by the present invention in combination with conventional cloning techniques.
[0050]
For example, cDNA can be cloned using mRNA obtained from a tissue or cell type that expresses Zalpha53 as disclosed herein. Suitable sources of mRNA can be identified by probing Northern blots with probes designed from the sequences disclosed herein. Next, a library is prepared from mRNA of positive tissues or cell lines. The Zalpha53-encoding cDNA can then be isolated by various methods, for example, by probing with fully or partially human cDNA, or with one or more modified probes based on the disclosed sequences.
[0051]
The cDNA can also be prepared using the polymerase chain reaction (PCR) (Mullis, U.S. Pat. No. 4,683,202) using primers designed from the representative human Zalpha53 polynucleotide sequences disclosed herein. Can also be cloned. In a further method, a cDNA library is used to transform or transfect host cells, and expression of the cDNA of interest can be detected by an antibody against Zalpha53 polypeptide. Similar techniques can also be applied to isolate genomic clones.
[0052]
One skilled in the art will recognize that the sequences disclosed in SEQ ID NOs: 1 or 19 represent particular alleles of human Zalpha53 and are expected to result in allelic variation and alternating splicing. Allelic variants of this sequence can be cloned by probing cDNA or genomic libraries from different individuals according to standard methods.
[0053]
Allelic variants of the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1, for example, those that include silent mutations and those in which the mutation results in an amino acid sequence change, are allelic variants of SEQ ID NOs: 2, 2, 20, or 21. As with proteins that are genetic variants, they are within the scope of the present invention. CDNAs generated from another spliced mRNA that retain the properties of the Zalpha53 polypeptide, as well as the polypeptides encoded by such cDNAs and mRNAs, are included within the scope of the invention. Allelic and splice variants of those sequences can be cloned by probing cDNA or genomic libraries from different individuals or tissues according to standard methods known in the art.
[0054]
The present invention also provides polypeptides of SEQ ID NOs: 2, 3, 20, or 21, and isolated Zalpha53 polypeptides that are substantially identical to their ortho forms. The term "substantially identical" refers to 50%, 60%, 70%, 80% and most preferably at least 50%, relative to the sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 20 or 21 or an ortho form thereof. Used herein to indicate polypeptides having 90%, 95% or 99% sequence identity. % Sequence identity is determined by conventional methods. For example, Altschul and the like. Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 and henikoff and Henikoff, Pruc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 89: 10915-10919, 1992.
[0055]
Briefly, two amino acid sequences have a gap initiation penalty of 10, a gap extension penalty of 1, and a Henikoff and Henikoff (as described above in Table 1 (amino acids are indicated by the standard one letter code)). ) Using the "blosum 62" rating matrix to optimize its matching score. Next, the% identity is calculated as follows:
[0056]
(Equation 1)

[0057]
[Table 1]

[0058]
One of skill in the art understands that there are many established algorithms for aligning two amino acid sequences. The Pearson and Lipman “FASTA” similarity search algorithm is an appropriate protein alignment method to test the level of identity shared by the amino acid sequences disclosed herein and the amino acid sequence of the putative variant. is there. The FASTA algorithm is described in Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. ScL USA 85: 2444 (1988), and Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990).
[0059]
Briefly, FASTA first determines the highest density of identity (ktup variable is 1) without considering the sequence in question (eg, SEQ ID NO: 2, 3, 20, or 21) and conservative amino acid substitutions, insertions or deletions Sequences are characterized by identifying regions shared by test sequences that have either (if any) or pair identity (when ktup = 2). Next, the ten regions with the highest density of identities were reevaluated by comparing the similarity of all paired amino acids using an amino acid substitution matrix, and the ends of the regions were identified as the highest It is "trimmed" to include only those residues that contribute to the score.
[0060]
If there are some regions that have a higher score than the "cutoff" value (calculated by a pre-determined formula based on the length of the array and the ktup value), the trimmed initial region will be the region Are tested to determine if they can be combined to form an approximate alignment with the gap. Finally, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Celllers, SIAJ), where the highest scoring regions of the two amino acid sequences allow for amino acid insertions and deletions. Appl. Math. 26: 787, 1974).
[0061]
Exemplary parameters for FASTA analysis are: ktup = 1, gap opening penalty = 10, gap extension penalty = 1 and substitution matrix = BLOSUM62. Those parameters can be introduced into the FASTA program by adjusting the rating matrix, as described in Appendix 2 of Pearson, 1990 (supra).
[0062]
FASTA can also be used to determine the sequence identity of nucleic acid molecules, using ratios as disclosed above. For nucleotide sequence comparisons, the ktup value may be 1-6, preferably 4-6, with other parameters set as errors.
[0063]
The invention includes a nucleic acid molecule that encodes a polypeptide having one or more conservative amino acid changes compared to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 3, 20, or 21. The BLOSUM62 table is an amino acid substitution matrix derived from about 2,000 local multiple alignments of protein sequence segments, representing highly conserved regions of over 500 groups of related proteins [Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)].
[0064]
Thus, the BLOSUM62 substitution frequency can be used to define conservative amino acid substitutions that can be introduced into the amino acid sequences of the invention. As used herein, the term "conservative amino acid substitution" refers to a substitution represented by a BLOSUM62 value of greater than -1. For example, an amino acid substitution is conservative if the substitution is characterized by a BLOSUM62 value of 0, 1, 2, or 3. Preferred conservative amino acid substitutions are characterized by a BLOSUM62 value of at least 1 (eg, 1, 2 or 3), but more preferably conservative substitutions are characterized by a BLOSUM62 value of at least 2 (eg, 2 or 3). Can be
Sequence identity of polynucleotide molecules is determined in a similar manner, using ratios as disclosed above.
[0065]
Variant Zalpha53 polypeptides and substantially homologous Zalpha53 polypeptides are characterized as having one or more amino acid substitutions, deletions or additions. These changes are preferably conservative amino acid substitutions (see Table 2) and other substitutions that do not substantially affect the folding or activity of the protein and polypeptide; small deletions, typically 1 Deletion of up to about 30 amino acids; and small amino- or carboxyl-terminal extensions, such as amino-terminal methionine residues, small linker peptides of up to about 20-25 residues, or affinity labeling. It is an extension.
[0066]
Accordingly, the present invention provides for sequences that are at least 90%, preferably at least 95%, and more preferably 99% or more, identical to their corresponding regions of SEQ ID NOs: 2, 3, 20, or 21. Polypeptides of 20 to 30 amino acid residues comprising. Polypeptides comprising an affinity tag further comprise a proteolytic site between the Zalpha53 polypeptide and the affinity tag. Preferred such sites include a thrombin degradation site and a factor Xa degradation site.
[0067]
[Table 2]

[0068]
The present invention further provides various other polypeptide fusions (and related multimeric proteins comprising one or more polypeptide fusions). For example, a Zalpha53 polypeptide can be prepared as a fusion to a dimeric protein as disclosed in US Pat. Nos. 5,155,027 and 5,567,584. Preferred dimer proteins therefor include an immunoglobulin constant region domain. Immunoglobulin-Zalpha53 polypeptide fusions can be expressed in genetically engineered cells to produce various multimeric Zalpha53 analogs. Auxiliary domains can be fused to Zalpha53 polypeptides to target them to particular cells, tissues or macromolecules (eg, collagen).
[0069]
For example, a Zalpha53 polypeptide or protein can be targeted to a predetermined cell type by fusing the Zalpha53 polypeptide to a ligand that specifically binds to a receptor on the surface of a target cell. In this case, the polypeptides and proteins can be targeted for therapeutic or diagnostic purposes. A Zalpha53 polypeptide can be fused to multiple components, such as an affinity tag for purification and a targeting domain. Polypeptide fusions can also include one or more cleavage sites, particularly between domains. Tuan et al. , Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.
[0070]
The proteins of the invention also comprise non-naturally occurring amino acid residues. Non-naturally occurring amino acids include trans-3-methylproline, 2,4-metaproline, cis-4-hydroxyproline, trans-4-hydroxyproline, N-methylglycine, allo-threonine, methylthreonine, hydroxyethylcysteine, Hydroxyethylhomocysteine, nitroglutamine, homoglutamine, pipecolic acid, thiazolidinecarboxylic acid, dehydroproline, 3- and 4-methylproline, 3,3-dimethylproline, tert-leucine, norvaline, 2-azaphenylalanine, 3-aza Includes phenylalanine, 4-azaphenylalanine, and 4-fluorophenylalanine. Several methods are known in the art for introducing non-naturally occurring amino acid residues into proteins. For example, an in vitro system in which nonsense mutations are suppressed using a chemically aminoacylated suppressor tRNA can be used.
[0071]
Methods for synthesizing amino acids and aminoacylating tRNA are known to those skilled in the art. Transcription and translation of plasmids containing nonsense mutations is described in It is performed in a cell-free system comprising E. coli S30 extract and commercially available enzymes and other reagents. The protein is purified by chromatography. For example, Robertson and the like. , J. et al. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al. , Meth. Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al. , Science 259: 806-09, 1993; and Chung et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 90: 10145-49, 1993.
