JP2004522425A - タンパク質クラスターｉをコードする遺伝子及びコードされるタンパク質 - Google Patents
タンパク質クラスターｉをコードする遺伝子及びコードされるタンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004522425A JP2004522425A JP2002544457A JP2002544457A JP2004522425A JP 2004522425 A JP2004522425 A JP 2004522425A JP 2002544457 A JP2002544457 A JP 2002544457A JP 2002544457 A JP2002544457 A JP 2002544457A JP 2004522425 A JP2004522425 A JP 2004522425A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- protein
- acid molecule
- polypeptide
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、代謝的に関連する組織において発現されるヒト遺伝子ファミリーの同定に関する。かかる遺伝子は、肥満及び糖尿病のような代謝性疾患の診断において、ならびに該疾患の治療の際に有用な物質の同定において有用であると予想される、「タンパク質クラスターＩ」と称されるポリペプチドグループをコードする。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝的に関連する組織において発現されるヒト遺伝子ファミリーの特定に関する。かかる遺伝子は、肥満及び糖尿病のような代謝性疾患の診断において、ならびに該疾患の治療において有用な物質の特定において有用であると予想される、「タンパク質クラスターＩ」と称されるポリペプチドグループをコードする。
【背景技術】
【０００２】
代謝性疾患は、正常な代謝を分断する何らかの疾患又は障害と定義される。それらは、栄養欠乏から；内分泌系、肝臓又は腎臓の疾患に関連して；又は遺伝的欠陥の結果として；起こりうる。代謝性疾患は、エネルギーを産生するために、細胞成分を再生するために、又はこれらのプロセスから生じる不必要な産物を排泄するために；不可欠である化学反応の１又はそれ以上における異常によって引き起こされる状態である。いずれの代謝経路が関与しているかに依存して、単一の欠陥化学反応が、１つの身体機能に関わる狭義の、又は多くの器官と系に作用する広義の影響をもたらすことがある。
【０００３】
代謝に影響を及ぼす主要なホルモンの１つは、膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞で合成されるインスリンである。インスリンは主として代謝の方向を調節し、多くのプロセスを基質の貯蔵へと方向づけ、それらの分解を抑制する。インスリンは、グルコースとアミノ酸ならびにカリウム、マグネシウム、及びリン酸のような重要な無機質の血液から細胞への輸送を高める働きをする。またインスリンは細胞内の様々な酵素反応を調節し、それらの反応はすべて共通の全体的方向、すなわち小さなユニットから大きな分子の合成へと向かう方向性を持つ。インスリンの作用の欠損（真性糖尿病）は、（ｉ）グリコーゲンの形態でのグルコースの貯蔵とエネルギーのためのグルコースの酸化、（ｉｉ）脂肪酸及びそれらの前駆体からの脂肪の合成と貯蔵及び脂肪酸酸化の完了、及び（ｉｉｉ）アミノ酸からのタンパク質の合成、に深刻な障害を引き起こす。
【０００４】
２種類の糖尿病が存在する。Ｉ型は、インスリン注射を必要とするインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である；以前は若年発症糖尿病と呼ばれていた。このタイプでは、インスリンが膵から分泌されず、それ故注射によって摂取しなければならない。ＩＩ型のインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は食事制限によって制御しうる。不十分な膵からのインスリン分泌と分泌されたインスリンに対する組織抵抗性に由来し、ベータ細胞によるインスリン分泌の微妙な変化を合併する。若年性又は成人発症という以前の分類にもかかわらず、どちらのタイプもどのような年齢でも起こりうる；ＮＩＤＤＭが、しかしながら、最も一般的なタイプであり、すべての糖尿病の９０パーセントを占める。糖尿病の正確な原因はあいまいなままであるが、ＮＩＤＤＭが遺伝と肥満に結びつくことは明白である。過剰体重又は肥満になる人々においては明らかにＮＩＤＤＭ糖尿病への遺伝的素因が存在する。
【０００５】
肥満は通常ボディマス指数（ＢＭＩ）、すなわち体重（キログラム）を身長（メートル）の２乗で除した値で定義される。体重は非常な精密さで調節される。体重の調節は、正常体重の人だけでなく、肥満が、その付近で体重が調節される設定ポイントの上昇に起因する多くの肥満者においても起こると考えられる。肥満の決定因子は遺伝、環境、及び調節に分類することができる。
【０００６】
最近の発見は、どの遺伝子が肥満を決定し、それらがどのようにして体重の調節に影響を及ぼしうるのかを説明する助けとなった。例えば、ｏｂ遺伝子における突然変異はマウスにおいて重大な肥満をもたらした；ｏｂ遺伝子のクローニングは、この遺伝子によってコードされるタンパク質、レプチンの同定を導いた；レプチンは脂肪組織細胞において産生され、体脂肪を制御するように働く。レプチンは、体重に影響を及ぼす、脂肪組織とエネルギー代謝を制御する脳領域との間のシグナルとして働くので、レプチンの存在は体重が調節されるという概念を裏付ける。
【０００７】
糖尿病や肥満のような代謝性疾患は臨床的及び遺伝的に不均質な疾患である。分子遺伝学における最近の進歩により、ＩＤＤＭ及び（若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）を含む）ＮＩＤＤＭのいくつかのサブタイプに関与する遺伝子が認識された（Ｖｅｌｈｏ ＆ Ｆｒｏｇｕｅｌ（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．２３ Ｓｕｐｐｌ．２：３４−３７）。しかし、いくつかのＩＤＤＭ感受性遺伝子はまだ同定されておらず、また一般的な形態のＮＩＤＤＭに寄与する遺伝子についてはごくわずかしか知られていない。候補遺伝子及びＩＤＤＭ又はＮＩＤＤＭの動物モデルにおいて位置づけされた遺伝子の試験、ならびに種々の個体群からの糖尿病ファミリーのゲノム全体のスキャニングは、ほとんどの糖尿病感受性遺伝子の同定及び新しい潜在的薬剤についての分子標的の特定を可能にするはずである。代謝性疾患に関わる遺伝子の特定は、それ故、新しい予測的及び治療的アプローチの開発に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明によれば、遺伝子及びコードされる相応するタンパク質のファミリー（以下「タンパク質クラスターＩ」と称する）が特定された。その結果、本発明は、
（ａ）配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）に定義された核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子；及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に定義されたヌクレオチド配列の遺伝子コードの縮重の結果である核酸配列を含む核酸分子
から選択される単離核酸分子を提供する。
【０００９】
本発明によれば核酸分子は、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及びそれらの組合せを含む。ＤＮＡから転写されるＲＮＡも本発明に包含される。
【００１０】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」の語は、標準的なプロトコール（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、前出）からこの分野において既知であり、例えば＋６５℃の０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと＋６８℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として理解できる。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は配列表の配列番号１と同じヌクレオチド配列を持つ。しかし、本発明に従った核酸分子は、配列番号１として示す配列に厳密に限定されるわけではない。むしろ本発明は、置換、小さな欠失、挿入又は逆位のような修飾を担い、それにかかわらず本発明に従ったタンパク質クラスターＩポリペプチドの特徴を実質的に備えるタンパク質をコードする核酸分子を包含する。その結果、ヌクレオチド配列が配列表において配列番号１として示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同である核酸分子は本発明に包含される。
【００１２】
また、ヌクレオチド配列が、遺伝暗号のために、配列番号１として示すヌクレオチド配列に縮重している核酸分子も本発明に含まれる。３個のヌクレオチドの連続的な組分けである「コドン」は１個のアミノ酸をコードする。６４個の可能なコドンが存在するが、天然アミノ酸は２０個しかないので、ほとんどのアミノ酸は２個以上のコドンによってコードされる。遺伝子コードのこの天然の「縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）」又は「重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」は当該技術において周知である。それ故、配列表に示すヌクレオチド配列は、タンパク質クラスターＩポリペプチドをコードする配列の、大きいが限定された群の中の一例にすぎない。
【００１３】
本発明に従った核酸分子は、分子生物学の当業者に既知の手法において数多くの適用を持つ。これらの手法は、ハイブリダイゼーションプローブとして、染色体及び遺伝子マッピングのため、ＰＣＲテクノロジーにおいて、センス又はアンチセンス核酸の作製において、新しい治療分子のスクリーニングにおいて、等々でのそれらの使用を含む。
【００１４】
より明細には、本発明によって提供される配列情報は、当該技術において周知の手法によってコードされるポリペプチドの大規模発現を可能にする。本発明の核酸分子はまた、サザン及び／又はノーザンハイブリダイゼーション、及びＰＣＲを含めた周知の手法によって、ヒト対立遺伝子変異体及び種相同体のような関連ポリペプチドをコードする核酸分子の同定と単離を可能にする。ヒトＤＮＡ配列についての知識はまた、サザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲの使用を通して、クラスターＩ内のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列の同定、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のような発現制御調節配列の同定を可能にする。本発明の核酸分子はまた、細胞がクラスターＩ内のタンパク質を発現する能力を検出するハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明の核酸分子はまた、１又はそれ以上の疾患状態の基礎となる、遺伝子座における遺伝子変化を同定するために有用な診断方法の基礎を提供することができ、かかる情報は診断と治療戦略の選択の両方にとって有用である。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義したような核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、該ポリペプチドは配列表の配列番号２、４、６又は８に従ったアミノ酸配列を持つ。しかし、本発明に従ったポリペプチドは、配列表の中の配列番号２、４、６又は８と同じアミノ酸配列を持つポリペプチドに厳密に限定されるわけではない。むしろ本発明は、置換、小さな欠失、挿入又は逆位のような修飾を担い、それにかかわらずタンパク質クラスターＩポリペプチドの特徴を実質的に備えるポリペプチドを包含する。その結果、アミノ酸配列が配列表において配列番号２、４、６又は８として示すアミノ酸配列と少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同であるポリペプチドは本発明に包含される。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義したような核酸分子を備えるベクターを提供する。該ベクターは、例えば、本発明に従ったＤＮＡ分子を担い、その発現を仲介することができる、複製可能な発現ベクターでありうる。本文中において「複製可能な」の語は、ベクターが、導入された所与の種類の宿主細胞において複製することができることを意味する。ベクターの例は、バクテリオファージのようなウイルス、コスミド、プラスミド及び他の組換えベクターである。核酸分子は、当該技術において周知の方法によってベクターゲノム内に挿入する。
