JP2004517700A - 活性物質を含有する再吸収性骨セメント - Google Patents
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Abstract
骨組織成長をその箇所で促進するインビボ移植用の水性骨代替物について記載する。この物は、骨代替材料、遅い放出の骨成長因子、速い放出の抗微生物性物質を含む。さらに、この骨代替物の調製のためのキットおよび方法を開示する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、再吸収性骨代替材料、抗微生物性物質、骨成長因子を含むインビボ移植用の新規な再吸収性骨代替物、およびその調製用のキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【0002】
再吸収性骨代替材料は、当技術分野で既知であり、薄層または塊の形状で使用でき、少なくとも1Mpaの圧抵抗および生きている骨組織への付着を提供する凝集力を有する化学的結合物質であると、本明細書では定義する。骨代替材料は、骨代替の移植材料であって、患者の身体運動によっても保持できるだけの強さがある。骨代替物は、近接の生きている骨細胞が入り込むことができ、また時間とともに分解するべきものであり、分解によって空間をつくる。生存骨細胞が再吸収性材料により残された該空間中に成長することができる。この過程は骨導入(osteotransduction)として知られている。骨導入は、骨欠失に適用された後の骨代替材料が生存の骨組織により徐々に置きかえられていく過程であると定義できる。2つの過程が骨導入に役割を演じる:第1は代替材料の再吸収であり、第2は骨組織の生物的成長である。こうして、骨代替物により最初に占められていた空間が生存骨で満たされるようになる。
【0003】
当技術分野において、固体の微粒子状で硬化性プラスチック再吸収性骨代替材料が知られている。固体の微粒子は、顆粒や立方体などの形態に予め作られた固体の粒子を含むことができ、人体または動物体の意図する骨成長の部位に運ばれる。予め作られた骨代替材料は当技術分野で既知であり、例えば、ポリ酢酸(PLA)やポリグリコール酸(PGA)の粒子がある。当業者は他の適当な予め作られた骨代替材料を想起できるであろう(Tadjoedinetal.,Clin.OralImplantsRes.(2000),11,p334―344)。予め作られた粒子を含む骨代替物は、骨代替粒子を意図する部位、例えば、骨障害部位に固定するために、バイオ適合性接着材料も含み得る。この接着材料はペーストの形態であり得る。当業者は他の適当な接着材料を想起できるであろう(Driessenetal.,J.Mater.Sci.MaterinMed(1993),4,p503―508)。
【0004】
再吸収性骨代替材料はまた、硬化性プラスチック骨材料のセメント材料をペーストなどの形態で含むことがあり、これは人体または動物体への適用後にその場で硬化する。このような骨代替材料は骨セメントとしても知られ、例えば、リン酸カルシウムを基とするセメントがある。この骨セメント組成物は、その場で生理的条件で硬化した後、膠着されたセメント粒子の微構造を含み、そこでは空洞が隣接のセメント粒子間に存在する。微細孔は、脊椎動物の細胞が通過できないような大きさをもっている細孔であると定義する。この細孔の直径は通常1μm以下である。このような骨材料は当技術分野で周知であり、例えば、WO96/39202およびWO99/34844(両者を出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。
【0005】
本明細書において、「抗微生物性物質」とは、MIC(最小発育阻止濃度)10μM以下を有するすべての化合物または調製物であると定義する。化合物または調製物のMICは、2.5x104E.coli株D31を一夜37℃で0.25x100TSB(TrypticaseSolidBroth)中で、好ましくは等張条件で、マイクロプレートなどの化合物の濃度を増しながら、インキュベートすることにより測定できる。化合物または調製物は、各々のMICが10μM以下であるときに「抗微生物性」であると定義する。適当な抗微生物性物質の例には、抗生物質、ラクトフェリンなどの抗微生物性タンパク質、抗微生物性ペプチド(AMP)および胆汁酸塩がある。
【0006】
本明細書において、「骨成長因子」は、前造骨細胞における酵素アルカリホスファターゼの活性を高め得る化合物または調製物であると定義する(参照、Blometal.,J.Biomed.Master.Res.50,67―74,2000)。成ラットの長骨から咀嚼骨フラグメントのコラゲナーゼ処理により得られた前造骨細胞を組織培養原質上の単層として成長さす。化合物または調製物は、媒質1mlにつき25μg以下、好ましくは10μg以下の濃度において、細胞のアルカリホスファターゼ活性が2以上の係数で増加したときに、骨成長因子であると定義する。アルカリホスファターゼ活性は骨成長因子の添加10日後に測定する。
【0007】
WO96/39202に記載されている再吸収性骨セメント代替物は、バイオ適合性ヒドロキシアパタイト骨代替材料を含み、そして骨成長因子および抗生物質の両者を含み得る。骨成長因子は骨組織成長を促進するために組み込まれている。一方、抗生物質は細菌の成長を制限するために、または細菌感染を回避するために組み込まれている。
【0008】
しかし、WO96/39202の骨代替物においては、抗生物質と骨成長因子が類似の比較的遅い放出プロファイルを有する。抗生物質と骨成長因子の両方が骨セメントからそれらが適用される箇所の直接的環境へ緩やかに放出されることは、上記の効果の両方を消失せしめる。抗生物質の遅い放出は、存在の微生物が該抗生物質に対する耐性を獲得するのを可能にし、その結果、治癒するのが難しく、骨形成過程を破壊する重い感染をもたらす。そのため骨成長因子の作用が妨害される。一方、該放出プロファイルは、生存の骨組織が再吸収性骨代替物に置き換わる骨導入過程に何ヶ月、何年もかかるので(TadjoedinE:¨Histomorphometryofboneformedinthereconstructedmaillarysinus¨AcademicThesis,VrijeUniversiteitAmsterdam,TheNetherlands2000,ISBN90―9014251―7)、成長因子にとって速すぎる。今回、最適の医療効果を得るためには、抗生物質と骨成長因子について完全に異なる特性が必要であることが分かった。先行の技術に記載の組成物は、この必要条件に合致しない。
【0009】
先行技術の再吸収性骨代替物で、抗微生物性物質に対する耐性が骨代替物の埋め込み箇所に生じ得るので、WO96/39202に開示されている抗生物質の組込みの選択は、当技術分野において純粋に理論的なものと考えられる。当業者は耐性微生物の発生の危険性を承知しており、抗生物質を含む再吸収性骨代替物は好まれておらず、実用にもなっていない。
【0010】
上記の理由により、骨セメント中の抗生物質および成長因子の併用に対し当技術分野で忌避または偏見がある。
【0011】
WO90/15586およびWO99/17710に、骨成長因子または抗生物質などのバイオ活性分子を含むバイオ分解性骨セメントが記載されている。しかし、これらに記載された抗生物質(ゲンタマイシン、バンコマイシン、アミノグリコシド)は、骨成長因子に類似する遅い放出プロファイルをもっている。骨成長因子と抗生物質の併用は記載されていないし、示唆もされていない。
【0012】
さらにEP−A−0701824に、骨成長因子または抗生物質(ゲンタマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、クリンダマイシン)などのバイオ活性分子を含むアクリレート/メタアクリレートを基にする骨セメントが記載されている。これらの抗生物質は骨成長因子に類似する遅い放出プロファイルを有する。ここでも、骨成長因子と抗生物質の併用は記載されていないし、示唆もされていない。
【発明の開示】
【0013】
本発明は、驚くべき優れた性質を有する新規の骨代替物を提供する。この物は、骨代替材料、抗微生物性物質、骨成長因子を含む再吸収性骨代替物である。抗微生物性物質は速い放出プロファイルを持ち、骨成長因子は遅い放出プロファイルを有する。
【0014】
本明細書における「速い放出プロファイル」とは、37℃で、抗微生物性物質の60%、好ましくは70%以上が骨代替物から48時間以内に放出されることと定義する。骨代替物は固体形態にあり、生理的リン酸緩衝液(PBS、pH7.2)中に懸濁されている。この緩衝液中に抗微生物性物質が放出される。
【0015】
「遅い放出プロファイル」とは、37℃で、骨成長因子の全量の5%以下、好ましくは2%以下が骨代替物から48時間後に放出されることと定義する。骨代替物は固体形態にあり、生理的リン酸緩衝液(pH7.2)中に懸濁されている。この緩衝液中に骨成長因子が放出される。
【0016】
当業者は、抗微生物性物質または骨成長因子の放出プロファイルを容易に測定できる。骨代替物、好ましくは1cm3の立方体を生理的リン酸緩衝液中に一定時間に懸濁する。生理的塩緩衝液中の抗微生物性物質または骨成長因子の濃度は、一定の時点でまたは継続的に容易に調べることができ、それでもって放出プロファイルを測定する。
【0017】