[0072]
In the second method, translation is performed in Xenopus oocytes by microinjection of mutagenized mRNA and chemically aminoamylated suppressor-tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 1991-98, 1996). In the third method, E.I. The E. coli cell is isolated in the absence of the natural amino acid to be replaced (eg, phenylalanine) and the desired non-naturally occurring amino acid (eg, 2-azaphenylalanine, 3-azaphenylalanine, 4-azaphenylalanine or 4-azaphenylalanine). (Fluorophenylalanine).
[0073]
Non-naturally occurring amino acids are introduced into proteins in place of their natural counterparts. Koide et al. , Biochem. 33: 7470-46, 1994. Naturally occurring amino acid residues can be converted to non-naturally occurring species by in vitro chemical modification. Chemical modifications can be combined with site-directed mutagenesis to further extend the scope of the substitution (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).
[0074]
A limited number of non-conservative amino acids, amino acids not encoded by the genetic code, non-naturally occurring amino acids, and unnatural amino acids can be replaced by a Zalpha 53 amino acid.
[0075]
Essential amino acids in the polypeptides of the present invention can be identified by methods known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-11085, 1989). Bass et al., Proc.Natl.Scad.Sci.USA 88: 4498-502, 1991). In the latter technique, a single alanine mutation is introduced at every residue in the molecule, and the resulting mutant molecule is used to identify amino acid residues that are critical for the activity of the molecule. , Tested for biological activity as disclosed below.
[0076]
Also, Hilton et al. , J. et al. Biol. Chem. 271: 4699-5708, 1996. The site of ligand-receptor interaction can also be determined by techniques such as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction or photoaffinity labeling for mutations of putative contact site amino acids. For example, de Vos. , Science 255: 306-312, 1992; Smith et al. , J. et al. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al. , FEBS Lett. 309: 59-64, 1992.
[0077]
Multiple amino acid substitutions can be made by known methods of mutagenesis and screening, such as Reidhaar-Olson and Sauer (science 241: 53-57, 1988) or Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). This is done and tested using the method disclosed by Briefly, the authors found that co-randomizing multiple positions in a polypeptide, screening for functional polypeptides, and then suddenly determining the range of possible substitutions at individual positions. Disclosed are methods for sequencing a mutagenized polypeptide. Other methods that can be used include phage display (eg, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., US Pat. No. 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204. ), And region-directed mutagenesis (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
[0078]
Variants of the disclosed Zalpha53 DNA and polypeptide sequences are described in Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51, 1994 and WIPO publication WI97 / 20078, which can be produced through DNA shuffling. Briefly, mutant DNA is produced by random fragmentation of the parent DNA, resulting in randomly introduced point mutations, followed by in vitro homologous recombination by assembly using PCR. This technique can be improved with families of parent DNA, eg, allelic variants or DNA from different species, to introduce additional variability during the process. Selection or screening of the desired activity, followed by further interaction of mutagenesis and assay, provides rapid "evolution" of the sequence by selecting for the desired mutation while simultaneously selecting for deleterious changes. I do.
[0079]
Mutagenesis methods as disclosed herein can be combined with high-throughput automated screening methods to detect the activity of the cloned mutagenized polypeptide in a host cell. Mutagenized DNA molecules encoding the active polypeptide can be recovered from the host cells and immediately sequenced using modern equipment. These methods allow for the rapid determination of the importance of individual amino acid residues in a polypeptide of interest and can be applied to polypeptides of unknown structure.
[0080]
Using the methods discussed herein, one of skill in the art will identify and / or prepare various polypeptide fragments of SEQ ID NO: 2, 3, 20, or 21 that retain the properties of the wild-type Zalpha53 protein. be able to.
For any Zalpha53 polypeptide, including variants and fusion proteins, one of skill in the art can use the information provided in Tables 1 and 2 above to readily prepare a sufficient degenerate polynucleotide sequence encoding the variant. Can be generated.
[0081]
Protein production
Zalpha53 polypeptides of the present invention, eg, full-length polypeptides, biologically active fragments and fusion polypeptides, can be produced in genetically constructed host cells according to conventional techniques. Suitable host cells are those cell types that can be transformed or transfected with exogenous DNA, and grown in culture, and include bacteria, fungal cells, and cultured higher eukaryotic cells. Eukaryotic cells, especially cultured cells of multicellular organisms, are preferred. Techniques for manipulating cloned DNA molecules and introducing exogenous DNA into various host cells are disclosed in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and Ausubel. , Eds. , Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Ins. , NY, 1987.
[0082]
Generally, a DNA sequence encoding a Zalpha53 polypeptide of the present invention is operably linked to other genetic elements required for its expression, such as, in general, transcription promoters and terminators in expression vectors. Is done. A vector will also usually include one or more selectable markers and one or more origins of replication, however, one of skill in the art will appreciate that within certain systems, the selectable marker can be provided on another vector, It will be appreciated that replication of the exogenous DNA may be provided by integration into the host cell genome. Selection of promoters, terminators, selectable markers, vectors and elements is routine within the level of ordinary skill in the art. Many such elements are described in the literature and are available through commercial suppliers.
[0083]
To direct a Zalpha53 polypeptide into the secretory tract of a host cell, a secretory signal sequence (or also known as a signal sequence, leader sequence, prepro sequence or pre sequence) is provided in the expression vector. The secretory signal sequence may be that of Zalpha53, or may be derived from another secreted protein (eg, t-PA) or may be newly synthesized. The secretory signal sequence is operably linked to the Zalpha53 DNA sequence, i.e., the two sequences are joined in the correct reading frame and positioned to direct the newly synthesized polynucleotide into the secretory pathway of the host cell. You. Secretory signal sequences are usually located 5 'to the DNA sequence encoding the polypeptide of interest, although certain secretory signal sequences can be located elsewhere in the DNA sequence of interest (eg, Welch). U.S. Patent No. 5,037,743; Holland et al., U.S. Patent No. 5,143,830).
[0084]
On the other hand, a secretory signal sequence contained in a polypeptide of the present invention is used to direct another polypeptide into the secretory tract. The present invention provides such fusion polypeptides. The secretory signal sequence contained in the fusion polypeptide of the invention is preferably fused amino-terminally to the additional peptide in order to direct the additional peptide in the secretory tract. Such a structure has many uses known in the art. For example, these novel secretory signal sequence fusion constructs can direct the secretion of normally secreted proteins, such as the active components of the receptor. Such fusions can be used in vivo or in vitro to direct the peptide through the secretory tract.
[0085]
A cultured mammalian cell or a suitable host within the present invention. Methods for introducing exogenous DNA into mammalian host cells include calcium phosphate-mediated transfection (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham). , Virology 52; 456, 1973), electroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982); DEAE-dextran mediated transfection (Ausubel et al., Supra), and liposome-mediated transfection. (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, It encompasses 993).
[0086]
Production of recombinant polypeptides in cultured mammalian cells is described, for example, in Levinson et al. No. 4,713,339; Hagen et al. U.S. Pat. No. 4,784,950; Palmiter et al. No. 4,579,821; and Ringold, U.S. Pat. No. 4,656,134. Suitable cultured mammalian cells include COS-1 (ATCC No. CRL 165), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Viro. 36: 59-72, 1977), and Chinese Hamster Ovary (eg, CHO-K1; ATCC No. CCL61) cell lines.
[0087]
Additional suitable cell lines are known in the art, and are available from public depositories, such as the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Generally, strong transcription promoters are preferred, such as promoters from SV-40 or cytomegalovirus. See, for example, U.S. Pat. No. 4,956,288. Other suitable promoters include those from the metallothionein gene (U.S. Pat. Nos. 4,579,821 and 4,601,978), the adenovirus major late promoter.
[0088]
Drug selection is commonly used to select cultured mammalian cells into which exogenous DNA has been inserted. Such cells are commonly referred to as "transfectants." Cells that are cultured in the presence of the selection agent and are capable of transmitting the gene of interest to their progeny are referred to as "suitable transfectants." A preferred selectable marker is a gene encoding resistance to the antibiotic neomycin. The selection is performed in the presence of a neomycin-type drug, such as G-418 or the like. The selection system, a method referred to as "amplification," is also used to increase the level of expression of the gene of interest.
[0089]
Amplification involves culturing the transfectant in the presence of low levels of the selection agent, and then increasing the amount of the selection agent to select for cells that produce high levels of the introduced gene product. Implemented by A preferred amplifiable selectable marker is dihydrofolate reductase, which confers resistance to methotrexate. Other drug resistance genes (eg, hygromycin resistance, multiple drug resistance, puromycin acetyltransferase) can also be used. Other markers that introduce an altered phenotype, such as green fluorescent protein, or cell surface proteins, such as CD4, CD8, class I MHC, placental alkaline phosphatase, can be trans-expressed by means such as FACS sorting or magnetic bead separation techniques. It can be used to classify untransfected and transfected cells.
[0090]
Other higher eukaryotic cells, such as insect cells, plant cells and bird cells, can also be used as hosts. The use of Agrobacterium rhizogenes as a vector for expressing genes in plant cells is described in Sinkar et al. J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Transformation of insect cells and production of foreign polypeptides therein is described by Guarino et al. No. 5,162,222; and WIPO Publication No. WO 94/06463. Insect cells can be infected by a recombinant baculovirus normally derived from Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV).
