JP2004520262A - Ｈｉｖ−１ワクチン及びそのスクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質Ｖ２領域欠失がある、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片又は修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片をコードしているＤＮＡを用いた、動物、好ましくはヒトにおいてＨＩＶ−１に対する異種免疫応答を惹起させるための免疫方法、及び免疫原医薬組成物を提供する。異種ＨＩＶ−１株に対する体液性応答が得られる。
Description
【０００１】
発明の背景
ＤＮＡ免疫化によって、免疫系の細胞性アームと体液性アームの双方が刺激される（Ｌｉｕ， Ｍ． Ａ．， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｓ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｄ． Ｃ． Ｆｒｅｅｄ， Ｎ． Ｌ． Ｌｅｔｖｉｎ ＆ Ｊ． Ｗ． Ｓｈｉｖｅｒ． １９９６． Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ＨＩＶ−ｇｅｎｅ−ｇｕｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ， ｖｏｌ． ４８． Ｋａｒｇｅｒ， Ｓ， Ｂａｓｅｌ； Ｓｈｉｖｅｒ， Ｊ． Ｗ．， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｄ． Ｃ． Ｆｒｅｅｄ， ＆ Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ． １９９６． Ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＨＩＶ−１ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８５：１３１７−１３２４； Ｓｈｉｖｅｒ， Ｊ． Ｗ．， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｄ． Ｃ． Ｆｒｅｅｄ ＆ Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ． １９９５． Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＨＩＶ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． ７７２：１９８−２０８； Ｓｈｉｖｅｒ， Ｊ． Ｗ．， Ｊ． Ｂ． Ｕｌｍｅｒ， Ｊ． Ｊ． Ｄｏｎｎｅｌｙ ＆ Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ． １９９６． Ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ２１：１９−３１−１８）とともにチンパンジーにおけるＨＩＶ−１のように徐々に複製するウイルスによって動物の感染を予防できる免疫応答が惹起する（Ｂｏｙｅｒ， Ｊ． Ｄ．， Ｋ． Ｅ． Ｕｇｅｎ， Ｂ． Ｗａｎｇ， Ｍ． Ａｇａｄｊａｎｙａｎ， Ｌ． Ｇｉｌｂｅｔ， Ｍ． Ｌ． Ｂａｇａｒａｚｚｉ， Ｍ． Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ， Ｐ． Ｆｒｏｓｔ， Ａ． Ｊａｖａｄｉａｎ， Ｗ． Ｖ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｙ． Ｒｅｆａｅｌｉ， Ｒ． Ｂ． Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ， Ｄ． ＭｃＣａｌｌｕｓ， Ｌ． Ｃｏｎｅｙ ＆ Ｄ． Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ． １９９７． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ＨＩＶ−１ ｃｈｌｌｅｎｇｅ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ３：５２６−５３２）。
【０００２】
しかしながら、攻撃ウイルスがサルにおけるＳＩＶ又はＳＨＩＶのようにホストにおいて効率よく複製する場合、ＤＮＡ惹起免疫応答は部分的防御しか与えない（Ｂｏｙｅｒ， Ｊ． Ｄ．， Ｂ． Ｗａｎｇ， Ｋ． Ｅ． Ｕｇｅｎ， Ｍ． Ａｇａｄｊａｎｙａｎ， Ａ． Ｊａｖａｄｉａｎ， Ｐ． Ｆｒｏｓｔ， Ｋ． Ｄａｎｇ， Ｒ． Ａ． Ｃａｒｒａｎｏ， Ｒ． Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ， Ｌ． Ｃｏｎｅｙ， Ｗ． Ｖ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｄ． Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ． １９９６． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｏｍａｔｏｌ． ２５：２４２−２５０； Ｌｕ， Ｓ．， Ｊ． Ａｒｔｈｏｓ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｋ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｆ． Ｍｕｓｔａｆａ， Ｅ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ． Ｃ． Ｓａｎｔｏｒｏ， Ｊ． Ｗｉｓｓｉｎｋ， Ｊ． Ｉ． Ｍｕｌｌｉｎｓ， Ｊ． Ｒ． Ｈａｙｎｅｓ， Ｎ． Ｌ． Ｌｅｔｖｉｎ， Ｍ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９６． Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｒｉａｌ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：３９７８−３９９１； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｒ． Ｐ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｈ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． Ｋａｌｉｓｈ， Ｊ． Ｄ． Ｌｉｆｓｏｎ， Ｔ． Ａ． Ｒｉｚｖｉ， Ｓ． Ｌｕ， Ｓ． Ｌ． Ｈｕ， Ｇ． Ｐ． Ｍａｚｚａｒａ， Ｄ． Ｌ． Ｐａｎｉｃａｌｉ， Ｊ． Ｇ． Ｈｅｒｄｏｎ， Ｒ． Ｇｌｉｃｋｍａｎ， Ｍ． Ａ． Ｃａｎｄｉｄｏ， Ｓ． Ｌ． Ｌｙｄｙ， Ｍ． Ｓ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｍ． ＭｃＣｌｕｒｅ． １９９９． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ５：５２６−３４）。
【０００３】
これらの応答の強さ、特に高抗ＨＩＶ／ＳＩＶエンベロープ抗体力価の産生を高めるために、ＨＩＶ／ＳＩＶエンベロープを発現する可溶性ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス粒子又は組換えワクシニア系ウイルスの継続投与が必要である（Ａｇａｄｊａｎｙａｎ， Ｍ． Ｇ．， Ｎ． Ｎ． Ｔｒｉｖｅｄｉ， Ｓ． Ｋｕｄｃｈｏｄｋａｒ， Ｍ． Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｗ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ａ． Ｌｉｎ， Ｊ． Ｂｏｙｅｒ， Ｄ． Ｌｅｖｙ， Ｋ． Ｅ． Ｕｇｅｎ， Ｊ． Ｊ． Ｋｉｍ ＆ Ｄ． Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ． １９９７． Ａｎ ＨＩＶ ｔｙｐｅ ２ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ ｔｙｐｅ ２ ａｎｄ ＳＩＶ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． １３：１５６１−１５７２； Ｂａｒｎｅｔｔ， Ｓ． Ｗ．， Ｊ． Ｍ． Ｋｌｉｎｇｅｒ， Ｂ． Ｄｏｅ， Ｃ． Ｍ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｌ． Ｈａｎｓｅｎ， Ａ． Ｍ． Ｄｕｌｉｅｇｅ ＆ Ｆ． Ｍ． Ｓｉｎａｎｇｉｌ． １９９８． Ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． １４ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ２９９−３０９； Ｌｅｔｖｉｎ， Ｎ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｃ． Ｌｅｋｕｔｉｓ， Ｍ． Ａｌｒｏｙ， Ｄ． Ｌ． Ｆｒｅｅｄ， Ｃ． Ｉ． Ｌｏｒｄ， Ｌ． Ｋ． Ｈａｎｄｔ， Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ ＆ Ｊ． Ｗ． Ｓｈｉｖｅｒ． １９９７． Ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｂｉｍｏｄａｌ ＨＩＶ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：９３７８−９３８３；
【０００４】
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｊ． Ｆ．， Ｓ． Ｌｕ， Ｊ． Ｃ． Ｓａｎｔｏｒｏ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｓ． Ｌ． Ｈｕ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９８． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ Ｅｎｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｏｏｓｔｉｎｇ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７２：９０９２−１００； Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｊ． Ｆ． Ｌ．， Ｍｕｓｔａｆａ， Ｓ． Ｌｕ， Ｊ． Ｃ． Ｓａｎｔｏｒｏ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｍ． Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｅ． Ｍ． Ｆｅｎｙｏ， Ｊ． Ｌ． Ｈｕｒｗｉｔｚ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９７． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒａｉｓｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｉｎｇ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２３０：２６５−２７４； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｒ． Ｐ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｈ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． Ｋａｌｉｓｈ， Ｊ． Ｄ． Ｌｉｆｓｏｎ， Ｔ． Ａ． Ｒｉｚｖｉ， Ｓ． Ｌｕ． Ｈｕ， Ｇ． Ｐ． Ｍａｚｚａｒａ， Ｄ． Ｌ． Ｐａｎｉｃａｌｉ， Ｊ． Ｇ． Ｈｅｒｎｄｏｎ， Ｒ． Ｇｌｉｃｋｍａｎ， Ｍ． Ａ． Ｃａｎｄｉｄｏ， Ｓ． Ｌ． Ｌｙｄｙ， Ｍ． Ｓ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｍ． ＭｃＣｌｕｒｅ， １９９９． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｉｎｇｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ５：５２６−３４）。
【０００５】
この２頂免疫化方法によってアカゲザル（Ｒｈ）をＳＨＩＶによる感染から防御できる応答が惹起する（Ｌｅｔｖｉｎ， Ｎ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｃ． Ｌｅｋｕｔｉｓ， Ｍ． Ａｌｒｏｙ， Ｄ． Ｌ． Ｆｒｅｅｄ， Ｃ． Ｉ． Ｌｏｒｄ， Ｌ． Ｋ． Ｈａｎｄｔ， Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ ＆ Ｊ． Ｗ． Ｓｈｉｖｅｒ． １９９７． Ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｂｉｍｏｄａｌ ＨＩＶ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：９３７８−９３８３； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｒ． Ｐ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｈ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． Ｋａｌｉｓｈ， Ｊ． Ｄ． Ｌｉｆｓｏｎ， Ｔ． Ａ． Ｒｉｚｖｉ， Ｓ． Ｌｕ， Ｓ． Ｌ． Ｈｕ， Ｇ． Ｐ． Ｍａｚｚａｒａ， Ｄ． Ｌ． Ｐａｎｉｃａｌｉ， Ｊ． Ｇ． Ｈｅｒｎｄｏｎ， Ｒ． Ｇｌｉｃｋｍａｎ， Ｍ． Ａ． Ｃａｎｄｉｄｏ， Ｓ． Ｌ． Ｌｙｄｙ， Ｍ． Ｓ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｍ． ＭｃＣｌｕｒｅ． １９９９． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ５：５２６−３４）。しかしながら、上記ワクチン接種方法で細胞性抗ウイルス応答も体液性抗ウイルス応答も共に生じたことから、記録された防御がＤＮＡ免疫化で惹起された細胞性抗ウイルス応答及び／又は体液性抗ウイルス応答で仲介されたかははっきりしない。これらの２つのタイプの応答のそれぞれの抗ウイルス防御の役割を評価比較することにより、より効果的なＤＮＡ免疫化プロトコールを開発することができる。
【０００６】
ｇｐ１２０ ＨＩＶエンベロープサブユニットの結晶構造の解析から、オリゴマーエンベロープ形の中に自然に閉鎖されているタンパク質の１つの面に中和エピトープが主としてクラスター形成されていること、即ち、ビリオンや感染細胞の表面上に存在していることが示された（Ｋｗｏｎｇ， Ｐ． Ｄ．， Ｒ． Ｗｙａｔｔ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｒ． Ｗ． Ｓｗｅｅｔ， Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ ＆ Ｗ． Ａ． Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ． １９９８． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ＨＩＶ ｇｐ１２０ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＤ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３９３：６４８−６５９； Ｗｙａｔｔ， Ｒ．， Ｐ， Ｄ． Ｋｗｏｎｇ， Ｅ． Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ， Ｒ． Ｗ． Ｓｗｅｅｔ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｗ． Ａ． Ｈｅｎｄｒｉｃｋｅｓｏｎ ＆ Ｊ． Ｇ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９８， Ｔｈｅ ａｔｉｇｅｎｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ ｇｐ１２０ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３９３：７０５−７１１）。
【０００７】
これらの構造上の所見は、多くの免疫化学実験とウイルス学的実験によって支持されている（Ｂｏｕ−Ｈａｂｉｂ， Ｄ． Ｃ．， Ｇ． ｒｏｄｅｒｉｑｕｅｚ， Ｔ． Ｏｒａｖｅｓｚ， Ｐ． Ｗ． Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ． Ｌｕｓｓｏ ＆ Ｍ． Ａ． Ｎｏｒｃｒｏｓｓ． １９９４． Ｃｒｙｐｔｉｃ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｖ３ ｒｅｇｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｎｏｃｙｔｏｔｒｏｐｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：６００６−６０１３； Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｐ．， Ｊ． Ａ． ＭｃＫｅａｔｉｎｇ， Ｙ． Ｈｕａｎｇ， Ａ． Ａｓｋｅｎａｚｉ ＆ Ｄ． Ｄ． Ｈｏ． １９９２． Ｖｉｒｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４（ｓＣＤ４） ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｓＣＤ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｐ１２０ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓＣＤ４−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２３５−２４３； Ｒｅｉｔｔｅｒ， Ｊ． Ｎ．， Ｒ． Ｅ． Ｍｃａｎｓ ＆ Ｒ． Ｃ． Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ． １９９８． Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｉｎ ＡＩＤＳ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４：６７９−６８４； Ｓａｔｔｅｎｔａｕ， Ｑ． Ｊ． ＆ Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ． １９９１． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：４０７−４１５； Ｓａｔｔｅｎｔａｕ， Ｑ． Ｊ．， Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ， Ｆ． Ｖｉｇｎａｕｘ， Ｆ． Ｔｒａｉｎｃａｒｄ ＆ Ｐ． Ｐｏｉｇｎａｒｄ． １９９３． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：７３８３−７３９３；
【０００８】
Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８； Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｎ． Ｙ． Ｓｕｎ， Ｊ． Ｌｉ， Ｗ． Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９５． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｐａｓｓａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：４４１３−４４２２； Ｗｙａｔｔ， Ｒ．， Ｊ． Ｍｏｏｒｅ， Ｍ． Ａｃｃｏｌａ， Ｅ． Ｄｅｓｊａｒｄｉｎ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９５． Ｉｎｖｏｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｖ１／Ｖ２ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｐ１２０ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５７２３−５７３３； Ｗｙａｔｔ， Ｒ．， Ｎ． Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｍ． Ｔｈａｌｉ， Ｈ． Ｒｅｐｋｅ， Ｄ． Ｈｏ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｍ． Ｐｏｓｎｅｒ ＆ Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９３． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４５５７−４５６５）。
本発明は、ＨＩＶ−１に対して有効なワクチン接種のエンハンスメントに関する。
本明細書中の文献の引用は、そのような文献が本発明の従来技術として用いうることを許容するものとして判断すべきではない。
【０００９】
発明の要約
本発明によれば、動物においてＨＩＶ−１に対する異種免疫応答を惹起させる方法であって、該動物を少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又は少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルス、又はその組合わせで免疫し、該修飾エンベロープタンパク質にはＨＩＶ−１エンベロープタンパク質Ｖ２領域欠失があることによる、前記方法が提供される。修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、哺乳動物細胞において発現した断片の組換えタンパク質であってもよい。好ましくは、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片はグリコシル化されている。免疫された動物は、免疫原以外の少なくとも１種のＨＩＶ−１株に対して免疫応答を示している。好適実施態様においては、免疫応答は体液性応答を含んでいる。更に好適な実施態様においては、体液性応答には中和抗体が含まれ、最も好適な実施態様においては防御抗体が含まれている。好ましくは、動物はヒトである。
【００１０】
限定されない例においては、免疫原は、クレードＢ ＨＩＶ−１株由来の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又はクレードＢ ＨＩＶ−１株由来の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡ又はウイルス又はその断片を含んでいる。好適実施態様においては、ＨＩＶ−１株はＳＦ１６２である。一例として、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片は、配列番号２又は配列番号４であり、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡは配列番号１又は配列番号３である。
【００１１】
本発明の他の広範囲態様においては、動物をＨＩＶ−１ウイルスに対して免疫するために、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質Ｖ２領域欠失がある、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又は少なくとも１種の該修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルス、又はその組合わせの異種免疫応答惹起有効量と、薬学的に許容しうる担体又は賦形剤とを含むワクチン医薬組成物が提供される。修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片は、哺乳動物細胞中で発現させることができる。グリコシル化されていてもよい。実施態様においては、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片はクレードＢ ＨＩＶ−１株由来である。好適実施態様においては、ＨＩＶ−１株はＳＦ １６２である。限定されない例としては、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片は配列番号２又は配列番号４であり、少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡは配列番号１又は配列番号３である。動物を前述のワクチン医薬組成物で免疫化又はワクチン接種すると、ＨＩＶ−１に対する異種免疫応答が惹起される。応答は、体液性応答を含んでいる。実施態様においては、体液性応答は中和抗体を含んでいる。好適実施態様においては、惹起された抗体は防御抗体である。
【００１２】
本発明は、また、化合物が動物において少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対して少なくとも中和抗体を産生させることができるかを評価する方法であって、該動物を化合物で免疫する段階と、該動物のＣＤ８＋ 細胞を枯渇させる段階と、該動物について少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対する中和抗体、好ましくは防御抗体の存在をスクリーニングする段階とを含む、前記方法に関する。好適実施態様においては、枯渇させる段階は、前記動物に抗ＣＤ８モノクローナル抗体を投与することにより行われる。化合物は、ＨＩＶ−１由来ポリぺプチド又はその断片又は該ぺプチド又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスであってもよく、その免疫原は、ウイルス又はＤＮＡワクチン、タンパク質、又はその組合わせを含んでいる。その防御抗体は、好ましくは中和抗体であり、最も好ましくは防御抗体である。防御抗体を検出するための動物は野生型ＨＩＶ−１又はＳＨＩＶ株、又は野生型ＨＩＶ−１又はＳＨＩＶ−１に対して防御抗体応答できるもので感染可能なものである。
本発明は、更に、上記のタンパク質、タンパク質断片、該タンパク質又はタンパク質断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスを作製する方法に関する。好ましくは、タンパク質免疫原は哺乳動物細胞中で発現し、それ故グリコシル化されている。
本発明のこれらの、また、他の態様は、次の図面と詳細な説明によってよく理解されるであろう。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、Ｖ２（二次高頻度可変）領域に欠失がある修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を用いた動物免疫化によって抗ＨＩＶ−１エンベロープ特異的免疫応答の一部として強力な中和抗体が惹起されるという驚くべき発見をなした。更に、免疫応答は免疫原エンベロープタンパク質の野生型に対するだけでなく、免疫原が由来するクレードの内外の他のＨＩＶ−１ウイルスに対するものである。この強力な異種免疫応答、特に強い体液性応答は、ＨＩＶ感染症の予防と治療に他の免疫療法の中でもワクチン接種の新しい手段を与えるものである。本発明は、Ｖ２領域に欠失がある１種以上のエンベロープタンパク質又はその断片を含む両ＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン又はタンパク質ワクチン、及びその使用方法に関する。
【００１４】
限定されない実施態様においては、免疫化はＶ２領域に欠失があるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスで行うことができる。下記の実施例に記載されるように、Ｖ２高頻度可変領域に部分的欠失が含まれるＨＩＶ−１株ＳＦ１６２（クレードＢ）由来の修飾ｇｐ１４０エンベロープタンパク質を発現できるＤＮＡベクターを調製した。この場合、ＤＮＡとタンパク質配列の最初の２７ Ｎ末端アミノ酸（８１ヌクレオチド）はそれぞれ発現しなかった。ＳＦ１６２の修飾ｇｐ１４０のこれらのＤＮＡ断片とタンパク質断片は、それぞれ配列番号３と配列番号４に示されている。対応する全長配列の配列番号１と配列番号２は、それぞれ同じ目的に用いられる。サルのＤＮＡ免疫化によって強力な中和抗体を含む免疫応答が惹起された。ＣＤ８＋ Ｔリンパ球が枯渇し、ＳＨＩＶ１６２Ｐ４で攻撃した場合、ワクチン接種した動物は、免疫されていない対照動物と比べて、ウイルス血症ピークが低く、血漿からのウイルスクリアランスが速く、血清変換が遅かった。これらの結果から、本発明の免疫原による強力な防御体液性応答の惹起が証明される。更に、上記のように、いくつかの異種ＨＩＶ−１株に対する交差中和反応性が見られ、ＨＩＶ−１株に対する普遍的免疫応答を惹起するのにＶ２欠失免疫原の有用性が支持された。免疫したウサギにおいては、修飾（Ｖ２欠失）免疫原は、同種親ＳＦ１６２ウイルスに対して、いくつかの異種ＨＩＶ−１分離物に対しても中和抗体を惹起する点で更に有効である。サルにおいては、修飾免疫原は異種分離物に対してのみ中和抗体を惹起できた。
【００１５】