速い放出プロファイルを有する抗微生物性物質および遅い放出プロファイルを有する骨成長因子を含む再吸収性骨代替物を準備することにより、先行技術の再吸収性骨代替物に非常に勝る利点を達成できる。骨代替物中に速い放出プロファイルを有する抗微生物性物質と遅い放出プロファイル有する骨成長因子が存在することは、手術の前および間における感染の可能性を効果的に制御し、抗微生物性物質に対する耐性の発生を回避するという利点をもたらす。一方、骨成長因子は骨代替物から長期間にわたって、例えば数ヶ月間、非常に少量で運搬される。本発明の骨代替物中の成長因子は、固体または硬化の骨代替材料を通して実質的に拡散し得るのではなく、そこから主にセメント材料の再吸収過程の結果として放出される。さらに、インビボで生じ得るセメント材料の割れ目形成時に、骨成長因子もその割れ目の表面を経て放出され得る。セメント材料のこの再吸収は、遅い過程であり、周りの骨組織の貫入力に依存的であるので、骨成長因子が非常に長い期間(数ヶ月)、低い量で運搬される。
【0018】
このように、本発明の骨代替物において、抗微生物性物質が数日間に実質的な完全性で容易に運搬され、一方、骨成長因子が遅い放出プロファイルを示す。本発明の骨代替物のおける速い放出の抗微生物性物質と遅い放出の骨成長因子の併用によって、骨成長因子は、宿主の免疫系における骨成長因子の活性化機能により抗微生物性物質の機能を驚くほど支持する。損傷の回復の促進が予測に比して見られる。さらに、骨導入の後相において、骨成長因子の遅い継続的な放出が骨代替材料の再吸収および骨組織の形成を促進する。このことは、治癒相での抗微生物性物質と骨成長因子の相乗作用、および骨代替物再吸収の後相での骨導入促進により、治療効果を改善する。
【0019】
本発明の迅速かつ完全な放出の抗微生物性物質と遅い放出の骨成長因子との併用は、最適の骨代替物を提供する。この物は、骨外科処置後の傷回復を、耐性菌株の発生の危険性なしに、促進および改善し、その後の骨導入を促進できる。
【0020】
上記したように、先行文献のいずれにおいても、骨セメントにおいて骨成長因子を抗生物質と組み合せるときに、抗生物質の放出プロファイルが骨成長因子に比して速くなければならないことは、実施も示唆もなされていない。
【0021】
骨成長因子は生理的pHとして好ましくは非電荷である。このような成長因子は、骨代替材料の微細孔から拡散工程により実質的に放出されないで、上記のように、骨代替物の分解に際し大部分が必要な遅い放出プロファイルを確保する。
【0022】
好ましい実施態様において、骨成長因子はTGFβスーパーファミリーから選択する。用語「TGFβスーパーファミリー」は当技術分野で既知である(KingsleyD.M.GenesandDevelopment8:133―146,1994)。とりわけ、TGFβに加えて、成長・分化因子(GDF)および骨形態生成性タンパク質(BMP)がこのスーパーファミリーに属する(MassagueJ.,AnimalReviewofCellBiology,6:597―641,1990)。しかし、非常に多数の骨成長因子が当技術分野で既知であって、それらを本発明の骨代替物に効果的および好都合に使用できる。この点について、WO96/39202に記載されている骨成長因子を挙げることができる。
【0023】
本発明の骨代替物は、好ましくは骨成長因子0.1−30μgを骨代替物のcm3につき含む。
【0024】
骨成長因子は、タンパク質などの担体と好ましくは結合している。このタンパク質は、好ましくは血清タンパク質であり、例えば、ウシやヒトの血清アルブミンである。本発明の骨代替物における骨成長因子の量が比較的低いので、骨成長因子の放出プロファイルに干渉する非特異的な結合相互作用を回避できる。担体タンパク質は調製時における成長因子のガラスやプラスチック容器などとの非特異的結合を避けることができ、そしてさらに、タンパク質は骨セメント中の所定の箇所に成長因子を保持し、骨代替物、例えば硬化セメント中の骨セメントからの拡散を防ぐのに役立ち、それによってセメントからの成長因子の遅い放出を確保すると考え得る。また、他のバイオ適合性担体材料も使用でき、例えば、すべてのヒト血漿やヒトコラーゲンである。担体は骨成長因子よりも過剰であるべきが好ましく、従って、骨代替材料cm3につき、0.1−4mg以上の担体が骨代替材料中に好ましくは存在する。
【0025】
上記のように、再吸収性骨代替材料中の組込みのために提案されている抗生物質が示す放出プロファイルは遅すぎる。
【0026】
今回驚くべきことに、骨代替物中の成長因子と抗微生物性ペプチド(AMP)の両者の組込みが、上記に説明したような予期しない相乗的性質を有する優れた骨代替物を提供することを見出した。本発明者らは、小さい抗微生物性ペプチドの組込みが、広範な種類の骨代替物、例えば、PLAなどの固体骨代替粒子または硬化リン酸カルシウム製の骨セメント、特に硬化リン酸カルシウム製の骨セメントからの速い放出プロファイル能力を有することを発見した。
【0027】
抗微生物性ペプチドは当技術分野で既知である。AMPは自然界に生じる抗生物質性分子であり、とりわけ唾液中にヒスタチンやデフェンシンとして存在する。ヒスタチンは、強力な抗菌および抗真菌作用を有し、哺乳動物などの脊椎動物における感染に対する天然の防御システムの部分を形成する(参照、Oppenheimetal.,J.Biol.Chem.263(2000)pp7472―7477およびSelstedtetal.,J.Clin.Invest.76(1985)pp1436―1439)。以前の研究において、ヒスタチンの合成および末端切除誘導体が広いスペクトルの抗菌活性を示すことが知られている。これには、制御が非常に難しい細菌であるメチシリン耐性Staphylococcusaureusに対する活性が含まれる(Lyaruuetal.,J.Dent.Res.79,IADRAbstractsNo.669,p227(2000))。
【0028】
驚くべきことに、脂肪族性を有するAMPの合成および末端切除誘導体、特にヒスタチン由来の誘導体は、元の天然のAMPに比して、改善された速い放出プロファイルを示すことを見出した。さらに驚くべきことに、この誘導体は等張条件で実質的に完全な抗微生物活性を保持し、組織中で好都合に使用され得ることを意味している。一方、唾液中の天然のヒスタチンは、口腔内などの低張条件で最適の活性を通常有する。このようなヒスタチン誘導体は、WO00/367678およびWO00/01427(両者を出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。WO00/01427は、抗微生物性ペプチドを含む骨セメントを開示するが、骨セメントから該ペプチドの放出プロファイルについてはなにも言及していない。速い放出プロファイルを有する抗微生物性ペプチドと遅い放出プロファイルを有する骨成長因子との骨セメントにおける併用について、WO00/01427中になんらの記載も示唆もない。
【0029】
下記において、用語「抗微生物性ペプチド」または「AMP」は、上記のような該誘導体の合成および末端切除の形態を含む。
【0030】
本発明の骨代替物における組込み用の好ましい抗微生物性ペプチドは、長さが10−25アミノ酸の抗微生物性ペプチドであって、2つの立体的に対立的に配置されるサブドメイン(「末端の半分」をも意味する)からなる少なくとも10アミノ酸のドメインを含む。ここで、第1ドメインのアミノ酸の多くが生理的pHで正に電荷され、第2サブドメインのアミノ酸の多くが生理的pHで電荷されていない。
【0031】
今回、このようなドメインを含むAMPが骨代替物からの驚くべき速さの拡散プロファイルを有すること、および等張条件で高い抗生物質活性を有することを明らかにする。
【0032】
抗生物質活性は、AMPの脂肪族性により生じると考える。脂肪族性により、AMPは細菌膜に侵入でき、最終的に細菌細胞の漏出を起こす。脂肪族性のために、従って抗微生物活性のために、ドメインにおいて、両サブドメイン間の電荷相違が生理的pHで存在することが重要である。これに、サブドメインは互いに立体的に対立的に配置される。このサブドメインの配置はいくつかの態様でなされ得る。例えば、ドメインの三次構造がαヘリックス構造を含むときに、第1サブドメインがドメインのアミノ末端半分に位置でき、そして第2サブドメインがそのカルボキシ末端半分に位置でき、また、その逆でもあり得る。この配置は「末端」脂肪族性といえる。
【0033】
軸方向脂肪族性を有するAMPの例を図1に示す。該ペプチドは配列番号4のアミノ酸配列を有する。サブドメインもドメイン中に軸方法に配置され得る。すなわち、ヘリックスの1面が軸方法観点から主に正に電荷され(第1サブドメインを構成する)、ヘリックスの他の反対面が軸方法観点から主に非電荷である(第2サブドメインを構成する)。この配置は「軸方向」脂肪族性といえる。軸方向脂肪族性を有するAMPの例を表2に示す。該ペプチドは配列番号3のアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、上記の軸方向または末端の配置に2つのサブドメインを含むβシート構造を含み得る。主要構造レベル上で(すなわち、平らなアミノ酸配列のレベル上で)、サブドメインの末端配置は両サブドメインがアミノ酸の連続的な伸長により互いに形成されていることを意味する。好ましくは、両サブドメインは互いに隣接している。しかし、両サブドメインは、脂肪族性、それによる抗微生物活性、速い放出プロファイルが保持されている限り、例えば追加のアミノ酸により互いに隔たっていることがある。軸方向配置の場合、サブドメインのアミノ酸は主要構造レベル上のアミノ酸の連続的な伸長により明確にならないで、サブドメインは単にその三次構造によって明確になる。
【0034】