[0091]
DNA encoding a Zalpha53 polypeptide is inserted into the baculovirus genome in place of the AcNPV polyhedrin gene coding sequence by one of two methods. The first method is a conventional method of homologous DNA recombination between a wild-type AcNPV and a transfer vector containing Zalpha53 having an AcNPV sequence at the end. Appropriate insect cells, eg, SF9 cells, are infected with wild-type AcNPV and transfected with a transfer vector comprising a Zalpha53 polynucleotide operably linked to an AcNPV polyhedrin gene promoter, terminator and flanking sequences.
[0092]
King, L .; A. and Possee, R.A. D. O'Reilly, D., The Baculovirus Explosion System: A Laboratory Guide, London, Chapman &Hall; R. . , Baculovirus Expression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press. And Richardson, C. et al., 1994; D. , Ed. , Baculovirus Expression Protocols. See Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Natural recombination in insect cells will result in a recombinant baculovirus containing Zalpha53 driven by the polyhedrin promoter. Recombinant virus stocks are produced by methods commonly used in the art.
[0093]
A second method for producing a recombinant baculovirus utilizes a transposon-based system described by Luckow (Luckow, VA, et al., J. Virol 67: 4566-79, 1993). This system is commercially available as the Bac-to-Bac (TM) kit (Life Technologies, Rockville, MD). This system is based on E. coli as a large plasmid called "bacmid". To transfer the DNA encoding the Zalpha53 polypeptide into the baculovirus genome maintained in E. coli, a transfer vector containing the Tn7 transposon, pFastBacI (TM) (Life Technologies) is used.
[0094]
PFastBacl^TM The transfer vector uses the AcNPV polyhydrin promoter to drive expression of the gene of interest, in this case, Zalpha53. However, pFastBacl^TMCan be modified to a considerable extent. The polyhydrin promoter is removed and is expressed prematurely in baculovirus infections, and the baculovirus basic protein promoter known to be advantageous for expressing secreted proteins (also Pcor, p6.9, also known as the MP promoter). Hill-Perkins, M.C. S. and Possee, R.A. D. , J. et al. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning, B .; C. Such. , J. et al. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; and Chazenbalk, G. et al. D. , And Raport, B .; , J. et al. Biol Chem. 270: 1543-9, 1995.
[0095]
In such transfer vector constructs, short or long versions of the basic protein promoter may be used. Furthermore, a transfer vector in which the natural Zalpha53 secretory signal sequence is replaced by a secretory signal sequence derived from an insect protein may be constructed. For example, ecdysteroid glucosyltransferase (EGT), bee Melittin (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Or baculovirus gp67 (PharMingem, San Diego, Calif.) Replaces the native Zalpha53 secretion signal sequence with a construct. Can be used.
[0096]
In addition, the transfer vector can include an in-frame fusion with an epitope tag, such as a Glu-Glu epitope tag, at the C- or N-terminus of the expressed Zalpha53 polypeptide (Grussenmeyer, T. et al.). Natl. Acad. Sci. 82: 7952-6, 1985). Using techniques known in the art, transfer vectors containing Zalpha53 can be used to transform E. coli. E. coli are transformed and screened for bacmida containing the intermittent lacZ gene, which is a sign of recombinant baculovirus.
[0097]
Bacmid DNA containing the recombinant baculovirus genome is isolated using conventional techniques and used to transfect Spodoptera frugiperda cells, such as Sf9 cells. A recombinant virus expressing Zalpha53 is produced. Recombinant virus stocks are produced by methods commonly used in the art.
[0098]
The recombinant virus is used to infect host cells, typically cell lines derived from the armyworm larva, Spodoptera frugiperda. Generally, Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Application of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C. C. , 1994. Another suitable cell line is High Five O from Trichoplusia ni.^TMCell line (Invitrogen) (U.S. Pat. No. 5,300,435). Commercially available serum-free media is used to grow and maintain the cells.
[0099]
A suitable medium is SF900II for Sf9 cells.^TM (Life Technologies) or EST 921^TM(Expression Systems); For ni cells, Ex-CellO405^TM(JRH Biosciences, Lenza, KS) or Express FiveO^TM(Life Technologies). Cells are about 2-5 x 10⁵Individual cells ~ 1-2 x 10⁶Individual cells are grown from an inoculation density, at which point the recombinant virus stock is added at a multiplicity of infection (MCI) of 0.1 to 10, and more typically around 3. Recombinant virus-infected cells typically produce recombinant Zalpha53 polypeptide 12-72 hours after infection and secrete it into the medium with varying efficiencies.
[0100]
Cultures are usually harvested 48 hours after infection. Centrifugation is used to separate cells from the medium (supernatant). The supernatant containing the Zalpha53 polypeptide is filtered through a filter having a pore size of usually 0.45 μm. The methods used are generally described in available laboratory manuals (King, LA and Possee, RD, supra; O'Reilly, DR, etc., supra; Richardson). , CD, supra). Subsequent purification of Zalpha53 polypeptide from the supernatant can be achieved using the methods described herein.
[0101]
Fungal cells, such as yeast cells, can also be used within the present invention. In this regard, yeast species of particular interest include Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris and Pichia methanolica. Due to exogenous DNA, Methods for transforming S. cerevisiae cells and producing recombinant polypeptides therefrom are described, for example, in Kawasaki, U.S. Pat. No. 4,599,311; Kawasaki et al. U.S. Pat. No. 4,931,373; Brake, U.S. Pat. No. 4,870,008; Welch et al. No. 5,037,743; and Murray et al. No. 4,845,075. Transformed cells are selected by phenotype determined by the selectable marker, usually drug resistance, or the ability to grow in the absence of a particular nutrient (eg, leucine).
[0102]
A preferred vector system for use in Saccharomyces cerevisiae is that which allows the selection of cells transformed by growth in a glucose-containing medium, Kawasaki et al. (US Pat. No. 4,931,373) is a POT1 vector system. Suitable promoters and terminators for use in yeast include glycolytic enzyme genes (eg, Kawasaki, US Patent No. 4,599,311; Kingsman et al., US Patent No. 4,615,974; and Bitter, See U.S. Patent No. 4,977,092) and those from the alcohol dehydrogenase gene. See also U.S. Patent Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936; and 4,661,454.
[0103]
Other enzymes, such as Hansenula polymorpha (Hansenula polymorpha), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), Kuruiberimisesu lactis (Kluyveromyces lactis), Kuruiberimisesu fragilis (Kluyveromyces fragilis), Ustilago Maijisu (Ustilago maydis), Pichia pastoris Transformation systems for (Pichia pastoris), Pichia methanolica, Pichia guilermondi, and Candida maltosa are known in the art.
[0104]
For example, Gleason. , J. et al. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 and Cregg, U.S. Patent No. 4,882,279. Aspergillus cells are described in Mcknight et al. No. 4,935,349. Methods for transforming Acremonium chrysogenum are described in Sumino. No. 5,162,228. A method for transforming Neurospora is disclosed by Lambowitz, U.S. Patent No. 4,486,533.
[0105]
The use of Pichia methanolica as a host for the production of recombinant proteins is disclosed in WIPO publications WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 and WO 98/02565. P. DNA molecules for use in transforming methanolica will usually be prepared as double-stranded, circular plasmids, which are preferably linearized prior to transformation. P. For polypeptide production in methanolica, the promoter and terminator in the plasmid are The methanolica gene, e.g. It is preferably that of a methanolic alcohol utilization gene (AUG1 or AUG2). Other useful promoters include those of the dihydroxyacetone synthase (DHAS), formate dehydrogenase (FMD), and catalase (CAT) genes.
[0106]
To facilitate integration of the DNA into the host chromosome, it is preferred to have a complete expression segment of the plasmid with the host DNA sequence at both ends. A preferred selectable marker for use in Pichia methanolica encodes phosphoribosyl-5-aminoimidazole carboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21), which allows the growth of ade2 host cells in the absence of adenine. P. It is a methanolica ADE2 gene. For large-scale industrial processes where it is desired to minimize the use of methanol, it is preferable to use host cells in which both methanol utilization genes (AUG1 and AUG2) have been deleted.
[0107]
For the production of secreted proteins, host cells that lack the vacuolar protease genes (PEP4 and PRB1) are preferred. Electroporation was performed by P.I. It is used to facilitate the introduction of a plasmid containing DNA encoding the polypeptide of interest into methanolica cells. Exponentially decay with an electric field strength of 2.5-4.5 kV / cm, preferably about 3.75 kV / cm, and a time constant (r) of 1-40 ms, most preferably about 20 ms. By electroporation using a pulsed electric field. Preferably, the methanolic cells are transformed.
[0108]
Prokaryotic host cells, such as bacteria E. E. coli, Bacillus and other genera strains are also useful host cells in the present invention. Techniques for transforming those hosts and expressing the exogenous DNA sequence cloned therein are well known in the art (eg, Sambrook et al., Supra). Bacteria, such as E. When expressing a Zalpha53 polypeptide in E. coli, the polypeptide can be retained in the cytoplasm, typically as insoluble granules, or can be directed to the periplasmic space by bacterial secretory sequences. In the former case, the cells are lysed and the granules are collected and denatured using, for example, guanidine isothiocyanate or urea.