【００１７】
本発明に従ったベクターを備える培養宿主細胞も本発明に包含される。そのような宿主細胞は、原核細胞、単細胞真核細胞又は多細胞生物から誘導される細胞でありうる。宿主細胞はそれ故、例えば大腸菌細胞のような細菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母からの細胞、又は哺乳類細胞でありうる。宿主細胞へのベクターの導入を行うために用いる方法は、組換えＤＮＡ法に精通する者には周知の標準的な方法である。
【００１８】
さらにもう１つの態様では、本発明は、該ポリペプチドが生産される条件下で本発明に従った宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの生産のための方法を提供する。細胞を増殖させるために使用する培地は、かかる目的に適した従来のいかなる培地であってもよい。適切なベクターは上述したベクターのいずれかであり、適切な宿主細胞は上記に列挙した細胞型のいずれかでありうる。ベクターを構築し、それを宿主細胞に導入するために用いる方法は、組換えＤＮＡの分野においてそのような目的のために既知であるいかなる方法でもよい。細胞によって発現された組換えポリペプチドは、細胞型及びベクターの組成物に依存して、分泌されうる、すなわち細胞膜を通して外へと輸送されうる。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）該核酸分子を含む細胞を提供すること、
（ｉｉ）該細胞を候補物質と接触させること、および
（ｉｉｉ）該候補物質の不在下では存在しない作用に関して該細胞をモニターする
ことを含む本発明に従った核酸分子を調節することができる物質を特定するための方法を提供する。
【００２０】
スクリーニングのために、適切な宿主細胞を、本発明に従った核酸分子の制御下のレポーター遺伝子を有するベクターで形質転換することができる。既知の活性を持つ物質（すなわち標準物質）又は推定上の活性を持つ物質（すなわち「被験物質」又は「候補物質」の存在下又は不在下でレポーター遺伝子の発現を測定することができる。被験物質の存在下でのレポーター遺伝子の発現レベルの変化を標準物質によって生じる変化と比較する。このようにして、活性物質を同定し、このアッセイにおけるそれらの相対的効力を決定する。
【００２１】
トランスフェクションアッセイは、有効物質を特定するために特に有用なスクリーニングアッセイである。トランスフェクションアッセイでは、本発明に従った核酸分子に作動可能に連結されたレポーター遺伝子のような遺伝子を含む核酸を、所望する細胞型にトランスフェクションする。レポーター遺伝子発現の試験レベルを候補物質の存在下で検定し、対照発現レベルと比較する。候補物質の不在下で測定された発現レベルである、レポーター遺伝子発現の対照レベルとは異なる試験発現レベルを生じる物質として、有効物質を特定する。細胞をトランスフェクションするための方法及び種々の好都合なレポーター遺伝子は当該技術において周知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編集）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１８５巻，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）参照；またＳａｍｂｒｏｏｋ、前出も参照のこと）。
【００２２】
この説明全体を通じて、分子生物学の手法に関連して使用するとき「標準プロトコール」及び「標準手順」の語は、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４、又はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９のような常用実験室マニュアルの中で認められるプロトコール及び手順と理解されるべきである。
【００２３】
本発明のさらなる特徴は下記の実施例から明らかになる。実施例１から３は実際のものであり、実施例４から９は予測的である。
【実施例１】
【００２４】
タンパク質クラスターの同定
相同タンパク質のファミリー（以下「タンパク質クラスターＩ」と称する）を、Ｗｏｒｍｐｅｐ２０データベース公開（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｅｌｅｇａｎｓ／ｗｏｒｍｐｅｐ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）の中のすべてのＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓタンパク質を使用して「ａｌｌ−ｖｅｒｓｕｓ−ａｌｌ」ＢＬＡＳＴ手法によって同定した。Ｗｏｒｍｐｅｐデータベースは、Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ ｉｎ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫとＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡが共同で実施する、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノム塩基配列決定プロジェクトからの予測タンパク質を含む。１８，９４０個のタンパク質がＷｏｒｍｐｅｐ２０から回収された。類似性を持つタンパク質を一緒に群分けするために、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎクラスター化手順においてタンパク質を使用した（Ｓｍｉｔｈ Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ｍ．Ｓ．（１９８１）「共通分子サブ配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７（１）：１９５−１９７；Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ．（１９９１）「タンパク質配列ライブラリーの検索：Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎとＦＡＳＴＡアルゴリズムの感受性と選択性の比較（Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：６３５−６５０；Ｏｌｓｅｎら（１９９９）「Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ整列の至適化（Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）」、Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．３０２−３１３）。完全に注釈付けられたタンパク質をフィルターにかけて除き、それによって未知の機能の１０，１３０個のタンパク質を１，８００のクラスターに群分けすることができた。
【００２５】
得られた配列クラスターを、Ｆｌｙｂａｓｅデータベース（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｈｐｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）に含まれるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）タンパク質と比較し、注釈付けられたクラスターを排除した。Ｃ．エレガンスとキイロショウジョウバエの両方で保存される、注釈付けられていないタンパク質クラスターを蠕虫／ハエデータセットに保存し、それをＣｅｌｅｒａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ）に対してＢＬＡＳＴ手順（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ）において使用した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｅｄｕ／ＵＷＧＣ／ａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍ）で開発されたＰＨＲＡＰソフトウエアを使用して、できる限り完全長タンパク質に近くなるようにオーバーラップフラグメントを収集した。未知の機能を持つ相同タンパク質の群（「タンパク質クラスターＩ」）をさらなる試験のために選択した。
【実施例２】
【００２６】
タンパク質クラスターＩの分析
（ａ）整列化
タンパク質クラスターＩのヒト部分は３個の遺伝子（配列番号１、５及び７）によってコードされるポリペプチドを含む。さらに、選択的スプライシング（配列番号１として示す遺伝子の６２４位から７９４位までの欠失に対応する）は配列番号３を生じる。配列番号１として示す遺伝子は、染色体１０番上のクローンＲＰ１１−１０８Ｌ７からのヒトＤＮＡ配列に含まれることが認められた（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＬ１３３２１５）。
【００２７】
ＣｌｕｓｔａｌＸ多重整列ソフトウエア（例えばｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋよりダウンロード可能）を用いた、タンパク質クラスターＩに含まれるヒトポリペプチド（配列番号２、４、６及び８）の整列を表Ｉに示す。ＣｌｕｓｔａｌＸソフトウエアの参照については、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９７）「ＣｌｕｓｔａｌＸウインドウズインターフェイス：クオリティ分析ツールを援用した多重配列整列のための柔軟な戦略（Ｔｈｅ ｃｌｕｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎａｌｓｉｓ ｔｏｏｌｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４８７６−４８８２参照。またＪｅａｎｍｏｕｇｉｎら（１９９８）、「ＣｌｕｓｔａｌＸによる多重配列整列（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｈｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＣｌｕｓｔａｌＸ）」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：４０３−４０５も参照のこと。整列は２つの離れた領域における高度の保存を示し、２つの新規ドメインの存在を示唆した（表Ｉにおいて星印で示した位置参照）。
【００２８】
（ｂ）ＨＭＭ−Ｐｆａｍ