他の好ましい実施態様において、抗微生物性を有するラクトフェリン誘導ペプチドを骨セメントに組み込む。特に、ラクトフェリン誘導ペプチドは天然ラクトフェリンのアミノ酸11−30を含み(配列番号5)、このペプチドはMRSA感染の原因である多くの細菌および真菌に対して優れた抗微生物活性を示す。非常に特殊な実施態様において、本発明の骨セメントは、天然ラクトフェリンの最初の11末端アミノ酸に相当するアミノ酸配列を含むペプチドを含み(配列番号6)、MRSA感染の原因である大部分の細菌および真菌に対して改善された抗微生物活性を示す。好ましくは、このペプチドは長さが25以下のアミノ酸であって、好ましくは上記のアミノ酸配列(配列番号5または6)よりなる。
【0035】
抗微生物性ペプチドを有するシスタチン誘導ペプチドも本発明の骨セメントに好都合に組み込むことができる。シスタチンは、ヒト、動物、植物に存在する天然のタンパク質であって、システイン・プロテイナーゼ類を特異的に阻害し得る(Blankenvoordeetal.,Biol.Chem.377,847―850(1996))。porfiromonasgingivalisなどにより生じる炎症過程は、シスタチンおよびシスタチン誘導ペプチドにより効果的に阻害され得る。これらのペプチドは、速い放出プロファイルを示し、本発明の骨セメントにおいて効果的である。好都合に、シスタチンの14アミノ末端アミノ酸(配列番号7)を含むシスタチン誘導ペプチドを骨セメント中に組み込み得る。
【0036】
本発明の骨代替物に組み込まれるAMPの最適な抗生物質活性にとって、両サブドメインの電荷相違ができるだけ大きいときが非常に好都合である。従って、ドメインに負電荷のアミノ酸がないのが好ましい。
【0037】
本発明の骨セメント組成物中への組み込み用の最適に予めつくられペプチドにおいて、AMPまたはAMP誘導体のドメインは、好ましくは下記の配列の1つを含有する:
【表1】
【0038】
配列番号1は、天然ヒトヒスタチン5の天然カルボキシ末端であって、DH5とも言われる(Helmenhorstetal.,1997,Biochem.J.326,pp.39―45)。すなわち、末端切除ヒスタチン誘導体である。配列番号2、3、4は、配列番号1を基とする合成誘導体である。配列番号4または6を特に含む合成誘導体が高い抗生物質活性に好ましく、非常に適した速い放出プロファイルを得ることができる。
【0039】
AMPの上記ドメインは25アミノ酸の長さを持ち得るが、好ましくはさらに短い。好ましくは、AMPは15未満のアミノ酸を含有し、より好ましくは、ドメインが全ペプチドを形成する。短いペプチドが長いペプチドに比して、より速い骨代替物からの放出プロファイルを示す。従って、該放出をいくらか遅くすべきときは、長い目のAMPの使用を考慮できる。ドメインは他のアミノ酸によって片側または両側で挟まれ得る。互いに、ヘッドとヘッド、ヘッドとテイル、テイルとテイルで結合し得る2つのドメインを含むAMPを使用することが好ましい。当技術分野で、このような配座の調製についての方法は既知である。参照、WO99/37678。骨セメントからのAMPなどの抗微生物性物質の運搬を遅らすことも可能である。例えば、AMPを適当なポリマー、例えば、ポリアクリルアミド、キサンタングム、グアガム、カルボキシメチルセルロース中に封入する。当業者は、所望の目的のために抗微生物性物質をどのように封入するかを知っている。
【0040】
予め作られた固体粒子を、本発明の再吸収性骨セメント代替物において都合よく使用できる。予め作られた粒子は、立体や球体などの形態であってよく、損傷骨の空間を満たすのに使用できる。他の実施態様において、粒子は骨またはその部分の予め形成された形態を有し、その骨や部分に置き換わる。予め形成された形態は、例えば、整形外科および脊髄外科での使用に適しており、例えば、手首、中手、下顎、肋骨、脊椎、これらの部分の形態を有し得る。
【0041】
予め作られた粒子は、既知の適当なバイオ適合再吸収性材料、例えば、PLA、PGAまたは(体外)硬化リン酸カルシウム製骨セメントを含み得る。
【0042】
予め作られた骨代替粒子の場合、骨成長因子をこの粒子の微細孔中に組込むことができる。抗生物質は該粒子上に被覆でき、抗生物質の速い放出が可能となる。このような被覆のために、上記の封入された抗生物質も使用できる。別個の接着剤を患者の骨損傷箇所における粒子の互いのおよび/または骨材料との結合に使用するとき、抗微生物性物質を接着材料中に組み込むことができる。抗微生物性物質は、速い放出プロファイルが得られる限り、粒子中に組み込むこともできる。
【0043】
好ましい実施態様において、骨代替物は硬化性骨セメント材料を含む。この材料で優れた結果が得られることが分かった。好ましくは、セメントはリン酸カルシウムを含む。これは、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、ヒドロキシリン灰石、これらの2以上の混合物よりなる群から選択する。AMP、特に上記の誘導体は、リン酸カルシウム製硬化性骨セメントに組み込まれたときに、必要な遅い放出プロファイルを示すことが分かった。当業者は、目的とする適用とっての上記化合物の適切な比率が分かるであろう。
【0044】
骨代替物は、PLAやPGAなどの固体バイオ適合再吸収性材料の外側構造中に都合よく存在せしめることもできる。外側構造は立方体の形態であり得て、そこに本発明の骨代替物を組み込む。このような立方体は開いていても閉じていてもよく、例えば、立方体の帯のみからなる。外側構造の他の形態も可能であり、例えば、四面体や八面体または上記のように骨やその部分の形に対応する形態である。骨代替材料が滞留するこのような構造は、いわゆる「ケージ(cages)」として当技術分野で知られ、例えば、脊椎外科で使用される。
【0045】
成長因子および抗微生物性物質の両方は骨代替物を通して好ましくは一様に運搬される。予め作られた固体粒子を含む骨代替物が被覆を有するか、または接着剤と組合されている場合、成長因子は該固体粒子を通して好ましくは一様に運搬される。抗微生物性物質は、この場合、被覆または接着剤を通して一様に運搬される。
【0046】
当技術分野において、骨代替物の調製には、水相を乾燥セメント材料と混合し、型形成可能ペーストなどの形態で骨代替マスを得る。これは患者の身体での適用の前後に硬化し得る。
【0047】
しかし、骨成長因子の添加には問題がある。比較的少量の骨成長因子を必要とするので(0.1−10μg/gセメント)、上記のように、非特異的な結合による成長因子の損失を避けるために、担体、好ましくは上記の担体タンパク質を要することが分かった。従って、骨成長因子を、担体材料をすでに含む水性媒質に加えることが重要である。しかし、骨成長因子を骨代替物の調製に完全に必要な量まで加えると、担体の対応量が骨代替材料の硬化過程に干渉することが分かった。さらに、骨成長因子を、骨セメント粉末材料と適合しない緩衝液中に供給できる。例えば、4mMのHClを含む緩衝液中でTGFβを安定に保存する。セメント粉末に加えられた液相がこのような量のHClを含むことは、好ましくは避けるべきである。本発明により、従って、担体量と非適合性イオンを制限するために、骨成長因子を比較的少量の第1量で準備する。第2量を該第1量に加えるか、両量をセメント材料に別個に加える。
【0048】
従って、本発明は、本発明の再吸収性骨代替物の調製方法にも関する。この方法は、液体水性成分と骨セメント粉末材料を含む乾燥成分とを混合する工程を含む。液体成分の調製は下記の工程を含む:
a)担体タンパク質を含む媒質中に骨成長因子を加えることにより調製される第1水性媒質の第1量を準備すること、
b)第2水性媒質の第2量を準備すること。
【0049】
すでに担体を含む第1水性媒質の第1量と骨成長因子を混合するとき、担体の量は骨成長因子の活性の損失を防ぐのに十分であって、骨代替物の硬化過程に干渉するに至らないことが、今回判明した。第2水性媒質の第2量は、骨代替物の調製に要する量を補充する。第1と第2の両媒質の混合を、乾燥成分との混合の前に行うことができる。第1および第2の媒質が異なる量である場合、多い方の量を最初に加えるのが好ましい。第1と第2の水性媒質の量比は、好ましくは1:1−1:10である。
【0050】
上記したように、担体の量は骨成長因子の量よりも過剰であるのが好ましい。過剰係数100−1000が効果的であるが、当業者は適当な過剰係数を見つけ得るであろう。
【0051】
本発明の好ましい実施態様において、抗微生物性物質を第2媒質または第1と第2媒質の混合物に加える。この場合、抗微生物性物質は水性成分中に存在する。
【0052】
本発明方法の別の実施態様において、抗微生物性物質を乾燥形態の乾燥成分中に組み込む。この場合、AMPを好ましくは凍結乾燥し、セメント製剤(例えば、BiobonRfromETEXCorp.CambridgeMA,USA)と混合して、乾燥成分をつくる。
【0053】
骨代替物は、乾燥骨セメント粉末gにつき抗微生物性物質0.1−10mgおよび骨成長因子0,1−10μg含むのが好ましい。
上記したように、骨成長因子はTGFβを好ましくは含み、抗微生物性物質は上記に定義された脂肪族抗微生物性ペプチドを好ましくは含む。
【0054】
本発明は、本発明の再吸収性骨代替物の調製用のキットにも関する。これは下記を含む:
− 骨成長因子および担体タンパク質を含む液体水性成分、および
− 骨セメント材料を含む固体の成分。
【0055】
抗微生物性物質を液体または固体の成分あるいは両方、好ましくは固体成分中に組み込む。
このキットでもって、骨代替物を両成分の混合により容易に調製できる。
【0056】