[0109]
The denatured polypeptide is then regenerated and dimerized by diluting the denatured polypeptide, for example, by dialysis against a solution of urea and a combination of reduced and oxidized glutathione, followed by dialysis against a buffer solution. Can be In the latter case, the polypeptide is soluble and functional from the periplasmic space by disrupting the cells to release the contents of the periplasmic space (eg, by sonication or osmotic shock) and recovering the protein. It can be recovered in form, thereby avoiding the need for denaturation and regeneration.
[0110]
The transformed or transfected host cells are cultured according to conventional methods in a culture medium containing the nutrients and other components required for growth of the selected host cells. A variety of suitable media, such as defined and complex media, are known in the art and generally include a carbon source, a nitrogen source, essential amino acids, vitamins and minerals. The medium can also include components such as growth factors or serum, if needed. The growth medium generally comprises cells containing the exogenously added DNA, supplemented by, for example, a selectable marker carried on an expression vector, or drug selection in essential nutrients co-transfected into host cells or Will choose on nutrition deficiency.
[0111]
P. The methanolica cells are cultured at a temperature of about 25 ° C to 35 ° C in a medium comprising a suitable carbon source, nitrogen source and micronutrients. Liquid cultures are provided with sufficient aeration by conventional means, such as shaking a small flask or sparging a fermenter. P. A preferred culture medium for methanolica is YEPD (2% D-glucose, 2% Bacto^TMPeptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto^TM  Yeast extract (Difco Laboratories), 0.004% adenine and 0.006% L-leucine).
[0112]
Another aspect of the invention provides a peptide or polypeptide comprising an epitope-bearing portion of a Zalpha53 polypeptide of the invention. The epiop of this polypeptide portion is an immunogenic or antigenic epitope of the invention. The region of the protein to which an antibody can bind is defined as an "antigenic epitope." See, for example, Geysen, H .; M. Such. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984).
[0113]
With respect to the selection of peptides or polypeptides that carry an antigenic epitope (ie, including the region of the protein molecule to which the antibody can bind), relatively short synthetic peptides that mimic a portion of the protein sequence are partially mimicked. It is well known in the art that antisera that normally react with different proteins can be induced. Sutcliffe, J.M. G. FIG. Such. Science 219: 660-666 (1983). Peptides capable of inducing protein-reactive sera are sometimes represented in the major sequence of the protein, can be characterized by a set of simple chemical rules, and can also be characterized by the intact immunodominant region of the protein (ie, immune epitope). Or amino or carboxyl termini. Extremely hydrophobic peptides and those peptides of 6 or fewer residues are generally ineffective at inducing antibodies that bind to the mimicked protein; longer soluble peptides, especially proline residues Those peptides containing are usually effective.
[0114]
The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the invention can also be used to raise antibodies, eg, monoclonal antibodies, that specifically bind to the polypeptides of the invention. The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the invention comprise at least 9 and preferably 15 to about 30 amino acids contained within the amino acids of the polypeptide of the invention. However, a large portion of the amino acid sequence of the invention, i.e., 30 to 50 amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide of the invention, or any length up to and including the entire length of amino acids of the polypeptide of the present invention The resulting peptide or polypeptide is also useful for inducing antibodies that react with the protein.
[0115]
Preferably, the amino acid sequence of the epitope-bearing peptide is chosen to provide substantial solubility in aqueous solvents (ie, the sequence comprises relatively hydrophilic residues and the hydrophobic residues And sequences containing proline residues are particularly preferred. All of the polypeptides set forth in the sequence listing include the antigenic epitopes used in accordance with the present invention. The invention also provides a polypeptide fragment or peptide comprising an epitope-bearing portion of a Zalpha53 polypeptide described herein.
[0116]
Such fragments or peptides comprise an "immunogenic epitope, which is part of a protein that elicits an antibody response when the entire protein is used as an immunogen. The immunogenic epitope-bearing peptide comprises (See, eg, Geysen et al., Supra.) U.S. Patent No. 4,708,781 (1987) discloses a peptide bearing an immunogenic epitope of a desired protein. How to identify is further described.
[0117]
Protein isolation
It is preferred that the polypeptides of the present invention be purified to a purity of 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and to contaminating macromolecules, especially other proteins and nucleic acids. Thus, pharmaceutically pure forms that are at least 99.9% pure and free of infectious and pyrogenic agents are particularly preferred. Preferably, the purified polypeptide is substantially free of other polypeptides, especially other polypeptides of animal origin.
[0118]
Expressed recombinant Zalpha53 polypeptide (or chimeric Zalpha53 polypeptide) can be fractionated and / or purified using conventional purification methods and media. Ammonium sulfate precipitation and acid or chaotropic agent extraction are used for sample separation. Typical purification steps include hydroxyapatite, size exclusion, FPLC and reverse phase high performance liquid chromatography. Suitable chromatographic media include derivatized dextran, agarose, cellulose, polyacrylamide, special silica, and the like. PEI, DEAE, QAE and Q derivatives are preferred.
[0119]
Typical chromatographic media are those derivatized with phenyl, butyl or octyl groups, such as phenyl-Sepharose FF (pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), octyl-Sepharose (Pharmac). Or the like; or polyacrylic resins such as Amberchrom CG71 (Toso Haas) and the like. Suitable solid supports include glass beads, silica-based resins, cellulose resins, agarose beads, cross-linked agarose beads, polystyrene beads, cross-linked polyacrylamide resins, and the like, which are insoluble under the conditions in which they are used. Includes The supports can be modified with amino, carboxyl, sulfhydryl, hydroxyl, and / or reactive groups that allow binding of the protein by carbohydrate moieties.
[0120]
Examples of coupling chemistries include carboxyl and amino derivatives for cyanogen bromide activation, N-hydroxysuccinimide activation, epoxide activation, sulfhydryl activation, hydrazide activation and carbodiimide coupling chemistries. These and other solid media are well known in the art and are widely used, and are available from commercial suppliers. Methods for binding a ligand or receptor polypeptide to a support medium are well known in the art. The choice of a particular method is conventional and is determined in part by the nature of the support chosen. See, for example, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.
[0121]
The polypeptides of the present invention can be isolated by exploiting their properties. For example, immobilized metal ion adsorption (IMAC) chromatography can be used to purify histidine-rich proteins and those proteins comprising a polyhistidine tag. Briefly, the gel is first charged with divalent metal ions to form a chelate (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). Histidine-rich proteins are adsorbed to this matrix with different affinities, depending on the metal ion used, and are eluted by competitive elution, lowering the pH, or using strong chelating agents. There will be.
[0122]
Other purification methods include purification of glycosylated proteins by lectin affinity chromatography and ion exchange chromatography (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (edd. .), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). In a further aspect of the invention, a fusion of the polypeptide of interest and an affinity label (eg, a maltose-binding protein, an immunoglobulin domain) can be configured to facilitate purification.
[0123]
In addition, according to methods described in the art, polypeptide fusion or hybrid Zalpha53 proteins are constructed using Zalpha53 regions or domains of the invention (Sambrook et al., Supra; Altschul et al., Supra; Picard, Cur Opin. Biology, 5: 511-5, 1994). These methods allow for the determination of the biological significance of a large domain or region in a polypeptide of interest. Such hybrids alter reaction kinetics, binding, suppress or extend substrate specificity, or alter the tissue and cellular localization of the polypeptide, and are applied to polypeptides of unknown structure. You.
[0124]
Fusion proteins can be prepared by methods known to those of skill in the art by preparing the individual components of the fusion protein and chemically conjugating them. On the other hand, polynucleotides encoding both components of the fusion protein, in correct reading frame alignment, can be produced using known techniques and expressed by the methods described herein. For example, some or all of the domain that confers a biological function can be exchanged between Zalpha53 of the present invention and its functionally equivalent domain from another family member.
[0125]
Such domains include, but are not limited to: secretion signal sequences, and significant domains or regions in this family. Such fusion proteins are expected to have the same or similar biological function profile as the polypeptides of the invention or other known families of proteins, depending on the fusion being constructed. In addition, such fusion proteins can exhibit other properties, as disclosed herein.
[0126]
Zalpha53 polypeptides or fragments thereof can also be prepared by chemical synthesis. A Zalpha53 polypeptide is a monomer or multimer; may be glycosylated or unglycosylated; may be pegylated or unpegylated; and may include an initiating methionine amino acid residue or You don't have to.
[0127]
Chemical synthesis of polypeptides
Polypeptides, particularly those of the present invention, can also be synthesized by exclusive solid phase synthesis, partial solid phase methods, fragment condensation, or conventional solution methods. Polypeptides are preferably those described in Merrifield, J .; Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963, and can be prepared by solid phase peptide synthesis.
[0128]
Assay
The activity of the molecules of the invention can be measured using various assays. Of particular interest are steroidogenesis, spermatogenesis, LH and FSH production in sperm, and changes in GnRH in the hypothalamus. Such assays are well-known in the art.
[0129]
The proteins of the present invention are useful for enhancing sperm production. Zalpha53 can be measured in vitro using cultured cells or in vivo by administering a molecule of the invention to a suitable animal model. For example, Zalpha53 transfected (or co-transfected) expression host cells can be embedded in an alginate environment and injected (implanted) into a recipient animal. Alginate-poly-L-lysine microencapsulation, permeable membrane encapsulation and diffusion chambers have been described as a means for capturing transfected or primary mammalian cells.