本発明は、ＤＮＡ、ウイルス、タンパク質、その組合わせのような免疫化のタイプ或いはプロトコール、又は本明細書に記載された免疫原の少なくとも１種のほかに１種以上のアジュバント、又は材料の組合わせを用いた免疫化のタイプ或いはプロトコール、及び免疫原としてＶ２（二次高頻度可変）ループ（本明細書ではＶ２ドメイン又はＶ２領域とも同じ意味で言われる）に欠失を含んでいるＨＩＶ−１ウイルスエンベロープタンパク質をコードしているタンパク質又はＤＮＡを用いた免疫化プロトコールに関する。本明細書に記載されるタンパク質、ＤＮＡ又はウイルス免疫原においてＶ２領域内の欠失に対するＨＩＶ−１エンベロープタンパク質候補の野生型配列はｈｔｔｐ：／／ｉｄｉｏｔｙｐｅ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／で見ることができ、そのような配列はすべて免疫原の調製の出発配列として全体で本明細書に含まれるものとする。そのような免疫原の１つ又は組合わせを共に用いることができる。更に、本発明の修飾（即ち、Ｖ２ループ欠失含有）エンベロープタンパク質又は本発明の修飾エンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡの他の種々の修飾は、本発明を逸脱することなく行うことができる。例えば、修飾タンパク質の未変性エンベロープリーターをコードしているＤＮＡ又はウイルスヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞において高いタンパク質発現のために、例えば、ヒト組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子のシグナルぺプチドで置き換えることができる。
【００１６】
他のシグナルぺプチドも用いることができる。他の実施態様においては、修飾タンパク質の一部又はそのエンコーディングＤＮＡ配列の端を切り取って中和体液性応答を生じるための免疫原を得ることができ、そのような修飾は本明細書に十分に含まれる。好ましくは、断片は修飾タンパク質又は修飾タンパク質をコードしているＤＮＡ又はウイルスのＮ末端で切断され、切断は１個〜約３０個のアミノ酸であるが、そのように限定されず、本明細書に記載される免疫学的性質を有する免疫原を与える他の切断も含まれる。更に、本明細書の例に示されるように哺乳動物細胞におけるＤＮＡ構築物の発現によって、図１６と図１７に示されるアスパラギン残基でグリコシル化されたグリコシル化タンパク質が得られ、本明細書に含まれるタンパク質免疫原組成物にはグリコシル化型のタンパク質も含まれる。従って、Ｖ２ループドメインに欠失を共通して含んでいる本発明のタンパク質やＤＮＡの免疫原の態様の前述の限定されない例は、フレーズ修飾タンパク質又はその断片、又は修飾タンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスにより包含されている。
【００１７】
Ｖ２ドメインは、ＨＩＶエンベロープのｇｐ１２０サブユニットの高頻度可変領域の１つである。グリコシル化の長さ（アミノ酸の数）と程度はＨＩＶ分離物の間で変動する。ＳＦ１６２ウイルスの場合には、Ｖ２ループは４０個のアミノ酸を含んでいる。本発明の実験では、３０個のアミノ酸がＶ２ループの中央領域から除去され、ＧＡＧトリぺプチドで置き換えられた。当業者はこの株のＶ２ドメインに他の欠失、又は他の株のＶ２領域に欠失をつくることができ、それらは本発明の範囲と真意から逸脱することなく、同じ免疫応答惹起特性を示し、そのような特性を容易に評価することができる。本明細書に用いられる“ΔＶ２”の略号はＶ２ドメインの部分的又は全部の欠失を意味する。ＨＩＶ−１のＶ２ドメインの詳細な説明は、Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ｅｆｆｅｃｔ ｆｏ ｍａｊｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１ ａｎｄ Ｖ２ ｌｏｏｐｓ ｏｆ ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｅｌｌ−ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１１２９−１１３９に見出すことができ、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【００１８】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含んでいる修飾タンパク質又は修飾タンパク質をコードしているＤＮＡを調製することができ、Ｖ２領域での欠失を行うことができる限定されない手段は、上記論文又はＳｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｆｏｌ． ７２：７８４０−７８４５に記載されているものである。限定されない例として、ＨＩＶ−１ ＳＦ１６２（クレードＢ ＨＩＶ−１）のエンベロープタンパク質の修飾Ｖ２欠失を調製することができ、ＤＮＡとタンパク質の配列はそれぞれ配列番号１と配列番号２に示される。しかしながら、他のクレードＢ ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質も同様に修飾することができ、タンパク質又はタンパク質をコードしているＤＮＡを免疫原として用いることができる。また、他のＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を用いることもできる。ＨＩＶ−１タンパク質の選択とそれらのエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｉｄｉｏｔｙｐｅ／ｌａｎｌ．ｇｏｖ／でアクセスできるロスアラモスナショナルラボラトリーズＨＩＶ配列データベースのような文献に見ることができる。本発明は、本明細書の目的のＤＮＡ又はタンパク質免疫原の調製のためにＶ２領域内の欠失の候補としてこれらの及び他のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含んでいる。
【００１９】
Ｖ２ドメイン内に欠失のあるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、及びタンパク質をコードしているウイルスを含んでいるエンコーディングＤＮＡを調製するために分子生物学標準法を用いることができ、本明細書の本発明は免疫原を調製する方法について制限されない。本明細書に用いられるＤＮＡワクチンという用語には、上記タンパク質をコードしているＤＮＡを含んでいるウイルスワクチンが含まれている。そのような方法は当該技術において周知である。本明細書に示されるように、当業者は動物において異種ＨＩＶ−１免疫応答を惹起する本発明のＤＮＡ又はタンパク質免疫原の能力を容易に求め得る。ＳＦ１６２クレードＢ ＨＩＶ−１ウイルス株の限定されない例においては、アミノ酸Ｔ１６０〜Ｙ１８９の３０アミノ酸欠失が調製され、欠失した配列はＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙトリぺプチドで置き換えられる。欠失した配列の上記トリぺプチド、又は短いぺプチドによる置換は必要でないが便宜上行うことができる。
異種ウイルス免疫応答を高めることができる動物は、ＨＩＶ−１感染症又は関連したウイルスに感受性のある動物である。そのような動物には、ヒト、非ヒト霊長類、又は他の哺乳動物が含まれるがこれらに限定されない。ヒトの場合、本発明の方法はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２等について、非ヒト霊長類においてはＳＨＩＶ−１について行うことができる。
【００２０】
本発明は、ＨＩＶ−１ウイルスに対して動物を免疫するために提供されるワクチン医薬組成物であって、Ｖ２領域欠失がある、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、少なくとも１種の該修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ、又はその組合わせの異種免疫応答惹起有効量と、薬学的に許容しうる担体又は賦形剤とを含む、前記組成物に関する。本明細書に同じ意味で用いられる免疫原は、Ｖ２域領域が異種免疫応答を惹起するのであれば、全長又は切断型の修飾タンパク質又は修飾タンパク質をコードしているＤＮＡであってもよい。有効な免疫原の種々の選択は上に記載されている。実施態様においては、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片は、クレードＢ ＨＩＶ−１株に由来する。好適実施態様においては、ＨＩＶ−１株はＳＦ１６２である。限定されない例として、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片は配列番号２又は配列番号４であり、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片をコードしているＤＮＡは配列番号１又は配列番号３である。哺乳動物細胞において発現されるタンパク質又は断片のグリコシル化も提供される。
【００２１】
ワクチン医薬組成物は、ワクチンの投与を容易にするために、１種以上のＤＮＡ又はタンパク質免疫原を１種以上の薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に含むことができる。更に、１種以上のアジュバントのような追加成分を免疫応答を高めるために含めることができる。アジュバントの選択は、免疫すべき動物、特に適切なアジュバントの選択が制限されるヒトにおいて左右される。当業者は、所望効果を得るために免疫原とともに含められる適切な医薬的に許容しうる成分を選択することができる。
本発明の目的は、更に、免疫原のような化合物がＨＩＶ−１の異種株に対して防御抗体を産生させることができるかを評価する方法を提供することである。該方法は、免疫原で動物を免疫し、該動物のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を枯渇させ、次に該動物について少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対して少なくとも防御抗体の存在、好ましくは防御抗体の存在をスクリーニングすることにより行われる。枯渇させる段階は動物に抗ＣＤ８モノクローナル抗体を投与することにより行ってもよい。化合物は、ＨＩＶ−１由来ポリぺプチド又はその断片、例えば、ＨＩＶ由来ポリぺプチド又はその断片をコードしているＤＮＡワクチンであってもよいがそれに限定されない。免疫化プロトコールは、ＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン、タンパク質、その断片、その組合わせ、又は一方又は双方を免疫応答を誘発させるために連続して投与するプロトコールを含むことができる。限定されない実施態様においては、中和抗体は防御抗体である。防御抗体の惹起を評価する方法は、ＨＩＶに対する防御抗体を産生できる動物、例えば、霊長類又は他の動物において行うことができるが、そのように限定されない。上記のように前述の方法は本発明のＤＮＡ及び／又はタンパク質免疫原の有効性を評価するために用いることもできる。
【００２２】
下記の実施例に記載されるように、ΔＶ２免疫原でワクチン接種した動物において最低レベルの血漿ピークのウイルス血症を記録し、血清が攻撃の日にＳＨＩＶ１６２Ｐ４に対して最強の中和活性を有したという所見は、中和抗体が攻撃後の最初の７日間に防御の重要な役割を果たしたことを意味している。ＳＨＩＶ１６２Ｐ４攻撃直後に強い抗ＨＩＶエンベロープ既往応答が生じたという事実は、抗体が検出不可能なレベルまで急速なウイルスクリアランスに寄与したことを意味する。しかしながら、攻撃７日後にワクチン接種した動物の末梢にＣＤ８＋リンパ球が再び現れたことから、それらも急速なウイルスクリアランスに寄与することができた。
更に、本発明の実験により、異種免疫応答と言われる免疫原が調製されたものと異なるクレードのＨＩＶ−１に対して免疫応答が示される。
これらの実験は、非ＣＤ８仲介ＤＮＡベースワクチン誘発抗ＨＩＶエンベロープ応答の防御の重要な役割を強調するものでありかつＨＩＶ感染症の予防と治療のヒト使用に有効な抗ＨＩＶワクチンを開発する実行可能性を証明するものである。上記のように、ΔＶ２ループ欠失のある修飾エンベロープタンパク質を用いる戦略は、Ｖ２ループをもつエンベロープタンパク質に用いることができる戦略であり、本発明はすべてのその使用、及び免疫応答を惹起するためのΔＶ２ループ欠失修飾タンパク質又はＤＮＡワクチン、又はその組合わせを含む医薬組成物を含んでいる。
【００２３】
本明細書に記載される実験においては、関連の中和耐性（ＳＦ１６２）ウイルスと中和感受性（ＳＦ１６２ΔＶ２）ウイルスとに由来する可溶性オリゴマーｇｐ１４０エンベロープタンパク質間で免疫原性を比較した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ， ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８， Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）。２つの免疫原の唯一の差はＳＦ１６２ΔＶ２由来免疫原のＶ２ループからの３０個のアミノ酸がないことである（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ， ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８， Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）。免疫化実験は、まず、ウサギにおいて行われ、両タンパク質は結合抗体の同様の力価を惹起したが、修飾免疫原はＳＦ１６２ΔＶ２エンベロープだけでなく、非修飾親ＳＦ１６２エンベロープも発現する分離物に対して中和抗体の強い力価を惹起したことが見られた。
【００２４】
ウサギにおいては、非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原と修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原共に、いくつかの異種ＨＩＶ−１一次分離物に対して中和抗体を惹起したが、そのようにする修飾免疫原の可能性は更に大きく、重要なことに以前には記載も予想もされなかった。従って、修飾免疫原でワクチン接種した多くの動物は交差反応性中和抗体を惹起するだけでなく、交差中和応答の幅と強さは非修飾免疫原で免疫した動物よりこれらの動物から集めた血清において大きかった。修飾免疫原は、非修飾免疫原よりいくつかのＨＩＶ分離物の間で保存されている抗体認識中和エピトープをより効果的に惹起する。
アカゲザルにおいて行われたワクチン接種実験によりウサギにおいてなされた所見が確認され、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原は、親ＳＦ１６２エンベロープを発現する分離物に対して中和抗体を惹起するのに非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０より効果的である。重要なことに、サルにおいては修飾エンベロープだけが異種ＨＩＶ−１分離物に対して中和抗体を惹起させることができる。
本発明は、本明細書に記載されるΔＶ２ループ欠失のほかに他のエンベロープ修飾を含んでいる。そのような修飾は、免疫原に対して保存中和エピトープの曝露及び／又は数を増大させることが考えられる。
次の実施例は、本発明の好適実施態様を十分に説明するために示されるものである。しかしながら、本発明の広範囲の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【００２５】
実施例 １
２匹のアカゲザル（Ｒｈ）（Ｈ４４５及びＪ４０８）を、無傷ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｌｉｍ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． ２０００． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． １６：９８１−９９４）をもつＳＦ１６２ΔＶ２ｇｐ１４０エンベロープを発現するＤＮＡベクター（Ｃｈａｐｍａｎ， Ｂ． Ｓ．， Ｒ． Ｍ． Ｔｈａｙｅｒ， Ｋ． Ａ． Ｖｉｎｃｅｎｔ ＆ Ｎ． Ｌ． Ｈａｉｇｗｏｏｄ． １９９１． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｒｏｎ Ａ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３９７９−８６； ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ， Ｊ．， Ｍ． Ｃ． Ｃｈｅｎ， Ｂ． Ｄｏｅ， Ｍ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ， Ｃ． Ｅ． Ｇｒｅｅｒ， Ｍ． Ｓｅｌｂｙ， Ｇ． Ｒ． Ｏｔｔｅｎ ＆ Ｓ． Ｗ． Ｂａｒｎｅｔｔ． ２０００． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇａｇ ｇｅｎｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７４：２６２８−３５）で０週、４週及び８週目に（毎回２ ｍｇの全ＤＮＡ）皮内と筋肉内双方で免疫した。ＤＮＡ構築物を哺乳動物細胞における発現を高めるためにコドンを最適化した。２７週目に、ＤＮＡと、ＭＦ−５９Ｃアジュバントと混合したＣＨＯ産生精製オリゴマーＳＦ１６２ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質（１００μｇ）でもう１回免疫した。３８週目にアジュバント混合タンパク質のみでもう１回免疫した。
【００２６】
結合抗体の産生をＥＬＩＳＡ法で評価した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８）。
抗体は２回目のＤＮＡ免疫後検出可能であり、３回目のＤＮＡ免疫後力価は高くならなかった（図１）。５ヶ月の間、力価は徐々に下がったが、常に検出可能であった。１回目の‘追加刺激’により３回目のＤＮＡ免疫後に記録されたピーク値から約ｌｏｇ１０１〜２だけ力価が上がった。次の１１週間で力価が徐々に下がり横ばい状態になり、その時点で動物に２回目の‘追加刺激’をし、抗体力価を更に上げた。中和抗体（ＮＡ）を非特異的中和を修正するために免疫前血清を用いた‘活性化ＰＢＭＣターゲット’分析を用いて評価した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｄｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）（図２）。３回目のＤＮＡ免疫後、結合抗体力価は２匹の動物間で同じであったが、Ｈ４４５動物のＮＡ力価の方がＪ４０８動物より小さかった。次の‘追加刺激’でＳＦ１６２ΔＶ２とＳＦ１６２対するＮＡ力価は共に著しく増大した。いずれの動物にもワクチン特異的増殖応答が記録された。Ｊ４０８とＨ４４５の動物には１回目の‘追加刺激’後にそれぞれ刺激指数（Ｓ．Ｉ．）５及び１０が記録された。２回目の‘追加刺激’によりＨ４４５動物の応答の強さは大きくなった（Ｓ．Ｉ．２５）が、Ｊ４０８動物では大きくならなかった（Ｓ．Ｉ．５）。
【００２７】
本発明のワクチンによって惹起された高ＨＩＶエンベロープ抗体の防御の役割を評価するために、ウイルス攻撃の前にワクチン接種した動物からＣＤ８＋細胞を枯渇させた（図３）。抗ＣＤ８ ＭＡｂ ＯＫＴ８Ｆ（２ ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに３回静脈内投与することによりＣＤ８枯渇が得られた（Ｊｉｎ， Ｘ． Ｄ． Ｅ． Ｂａｕｅｒ， Ｓ． Ｅ． Ｔｕｔｔｌｅｔｏｎ， Ｓ． Ｌｅｗｉｎ， Ａ． Ｇｅｔｔｉｅ， Ｊ． Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｃ． Ｅ． Ｉｒｗｉｎ， Ｊ． Ｔ． Ｓａｆｒｉｔ， Ｊ． Ｍｉｔｔｌｅｒ， Ｌ． Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ， Ｌ． Ｇ． Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ， Ｌ． Ｚｈａｎｇ， Ａ． Ｓ． Ｐｅｒｅｌｓｏｎ ＆ Ｄ． Ｄ． Ｈｏ． １９９９． Ｄｒａｍａｔｉｃ ｒｉｓｅ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｖｉｒｅｍｉａ ａｆｔｅｒ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍａｃａｑｕｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８９：９９１−８）。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は約１０日間で検出不可能なままであった。付随して、循環しているＣＤ３＋Ｔ細胞の総数の減少が記録された。このことは、末梢からのＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇記録が実際の脱離によることを意味する。リンパ節からのＣＤ８枯渇を評価しなかったが、抗ＣＤ８ ＭＡｂをサルの血液循環に導入した場合に末梢とリンパ節からＣＤ８＋ Ｔ細胞の付随した枯渇が生じることが以前に証明されている（Ｍａｔａｎｏ， Ｔ．， Ｒ． Ｓｈｉｂａｔａ， Ｃ． Ｓｉｅｍｏｎ， Ｍ． Ｃｏｎｎｏｒｓ， Ｈ． Ｃ． Ｌａｎｅ ＆ Ｍ． Ａ． Ｍａｒｔｉｎ． １９９８． Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｉｍｉａｎ／ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１６４：１６９； Ｓｃｈｍｉｔｚ， Ｊ． Ｅ．， Ｍ． Ｊ． Ｋｕｒｏｄａ， Ｓ． Ｓａｎｔｒａ， Ｖ． Ｇ． Ｓａｓｓｅｖｉｌｌｅ， Ｍ． Ａ． Ｓｉｍｏｎ， Ｍ． Ａ． Ｌｉｆｔｏｎ， Ｐ． Ｒａｃｚ， Ｋ． Ｔｅｎｎｅｒ−Ｒａｃｚ， Ｍ． Ｄａｌｅｓａｎｄｒｏ， Ｂ． Ｊ． Ｓｃａｌｌｏｎ， Ｊ． Ｇｈｒａｙｅｂ， Ｍ． Ａ． Ｆｏｒｍａｎ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｅ． Ｐ． Ｒｉｅｂｅｒ， Ｎ． Ｌ． Ｌｅｔｖｉｎ ＆ Ｋ． Ａ． Ｒｅｉｍａｎｎ． １９９９． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｉｒｅｍｉａ ｉｎ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤ８＋ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８３：８５７−６０）。
【００２８】
ＯＫＴ８Ｆの最後の投与の１日後、免疫した又は２匹の免疫されていない実験未使用の動物を１００ ＴＣＩＤ５０のＳＨＩＶ１６２Ｐ４ウイルスの無細胞株で静脈内に攻撃した（Ｈａｒｏｕｓｅ， Ｊ． Ｍ．， Ａ． Ｇｅｔｔｉｅ， Ｒ． Ｃ． Ｔａｎ． Ｊ． Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９９． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｌａ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＣＲ５ ｏｒ ＣＸＣＲ４ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＳＨＩＶｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８４：８１６−９）。この分離物はＨ４４５とＪ４０８の動物から攻撃の日に集めた血清（１：５に希釈）でそれぞれ５０％と９０％が中和された。
ワクチン接種した動物もワクチン接種されていない動物も感染した。しかしながら、２つのグループの間でウイルス負荷レベルのピークとウイルス設定点の差が認められた（図４Ａ）。攻撃の１１日後、ワクチン接種したＨ４４５動物の血漿ウイルス血症がワクチン接種されていないＡ１４１とＡＴ５４の動物と比べてそれぞれｌｏｇ１０２と４だけ低く、ワクチン接種したＪ４０８動物は無ウイルス血症であった。ウイルス血症ピークにおいて、ワクチン接種した動物におけるウイルス血漿レベルはワクチン接種されていない動物よりｌｏｇ１０１〜４低かった。ウイルス血症ピーク後、ワクチン接種されていないＡ１４１動物に血漿ウイルス負荷が最初の急な低下に続いて漸次低下が記録されたが、第２のワクチン接種されていないＡＴ５４動物には高ウイルス負荷の持続が記録された。攻撃の３５日以内にワクチン接種した両動物に検出不可能なレベルまでの非常に急速な低下が記録された。
【００２９】
ワクチン接種したＨ４４５動物における血漿ウイルス血症の出現と付随して、抗ＨＩＶエンベロープ抗体力価の急速な増大（約５倍だけ）がモニターされた（図４Ｂ）。次に、この動物のウイルス負荷が検出不可能なレベルまで低下したように、抗体力価が攻撃前力価まで徐々に低下した。対照的に、２回目ののワクチン接種したＪ４０８動物では抗エンベロープ抗体力価が増大せず、血漿ウイルス血症ピークが最低レベルであった。ワクチン接種されていない動物においては、抗ＨＩＶエンベロープ抗体は攻撃の約３０日後に検出可能になった。Ａ１４１動物では力価が経時増加したが、ＡＴ５４動物では弱いままでくついには低下した後死亡した。
２匹のワクチン接種されていない動物は攻撃後２週間以内にＳＩＶ ｇａｐ ｐ２７タンパク質とｐｏｌ ３１タンパク質に血清変換し、２匹のワクチン接種した動物は攻撃後最初の１７週間血清陰性のままであった（図５）。この図は、コアＳＩＶタンパク質ｇａｐ ｐ２７とｐｏｌ ３１、及びｇｐ４１とｇｐ１２０ ＨＩＶエンベロープサブユニットへの変換を示し、ＲＩＢＡＴＭで求めた。上の各ストリップの数字は攻撃の日（０日）に相対して血清試料が集められた日を示している［（＋）正の対照ストリップ； （−）負の対照ストリップ］。
【００３０】
また、攻撃後１８日、４２日、４８日目にワクチン接種されていない動物から集めたＲｈ−ＰＢＭＣからウイルスが回収可能であったが、ワクチン接種した動物からは１８日目にだけ回収可能であった。最後に、健康が保たれた２匹のワクチン接種した動物とワクチン接種されていない動物Ａ１４１と対照的に、２回目のワクチン接種されていないＡＴ５４動物は攻撃の１６週後にＳＡＩＤＳにより死亡した。
攻撃の日にＳＨＩＶ１６２Ｐ４に対して血清が最強の中和活性を有したワクチン接種したＪ４０８動物において血漿ウイルス血症ピークの最低レベルが記録されたという所見は、攻撃後最初の７日間、中和抗体が重要な防御の役割を果たしたことを示している。しかしながら、中和抗体のほかに、中和活性を含まないエンベロープ特異抗体を本発明のワクチンで惹起させることもでき、ウイルスクリアランスにも寄与することができる。ＳＨＩＶ攻撃直後にＨ４４５動物において強い抗ＨＩＶエンベロープ既往応答が生じるという事実は、抗体が検出不可能なレベルまで急速なウイルスクリアランスに寄与したことを意味している。しかしながら、ＣＤ８＋リンパ球が攻撃７日後のワクチン接種した動物の末梢に再び現れたことから、その急速なウイルスクリアランスにも寄与することができる。
これらの実験は、非ＣＤ８仲介ＤＮＡワクチン誘発抗ＨＩＶエンベロープ応答の重要な防御の役割を強調するものでありかつ有効な抗ＨＩＶワクチンを開発する実行可能性を証明するものである。
【００３１】
実施例 ２
ここに示される実験では、非修飾ＳＦ１６２の免疫原性の可能性を修飾ＳＦ１６２ΔＶ２（ここからΔＶ２と呼ぶ）エンベロープと比較する。遺伝子ガンワクチン接種方法を用いてウサギをＳＦ１６２とΔＶ２エンベロープのｇｐ１４０型で免疫した。免疫原は共に同様の抗体力価の生成を惹起したが、修飾免疫原は非修飾免疫原より親ＳＦ１６２ウイルスに対して高い力価の中和抗体を惹起した。更に、ΔＶ２由来修飾免疫原は異種ＨＩＶ−１一次分離物を中和できる抗体を産生させるのにＳＦ１６２由来非修飾免疫原より効果的であった。
これらの２つの抗原の免疫原性をヒトに密接に関係がありかつＨＩＶワクチン実験に適切な動物モデルのアカゲザルにおいてＤＮＡ初回刺激に続いてタンパク質追加刺激ワクチン接種方法を用いて評価した。この点に関して、同種ＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対しても親ＳＦ１６２ウイルスに対しても強力な中和抗体を産生させるのに修飾免疫原が非修飾免疫原より効果的であることがわかった。抗体は、サルにおいて修飾免疫原で惹起し、非修飾免疫原では惹起されない抗体は、いくつかの異種ＨＩＶ−１一次分離物を中和した。これらの実験は、始めて、Ｒ５を用いたＨＩＶ−１様一次分離物に由来する可溶性オリゴマーサブユニットＨＩＶエンベロープワクチンで免疫した非ヒト霊長類において強力な交差反応性中和抗体が惹起され得ることを示している。中和エピトープの曝露を高めかつこれらの応答の幅と強さを高める特異的なエンベロープ修飾の使用を支持している。
【００３２】
ウイルス： ＳＦ１６２とＳＦ１６２Ｖ２の分離と表現型の確認は以前に報告されている（Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ， Ｃ．， Ｍ． Ｑｕｉｒｏｇａ， Ｊ． Ｗ． Ｔｕｎｇ， Ｄ． Ｄｉｎａ ＆ Ｊ． Ａ． Ｌｅｖｙ． １９９０． Ｖｉｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ Ｔ−ｃｅｌｌ ｏｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｒｏｐｉｓｍ， ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ＣＤ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：４３９０−４３９８； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）。クレードＢ ＨＩＶ−１一次分離物９２ＵＳ６６０、９２ＨＴ５９３、９２ＵＳ６５７、９２ＵＳ７１４、９２ＵＳ７２７、９１ＵＳ０５６、９１ＵＳ０５４及び９３ＵＳ０７３は、ＮＩＨ ＡＩＤＳリサーチアンドリファレンスリエイジェントプログラムから入手した。すべてのウイルス株を調製し、活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において力価測定した。