好ましくは、キットの液体成分は、固体成分中の粉末骨セメント材料gにつき下記のものを含む:
− 骨成長因子、好ましくはTGFβ0.2−20μg、
− 担体タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミン0.2−8mg、
− 抗微生物性物質、好ましくは上記に定義された脂肪族抗微生物性ペプチド0−20mg。
抗微生物性物質を乾燥または液体の成分あるいは両方に組み込む。その全量は本実施態様において、0.2−20mgである。
【0057】
キットの水性成分は2サブ成分に分けることもできる。そのうち、第1サブ成分は骨成長因子および担体を第1水性媒質中に含み、第2サブ成分は骨成長因子および担体のない第2水性媒質を含む。上記したように、骨代替材料中の担体の量を制限することが好ましい。また、骨成長因子の安定な保存に必要な媒質の量は骨代替材料中で制限すべきである。この媒質は骨代替材料の適当な硬化に干渉することがあるからである。従って、第1サブ成分は比較的高い量の担体および非適合性の第1培質を含むが、これらの成分は第2水性媒質の添加により低い臨界量に稀釈する。
本発明を以下の非制限的実施例でさらに説明する。
【実施例1】
【0058】
TGFβおよび抗微生物性ペプチドを含む硬化性骨代替物
抗微生物性ペプチドDHVAR―5(LLLFLLKKRKKRKY、配列番号4)1mgをBiobonRセメント粉末(ETEXCorp.cambridge,MA,USA)1gと混合する。成長因子であるトランスフォーミング成長因子―β(TGFβ)を0.2%血清アルブミンの4mMのHCl溶液に懸濁させて、溶液mlにつきTGFβ1μgとし、第1水性媒質をつくる。この懸濁液を、4%Na2PO4を含む第2水性媒質の等量と混合する。第1と第2の媒質を合わせて、混合する。
【0059】
乾燥成分、DHVAR―5に富むセメント粉末1gを液体成分、TGFβに富むセメント液体0.8mlに混合する。これで5分間で固まる成型可能なペーストを得る。得られた骨代替物はセメントgにつき抗微生物性ペプチド1mgおよびTGFβ0.4μgを含む。
【実施例2】
【0060】
骨代替物の放出速度
骨代替物から骨成長因子および抗微生物性ペプチドの放出速度を下記のように測定した:
放出試験において、セメント粉末(40mg)をガラスプレート上でTGFβ含有の液体(13.3μl)と混合して、133ngのTGFβおよび250μgのDHVAR―5を有する53mgのセメントペーストを得た。1分間混合した後、セメントペーストを、直径5mmで高さ1mmのTeflon成型器に入れた。2分後にセメントペレットを成型器から取り出し、12ウエル培養プレート(Coster,Cambridge,MA,USA)のウエルに加えた。10%ウシ胎児血清を有する完全培養基(Dulbecco修飾Eagle培地(DMEM,Gibco―BRLLifeTechnologiesLtd.Paisley))をウエルにつき1mlで、上記のTGFβDHVAR5に富むセメントペレットを含有するウエルに加えた。マルチウエルプレートを5%CO2中で37℃、湿度95%でインキュベートした。培養基を適当な時間間隔(0.5、1、2、4、24、48時間および1、2、4、8週)で完全に新しくし、培養サンプルをTGFβおよびDHVAR5の測定に供するまで20℃で保存した。市販の酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)(Promega,Madison,WI,USA)を用いて、TGFβを収集の培養基において測定した。培養基を除去した後、少量のセメントペレットをモルタルでウエル中48時間粉砕した。フラグメントを新鮮な培養基中1時間インキュベートした。ついで培養基を取りだし、TGFβおよびDHVAR5の測定のために保存した。放出されたDHVAR5量を、培養基サンプルを毛管ゾーン電気泳動にかけて、測定した。S.aureusに対する生物活性を標準殺菌アッセイで確認した。TGFβを標準免疫分析および上記の細胞成長促進能の検査により検定した。
【0061】
セメントの作成時にTGFβおよびDHVAR5を組み込んだセメントペレット(53mgのセメント中、133ngのTGFβおよび250μgのDHVAR5)からのTGFβ放出を夫々図3および4に示す。迅速なTGFβ放出が最初の4時間であり、非常に遅い放出が続いた。4時間後の累積放出はセメント中に混合されたTGFβの元の量の0.5%であり、48時間後に1%に増加した。その後TGFβ放出は徐々に継続し、次の8週間で最大0.1%が放出された(データは示さず)。48時間でフラグメント化されたペレットは、フラグメント化後1時間以内に約0.5%TGFβを放出し(データは示さず)、放出が表面依存的であることを示した。DHVAR5は48時間以内に70%の放出を示した。4日後、80%以上の抗微生物性ペプチドがセメント材料から放出された。同様の結果を配列番号1−3および5−7のペプチドについて得た。類似の試験で抗生物質ゲンタマイシンが不完全で遅い放出速度を示した。
【実施例3】
【0062】
骨代替物のインビボでの抗菌活性および骨導入活性
本試験は、再吸収性骨セメントにおける短時間放出抗微生物性物質および長時間放出成長因子の組合せの医療効果についての改善を示す。
(実験手法の詳細については、J.P.Eerenbergの学位論文¨Taurolininthetreatmentofexperimentalpost―traumaticosteomyelitis¨,VrijeUniversiteit,Amsterdam,TheNederlands,1996を参照のこと。)
【0063】
モデルはウサギにおけるForeignBodyBoneInfectionModelである。全身麻酔をして、鋼線をウサギの大腿骨に、大転子に開けた穴から挿入した。次いで第2の穴を骨幹に開け、メチシリン耐性Staphylococcusaureusの接種物を髄洞に導入した。この方法は外傷後の外来物関連骨感染に類似する。自己セティング骨セメントを用いて、骨幹の穴を塞ぐ。再吸収性自己セティング骨セメントとして実施例1の骨代替物を用いた。対照としてDHVAR5およびTGFβのない対応のセメントを使用した。さらに、DHVAR5またはTGFβのいずれかを有する対応のセメント製剤を使用した。
【0064】
試験を6群で行った。各群8ウサギからなる。すなわち、下記の群を用いた。
群1:添加なし(対照群)
群2:DHVAR5のみ
群3:TGFβのみ
群4:DHVAR5+TGFβ
群5:DHVAR5
群6:DHVAR5+TGFβ
【0065】
4週間後、群1、2,3、4の動物を殺し、大腿部を骨髄炎について、X線、骨および軟組織の細菌培養、組織学的検査を用いて調べた。群1動物の90%および群3動物の80%が骨髄炎になっていた。群2および4のいずれの動物も骨髄炎がなかったが、炎症反応は群2よりも群4で早く収まった。
【0066】
8週間後に群5および6の動物を殺した。いずれの動物も骨髄炎を示さなかったが、群5では,多くのセメントをなお含有する骨幹に小さい骨が形成した。群6では、骨髄炎がなく、一方、群5に比して、穴を充填する骨量が大きく、残存セメント量が少量で、骨導入の加速を示した。
【0067】
合わせて、このデータは、組合された豊富さが骨髄炎の発生を防ぎ、骨導入を加速および改善したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図1】軸方向脂肪族性を有するAMP(配列番号4のアミノ酸配列)を例示する。
【図2】軸方向脂肪族性を有するAMP(配列番号3のアミノ酸配列)を例示する。
【図3】TGFβの累積放出を示す。
【図4】DHVAR5の累積放出を示す。
【0001】
本発明は、再吸収性骨代替材料、抗微生物性物質、骨成長因子を含むインビボ移植用の新規な再吸収性骨代替物、およびその調製用のキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【0002】
再吸収性骨代替材料は、当技術分野で既知であり、薄層または塊の形状で使用でき、少なくとも1Mpaの圧抵抗および生きている骨組織への付着を提供する凝集力を有する化学的結合物質であると、本明細書では定義する。骨代替材料は、骨代替の移植材料であって、患者の身体運動によっても保持できるだけの強さがある。骨代替物は、近接の生きている骨細胞が入り込むことができ、また時間とともに分解するべきものであり、分解によって空間をつくる。生存骨細胞が再吸収性材料により残された該空間中に成長することができる。この過程は骨導入(osteotransduction)として知られている。骨導入は、骨欠失に適用された後の骨代替材料が生存の骨組織により徐々に置きかえられていく過程であると定義できる。2つの過程が骨導入に役割を演じる:第1は代替材料の再吸収であり、第2は骨組織の生物的成長である。こうして、骨代替物により最初に占められていた空間が生存骨で満たされるようになる。
【0003】
当技術分野において、固体の微粒子状で硬化性プラスチック再吸収性骨代替材料が知られている。固体の微粒子は、顆粒や立方体などの形態に予め作られた固体の粒子を含むことができ、人体または動物体の意図する骨成長の部位に運ばれる。予め作られた骨代替材料は当技術分野で既知であり、例えば、ポリ酢酸(PLA)やポリグリコール酸(PGA)の粒子がある。当業者は他の適当な予め作られた骨代替材料を想起できるであろう(Tadjoedinetal.,Clin.OralImplantsRes.(2000),11,p334―344)。予め作られた粒子を含む骨代替物は、骨代替粒子を意図する部位、例えば、骨障害部位に固定するために、バイオ適合性接着材料も含み得る。この接着材料はペーストの形態であり得る。当業者は他の適当な接着材料を想起できるであろう(Driessenetal.,J.Mater.Sci.MaterinMed(1993),4,p503―508)。