ＨＭＭ−Ｐｆａｍ検索を３つのヒトファミリー成員に関して実施した。Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）はタンパク質ファミリーとドメインの大きなコレクションである。Ｐｆａｍは、これらのファミリーの多重タンパク質整列とプロフィール−ＨＭＭ（プロフィール隠蔽マルコフモデル（Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ））を含む。プロフィール−ＨＭＭは、配列ファミリーのコンセンサス統計的説明を用いて感受性のあるデータベース検索を行うために使用できる。Ｐｆａｍは、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｓａｎｇｅｒ／ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ；及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｒ．ｋｉ．ｓｅ／ＰｆａｍにおいてＷＷＷ上で入手可能である。Ｐｆａｍの最新バージョン（４．３）は１８１５ファミリーを含む。これらのＰｆａｍファミリーはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ ３７及びＴｒＥＭＢＬ９の中のタンパク質の６３％にマッチする。Ｐｆａｍの参照については、Ｂａｔｅｍａｎら（２０００）「Ｐｆａｍタンパク質ファミリーデータベース（Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２６３−２６６；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９８）「Ｐｆａｍ：多重配列整列化とタンパク質ドメインのＨＭＭ−プロフィール（Ｐｆａｍ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｈｍｍ−Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：３２２−３２５；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９８）「Ｐｆａｍ：種子整列に基づくタンパク質ドメインファミリーの包括的データベース（Ｐｆａｍ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｅｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２８：４０５−４２０参照。
【００２９】
ＨＭＭ−Ｐｆａｍ検索は、タンパク質クラスターＩにおいてはこれまでに既知のドメインが全く同定できないことを示した。
【００３０】
（ｃ）ＴＭ−ＨＭＭ
クラスターＩの中のヒトタンパク質を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−１．０において入手可能なＴＭ−ＨＭＭツールを用いて分析した。ＴＭ−ＨＭＭは、膜貫通タンパク質におけるα−ヘリックスの位置と方向をモデリングし、予測する方法である。（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９８）「タンパク質配列内の膜貫通ヘリックスを予測するための隠蔽マルコフモデル（Ａ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、ＩＳＭＢ ６：１７５−１８２）。配列番号２、６及び８として示すタンパク質において膜貫通セグメントを同定した（図１）。
【００３１】
（ｄ）非ヒトオーソローグの分析
Ｃ．エレガンスゲノムは、タンパク質クラスターＩ内のタンパク質をコードする６個の遺伝子を含み、その進化における最も近い祖先である、Ｃ．エレガンスコスミドＴ０４Ｆ８．１に含まれる配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｚ６６５６５；また「線虫Ｃ．エレガンスのゲノム配列：生物学を検討するためのプラットフォーム（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｃ．ｅｌｇａｎｓ：ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｔｈｅ Ｃ．ｅｌｇａｎｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２：２０１２−２０１８も参照のこと。Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８３：３５；２８３：２１０３；及び２８５：１４９３に公表された誤りが掲載されている）は、３個の同定されたヒトタンパク質（配列番号２、６及び８）と５３％同一である。
【００３２】
キイロショウジョウバエゲノムはタンパク質クラスターＩに属する２個の遺伝子を含み、その最も近い類縁（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＥ００３６０６＿２４；Ａｄａｍｓら（２０００）「キイロショウジョウバエのゲノム配列（Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２１８５−２１９５）はヒトタンパク質セットと５３％同一である。
【００３３】
ヒトタンパク質はまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔアクセス番号ＣＡＡ９９４９５．１）に３８％の同一性を示す。かかる酵母タンパク質はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓゲノムデータベースにおいて推定上の輸送体として注釈付けられている（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ４．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＳＧＤ／ｌｏｃｕｓ．ｐｌ？ｌｏｃｕｓ＝ＹＯＲ２７０ｃ）。
【００３４】
２つの公的ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）データベースエントリー（ＧＥＮＢＡＮＫエントリーＡＦ２７６９９７及びＳ７００１１）が推定上のトリカルボン酸輸送タンパク質として注釈付けられている。遺伝子はそれぞれ、配列番号１と８８％及び７９％の同一性を持つ。トリカルボン酸担体は、リンゴ酸又は他のジカルボン酸との電気中性交換においてミトコンドリアの内側の膜を越えてクエン酸又はトリカルボン酸を輸送する（Ａｚｚｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２５：５１５−５２４）。
【実施例３】
【００３５】
発現分析
推定上の偽遺伝子を同定するために、ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって提供されるＥＳＴデータベースを使用してクラスターＩ内のヒトタンパク質が発現されるかどうかを調べた。タンパク質クラスターＩにおいて推定偽遺伝子は同定されなかった。
【００３６】
Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑ（登録商標）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ）を使用してヒト遺伝子の組織分布を検討した。配列番号１として示す核酸分子は、主として神経系と消化器系において発現されることが認められた。配列番号３として示す核酸分子は主として雄性生殖器において発現された。配列番号５として示す核酸分子は主として肝と胚構造において発現された。配列番号７として示す核酸分子は主として免疫系において発現された。それ故、配列番号１、３、５及び７として示す該核酸分子及び配列番号２、４、６及び８として示すポリペプチドは、生物学的試料中に存在する組織又は細胞型の識別同定のため、そして代謝性疾患及び免疫疾患を含めた疾患及び障害の診断のために有用であることが提議される。
【実施例４】
【００３７】
多組織ノーザンブロット法
クラスターＩ内のタンパク質の発現プロフィールのより完全な解析を行うために多組織ノーザンブロット法（ＭＴＮ）を実施する。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ（商標））Ｂｌｏｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍｔｎ）は、多様な異なるヒト、マウス又はラット組織からのＰｒｅｍｉｕｍ Ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡを特徴とするあらかじめ作製されたノーザンブロットである。ＭＴＮ Ｂｌｏｔｓは、種々の組織における転写産物の大きさと相対的存在率を分析するために使用できる。ＭＴＮ Ｂｌｏｔｓはまた、遺伝子ファミリーと選択的スプライシング形態を検討し、交雑種相同性を評価するためにも使用できる。
【実施例５】
【００３８】
マイクロアレイを使用した発現プロファイル作成
マイクロアレイは、遺伝子発現プロファイル作成、比較ゲノム学及び遺伝子型分類を含む適用においてＤＮＡ及びＲＮＡの変異を測定するために使用できる、数千の異なるＤＮＡ配列の高度に整列されたマトリックスから成る（最近の総説については、例えば：Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２０００）「ＤＮＡマイクロアレイを使用した遺伝子発現のモニター（Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（３）２８５−２９１；又はＤｕｇｇａｎら（１９９９）「ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた発現プロファイル作成（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｃＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：１０−１４参照）。
【００３９】
クラスターＩ内のタンパク質の発現パターンをＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイを用いて解析することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐ＿ｅｘｐ．ｈｔｍｌ）。簡単に述べると、様々な組織からｍＲＮＡを抽出する。Ｔ７標識オリゴｄＴプライマーを用いてそれらを逆転写し、二本鎖ｃＤＮＡを作製する。次にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとビオチニル化ヌクレオチドによるインビトロ転写法（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）を用いてこれらのｃＤＮＡを増幅し、標識する。得られたｃＲＮＡの個体群を精製し、熱によって断片化して、約３５−２００塩基のＲＮＡフラグメントサイズの分布を作製する。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイを試料とハイブリダイズする。アレイを洗浄して染色する。共焦点スキャナーを用いてカートリッジを走査し、画像をＧｅｎｅＣｈｉｐ ３．１ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で解析する。
【実施例６】
【００４０】
タンパク質クラスターＩに結合するポリペプチドの特定
タンパク質クラスターＩと相互作用するタンパク質について検定するために、ツーハイブリッドスクリーニング法を使用することができる。Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｓｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５−２４７によって最初に記述されたツーハイブリッド法は、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための酵母ベースの遺伝子アッセイである。この方法は、相互作用するタンパク質の同定を可能にするだけでなく、これらのタンパク質についてのクローン化された遺伝子を直ちに使用可能にする。
【００４１】