【００３３】
ワクチン： ウサギにおいて本発明の免疫原を発現させるために用いられるＤＮＡベクターはｐＪＷ４３０３である（Ｌｕ， Ｓ．， Ｗｙａｔｔ， Ｊ． Ｆ． Ｌ． Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｆ． Ｍｕｓｔａｆａ， Ｓ． Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９８． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１／Ｖ２ ａｎｄ Ｖ３ ｒｅｇｉｏｎｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１５１−１５５）。アカゲザルを免疫するために用いられるＤＮＡベクターはｐＣＭＶＫｍ２ベクターに由来する（Ｃｈａｐｍａｎ， Ｂ． Ｓ．， Ｒ． Ｍ． Ｔｈａｙｅｒ， Ｋ． Ａ． Ｖｉｎｃｅｎｔ ＆ Ｎ． Ｌ． Ｈａｉｇｗｏｏｄ． １９９１． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｒｏｎ Ａ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３９７９−８６； ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ， Ｊ．， Ｍ． Ｃ． Ｃｈｅｎ， Ｂ． Ｄｏｅ， Ｍ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ， Ｃ． Ｅ． Ｇｒｅｅｒ， Ｍ． Ｓｅｌｂｙ， Ｇ． Ｒ． Ｏｔｔｅｎ ＆ Ｓ． Ｗ． Ｂａｒｎｅｔｔ． ２０００． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇａｇ ｇｅｎｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：２６２８−３５）。いずれのプラスミドもヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素を有し、ＨＩＶエンベロープの未変性リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子に由来するもので置き換えた。サル免疫化の場合、ＤＮＡ構築物を哺乳動物における発現を高めるためにコドンを最適化した。いずれのＤＮＡベクターも無傷ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位をもつＨＩＶエンベロープ免疫原のｇｐ１４０エクトドメインを発現する。
【００３４】
タンパク質追加刺激免疫は、アカゲザルにおいてのみ行われて惹起抗体の力価に続いてＤＮＡ相の免疫化を高めた。このために、ＣＨＯ細胞においてΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質を生産し、安定な可溶性３量体として精製した。しかしながら、これらの分泌オリゴマーの安定性を高めるために、ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位を突然変異誘発により除去した（Ｅａｒｌ， Ｐ． Ｌ．， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ ＆ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９１． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：３１−４１； Ｅａｒｌ， Ｐ． Ｌ． ＆ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９３． Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：５８９−５９４； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｌｉｍ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． ２０００． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６：９８１−９９４）。
【００３５】
免疫化： ａ）ウサギ： 遺伝子ガンワクチン接種方法（Ｌｕ， Ｓ．， Ｒ． Ｗｙａｔｔ， Ｊ． Ｆ． Ｌ． Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｆ． Ｍｕｓｔａｆａ， Ｓ． Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９８． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１／Ｖ２ ａｎｄ Ｖ３ ｒｅｇｉｏｎｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１５１−１５５）を用いて動物は０週、４週、８週、１８週及び２２週に５回ＤＮＡ免疫処理した。各免疫化の２週間後に採血した。６匹の動物（Ａ１〜Ａ６）を修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫し、６匹の動物（Ａ７〜Ａ１２）を修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫した。２匹の動物（Ａ１３とＡ１４）は対照として働き、ＤＮＡベクターのみで免疫した。
【００３６】
ｂ）アカゲザル： Ｈ４４５とＪ４０８の動物を修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫し、Ｎ４７２とＰ６５５の動物を非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫し、Ｍ８４４とＨ４７３の動物をＤＮＡベクターのみで免疫した。免疫化の開始前に、動物についてＳＩＶ、Ｄ型レトロウイルス又はＳＴＬＶ−１のような種々のシミアンウイルスに対する抗体を試験した。修飾エンベロープでワクチン接種した動物を０週、４週及び８週にＤＮＡで免疫し、非修飾エンベロープでワクチン接種した動物を０週、４週及び９週にＤＮＡで免疫した。ＤＮＡ（１動物当たり毎回１ ｍｌの内毒素を含まない水中２ ｍｇのＤＮＡ）を皮内（ｉ．ｄ．）２ヶ所（２×０．２ ｍｇ）と筋肉内（ｉ．ｍ．）（四頭筋に２×０．８ ｍｇ）双方で投与した。四回目に動物をＤＮＡで免疫し、同時にＭＦ−５９Ｃアジュバントと混合した精製オリゴマーΔＶ２ｇｐ１４０又はＳＦ１６２ｇｐ１４０タンパク質で免疫した。タンパク質（１動物当たり０．５ ｍｌ全量中０．１ ｍｇの精製タンパク質）を三角筋にｉ．ｍ．投与した。対照動物にアジュバントだけを投与した。このＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫は、修飾免疫原でワクチン接種した動物に２７週で、また、非修飾免疫原で免疫した動物に４８週で生じた。３８週目に修飾免疫原で免疫した動物を更に１回アジュバント混合タンパク質のみ（ＤＮＡを含まない）で免疫し、非修飾免疫原で免疫した動物はしなかった。
【００３７】
抗体定量： ａ）抗ｇｐ１４０抗体： 以前に記載されているようにＥＬＩＳＡ法を用いて免疫化プロトコール全体の力価を定量した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１ ａｎｄ Ｖ２ ｌｏｏｐｓ ｏｆ ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｅｌｌ−ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１１２９−１１３９）。概要としては、精製した可溶性オリゴマーのΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質とＳＦ１６２ｇｐ１４０タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ）（０．１ ｍｌの１００ ｍＭ ＮａＨＣＯ３中０．２μｇのタンパク質、ｐＨ８．５）を４℃で一晩インキュベートすることにより被覆した。非吸着タンパク質分子をＴＢＳで除去し、ウェルをスーパーブロック（ＳＢ）（ピアス）で阻止した。免疫した動物から集めた熱失活（５６℃で３５分間）をＳＢで連続希釈し、３７℃で１時間ウェルに添加した（０．１ ｍｌ／ウェル）。ウサギの場合、ＤＮＡベクターのみを投与した対照動物からの血清を負の対照として用いた。
【００３８】
サルの場合、免疫前血清を負の対照として用いた。非結合抗体をＴＢＳ洗浄により除去し、エンベロープ結合抗体を、以前に記載されているようにアルカリホスファターゼ抗体（ザイムドイムノケミカルズ）に結合したヤギ抗ヒト（サル血清の場合）又は抗ウサギ（ウサギ血清の場合）を用いることにより検出した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８）。各ウェルのＯＤ４９０ｎｍをバイオルミノメータ（モレキュラーダイナミクス）で記録した。血清希釈液に対するＯＤ４９０ｎｍのプロットを作成し、終点抗体力価を、最低希釈液の免疫前血清で生じるＯＤ４９０ｎｍの３倍のＯＤ４９０ｎｍを生じる最高免疫後血清希釈液として求めた。同時に各段階の免疫化からの血清を試験した。
【００３９】
中和分析： 以前に記載されているように、標的細胞としてＰＨＡ（シグマ、３μｇ／ｍｌ）で３日間活性化したヒトＰＢＭＣを用いて中和分析を行った（Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｍ． Ｇ． Ｌｅｗｉｓ， Ｇ． Ｓｔｉｅｇｌｅｒ， Ｄ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｔ． Ｃ． ＶａｎＣｏｔｔ， Ｄ． Ｈａｙｅｓ， Ｍ． Ｋ． Ｌｏｕｄｅｒ， Ｃ． Ｒ． Ｂｒｏｗｎ， Ｃ． Ｖ． Ｓａｐａｎ， Ｓ． Ｓ． Ｆｒａｎｋｅｌ， Ｙ． Ｌｕ， Ｍ． Ｌ． Ｒｏｂｂ， Ｈ． Ｋａｔｉｎｇｅｒ ＆ Ｄ． Ｌ． Ｂｉｒｘ． １９９９． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃａｑｕｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｉｍｉａｎ／ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ８９．６ＰＤ ｂｙ ｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：４００９−１８； Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｓ． Ｗ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｏ． Ｓ． Ｗｅｉｓｌｏｗ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅｌａｙ， Ｒ． Ｂ． Ｂｅｌｓｈｅ， Ｄ． Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｍ． Ｌ． Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｒ． Ｄｏｌｉｎ， Ｂ． Ｓ． Ｇｒａｈａｍ， Ｇ． Ｊ． Ｇｏｒｓｅ， Ｍ． Ｃ． Ｋｅｅｆｅｒ， Ｍ． Ｊ． ＭｃＥｌｒａｔｈ， Ｍ． Ｃ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｊ． Ｇ． ＭｃＮｅｉｌ， Ｆ． Ｅ． ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， Ｄ． Ｓ． Ｂｕｒｋｅ ＆ ｔｈｅ ＮＩＡＩＤ ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ． １９９６． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ａｄａｐｔｅｄ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３：３４０−３４８； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｔｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ， Ｍ． Ｇｏｒｎｙ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９７． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｖｉｒｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｐ１２０ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ−ｌｉｋｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １（ＨＩＶ−１）ｉｓｏｌａｔｅｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２９：３６０−３６９）。
【００４０】
試験するＨＩＶ−１分離物のすべてを増殖し、ヒトＰＢＭＣ中で滴定し、アリコート分割し、使用するまで−８０℃で凍結した。ウイルス（２０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有する５０μｌのＲＰＭＩ完全培地中５０〜１００ ＴＣＩＤ５０（ホフマン・ラロッシュ））を同量の連続希釈した熱失活（５６℃で３５分）血清と３７℃で１時間９６ウェルＵ底プレート（コーニング）においてプレインキュベートした。各血清希釈について、３回実験のウェルを用いた。サルからの免疫前血清とＤＮＡベクターのみで免疫したウサギから集めた血清をウイルスとインキュベートし、非特異的中和の対照として働いた。各ウェルに０．４×１０６ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを含有する０．１ ｍｌの完全培地を添加した。３７℃で一晩インキュベートした後、各ウェルの半量を新しいＲＰＭＩ完全培地に取り替えた。プレートを遠心分離した後（２，０００ ｒｐｍで５分間）、各ウェルの半量を再び新しい培地に取り替えた。この手順を２回繰り返した。各ウェル中のｐ２４抗原濃度を感染後の種々の時点（通常は４日、６日及び１１日目）でインハウスＥＬＩＳＡ ｐ２４検定分析を用いて評価した。３回実験のウェルからの中和平均％と各血清希釈の標準偏差を、ウイルスと、細胞と、非ウサギ血清又は非サル血清とを含有するウェルに記録されたｐ２４濃度に基づいて以前に記載されているように算出した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ， Ｍ． Ｇｏｒｎｙ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９７． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｖｉｒｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｐ１２０ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ−ｌｉｋｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １（ＨＩＶ−１）ｉｓｏｌａｔｅｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２９：３６０−３６９）。
【００４１】
しかしながら、一部の分離物の感染は免疫前血清（非特異的中和）の存在下に減少したことが認められた。それ故、結果は２つの方法の中和実験から示される。１、同じ図面にはワクチン接種前（出血前）に集めた血清で記録された中和曲線と、ワクチン接種後の様々な段階で集めた血清で記録された中和曲線の両方が示されている。２、各血清希釈液についてワクチン接種後の血清で記録された中和％−ワクチン接種前の血清で記録された中和％の差を計算した。一部の図面には、この差（ここでは“特異的中和”と呼ばれる）が血清希釈液の関数としてプロットされている。同時に、ＭＡｂ ２Ｆ５と２Ｇ１２による中和に対する種々の一次分離物の感受性を評価した。
【００４２】
これらの中和実験では、組換えＳＦ２ ｇｐ１２０エンベロープで免疫したサルから集めた血清の能力を評価した。この免疫原は、ＨＩＶに対する潜在的ワクチンとして以前に試験されており、交差反応性中和抗体を高めることはできなかった（Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｓ． Ｗ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｏ． Ｓ． Ｗｅｉｓｌｏｗ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅｌａｙ， Ｒ． Ｂ． Ｂｅｌｓｈｅ， Ｄ． Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｍ． Ｌ． Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｒ． Ｄｏｌｉｎ， Ｂ． Ｓ． Ｇｒａｈａｍ， Ｇ． Ｊ． Ｇｏｒｓｅ， Ｍ． Ｃ． Ｋｅｅｆｅｒ， Ｍ． Ｊ． ＭｃＥｌｒａｔｈ， Ｍ． Ｃ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｊ． Ｇ． ＭｃＮｅｉｌ， Ｆ． Ｅ． ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， Ｄ． Ｓ． Ｂｕｒｋｅ ＆ ｔｈｅ ＮＩＡＩＤ ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ． １９９６． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ａｄａｐｔｅｄ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３：３４０−３４８）。
【００４３】
結果： ウサギにおける抗体の産生： ＳＦ１６２由来免疫原もΔＶ２免疫原も共にオリゴマーのΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質とＳＦ１６２ｇｐ１４０タンパク質双方に対して結合できる高力価の抗体を惹起した（図６）。予想されるように、抗体力価の変化がいずれのグループにも属している動物のワクチン接種計画全体に記録された。しかしながら、免疫計画全体で２つの動物グループ間に統計的に有意な抗体力価の差は記録されなかった。修飾免疫原又は非修飾免疫原で免疫したかに無関係に各動物における抗体力価は、最初の２回の免疫化（０週目と４週目）では非常に弱かった。４回目の免疫化（１８週目）により、３回目の免疫（８週目）と比べて両動物グループにおいてｌｏｇ１０２〜３で抗体力価の増加が得られた。５回目の免疫化（２２週）は、４回目の免疫化と比べてＳＦ１６２ｇｐ１４０抗原（ｌｏｇ１０１未満だけ）に対する抗体力価を高めたが、ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質に対しては高めなかった。ワクチン接種計画の終わりに、両抗原に対して両動物グループに１０５〜１０６の程度で非常に強力な終点ＥＬＩＳＡ結合抗体が記録された。従って、ウサギにおいては、抗体力価を求めるためにここで用いられた分析に基づいて、修飾免疫原がＶ２ループから３０個のアミノ酸を欠いているが抗体の産生を惹起させるのに非修飾免疫原と同様に有効であると思われる。
【００４４】
ＳＦ１６２分離物とＳＦ１６２ΔＶ２分離物に対するウサギ血清における中和抗体： いずれの免疫原も３回目の免疫化後にＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和抗体を産生した（図７Ａ）。修飾免疫原ワクチン接種グループにおいて高い中和力価の傾向が記録された。従って、７０％感染阻止がＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫動物とＳＦ１６２ΔＶ２免疫動物について記録された平均血清希釈度（及び標準誤差）は、それぞれ１７９（＋／−３４）と４８３（＋／−１４８）であった。このワクチン接種の段階で、修飾免疫原で免疫した６匹の中から２匹（Ａ８とＡ９）が親ＳＦ１６２分離物に対して中和抗体を惹起したが、非修飾免疫原で免疫した動物はいずれもそうのようにすることができる抗体を惹起しなかった（図７Ｂ）。しかしながら、ＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和抗体を産生した動物の数は、それぞれ後続の免疫化で増加したので、免疫計画の終わりには（即ち、５回目の免疫化後）すべの動物がＳＦ１６２ウイルスに対して中和抗体を産生した。更に、各血清の中和効力は、動物が修飾免疫原でワクチン接種されたか非修飾免疫原でワクチン接種されたかに無関係に各免疫化で高められた。
【００４５】
免疫計画の終わりに、修飾免疫原で免疫したウサギから集めた血清は、非修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清よりＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスとＳＦ１６２ウイルスに対する中和効力が高かった。修飾免疫原で免疫した６匹の動物の中の６匹がＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスを中和できる抗体を１：５，０００の希釈液において７０％〜１００％惹起した（図７Ａ）。対照的に、同じ血清希釈液で非修飾エンベロープでワクチン摂取した６匹の動物のうち１匹（Ａ１）だけがＳＦ１６２ΔＶ２感染を５０％だけ中和できる抗体応答を生じた。このグループの残りの５匹の動物は、この希釈液で有意な程度までＳＦ１６２ΔＶ２感染を十分中和する抗体応答を惹起できなかった。修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清と非修飾免疫で免疫したものとの間の中和可能性の差は、ＳＦ１６２ウイルスを中和する能力を比べた場合に明らかであった（図７Ｂ）。修飾抗原で免疫した６匹の動物の中の４匹（Ａ８、Ａ９、Ａ１０及びＡ１２）から集めた血清は７０％〜９０％のＳＦ１６２感染を１：１００〜１：３００の希釈液で中和した。対照的に、非修飾抗原で免疫した動物から集めた血清はいずれも同じ希釈液で７０％〜９０％だけのＳＦ１６２感染を阻止することができなかった。
【００４６】
ウサギにおける交差反応性中和抗体の産生： ＳＦ１６２ΔＶ２由来エンベロープ免疫原がＳＦ１６２分離物自体に由来する免疫原より親ＳＦ１６２分離物（完全なエンベロープを発現する）に対して高い力価の中和抗体を惹起できたという事実は、修飾免疫原が交差反応性中和抗体、即ち、ワクチンに対して異種ＨＩＶ−１一次分離物を中和できる抗体を惹起するのに効果的であるかを調べるのに我々を駆り立てた。種々のモノクローナル抗体に対する中和感受性が以前に証明されているそのようないくつかの分離物を試験した（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｍ． Ｐ．， Ｄ． Ｌｉｖｎａｔ， Ｊ． Ａ． Ｂｒａｄａｃ ＆ Ｓ． Ｈ． Ｂｒｉｄｇｅｓ． １９９７， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ： ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． ＡＩＤＳ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５：１０５６−６２）。非修飾免疫原によって惹起された抗体で中和された点では６つの分離物の中から２つだけ（９２ＵＳ７１４と９２ＨＴ５９３）であった（下記表１）。
【００４７】
【表１】
【００４８】
中和活性を１：１０の希釈液で評価し、ＤＮＡベクターのみでワクチン接種した動物から集めた血清で記録された非特異的中和を考慮に入れた（詳しくは材料及び方法を参照されたい）。（−）： ５０％の特異的中和が記録されなかった。（＋）： ５０％〜８０％の特異的中和が記録された。結果は３回の独立した中和実験からのものである。
Ａ１の動物を除いて、他の動物はすべて９２ＵＳ７１４に対して中和抗体を産生し、Ａ２とＡ５の動物のみが９２ＨＴ５９３に対して中和抗体を産生した。対照的に、修飾ΔＶ２ｇｐ１２０免疫原で免疫した６匹の動物の中から４匹が試験したほとんどの異種分離物に対して交差反応性中和抗体を産生した。更に、修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清の中和の強さは、非修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清より大きかった（上記表１を参照されたい）。従って、感染の８０％阻止は前者の血清でしばしば記録されたが、このレベルの阻止は２つの場合でのみ記録された（９２ＵＳ７１４と９２ＨＴ５９３の分離物に対してＡ５の動物からの血清）。
【００４９】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原でワクチン接種したアカゲザルにおける抗体の産生： 上記結果は、ワクチン惹起抗体の防御の可能性を結局は評価し得る動物モデルのアカゲザルにおける非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０抗原と修飾ΔＶ２ｇｐ１４０抗原の免疫原の可能性の評価に駆り立てた。サルにこれらの２つの免疫原をＤＮＡの初回刺激に続いてタンパク質の追加ワクチン接種方法を用いてワクチン接種した。
エンベロープ特異抗体は、２回目のＤＮＡ免疫後に検出可能であった（図８）。この段階で、修飾抗原で免疫した動物における終点ＥＬＩＳＡ力価（Ｊ４０８とＨ４４５の動物）は１：２，０００の程度であった。対照的に、非修飾エンベロープで免疫した動物（Ｎ４７２とＰ６５５の動物）においては、抗体は動物Ｎ４７２でのみ検出可能であった（１：５００の程度での終点ＥＬＩＳＡ力価）。Ｈ４４５の動物を除いて、３回目のＤＮＡ免疫化によって抗体力価は高められなかった。抗ｇｐ１２０抗体と抗ｇｐ４１抗体はＤＮＡ免疫化で同調して産生した。
引き続き５〜１０ヶ月の所見では、非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物において抗体は検出不可能であり、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物においては、抗体は常に検出可能であるが、その力価は経時低下した。
【００５０】
ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫後、抗体力価はすべての動物において著しく増大した。ピーク値で（‘追加刺激’後の２〜４週間以内に達する）、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物における終点ＥＬＩＳＡ抗体力価はＪ４０８の動物については１：３０，０００、Ｈ４４５の動物については１：１１０，０００であった。力価は経時徐々に低下し、両動物共に数週間約１：８，０００で安定であった。非修飾ＳＦ１６２ｇｐ免疫原でワクチン接種した動物においては高いピーク抗体力価が記録された（終点ＥＬＩＳＡ抗体力価がＮ４７２の動物では１：１５０，０００、Ｐ６５５の動物では１７５，０００）。次の７週間の所見では、両動物共に抗体力価が約１：３５，０００まで急速に低下した。従って、ウサギで記録されたものと対照的に、サルにおいては非修飾免疫原は修飾免疫原より高い力価の結合抗体を産生した。
予想されるように、抗ＨＩＶエンベロープ抗体はＤＮＡベクターのみで免疫した対照動物（Ｍ８４４とＨ４７３）には産生されなかった。
同種ＳＦ１６２ΔＶ２分離物と親ＳＦ１６２分離物に対するサル血清の中和活性： ＤＮＡ相の免疫化では、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０で免疫した動物のみがＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対して中和抗体を惹起した（図９Ａ−Ｂ）。２回目のＤＮＡ免疫後、Ｊ４０８の動物は同種ＳＦ１６２ΔＶ２分離物に対して中和抗体を産生したが、親ＳＦ１６２分離物に対しては産生しなかった（図９Ａ）。Ｊ４０８の動物における中和抗体の力価は、３回目のＤＮＡ免疫後増大し、その点で両分離物の中和が記録されたが、結合抗体の力価は同時に増大しなかった（図９Ｂ）。対照的に、Ｈ４４５の動物においてＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対しては非常に弱い中和抗体応答が惹起され、ＳＦ１６２ウイルスに対しては中和抗体応答が惹起されなかったが、この動物はＪ４０８で産生したのと同様の力価の結合抗体を産生した（図９Ｂ）。
【００５１】
ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後、いずれの免疫原で免疫した動物から集めた血清もＳＦ１６２ΔＶ２感染を阻止した。修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清の中和の強さは、非修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清より大きかった。例えば、ＳＦ１６２ΔＶ２感染の５０％阻害は前者の血清から１：２，０００〜１：５，０００の希釈液で記録されたが、このレベルの阻害は後者の血清から集めた血清においてはこの希釈液で記録されなかった。いずれのΔＶ２ｇｐ１４０免疫動物も親ＳＦ１６２ウイルスに対して強い中和抗体を産生したが、ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した２匹の動物のうち１匹（Ｎ４７２）だけがこのウイルスに対して中和抗体を産生した。次の２週間にこれらの血清の中和の強さの変化は記録されなかったが、この期間中に抗体力価レベルの変化は検出可能であった（図９）。ベクターのみでワクチン接種した対照動物（Ｍ８４４とＨ４７３）は、中和抗体を産生しなかった。