【0004】
再吸収性骨代替材料はまた、硬化性プラスチック骨材料のセメント材料をペーストなどの形態で含むことがあり、これは人体または動物体への適用後にその場で硬化する。このような骨代替材料は骨セメントとしても知られ、例えば、リン酸カルシウムを基とするセメントがある。この骨セメント組成物は、その場で生理的条件で硬化した後、膠着されたセメント粒子の微構造を含み、そこでは空洞が隣接のセメント粒子間に存在する。微細孔は、脊椎動物の細胞が通過できないような大きさをもっている細孔であると定義する。この細孔の直径は通常1μm以下である。このような骨材料は当技術分野で周知であり、例えば、WO96/39202およびWO99/34844(両者を出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。
【0005】
本明細書において、「抗微生物性物質」とは、MIC(最小発育阻止濃度)10μM以下を有するすべての化合物または調製物であると定義する。化合物または調製物のMICは、2.5x104E.coli株D31を一夜37℃で0.25x100TSB(TrypticaseSolidBroth)中で、好ましくは等張条件で、マイクロプレートなどの化合物の濃度を増しながら、インキュベートすることにより測定できる。化合物または調製物は、各々のMICが10μM以下であるときに「抗微生物性」であると定義する。適当な抗微生物性物質の例には、抗生物質、ラクトフェリンなどの抗微生物性タンパク質、抗微生物性ペプチド(AMP)および胆汁酸塩がある。
【0006】
本明細書において、「骨成長因子」は、前造骨細胞における酵素アルカリホスファターゼの活性を高め得る化合物または調製物であると定義する(参照、Blometal.,J.Biomed.Master.Res.50,67―74,2000)。成ラットの長骨から咀嚼骨フラグメントのコラゲナーゼ処理により得られた前造骨細胞を組織培養原質上の単層として成長さす。化合物または調製物は、媒質1mlにつき25μg以下、好ましくは10μg以下の濃度において、細胞のアルカリホスファターゼ活性が2以上の係数で増加したときに、骨成長因子であると定義する。アルカリホスファターゼ活性は骨成長因子の添加10日後に測定する。
【0007】
WO96/39202に記載されている再吸収性骨セメント代替物は、バイオ適合性ヒドロキシアパタイト骨代替材料を含み、そして骨成長因子および抗生物質の両者を含み得る。骨成長因子は骨組織成長を促進するために組み込まれている。一方、抗生物質は細菌の成長を制限するために、または細菌感染を回避するために組み込まれている。
【0008】
しかし、WO96/39202の骨代替物においては、抗生物質と骨成長因子が類似の比較的遅い放出プロファイルを有する。抗生物質と骨成長因子の両方が骨セメントからそれらが適用される箇所の直接的環境へ緩やかに放出されることは、上記の効果の両方を消失せしめる。抗生物質の遅い放出は、存在の微生物が該抗生物質に対する耐性を獲得するのを可能にし、その結果、治癒するのが難しく、骨形成過程を破壊する重い感染をもたらす。そのため骨成長因子の作用が妨害される。一方、該放出プロファイルは、生存の骨組織が再吸収性骨代替物に置き換わる骨導入過程に何ヶ月、何年もかかるので(TadjoedinE:¨Histomorphometryofboneformedinthereconstructedmaillarysinus¨AcademicThesis,VrijeUniversiteitAmsterdam,TheNetherlands2000,ISBN90―9014251―7)、成長因子にとって速すぎる。今回、最適の医療効果を得るためには、抗生物質と骨成長因子について完全に異なる特性が必要であることが分かった。先行の技術に記載の組成物は、この必要条件に合致しない。
【0009】
先行技術の再吸収性骨代替物で、抗微生物性物質に対する耐性が骨代替物の埋め込み箇所に生じ得るので、WO96/39202に開示されている抗生物質の組込みの選択は、当技術分野において純粋に理論的なものと考えられる。当業者は耐性微生物の発生の危険性を承知しており、抗生物質を含む再吸収性骨代替物は好まれておらず、実用にもなっていない。
【0010】
上記の理由により、骨セメント中の抗生物質および成長因子の併用に対し当技術分野で忌避または偏見がある。
【0011】
WO90/15586およびWO99/17710に、骨成長因子または抗生物質などのバイオ活性分子を含むバイオ分解性骨セメントが記載されている。しかし、これらに記載された抗生物質(ゲンタマイシン、バンコマイシン、アミノグリコシド)は、骨成長因子に類似する遅い放出プロファイルをもっている。骨成長因子と抗生物質の併用は記載されていないし、示唆もされていない。
【0012】
さらにEP−A−0701824に、骨成長因子または抗生物質(ゲンタマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、クリンダマイシン)などのバイオ活性分子を含むアクリレート/メタアクリレートを基にする骨セメントが記載されている。これらの抗生物質は骨成長因子に類似する遅い放出プロファイルを有する。ここでも、骨成長因子と抗生物質の併用は記載されていないし、示唆もされていない。
【発明の開示】
【0013】
本発明は、驚くべき優れた性質を有する新規の骨代替物を提供する。この物は、骨代替材料、抗微生物性物質、骨成長因子を含む再吸収性骨代替物である。抗微生物性物質は速い放出プロファイルを持ち、骨成長因子は遅い放出プロファイルを有する。
【0014】
本明細書における「速い放出プロファイル」とは、37℃で、抗微生物性物質の60%、好ましくは70%以上が骨代替物から48時間以内に放出されることと定義する。骨代替物は固体形態にあり、生理的リン酸緩衝液(PBS、pH7.2)中に懸濁されている。この緩衝液中に抗微生物性物質が放出される。
【0015】
「遅い放出プロファイル」とは、37℃で、骨成長因子の全量の5%以下、好ましくは2%以下が骨代替物から48時間後に放出されることと定義する。骨代替物は固体形態にあり、生理的リン酸緩衝液(pH7.2)中に懸濁されている。この緩衝液中に骨成長因子が放出される。
【0016】
当業者は、抗微生物性物質または骨成長因子の放出プロファイルを容易に測定できる。骨代替物、好ましくは1cm3の立方体を生理的リン酸緩衝液中に一定時間に懸濁する。生理的塩緩衝液中の抗微生物性物質または骨成長因子の濃度は、一定の時点でまたは継続的に容易に調べることができ、それでもって放出プロファイルを測定する。
【0017】
速い放出プロファイルを有する抗微生物性物質および遅い放出プロファイルを有する骨成長因子を含む再吸収性骨代替物を準備することにより、先行技術の再吸収性骨代替物に非常に勝る利点を達成できる。骨代替物中に速い放出プロファイルを有する抗微生物性物質と遅い放出プロファイル有する骨成長因子が存在することは、手術の前および間における感染の可能性を効果的に制御し、抗微生物性物質に対する耐性の発生を回避するという利点をもたらす。一方、骨成長因子は骨代替物から長期間にわたって、例えば数ヶ月間、非常に少量で運搬される。本発明の骨代替物中の成長因子は、固体または硬化の骨代替材料を通して実質的に拡散し得るのではなく、そこから主にセメント材料の再吸収過程の結果として放出される。さらに、インビボで生じ得るセメント材料の割れ目形成時に、骨成長因子もその割れ目の表面を経て放出され得る。セメント材料のこの再吸収は、遅い過程であり、周りの骨組織の貫入力に依存的であるので、骨成長因子が非常に長い期間(数ヶ月)、低い量で運搬される。
【0018】
このように、本発明の骨代替物において、抗微生物性物質が数日間に実質的な完全性で容易に運搬され、一方、骨成長因子が遅い放出プロファイルを示す。本発明の骨代替物のおける速い放出の抗微生物性物質と遅い放出の骨成長因子の併用によって、骨成長因子は、宿主の免疫系における骨成長因子の活性化機能により抗微生物性物質の機能を驚くほど支持する。損傷の回復の促進が予測に比して見られる。さらに、骨導入の後相において、骨成長因子の遅い継続的な放出が骨代替材料の再吸収および骨組織の形成を促進する。このことは、治癒相での抗微生物性物質と骨成長因子の相乗作用、および骨代替物再吸収の後相での骨導入促進により、治療効果を改善する。
【0019】
本発明の迅速かつ完全な放出の抗微生物性物質と遅い放出の骨成長因子との併用は、最適の骨代替物を提供する。この物は、骨外科処置後の傷回復を、耐性菌株の発生の危険性なしに、促進および改善し、その後の骨導入を促進できる。
【0020】
上記したように、先行文献のいずれにおいても、骨セメントにおいて骨成長因子を抗生物質と組み合せるときに、抗生物質の放出プロファイルが骨成長因子に比して速くなければならないことは、実施も示唆もなされていない。
【0021】
骨成長因子は生理的pHとして好ましくは非電荷である。このような成長因子は、骨代替材料の微細孔から拡散工程により実質的に放出されないで、上記のように、骨代替物の分解に際し大部分が必要な遅い放出プロファイルを確保する。
【0022】