ツーハイブリッド法を使用して、２つの既知のタンパク質（すなわち対応する遺伝子がこれまでにクローン化されているタンパク質）が相互作用するかどうかを決定することができる。ツーハイブリッド法のもう１つの重要な適用は、ツーハイブリッドライブラリーをスクリーニングすることによって標的タンパク質と相互作用するこれまで未知のタンパク質を同定することである。総説については、例えば：Ｃｈｉｅｎら（１９９１）「ツーハイブリッドシステム：目的とするタンパク質と相互作用するタンパク質を同定し、かかるタンパク質についての遺伝子をクローニングするための方法（Ｔｈｅ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｃｌｏｎｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９５７８−９５８２；Ｂａｒｔｅｌ ＰＬ，Ｆｉｅｌｄｓ（１９９５）「ツーハイブリッドシステムを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の分析（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２４１−２６３；又はＷａｌｌａｃｈら（１９９８）「酵母ツーハイブリッドスクリーニング手法及びアポトーシスにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の検討におけるその使用（Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２）：１３１−１３６参照。またｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍａｔｃｈｍａｋｅｒも参照のこと。
【００４２】
ツーハイブリッド法は、２つのタンパク質間の相互作用を示すために転写活性化の回復を使用する。この手法の重要な点は、多くの真核生物転写活性化因子が２つの物理的に離れたモジュラードメイン：特定プロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体にＤＮＡ結合部位の下流の遺伝子の転写を指令する活性化ドメイン（ＡＤ）から成るという事実である。ＤＮＡ−ＢＤとベイトタンパク質Ｘの融合を生成するためにＤＮＡ−ＢＤベクターを使用し、ＡＤともう１つのタンパク質Ｙの融合を生成するためにＡＤベクターを使用する。ベイトタンパク質と相互作用する新しい又は未知のタンパク質を検索するために、ＡＤとのハイブリッドの完全なライブラリーも構築することができる。ベイトタンパク質Ｘと候補タンパク質Ｙの間で相互作用が起こるときには、ＤＮＡ結合と活性化の役割を担う２つの機能的ドメインがつながって、転写活性化の機能回復を生じる。２つのハイブリッドを、適切な上流結合部位を含むレポーター遺伝子を備えた酵母宿主株に同時形質転換する；レポーター遺伝子の発現は、候補タンパク質と標的タンパク質の間の相互作用を示唆する。
【実施例７】
【００４３】
クラスターＩ遺伝子の完全長クローニング
特定ＤＮＡセグメントのインビトロでの酵素的増幅のための周知の手順であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、タンパク質クラスターＩ遺伝子の直接クローニングに使用することができる。組織ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、適切なプラスミドにクローニングして、配列決定することができる。総説については、例えばＨｏｏｆｔ ｖａｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ（１９９８）「ＰＣＲ援用ｃＤＮＡクローニング：鉱脈へのガイド付きツアー（ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｇｕｉｄｅｄ ｔｏｕｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｅｆｉｅｌｄ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：３９０−３９２；Ｌｅｎｓｔｒａ（１９９５）「ライフサイエンスにおけるポリメラーゼ連鎖反応の適用（Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４１：６０３−６１４；又はＲａｓｈｔｃｈｉａｎ（１９９５）「ポリメラーゼ連鎖反応を使用して遺伝子をクローニングし、構築するための新しい方法（Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：３０−３６参照。ＰＣＲ産物の直接クローニングを容易にするために適当な末端を作製するための様々な方法が、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、前出（１５．７章）に述べられている。
【００４４】
タンパク質クラスターＩの完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを単離するための代替的アプローチでは、配列番号１、３、５又は７から成る群より選択されるヌクレオチド配列、又はその部分に対応するＤＮＡフラグメントを、ファージｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングのためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する。プライマーは好ましくは１０−２５ヌクレオチドの長さであり、当業者に周知の手順によって決定される。λファージベクターにクローニングしたｃＤＮＡを含むλファージライブラリーを大腸菌宿主細胞と共に寒天平板に播種して、増殖させる。ファージプラークをナイロン膜に移し、それを上述したように調製したＤＮＡプローブとハイブリダイズする。陽性コロニーを平板から単離する。ｃＤＮＡを含むプラスミドを標準方法によって単離したファージから回収する。プラスミドＤＮＡをクローンから単離する。プラスミドを適切な制限酵素で消化してインサートの大きさを決定する。プラスミドの自動シークエンシングによってインサート全体の配列を決定する。
【実施例８】
【００４５】
真核宿主細胞におけるタンパク質の組換え発現
クラスターＩのタンパク質を生成するために、適当な発現ベクターと標準遺伝子工学手法を用いて、ポリペプチドをコードする核酸分子を適当な宿主細胞において発現させる。例えば、ポリペプチドをコードする配列を市販の発現ベクターにサブクローニングし、標準トランスフェクション試薬を使用して哺乳類、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションする。安定してタンパク質を発現する細胞を選択する。場合によって、標準クロマトグラフィー手法を用いてタンパク質を細胞から精製してもよい。精製を容易にするために、アミノ酸配列の部分に対応する１又はそれ以上の合成ペプチド配列に対する抗血清を惹起し、抗血清を使用してタンパク質をアフィニティー精製する。
【実施例９】
【００４６】
遺伝子機能の決定
個々の遺伝子の生物学的機能又は作用機構を明らかにするための方法は当該技術において既知である。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、クローン化した遺伝子を特異的且つ強力に不活性化する方法を提供し、遺伝子機能を検討するための強力なツールを提供する。総説については、例えばＦｉｒｅ（１９９９）「ＲＮＡが引き金となる遺伝子休止化（ＲＮＡ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：３５８−３６３；又はＫｕｗａｂａｒａ ＆ Ｃｏｕｌｓｏｎ（２０００）「ＲＮＡｉ−遺伝子機能を決定するための一般的手法への期待（ＲＮＡｉ−ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １６：３４７−３４９参照。内因性ｍＲＮＡのセンス及びアンチセンス配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入すると、コグネイトｍＲＮＡは分解され、遺伝子は休止化する。この種の転写後遺伝子休止化（ＰＴＧＳ）はＣ．エレガンスにおいて最初に発見された（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡ干渉は最近、Ｃ．エレガンス染色体Ｉ番上の予測遺伝子のほぼ９０％（Ｆｒａｓｅｒら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０８：３２５−３３０）及びＣ．エレガンス染色体ＩＩＩ番上の予測遺伝子の９６％（Ｇｏｎｃｚｙら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０８：３３１−３３６）をターゲティングするために使用された。
【００４７】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】配列番号２として示すタンパク質において同定された膜貫通領域。
【図１ｂ】配列番号８として示すタンパク質において同定された膜貫通領域。
【図１ｃ】配列番号６として示すタンパク質において同定された膜貫通領域。
【０００１】
本発明は、代謝的に関連する組織において発現されるヒト遺伝子ファミリーの特定に関する。かかる遺伝子は、肥満及び糖尿病のような代謝性疾患の診断において、ならびに該疾患の治療において有用な物質の特定において有用であると予想される、「タンパク質クラスターＩ」と称されるポリペプチドグループをコードする。
【背景技術】
【０００２】
代謝性疾患は、正常な代謝を分断する何らかの疾患又は障害と定義される。それらは、栄養欠乏から；内分泌系、肝臓又は腎臓の疾患に関連して；又は遺伝的欠陥の結果として；起こりうる。代謝性疾患は、エネルギーを産生するために、細胞成分を再生するために、又はこれらのプロセスから生じる不必要な産物を排泄するために；不可欠である化学反応の１又はそれ以上における異常によって引き起こされる状態である。いずれの代謝経路が関与しているかに依存して、単一の欠陥化学反応が、１つの身体機能に関わる狭義の、又は多くの器官と系に作用する広義の影響をもたらすことがある。
【０００３】
代謝に影響を及ぼす主要なホルモンの１つは、膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞で合成されるインスリンである。インスリンは主として代謝の方向を調節し、多くのプロセスを基質の貯蔵へと方向づけ、それらの分解を抑制する。インスリンは、グルコースとアミノ酸ならびにカリウム、マグネシウム、及びリン酸のような重要な無機質の血液から細胞への輸送を高める働きをする。またインスリンは細胞内の様々な酵素反応を調節し、それらの反応はすべて共通の全体的方向、すなわち小さなユニットから大きな分子の合成へと向かう方向性を持つ。インスリンの作用の欠損（真性糖尿病）は、（ｉ）グリコーゲンの形態でのグルコースの貯蔵とエネルギーのためのグルコースの酸化、（ｉｉ）脂肪酸及びそれらの前駆体からの脂肪の合成と貯蔵及び脂肪酸酸化の完了、及び（ｉｉｉ）アミノ酸からのタンパク質の合成、に深刻な障害を引き起こす。
【０００４】
２種類の糖尿病が存在する。Ｉ型は、インスリン注射を必要とするインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である；以前は若年発症糖尿病と呼ばれていた。このタイプでは、インスリンが膵から分泌されず、それ故注射によって摂取しなければならない。ＩＩ型のインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は食事制限によって制御しうる。不十分な膵からのインスリン分泌と分泌されたインスリンに対する組織抵抗性に由来し、ベータ細胞によるインスリン分泌の微妙な変化を合併する。若年性又は成人発症という以前の分類にもかかわらず、どちらのタイプもどのような年齢でも起こりうる；ＮＩＤＤＭが、しかしながら、最も一般的なタイプであり、すべての糖尿病の９０パーセントを占める。糖尿病の正確な原因はあいまいなままであるが、ＮＩＤＤＭが遺伝と肥満に結びつくことは明白である。過剰体重又は肥満になる人々においては明らかにＮＩＤＤＭ糖尿病への遺伝的素因が存在する。
【０００５】
肥満は通常ボディマス指数（ＢＭＩ）、すなわち体重（キログラム）を身長（メートル）の２乗で除した値で定義される。体重は非常な精密さで調節される。体重の調節は、正常体重の人だけでなく、肥満が、その付近で体重が調節される設定ポイントの上昇に起因する多くの肥満者においても起こると考えられる。肥満の決定因子は遺伝、環境、及び調節に分類することができる。
【０００６】
最近の発見は、どの遺伝子が肥満を決定し、それらがどのようにして体重の調節に影響を及ぼしうるのかを説明する助けとなった。例えば、ｏｂ遺伝子における突然変異はマウスにおいて重大な肥満をもたらした；ｏｂ遺伝子のクローニングは、この遺伝子によってコードされるタンパク質、レプチンの同定を導いた；レプチンは脂肪組織細胞において産生され、体脂肪を制御するように働く。レプチンは、体重に影響を及ぼす、脂肪組織とエネルギー代謝を制御する脳領域との間のシグナルとして働くので、レプチンの存在は体重が調節されるという概念を裏付ける。