[0130]
These types of non-immunogenic "encapsulations" or microenvironments allow nutrient transfer to the microenvironment and / or environmental barriers for proteins and other macromolecules secreted or released by the captured cells. To allow diffusion to the recipient animal. Most importantly, the capsule or microenvironment masks and blocks exogenous embedded cells from the recipient animal's immune response. Such a microenvironment can extend the life span of injected cells from hours or days (naked cells) to weeks (embedded cells).
[0131]
Alginate threads provide a simple and rapid means for producing embedded cells. The materials required to produce alginate threads are readily available and relatively inexpensive. As manufactured, the alginate yarn is relatively strong and durable in vitro and in vivo, based on data obtained with the yarn. The alginate thread is easy to operate and its methodology can be evaluated for many preparations. In a typical method, 3% alginate is prepared in sterile water and sterile filtered. Immediately before the preparation of the alginate thread, the alginate solution is filtered again. About 50% cell suspension (about 5 × 10⁵Individual to about 5 × 10⁷Individual cells are mixed with a 3% alginate solution.
[0132]
1 ml of alginate / cell suspension is dispensed with 100 mM sterile filtered Cacl for approximately 15 minutes.₂ Extruded into solution to form "Thread". Next, the extruded yarn was a 50 mM Cacl₂And then 25 mM Cacl₂Transferred to the solution. Next, the thread is rinsed with deionized water and then coated by incubating in a 0.01% solution of poly-L-lysine. Finally, the thread is rinsed with a lactated Ringer's solution and withdrawn from the solution in a syringe (without a needle). A large bore needle is then attached to the syringe, and the thread is injected intraperitoneally into the recipient in a minimal amount of lactated Ringer's solution.
[0133]
Another in vivo approach to assay the proteins of the invention involves a virus delivery system. Typical viruses for this purpose include adenovirus, herpes virus, vaccinia virus and adeno-associated virus (AAV). Adenovirus, a double-stranded DNA virus, is currently the most studied gene transfer vector for the provision of heterologous spread (TC Becker et al., Meth. Cell Bio. 43: 161-89, 1994; And JT Douglas and DT Curiel, Science & Medicine 4: 44-53, 1997).
[0134]
The adenovirus system offers several advantages: (i) adenovirus can accommodate relatively large DNA inserts; (ii) can be grown to high titers; (iii) a wide range of mammalian cell types And (iv) can be used with a number of available vectors containing different promoters. Also, because adenoviruses are stable in the bloodstream, they can be administered by intravenous injection.
[0135]
By deleting a portion of the adenovirus genome, larger inserts (up to 7 kb) of heterologous DNA can be accommodated. These inserts can be integrated into the viral DNA by direct ligation or by homologous recombination with a co-transfected plasmid. In a typical system, the essential E1 gene is deleted from the viral vector, and the virus will not replicate unless the E1 gene is supplied by a host cell (a human 293 cell line is typical).
[0136]
When given intravenously to intact animals, adenovirus primarily targets the liver. If the adenovirus delivery system has an E1 gene deletion, the virus cannot replicate in the host cell. However, the host tissue (eg, liver) will express and process the heterologous protein (and secrete, if a secretory signal sequence is present). Secreted proteins enter the circulation in the highly vascularized liver, and the effect on infected animals can be determined.
[0137]
Adenovirus systems can also be used for protein production in vitro. By culturing adenovirus-infected non-293 cells under conditions such that the cells do not divide rapidly, the cells can produce proteins for extended periods of time. For example, BHK cells are grown to confluence in a cell factory and then exposed to an adenovirus vector encoding a secreted protein of interest.
[0138]
The cells are then grown under serum-free conditions that allow the infected cells to survive for several weeks without significant cell division. On the other hand, 293S cells infected with adenovirus vector can be grown at relatively high cell densities, either as adherent cells or in suspension culture, to produce significant amounts of protein (Garnier et al., Cytotechnol. 15). : 145-55, 1994). By either protocol, the expressed and secreted heterologous protein can be repeatedly isolated from cell culture supernatant. In the infected 293S cell generation protocol, non-secreted proteins are effectively obtained.
[0139]
Agonists and antagonists:
In view of the tissue distribution observed for Zalpha53, agonists (eg, natural ligands / substrates / cofactors / etc.) And antagonists have enormous potential for in vitro and in vivo applications. Compounds identified as Zalpha53 agonists are useful for stimulating the immune system or spermatogenesis. For example, Zalpha53 and agonist compounds are useful as components of defined cell culture media, and are used alone or in combination with other cytokines and hormones to replace the serum commonly used in cell culture. Can be done.
[0140]
Antagonists:
Antagonists are also useful as research reagents for characterizing sites of ligand-receptor interaction. Antagonists of Zalpha53 can also be used to down-regulate inflammation as discussed in more detail below. Inhibitors of Zalpha53 activity (Zalpha53 antagonists) include anti-Zalpha53 antibodies and soluble Zalpha53 receptors, as well as other peptide and non-peptide agents (eg, ribozymes).
[0141]
Zalpha53 can also be used to identify inhibitors (antagonists) of its activity. Test compounds are added to the assays disclosed herein to identify compounds that inhibit the activity of Zalpha53. In addition to those assays disclosed herein, samples are tested for inhibition of Zalpha53 activity by various assays designed to measure receptor binding or stimulation / inhibition of Zalpha53-dependent cellular responses. obtain. For example, a Zalpha53-responsive cell line can be transfected with a reporter gene construct that responds to a Zalpha53-stimulated cellular pathway. Reporter gene constructs of this type are known in the art and will generally include a Zalpha53-DNA response element operably linked to a gene that encodes an assayable protein, eg, luciferase.
[0142]
DNA response elements include cyclic AMP response elements (CRE), hormone response elements (HRE), insulin response elements (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273-7, 1990) and Serum Response Element (SRE) (Shaw et al., Cell 56: 563-72, 1989), but is not limited thereto. Cyclic AMP response elements are described in Roestler et al. , J. et al. Biol. Chem. 263 (19): 9063-6, 1988 and Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-94, 1990. Hormone response elements are reconsidered in Beato, Cell 56: 335-441, 1989. Candidate compounds, solutions, mixtures or extracts are tested for their ability to inhibit the activity of Zalpha53 on target cells, as evidenced by a reduction in Zalpha53 stimulation of reporter gene expression.
[0143]
This type of assay will detect compounds that directly block Zalpha53 binding to cell surface receptors and compounds that block steps in the cellular pathway following reporter ligand binding. On the other hand, the compound or other sample can be labeled with a detectable label (eg,¹²⁵I, biotin, horseradish peroxidase, FITC, and the like) can be tested for direct blocking of Zalpha53 binding to the receptor using Zalpha53. In this type of assay, the ability of the test sample to inhibit the binding of labeled Zalpha53 to the receptor is an indication of the inhibitory activity that can be ascertained through a secondary assay. The receptor used in the binding assay can be a cellular receptor, or an isolated, immobilized receptor.
[0144]
Zalpha53 polypeptides can be expressed as a fusion with an immunoglobulin heavy chain constant region, typically an Fc fragment, which contains two region domains and lacks the variable regions. Methods for preparing such fusions are disclosed in U.S. Patent Nos. 5,155,027 and 5,567,584. Such fusions are typically secreted as multimeric molecules, where the Fc portions are disulfide bonded to each other and the two non-Ig polypeptides are arranged in close proximity to each other. This type of fusion can be used to affinity purify the ligand. For use in assays, the chimeras are bound to a support through the Fc region and used in an ELISA format.
[0145]
Zalpha53 ligand-binding polypeptides can also be used for purification of ligand. The polypeptide may be present on a solid support, such as beads of agarose, cross-linked agarose, glass, cellulose resin, silica-based resin, polystyrene, cross-linked polyacrylamide, or similar materials that are stable under the conditions of use. Be identified.
[0146]
Methods for linking polypeptides to solid supports are known in the art and include amine chemistry, cyanogen bromide activation, N-hydroxysuccinimide activation, epoxide activation, sulfhydryl activation and hydrazide activation. Is included. The resulting medium is generally formed in the form of a column, and the fluid containing the ligand is passed one or more times through the column, allowing the ligand to bind to the receptor polypeptide. The ligand is then eluted using a change in salt concentration, chaotropic (guanidine HCl), or pH to break ligand-receptor binding.
[0147]
Assay systems using ligand-bound receptors (or antibodies, one member of a complement / anti-complement pair), or binding fragments thereof, and commercially available biosensor devices (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) are advantageous. Can be used. Such a receptor, antibody, member of a complement / anti-complement pair, or fragment is immobilized on the surface of a receptor chip. The use of this device is described in Karlsson, J .; Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 and Cunningham and Wells, J. Am. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993.
[0148]
Receptors, antibodies, members or fragments are covalently attached to dextran fibers that are attached to gold film in flowing cells using amine or sulfhydryl chemistry. A test sample is passed through the cells. If an opposite member of the ligand, epitope or complement / anti-complement pair is present in the sample, it will bind to the immobilized receptor, antibody or member, respectively, and be detected as a change in plasmon resonance on the surface of the gold film. Cause a change in the refractive index of the medium. This system allows for the determination of on- and off-rates, from which the binding affinity is calculated and the stoichiometry of the binding is allowed.