サル血清による異種ＨＩＶ−１一次分離物の中和： 修飾免疫原と非修飾免疫原で免疫したサルに惹起された中和抗体応答の幅は、異種クレードＢ ＨＩＶ−１一次分離物の感染を阻止するこれらの２つの免疫原で免疫したサルから集めた血清の能力を比較することにより評価した。これらの分離物が種々のＭＡｂによって中和される感受性は、以前に報告されている（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｍ． Ｐ．， Ｄ． Ｌｉｖｎａｔ， Ｊ． Ａ． Ｂｒａｄａｃ ＆ Ｓ． Ｈ． Ｂｒｉｄｇｅｓ． １９９７． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ： ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． ＡＩＤＳ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５：１０５６−６２）。血清中和実験では、同時にこれらの分離物が２つの最も一般的に用いられる一次分離物中和ＭＡｂ（２Ｆ５と２Ｇ１２）により中和される感受性を評価した（表２）。
【００５２】
【表２】
【００５３】
数値は、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０（Ｊ４０８とＨ４４５）、非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０（Ｐ６５５とＮ４７２）及び組換えｇｐ１２０（Ｌ７１４とＬ８１４）で免疫した動物から集めた血清（１：１０の希釈液）による一定のＨＩＶ−１分離物の中和％である。各分離物の共レセプターの使用を括弧に示す。中和％は材料及び方法に記載されているように計算され、免疫計画の開始前に同じ動物から集めた血清で記録された非特異的中和を考慮に入れた。＆（Ａ）： Ｊ４０８とＨ４４５の動物のＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後に集めた血清及び（Ｂ）最後のタンパク質‘ブースター’免疫の２週間後に集めた血清。数値は、２〜３回の独立した実験からの平均である。２Ｆ５と２Ｇ１２による２５μｇ／ｍｌのＭＡｂでの中和に対するこれらの分離物の感受性も示されている。ＮＴ：評価せず。
サルにおけるＤＮＡ相の免疫化では異種分離物中和は記録されなかった（１：１０の希釈液で感染阻止５０％未満）。ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質でワクチン接種した２匹の動物から集めた血清は、試験した異種ＨＩＶ−１一次分離物の一部を中和した（図１０）。試験した最低血清希釈液（１：１０）において、また、免疫前血清で記録された非特異的中和を考慮に入れた場合（詳しくは材料及び方法を参照されたい）、８０〜９０％の感染阻止がＪ４０８によりＡＤＡ、９１ＵＳ０５６と９２ＵＳ７１４の分離物で、また、Ｈ４４５血清によりＡＤＡ、９２ＵＳ７１４と９２ＵＳ６６０の分離物でのみ記録された（図１０及び表２）。これらの２匹の動物から集めた血清の交差中和活性は異なった。例えば、９２ＵＳ６６０感染は、Ｈ４４５とＪ４０８の血清でそれぞれ８０％と５０％だけ阻止された。血清交差中和活性はその後の週の所見では低下した（図１０）。このＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の５週間後に集めた血清は、交差反応性中和活性がなかったが、ＳＦ１６２とＳＦ１６２ΔＶ２の分離物の強力な中和はなお記録された。
【００５４】
このＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫後、非修飾免疫原でワクチン接種した動物における結合抗体力価は修飾免疫原でワクチン接種した動物より大きいという事実にもかかわらず（図８）、前者の血清は試験した異種分離物のいずれも中和することができなかった（表２）（即ち、５０％未満の特異的中和が記録された）。従って、ウサギにおいて非修飾免疫原は一部の異種ＨＩＶ−１一次分離物に対して中和抗体を惹起することができた（修飾免疫原より非常に効率が悪いが）（表１）が、アカゲザルにおいてはそのように惹起できなかった。
同時に、組換えＳＦ２由来ｇｐ１２０タンパク質で免疫したサルから集めた血清により中和される異種分離物の感受性を評価した。このタンパク質は、ワクチン候補として以前に評価されており、交差反応性中和抗体を惹起するのに無効であった。即ち、１：１０の血清希釈液で５０％未満の中和が記録された（Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｓ． Ｗ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｏ． Ｓ． Ｗｅｉｓｌｏｗ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅｌａｙ， Ｒ． Ｂ． Ｂｅｌｓｈｅ， Ｄ． Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｍ． Ｌ． Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｒ． Ｄｏｌｉｎ， Ｂ． Ｓ． Ｇｒａｈａｍ， Ｇ． Ｊ． Ｇｏｒｓｅ， Ｍ． Ｃ． Ｋｅｅｆｅｒ， Ｍ． Ｊ． ＭｃＥｌｒａｔｈ， Ｍ． Ｃ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｊ． Ｇ． ＭｃＮｅｉｌ， Ｆ． Ｅ． ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， Ｄ． Ｓ． Ｂｕｒｋｅ ＆ ｔｈｅ ＮＩＡＩＤ ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ． １９９６． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ａｄａｐｔｅｄ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３：３４０−３４８）。ここで試験した分離物はすべてＳＦ２ ｇｐ１２０タンパク質で惹起される抗体による中和に感受性でなかった（表２）。
【００５５】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による２回目の‘ブースター’免疫： 上記結果は修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原が非修飾免疫原より交差反応性中和抗体応答を惹起するのに実際に効果的であることを示したが、これらの応答は親ＳＦ１６２分離物に対して記録されたものより弱かった（図１１Ａ−Ｂ）。これらの応答の強さと幅を更に増大させる努力として、精製オリゴマーΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質で１回更に免疫することによりＨ４４５とＪ４０８の動物において抗体力価を更に‘追加刺激’することが試みられた（このときＤＮＡ免疫はない）。
抗体力価の増大は実際にこのタンパク質‘追加刺激’後に記録されたので、ピーク値（１：１４５，０００終点ＥＬＩＳＡ力価）の力価はＤＮＡ＋タンパク質による最初の‘ブースター’免疫化で記録されたものより約３倍大きかった（図１１Ａ）。同時に、同種ＳＦ１６２ΔＶ２分離物と親ＳＦ１６２分離物に対する中和抗体の力価に著しい増加が見られた（図１１）。
この最後の‘追加刺激’の２週間と５週間後に集めた血清の中和可能性の差は報告されなかったが、結合抗体力価は同期間中に著しく減少した。しかしながら、予想外に、試験したほとんどの異種一次分離物に対する同じ血清の中和可能性がたいてい減少した（表２）。従って、ＢＺ１６７、９２ＵＳ６５７及びＡＤＡの分離物を除いて、試験した異種分離物のすべてが２回目の‘追加刺激’の２週間後に集めた血清による中和に抵抗した。面白いことに、分離物９２ＵＳ６５７は１回目の追加刺激後に集めた血清による中和に抵抗したが、２回目の追加刺激後に集めた血清による中和には感受性であった。
【００５６】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０でワクチン接種したアカゲザルにおける抗Ｖ３ループ抗体の産生： 親ＳＦ１６２ウイルスと同種ＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和活性の増大と２回目の‘ブースター’免疫後の異種分離物に対する中和活性の減少の説明は、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による多重免疫化がＳＦ１６２エンベロープとＳＦ１６２ΔＶ２エンベロープ上でユニークに（又は優先して）発現するエピトープに対する抗体の力価を増大させるということである。ΔＶ２ｇｐ１４０による多重免疫化により高力価の抗Ｖ３ループ抗体の産生が得られることはありそうなことである。そのような抗体の力価を求めるために、ＳＦ１６２／ＳＦ１６２ΔＶ２由来Ｖ３ループを用いたＶ３ループぺプチドに基づくＥＬＩＳＡ分析を用いた（図１２Ａ−Ｂ）。このぺプチドは、線状（４４７Ｄ）エピトープ（Ｃｏｎｌｅｙ， Ａ． Ｊ．， Ｍ． Ｋ． Ｇｏｒｎｙ， Ｊ． Ａ． Ｋｅｓｓｌｅｒ， ｓｅｃｏｎｄ， Ｌ． Ｊ． Ｂｏｏｔｓ， Ｍ． Ｏｓｓｏｒｉｏ−Ｃａｓｔｒｏ， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ， Ｄ． Ｗ． Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ， Ｅ． Ａ． Ｅｍｉｎｉ， Ｃ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ． １９９４． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−Ｖ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ４４７−５２Ｄ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：６９９４−７０００； Ｇｏｒｎｙ， Ｍ． Ｋ．， Ａ． Ｊ． Ｃｏｎｌｅｙ， Ｓ． Ｋａｒｗｏｗｓｋａ， Ａ． Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ， Ｊ．−Ｙ． Ｘｕ， Ｅ． Ａ． Ｅｍｉｎｉ， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ ＆ Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ． １９９２． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ ａｎ ａｎｔｉ−Ｖ３ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：７５３８−７５４２）にもコンフォメーショナル（３９１〜９５Ｄ）エピトープ（Ｓｅｌｉｇｍａｎ， Ｓ． Ｊ．， Ｊ． Ｍ． Ｂｉｎｌｅｙ， Ｍ． Ｋ． Ｇｏｒｎｙ， Ｄ． Ｒ． Ｂｕｒｔｏｎ， Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ ＆ Ｋ． Ａ． Ｓｏｋｏｌｏｗｓｋｉ． １９９６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３：７３７−７４５）にも結合する抗体によって認識された（図１１Ａ）。
【００５７】
抗Ｖ３ループ抗体は修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原によるサルの免疫化時に産生されたが、力価は全体のエンベロープに対するものより非常に小さかった（図１１Ｂ）。更に、２回目の‘ブースター’免疫は抗Ｖ３ループ抗体の力価を高めなかった。しかしながら、これらの動物の血清中に存在するある種の抗Ｖ３ループ抗体がＥＬＩＳＡ方式でＶ３ループぺプチドと効率よく相互作用することができないが、未変性エンベロープ上のエピトープに結合することができることは留意すべきである（Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｐ． １９９３． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＨＩＶ−１＋ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｐｏｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｖ３ ｌｏｏｐｓ ｏｎ ｎａｔｉｖｅ ｇｐ １２０ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：２０９−１９）。更に、ここで用いられるＶ３ループぺプチドはＶ３ループのカルボキシ末端とアミノ末端にかからず、分析はこれらの２つの領域をターゲッティングする抗体を検出しない。従って、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０で惹起する抗体のエピトープ特異性を更に詳しく調べることが必要である。
【００５８】
図１３Ａ及び１３Ｂは、異なるクレードのＨＩＶ−１ウイルスを中和することによる本発明の免疫原によって惹起される異種免疫応答を示すグラフである。図１３ＡはＨ４４５の動物からの血清を用いた中和を示し、図１３ＢはＪ４０８からの血清を用いた中和を示している。
本発明を個々の実施態様、個々の材料、手順及び実施例によって記述し具体的に説明してきたが、本発明が材料の具体的な材料の組合わせやそのために選ばれた手順に限定されないことは理解される。実際は、本明細書に記載されたもおのほかに本発明の種々の変更が上記説明と添付の図面から当業者には明らかである。そのような変更は、前述の特許請求の範囲の範囲内に包含されるものである。
種々の文献が本明細書に引用され、その開示は本願明細書に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
免疫化で抗ＨＩＶ−１エンベロープ結合抗体の産生を示すグラフである。ワクチン、即ち、精製ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０オリゴマータンパク質に対して、免疫計画全体で動物Ｊ４０８とＨ４４５における結合抗体のエンベロープ特異的力価を求めた。点線は、免疫化の時間を示し、矢印はウイルス攻撃の時間を示している。
【図２】
ＨＩＶ−１中和抗体の産生を示すグラフである。同種ＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスや親ＳＦ１６２ウイルスに対する中和抗体の存在を、免疫計画中の様々な時点で求めた。○： 出血前； ▲： ３回目のＤＮＡ免疫化の１ヶ月後； ■： １回目の‘追加免疫’の２週間後； 及び◆： ２回目の‘追加免疫’の２週間後。
【図３】
ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の枯渇： ＣＤ８＋ Ｔリンパ球は抗ＣＤ８ ＭＡｂ ＯＫＴ８Ｆのボーラス注射（矢印）によりワクチン接種した動物から枯渇したことを示すグラフである。ＳＨＩＶ １６２Ｐ４攻撃（点線）前後の種々の時点で集めた試料において、ワクチン接種した動物とワクチン接種していない動物からの循環しているＣＤ４＋（黒い丸）、ＣＤ８＋ Ｔ（白い丸）及び全ＣＤ３＋ Ｔリンパ球（星印）の数を求めた。
【図４Ａ−Ｂ】
ＳＨＩＶ１６２Ｐ４曝露後のウイルス負荷と抗ＨＩＶエンベロープ抗体力価の産生を示すグラフである。（Ａ）ウイルス負荷は血漿１ ｍｌ当たりのＲＮＡコピー数として示されている。点線は、この分析の検出限界を示している（＜５００コピー／ｍｌ）。十字：ワクチン接種していない動物ＡＴ５４を、攻撃後のサルエイズ（ＳＡＩＤＳ）の発症の１１１日後に安楽死させた。矢印は、ワクチン接種した動物の末梢にＣＤ８＋細胞が再び現れた時点を示している。（Ｂ）ＳＨＩＶ１６２Ｐ４攻撃後の抗ＨＩＶエンベロープ抗体の産生をＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０に基づくＥＬＩＳＡ法によりモニターした。終点ＥＬＩＳＡ力価が示されている。
【図５】
ワクチン接種したサルとワクチン接種していないサルにおけるＳＩＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ抗原とＨＩＶ ｅｎｖ抗原への動物の血清変換を示す図である。
【図６】
ウサギにおける抗体産生を示す図である。抗エンベロープ抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により求めた。６匹の動物（Ａ１〜Ａ６）を非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原を発現するＤＮＡで、６匹（Ａ７〜Ａ１２）を修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原を発現するＤＮＡで免疫化した。それぞれの免疫化の２週間後に、ＳＦ１６２ｇｐ１４０とΔＶ２ｇｐ１４０のオリゴマータンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法により力価を求めた。点線は各免疫化の時点を示している。
【図７ａ】
ウサギ血清によるＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスとＳＦ１６２ウイルスの中和を示すグラフである。ＳＦ１６２ΔＶ２（Ａ）ウイルスとＳＦ１６２（Ｂ）ウイルスに対する３回目と５回目の免疫化後に集めた血清を用いた中和実験からの結果が示されている。データは少なくとも３回の独立した実験の代表である。記号は３回の実験ウェルからの平均中和％と標準偏差を示している。点線は感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。点線と星印（対照）はＤＮＡベクターのみで免疫化された動物から集めた血清で得られた中和曲線であり、非特異的中和を示している。
【図７Ｂ】
ウサギ血清によるＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスとＳＦ１６２ウイルスの中和を示すグラフである。ＳＦ１６２ΔＶ２（Ａ）ウイルスとＳＦ１６２（Ｂ）ウイルスに対する３回目と５回目の免疫化後に集めた血清を用いた中和実験からの結果が示されている。データは少なくとも３回の独立した実験の代表である。記号は３回の実験ウェルからの平均中和％と標準偏差を示している。点線は感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。点線と星印（対照）はＤＮＡベクターのみで免疫化された動物から集めた血清で得られた中和曲線であり、非特異的中和を示している。
【図８】
アカゲザルにおける抗体の産生を示すグラフである。修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫化した動物（Ｊ４０８とＨ４４５）及び非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫化した２種の動物（Ｐ６５５とＮ４７２）、並びにＤＮＡベクターのみで免疫化した対照動物（Ｍ８４４とＨ４７３）における抗エンベロープ抗体の産生を対応するタンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法により求めた。点線は免疫化の時点を示している。ＤＮＡ： 動物は各免疫原のｇｐ１４０型を発現するＤＮＡベクターで３回１ヶ月毎に免疫処置した。対照動物はＤＮＡベクターのみを投与した。ＤＮＡ＋タンパク質： 動物は４回免疫処置し、同時にＭＦ−５９Ｃのアジュバントを用いた対応するＣＨＯ産生ｇｐ１４０オリゴマータンパク質で免疫した。対照動物はアジュバントのみを投与した。
【図９Ａ】
アカゲザル血清の中和活性を示すグラフである。修飾ΔＶ２ｇｐ１４０（Ａ）と非修飾（Ｂ）ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物から集めた血清のＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和活性を実施例２に記載されたように求めた。点線は、感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。結果は３〜５回の独立した実験の代表である。データは、３回の実験のウェルからの平均と標準偏差を示している。出血前（プレブリード（Ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ））： ワクチン接種の開始前に集めた血清； ２回目のＤＮＡ及び３回目のＤＮＡ： それぞれ２回目と３回目のＤＮＡ投与の１ヶ月後に集めた血清； 追加刺激の２週間後と４週間後： それぞれＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後と４週間後に集めた血清。
【図９Ｂ】
アカゲザル血清の中和活性を示すグラフである。修飾ΔＶ２ｇｐ１４０（Ａ）と非修飾（Ｂ）ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物から集めた血清のＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和活性を実施例２に記載されたように求めた。点線は、感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。結果は３〜５回の独立した実験の代表である。データは、３回の実験のウェルからの平均と標準偏差を示している。出血前（プレブリード（Ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ））： ワクチン接種の開始前に集めた血清； ２回目のＤＮＡ及び３回目のＤＮＡ： それぞれ２回目と３回目のＤＮＡ投与の１ヶ月後に集めた血清； 追加刺激の２週間後と４週間後： それぞれＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後と４週間後に集めた血清。
【図１０】
サル血清による異種クレードＢ ＨＩＶ−１一次分離物の中和を示すグラフである。ワクチンに異種ＨＩＶ−１一次分離物に対する、ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後と４週間後に集めた血清の中和活性を実施例２に記載されたように求めた。点線は、感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。数値は特異的中和を示し、ワクチン接種後に集めた血清で記録されたウイルス中和％とワクチン接種開始前に集めた血清で記録されたウイルス中和％との間の差として定義される。データ点は、２回の独立した実験からの平均特異的中和％を示している。
【図１１Ａ】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による２回目の‘ブースター’免疫後の結合抗体と中和抗体の産生を示すグラフである。（Ａ）修飾ΔＶ２ｇｐ１４０でワクチン接種した２種のアカゲザル（Ｊ４０８とＨ４４５）における抗エンベロープ抗体の産生を、実施例２に記載されたようにＥＬＩＳＡ法により求めた。点線は免疫化時を示している。ＤＮＡ： その免疫原のｇｐ１４０型を発現するＤＮＡベクターで３回１ヶ月毎に免疫処置した。ＤＮＡ＋タンパク質： 動物は４回目のＤＮＡ免疫処置と精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質を投与した。タンパク質： 動物を精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質のみで免疫した。（Ｂ）２回目の‘追加刺激’後の血清のＳＦ１６２ΔＶ２分離物とＳＦ１６２分離物に対する中和活性を１回目の‘追加刺激’後に集めた血清と比較した（図４を参照されたい）。免疫前血清（出血前（プレブリード））で記録された非特異的中和も示されている。
【図１１Ｂ】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による２回目の‘ブースター’免疫後の結合抗体と中和抗体の産生を示すグラフである。（Ａ）修飾ΔＶ２ｇｐ１４０でワクチン接種した２種のアカゲザル（Ｊ４０８とＨ４４５）における抗エンベロープ抗体の産生を、実施例２に記載されたようにＥＬＩＳＡ法により求めた。点線は免疫化時を示している。ＤＮＡ： その免疫原のｇｐ１４０型を発現するＤＮＡベクターで３回１ヶ月毎に免疫処置した。ＤＮＡ＋タンパク質： 動物は４回目のＤＮＡ免疫処置と精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質を投与した。タンパク質： 動物を精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質のみで免疫した。（Ｂ）２回目の‘追加刺激’後の血清のＳＦ１６２ΔＶ２分離物とＳＦ１６２分離物に対する中和活性を１回目の‘追加刺激’後に集めた血清と比較した（図４を参照されたい）。免疫前血清（出血前（プレブリード））で記録された非特異的中和も示されている。
【図１２Ａ−Ｂ】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫したサル（マカク）から集めた血清における抗Ｖ３ループ抗体の存在を示すグラフである。ＳＦ１６２／ＳＦ１６２ΔＶ２エンベロープ由来のＶ３ループぺプチドを用いたＥＬＩＳＡ法の使用により抗Ｖ３ループ抗体の産生を求めた。（Ａ）まず、捕捉Ｖ３ループぺプチドが線状（４４７Ｄ）Ｖ３エピトープとコンフォメーショナル（３９１−９５Ｄ）Ｖ３ループエピトープを認識する特異的抗Ｖ３ループＭＡｂと相互作用するかを調べた。（Ｂ）次に、２種のワクチン接種した動物から１回目と２回目の追加刺激の２週間後と４週間後に集めた血清中に存在する抗Ｖ３ループ抗体の力価を求めた。比較として同じ血清中に存在する全抗エンベロープ抗体の力価も含めた。
【図１３Ａ】
Ｖ２領域欠失があるＨＩＶ−１クレードＢ免疫原由来修飾エンベロープタンパク質で免疫した２種の動物からの血清によるクレードＡ、Ｅ及びＤのＨＩＶ−１の中和を示すグラフである。
【図１３Ｂ】
Ｖ２領域欠失があるＨＩＶ−１クレードＢ免疫原由来修飾エンベロープタンパク質で免疫した２種の動物からの血清によるクレードＡ、Ｅ及びＤのＨＩＶ−１の中和を示すグラフである。
【図１４】
全長ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質のポリヌクレオチド配列を示すアミノ酸配列である（配列番号１）。
【図１５】
ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質断片のポリヌクレオチド配列を示すアミノ酸配列である（配列番号３）。
【図１６】
全長ＳＦ １６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質を示すアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図１７】
ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質断片を示すアミノ酸配列である（配列番号４）。
発明の背景
ＤＮＡ免疫化によって、免疫系の細胞性アームと体液性アームの双方が刺激される（Ｌｉｕ， Ｍ． Ａ．， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｓ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｄ． Ｃ． Ｆｒｅｅｄ， Ｎ． Ｌ． Ｌｅｔｖｉｎ ＆ Ｊ． Ｗ． Ｓｈｉｖｅｒ． １９９６． Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ＨＩＶ−ｇｅｎｅ−ｇｕｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ， ｖｏｌ． ４８． Ｋａｒｇｅｒ， Ｓ， Ｂａｓｅｌ； Ｓｈｉｖｅｒ， Ｊ． Ｗ．， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｄ． Ｃ． Ｆｒｅｅｄ， ＆ Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ． １９９６． Ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＨＩＶ−１ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８５：１３１７−１３２４； Ｓｈｉｖｅｒ， Ｊ． Ｗ．， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｄ． Ｃ． Ｆｒｅｅｄ ＆ Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ． １９９５． Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＨＩＶ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． ７７２：１９８−２０８； Ｓｈｉｖｅｒ， Ｊ． Ｗ．， Ｊ． Ｂ． Ｕｌｍｅｒ， Ｊ． Ｊ． Ｄｏｎｎｅｌｙ ＆ Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ． １９９６． Ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ２１：１９−３１−１８）とともにチンパンジーにおけるＨＩＶ−１のように徐々に複製するウイルスによって動物の感染を予防できる免疫応答が惹起する（Ｂｏｙｅｒ， Ｊ． Ｄ．， Ｋ． Ｅ． Ｕｇｅｎ， Ｂ． Ｗａｎｇ， Ｍ． Ａｇａｄｊａｎｙａｎ， Ｌ． Ｇｉｌｂｅｔ， Ｍ． Ｌ． Ｂａｇａｒａｚｚｉ， Ｍ． Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ， Ｐ． Ｆｒｏｓｔ， Ａ． Ｊａｖａｄｉａｎ， Ｗ． Ｖ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｙ． Ｒｅｆａｅｌｉ， Ｒ． Ｂ． Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ， Ｄ． ＭｃＣａｌｌｕｓ， Ｌ． Ｃｏｎｅｙ ＆ Ｄ． Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ． １９９７． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ＨＩＶ−１ ｃｈｌｌｅｎｇｅ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ３：５２６−５３２）。