【０００７】
糖尿病や肥満のような代謝性疾患は臨床的及び遺伝的に不均質な疾患である。分子遺伝学における最近の進歩により、ＩＤＤＭ及び（若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）を含む）ＮＩＤＤＭのいくつかのサブタイプに関与する遺伝子が認識された（Ｖｅｌｈｏ ＆ Ｆｒｏｇｕｅｌ（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．２３ Ｓｕｐｐｌ．２：３４−３７）。しかし、いくつかのＩＤＤＭ感受性遺伝子はまだ同定されておらず、また一般的な形態のＮＩＤＤＭに寄与する遺伝子についてはごくわずかしか知られていない。候補遺伝子及びＩＤＤＭ又はＮＩＤＤＭの動物モデルにおいて位置づけされた遺伝子の試験、ならびに種々の個体群からの糖尿病ファミリーのゲノム全体のスキャニングは、ほとんどの糖尿病感受性遺伝子の同定及び新しい潜在的薬剤についての分子標的の特定を可能にするはずである。代謝性疾患に関わる遺伝子の特定は、それ故、新しい予測的及び治療的アプローチの開発に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明によれば、遺伝子及びコードされる相応するタンパク質のファミリー（以下「タンパク質クラスターＩ」と称する）が特定された。その結果、本発明は、
（ａ）配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）に定義された核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子；及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に定義されたヌクレオチド配列の遺伝子コードの縮重の結果である核酸配列を含む核酸分子
から選択される単離核酸分子を提供する。
【０００９】
本発明によれば核酸分子は、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及びそれらの組合せを含む。ＤＮＡから転写されるＲＮＡも本発明に包含される。
【００１０】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」の語は、標準的なプロトコール（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、前出）からこの分野において既知であり、例えば＋６５℃の０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと＋６８℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として理解できる。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は配列表の配列番号１と同じヌクレオチド配列を持つ。しかし、本発明に従った核酸分子は、配列番号１として示す配列に厳密に限定されるわけではない。むしろ本発明は、置換、小さな欠失、挿入又は逆位のような修飾を担い、それにかかわらず本発明に従ったタンパク質クラスターＩポリペプチドの特徴を実質的に備えるタンパク質をコードする核酸分子を包含する。その結果、ヌクレオチド配列が配列表において配列番号１として示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同である核酸分子は本発明に包含される。
【００１２】
また、ヌクレオチド配列が、遺伝暗号のために、配列番号１として示すヌクレオチド配列に縮重している核酸分子も本発明に含まれる。３個のヌクレオチドの連続的な組分けである「コドン」は１個のアミノ酸をコードする。６４個の可能なコドンが存在するが、天然アミノ酸は２０個しかないので、ほとんどのアミノ酸は２個以上のコドンによってコードされる。遺伝子コードのこの天然の「縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）」又は「重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」は当該技術において周知である。それ故、配列表に示すヌクレオチド配列は、タンパク質クラスターＩポリペプチドをコードする配列の、大きいが限定された群の中の一例にすぎない。
【００１３】
本発明に従った核酸分子は、分子生物学の当業者に既知の手法において数多くの適用を持つ。これらの手法は、ハイブリダイゼーションプローブとして、染色体及び遺伝子マッピングのため、ＰＣＲテクノロジーにおいて、センス又はアンチセンス核酸の作製において、新しい治療分子のスクリーニングにおいて、等々でのそれらの使用を含む。
【００１４】
より明細には、本発明によって提供される配列情報は、当該技術において周知の手法によってコードされるポリペプチドの大規模発現を可能にする。本発明の核酸分子はまた、サザン及び／又はノーザンハイブリダイゼーション、及びＰＣＲを含めた周知の手法によって、ヒト対立遺伝子変異体及び種相同体のような関連ポリペプチドをコードする核酸分子の同定と単離を可能にする。ヒトＤＮＡ配列についての知識はまた、サザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲの使用を通して、クラスターＩ内のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列の同定、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のような発現制御調節配列の同定を可能にする。本発明の核酸分子はまた、細胞がクラスターＩ内のタンパク質を発現する能力を検出するハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明の核酸分子はまた、１又はそれ以上の疾患状態の基礎となる、遺伝子座における遺伝子変化を同定するために有用な診断方法の基礎を提供することができ、かかる情報は診断と治療戦略の選択の両方にとって有用である。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義したような核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、該ポリペプチドは配列表の配列番号２、４、６又は８に従ったアミノ酸配列を持つ。しかし、本発明に従ったポリペプチドは、配列表の中の配列番号２、４、６又は８と同じアミノ酸配列を持つポリペプチドに厳密に限定されるわけではない。むしろ本発明は、置換、小さな欠失、挿入又は逆位のような修飾を担い、それにかかわらずタンパク質クラスターＩポリペプチドの特徴を実質的に備えるポリペプチドを包含する。その結果、アミノ酸配列が配列表において配列番号２、４、６又は８として示すアミノ酸配列と少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同であるポリペプチドは本発明に包含される。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義したような核酸分子を備えるベクターを提供する。該ベクターは、例えば、本発明に従ったＤＮＡ分子を担い、その発現を仲介することができる、複製可能な発現ベクターでありうる。本文中において「複製可能な」の語は、ベクターが、導入された所与の種類の宿主細胞において複製することができることを意味する。ベクターの例は、バクテリオファージのようなウイルス、コスミド、プラスミド及び他の組換えベクターである。核酸分子は、当該技術において周知の方法によってベクターゲノム内に挿入する。
【００１７】
本発明に従ったベクターを備える培養宿主細胞も本発明に包含される。そのような宿主細胞は、原核細胞、単細胞真核細胞又は多細胞生物から誘導される細胞でありうる。宿主細胞はそれ故、例えば大腸菌細胞のような細菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母からの細胞、又は哺乳類細胞でありうる。宿主細胞へのベクターの導入を行うために用いる方法は、組換えＤＮＡ法に精通する者には周知の標準的な方法である。
【００１８】
さらにもう１つの態様では、本発明は、該ポリペプチドが生産される条件下で本発明に従った宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの生産のための方法を提供する。細胞を増殖させるために使用する培地は、かかる目的に適した従来のいかなる培地であってもよい。適切なベクターは上述したベクターのいずれかであり、適切な宿主細胞は上記に列挙した細胞型のいずれかでありうる。ベクターを構築し、それを宿主細胞に導入するために用いる方法は、組換えＤＮＡの分野においてそのような目的のために既知であるいかなる方法でもよい。細胞によって発現された組換えポリペプチドは、細胞型及びベクターの組成物に依存して、分泌されうる、すなわち細胞膜を通して外へと輸送されうる。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）該核酸分子を含む細胞を提供すること、
（ｉｉ）該細胞を候補物質と接触させること、および
（ｉｉｉ）該候補物質の不在下では存在しない作用に関して該細胞をモニターする
ことを含む本発明に従った核酸分子を調節することができる物質を特定するための方法を提供する。
【００２０】
スクリーニングのために、適切な宿主細胞を、本発明に従った核酸分子の制御下のレポーター遺伝子を有するベクターで形質転換することができる。既知の活性を持つ物質（すなわち標準物質）又は推定上の活性を持つ物質（すなわち「被験物質」又は「候補物質」の存在下又は不在下でレポーター遺伝子の発現を測定することができる。被験物質の存在下でのレポーター遺伝子の発現レベルの変化を標準物質によって生じる変化と比較する。このようにして、活性物質を同定し、このアッセイにおけるそれらの相対的効力を決定する。
【００２１】
トランスフェクションアッセイは、有効物質を特定するために特に有用なスクリーニングアッセイである。トランスフェクションアッセイでは、本発明に従った核酸分子に作動可能に連結されたレポーター遺伝子のような遺伝子を含む核酸を、所望する細胞型にトランスフェクションする。レポーター遺伝子発現の試験レベルを候補物質の存在下で検定し、対照発現レベルと比較する。候補物質の不在下で測定された発現レベルである、レポーター遺伝子発現の対照レベルとは異なる試験発現レベルを生じる物質として、有効物質を特定する。細胞をトランスフェクションするための方法及び種々の好都合なレポーター遺伝子は当該技術において周知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編集）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１８５巻，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）参照；またＳａｍｂｒｏｏｋ、前出も参照のこと）。
【００２２】
この説明全体を通じて、分子生物学の手法に関連して使用するとき「標準プロトコール」及び「標準手順」の語は、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４、又はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９のような常用実験室マニュアルの中で認められるプロトコール及び手順と理解されるべきである。
【００２３】
本発明のさらなる特徴は下記の実施例から明らかになる。実施例１から３は実際のものであり、実施例４から９は予測的である。
【実施例１】
【００２４】
タンパク質クラスターの同定