[0149]
Ligand-bound receptor polypeptides can also be used in other assay systems known in the art. Such systems include Scatchard analysis for determination of binding affinity (Scatchard, Ann. NY. Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) and calorimetric assays (Cunningham et al., Science 253: 545-48). Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).
[0150]
Zalpha53 polypeptides can also be used to prepare antibodies that specifically bind to a Zalpha53 epitope, peptide or polypeptide. Zalpha53 polypeptide or its fragment acts as an antigen (immunogen) to inoculate animals and elicit an immune response. A suitable antigen is the Zalpha53 polypeptide encoded by SEQ ID NOs: 2-18 and 20-37. Antibodies generated from this immune response can be isolated as described herein.
[0151]
Methods for preparing and isolating polyclonal and monoclonal antibodies are well-known in the art. For example, Current Protocols in Immunology, Cooligan, and the like. , (Eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc. Sambrook et al., 1995; , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Hurrell, J. et al. G. FIG. R. , Ed. , Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc. , Boca Raton, FL, 1982.
[0152]
As will be apparent to those skilled in the art, polyclonal antibodies can be obtained by inoculating various warm-blooded animals, such as horses, cows, goats, sheep, dogs, chickens, rabbits, mice, and rats, with Zalpha53 polypeptide or a fragment thereof. Can be generated. The immunity of a Zalpha53 polypeptide can be increased by use of an adjuvant, such as alum (aluminum hydroxide) or Freund's complete or incomplete adjuvant.
[0153]
Polypeptides useful for immunization also include fusion polypeptides with immunoglobulin polypeptides or maltose binding proteins, such as Zalpha53 or a portion thereof. The polypeptide immunogen can be a full-length molecule or a portion thereof. Where the polypeptide moiety is "hapten-like", such moiety is conveniently attached to a macromolecular carrier (eg, limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA) or tetanus toxoid) for immunization. Can be linked or joined.
[0154]
As used herein, the term "antibody" refers to polyclonal antibodies, affinity-purified polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and antigen-binding fragments, such as F (ab ')₂And Fab proteolytic fragments. Also encompassed are genetically engineered intact antibodies or fragments, such as chimeric antibodies, Fv fragments, single-chain antibodies and the like, as well as synthetic antigen-binding peptides and polypeptides.
[0155]
Non-human antibodies can be prepared by grafting only non-human CDRs onto the human backbone and constant regions, or by incorporating the entire non-human variable domain (optionally by substituting exposed residues for a human-like surface). By "cloaking" their domains; where the result is a "laminated" antibody). In many cases, humanized antibodies can retain non-human residues within the human variable region backbone domain to enhance correct binding properties. Through the use of humanized antibodies, the biological half-life is increased and the potential for adverse immune responses upon administration to humans is reduced.
[0156]
Other techniques for generating or selecting antibodies useful herein are in vitro exposure of lymphocytes to Zalpha53 protein or peptide, and selection of antigen display libraries on phage or similar vectors (eg, immobilized Or through the action of a labeled Zalpha53 protein or peptide). Genes encoding polypeptides with potential Zalpha53 polypeptide binding domains can be phage (phage display) or bacteria such as E. coli. It is obtained by screening a random peptide library displayed on E. coli. The nucleotide sequence encoding the polypeptide can be obtained through a number of means, such as random mutagenesis and random polynucleotide synthesis.
[0157]
These random peptide display libraries can be used to screen for known targets, which can be proteins or polypeptides, such as ligands or receptors, biological or synthetic macromolecules, or peptides that interact with organic or inorganic substances. Can be used. Techniques for creating and screening such random peptide display libraries are known in the art (Ladner et al., US Patent No. 5,223,409; Ladner et al., US Patent No. 4). Ladner et al., U.S. Pat. No. 5,403,484 and Ladner et al., U.S. Pat. No. 5,571,698), and random peptide display libraries and screening such libraries. Kits are available, for example, from Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) and Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ).
[0158]
Random peptide display libraries can be screened using the Zalpha53 sequences disclosed herein to identify proteins that bind to Zalpha53. Those "binding proteins" that interact with Zalpha53 polypeptides can be used to label cells; to isolate homologous polypeptides by affinity purification; they can be used as drugs, toxins, radionuclides and the like. Directly or indirectly.
[0159]
The binding proteins can also be used in analytical methods, for example, to screen expression libraries and neutralize activity. Bound tampon protein can also be used in diagnostic assays to determine circulating levels of the polypeptide; to detect or quantify soluble polypeptide as a marker of underlying pathology or disease. These binding proteins can also be used as Zalpha53 "antagonists" to block Zalpha53 binding and signal transduction in vitro and in vivo.
[0160]
Antibodies were determined to specifically bind 1) if they exhibited a marginal level of binding activity, and 2) if they did not significantly cross-react with related polypeptide molecules. First, the antibodies described herein are those that⁶M^-1Or more, preferably 10⁷M^-1Or more, more preferably 10⁸M^-1Or more, and most preferably 10⁹M^-1Or specifically binds to a Zalpha53 polypeptide, peptide or epitope having a binding affinity (Ka) of greater than or equal to. The binding affinity of an antibody can be readily determined by one skilled in the art, for example, using Scatchard analysis (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).
[0161]
Second, antibodies are determined to bind significantly if they do not significantly cross-react with related polypeptide molecules. Antibodies detect Zalpha53 using standard Western blot analysis, but do not significantly cross-react with related polypeptide molecules if they are not known related polypeptides (Ausubel et al., Supra). . Examples of known related polypeptides are orthoforms, proteins from the same species that are members of the protein family (eg, IL-16), Zalpha53 polypeptides, and non-human Zalpha53.
[0162]
In addition, antibodies can be "screened" against known related polypeptides to isolate populations that specifically bind to a polypeptide of the invention. For example, antibodies raised against Zalpha53 are adsorbed to the relevant polypeptide attached to an insoluble matrix; antibodies specific for Zalpha53 will flow through the matrix under appropriate buffer conditions. Would.
[0163]
Such screening allows for the isolation of polyclonal and monoclonal antibodies that do not cross-react with known closely related polypeptides (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory). Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (Eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Screening and isolation of specific antibodies is well known in the art. Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al. , Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. et al. W. (Eds.), Academic Press Ltd. , 1996; Benjamin et al. , Ann. Rev .. Immunol. 2: 67-101, 1984.
[0164]
Various assays known to those skilled in the art can be used to detect antibodies that specifically bind to Zalpha53 protein or peptide. A typical assay is described in detail in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speeding Harbor Laboratory Press, 1988. Representative examples of such assays include: co-immunoelectrophoresis, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dot blot or western blot assay, inhibition or competition Assay. And sandwich assays. In addition, antibodies that bind to wild-type versus mutant Zalpha53 protein or peptide can be screened.
[0165]
Antibodies to Zalpha53 may be used to label cells that express Zalpha53; to isolate Zalpha53 by affinity purification; for diagnostic assays to determine circulating levels of Zalpha53 polypeptide; To detect or quantify soluble Zalpha53 as a marker; in an analytical method using FACS, to screen an expression library; to generate anti-indiotype antibodies; and to detect Zalpha53-mediated activity in vitro. It can be used as a neutralizing antibody or antagonis to block.
[0166]
Suitable direct labels or labels include radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent markers, chemiluminescent markers, magnetic particles and the like; indirect labels or labels may be used as intermediates. It features the use of biotin-avidin or other complement / anti-complement pairs. The antibodies and binding proteins herein can also be conjugated directly or indirectly to drugs, toxins, radionuclides, and the like, and the conjugates can be used for in vivo diagnostic or therapeutic applications. obtain. Furthermore, antibodies to Zalpha53 or a fragment thereof can be used in vitro to detect denatured Zalpha53 or a fragment thereof in an assay, such as a Western blot or other assay known in the art.
[0167]
Bioactive conjugate
The antibodies or polypeptides described herein can also be conjugated directly or indirectly to drugs, toxins, radionuclides and the like, and the conjugates can be used for in vivo diagnostic or therapeutic applications. Can be used. For example, a polypeptide or antibody of the invention can be used to identify or treat a tissue or organ that expresses a corresponding anti-complementary molecule (eg, a receptor or antigen, respectively). More specifically, a Zalpha53 polypeptide or anti-Zalpha53 antibody, or biologically active fragment or portion thereof, binds a detectable or cytotoxic molecule and expresses a cell, tissue or organ that expresses an anti-complementary molecule. Can be supplied to a mammal having the disease.
[0168]
Suitable detectable molecules can be bound directly or indirectly to the polypeptide or antibody, and can include radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent markers, chemiluminescent markers, magnetic particles, and the like. Is included. Suitable cytotoxic molecules can be conjugated directly or indirectly to the polypeptide or antibody and can be used for bacterial or phytotoxic (eg, diphtheria toxin, pseudomonas endotoxin, ricin, abrin and the like), and therapeutic Includes radionuclides, such as I-131, rhenium-188 or yttrium-90 (directly attached to the polypeptide or antibody or indirectly through a chelating moiety).