好ましい実施態様において、骨成長因子はTGFβスーパーファミリーから選択する。用語「TGFβスーパーファミリー」は当技術分野で既知である(KingsleyD.M.GenesandDevelopment8:133―146,1994)。とりわけ、TGFβに加えて、成長・分化因子(GDF)および骨形態生成性タンパク質(BMP)がこのスーパーファミリーに属する(MassagueJ.,AnimalReviewofCellBiology,6:597―641,1990)。しかし、非常に多数の骨成長因子が当技術分野で既知であって、それらを本発明の骨代替物に効果的および好都合に使用できる。この点について、WO96/39202に記載されている骨成長因子を挙げることができる。
【0023】
本発明の骨代替物は、好ましくは骨成長因子0.1−30μgを骨代替物のcm3につき含む。
【0024】
骨成長因子は、タンパク質などの担体と好ましくは結合している。このタンパク質は、好ましくは血清タンパク質であり、例えば、ウシやヒトの血清アルブミンである。本発明の骨代替物における骨成長因子の量が比較的低いので、骨成長因子の放出プロファイルに干渉する非特異的な結合相互作用を回避できる。担体タンパク質は調製時における成長因子のガラスやプラスチック容器などとの非特異的結合を避けることができ、そしてさらに、タンパク質は骨セメント中の所定の箇所に成長因子を保持し、骨代替物、例えば硬化セメント中の骨セメントからの拡散を防ぐのに役立ち、それによってセメントからの成長因子の遅い放出を確保すると考え得る。また、他のバイオ適合性担体材料も使用でき、例えば、すべてのヒト血漿やヒトコラーゲンである。担体は骨成長因子よりも過剰であるべきが好ましく、従って、骨代替材料cm3につき、0.1−4mg以上の担体が骨代替材料中に好ましくは存在する。
【0025】
上記のように、再吸収性骨代替材料中の組込みのために提案されている抗生物質が示す放出プロファイルは遅すぎる。
【0026】
今回驚くべきことに、骨代替物中の成長因子と抗微生物性ペプチド(AMP)の両者の組込みが、上記に説明したような予期しない相乗的性質を有する優れた骨代替物を提供することを見出した。本発明者らは、小さい抗微生物性ペプチドの組込みが、広範な種類の骨代替物、例えば、PLAなどの固体骨代替粒子または硬化リン酸カルシウム製の骨セメント、特に硬化リン酸カルシウム製の骨セメントからの速い放出プロファイル能力を有することを発見した。
【0027】
抗微生物性ペプチドは当技術分野で既知である。AMPは自然界に生じる抗生物質性分子であり、とりわけ唾液中にヒスタチンやデフェンシンとして存在する。ヒスタチンは、強力な抗菌および抗真菌作用を有し、哺乳動物などの脊椎動物における感染に対する天然の防御システムの部分を形成する(参照、Oppenheimetal.,J.Biol.Chem.263(2000)pp7472―7477およびSelstedtetal.,J.Clin.Invest.76(1985)pp1436―1439)。以前の研究において、ヒスタチンの合成および末端切除誘導体が広いスペクトルの抗菌活性を示すことが知られている。これには、制御が非常に難しい細菌であるメチシリン耐性Staphylococcusaureusに対する活性が含まれる(Lyaruuetal.,J.Dent.Res.79,IADRAbstractsNo.669,p227(2000))。
【0028】
驚くべきことに、脂肪族性を有するAMPの合成および末端切除誘導体、特にヒスタチン由来の誘導体は、元の天然のAMPに比して、改善された速い放出プロファイルを示すことを見出した。さらに驚くべきことに、この誘導体は等張条件で実質的に完全な抗微生物活性を保持し、組織中で好都合に使用され得ることを意味している。一方、唾液中の天然のヒスタチンは、口腔内などの低張条件で最適の活性を通常有する。このようなヒスタチン誘導体は、WO00/367678およびWO00/01427(両者を出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。WO00/01427は、抗微生物性ペプチドを含む骨セメントを開示するが、骨セメントから該ペプチドの放出プロファイルについてはなにも言及していない。速い放出プロファイルを有する抗微生物性ペプチドと遅い放出プロファイルを有する骨成長因子との骨セメントにおける併用について、WO00/01427中になんらの記載も示唆もない。
【0029】
下記において、用語「抗微生物性ペプチド」または「AMP」は、上記のような該誘導体の合成および末端切除の形態を含む。
【0030】
本発明の骨代替物における組込み用の好ましい抗微生物性ペプチドは、長さが10−25アミノ酸の抗微生物性ペプチドであって、2つの立体的に対立的に配置されるサブドメイン(「末端の半分」をも意味する)からなる少なくとも10アミノ酸のドメインを含む。ここで、第1ドメインのアミノ酸の多くが生理的pHで正に電荷され、第2サブドメインのアミノ酸の多くが生理的pHで電荷されていない。
【0031】
今回、このようなドメインを含むAMPが骨代替物からの驚くべき速さの拡散プロファイルを有すること、および等張条件で高い抗生物質活性を有することを明らかにする。
【0032】
抗生物質活性は、AMPの脂肪族性により生じると考える。脂肪族性により、AMPは細菌膜に侵入でき、最終的に細菌細胞の漏出を起こす。脂肪族性のために、従って抗微生物活性のために、ドメインにおいて、両サブドメイン間の電荷相違が生理的pHで存在することが重要である。これに、サブドメインは互いに立体的に対立的に配置される。このサブドメインの配置はいくつかの態様でなされ得る。例えば、ドメインの三次構造がαヘリックス構造を含むときに、第1サブドメインがドメインのアミノ末端半分に位置でき、そして第2サブドメインがそのカルボキシ末端半分に位置でき、また、その逆でもあり得る。この配置は「末端」脂肪族性といえる。
【0033】
軸方向脂肪族性を有するAMPの例を図1に示す。該ペプチドは配列番号4のアミノ酸配列を有する。サブドメインもドメイン中に軸方法に配置され得る。すなわち、ヘリックスの1面が軸方法観点から主に正に電荷され(第1サブドメインを構成する)、ヘリックスの他の反対面が軸方法観点から主に非電荷である(第2サブドメインを構成する)。この配置は「軸方向」脂肪族性といえる。軸方向脂肪族性を有するAMPの例を表2に示す。該ペプチドは配列番号3のアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、上記の軸方向または末端の配置に2つのサブドメインを含むβシート構造を含み得る。主要構造レベル上で(すなわち、平らなアミノ酸配列のレベル上で)、サブドメインの末端配置は両サブドメインがアミノ酸の連続的な伸長により互いに形成されていることを意味する。好ましくは、両サブドメインは互いに隣接している。しかし、両サブドメインは、脂肪族性、それによる抗微生物活性、速い放出プロファイルが保持されている限り、例えば追加のアミノ酸により互いに隔たっていることがある。軸方向配置の場合、サブドメインのアミノ酸は主要構造レベル上のアミノ酸の連続的な伸長により明確にならないで、サブドメインは単にその三次構造によって明確になる。
【0034】
他の好ましい実施態様において、抗微生物性を有するラクトフェリン誘導ペプチドを骨セメントに組み込む。特に、ラクトフェリン誘導ペプチドは天然ラクトフェリンのアミノ酸11−30を含み(配列番号5)、このペプチドはMRSA感染の原因である多くの細菌および真菌に対して優れた抗微生物活性を示す。非常に特殊な実施態様において、本発明の骨セメントは、天然ラクトフェリンの最初の11末端アミノ酸に相当するアミノ酸配列を含むペプチドを含み(配列番号6)、MRSA感染の原因である大部分の細菌および真菌に対して改善された抗微生物活性を示す。好ましくは、このペプチドは長さが25以下のアミノ酸であって、好ましくは上記のアミノ酸配列(配列番号5または6)よりなる。
【0035】
抗微生物性ペプチドを有するシスタチン誘導ペプチドも本発明の骨セメントに好都合に組み込むことができる。シスタチンは、ヒト、動物、植物に存在する天然のタンパク質であって、システイン・プロテイナーゼ類を特異的に阻害し得る(Blankenvoordeetal.,Biol.Chem.377,847―850(1996))。porfiromonasgingivalisなどにより生じる炎症過程は、シスタチンおよびシスタチン誘導ペプチドにより効果的に阻害され得る。これらのペプチドは、速い放出プロファイルを示し、本発明の骨セメントにおいて効果的である。好都合に、シスタチンの14アミノ末端アミノ酸(配列番号7)を含むシスタチン誘導ペプチドを骨セメント中に組み込み得る。
【0036】
本発明の骨代替物に組み込まれるAMPの最適な抗生物質活性にとって、両サブドメインの電荷相違ができるだけ大きいときが非常に好都合である。従って、ドメインに負電荷のアミノ酸がないのが好ましい。
【0037】
本発明の骨セメント組成物中への組み込み用の最適に予めつくられペプチドにおいて、AMPまたはAMP誘導体のドメインは、好ましくは下記の配列の1つを含有する:
【表1】
【0038】
配列番号1は、天然ヒトヒスタチン5の天然カルボキシ末端であって、DH5とも言われる(Helmenhorstetal.,1997,Biochem.J.326,pp.39―45)。すなわち、末端切除ヒスタチン誘導体である。配列番号2、3、4は、配列番号1を基とする合成誘導体である。配列番号4または6を特に含む合成誘導体が高い抗生物質活性に好ましく、非常に適した速い放出プロファイルを得ることができる。
【0039】