【０００２】
しかしながら、攻撃ウイルスがサルにおけるＳＩＶ又はＳＨＩＶのようにホストにおいて効率よく複製する場合、ＤＮＡ惹起免疫応答は部分的防御しか与えない（Ｂｏｙｅｒ， Ｊ． Ｄ．， Ｂ． Ｗａｎｇ， Ｋ． Ｅ． Ｕｇｅｎ， Ｍ． Ａｇａｄｊａｎｙａｎ， Ａ． Ｊａｖａｄｉａｎ， Ｐ． Ｆｒｏｓｔ， Ｋ． Ｄａｎｇ， Ｒ． Ａ． Ｃａｒｒａｎｏ， Ｒ． Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ， Ｌ． Ｃｏｎｅｙ， Ｗ． Ｖ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｄ． Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ． １９９６． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｏｍａｔｏｌ． ２５：２４２−２５０； Ｌｕ， Ｓ．， Ｊ． Ａｒｔｈｏｓ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｋ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｆ． Ｍｕｓｔａｆａ， Ｅ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ． Ｃ． Ｓａｎｔｏｒｏ， Ｊ． Ｗｉｓｓｉｎｋ， Ｊ． Ｉ． Ｍｕｌｌｉｎｓ， Ｊ． Ｒ． Ｈａｙｎｅｓ， Ｎ． Ｌ． Ｌｅｔｖｉｎ， Ｍ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９６． Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｒｉａｌ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：３９７８−３９９１； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｒ． Ｐ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｈ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． Ｋａｌｉｓｈ， Ｊ． Ｄ． Ｌｉｆｓｏｎ， Ｔ． Ａ． Ｒｉｚｖｉ， Ｓ． Ｌｕ， Ｓ． Ｌ． Ｈｕ， Ｇ． Ｐ． Ｍａｚｚａｒａ， Ｄ． Ｌ． Ｐａｎｉｃａｌｉ， Ｊ． Ｇ． Ｈｅｒｄｏｎ， Ｒ． Ｇｌｉｃｋｍａｎ， Ｍ． Ａ． Ｃａｎｄｉｄｏ， Ｓ． Ｌ． Ｌｙｄｙ， Ｍ． Ｓ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｍ． ＭｃＣｌｕｒｅ． １９９９． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ５：５２６−３４）。
【０００３】
これらの応答の強さ、特に高抗ＨＩＶ／ＳＩＶエンベロープ抗体力価の産生を高めるために、ＨＩＶ／ＳＩＶエンベロープを発現する可溶性ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス粒子又は組換えワクシニア系ウイルスの継続投与が必要である（Ａｇａｄｊａｎｙａｎ， Ｍ． Ｇ．， Ｎ． Ｎ． Ｔｒｉｖｅｄｉ， Ｓ． Ｋｕｄｃｈｏｄｋａｒ， Ｍ． Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｗ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ａ． Ｌｉｎ， Ｊ． Ｂｏｙｅｒ， Ｄ． Ｌｅｖｙ， Ｋ． Ｅ． Ｕｇｅｎ， Ｊ． Ｊ． Ｋｉｍ ＆ Ｄ． Ｂ． Ｗｅｉｎｅｒ． １９９７． Ａｎ ＨＩＶ ｔｙｐｅ ２ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ ｔｙｐｅ ２ ａｎｄ ＳＩＶ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． １３：１５６１−１５７２； Ｂａｒｎｅｔｔ， Ｓ． Ｗ．， Ｊ． Ｍ． Ｋｌｉｎｇｅｒ， Ｂ． Ｄｏｅ， Ｃ． Ｍ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｌ． Ｈａｎｓｅｎ， Ａ． Ｍ． Ｄｕｌｉｅｇｅ ＆ Ｆ． Ｍ． Ｓｉｎａｎｇｉｌ． １９９８． Ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． １４ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ２９９−３０９； Ｌｅｔｖｉｎ， Ｎ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｃ． Ｌｅｋｕｔｉｓ， Ｍ． Ａｌｒｏｙ， Ｄ． Ｌ． Ｆｒｅｅｄ， Ｃ． Ｉ． Ｌｏｒｄ， Ｌ． Ｋ． Ｈａｎｄｔ， Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ ＆ Ｊ． Ｗ． Ｓｈｉｖｅｒ． １９９７． Ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｂｉｍｏｄａｌ ＨＩＶ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：９３７８−９３８３；
【０００４】
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｊ． Ｆ．， Ｓ． Ｌｕ， Ｊ． Ｃ． Ｓａｎｔｏｒｏ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｓ． Ｌ． Ｈｕ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９８． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ Ｅｎｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｏｏｓｔｉｎｇ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７２：９０９２−１００； Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｊ． Ｆ． Ｌ．， Ｍｕｓｔａｆａ， Ｓ． Ｌｕ， Ｊ． Ｃ． Ｓａｎｔｏｒｏ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｍ． Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｅ． Ｍ． Ｆｅｎｙｏ， Ｊ． Ｌ． Ｈｕｒｗｉｔｚ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９７． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒａｉｓｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｉｎｇ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２３０：２６５−２７４； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｒ． Ｐ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｈ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． Ｋａｌｉｓｈ， Ｊ． Ｄ． Ｌｉｆｓｏｎ， Ｔ． Ａ． Ｒｉｚｖｉ， Ｓ． Ｌｕ． Ｈｕ， Ｇ． Ｐ． Ｍａｚｚａｒａ， Ｄ． Ｌ． Ｐａｎｉｃａｌｉ， Ｊ． Ｇ． Ｈｅｒｎｄｏｎ， Ｒ． Ｇｌｉｃｋｍａｎ， Ｍ． Ａ． Ｃａｎｄｉｄｏ， Ｓ． Ｌ． Ｌｙｄｙ， Ｍ． Ｓ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｍ． ＭｃＣｌｕｒｅ， １９９９． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｉｎｇｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ５：５２６−３４）。
【０００５】
この２頂免疫化方法によってアカゲザル（Ｒｈ）をＳＨＩＶによる感染から防御できる応答が惹起する（Ｌｅｔｖｉｎ， Ｎ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｙ． Ｙａｓｕｔｏｍｉ， Ｈ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．−Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ， Ｃ． Ｌｅｋｕｔｉｓ， Ｍ． Ａｌｒｏｙ， Ｄ． Ｌ． Ｆｒｅｅｄ， Ｃ． Ｉ． Ｌｏｒｄ， Ｌ． Ｋ． Ｈａｎｄｔ， Ｍ． Ａ． Ｌｉｕ ＆ Ｊ． Ｗ． Ｓｈｉｖｅｒ． １９９７． Ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ＨＩＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｂｉｍｏｄａｌ ＨＩＶ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：９３７８−９３８３； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｈ． Ｌ．， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｒ． Ｐ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｈ． Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． Ｋａｌｉｓｈ， Ｊ． Ｄ． Ｌｉｆｓｏｎ， Ｔ． Ａ． Ｒｉｚｖｉ， Ｓ． Ｌｕ， Ｓ． Ｌ． Ｈｕ， Ｇ． Ｐ． Ｍａｚｚａｒａ， Ｄ． Ｌ． Ｐａｎｉｃａｌｉ， Ｊ． Ｇ． Ｈｅｒｎｄｏｎ， Ｒ． Ｇｌｉｃｋｍａｎ， Ｍ． Ａ． Ｃａｎｄｉｄｏ， Ｓ． Ｌ． Ｌｙｄｙ， Ｍ． Ｓ． Ｗｙａｎｄ ＆ Ｈ． Ｍ． ＭｃＣｌｕｒｅ． １９９９． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ５：５２６−３４）。しかしながら、上記ワクチン接種方法で細胞性抗ウイルス応答も体液性抗ウイルス応答も共に生じたことから、記録された防御がＤＮＡ免疫化で惹起された細胞性抗ウイルス応答及び／又は体液性抗ウイルス応答で仲介されたかははっきりしない。これらの２つのタイプの応答のそれぞれの抗ウイルス防御の役割を評価比較することにより、より効果的なＤＮＡ免疫化プロトコールを開発することができる。
【０００６】
ｇｐ１２０ ＨＩＶエンベロープサブユニットの結晶構造の解析から、オリゴマーエンベロープ形の中に自然に閉鎖されているタンパク質の１つの面に中和エピトープが主としてクラスター形成されていること、即ち、ビリオンや感染細胞の表面上に存在していることが示された（Ｋｗｏｎｇ， Ｐ． Ｄ．， Ｒ． Ｗｙａｔｔ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｒ． Ｗ． Ｓｗｅｅｔ， Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ ＆ Ｗ． Ａ． Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ． １９９８． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ＨＩＶ ｇｐ１２０ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＤ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３９３：６４８−６５９； Ｗｙａｔｔ， Ｒ．， Ｐ， Ｄ． Ｋｗｏｎｇ， Ｅ． Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ， Ｒ． Ｗ． Ｓｗｅｅｔ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｗ． Ａ． Ｈｅｎｄｒｉｃｋｅｓｏｎ ＆ Ｊ． Ｇ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９８， Ｔｈｅ ａｔｉｇｅｎｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ ｇｐ１２０ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３９３：７０５−７１１）。
【０００７】
これらの構造上の所見は、多くの免疫化学実験とウイルス学的実験によって支持されている（Ｂｏｕ−Ｈａｂｉｂ， Ｄ． Ｃ．， Ｇ． ｒｏｄｅｒｉｑｕｅｚ， Ｔ． Ｏｒａｖｅｓｚ， Ｐ． Ｗ． Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ． Ｌｕｓｓｏ ＆ Ｍ． Ａ． Ｎｏｒｃｒｏｓｓ． １９９４． Ｃｒｙｐｔｉｃ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｖ３ ｒｅｇｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｎｏｃｙｔｏｔｒｏｐｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：６００６−６０１３； Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｐ．， Ｊ． Ａ． ＭｃＫｅａｔｉｎｇ， Ｙ． Ｈｕａｎｇ， Ａ． Ａｓｋｅｎａｚｉ ＆ Ｄ． Ｄ． Ｈｏ． １９９２． Ｖｉｒｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４（ｓＣＤ４） ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｓＣＤ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｐ１２０ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓＣＤ４−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２３５−２４３； Ｒｅｉｔｔｅｒ， Ｊ． Ｎ．， Ｒ． Ｅ． Ｍｃａｎｓ ＆ Ｒ． Ｃ． Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ． １９９８． Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｉｎ ＡＩＤＳ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４：６７９−６８４； Ｓａｔｔｅｎｔａｕ， Ｑ． Ｊ． ＆ Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ． １９９１． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ４ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：４０７−４１５； Ｓａｔｔｅｎｔａｕ， Ｑ． Ｊ．， Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ， Ｆ． Ｖｉｇｎａｕｘ， Ｆ． Ｔｒａｉｎｃａｒｄ ＆ Ｐ． Ｐｏｉｇｎａｒｄ． １９９３． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：７３８３−７３９３；
【０００８】
Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８； Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｎ． Ｙ． Ｓｕｎ， Ｊ． Ｌｉ， Ｗ． Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９５． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｐａｓｓａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：４４１３−４４２２； Ｗｙａｔｔ， Ｒ．， Ｊ． Ｍｏｏｒｅ， Ｍ． Ａｃｃｏｌａ， Ｅ． Ｄｅｓｊａｒｄｉｎ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９５． Ｉｎｖｏｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｖ１／Ｖ２ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｐ１２０ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５７２３−５７３３； Ｗｙａｔｔ， Ｒ．， Ｎ． Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｍ． Ｔｈａｌｉ， Ｈ． Ｒｅｐｋｅ， Ｄ． Ｈｏ， Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｍ． Ｐｏｓｎｅｒ ＆ Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ． １９９３． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４５５７−４５６５）。
本発明は、ＨＩＶ−１に対して有効なワクチン接種のエンハンスメントに関する。
本明細書中の文献の引用は、そのような文献が本発明の従来技術として用いうることを許容するものとして判断すべきではない。
【０００９】
発明の要約
本発明によれば、動物においてＨＩＶ−１に対する異種免疫応答を惹起させる方法であって、該動物を少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又は少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルス、又はその組合わせで免疫し、該修飾エンベロープタンパク質にはＨＩＶ−１エンベロープタンパク質Ｖ２領域欠失があることによる、前記方法が提供される。修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、哺乳動物細胞において発現した断片の組換えタンパク質であってもよい。好ましくは、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片はグリコシル化されている。免疫された動物は、免疫原以外の少なくとも１種のＨＩＶ−１株に対して免疫応答を示している。好適実施態様においては、免疫応答は体液性応答を含んでいる。更に好適な実施態様においては、体液性応答には中和抗体が含まれ、最も好適な実施態様においては防御抗体が含まれている。好ましくは、動物はヒトである。
【００１０】
限定されない例においては、免疫原は、クレードＢ ＨＩＶ−１株由来の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又はクレードＢ ＨＩＶ−１株由来の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡ又はウイルス又はその断片を含んでいる。好適実施態様においては、ＨＩＶ−１株はＳＦ１６２である。一例として、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片は、配列番号２又は配列番号４であり、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡは配列番号１又は配列番号３である。
【００１１】
本発明の他の広範囲態様においては、動物をＨＩＶ−１ウイルスに対して免疫するために、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質Ｖ２領域欠失がある、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又は少なくとも１種の該修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルス、又はその組合わせの異種免疫応答惹起有効量と、薬学的に許容しうる担体又は賦形剤とを含むワクチン医薬組成物が提供される。修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片は、哺乳動物細胞中で発現させることができる。グリコシル化されていてもよい。実施態様においては、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片はクレードＢ ＨＩＶ−１株由来である。好適実施態様においては、ＨＩＶ−１株はＳＦ １６２である。限定されない例としては、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片は配列番号２又は配列番号４であり、少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡは配列番号１又は配列番号３である。動物を前述のワクチン医薬組成物で免疫化又はワクチン接種すると、ＨＩＶ−１に対する異種免疫応答が惹起される。応答は、体液性応答を含んでいる。実施態様においては、体液性応答は中和抗体を含んでいる。好適実施態様においては、惹起された抗体は防御抗体である。
【００１２】
本発明は、また、化合物が動物において少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対して少なくとも中和抗体を産生させることができるかを評価する方法であって、該動物を化合物で免疫する段階と、該動物のＣＤ８＋ 細胞を枯渇させる段階と、該動物について少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対する中和抗体、好ましくは防御抗体の存在をスクリーニングする段階とを含む、前記方法に関する。好適実施態様においては、枯渇させる段階は、前記動物に抗ＣＤ８モノクローナル抗体を投与することにより行われる。化合物は、ＨＩＶ−１由来ポリぺプチド又はその断片又は該ぺプチド又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスであってもよく、その免疫原は、ウイルス又はＤＮＡワクチン、タンパク質、又はその組合わせを含んでいる。その防御抗体は、好ましくは中和抗体であり、最も好ましくは防御抗体である。防御抗体を検出するための動物は野生型ＨＩＶ−１又はＳＨＩＶ株、又は野生型ＨＩＶ−１又はＳＨＩＶ−１に対して防御抗体応答できるもので感染可能なものである。
本発明は、更に、上記のタンパク質、タンパク質断片、該タンパク質又はタンパク質断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスを作製する方法に関する。好ましくは、タンパク質免疫原は哺乳動物細胞中で発現し、それ故グリコシル化されている。
本発明のこれらの、また、他の態様は、次の図面と詳細な説明によってよく理解されるであろう。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、Ｖ２（二次高頻度可変）領域に欠失がある修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を用いた動物免疫化によって抗ＨＩＶ−１エンベロープ特異的免疫応答の一部として強力な中和抗体が惹起されるという驚くべき発見をなした。更に、免疫応答は免疫原エンベロープタンパク質の野生型に対するだけでなく、免疫原が由来するクレードの内外の他のＨＩＶ−１ウイルスに対するものである。この強力な異種免疫応答、特に強い体液性応答は、ＨＩＶ感染症の予防と治療に他の免疫療法の中でもワクチン接種の新しい手段を与えるものである。本発明は、Ｖ２領域に欠失がある１種以上のエンベロープタンパク質又はその断片を含む両ＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン又はタンパク質ワクチン、及びその使用方法に関する。
【００１４】
限定されない実施態様においては、免疫化はＶ２領域に欠失があるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスで行うことができる。下記の実施例に記載されるように、Ｖ２高頻度可変領域に部分的欠失が含まれるＨＩＶ−１株ＳＦ１６２（クレードＢ）由来の修飾ｇｐ１４０エンベロープタンパク質を発現できるＤＮＡベクターを調製した。この場合、ＤＮＡとタンパク質配列の最初の２７ Ｎ末端アミノ酸（８１ヌクレオチド）はそれぞれ発現しなかった。ＳＦ１６２の修飾ｇｐ１４０のこれらのＤＮＡ断片とタンパク質断片は、それぞれ配列番号３と配列番号４に示されている。対応する全長配列の配列番号１と配列番号２は、それぞれ同じ目的に用いられる。サルのＤＮＡ免疫化によって強力な中和抗体を含む免疫応答が惹起された。ＣＤ８＋ Ｔリンパ球が枯渇し、ＳＨＩＶ１６２Ｐ４で攻撃した場合、ワクチン接種した動物は、免疫されていない対照動物と比べて、ウイルス血症ピークが低く、血漿からのウイルスクリアランスが速く、血清変換が遅かった。これらの結果から、本発明の免疫原による強力な防御体液性応答の惹起が証明される。更に、上記のように、いくつかの異種ＨＩＶ−１株に対する交差中和反応性が見られ、ＨＩＶ−１株に対する普遍的免疫応答を惹起するのにＶ２欠失免疫原の有用性が支持された。免疫したウサギにおいては、修飾（Ｖ２欠失）免疫原は、同種親ＳＦ１６２ウイルスに対して、いくつかの異種ＨＩＶ−１分離物に対しても中和抗体を惹起する点で更に有効である。サルにおいては、修飾免疫原は異種分離物に対してのみ中和抗体を惹起できた。
【００１５】
本発明は、ＤＮＡ、ウイルス、タンパク質、その組合わせのような免疫化のタイプ或いはプロトコール、又は本明細書に記載された免疫原の少なくとも１種のほかに１種以上のアジュバント、又は材料の組合わせを用いた免疫化のタイプ或いはプロトコール、及び免疫原としてＶ２（二次高頻度可変）ループ（本明細書ではＶ２ドメイン又はＶ２領域とも同じ意味で言われる）に欠失を含んでいるＨＩＶ−１ウイルスエンベロープタンパク質をコードしているタンパク質又はＤＮＡを用いた免疫化プロトコールに関する。本明細書に記載されるタンパク質、ＤＮＡ又はウイルス免疫原においてＶ２領域内の欠失に対するＨＩＶ−１エンベロープタンパク質候補の野生型配列はｈｔｔｐ：／／ｉｄｉｏｔｙｐｅ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／で見ることができ、そのような配列はすべて免疫原の調製の出発配列として全体で本明細書に含まれるものとする。そのような免疫原の１つ又は組合わせを共に用いることができる。更に、本発明の修飾（即ち、Ｖ２ループ欠失含有）エンベロープタンパク質又は本発明の修飾エンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡの他の種々の修飾は、本発明を逸脱することなく行うことができる。例えば、修飾タンパク質の未変性エンベロープリーターをコードしているＤＮＡ又はウイルスヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞において高いタンパク質発現のために、例えば、ヒト組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子のシグナルぺプチドで置き換えることができる。
【００１６】
他のシグナルぺプチドも用いることができる。他の実施態様においては、修飾タンパク質の一部又はそのエンコーディングＤＮＡ配列の端を切り取って中和体液性応答を生じるための免疫原を得ることができ、そのような修飾は本明細書に十分に含まれる。好ましくは、断片は修飾タンパク質又は修飾タンパク質をコードしているＤＮＡ又はウイルスのＮ末端で切断され、切断は１個〜約３０個のアミノ酸であるが、そのように限定されず、本明細書に記載される免疫学的性質を有する免疫原を与える他の切断も含まれる。更に、本明細書の例に示されるように哺乳動物細胞におけるＤＮＡ構築物の発現によって、図１６と図１７に示されるアスパラギン残基でグリコシル化されたグリコシル化タンパク質が得られ、本明細書に含まれるタンパク質免疫原組成物にはグリコシル化型のタンパク質も含まれる。従って、Ｖ２ループドメインに欠失を共通して含んでいる本発明のタンパク質やＤＮＡの免疫原の態様の前述の限定されない例は、フレーズ修飾タンパク質又はその断片、又は修飾タンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスにより包含されている。
【００１７】