相同タンパク質のファミリー（以下「タンパク質クラスターＩ」と称する）を、Ｗｏｒｍｐｅｐ２０データベース公開（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｅｌｅｇａｎｓ／ｗｏｒｍｐｅｐ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）の中のすべてのＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓタンパク質を使用して「ａｌｌ−ｖｅｒｓｕｓ−ａｌｌ」ＢＬＡＳＴ手法によって同定した。Ｗｏｒｍｐｅｐデータベースは、Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ ｉｎ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫとＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡが共同で実施する、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノム塩基配列決定プロジェクトからの予測タンパク質を含む。１８，９４０個のタンパク質がＷｏｒｍｐｅｐ２０から回収された。類似性を持つタンパク質を一緒に群分けするために、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎクラスター化手順においてタンパク質を使用した（Ｓｍｉｔｈ Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ｍ．Ｓ．（１９８１）「共通分子サブ配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７（１）：１９５−１９７；Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ．（１９９１）「タンパク質配列ライブラリーの検索：Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎとＦＡＳＴＡアルゴリズムの感受性と選択性の比較（Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：６３５−６５０；Ｏｌｓｅｎら（１９９９）「Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ整列の至適化（Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）」、Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．３０２−３１３）。完全に注釈付けられたタンパク質をフィルターにかけて除き、それによって未知の機能の１０，１３０個のタンパク質を１，８００のクラスターに群分けすることができた。
【００２５】
得られた配列クラスターを、Ｆｌｙｂａｓｅデータベース（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｈｐｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）に含まれるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）タンパク質と比較し、注釈付けられたクラスターを排除した。Ｃ．エレガンスとキイロショウジョウバエの両方で保存される、注釈付けられていないタンパク質クラスターを蠕虫／ハエデータセットに保存し、それをＣｅｌｅｒａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ）に対してＢＬＡＳＴ手順（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ）において使用した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｅｄｕ／ＵＷＧＣ／ａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍ）で開発されたＰＨＲＡＰソフトウエアを使用して、できる限り完全長タンパク質に近くなるようにオーバーラップフラグメントを収集した。未知の機能を持つ相同タンパク質の群（「タンパク質クラスターＩ」）をさらなる試験のために選択した。
【実施例２】
【００２６】
タンパク質クラスターＩの分析
（ａ）整列化
タンパク質クラスターＩのヒト部分は３個の遺伝子（配列番号１、５及び７）によってコードされるポリペプチドを含む。さらに、選択的スプライシング（配列番号１として示す遺伝子の６２４位から７９４位までの欠失に対応する）は配列番号３を生じる。配列番号１として示す遺伝子は、染色体１０番上のクローンＲＰ１１−１０８Ｌ７からのヒトＤＮＡ配列に含まれることが認められた（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＬ１３３２１５）。
【００２７】
ＣｌｕｓｔａｌＸ多重整列ソフトウエア（例えばｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋよりダウンロード可能）を用いた、タンパク質クラスターＩに含まれるヒトポリペプチド（配列番号２、４、６及び８）の整列を表Ｉに示す。ＣｌｕｓｔａｌＸソフトウエアの参照については、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９７）「ＣｌｕｓｔａｌＸウインドウズインターフェイス：クオリティ分析ツールを援用した多重配列整列のための柔軟な戦略（Ｔｈｅ ｃｌｕｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎａｌｓｉｓ ｔｏｏｌｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４８７６−４８８２参照。またＪｅａｎｍｏｕｇｉｎら（１９９８）、「ＣｌｕｓｔａｌＸによる多重配列整列（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｈｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＣｌｕｓｔａｌＸ）」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：４０３−４０５も参照のこと。整列は２つの離れた領域における高度の保存を示し、２つの新規ドメインの存在を示唆した（表Ｉにおいて星印で示した位置参照）。
【００２８】
（ｂ）ＨＭＭ−Ｐｆａｍ
ＨＭＭ−Ｐｆａｍ検索を３つのヒトファミリー成員に関して実施した。Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）はタンパク質ファミリーとドメインの大きなコレクションである。Ｐｆａｍは、これらのファミリーの多重タンパク質整列とプロフィール−ＨＭＭ（プロフィール隠蔽マルコフモデル（Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ））を含む。プロフィール−ＨＭＭは、配列ファミリーのコンセンサス統計的説明を用いて感受性のあるデータベース検索を行うために使用できる。Ｐｆａｍは、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｓａｎｇｅｒ／ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ；及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｒ．ｋｉ．ｓｅ／ＰｆａｍにおいてＷＷＷ上で入手可能である。Ｐｆａｍの最新バージョン（４．３）は１８１５ファミリーを含む。これらのＰｆａｍファミリーはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ ３７及びＴｒＥＭＢＬ９の中のタンパク質の６３％にマッチする。Ｐｆａｍの参照については、Ｂａｔｅｍａｎら（２０００）「Ｐｆａｍタンパク質ファミリーデータベース（Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２６３−２６６；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９８）「Ｐｆａｍ：多重配列整列化とタンパク質ドメインのＨＭＭ−プロフィール（Ｐｆａｍ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｈｍｍ−Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：３２２−３２５；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９８）「Ｐｆａｍ：種子整列に基づくタンパク質ドメインファミリーの包括的データベース（Ｐｆａｍ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｅｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２８：４０５−４２０参照。
【００２９】
ＨＭＭ−Ｐｆａｍ検索は、タンパク質クラスターＩにおいてはこれまでに既知のドメインが全く同定できないことを示した。
【００３０】
（ｃ）ＴＭ−ＨＭＭ
クラスターＩの中のヒトタンパク質を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−１．０において入手可能なＴＭ−ＨＭＭツールを用いて分析した。ＴＭ−ＨＭＭは、膜貫通タンパク質におけるα−ヘリックスの位置と方向をモデリングし、予測する方法である。（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９８）「タンパク質配列内の膜貫通ヘリックスを予測するための隠蔽マルコフモデル（Ａ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、ＩＳＭＢ ６：１７５−１８２）。配列番号２、６及び８として示すタンパク質において膜貫通セグメントを同定した（図１）。
【００３１】
（ｄ）非ヒトオーソローグの分析
Ｃ．エレガンスゲノムは、タンパク質クラスターＩ内のタンパク質をコードする６個の遺伝子を含み、その進化における最も近い祖先である、Ｃ．エレガンスコスミドＴ０４Ｆ８．１に含まれる配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｚ６６５６５；また「線虫Ｃ．エレガンスのゲノム配列：生物学を検討するためのプラットフォーム（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｃ．ｅｌｇａｎｓ：ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｔｈｅ Ｃ．ｅｌｇａｎｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２：２０１２−２０１８も参照のこと。Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８３：３５；２８３：２１０３；及び２８５：１４９３に公表された誤りが掲載されている）は、３個の同定されたヒトタンパク質（配列番号２、６及び８）と５３％同一である。
【００３２】
キイロショウジョウバエゲノムはタンパク質クラスターＩに属する２個の遺伝子を含み、その最も近い類縁（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＥ００３６０６＿２４；Ａｄａｍｓら（２０００）「キイロショウジョウバエのゲノム配列（Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２１８５−２１９５）はヒトタンパク質セットと５３％同一である。
【００３３】
ヒトタンパク質はまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔアクセス番号ＣＡＡ９９４９５．１）に３８％の同一性を示す。かかる酵母タンパク質はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓゲノムデータベースにおいて推定上の輸送体として注釈付けられている（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ４．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＳＧＤ／ｌｏｃｕｓ．ｐｌ？ｌｏｃｕｓ＝ＹＯＲ２７０ｃ）。
【００３４】