AMPの上記ドメインは25アミノ酸の長さを持ち得るが、好ましくはさらに短い。好ましくは、AMPは15未満のアミノ酸を含有し、より好ましくは、ドメインが全ペプチドを形成する。短いペプチドが長いペプチドに比して、より速い骨代替物からの放出プロファイルを示す。従って、該放出をいくらか遅くすべきときは、長い目のAMPの使用を考慮できる。ドメインは他のアミノ酸によって片側または両側で挟まれ得る。互いに、ヘッドとヘッド、ヘッドとテイル、テイルとテイルで結合し得る2つのドメインを含むAMPを使用することが好ましい。当技術分野で、このような配座の調製についての方法は既知である。参照、WO99/37678。骨セメントからのAMPなどの抗微生物性物質の運搬を遅らすことも可能である。例えば、AMPを適当なポリマー、例えば、ポリアクリルアミド、キサンタングム、グアガム、カルボキシメチルセルロース中に封入する。当業者は、所望の目的のために抗微生物性物質をどのように封入するかを知っている。
【0040】
予め作られた固体粒子を、本発明の再吸収性骨セメント代替物において都合よく使用できる。予め作られた粒子は、立体や球体などの形態であってよく、損傷骨の空間を満たすのに使用できる。他の実施態様において、粒子は骨またはその部分の予め形成された形態を有し、その骨や部分に置き換わる。予め形成された形態は、例えば、整形外科および脊髄外科での使用に適しており、例えば、手首、中手、下顎、肋骨、脊椎、これらの部分の形態を有し得る。
【0041】
予め作られた粒子は、既知の適当なバイオ適合再吸収性材料、例えば、PLA、PGAまたは(体外)硬化リン酸カルシウム製骨セメントを含み得る。
【0042】
予め作られた骨代替粒子の場合、骨成長因子をこの粒子の微細孔中に組込むことができる。抗生物質は該粒子上に被覆でき、抗生物質の速い放出が可能となる。このような被覆のために、上記の封入された抗生物質も使用できる。別個の接着剤を患者の骨損傷箇所における粒子の互いのおよび/または骨材料との結合に使用するとき、抗微生物性物質を接着材料中に組み込むことができる。抗微生物性物質は、速い放出プロファイルが得られる限り、粒子中に組み込むこともできる。
【0043】
好ましい実施態様において、骨代替物は硬化性骨セメント材料を含む。この材料で優れた結果が得られることが分かった。好ましくは、セメントはリン酸カルシウムを含む。これは、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、ヒドロキシリン灰石、これらの2以上の混合物よりなる群から選択する。AMP、特に上記の誘導体は、リン酸カルシウム製硬化性骨セメントに組み込まれたときに、必要な遅い放出プロファイルを示すことが分かった。当業者は、目的とする適用とっての上記化合物の適切な比率が分かるであろう。
【0044】
骨代替物は、PLAやPGAなどの固体バイオ適合再吸収性材料の外側構造中に都合よく存在せしめることもできる。外側構造は立方体の形態であり得て、そこに本発明の骨代替物を組み込む。このような立方体は開いていても閉じていてもよく、例えば、立方体の帯のみからなる。外側構造の他の形態も可能であり、例えば、四面体や八面体または上記のように骨やその部分の形に対応する形態である。骨代替材料が滞留するこのような構造は、いわゆる「ケージ(cages)」として当技術分野で知られ、例えば、脊椎外科で使用される。
【0045】
成長因子および抗微生物性物質の両方は骨代替物を通して好ましくは一様に運搬される。予め作られた固体粒子を含む骨代替物が被覆を有するか、または接着剤と組合されている場合、成長因子は該固体粒子を通して好ましくは一様に運搬される。抗微生物性物質は、この場合、被覆または接着剤を通して一様に運搬される。
【0046】
当技術分野において、骨代替物の調製には、水相を乾燥セメント材料と混合し、型形成可能ペーストなどの形態で骨代替マスを得る。これは患者の身体での適用の前後に硬化し得る。
【0047】
しかし、骨成長因子の添加には問題がある。比較的少量の骨成長因子を必要とするので(0.1−10μg/gセメント)、上記のように、非特異的な結合による成長因子の損失を避けるために、担体、好ましくは上記の担体タンパク質を要することが分かった。従って、骨成長因子を、担体材料をすでに含む水性媒質に加えることが重要である。しかし、骨成長因子を骨代替物の調製に完全に必要な量まで加えると、担体の対応量が骨代替材料の硬化過程に干渉することが分かった。さらに、骨成長因子を、骨セメント粉末材料と適合しない緩衝液中に供給できる。例えば、4mMのHClを含む緩衝液中でTGFβを安定に保存する。セメント粉末に加えられた液相がこのような量のHClを含むことは、好ましくは避けるべきである。本発明により、従って、担体量と非適合性イオンを制限するために、骨成長因子を比較的少量の第1量で準備する。第2量を該第1量に加えるか、両量をセメント材料に別個に加える。
【0048】
従って、本発明は、本発明の再吸収性骨代替物の調製方法にも関する。この方法は、液体水性成分と骨セメント粉末材料を含む乾燥成分とを混合する工程を含む。液体成分の調製は下記の工程を含む:
a)担体タンパク質を含む媒質中に骨成長因子を加えることにより調製される第1水性媒質の第1量を準備すること、
b)第2水性媒質の第2量を準備すること。
【0049】
すでに担体を含む第1水性媒質の第1量と骨成長因子を混合するとき、担体の量は骨成長因子の活性の損失を防ぐのに十分であって、骨代替物の硬化過程に干渉するに至らないことが、今回判明した。第2水性媒質の第2量は、骨代替物の調製に要する量を補充する。第1と第2の両媒質の混合を、乾燥成分との混合の前に行うことができる。第1および第2の媒質が異なる量である場合、多い方の量を最初に加えるのが好ましい。第1と第2の水性媒質の量比は、好ましくは1:1−1:10である。
【0050】
上記したように、担体の量は骨成長因子の量よりも過剰であるのが好ましい。過剰係数100−1000が効果的であるが、当業者は適当な過剰係数を見つけ得るであろう。
【0051】
本発明の好ましい実施態様において、抗微生物性物質を第2媒質または第1と第2媒質の混合物に加える。この場合、抗微生物性物質は水性成分中に存在する。
【0052】
本発明方法の別の実施態様において、抗微生物性物質を乾燥形態の乾燥成分中に組み込む。この場合、AMPを好ましくは凍結乾燥し、セメント製剤(例えば、BiobonRfromETEXCorp.CambridgeMA,USA)と混合して、乾燥成分をつくる。
【0053】
骨代替物は、乾燥骨セメント粉末gにつき抗微生物性物質0.1−10mgおよび骨成長因子0,1−10μg含むのが好ましい。
上記したように、骨成長因子はTGFβを好ましくは含み、抗微生物性物質は上記に定義された脂肪族抗微生物性ペプチドを好ましくは含む。
【0054】
本発明は、本発明の再吸収性骨代替物の調製用のキットにも関する。これは下記を含む:
− 骨成長因子および担体タンパク質を含む液体水性成分、および
− 骨セメント材料を含む固体の成分。
【0055】
抗微生物性物質を液体または固体の成分あるいは両方、好ましくは固体成分中に組み込む。
このキットでもって、骨代替物を両成分の混合により容易に調製できる。
【0056】
好ましくは、キットの液体成分は、固体成分中の粉末骨セメント材料gにつき下記のものを含む:
− 骨成長因子、好ましくはTGFβ0.2−20μg、
− 担体タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミン0.2−8mg、
− 抗微生物性物質、好ましくは上記に定義された脂肪族抗微生物性ペプチド0−20mg。
抗微生物性物質を乾燥または液体の成分あるいは両方に組み込む。その全量は本実施態様において、0.2−20mgである。
【0057】
キットの水性成分は2サブ成分に分けることもできる。そのうち、第1サブ成分は骨成長因子および担体を第1水性媒質中に含み、第2サブ成分は骨成長因子および担体のない第2水性媒質を含む。上記したように、骨代替材料中の担体の量を制限することが好ましい。また、骨成長因子の安定な保存に必要な媒質の量は骨代替材料中で制限すべきである。この媒質は骨代替材料の適当な硬化に干渉することがあるからである。従って、第1サブ成分は比較的高い量の担体および非適合性の第1培質を含むが、これらの成分は第2水性媒質の添加により低い臨界量に稀釈する。
本発明を以下の非制限的実施例でさらに説明する。
【実施例1】
【0058】
TGFβおよび抗微生物性ペプチドを含む硬化性骨代替物
抗微生物性ペプチドDHVAR―5(LLLFLLKKRKKRKY、配列番号4)1mgをBiobonRセメント粉末(ETEXCorp.cambridge,MA,USA)1gと混合する。成長因子であるトランスフォーミング成長因子―β(TGFβ)を0.2%血清アルブミンの4mMのHCl溶液に懸濁させて、溶液mlにつきTGFβ1μgとし、第1水性媒質をつくる。この懸濁液を、4%Na2PO4を含む第2水性媒質の等量と混合する。第1と第2の媒質を合わせて、混合する。
【0059】
乾燥成分、DHVAR―5に富むセメント粉末1gを液体成分、TGFβに富むセメント液体0.8mlに混合する。これで5分間で固まる成型可能なペーストを得る。得られた骨代替物はセメントgにつき抗微生物性ペプチド1mgおよびTGFβ0.4μgを含む。
【実施例2】
【0060】
骨代替物の放出速度
骨代替物から骨成長因子および抗微生物性ペプチドの放出速度を下記のように測定した:
放出試験において、セメント粉末(40mg)をガラスプレート上でTGFβ含有の液体(13.3μl)と混合して、133ngのTGFβおよび250μgのDHVAR―5を有する53mgのセメントペーストを得た。1分間混合した後、セメントペーストを、直径5mmで高さ1mmのTeflon成型器に入れた。2分後にセメントペレットを成型器から取り出し、12ウエル培養プレート(Coster,Cambridge,MA,USA)のウエルに加えた。10%ウシ胎児血清を有する完全培養基(Dulbecco修飾Eagle培地(DMEM,Gibco―BRLLifeTechnologiesLtd.Paisley))をウエルにつき1mlで、上記のTGFβDHVAR5に富むセメントペレットを含有するウエルに加えた。マルチウエルプレートを5%CO2中で37℃、湿度95%でインキュベートした。培養基を適当な時間間隔(0.5、1、2、4、24、48時間および1、2、4、8週)で完全に新しくし、培養サンプルをTGFβおよびDHVAR5の測定に供するまで20℃で保存した。市販の酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)(Promega,Madison,WI,USA)を用いて、TGFβを収集の培養基において測定した。培養基を除去した後、少量のセメントペレットをモルタルでウエル中48時間粉砕した。フラグメントを新鮮な培養基中1時間インキュベートした。ついで培養基を取りだし、TGFβおよびDHVAR5の測定のために保存した。放出されたDHVAR5量を、培養基サンプルを毛管ゾーン電気泳動にかけて、測定した。S.aureusに対する生物活性を標準殺菌アッセイで確認した。TGFβを標準免疫分析および上記の細胞成長促進能の検査により検定した。
【0061】
セメントの作成時にTGFβおよびDHVAR5を組み込んだセメントペレット(53mgのセメント中、133ngのTGFβおよび250μgのDHVAR5)からのTGFβ放出を夫々図3および4に示す。迅速なTGFβ放出が最初の4時間であり、非常に遅い放出が続いた。4時間後の累積放出はセメント中に混合されたTGFβの元の量の0.5%であり、48時間後に1%に増加した。その後TGFβ放出は徐々に継続し、次の8週間で最大0.1%が放出された(データは示さず)。48時間でフラグメント化されたペレットは、フラグメント化後1時間以内に約0.5%TGFβを放出し(データは示さず)、放出が表面依存的であることを示した。DHVAR5は48時間以内に70%の放出を示した。4日後、80%以上の抗微生物性ペプチドがセメント材料から放出された。同様の結果を配列番号1−3および5−7のペプチドについて得た。類似の試験で抗生物質ゲンタマイシンが不完全で遅い放出速度を示した。
【実施例3】
【0062】
骨代替物のインビボでの抗菌活性および骨導入活性
本試験は、再吸収性骨セメントにおける短時間放出抗微生物性物質および長時間放出成長因子の組合せの医療効果についての改善を示す。
(実験手法の詳細については、J.P.Eerenbergの学位論文¨Taurolininthetreatmentofexperimentalpost―traumaticosteomyelitis¨,VrijeUniversiteit,Amsterdam,TheNederlands,1996を参照のこと。)
【0063】
モデルはウサギにおけるForeignBodyBoneInfectionModelである。全身麻酔をして、鋼線をウサギの大腿骨に、大転子に開けた穴から挿入した。次いで第2の穴を骨幹に開け、メチシリン耐性Staphylococcusaureusの接種物を髄洞に導入した。この方法は外傷後の外来物関連骨感染に類似する。自己セティング骨セメントを用いて、骨幹の穴を塞ぐ。再吸収性自己セティング骨セメントとして実施例1の骨代替物を用いた。対照としてDHVAR5およびTGFβのない対応のセメントを使用した。さらに、DHVAR5またはTGFβのいずれかを有する対応のセメント製剤を使用した。
【0064】
試験を6群で行った。各群8ウサギからなる。すなわち、下記の群を用いた。
群1:添加なし(対照群)
群2:DHVAR5のみ
群3:TGFβのみ
群4:DHVAR5+TGFβ
群5:DHVAR5
群6:DHVAR5+TGFβ
【0065】
4週間後、群1、2,3、4の動物を殺し、大腿部を骨髄炎について、X線、骨および軟組織の細菌培養、組織学的検査を用いて調べた。群1動物の90%および群3動物の80%が骨髄炎になっていた。群2および4のいずれの動物も骨髄炎がなかったが、炎症反応は群2よりも群4で早く収まった。
【0066】
8週間後に群5および6の動物を殺した。いずれの動物も骨髄炎を示さなかったが、群5では,多くのセメントをなお含有する骨幹に小さい骨が形成した。群6では、骨髄炎がなく、一方、群5に比して、穴を充填する骨量が大きく、残存セメント量が少量で、骨導入の加速を示した。
【0067】
合わせて、このデータは、組合された豊富さが骨髄炎の発生を防ぎ、骨導入を加速および改善したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図1】軸方向脂肪族性を有するAMP(配列番号4のアミノ酸配列)を例示する。
【図2】軸方向脂肪族性を有するAMP(配列番号3のアミノ酸配列)を例示する。
【図3】TGFβの累積放出を示す。
【図4】DHVAR5の累積放出を示す。
Claims (19)
- インビボ移植用の再吸収性骨代替物であって、骨セメント材料、抗微生物性物質および骨成長因子を含み、うち、
− 抗微生物性物質は速い放出プロファイルを有し、および
− 骨成長因子は遅い放出プロファイルを有する、
再吸収性骨代替物。 - 骨成長因子が生理的pHで非電荷である、請求項1の再吸収性骨代替物。
- 骨成長因子がTGFβスーパーファミリーから選ばれ、骨成長因子が好ましくはTGFβを含む、請求項1または2の再吸収性骨代替物。
- 骨代替材料cm3につき骨成長因子0.1−30μgを含む、請求項1−3のいずれかの再吸収性骨代替物。
- 担体タンパク質を含み、このタンパク質は、血清タンパク質、好ましくは血清アルブミンから好ましくは選ばれ、好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である、請求項1−4のいずれかの再吸収性骨代替物。
- 骨代替材料cm3につき、好ましくは担体タンパク質を含む担体0.1−4mgを含む、請求項5の再吸収性骨代替物。
- 抗微生物性物質が長さ10−25アミノ酸の抗微生物性ペプチドを含み、このペプチドは2つの立体的に対立的に配置されたサブドメインからなる少なくとも10アミノ酸のドメインを含み、ここで、第1サブドメインのアミノ酸の多くが生理的pHで正に電荷され、第2サブドメインのアミノ酸の多くが生理的pHで電荷されていない、請求項1−6のいずれかの再吸収性骨代替物。
- 抗微生物性ペプチドのドメインが生理的pHで負に電荷されるアミノ酸を有していない、請求項7の再吸収性骨代替物。
- 抗微生物性ペプチドのドメインが下記:
KRKFHEKHHSHRGY(配列番号1)
KRLFKKLKFSLRKY(配列番号2)
KRLFKKLLFSLRKY(配列番号3)
LLLFLLKKRKKRKY(配列番号4)
FKCRRWQWRMKKLG(配列番号5)
GRRRRSVQWCA (配列番号6)
SSSKEENRIIPGGI(配列番号7)
から選ばれ、このドメインは好ましくはLLLFLLKKRKKRKY(配列番号4)またはGRRRRSVQWCA(配列番号6)である、請求項7または8の再吸収性骨代替物。 - 硬化性骨セメント材料を含む、請求項1−9のいずれかの再吸収性骨代替物。
- バイオ適合再吸収性材料の被覆された固体骨セメント粒子を含み、粒子中に骨成長因子が組み込まれ、被覆が抗微生物性物質を含む、請求項1−10のいずれかの再吸収性骨代替物。
- 骨セメント材料gにつき下記:
− 骨成長因子0,1−10μg、
− 抗微生物性物質0,1−10mg
を含む、請求項1−11のいずれかの再吸収性骨代替物。 - 請求項1−12のいずれかの再吸収性骨代替物を調製する方法であって、液体水性成分と骨セメント粉末材料を含む乾燥成分とを混合する工程を含み、液体成分の調製は下記の工程:
a)担体タンパク質を含む媒質中に骨成長因子を加えることにより調製される第1水性媒質の第1量を準備すること、
b)第2水性媒質の第2量を準備すること
を含む方法。 - 第1水性媒質と第2水性媒質の量比が1:1−1:10である、請求項13の方法。
- 骨成長因子がTGFβを含む、請求項13または14の方法。
- 抗微生物性物質が請求項7−9に定義される抗微生物性ペプチドを含む、請求項13−15のいずれかの方法。
- 請求項1−16のいずれかの再吸収性骨代替物の調製用のキットであって、
− 骨成長因子および担体タンパク質を含む液体水性成分、および
− 粉末骨セメント材料を含む固体成分
を含み、抗微生物性物質が液体または固体の成分あるいは両方、好ましくは固体成分中に組み込れているキット。 - 液体成分が粉末骨セメント材料gにつき下記:
− 骨成長因子、好ましくはTGFβ0.2−20μg、
− 担体タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミン0.2−8mg、
− 抗微生物性物質、好ましくは請求項7−9に定義された脂肪族抗微生物性ペプチド0−20mg、および水または水性媒質1mlを含み、
キット中の抗微生物性物質の量が粉末骨セメントgにつき少なくとも0.2mgである、請求項17のキット。 - 水性成分は2水性サブ成分を含み、第1サブ成分は骨成長因子および担体を第1水性媒質中に含み、第2サブ成分は骨成長因子および担体のない第2水性媒質を含む、請求項17または18のキット。
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