Ｖ２ドメインは、ＨＩＶエンベロープのｇｐ１２０サブユニットの高頻度可変領域の１つである。グリコシル化の長さ（アミノ酸の数）と程度はＨＩＶ分離物の間で変動する。ＳＦ１６２ウイルスの場合には、Ｖ２ループは４０個のアミノ酸を含んでいる。本発明の実験では、３０個のアミノ酸がＶ２ループの中央領域から除去され、ＧＡＧトリぺプチドで置き換えられた。当業者はこの株のＶ２ドメインに他の欠失、又は他の株のＶ２領域に欠失をつくることができ、それらは本発明の範囲と真意から逸脱することなく、同じ免疫応答惹起特性を示し、そのような特性を容易に評価することができる。本明細書に用いられる“ΔＶ２”の略号はＶ２ドメインの部分的又は全部の欠失を意味する。ＨＩＶ−１のＶ２ドメインの詳細な説明は、Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ｅｆｆｅｃｔ ｆｏ ｍａｊｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１ ａｎｄ Ｖ２ ｌｏｏｐｓ ｏｆ ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｅｌｌ−ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１１２９−１１３９に見出すことができ、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【００１８】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含んでいる修飾タンパク質又は修飾タンパク質をコードしているＤＮＡを調製することができ、Ｖ２領域での欠失を行うことができる限定されない手段は、上記論文又はＳｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｆｏｌ． ７２：７８４０−７８４５に記載されているものである。限定されない例として、ＨＩＶ−１ ＳＦ１６２（クレードＢ ＨＩＶ−１）のエンベロープタンパク質の修飾Ｖ２欠失を調製することができ、ＤＮＡとタンパク質の配列はそれぞれ配列番号１と配列番号２に示される。しかしながら、他のクレードＢ ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質も同様に修飾することができ、タンパク質又はタンパク質をコードしているＤＮＡを免疫原として用いることができる。また、他のＨＩＶ−１クレードのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を用いることもできる。ＨＩＶ−１タンパク質の選択とそれらのエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｉｄｉｏｔｙｐｅ／ｌａｎｌ．ｇｏｖ／でアクセスできるロスアラモスナショナルラボラトリーズＨＩＶ配列データベースのような文献に見ることができる。本発明は、本明細書の目的のＤＮＡ又はタンパク質免疫原の調製のためにＶ２領域内の欠失の候補としてこれらの及び他のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含んでいる。
【００１９】
Ｖ２ドメイン内に欠失のあるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、及びタンパク質をコードしているウイルスを含んでいるエンコーディングＤＮＡを調製するために分子生物学標準法を用いることができ、本明細書の本発明は免疫原を調製する方法について制限されない。本明細書に用いられるＤＮＡワクチンという用語には、上記タンパク質をコードしているＤＮＡを含んでいるウイルスワクチンが含まれている。そのような方法は当該技術において周知である。本明細書に示されるように、当業者は動物において異種ＨＩＶ−１免疫応答を惹起する本発明のＤＮＡ又はタンパク質免疫原の能力を容易に求め得る。ＳＦ１６２クレードＢ ＨＩＶ−１ウイルス株の限定されない例においては、アミノ酸Ｔ１６０〜Ｙ１８９の３０アミノ酸欠失が調製され、欠失した配列はＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙトリぺプチドで置き換えられる。欠失した配列の上記トリぺプチド、又は短いぺプチドによる置換は必要でないが便宜上行うことができる。
異種ウイルス免疫応答を高めることができる動物は、ＨＩＶ−１感染症又は関連したウイルスに感受性のある動物である。そのような動物には、ヒト、非ヒト霊長類、又は他の哺乳動物が含まれるがこれらに限定されない。ヒトの場合、本発明の方法はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２等について、非ヒト霊長類においてはＳＨＩＶ−１について行うことができる。
【００２０】
本発明は、ＨＩＶ−１ウイルスに対して動物を免疫するために提供されるワクチン医薬組成物であって、Ｖ２領域欠失がある、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、少なくとも１種の該修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ、又はその組合わせの異種免疫応答惹起有効量と、薬学的に許容しうる担体又は賦形剤とを含む、前記組成物に関する。本明細書に同じ意味で用いられる免疫原は、Ｖ２域領域が異種免疫応答を惹起するのであれば、全長又は切断型の修飾タンパク質又は修飾タンパク質をコードしているＤＮＡであってもよい。有効な免疫原の種々の選択は上に記載されている。実施態様においては、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片は、クレードＢ ＨＩＶ−１株に由来する。好適実施態様においては、ＨＩＶ−１株はＳＦ１６２である。限定されない例として、修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片は配列番号２又は配列番号４であり、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又は断片をコードしているＤＮＡは配列番号１又は配列番号３である。哺乳動物細胞において発現されるタンパク質又は断片のグリコシル化も提供される。
【００２１】
ワクチン医薬組成物は、ワクチンの投与を容易にするために、１種以上のＤＮＡ又はタンパク質免疫原を１種以上の薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に含むことができる。更に、１種以上のアジュバントのような追加成分を免疫応答を高めるために含めることができる。アジュバントの選択は、免疫すべき動物、特に適切なアジュバントの選択が制限されるヒトにおいて左右される。当業者は、所望効果を得るために免疫原とともに含められる適切な医薬的に許容しうる成分を選択することができる。
本発明の目的は、更に、免疫原のような化合物がＨＩＶ−１の異種株に対して防御抗体を産生させることができるかを評価する方法を提供することである。該方法は、免疫原で動物を免疫し、該動物のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を枯渇させ、次に該動物について少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対して少なくとも防御抗体の存在、好ましくは防御抗体の存在をスクリーニングすることにより行われる。枯渇させる段階は動物に抗ＣＤ８モノクローナル抗体を投与することにより行ってもよい。化合物は、ＨＩＶ−１由来ポリぺプチド又はその断片、例えば、ＨＩＶ由来ポリぺプチド又はその断片をコードしているＤＮＡワクチンであってもよいがそれに限定されない。免疫化プロトコールは、ＤＮＡワクチン、ウイルスワクチン、タンパク質、その断片、その組合わせ、又は一方又は双方を免疫応答を誘発させるために連続して投与するプロトコールを含むことができる。限定されない実施態様においては、中和抗体は防御抗体である。防御抗体の惹起を評価する方法は、ＨＩＶに対する防御抗体を産生できる動物、例えば、霊長類又は他の動物において行うことができるが、そのように限定されない。上記のように前述の方法は本発明のＤＮＡ及び／又はタンパク質免疫原の有効性を評価するために用いることもできる。
【００２２】
下記の実施例に記載されるように、ΔＶ２免疫原でワクチン接種した動物において最低レベルの血漿ピークのウイルス血症を記録し、血清が攻撃の日にＳＨＩＶ１６２Ｐ４に対して最強の中和活性を有したという所見は、中和抗体が攻撃後の最初の７日間に防御の重要な役割を果たしたことを意味している。ＳＨＩＶ１６２Ｐ４攻撃直後に強い抗ＨＩＶエンベロープ既往応答が生じたという事実は、抗体が検出不可能なレベルまで急速なウイルスクリアランスに寄与したことを意味する。しかしながら、攻撃７日後にワクチン接種した動物の末梢にＣＤ８＋リンパ球が再び現れたことから、それらも急速なウイルスクリアランスに寄与することができた。
更に、本発明の実験により、異種免疫応答と言われる免疫原が調製されたものと異なるクレードのＨＩＶ−１に対して免疫応答が示される。
これらの実験は、非ＣＤ８仲介ＤＮＡベースワクチン誘発抗ＨＩＶエンベロープ応答の防御の重要な役割を強調するものでありかつＨＩＶ感染症の予防と治療のヒト使用に有効な抗ＨＩＶワクチンを開発する実行可能性を証明するものである。上記のように、ΔＶ２ループ欠失のある修飾エンベロープタンパク質を用いる戦略は、Ｖ２ループをもつエンベロープタンパク質に用いることができる戦略であり、本発明はすべてのその使用、及び免疫応答を惹起するためのΔＶ２ループ欠失修飾タンパク質又はＤＮＡワクチン、又はその組合わせを含む医薬組成物を含んでいる。
【００２３】
本明細書に記載される実験においては、関連の中和耐性（ＳＦ１６２）ウイルスと中和感受性（ＳＦ１６２ΔＶ２）ウイルスとに由来する可溶性オリゴマーｇｐ１４０エンベロープタンパク質間で免疫原性を比較した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ， ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８， Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）。２つの免疫原の唯一の差はＳＦ１６２ΔＶ２由来免疫原のＶ２ループからの３０個のアミノ酸がないことである（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ， ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８， Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）。免疫化実験は、まず、ウサギにおいて行われ、両タンパク質は結合抗体の同様の力価を惹起したが、修飾免疫原はＳＦ１６２ΔＶ２エンベロープだけでなく、非修飾親ＳＦ１６２エンベロープも発現する分離物に対して中和抗体の強い力価を惹起したことが見られた。
【００２４】
ウサギにおいては、非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原と修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原共に、いくつかの異種ＨＩＶ−１一次分離物に対して中和抗体を惹起したが、そのようにする修飾免疫原の可能性は更に大きく、重要なことに以前には記載も予想もされなかった。従って、修飾免疫原でワクチン接種した多くの動物は交差反応性中和抗体を惹起するだけでなく、交差中和応答の幅と強さは非修飾免疫原で免疫した動物よりこれらの動物から集めた血清において大きかった。修飾免疫原は、非修飾免疫原よりいくつかのＨＩＶ分離物の間で保存されている抗体認識中和エピトープをより効果的に惹起する。
アカゲザルにおいて行われたワクチン接種実験によりウサギにおいてなされた所見が確認され、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原は、親ＳＦ１６２エンベロープを発現する分離物に対して中和抗体を惹起するのに非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０より効果的である。重要なことに、サルにおいては修飾エンベロープだけが異種ＨＩＶ−１分離物に対して中和抗体を惹起させることができる。
本発明は、本明細書に記載されるΔＶ２ループ欠失のほかに他のエンベロープ修飾を含んでいる。そのような修飾は、免疫原に対して保存中和エピトープの曝露及び／又は数を増大させることが考えられる。
次の実施例は、本発明の好適実施態様を十分に説明するために示されるものである。しかしながら、本発明の広範囲の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【００２５】
実施例 １
２匹のアカゲザル（Ｒｈ）（Ｈ４４５及びＪ４０８）を、無傷ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｌｉｍ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． ２０００． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． １６：９８１−９９４）をもつＳＦ１６２ΔＶ２ｇｐ１４０エンベロープを発現するＤＮＡベクター（Ｃｈａｐｍａｎ， Ｂ． Ｓ．， Ｒ． Ｍ． Ｔｈａｙｅｒ， Ｋ． Ａ． Ｖｉｎｃｅｎｔ ＆ Ｎ． Ｌ． Ｈａｉｇｗｏｏｄ． １９９１． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｒｏｎ Ａ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３９７９−８６； ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ， Ｊ．， Ｍ． Ｃ． Ｃｈｅｎ， Ｂ． Ｄｏｅ， Ｍ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ， Ｃ． Ｅ． Ｇｒｅｅｒ， Ｍ． Ｓｅｌｂｙ， Ｇ． Ｒ． Ｏｔｔｅｎ ＆ Ｓ． Ｗ． Ｂａｒｎｅｔｔ． ２０００． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇａｇ ｇｅｎｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７４：２６２８−３５）で０週、４週及び８週目に（毎回２ ｍｇの全ＤＮＡ）皮内と筋肉内双方で免疫した。ＤＮＡ構築物を哺乳動物細胞における発現を高めるためにコドンを最適化した。２７週目に、ＤＮＡと、ＭＦ−５９Ｃアジュバントと混合したＣＨＯ産生精製オリゴマーＳＦ１６２ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質（１００μｇ）でもう１回免疫した。３８週目にアジュバント混合タンパク質のみでもう１回免疫した。
【００２６】
結合抗体の産生をＥＬＩＳＡ法で評価した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８）。
抗体は２回目のＤＮＡ免疫後検出可能であり、３回目のＤＮＡ免疫後力価は高くならなかった（図１）。５ヶ月の間、力価は徐々に下がったが、常に検出可能であった。１回目の‘追加刺激’により３回目のＤＮＡ免疫後に記録されたピーク値から約ｌｏｇ１０１〜２だけ力価が上がった。次の１１週間で力価が徐々に下がり横ばい状態になり、その時点で動物に２回目の‘追加刺激’をし、抗体力価を更に上げた。中和抗体（ＮＡ）を非特異的中和を修正するために免疫前血清を用いた‘活性化ＰＢＭＣターゲット’分析を用いて評価した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｄｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）（図２）。３回目のＤＮＡ免疫後、結合抗体力価は２匹の動物間で同じであったが、Ｈ４４５動物のＮＡ力価の方がＪ４０８動物より小さかった。次の‘追加刺激’でＳＦ１６２ΔＶ２とＳＦ１６２対するＮＡ力価は共に著しく増大した。いずれの動物にもワクチン特異的増殖応答が記録された。Ｊ４０８とＨ４４５の動物には１回目の‘追加刺激’後にそれぞれ刺激指数（Ｓ．Ｉ．）５及び１０が記録された。２回目の‘追加刺激’によりＨ４４５動物の応答の強さは大きくなった（Ｓ．Ｉ．２５）が、Ｊ４０８動物では大きくならなかった（Ｓ．Ｉ．５）。
【００２７】
本発明のワクチンによって惹起された高ＨＩＶエンベロープ抗体の防御の役割を評価するために、ウイルス攻撃の前にワクチン接種した動物からＣＤ８＋細胞を枯渇させた（図３）。抗ＣＤ８ ＭＡｂ ＯＫＴ８Ｆ（２ ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに３回静脈内投与することによりＣＤ８枯渇が得られた（Ｊｉｎ， Ｘ． Ｄ． Ｅ． Ｂａｕｅｒ， Ｓ． Ｅ． Ｔｕｔｔｌｅｔｏｎ， Ｓ． Ｌｅｗｉｎ， Ａ． Ｇｅｔｔｉｅ， Ｊ． Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｃ． Ｅ． Ｉｒｗｉｎ， Ｊ． Ｔ． Ｓａｆｒｉｔ， Ｊ． Ｍｉｔｔｌｅｒ， Ｌ． Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ， Ｌ． Ｇ． Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ， Ｌ． Ｚｈａｎｇ， Ａ． Ｓ． Ｐｅｒｅｌｓｏｎ ＆ Ｄ． Ｄ． Ｈｏ． １９９９． Ｄｒａｍａｔｉｃ ｒｉｓｅ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｖｉｒｅｍｉａ ａｆｔｅｒ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍａｃａｑｕｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８９：９９１−８）。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は約１０日間で検出不可能なままであった。付随して、循環しているＣＤ３＋Ｔ細胞の総数の減少が記録された。このことは、末梢からのＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇記録が実際の脱離によることを意味する。リンパ節からのＣＤ８枯渇を評価しなかったが、抗ＣＤ８ ＭＡｂをサルの血液循環に導入した場合に末梢とリンパ節からＣＤ８＋ Ｔ細胞の付随した枯渇が生じることが以前に証明されている（Ｍａｔａｎｏ， Ｔ．， Ｒ． Ｓｈｉｂａｔａ， Ｃ． Ｓｉｅｍｏｎ， Ｍ． Ｃｏｎｎｏｒｓ， Ｈ． Ｃ． Ｌａｎｅ ＆ Ｍ． Ａ． Ｍａｒｔｉｎ． １９９８． Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｉｍｉａｎ／ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１６４：１６９； Ｓｃｈｍｉｔｚ， Ｊ． Ｅ．， Ｍ． Ｊ． Ｋｕｒｏｄａ， Ｓ． Ｓａｎｔｒａ， Ｖ． Ｇ． Ｓａｓｓｅｖｉｌｌｅ， Ｍ． Ａ． Ｓｉｍｏｎ， Ｍ． Ａ． Ｌｉｆｔｏｎ， Ｐ． Ｒａｃｚ， Ｋ． Ｔｅｎｎｅｒ−Ｒａｃｚ， Ｍ． Ｄａｌｅｓａｎｄｒｏ， Ｂ． Ｊ． Ｓｃａｌｌｏｎ， Ｊ． Ｇｈｒａｙｅｂ， Ｍ． Ａ． Ｆｏｒｍａｎ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｅ． Ｐ． Ｒｉｅｂｅｒ， Ｎ． Ｌ． Ｌｅｔｖｉｎ ＆ Ｋ． Ａ． Ｒｅｉｍａｎｎ． １９９９． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｉｒｅｍｉａ ｉｎ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤ８＋ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８３：８５７−６０）。
【００２８】
ＯＫＴ８Ｆの最後の投与の１日後、免疫した又は２匹の免疫されていない実験未使用の動物を１００ ＴＣＩＤ５０のＳＨＩＶ１６２Ｐ４ウイルスの無細胞株で静脈内に攻撃した（Ｈａｒｏｕｓｅ， Ｊ． Ｍ．， Ａ． Ｇｅｔｔｉｅ， Ｒ． Ｃ． Ｔａｎ． Ｊ． Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９９． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｌａ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＣＲ５ ｏｒ ＣＸＣＲ４ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＳＨＩＶｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８４：８１６−９）。この分離物はＨ４４５とＪ４０８の動物から攻撃の日に集めた血清（１：５に希釈）でそれぞれ５０％と９０％が中和された。
ワクチン接種した動物もワクチン接種されていない動物も感染した。しかしながら、２つのグループの間でウイルス負荷レベルのピークとウイルス設定点の差が認められた（図４Ａ）。攻撃の１１日後、ワクチン接種したＨ４４５動物の血漿ウイルス血症がワクチン接種されていないＡ１４１とＡＴ５４の動物と比べてそれぞれｌｏｇ１０２と４だけ低く、ワクチン接種したＪ４０８動物は無ウイルス血症であった。ウイルス血症ピークにおいて、ワクチン接種した動物におけるウイルス血漿レベルはワクチン接種されていない動物よりｌｏｇ１０１〜４低かった。ウイルス血症ピーク後、ワクチン接種されていないＡ１４１動物に血漿ウイルス負荷が最初の急な低下に続いて漸次低下が記録されたが、第２のワクチン接種されていないＡＴ５４動物には高ウイルス負荷の持続が記録された。攻撃の３５日以内にワクチン接種した両動物に検出不可能なレベルまでの非常に急速な低下が記録された。
【００２９】
ワクチン接種したＨ４４５動物における血漿ウイルス血症の出現と付随して、抗ＨＩＶエンベロープ抗体力価の急速な増大（約５倍だけ）がモニターされた（図４Ｂ）。次に、この動物のウイルス負荷が検出不可能なレベルまで低下したように、抗体力価が攻撃前力価まで徐々に低下した。対照的に、２回目ののワクチン接種したＪ４０８動物では抗エンベロープ抗体力価が増大せず、血漿ウイルス血症ピークが最低レベルであった。ワクチン接種されていない動物においては、抗ＨＩＶエンベロープ抗体は攻撃の約３０日後に検出可能になった。Ａ１４１動物では力価が経時増加したが、ＡＴ５４動物では弱いままでくついには低下した後死亡した。
２匹のワクチン接種されていない動物は攻撃後２週間以内にＳＩＶ ｇａｐ ｐ２７タンパク質とｐｏｌ ３１タンパク質に血清変換し、２匹のワクチン接種した動物は攻撃後最初の１７週間血清陰性のままであった（図５）。この図は、コアＳＩＶタンパク質ｇａｐ ｐ２７とｐｏｌ ３１、及びｇｐ４１とｇｐ１２０ ＨＩＶエンベロープサブユニットへの変換を示し、ＲＩＢＡＴＭで求めた。上の各ストリップの数字は攻撃の日（０日）に相対して血清試料が集められた日を示している［（＋）正の対照ストリップ； （−）負の対照ストリップ］。
【００３０】
また、攻撃後１８日、４２日、４８日目にワクチン接種されていない動物から集めたＲｈ−ＰＢＭＣからウイルスが回収可能であったが、ワクチン接種した動物からは１８日目にだけ回収可能であった。最後に、健康が保たれた２匹のワクチン接種した動物とワクチン接種されていない動物Ａ１４１と対照的に、２回目のワクチン接種されていないＡＴ５４動物は攻撃の１６週後にＳＡＩＤＳにより死亡した。
攻撃の日にＳＨＩＶ１６２Ｐ４に対して血清が最強の中和活性を有したワクチン接種したＪ４０８動物において血漿ウイルス血症ピークの最低レベルが記録されたという所見は、攻撃後最初の７日間、中和抗体が重要な防御の役割を果たしたことを示している。しかしながら、中和抗体のほかに、中和活性を含まないエンベロープ特異抗体を本発明のワクチンで惹起させることもでき、ウイルスクリアランスにも寄与することができる。ＳＨＩＶ攻撃直後にＨ４４５動物において強い抗ＨＩＶエンベロープ既往応答が生じるという事実は、抗体が検出不可能なレベルまで急速なウイルスクリアランスに寄与したことを意味している。しかしながら、ＣＤ８＋リンパ球が攻撃７日後のワクチン接種した動物の末梢に再び現れたことから、その急速なウイルスクリアランスにも寄与することができる。
これらの実験は、非ＣＤ８仲介ＤＮＡワクチン誘発抗ＨＩＶエンベロープ応答の重要な防御の役割を強調するものでありかつ有効な抗ＨＩＶワクチンを開発する実行可能性を証明するものである。
【００３１】
実施例 ２
ここに示される実験では、非修飾ＳＦ１６２の免疫原性の可能性を修飾ＳＦ１６２ΔＶ２（ここからΔＶ２と呼ぶ）エンベロープと比較する。遺伝子ガンワクチン接種方法を用いてウサギをＳＦ１６２とΔＶ２エンベロープのｇｐ１４０型で免疫した。免疫原は共に同様の抗体力価の生成を惹起したが、修飾免疫原は非修飾免疫原より親ＳＦ１６２ウイルスに対して高い力価の中和抗体を惹起した。更に、ΔＶ２由来修飾免疫原は異種ＨＩＶ−１一次分離物を中和できる抗体を産生させるのにＳＦ１６２由来非修飾免疫原より効果的であった。
これらの２つの抗原の免疫原性をヒトに密接に関係がありかつＨＩＶワクチン実験に適切な動物モデルのアカゲザルにおいてＤＮＡ初回刺激に続いてタンパク質追加刺激ワクチン接種方法を用いて評価した。この点に関して、同種ＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対しても親ＳＦ１６２ウイルスに対しても強力な中和抗体を産生させるのに修飾免疫原が非修飾免疫原より効果的であることがわかった。抗体は、サルにおいて修飾免疫原で惹起し、非修飾免疫原では惹起されない抗体は、いくつかの異種ＨＩＶ−１一次分離物を中和した。これらの実験は、始めて、Ｒ５を用いたＨＩＶ−１様一次分離物に由来する可溶性オリゴマーサブユニットＨＩＶエンベロープワクチンで免疫した非ヒト霊長類において強力な交差反応性中和抗体が惹起され得ることを示している。中和エピトープの曝露を高めかつこれらの応答の幅と強さを高める特異的なエンベロープ修飾の使用を支持している。
【００３２】
ウイルス： ＳＦ１６２とＳＦ１６２Ｖ２の分離と表現型の確認は以前に報告されている（Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ， Ｃ．， Ｍ． Ｑｕｉｒｏｇａ， Ｊ． Ｗ． Ｔｕｎｇ， Ｄ． Ｄｉｎａ ＆ Ｊ． Ａ． Ｌｅｖｙ． １９９０． Ｖｉｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ Ｔ−ｃｅｌｌ ｏｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｒｏｐｉｓｍ， ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ＣＤ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：４３９０−４３９８； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５）。クレードＢ ＨＩＶ−１一次分離物９２ＵＳ６６０、９２ＨＴ５９３、９２ＵＳ６５７、９２ＵＳ７１４、９２ＵＳ７２７、９１ＵＳ０５６、９１ＵＳ０５４及び９３ＵＳ０７３は、ＮＩＨ ＡＩＤＳリサーチアンドリファレンスリエイジェントプログラムから入手した。すべてのウイルス株を調製し、活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において力価測定した。
【００３３】
ワクチン： ウサギにおいて本発明の免疫原を発現させるために用いられるＤＮＡベクターはｐＪＷ４３０３である（Ｌｕ， Ｓ．， Ｗｙａｔｔ， Ｊ． Ｆ． Ｌ． Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｆ． Ｍｕｓｔａｆａ， Ｓ． Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９８． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１／Ｖ２ ａｎｄ Ｖ３ ｒｅｇｉｏｎｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１５１−１５５）。アカゲザルを免疫するために用いられるＤＮＡベクターはｐＣＭＶＫｍ２ベクターに由来する（Ｃｈａｐｍａｎ， Ｂ． Ｓ．， Ｒ． Ｍ． Ｔｈａｙｅｒ， Ｋ． Ａ． Ｖｉｎｃｅｎｔ ＆ Ｎ． Ｌ． Ｈａｉｇｗｏｏｄ． １９９１． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｒｏｎ Ａ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３９７９−８６； ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ， Ｊ．， Ｍ． Ｃ． Ｃｈｅｎ， Ｂ． Ｄｏｅ， Ｍ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ， Ｃ． Ｅ． Ｇｒｅｅｒ， Ｍ． Ｓｅｌｂｙ， Ｇ． Ｒ． Ｏｔｔｅｎ ＆ Ｓ． Ｗ． Ｂａｒｎｅｔｔ． ２０００． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇａｇ ｇｅｎｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：２６２８−３５）。いずれのプラスミドもヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター要素を有し、ＨＩＶエンベロープの未変性リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子に由来するもので置き換えた。サル免疫化の場合、ＤＮＡ構築物を哺乳動物における発現を高めるためにコドンを最適化した。いずれのＤＮＡベクターも無傷ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位をもつＨＩＶエンベロープ免疫原のｇｐ１４０エクトドメインを発現する。
【００３４】