[0169]
The polypeptide or antibody can also be conjugated to a cytotoxic drug, for example, adriamycin. For indirect binding of a detectable or cytotoxic molecule, the detectable or cytotoxic molecule can be bound by a member of a complementary / anti-complementary pair, where the other member is bound to the polypeptide or antibody moiety. . For those purposes, biotin / streptavidin is a typical complementary / anti-complementary pair.
[0170]
In another embodiment, the polypeptide-toxin fusion protein or antibody-toxin fusion protein can be used for targeted cell or tissue inhibition or removal (eg, to treat cancer cells or tissues). . On the other hand, if the polypeptide has multiple functional domains (ie, an activation or ligand binding domain, and a targeting domain), a fusion protein that includes only the targeting domain will have a detectable, cytotoxic, or complementary molecule. Suitable for directing a target molecule to a cell or tissue type of interest. If the domain-only fusion protein comprises a complementary molecule, the anti-complementary molecule can be conjugated to a detectable or cytotoxic molecule. Thus, such domain-complementary molecular fusion proteins represent a general targeting vehicle for general anti-complementary-detectable / cytotoxic molecular conjugates.
[0171]
In another embodiment, the Zalpha53-cytokine fusion protein or antibody-cytokine fusion protein is a target tissue (e.g., blood and bone marrow) when the Zalpha53 polypeptide or anti-Zalpha53 antibody targets hyperproliferative blood and bone marrow cells. (See, generally, Hornick et al., Blood 89: 4437-4447, 1997).
[0172]
The described fusion proteins allow targeting of the cytokine to a desired site of action, thereby providing an increased local concentration of the cytokine. Suitable Zalpha53 polypeptides or anti-Zalpha53 antibodies target unwanted cells or tissues (eg, tumors or leukemias) and the fused cytokine mediates improved target cell lysis by effector cells. For example, suitable cytokines for this purpose include interleukin-2 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSM).
[0173]
In yet another embodiment, where the Zalpha53 potipeptide or anti-Zalpha53 antibody targets vascular cells or tissue, such polypeptides or antibodies may be used to reduce restenosis by radionuclide and, in particular, beta-radiation. It can be conjugated by a luminescent radionuclide. Such a treatment approach poses little risk to the clinician managing the radiotherapy. For example, an iridium-192 impregnated ribbon that is placed into a patient's stented blood vessel until the required radiation dose is delivered will receive reduced tissue growth in the blood vessel and placebo ribbon. Showed a larger lumen than the control group. In addition, revascularization and stent thrombosis were significantly lower in the treatment group. Similar results are expected from targeting a bioactive conjugate that includes a radionuclide, as described herein.
[0174]
The bioactive polypeptides or antibody conjugates described herein can be supplied intravenously, intraarterially or intravascularly, or can be introduced locally at the intended site of action.
[0175]
Use of polynucleotides / polypeptides
The molecules of the present invention are used to identify and isolate receptors involved in spermatogenesis, steroidogenesis, testicular differentiation, and hypothalamic-pituitary-gonad axis regulation control, or receptors of the immune system. Can be done. For example, the proteins and peptides of the invention are immobilized on a column, and the membrane preparation is passed over the column (Immobilized Affinity Ligand Technologies, Hermanson et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA, 92). .
[0176]
Proteins and peptides can also be radiolabeled (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-7). Biom. 62: 483-514, 1993 and Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33: 1176-1180, 1984), and specific cell-surface proteins can be identified. .
The molecules of the present invention will be useful for testing diseases of the reproductive and immunological systems.
[0177]
Gene therapy
Polynucleotides encoding Zalpha53 polypeptides are useful in gene therapy applications where it is desired to increase or inhibit Zalpha53 activity. If the mammal has or lacks a mutated Zalpha53 gene, the Zalpha53 gene can be introduced into mammalian cells. In one embodiment, a gene encoding a Zalpha53 polypeptide is introduced in vivo in a viral vector. Such vectors include attenuated or defective DNA viruses such as herpes simplex virus (HSV), papillary virus, Epstein-Barr virus (EBV), adenovirus, adeno-associated virus (AAV) and the like. However, it is not limited only to them.
[0178]
Defective viruses that completely or almost completely lack viral genes are preferred. The defective virus is not infectious after introduction into the cell. The use of defective viral vectors allows for administration to cells in specific localized areas without having to worry about the vector infecting other cells. Examples of particular vectors include, but are not limited to: defective herpesvirus 1 (HSV1) vectors (Kaplit et al., Molc. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991). , Attenuated adenovirus vectors, such as Stratford-Perricaudat and the like. (J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992) and defective adeno-associated virus vectors (Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-28, 1989).
[0179]
In another embodiment, the Zalpha53 gene can be introduced into a retroviral vector as described in the following reference: Anderson et al. U.S. Patent No. 5,399,346; Mann et al. , Cell 33: 153, 1983; Temin et al. U.S. Pat. No. 4,650,764; Temin et al. U.S. Pat. No. 4,980,289; Markowitz et al. , J. et al. Virol. 62: 1120, 1988; Temin et al. U.S. Pat. No. 5,124,263; Dougherty et al. , WIPO Publication WO 95/07358; and kuo et al. , Blood 82: 845-52, 1993.
[0180]
On the other hand, the vector can be introduced by in vivo lipofection using liposomes. Synthetic cationic lipids can be used to prepare liposomes for in vivo transfection of the gene encoding the marker (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; and Mackey. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988). The use of lipofection to introduce exogenous genes into specific organs in vivo has certain practical advantages.
[0181]
Molecular targeting of liposomes to specific cells represents an advantage in one area. It is clear that directing transfection to particular cells represents an advantage of one area. It is clear that directing transfection to specific cell types is particularly advantageous in tissues with cellular heterogeneity, such as pancreas, liver, kidney and brain. Lipids are scientifically derived into other molecules for targeting. Targeted peptides, such as hormones or neurotransmitters, and proteins, such as antibodies or non-peptide molecules, can be chemically attached to liposomes.
[0182]
It is possible to remove cells from the body and introduce the vector as a naked DNA plasmid, and then reimplant the transformed cells into the body. Naked DNA vectors for gene therapy can be prepared into the desired host cells by methods known in the art, such as transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, gene It can be introduced by the use of a cancer or the use of a DNA vector transporter (for example, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621. 24, 1988).
[0183]
Antisense methods can be used to inhibit Zalpha53 gene transcription, for example, to inhibit cell growth in vivo. A polynucleotide that is complementary to a segment of a Zalpha53-encoding polynucleotide (eg, a polynucleotide as set forth in SEQ ID NOS: 1 or 19) binds to and encodes a Zalpha53-encoding mRNA. Designed to inhibit translation. Such antisense polynucleotides are used to inhibit expression of a Zalpha53 polypeptide-encoding gene in a cell culture or subject.
[0184]
The present invention also provides reagents that could be used for diagnosis. For example, a probe comprising the Zalpha53 gene, Zalpha53 DNA or RNA, or a subsequence thereof, can be used to determine whether the Zalpha53 gene is dependent on chromosome 10, or whether a mutation has occurred. Detectable chromosomal aberrations at the Zalpha53 locus include, but are not limited to, aneuploidy, gene copy number changes, insertions, deletions, restriction site changes, and translocations. Such abnormalities can be detected by molecular genetic techniques such as restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, short tandem repeat (STR) analysis using PCR techniques, and other genes known in the art. It can be detected using the polynucleotides of the present invention by using linkage analysis techniques (Sambrook et al., Supra; Ausubel et al., Supra; Marian, Chest 108: 255-65, 1995).
[0185]
Transgenic mice constructed to express the Zalpha53 gene and mice exhibiting a complete absence of Zalpha53 gene function, referred to as "knockout mice" (Snowawat et al., Science 257: 1083, 1992), are also known to those of skill in the art. (Lowell et al., Nature 366: 740-42, 1993). These mice are used to study the Zalpha53 gene and the protein encoded thereby in an in vivo system.
[0186]
Chromosome localization
Zalpha53 has been mapped to chromosome 10. Radiant gland hybrid mapping is a somatic genetic technique that has been developed to construct high-resolution serial maps of mammalian chromosomes (Cox et al., Science 250; 245-50, 1990). Partial or complete knowledge of the gene sequence allows the design of appropriate PCR primers for use by the chromosomal radiation hybrid mapping panel. Radiation hybrid mapping panels covering the entire human genome, such as the Stanford G3 RH panel and the GeneBridge 4 RH panel, are commercially available (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL).
[0187]
These panels allow rapid, PCR-based chromosomal localization and alignment of genes, sequence-labeled sites (STS), and other non-polymorphic and polymorphic markers within the region of interest. . This involves establishing a directly proportional physical distance between the newly discovered gene of interest and the previously mapped marker. Accurate knowledge of gene location is useful for many purposes, including: 1) determining whether a sequence is part of an existing contig and various forms, such as YAC, BAC or cDNA clones. 2) providing possible candidate genes for genetic diseases that exhibit binding to the same chromosomal region; and 3) model organisms, such as mice, to help determine the function of a particular gene Cross reference.