２つの公的ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）データベースエントリー（ＧＥＮＢＡＮＫエントリーＡＦ２７６９９７及びＳ７００１１）が推定上のトリカルボン酸輸送タンパク質として注釈付けられている。遺伝子はそれぞれ、配列番号１と８８％及び７９％の同一性を持つ。トリカルボン酸担体は、リンゴ酸又は他のジカルボン酸との電気中性交換においてミトコンドリアの内側の膜を越えてクエン酸又はトリカルボン酸を輸送する（Ａｚｚｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２５：５１５−５２４）。
【実施例３】
【００３５】
発現分析
推定上の偽遺伝子を同定するために、ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって提供されるＥＳＴデータベースを使用してクラスターＩ内のヒトタンパク質が発現されるかどうかを調べた。タンパク質クラスターＩにおいて推定偽遺伝子は同定されなかった。
【００３６】
Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑ（登録商標）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ）を使用してヒト遺伝子の組織分布を検討した。配列番号１として示す核酸分子は、主として神経系と消化器系において発現されることが認められた。配列番号３として示す核酸分子は主として雄性生殖器において発現された。配列番号５として示す核酸分子は主として肝と胚構造において発現された。配列番号７として示す核酸分子は主として免疫系において発現された。それ故、配列番号１、３、５及び７として示す該核酸分子及び配列番号２、４、６及び８として示すポリペプチドは、生物学的試料中に存在する組織又は細胞型の識別同定のため、そして代謝性疾患及び免疫疾患を含めた疾患及び障害の診断のために有用であることが提議される。
【実施例４】
【００３７】
多組織ノーザンブロット法
クラスターＩ内のタンパク質の発現プロフィールのより完全な解析を行うために多組織ノーザンブロット法（ＭＴＮ）を実施する。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ（商標））Ｂｌｏｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍｔｎ）は、多様な異なるヒト、マウス又はラット組織からのＰｒｅｍｉｕｍ Ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡを特徴とするあらかじめ作製されたノーザンブロットである。ＭＴＮ Ｂｌｏｔｓは、種々の組織における転写産物の大きさと相対的存在率を分析するために使用できる。ＭＴＮ Ｂｌｏｔｓはまた、遺伝子ファミリーと選択的スプライシング形態を検討し、交雑種相同性を評価するためにも使用できる。
【実施例５】
【００３８】
マイクロアレイを使用した発現プロファイル作成
マイクロアレイは、遺伝子発現プロファイル作成、比較ゲノム学及び遺伝子型分類を含む適用においてＤＮＡ及びＲＮＡの変異を測定するために使用できる、数千の異なるＤＮＡ配列の高度に整列されたマトリックスから成る（最近の総説については、例えば：Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２０００）「ＤＮＡマイクロアレイを使用した遺伝子発現のモニター（Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（３）２８５−２９１；又はＤｕｇｇａｎら（１９９９）「ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた発現プロファイル作成（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｃＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１：１０−１４参照）。
【００３９】
クラスターＩ内のタンパク質の発現パターンをＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイを用いて解析することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐ＿ｅｘｐ．ｈｔｍｌ）。簡単に述べると、様々な組織からｍＲＮＡを抽出する。Ｔ７標識オリゴｄＴプライマーを用いてそれらを逆転写し、二本鎖ｃＤＮＡを作製する。次にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとビオチニル化ヌクレオチドによるインビトロ転写法（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）を用いてこれらのｃＤＮＡを増幅し、標識する。得られたｃＲＮＡの個体群を精製し、熱によって断片化して、約３５−２００塩基のＲＮＡフラグメントサイズの分布を作製する。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイを試料とハイブリダイズする。アレイを洗浄して染色する。共焦点スキャナーを用いてカートリッジを走査し、画像をＧｅｎｅＣｈｉｐ ３．１ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で解析する。
【実施例６】
【００４０】
タンパク質クラスターＩに結合するポリペプチドの特定
タンパク質クラスターＩと相互作用するタンパク質について検定するために、ツーハイブリッドスクリーニング法を使用することができる。Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｓｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５−２４７によって最初に記述されたツーハイブリッド法は、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための酵母ベースの遺伝子アッセイである。この方法は、相互作用するタンパク質の同定を可能にするだけでなく、これらのタンパク質についてのクローン化された遺伝子を直ちに使用可能にする。
【００４１】
ツーハイブリッド法を使用して、２つの既知のタンパク質（すなわち対応する遺伝子がこれまでにクローン化されているタンパク質）が相互作用するかどうかを決定することができる。ツーハイブリッド法のもう１つの重要な適用は、ツーハイブリッドライブラリーをスクリーニングすることによって標的タンパク質と相互作用するこれまで未知のタンパク質を同定することである。総説については、例えば：Ｃｈｉｅｎら（１９９１）「ツーハイブリッドシステム：目的とするタンパク質と相互作用するタンパク質を同定し、かかるタンパク質についての遺伝子をクローニングするための方法（Ｔｈｅ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｃｌｏｎｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９５７８−９５８２；Ｂａｒｔｅｌ ＰＬ，Ｆｉｅｌｄｓ（１９９５）「ツーハイブリッドシステムを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の分析（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２４１−２６３；又はＷａｌｌａｃｈら（１９９８）「酵母ツーハイブリッドスクリーニング手法及びアポトーシスにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の検討におけるその使用（Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２）：１３１−１３６参照。またｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍａｔｃｈｍａｋｅｒも参照のこと。
【００４２】
ツーハイブリッド法は、２つのタンパク質間の相互作用を示すために転写活性化の回復を使用する。この手法の重要な点は、多くの真核生物転写活性化因子が２つの物理的に離れたモジュラードメイン：特定プロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体にＤＮＡ結合部位の下流の遺伝子の転写を指令する活性化ドメイン（ＡＤ）から成るという事実である。ＤＮＡ−ＢＤとベイトタンパク質Ｘの融合を生成するためにＤＮＡ−ＢＤベクターを使用し、ＡＤともう１つのタンパク質Ｙの融合を生成するためにＡＤベクターを使用する。ベイトタンパク質と相互作用する新しい又は未知のタンパク質を検索するために、ＡＤとのハイブリッドの完全なライブラリーも構築することができる。ベイトタンパク質Ｘと候補タンパク質Ｙの間で相互作用が起こるときには、ＤＮＡ結合と活性化の役割を担う２つの機能的ドメインがつながって、転写活性化の機能回復を生じる。２つのハイブリッドを、適切な上流結合部位を含むレポーター遺伝子を備えた酵母宿主株に同時形質転換する；レポーター遺伝子の発現は、候補タンパク質と標的タンパク質の間の相互作用を示唆する。
【実施例７】
【００４３】
クラスターＩ遺伝子の完全長クローニング
特定ＤＮＡセグメントのインビトロでの酵素的増幅のための周知の手順であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、タンパク質クラスターＩ遺伝子の直接クローニングに使用することができる。組織ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、適切なプラスミドにクローニングして、配列決定することができる。総説については、例えばＨｏｏｆｔ ｖａｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ（１９９８）「ＰＣＲ援用ｃＤＮＡクローニング：鉱脈へのガイド付きツアー（ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｇｕｉｄｅｄ ｔｏｕｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｅｆｉｅｌｄ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：３９０−３９２；Ｌｅｎｓｔｒａ（１９９５）「ライフサイエンスにおけるポリメラーゼ連鎖反応の適用（Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４１：６０３−６１４；又はＲａｓｈｔｃｈｉａｎ（１９９５）「ポリメラーゼ連鎖反応を使用して遺伝子をクローニングし、構築するための新しい方法（Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：３０−３６参照。ＰＣＲ産物の直接クローニングを容易にするために適当な末端を作製するための様々な方法が、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、前出（１５．７章）に述べられている。
【００４４】
タンパク質クラスターＩの完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを単離するための代替的アプローチでは、配列番号１、３、５又は７から成る群より選択されるヌクレオチド配列、又はその部分に対応するＤＮＡフラグメントを、ファージｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングのためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する。プライマーは好ましくは１０−２５ヌクレオチドの長さであり、当業者に周知の手順によって決定される。λファージベクターにクローニングしたｃＤＮＡを含むλファージライブラリーを大腸菌宿主細胞と共に寒天平板に播種して、増殖させる。ファージプラークをナイロン膜に移し、それを上述したように調製したＤＮＡプローブとハイブリダイズする。陽性コロニーを平板から単離する。ｃＤＮＡを含むプラスミドを標準方法によって単離したファージから回収する。プラスミドＤＮＡをクローンから単離する。プラスミドを適切な制限酵素で消化してインサートの大きさを決定する。プラスミドの自動シークエンシングによってインサート全体の配列を決定する。