タンパク質追加刺激免疫は、アカゲザルにおいてのみ行われて惹起抗体の力価に続いてＤＮＡ相の免疫化を高めた。このために、ＣＨＯ細胞においてΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質を生産し、安定な可溶性３量体として精製した。しかしながら、これらの分泌オリゴマーの安定性を高めるために、ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位を突然変異誘発により除去した（Ｅａｒｌ， Ｐ． Ｌ．， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ ＆ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９１． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：３１−４１； Ｅａｒｌ， Ｐ． Ｌ． ＆ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９３． Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：５８９−５９４； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｌｉｍ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． ２０００． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６：９８１−９９４）。
【００３５】
免疫化： ａ）ウサギ： 遺伝子ガンワクチン接種方法（Ｌｕ， Ｓ．， Ｒ． Ｗｙａｔｔ， Ｊ． Ｆ． Ｌ． Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｆ． Ｍｕｓｔａｆａ， Ｓ． Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｗｅｎｇ， Ｄ． Ｃ． Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ， Ｊ． Ｓｏｄｒｏｓｋｉ ＆ Ｈ． Ｌ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ． １９９８． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１／Ｖ２ ａｎｄ Ｖ３ ｒｅｇｉｏｎｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１５１−１５５）を用いて動物は０週、４週、８週、１８週及び２２週に５回ＤＮＡ免疫処理した。各免疫化の２週間後に採血した。６匹の動物（Ａ１〜Ａ６）を修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫し、６匹の動物（Ａ７〜Ａ１２）を修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫した。２匹の動物（Ａ１３とＡ１４）は対照として働き、ＤＮＡベクターのみで免疫した。
【００３６】
ｂ）アカゲザル： Ｈ４４５とＪ４０８の動物を修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫し、Ｎ４７２とＰ６５５の動物を非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫し、Ｍ８４４とＨ４７３の動物をＤＮＡベクターのみで免疫した。免疫化の開始前に、動物についてＳＩＶ、Ｄ型レトロウイルス又はＳＴＬＶ−１のような種々のシミアンウイルスに対する抗体を試験した。修飾エンベロープでワクチン接種した動物を０週、４週及び８週にＤＮＡで免疫し、非修飾エンベロープでワクチン接種した動物を０週、４週及び９週にＤＮＡで免疫した。ＤＮＡ（１動物当たり毎回１ ｍｌの内毒素を含まない水中２ ｍｇのＤＮＡ）を皮内（ｉ．ｄ．）２ヶ所（２×０．２ ｍｇ）と筋肉内（ｉ．ｍ．）（四頭筋に２×０．８ ｍｇ）双方で投与した。四回目に動物をＤＮＡで免疫し、同時にＭＦ−５９Ｃアジュバントと混合した精製オリゴマーΔＶ２ｇｐ１４０又はＳＦ１６２ｇｐ１４０タンパク質で免疫した。タンパク質（１動物当たり０．５ ｍｌ全量中０．１ ｍｇの精製タンパク質）を三角筋にｉ．ｍ．投与した。対照動物にアジュバントだけを投与した。このＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫は、修飾免疫原でワクチン接種した動物に２７週で、また、非修飾免疫原で免疫した動物に４８週で生じた。３８週目に修飾免疫原で免疫した動物を更に１回アジュバント混合タンパク質のみ（ＤＮＡを含まない）で免疫し、非修飾免疫原で免疫した動物はしなかった。
【００３７】
抗体定量： ａ）抗ｇｐ１４０抗体： 以前に記載されているようにＥＬＩＳＡ法を用いて免疫化プロトコール全体の力価を定量した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｍ． Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９８． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ１ ａｎｄ Ｖ２ ｌｏｏｐｓ ｏｆ ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｅｌｌ−ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：１１２９−１１３９）。概要としては、精製した可溶性オリゴマーのΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質とＳＦ１６２ｇｐ１４０タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ）（０．１ ｍｌの１００ ｍＭ ＮａＨＣＯ３中０．２μｇのタンパク質、ｐＨ８．５）を４℃で一晩インキュベートすることにより被覆した。非吸着タンパク質分子をＴＢＳで除去し、ウェルをスーパーブロック（ＳＢ）（ピアス）で阻止した。免疫した動物から集めた熱失活（５６℃で３５分間）をＳＢで連続希釈し、３７℃で１時間ウェルに添加した（０．１ ｍｌ／ウェル）。ウサギの場合、ＤＮＡベクターのみを投与した対照動物からの血清を負の対照として用いた。
【００３８】
サルの場合、免疫前血清を負の対照として用いた。非結合抗体をＴＢＳ洗浄により除去し、エンベロープ結合抗体を、以前に記載されているようにアルカリホスファターゼ抗体（ザイムドイムノケミカルズ）に結合したヤギ抗ヒト（サル血清の場合）又は抗ウサギ（ウサギ血清の場合）を用いることにより検出した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９５． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｐ１２０ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｖｉｒｉｏｎ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６１９１−６１９８）。各ウェルのＯＤ４９０ｎｍをバイオルミノメータ（モレキュラーダイナミクス）で記録した。血清希釈液に対するＯＤ４９０ｎｍのプロットを作成し、終点抗体力価を、最低希釈液の免疫前血清で生じるＯＤ４９０ｎｍの３倍のＯＤ４９０ｎｍを生じる最高免疫後血清希釈液として求めた。同時に各段階の免疫化からの血清を試験した。
【００３９】
中和分析： 以前に記載されているように、標的細胞としてＰＨＡ（シグマ、３μｇ／ｍｌ）で３日間活性化したヒトＰＢＭＣを用いて中和分析を行った（Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｍ． Ｇ． Ｌｅｗｉｓ， Ｇ． Ｓｔｉｅｇｌｅｒ， Ｄ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｔ． Ｃ． ＶａｎＣｏｔｔ， Ｄ． Ｈａｙｅｓ， Ｍ． Ｋ． Ｌｏｕｄｅｒ， Ｃ． Ｒ． Ｂｒｏｗｎ， Ｃ． Ｖ． Ｓａｐａｎ， Ｓ． Ｓ． Ｆｒａｎｋｅｌ， Ｙ． Ｌｕ， Ｍ． Ｌ． Ｒｏｂｂ， Ｈ． Ｋａｔｉｎｇｅｒ ＆ Ｄ． Ｌ． Ｂｉｒｘ． １９９９． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃａｑｕｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｉｍｉａｎ／ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ８９．６ＰＤ ｂｙ ｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：４００９−１８； Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｓ． Ｗ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｏ． Ｓ． Ｗｅｉｓｌｏｗ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅｌａｙ， Ｒ． Ｂ． Ｂｅｌｓｈｅ， Ｄ． Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｍ． Ｌ． Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｒ． Ｄｏｌｉｎ， Ｂ． Ｓ． Ｇｒａｈａｍ， Ｇ． Ｊ． Ｇｏｒｓｅ， Ｍ． Ｃ． Ｋｅｅｆｅｒ， Ｍ． Ｊ． ＭｃＥｌｒａｔｈ， Ｍ． Ｃ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｊ． Ｇ． ＭｃＮｅｉｌ， Ｆ． Ｅ． ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， Ｄ． Ｓ． Ｂｕｒｋｅ ＆ ｔｈｅ ＮＩＡＩＤ ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ． １９９６． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ａｄａｐｔｅｄ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３：３４０−３４８； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｔｅｒ． １９９８． Ａｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ， ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ｃｌａｄｅ Ｂ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７８４０−７８４５； Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ．， Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ， Ｍ． Ｇｏｒｎｙ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９７． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｖｉｒｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｐ１２０ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ−ｌｉｋｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １（ＨＩＶ−１）ｉｓｏｌａｔｅｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２９：３６０−３６９）。
【００４０】
試験するＨＩＶ−１分離物のすべてを増殖し、ヒトＰＢＭＣ中で滴定し、アリコート分割し、使用するまで−８０℃で凍結した。ウイルス（２０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有する５０μｌのＲＰＭＩ完全培地中５０〜１００ ＴＣＩＤ５０（ホフマン・ラロッシュ））を同量の連続希釈した熱失活（５６℃で３５分）血清と３７℃で１時間９６ウェルＵ底プレート（コーニング）においてプレインキュベートした。各血清希釈について、３回実験のウェルを用いた。サルからの免疫前血清とＤＮＡベクターのみで免疫したウサギから集めた血清をウイルスとインキュベートし、非特異的中和の対照として働いた。各ウェルに０．４×１０６ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを含有する０．１ ｍｌの完全培地を添加した。３７℃で一晩インキュベートした後、各ウェルの半量を新しいＲＰＭＩ完全培地に取り替えた。プレートを遠心分離した後（２，０００ ｒｐｍで５分間）、各ウェルの半量を再び新しい培地に取り替えた。この手順を２回繰り返した。各ウェル中のｐ２４抗原濃度を感染後の種々の時点（通常は４日、６日及び１１日目）でインハウスＥＬＩＳＡ ｐ２４検定分析を用いて評価した。３回実験のウェルからの中和平均％と各血清希釈の標準偏差を、ウイルスと、細胞と、非ウサギ血清又は非サル血清とを含有するウェルに記録されたｐ２４濃度に基づいて以前に記載されているように算出した（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ， Ｌ． Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ， Ｍ． Ｇｏｒｎｙ ＆ Ｃ． Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ． １９９７． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｖｉｒｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｐ１２０ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ−ｌｉｋｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １（ＨＩＶ−１）ｉｓｏｌａｔｅｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２９：３６０−３６９）。
【００４１】
しかしながら、一部の分離物の感染は免疫前血清（非特異的中和）の存在下に減少したことが認められた。それ故、結果は２つの方法の中和実験から示される。１、同じ図面にはワクチン接種前（出血前）に集めた血清で記録された中和曲線と、ワクチン接種後の様々な段階で集めた血清で記録された中和曲線の両方が示されている。２、各血清希釈液についてワクチン接種後の血清で記録された中和％−ワクチン接種前の血清で記録された中和％の差を計算した。一部の図面には、この差（ここでは“特異的中和”と呼ばれる）が血清希釈液の関数としてプロットされている。同時に、ＭＡｂ ２Ｆ５と２Ｇ１２による中和に対する種々の一次分離物の感受性を評価した。
【００４２】
これらの中和実験では、組換えＳＦ２ ｇｐ１２０エンベロープで免疫したサルから集めた血清の能力を評価した。この免疫原は、ＨＩＶに対する潜在的ワクチンとして以前に試験されており、交差反応性中和抗体を高めることはできなかった（Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｓ． Ｗ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｏ． Ｓ． Ｗｅｉｓｌｏｗ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅｌａｙ， Ｒ． Ｂ． Ｂｅｌｓｈｅ， Ｄ． Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｍ． Ｌ． Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｒ． Ｄｏｌｉｎ， Ｂ． Ｓ． Ｇｒａｈａｍ， Ｇ． Ｊ． Ｇｏｒｓｅ， Ｍ． Ｃ． Ｋｅｅｆｅｒ， Ｍ． Ｊ． ＭｃＥｌｒａｔｈ， Ｍ． Ｃ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｊ． Ｇ． ＭｃＮｅｉｌ， Ｆ． Ｅ． ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， Ｄ． Ｓ． Ｂｕｒｋｅ ＆ ｔｈｅ ＮＩＡＩＤ ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ． １９９６． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ａｄａｐｔｅｄ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３：３４０−３４８）。
【００４３】
結果： ウサギにおける抗体の産生： ＳＦ１６２由来免疫原もΔＶ２免疫原も共にオリゴマーのΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質とＳＦ１６２ｇｐ１４０タンパク質双方に対して結合できる高力価の抗体を惹起した（図６）。予想されるように、抗体力価の変化がいずれのグループにも属している動物のワクチン接種計画全体に記録された。しかしながら、免疫計画全体で２つの動物グループ間に統計的に有意な抗体力価の差は記録されなかった。修飾免疫原又は非修飾免疫原で免疫したかに無関係に各動物における抗体力価は、最初の２回の免疫化（０週目と４週目）では非常に弱かった。４回目の免疫化（１８週目）により、３回目の免疫（８週目）と比べて両動物グループにおいてｌｏｇ１０２〜３で抗体力価の増加が得られた。５回目の免疫化（２２週）は、４回目の免疫化と比べてＳＦ１６２ｇｐ１４０抗原（ｌｏｇ１０１未満だけ）に対する抗体力価を高めたが、ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質に対しては高めなかった。ワクチン接種計画の終わりに、両抗原に対して両動物グループに１０５〜１０６の程度で非常に強力な終点ＥＬＩＳＡ結合抗体が記録された。従って、ウサギにおいては、抗体力価を求めるためにここで用いられた分析に基づいて、修飾免疫原がＶ２ループから３０個のアミノ酸を欠いているが抗体の産生を惹起させるのに非修飾免疫原と同様に有効であると思われる。
【００４４】
ＳＦ１６２分離物とＳＦ１６２ΔＶ２分離物に対するウサギ血清における中和抗体： いずれの免疫原も３回目の免疫化後にＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和抗体を産生した（図７Ａ）。修飾免疫原ワクチン接種グループにおいて高い中和力価の傾向が記録された。従って、７０％感染阻止がＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫動物とＳＦ１６２ΔＶ２免疫動物について記録された平均血清希釈度（及び標準誤差）は、それぞれ１７９（＋／−３４）と４８３（＋／−１４８）であった。このワクチン接種の段階で、修飾免疫原で免疫した６匹の中から２匹（Ａ８とＡ９）が親ＳＦ１６２分離物に対して中和抗体を惹起したが、非修飾免疫原で免疫した動物はいずれもそうのようにすることができる抗体を惹起しなかった（図７Ｂ）。しかしながら、ＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和抗体を産生した動物の数は、それぞれ後続の免疫化で増加したので、免疫計画の終わりには（即ち、５回目の免疫化後）すべの動物がＳＦ１６２ウイルスに対して中和抗体を産生した。更に、各血清の中和効力は、動物が修飾免疫原でワクチン接種されたか非修飾免疫原でワクチン接種されたかに無関係に各免疫化で高められた。
【００４５】
免疫計画の終わりに、修飾免疫原で免疫したウサギから集めた血清は、非修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清よりＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスとＳＦ１６２ウイルスに対する中和効力が高かった。修飾免疫原で免疫した６匹の動物の中の６匹がＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスを中和できる抗体を１：５，０００の希釈液において７０％〜１００％惹起した（図７Ａ）。対照的に、同じ血清希釈液で非修飾エンベロープでワクチン摂取した６匹の動物のうち１匹（Ａ１）だけがＳＦ１６２ΔＶ２感染を５０％だけ中和できる抗体応答を生じた。このグループの残りの５匹の動物は、この希釈液で有意な程度までＳＦ１６２ΔＶ２感染を十分中和する抗体応答を惹起できなかった。修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清と非修飾免疫で免疫したものとの間の中和可能性の差は、ＳＦ１６２ウイルスを中和する能力を比べた場合に明らかであった（図７Ｂ）。修飾抗原で免疫した６匹の動物の中の４匹（Ａ８、Ａ９、Ａ１０及びＡ１２）から集めた血清は７０％〜９０％のＳＦ１６２感染を１：１００〜１：３００の希釈液で中和した。対照的に、非修飾抗原で免疫した動物から集めた血清はいずれも同じ希釈液で７０％〜９０％だけのＳＦ１６２感染を阻止することができなかった。
【００４６】
ウサギにおける交差反応性中和抗体の産生： ＳＦ１６２ΔＶ２由来エンベロープ免疫原がＳＦ１６２分離物自体に由来する免疫原より親ＳＦ１６２分離物（完全なエンベロープを発現する）に対して高い力価の中和抗体を惹起できたという事実は、修飾免疫原が交差反応性中和抗体、即ち、ワクチンに対して異種ＨＩＶ−１一次分離物を中和できる抗体を惹起するのに効果的であるかを調べるのに我々を駆り立てた。種々のモノクローナル抗体に対する中和感受性が以前に証明されているそのようないくつかの分離物を試験した（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｍ． Ｐ．， Ｄ． Ｌｉｖｎａｔ， Ｊ． Ａ． Ｂｒａｄａｃ ＆ Ｓ． Ｈ． Ｂｒｉｄｇｅｓ． １９９７， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ： ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． ＡＩＤＳ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５：１０５６−６２）。非修飾免疫原によって惹起された抗体で中和された点では６つの分離物の中から２つだけ（９２ＵＳ７１４と９２ＨＴ５９３）であった（下記表１）。
【００４７】
【表１】
中和活性を１：１０の希釈液で評価し、ＤＮＡベクターのみでワクチン接種した動物から集めた血清で記録された非特異的中和を考慮に入れた（詳しくは材料及び方法を参照されたい）。（−）： ５０％の特異的中和が記録されなかった。（＋）： ５０％〜８０％の特異的中和が記録された。結果は３回の独立した中和実験からのものである。
Ａ１の動物を除いて、他の動物はすべて９２ＵＳ７１４に対して中和抗体を産生し、Ａ２とＡ５の動物のみが９２ＨＴ５９３に対して中和抗体を産生した。対照的に、修飾ΔＶ２ｇｐ１２０免疫原で免疫した６匹の動物の中から４匹が試験したほとんどの異種分離物に対して交差反応性中和抗体を産生した。更に、修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清の中和の強さは、非修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清より大きかった（上記表１を参照されたい）。従って、感染の８０％阻止は前者の血清でしばしば記録されたが、このレベルの阻止は２つの場合でのみ記録された（９２ＵＳ７１４と９２ＨＴ５９３の分離物に対してＡ５の動物からの血清）。
【００４９】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原でワクチン接種したアカゲザルにおける抗体の産生： 上記結果は、ワクチン惹起抗体の防御の可能性を結局は評価し得る動物モデルのアカゲザルにおける非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０抗原と修飾ΔＶ２ｇｐ１４０抗原の免疫原の可能性の評価に駆り立てた。サルにこれらの２つの免疫原をＤＮＡの初回刺激に続いてタンパク質の追加ワクチン接種方法を用いてワクチン接種した。
エンベロープ特異抗体は、２回目のＤＮＡ免疫後に検出可能であった（図８）。この段階で、修飾抗原で免疫した動物における終点ＥＬＩＳＡ力価（Ｊ４０８とＨ４４５の動物）は１：２，０００の程度であった。対照的に、非修飾エンベロープで免疫した動物（Ｎ４７２とＰ６５５の動物）においては、抗体は動物Ｎ４７２でのみ検出可能であった（１：５００の程度での終点ＥＬＩＳＡ力価）。Ｈ４４５の動物を除いて、３回目のＤＮＡ免疫化によって抗体力価は高められなかった。抗ｇｐ１２０抗体と抗ｇｐ４１抗体はＤＮＡ免疫化で同調して産生した。
引き続き５〜１０ヶ月の所見では、非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物において抗体は検出不可能であり、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物においては、抗体は常に検出可能であるが、その力価は経時低下した。
【００５０】
ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫後、抗体力価はすべての動物において著しく増大した。ピーク値で（‘追加刺激’後の２〜４週間以内に達する）、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物における終点ＥＬＩＳＡ抗体力価はＪ４０８の動物については１：３０，０００、Ｈ４４５の動物については１：１１０，０００であった。力価は経時徐々に低下し、両動物共に数週間約１：８，０００で安定であった。非修飾ＳＦ１６２ｇｐ免疫原でワクチン接種した動物においては高いピーク抗体力価が記録された（終点ＥＬＩＳＡ抗体力価がＮ４７２の動物では１：１５０，０００、Ｐ６５５の動物では１７５，０００）。次の７週間の所見では、両動物共に抗体力価が約１：３５，０００まで急速に低下した。従って、ウサギで記録されたものと対照的に、サルにおいては非修飾免疫原は修飾免疫原より高い力価の結合抗体を産生した。
予想されるように、抗ＨＩＶエンベロープ抗体はＤＮＡベクターのみで免疫した対照動物（Ｍ８４４とＨ４７３）には産生されなかった。
同種ＳＦ１６２ΔＶ２分離物と親ＳＦ１６２分離物に対するサル血清の中和活性： ＤＮＡ相の免疫化では、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０で免疫した動物のみがＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対して中和抗体を惹起した（図９Ａ−Ｂ）。２回目のＤＮＡ免疫後、Ｊ４０８の動物は同種ＳＦ１６２ΔＶ２分離物に対して中和抗体を産生したが、親ＳＦ１６２分離物に対しては産生しなかった（図９Ａ）。Ｊ４０８の動物における中和抗体の力価は、３回目のＤＮＡ免疫後増大し、その点で両分離物の中和が記録されたが、結合抗体の力価は同時に増大しなかった（図９Ｂ）。対照的に、Ｈ４４５の動物においてＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対しては非常に弱い中和抗体応答が惹起され、ＳＦ１６２ウイルスに対しては中和抗体応答が惹起されなかったが、この動物はＪ４０８で産生したのと同様の力価の結合抗体を産生した（図９Ｂ）。
【００５１】
ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後、いずれの免疫原で免疫した動物から集めた血清もＳＦ１６２ΔＶ２感染を阻止した。修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清の中和の強さは、非修飾免疫原で免疫した動物から集めた血清より大きかった。例えば、ＳＦ１６２ΔＶ２感染の５０％阻害は前者の血清から１：２，０００〜１：５，０００の希釈液で記録されたが、このレベルの阻害は後者の血清から集めた血清においてはこの希釈液で記録されなかった。いずれのΔＶ２ｇｐ１４０免疫動物も親ＳＦ１６２ウイルスに対して強い中和抗体を産生したが、ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した２匹の動物のうち１匹（Ｎ４７２）だけがこのウイルスに対して中和抗体を産生した。次の２週間にこれらの血清の中和の強さの変化は記録されなかったが、この期間中に抗体力価レベルの変化は検出可能であった（図９）。ベクターのみでワクチン接種した対照動物（Ｍ８４４とＨ４７３）は、中和抗体を産生しなかった。
サル血清による異種ＨＩＶ−１一次分離物の中和： 修飾免疫原と非修飾免疫原で免疫したサルに惹起された中和抗体応答の幅は、異種クレードＢ ＨＩＶ−１一次分離物の感染を阻止するこれらの２つの免疫原で免疫したサルから集めた血清の能力を比較することにより評価した。これらの分離物が種々のＭＡｂによって中和される感受性は、以前に報告されている（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｍ． Ｐ．， Ｄ． Ｌｉｖｎａｔ， Ｊ． Ａ． Ｂｒａｄａｃ ＆ Ｓ． Ｈ． Ｂｒｉｄｇｅｓ． １９９７． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ： ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． ＡＩＤＳ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７５：１０５６−６２）。血清中和実験では、同時にこれらの分離物が２つの最も一般的に用いられる一次分離物中和ＭＡｂ（２Ｆ５と２Ｇ１２）により中和される感受性を評価した（表２）。
【００５２】
【表２】
数値は、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０（Ｊ４０８とＨ４４５）、非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０（Ｐ６５５とＮ４７２）及び組換えｇｐ１２０（Ｌ７１４とＬ８１４）で免疫した動物から集めた血清（１：１０の希釈液）による一定のＨＩＶ−１分離物の中和％である。各分離物の共レセプターの使用を括弧に示す。中和％は材料及び方法に記載されているように計算され、免疫計画の開始前に同じ動物から集めた血清で記録された非特異的中和を考慮に入れた。＆（Ａ）： Ｊ４０８とＨ４４５の動物のＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後に集めた血清及び（Ｂ）最後のタンパク質‘ブースター’免疫の２週間後に集めた血清。数値は、２〜３回の独立した実験からの平均である。２Ｆ５と２Ｇ１２による２５μｇ／ｍｌのＭＡｂでの中和に対するこれらの分離物の感受性も示されている。ＮＴ：評価せず。