[0188]
Sequence labeled sites (STS) are also used independently for chromosome localization. An STS is a DNA sequence that is unique in the human genome and can be used as a reference point for a particular chromosome or region of chromosome. STS is defined by a pair of oligonucleotide primers used in the polymerase chain reaction to specifically detect this site in the presence of all other genomic sequences. Because STSs are solely based on DNA sequences, they are based on electronic databases, such as Database of Sequence Tagged Sites (dbSTS), GenBank (National Center for Biological Information, National Institutes of Health, National Institutes of Health, Medical and Health Sciences, National Institutes of Health, Medical and Medical Sciences, National Institutes of Health, and Medical Sciences).http: // www. ncbi. nlm. nih. gov) Can be interrogated for the gene sequence of interest with the mapping data contained within their short genomic landmark STS sequences.
[0189]
For pharmaceutical use, the proteins of the invention are formulated according to conventional methods for parenteral, especially intravenous or subcutaneous delivery. Intravenous administration will be by bolus injection or infusion for a typical period of one to several hours. Generally, the pharmaceutical formulation will include a Zalpha53 protein in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle, such as a salt solution, buffer solution, 5% dextrose in water, or the like. The formulation can further include one or more excipients, preservatives, solubilizers, buffers, albumin to prevent protein loss on vial surfaces, and the like.
[0190]
Formulation methods are well known in the art and are described, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed. , Mack Publishing Co., Ltd .; , Easton, PA, 19^th ed. , 1995. Therapeutic doses generally range from 0.1 to 100 μg / kg of the patient's body weight / day, preferably 0.5 to 20 mg / kg / day, and the exact dose will depend on the nature of the condition being treated and the severity of the illness. Determined by the clinician according to acceptable standards, taking into account degree, patient characteristics, etc. Determination of the dosage is within the level of ordinary skill in the art. The protein may be administered for one week or less, often for one to three days, for acute treatment, or may be used for months to years for chronic treatment. Administration of the protein can be subcutaneous, intraperitoneal or rectal, depending on the disease to be treated.
[0191]
Tissue expression and use
Zalpha53 provides a novel polypeptide having a putative signal peptide leader sequence and an α-helix structure. This gene can encode a secreted polypeptide having a secondary structure that indicates it is a member of a four helix bundle cytokine family. On the other hand, the polypeptide may have other activities associated with other biological functions, such as enzymatic activity, binding to cell membranes, or functioning as a carrier protein.
[0192]
Zalpha53 Use of
Zalpha53 can be administered to immunocompromised mammals, preferably humans, such as cancer patients who have undergone chemotherapy, AIDS patients and the elderly. This will stimulate their immune system. Zalpha53 can also be used as a vaccine adjuvant to be administered before, with or after administration of the vaccine. Zalpha53 can also be administered to stimulate the immune system to attack tumors.
[0193]
Zalpha53 Use of antagonists
Antagonists to Zalpha53, such as antibodies, soluble receptors or small molecule antagonists, can be administered to a mammal, preferably a human, to mitigate the inflammatory response. Antagonists, eg, antibodies, to Zalpha53 can be used to treat inflammation-related diseases, such as atherosclerotic heart disease (Paulsson, G., etc., Arterioscler Thromb. Vasc. Biol., 20: 10-17 (2000)), inflammatory bowel disease, It can be used to treat patients with Crohn's disease, rheumatoid arthritis and pancreatitis.
[0194]
Zalpha53 Utility of educational kits for polypeptides, polynucleotides and antibodies
The polynucleotides and polypeptides of the present invention will further be useful as educational tools in laboratory training kits related to genetics and molecular biology, protein chemistry, and antibody generation and analysis. Because of its unique polynucleotide and polypeptide sequences, Zalpha53 molecules can be used as standards for testing or as "unknown."
[0195]
For example, Zalpha53 polynucleotides can be used to teach students how to prepare expression constructs for bacterial, viral or mammalian expression, including fusion constructs, where Zalpha53 is the gene to be expressed. To determine the restriction endonuclease cleavage site of the polynucleotide; to determine the mRNA and DNA position of the Zalpha53 polynucleotide in the composition (ie, by Northern and Southern blots, and the polymerase chain reaction); and by nucleic acid hybridization. It can be used as an aid to identify related polynucleotides and polypeptides.
[0196]
Zalpha53 polypeptides may be prepared by preparing antibodies; identifying proteins by Western blot; determining the weight of expressed Zalpha53 polypeptide as a percentage of total protein expressed; identifying peptide cleavage sites; identifying amino and carboxyl terminal labels. Coupling; amino acid sequence analysis; and use as an aid for in vitro and in vivo monitoring of the biological activity of native and labeled proteins (ie, receptor binding, signal transduction, proliferation and differentiation) Can be done.
[0197]
Zalpha53 polypeptides may also be of analytical skill, for example, mass spectrometry, conformation, especially to determine the location of disulfide bonds, circular dichroism, to determine the conformation of an atom in detail, X- Line crystallography can also be used to teach nuclear magnetic resonance spectroscopy to describe the structure of proteins in solution. For example, a kit containing a Zalpha53 polypeptide can be provided to develop a student's analytical skill. Since the amino acid sequence is known by the professor, i.e., the protein is given to the student as a test to determine or advance the proficiency of the student, the professor asks whether the student correctly analyzed the polypeptide. You will know. Since every polypeptide is unique, the educational use of Zalpha53 will itself be unique.
[0198]
Antibodies that specifically bind to Zalpha53 are prepared by affinity column chromatography to purify Zalpha53, how to clone the polypeptide encoding the antibody, and how to sequence. And, thus, can be used as an exercise to teach students how to design a humanized antibody. Second, the Zalpha53 gene, polypeptide or antibody is packaged by a reagent company and marketed by universities to allow acquisition by students skilled in molecular biology techniques.
[0199]
Because individual genes and proteins are unique, individual genes and proteins create unique challenges and learning experiences for students in laboratory labs. Such educational kits containing a Zalpha53 gene, polypeptide or antibody are considered to be within the scope of the present invention.
The present invention is further illustrated by the following non-limiting examples.
[0200]
Example
Example 1  Zalpha53 Cloning
Zalpha53 cDNA was found in the testis cDNA library. The marathon cDNA was converted to a marathon-Ready^TM Manufactured using a kit (Clontech, Palo Alto, CA) and QC tested with clathrin primers ZC21195 GAGGAGACCATAACCCCCCGACAG (SEQ ID NO: 38) and ZC21196 CATAGCTCCCACCACACGAATTTT (SEQ ID NO: 39) and then based on the intensity of the clathrin band And diluted. To confirm the properties of the panel samples, three tests for quality control (QC) were performed:
[0201]
(1) To assess the nature of the RNA used for the library, internal cDNAs were average insert size by PCR with a vector oligonucleotide that was specific for the vector sequence for the individual cDNA library. Tested for;
(2) The standardization of the concentration of cDNA in the panel sample was performed using 5 ′ vector oligonucleotide ZC14,063 CACCAGACATAATAGCTGACAGACT (SEQ ID NO: 40) and 3′α tubulin-specific oligonucleotide primer ZC17,574 GGTRTTGCTCAGCCATGCACAC (SEQ ID NO: 41), or 3 Using a G3PDH-specific oligonucleotide primer ZC17,600 CATGTAGGCCATGAGGTCCCACCAC (SEQ ID NO: 42) achieved by standard PCR methods for amplifying full-length α-tubulin or G3PDH cDNA; and
[0202]
(3) Samples were sent for sequencing for potential ribosome or mitochondrial DNA contamination. Panels were assembled in a 96-well format containing human genomic DNA (Clontech, Palo Alto, CA) positive control samples. Each well contained approximately 0.2-100 pg / μl cDNA.
[0203]
The PCR reaction was performed using oligonucleotides ZC37195 CTCCCTGTTTCAGCACCATCATC (SEQ ID NO: 43) and ZC37194 GTCTTCCTCCTCTCATCATTTGTTTTC (SEQ ID NO: 44), TaKaRaExTag.^TM (TAKARA Shuzo Co. Ltd., Biomedicals Group, Japan) and Rediload dye (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Amplification was performed as follows: 94 ° C for 2 minutes (1 cycle), 94 ° C for 30 seconds, 57.0 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds (35 cycles), followed by 5 minutes at 72 ° C. Minutes (1 cycle). Approximately 10 μl of the PCR reaction product was subjected to standard agarose gel electrophoresis using a 4% agarose gel. A correctly predicted DNA fragment of about 272 bp was observed in four testis samples.
[0204]
Testis cDNA and DNA fragments for the testis 1K library pool were excised and purified using the Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, Calif.) According to the manufacturer's instructions. The fragment for the testis 1K library pool was verified by sequencing to show that it was in fact Zalpha53 but had a 36 bp insert.
[0205]
From the foregoing, while aspects of the features of the present invention have been described for purposes of illustration, it will be understood that various modifications may be made within the scope of the invention. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.

Claims (6)

An isolated polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-18 and 20-37, or a polypeptide that is at least 90% identical to said polypeptide. A polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-18 and 20-37, or an isolated polynucleotide encoding a polypeptide that is at least 90% identical to said polypeptide. An antibody that specifically binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 18 and 20 to 37. An anti-idiotype antibody that specifically binds to an antibody that specifically binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-18 and 20-37. Use of an antibody against a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-18 and 20-37 for the manufacture of a medicament for the treatment of an inflammatory disease. Use of a polypeptide consisting of SEQ ID NO: 3 to stimulate the immune system.