【実施例８】
【００４５】
真核宿主細胞におけるタンパク質の組換え発現
クラスターＩのタンパク質を生成するために、適当な発現ベクターと標準遺伝子工学手法を用いて、ポリペプチドをコードする核酸分子を適当な宿主細胞において発現させる。例えば、ポリペプチドをコードする配列を市販の発現ベクターにサブクローニングし、標準トランスフェクション試薬を使用して哺乳類、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションする。安定してタンパク質を発現する細胞を選択する。場合によって、標準クロマトグラフィー手法を用いてタンパク質を細胞から精製してもよい。精製を容易にするために、アミノ酸配列の部分に対応する１又はそれ以上の合成ペプチド配列に対する抗血清を惹起し、抗血清を使用してタンパク質をアフィニティー精製する。
【実施例９】
【００４６】
遺伝子機能の決定
個々の遺伝子の生物学的機能又は作用機構を明らかにするための方法は当該技術において既知である。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、クローン化した遺伝子を特異的且つ強力に不活性化する方法を提供し、遺伝子機能を検討するための強力なツールを提供する。総説については、例えばＦｉｒｅ（１９９９）「ＲＮＡが引き金となる遺伝子休止化（ＲＮＡ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：３５８−３６３；又はＫｕｗａｂａｒａ ＆ Ｃｏｕｌｓｏｎ（２０００）「ＲＮＡｉ−遺伝子機能を決定するための一般的手法への期待（ＲＮＡｉ−ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １６：３４７−３４９参照。内因性ｍＲＮＡのセンス及びアンチセンス配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入すると、コグネイトｍＲＮＡは分解され、遺伝子は休止化する。この種の転写後遺伝子休止化（ＰＴＧＳ）はＣ．エレガンスにおいて最初に発見された（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡ干渉は最近、Ｃ．エレガンス染色体Ｉ番上の予測遺伝子のほぼ９０％（Ｆｒａｓｅｒら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０８：３２５−３３０）及びＣ．エレガンス染色体ＩＩＩ番上の予測遺伝子の９６％（Ｇｏｎｃｚｙら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０８：３３１−３３６）をターゲティングするために使用された。
【００４７】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】配列番号２として示すタンパク質において同定された膜貫通領域。
【図１ｂ】配列番号８として示すタンパク質において同定された膜貫通領域。
【図１ｃ】配列番号６として示すタンパク質において同定された膜貫通領域。
Claims (8)
- （ａ）配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）に定義された核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子；及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に定義されたヌクレオチド配列の遺伝子コードの縮重の結果である核酸配列を含む核酸分子
から選択される単離核酸分子。 - 請求項１に記載の核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド。
- 配列表において配列番号２、４、６又は８として示されるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
- 請求項１に記載の核酸分子を備えるベクター。
- 請求項１に記載のヌクレオチド配列を担い、その発現を仲介することができる複製可能な発現ベクター。
- 請求項４又は５に記載のベクターを備える培養宿主細胞。
- ポリペプチドが産生される条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドの生産のための方法。
- （ｉ）該核酸分子を含む細胞を提供すること、
（ｉｉ）該細胞を候補物質と接触させること、および
（ｉｉｉ）該候補物質の不在下では存在しない作用に関して該細胞をモニターする
ことを含む請求項１に記載の核酸分子を調節することができる物質を特定するための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0004325A SE0004325D0 (sv) | 2000-11-24 | 2000-11-24 | Protein cluster I |
| PCT/SE2001/002581 WO2002042324A1 (en) | 2000-11-24 | 2001-11-22 | Gene encoding protein cluster i and the encoded protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004522425A true JP2004522425A (ja) | 2004-07-29 |
Family
ID=20281961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002544457A Pending JP2004522425A (ja) | 2000-11-24 | 2001-11-22 | タンパク質クラスターｉをコードする遺伝子及びコードされるタンパク質 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1335934A1 (ja) |
| JP (1) | JP2004522425A (ja) |
| AU (1) | AU2002218593A1 (ja) |
| SE (1) | SE0004325D0 (ja) |
| WO (1) | WO2002042324A1 (ja) |
-
2000
- 2000-11-24 SE SE0004325A patent/SE0004325D0/xx unknown
-
2001
- 2001-11-22 WO PCT/SE2001/002581 patent/WO2002042324A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-11-22 JP JP2002544457A patent/JP2004522425A/ja active Pending
- 2001-11-22 EP EP01997502A patent/EP1335934A1/en not_active Withdrawn
- 2001-11-22 AU AU2002218593A patent/AU2002218593A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE0004325D0 (sv) | 2000-11-24 |
| WO2002042324A1 (en) | 2002-05-30 |
| AU2002218593A1 (en) | 2002-06-03 |
| EP1335934A1 (en) | 2003-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4472173B2 (ja) | ５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク（ｆｌａｐ）のゲノム配列、その多型マーカーおよび喘息の検出方法 | |
| JP2001269182A (ja) | 配列タグおよびコードされたヒトタンパク質 | |
| WO2001000669A2 (en) | A bap28 gene and protein | |
| WO2001000803A2 (en) | Apolipoprotein a-iv-related protein: polypeptide, polynucleotide sequences and biallelic markers thereof | |
| WO2000022122A2 (en) | Genes, proteins and biallelic markers related to central nervous system disease | |
| US6835556B2 (en) | Protein cluster V | |
| AU2002233573B2 (en) | Schizophrenia-related voltage-gated ion channel gene and protein | |
| EP1165836A2 (en) | Schizophrenia associated genes, proteins and biallelic markers | |
| US6555316B1 (en) | Schizophrenia associated gene, proteins and biallelic markers | |
| AU2002233573A1 (en) | Schizophrenia-related voltage-gated ion channel gene and protein | |
| JP2004522425A (ja) | タンパク質クラスターｉをコードする遺伝子及びコードされるタンパク質 | |
| US20050096269A1 (en) | Protein Cluster II | |
| JP2004518424A (ja) | タンパク質クラスターｉｉ | |
| JP2002517242A (ja) | 前立腺癌腫瘍抗原−１（ｐｃｔａ−１）の多型マーカー | |
| US20020165182A1 (en) | Gene encoding Protein Cluster I and the encoded protein | |
| AU2002249749A1 (en) | Protein cluster V | |
| EP1377603A1 (en) | Protein cluster v | |
| Tunnicliffe et al. | Comparative analysis of the PCOLCE region in Fugu rubripes using a new automated annotation tool | |
| CA2388205A1 (en) | Schizophrenia associated gene, proteins and biallelic markers | |
| WO2000063375A1 (en) | Dna encoding a kinesin-like protein (hklp) comprising biallelic markers | |
| Agenda | Identification of Transcribed Sequences: Functional and Expression Analysis | |
| AU2008202192B9 (en) | Variants and exons of the glyt1 transporter | |
| WO2003010196A2 (en) | Variants and exons of the glyt1 transporter | |
| AU2002324283A1 (en) | Variants and exons of the GlyT1 transporter | |
| WO2003089466A1 (fr) | Nouvelles proteines et adn codant de celles-ci |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041119 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070717 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071218 |