サルにおけるＤＮＡ相の免疫化では異種分離物中和は記録されなかった（１：１０の希釈液で感染阻止５０％未満）。ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質でワクチン接種した２匹の動物から集めた血清は、試験した異種ＨＩＶ−１一次分離物の一部を中和した（図１０）。試験した最低血清希釈液（１：１０）において、また、免疫前血清で記録された非特異的中和を考慮に入れた場合（詳しくは材料及び方法を参照されたい）、８０〜９０％の感染阻止がＪ４０８によりＡＤＡ、９１ＵＳ０５６と９２ＵＳ７１４の分離物で、また、Ｈ４４５血清によりＡＤＡ、９２ＵＳ７１４と９２ＵＳ６６０の分離物でのみ記録された（図１０及び表２）。これらの２匹の動物から集めた血清の交差中和活性は異なった。例えば、９２ＵＳ６６０感染は、Ｈ４４５とＪ４０８の血清でそれぞれ８０％と５０％だけ阻止された。血清交差中和活性はその後の週の所見では低下した（図１０）。このＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の５週間後に集めた血清は、交差反応性中和活性がなかったが、ＳＦ１６２とＳＦ１６２ΔＶ２の分離物の強力な中和はなお記録された。
【００５４】
このＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫後、非修飾免疫原でワクチン接種した動物における結合抗体力価は修飾免疫原でワクチン接種した動物より大きいという事実にもかかわらず（図８）、前者の血清は試験した異種分離物のいずれも中和することができなかった（表２）（即ち、５０％未満の特異的中和が記録された）。従って、ウサギにおいて非修飾免疫原は一部の異種ＨＩＶ−１一次分離物に対して中和抗体を惹起することができた（修飾免疫原より非常に効率が悪いが）（表１）が、アカゲザルにおいてはそのように惹起できなかった。
同時に、組換えＳＦ２由来ｇｐ１２０タンパク質で免疫したサルから集めた血清により中和される異種分離物の感受性を評価した。このタンパク質は、ワクチン候補として以前に評価されており、交差反応性中和抗体を惹起するのに無効であった。即ち、１：１０の血清希釈液で５０％未満の中和が記録された（Ｍａｓｃｏｌａ， Ｊ． Ｒ．， Ｓ． Ｗ． Ｓｎｙｄｅｒ， Ｏ． Ｓ． Ｗｅｉｓｌｏｗ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅｌａｙ， Ｒ． Ｂ． Ｂｅｌｓｈｅ， Ｄ． Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｍ． Ｌ． Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｒ． Ｄｏｌｉｎ， Ｂ． Ｓ． Ｇｒａｈａｍ， Ｇ． Ｊ． Ｇｏｒｓｅ， Ｍ． Ｃ． Ｋｅｅｆｅｒ， Ｍ． Ｊ． ＭｃＥｌｒａｔｈ， Ｍ． Ｃ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｋ． Ｆ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｊ． Ｇ． ＭｃＮｅｉｌ， Ｆ． Ｅ． ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， Ｄ． Ｓ． Ｂｕｒｋｅ ＆ ｔｈｅ ＮＩＡＩＤ ＡＩＤＳ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ． １９９６． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ａｄａｐｔｅｄ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３：３４０−３４８）。ここで試験した分離物はすべてＳＦ２ ｇｐ１２０タンパク質で惹起される抗体による中和に感受性でなかった（表２）。
【００５５】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による２回目の‘ブースター’免疫： 上記結果は修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原が非修飾免疫原より交差反応性中和抗体応答を惹起するのに実際に効果的であることを示したが、これらの応答は親ＳＦ１６２分離物に対して記録されたものより弱かった（図１１Ａ−Ｂ）。これらの応答の強さと幅を更に増大させる努力として、精製オリゴマーΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質で１回更に免疫することによりＨ４４５とＪ４０８の動物において抗体力価を更に‘追加刺激’することが試みられた（このときＤＮＡ免疫はない）。
抗体力価の増大は実際にこのタンパク質‘追加刺激’後に記録されたので、ピーク値（１：１４５，０００終点ＥＬＩＳＡ力価）の力価はＤＮＡ＋タンパク質による最初の‘ブースター’免疫化で記録されたものより約３倍大きかった（図１１Ａ）。同時に、同種ＳＦ１６２ΔＶ２分離物と親ＳＦ１６２分離物に対する中和抗体の力価に著しい増加が見られた（図１１）。
この最後の‘追加刺激’の２週間と５週間後に集めた血清の中和可能性の差は報告されなかったが、結合抗体力価は同期間中に著しく減少した。しかしながら、予想外に、試験したほとんどの異種一次分離物に対する同じ血清の中和可能性がたいてい減少した（表２）。従って、ＢＺ１６７、９２ＵＳ６５７及びＡＤＡの分離物を除いて、試験した異種分離物のすべてが２回目の‘追加刺激’の２週間後に集めた血清による中和に抵抗した。面白いことに、分離物９２ＵＳ６５７は１回目の追加刺激後に集めた血清による中和に抵抗したが、２回目の追加刺激後に集めた血清による中和には感受性であった。
【００５６】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０でワクチン接種したアカゲザルにおける抗Ｖ３ループ抗体の産生： 親ＳＦ１６２ウイルスと同種ＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和活性の増大と２回目の‘ブースター’免疫後の異種分離物に対する中和活性の減少の説明は、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による多重免疫化がＳＦ１６２エンベロープとＳＦ１６２ΔＶ２エンベロープ上でユニークに（又は優先して）発現するエピトープに対する抗体の力価を増大させるということである。ΔＶ２ｇｐ１４０による多重免疫化により高力価の抗Ｖ３ループ抗体の産生が得られることはありそうなことである。そのような抗体の力価を求めるために、ＳＦ１６２／ＳＦ１６２ΔＶ２由来Ｖ３ループを用いたＶ３ループぺプチドに基づくＥＬＩＳＡ分析を用いた（図１２Ａ−Ｂ）。このぺプチドは、線状（４４７Ｄ）エピトープ（Ｃｏｎｌｅｙ， Ａ． Ｊ．， Ｍ． Ｋ． Ｇｏｒｎｙ， Ｊ． Ａ． Ｋｅｓｓｌｅｒ， ｓｅｃｏｎｄ， Ｌ． Ｊ． Ｂｏｏｔｓ， Ｍ． Ｏｓｓｏｒｉｏ−Ｃａｓｔｒｏ， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ， Ｄ． Ｗ． Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ， Ｅ． Ａ． Ｅｍｉｎｉ， Ｃ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ． １９９４． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−Ｖ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ４４７−５２Ｄ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：６９９４−７０００； Ｇｏｒｎｙ， Ｍ． Ｋ．， Ａ． Ｊ． Ｃｏｎｌｅｙ， Ｓ． Ｋａｒｗｏｗｓｋａ， Ａ． Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ， Ｊ．−Ｙ． Ｘｕ， Ｅ． Ａ． Ｅｍｉｎｉ， Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ ＆ Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ． １９９２． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ ａｎ ａｎｔｉ−Ｖ３ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：７５３８−７５４２）にもコンフォメーショナル（３９１〜９５Ｄ）エピトープ（Ｓｅｌｉｇｍａｎ， Ｓ． Ｊ．， Ｊ． Ｍ． Ｂｉｎｌｅｙ， Ｍ． Ｋ． Ｇｏｒｎｙ， Ｄ． Ｒ． Ｂｕｒｔｏｎ， Ｓ． Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ ＆ Ｋ． Ａ． Ｓｏｋｏｌｏｗｓｋｉ． １９９６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３：７３７−７４５）にも結合する抗体によって認識された（図１１Ａ）。
【００５７】
抗Ｖ３ループ抗体は修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原によるサルの免疫化時に産生されたが、力価は全体のエンベロープに対するものより非常に小さかった（図１１Ｂ）。更に、２回目の‘ブースター’免疫は抗Ｖ３ループ抗体の力価を高めなかった。しかしながら、これらの動物の血清中に存在するある種の抗Ｖ３ループ抗体がＥＬＩＳＡ方式でＶ３ループぺプチドと効率よく相互作用することができないが、未変性エンベロープ上のエピトープに結合することができることは留意すべきである（Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｐ． １９９３． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＨＩＶ−１＋ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｐｏｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｖ３ ｌｏｏｐｓ ｏｎ ｎａｔｉｖｅ ｇｐ １２０ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：２０９−１９）。更に、ここで用いられるＶ３ループぺプチドはＶ３ループのカルボキシ末端とアミノ末端にかからず、分析はこれらの２つの領域をターゲッティングする抗体を検出しない。従って、修飾ΔＶ２ｇｐ１４０で惹起する抗体のエピトープ特異性を更に詳しく調べることが必要である。
【００５８】
図１３Ａ及び１３Ｂは、異なるクレードのＨＩＶ−１ウイルスを中和することによる本発明の免疫原によって惹起される異種免疫応答を示すグラフである。図１３ＡはＨ４４５の動物からの血清を用いた中和を示し、図１３ＢはＪ４０８からの血清を用いた中和を示している。
本発明を個々の実施態様、個々の材料、手順及び実施例によって記述し具体的に説明してきたが、本発明が材料の具体的な材料の組合わせやそのために選ばれた手順に限定されないことは理解される。実際は、本明細書に記載されたもおのほかに本発明の種々の変更が上記説明と添付の図面から当業者には明らかである。そのような変更は、前述の特許請求の範囲の範囲内に包含されるものである。
種々の文献が本明細書に引用され、その開示は本願明細書に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
免疫化で抗ＨＩＶ−１エンベロープ結合抗体の産生を示すグラフである。ワクチン、即ち、精製ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０オリゴマータンパク質に対して、免疫計画全体で動物Ｊ４０８とＨ４４５における結合抗体のエンベロープ特異的力価を求めた。点線は、免疫化の時間を示し、矢印はウイルス攻撃の時間を示している。
【図２】
ＨＩＶ−１中和抗体の産生を示すグラフである。同種ＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスや親ＳＦ１６２ウイルスに対する中和抗体の存在を、免疫計画中の様々な時点で求めた。○： 出血前； ▲： ３回目のＤＮＡ免疫化の１ヶ月後； ■： １回目の‘追加免疫’の２週間後； 及び◆： ２回目の‘追加免疫’の２週間後。
【図３】
ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の枯渇： ＣＤ８＋ Ｔリンパ球は抗ＣＤ８ ＭＡｂ ＯＫＴ８Ｆのボーラス注射（矢印）によりワクチン接種した動物から枯渇したことを示すグラフである。ＳＨＩＶ １６２Ｐ４攻撃（点線）前後の種々の時点で集めた試料において、ワクチン接種した動物とワクチン接種していない動物からの循環しているＣＤ４＋（黒い丸）、ＣＤ８＋ Ｔ（白い丸）及び全ＣＤ３＋ Ｔリンパ球（星印）の数を求めた。
【図４Ａ−Ｂ】
ＳＨＩＶ１６２Ｐ４曝露後のウイルス負荷と抗ＨＩＶエンベロープ抗体力価の産生を示すグラフである。（Ａ）ウイルス負荷は血漿１ ｍｌ当たりのＲＮＡコピー数として示されている。点線は、この分析の検出限界を示している（＜５００コピー／ｍｌ）。十字：ワクチン接種していない動物ＡＴ５４を、攻撃後のサルエイズ（ＳＡＩＤＳ）の発症の１１１日後に安楽死させた。矢印は、ワクチン接種した動物の末梢にＣＤ８＋細胞が再び現れた時点を示している。（Ｂ）ＳＨＩＶ１６２Ｐ４攻撃後の抗ＨＩＶエンベロープ抗体の産生をＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０に基づくＥＬＩＳＡ法によりモニターした。終点ＥＬＩＳＡ力価が示されている。
【図５】
ワクチン接種したサルとワクチン接種していないサルにおけるＳＩＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ抗原とＨＩＶ ｅｎｖ抗原への動物の血清変換を示す図である。
【図６】
ウサギにおける抗体産生を示す図である。抗エンベロープ抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により求めた。６匹の動物（Ａ１〜Ａ６）を非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原を発現するＤＮＡで、６匹（Ａ７〜Ａ１２）を修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原を発現するＤＮＡで免疫化した。それぞれの免疫化の２週間後に、ＳＦ１６２ｇｐ１４０とΔＶ２ｇｐ１４０のオリゴマータンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法により力価を求めた。点線は各免疫化の時点を示している。
【図７ａ】
ウサギ血清によるＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスとＳＦ１６２ウイルスの中和を示すグラフである。ＳＦ１６２ΔＶ２（Ａ）ウイルスとＳＦ１６２（Ｂ）ウイルスに対する３回目と５回目の免疫化後に集めた血清を用いた中和実験からの結果が示されている。データは少なくとも３回の独立した実験の代表である。記号は３回の実験ウェルからの平均中和％と標準偏差を示している。点線は感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。点線と星印（対照）はＤＮＡベクターのみで免疫化された動物から集めた血清で得られた中和曲線であり、非特異的中和を示している。
【図７Ｂ】
ウサギ血清によるＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスとＳＦ１６２ウイルスの中和を示すグラフである。ＳＦ１６２ΔＶ２（Ａ）ウイルスとＳＦ１６２（Ｂ）ウイルスに対する３回目と５回目の免疫化後に集めた血清を用いた中和実験からの結果が示されている。データは少なくとも３回の独立した実験の代表である。記号は３回の実験ウェルからの平均中和％と標準偏差を示している。点線は感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。点線と星印（対照）はＤＮＡベクターのみで免疫化された動物から集めた血清で得られた中和曲線であり、非特異的中和を示している。
【図８】
アカゲザルにおける抗体の産生を示すグラフである。修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫化した動物（Ｊ４０８とＨ４４５）及び非修飾ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫化した２種の動物（Ｐ６５５とＮ４７２）、並びにＤＮＡベクターのみで免疫化した対照動物（Ｍ８４４とＨ４７３）における抗エンベロープ抗体の産生を対応するタンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法により求めた。点線は免疫化の時点を示している。ＤＮＡ： 動物は各免疫原のｇｐ１４０型を発現するＤＮＡベクターで３回１ヶ月毎に免疫処置した。対照動物はＤＮＡベクターのみを投与した。ＤＮＡ＋タンパク質： 動物は４回免疫処置し、同時にＭＦ−５９Ｃのアジュバントを用いた対応するＣＨＯ産生ｇｐ１４０オリゴマータンパク質で免疫した。対照動物はアジュバントのみを投与した。
【図９Ａ】
アカゲザル血清の中和活性を示すグラフである。修飾ΔＶ２ｇｐ１４０（Ａ）と非修飾（Ｂ）ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物から集めた血清のＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和活性を実施例２に記載されたように求めた。点線は、感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。結果は３〜５回の独立した実験の代表である。データは、３回の実験のウェルからの平均と標準偏差を示している。出血前（プレブリード（Ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ））： ワクチン接種の開始前に集めた血清； ２回目のＤＮＡ及び３回目のＤＮＡ： それぞれ２回目と３回目のＤＮＡ投与の１ヶ月後に集めた血清； 追加刺激の２週間後と４週間後： それぞれＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後と４週間後に集めた血清。
【図９Ｂ】
アカゲザル血清の中和活性を示すグラフである。修飾ΔＶ２ｇｐ１４０（Ａ）と非修飾（Ｂ）ＳＦ１６２ｇｐ１４０免疫原で免疫した動物から集めた血清のＳＦ１６２ウイルスとＳＦ１６２ΔＶ２ウイルスに対する中和活性を実施例２に記載されたように求めた。点線は、感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。結果は３〜５回の独立した実験の代表である。データは、３回の実験のウェルからの平均と標準偏差を示している。出血前（プレブリード（Ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ））： ワクチン接種の開始前に集めた血清； ２回目のＤＮＡ及び３回目のＤＮＡ： それぞれ２回目と３回目のＤＮＡ投与の１ヶ月後に集めた血清； 追加刺激の２週間後と４週間後： それぞれＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後と４週間後に集めた血清。
【図１０】
サル血清による異種クレードＢ ＨＩＶ−１一次分離物の中和を示すグラフである。ワクチンに異種ＨＩＶ−１一次分離物に対する、ＤＮＡ＋タンパク質‘ブースター’免疫の２週間後と４週間後に集めた血清の中和活性を実施例２に記載されたように求めた。点線は、感染の５０％阻止、７０％阻止及び９０％阻止を示している。数値は特異的中和を示し、ワクチン接種後に集めた血清で記録されたウイルス中和％とワクチン接種開始前に集めた血清で記録されたウイルス中和％との間の差として定義される。データ点は、２回の独立した実験からの平均特異的中和％を示している。
【図１１Ａ】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による２回目の‘ブースター’免疫後の結合抗体と中和抗体の産生を示すグラフである。（Ａ）修飾ΔＶ２ｇｐ１４０でワクチン接種した２種のアカゲザル（Ｊ４０８とＨ４４５）における抗エンベロープ抗体の産生を、実施例２に記載されたようにＥＬＩＳＡ法により求めた。点線は免疫化時を示している。ＤＮＡ： その免疫原のｇｐ１４０型を発現するＤＮＡベクターで３回１ヶ月毎に免疫処置した。ＤＮＡ＋タンパク質： 動物は４回目のＤＮＡ免疫処置と精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質を投与した。タンパク質： 動物を精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質のみで免疫した。（Ｂ）２回目の‘追加刺激’後の血清のＳＦ１６２ΔＶ２分離物とＳＦ１６２分離物に対する中和活性を１回目の‘追加刺激’後に集めた血清と比較した（図４を参照されたい）。免疫前血清（出血前（プレブリード））で記録された非特異的中和も示されている。
【図１１Ｂ】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０タンパク質による２回目の‘ブースター’免疫後の結合抗体と中和抗体の産生を示すグラフである。（Ａ）修飾ΔＶ２ｇｐ１４０でワクチン接種した２種のアカゲザル（Ｊ４０８とＨ４４５）における抗エンベロープ抗体の産生を、実施例２に記載されたようにＥＬＩＳＡ法により求めた。点線は免疫化時を示している。ＤＮＡ： その免疫原のｇｐ１４０型を発現するＤＮＡベクターで３回１ヶ月毎に免疫処置した。ＤＮＡ＋タンパク質： 動物は４回目のＤＮＡ免疫処置と精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質を投与した。タンパク質： 動物を精製ΔＶ２ｇｐ１４０オリゴマータンパク質のみで免疫した。（Ｂ）２回目の‘追加刺激’後の血清のＳＦ１６２ΔＶ２分離物とＳＦ１６２分離物に対する中和活性を１回目の‘追加刺激’後に集めた血清と比較した（図４を参照されたい）。免疫前血清（出血前（プレブリード））で記録された非特異的中和も示されている。
【図１２Ａ−Ｂ】
修飾ΔＶ２ｇｐ１４０免疫原で免疫したサル（マカク）から集めた血清における抗Ｖ３ループ抗体の存在を示すグラフである。ＳＦ１６２／ＳＦ１６２ΔＶ２エンベロープ由来のＶ３ループぺプチドを用いたＥＬＩＳＡ法の使用により抗Ｖ３ループ抗体の産生を求めた。（Ａ）まず、捕捉Ｖ３ループぺプチドが線状（４４７Ｄ）Ｖ３エピトープとコンフォメーショナル（３９１−９５Ｄ）Ｖ３ループエピトープを認識する特異的抗Ｖ３ループＭＡｂと相互作用するかを調べた。（Ｂ）次に、２種のワクチン接種した動物から１回目と２回目の追加刺激の２週間後と４週間後に集めた血清中に存在する抗Ｖ３ループ抗体の力価を求めた。比較として同じ血清中に存在する全抗エンベロープ抗体の力価も含めた。
【図１３Ａ】
Ｖ２領域欠失があるＨＩＶ−１クレードＢ免疫原由来修飾エンベロープタンパク質で免疫した２種の動物からの血清によるクレードＡ、Ｅ及びＤのＨＩＶ−１の中和を示すグラフである。
【図１３Ｂ】
Ｖ２領域欠失があるＨＩＶ−１クレードＢ免疫原由来修飾エンベロープタンパク質で免疫した２種の動物からの血清によるクレードＡ、Ｅ及びＤのＨＩＶ−１の中和を示すグラフである。
【図１４】
全長ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質のポリヌクレオチド配列を示すアミノ酸配列である（配列番号１）。
【図１５】
ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質断片のポリヌクレオチド配列を示すアミノ酸配列である（配列番号３）。
【図１６】
全長ＳＦ １６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質を示すアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図１７】
ＳＦ１６２ΔＶ２ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質断片を示すアミノ酸配列である（配列番号４）。
Claims (27)
- 動物を異種ＨＩＶ−１に対して免疫する方法であって、Ｖ２領域欠失がある、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又は少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルス、又はその組合わせを含む免疫原を前記動物に投与する段階を含み、前記動物が前記免疫原以外の少なくとも１種のＨＩＶ−１株に免疫を示す、前記方法。
- 前記免疫が体液性応答を含んでいる、請求項１記載の方法。
- 前記免疫原がクレードＢ ＨＩＶ−１株由来の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含んでいる、請求項１又は２記載の方法。
- 前記ＨＩＶ−１株がＳＦ１６２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質が配列番号２又は配列番号４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードしている前記ＤＮＡが配列番号１又は配列番号３である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記体液性応答が中和抗体を含んでいる、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記体液性応答が防御抗体を含んでいる、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 動物においてＨＩＶ−１に対する異種免疫応答を惹起させる方法であって、Ｖ２領域欠失がある、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又は少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルス、又はその組合わせを含んでいる免疫原で前記動物を免疫する段階を含み、前記動物が前記免疫原以外の少なくとも１種のＨＩＶ−１株にエンベロープ特異免疫応答を示す、前記方法。
- 前記エンベロープ特異免疫応答が体液性応答を含んでいる、請求項１０記載の方法。
- 前記免疫原がクレードＢ ＨＩＶ−１株由来の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含んでいる、請求項１０又は１１記載の方法。
- 前記ＨＩＶ−１株がＳＦ１６２である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質が配列番号２又は配列番号４である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードしている前記ＤＮＡが配列番号１又は配列番号３である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記体液性応答が中和抗体を含んでいる、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記体液性応答が防御抗体を含んでいる、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
- 動物をＨＩＶ−１ウイルスに対して免疫するための医薬組成物であって、Ｖ２領域欠失がある、少なくとも１種の修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片、又は少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルス、又はその組合わせの異種エンベロープ特異免疫応答惹起有効量と、薬学的に許容しうる担体又は賦形剤とを含む、前記医薬組成物。
- 前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質がクレードＢ ＨＩＶ−１株由来である、請求項１９記載の医薬組成物。
- 前記ＨＩＶ−１株がＳＦ１６２である、請求項１９又は２０記載の医薬組成物。
- 前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質が配列番号２又は配列番号４である、請求項１９〜２１記載の医薬組成物。
- 少なくとも１種の前記修飾ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードしている前記ＤＮＡが配列番号１又は配列番号３である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 化合物が、野生型ＨＩＶ−１に対する防御抗体を産生できる動物において少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対して防御抗体を産生できるかを評価する方法であって、前記動物を前記化合物で免疫する段階と、前記動物のＣＤ８＋ Ｔリンパ球を枯渇させる段階と、前記動物において少なくとも１種の異種ＨＩＶ−１株に対する防御抗体の存在を評価する段階とを含む、前記方法。
- 前記枯渇させる段階が抗ＣＤ８モノクローナル抗体を前記動物に投与することによって行われる、請求項２４記載の方法。
- 前記化合物がＨＩＶ由来ポリぺプチド又はその断片、又は前記ぺプチド又はその断片をコードしているＤＮＡ又はウイルスである、請求項２４又は２５記載の方法。
- 前記免疫する段階がＤＮＡワクチン、タンパク質、又はその組合わせで行われる、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
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