JP2004517603A - Endogenous and non-endogenous forms of human G protein-coupled receptors - Google Patents

Abstract

The invention disclosed in this patent specification relates to transmembrane receptors, and more specifically to human G protein-coupled receptors for which the endogenous ligand is unknown ("orphan GPCR receptors"), and Most specifically, it relates to mutant (non-endogenous) forms of human GPCRs for evidence of constitutive activity.

Description

「部分アゴニスト」は、これらが受容体に結合された場合にアゴニストの作用よりも低い程度／範囲で細胞内反応を活性化するか、またはアゴニストの作用よりも低い程度／範囲で膜へのＧＴＰ結合を増強する物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味するものとする。
【００１１】
「アンタゴニスト」は、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するがしかし受容体の活性形により開始された細胞内反応を活性化せず、そしてこれによりアゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内反応を阻害できる物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味するものとする。「アンタゴニスト」は、アゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合に基準細胞内反応を低下させない。
【００１２】
「候補化合物」は、スクリーニング技術に適用できる分子（例えば化学化合物であり、これに限定はされない）を意味するものとする。好ましくは、語句「候補化合物」は、あらかじめ間接同定過程により決定されたもの（「間接同定された化合物」）であって、受容体に対して逆アゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストからなる群から選ばれた化合物として一般的に知られている化合物を含まず、さらに好ましくは、少なくとも１種の哺乳動物内において治療効力を有すると以前に決定された間接同定された化合物を含まず、そして最も好ましくは、ヒトにおいて治療効力を有すると以前に決定された間接同定された化合物を含まない。
【００１３】
「組成物」は、少なくとも１種の成分を含んでなる物質を意味する。「薬剤組成物」は、組成物の一例である。
【００１４】
「化合物効力」は、受容体結合親和性に対抗して、受容体機能性を阻害または刺激するための化合物の能力の尺度を意味するものとする。化合物効力を検出するための例示的な手段は、本明細書の実施例の部分に開示される。
【００１５】
「コドン」は、一般に、リン酸基に結合し、そして翻訳されるとアミノ酸をコードするヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ））を含んでなる３個のヌクレオチド（またはヌクレオチドの等価基）の群を意味するものとする。
【００１６】
「構成的活性化受容体」は、構成的受容体活性化を受ける受容体を意味するものとする。構成的活性化受容体は内因性または非内因性であることができる。
【００１７】
「構成的受容体活性化」は、受容体とその内因性リガンドまたはその化学的等価物との結合以外の手段により活性状態にある受容体の安定化を意味するものとする。
【００１８】
「接触」または「接触する」は、生体外系または生体内系のいずれでも、少なくとも２個の部分を一緒にすることを意味するものとする。
【００１９】
語句「候補化合物」に関連する「直接同定する」または「直接同定」は、構成的活性化受容体、好ましくは構成的活性化オーファン受容体、そして最も好ましくは構成的活性化Ｇタンパク質共役細胞表面オーファン受容体に対して候補化合物をスクリーニングし、そしてこの化合物の化合物効力を評価することを意味するものとする。この語句は、いかなる場合でも、語句「間接同定する」または「間接同定された」により包含されまたはこれらを包含するとは解釈または理解されない。
【００２０】
「内因性」は、哺乳動物が本来的に産生する物質を意味するものとする。例えば、限定ではないが用語「受容体」に関する「内因性」は、哺乳動物（例えば、限定ではないがヒト）またはウイルスにより本来的に産生されるものを意味するものとする。反対に、この範囲内での用語「非内因性」は、哺乳動物（例えば、限定ではないがヒト）またはウイルスにより本来的には産生されないものを意味するものとする。例えば、限定ではないが、その内因性形では構成的活性ではないが、しかし操作されると構成的活性となる受容体は、本明細書内では「非内因性、構成的活性化受容体」と呼ばれるのが最も好ましい。両方の用語は、「インビボ」および「インビトロ」系の両方を記述するために使用できる。例えば、限定ではないが、スクリーニング法において、内因性または非内因性受容体は、生体内スクリーニング系に関連してもよい。別の例であって限定ではないが、哺乳動物のゲノムが非内因性、構成的活性化受容体を含むように操作された場合に、生体内系の手段による候補化合物のスクリーニングが適用可能である。
【００２１】
「Ｇタンパク質共役型受容体融合タンパク質」および「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、本明細書中で開示する本発明の範囲内で、それぞれ、少なくとも１種のＧタンパク質、最も好ましくはこのようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これはＧＴＰを結合するサブユニットである）に融合された内因性、構成的活性化ＧＰＣＲまたは非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲを含んでなる非内因性タンパク質を意味し、ここでＧタンパク質は、好ましくは内因性オーファンＧＰＣＲと本来的に共役するＧタンパク質と同じ種類である。例えば、限定ではないが、内因性状態において、Ｇタンパク質”Ｇｓα”がＧＰＣＲと共役する優勢なＧタンパク質である場合に、特定のＧＰＣＲに基づく「ＧＰＣＲ融合タンパク質」はＧｓαに融合したＧＰＣＲを含んでなる非内因性タンパク質であろう。ある場合には、以下に記載するように、非−優勢Ｇタンパク質はＧＰＣＲに融合できる。Ｇタンパク質は、構成的活性ＧＰＣＲのｃ−末端に直接融合できるかまたはこれら２者の間にスペーサーがあってもよい。
【００２２】
「宿主細胞」は、その中に「プラスミド」および／または「ベクター」を組み込まれることができる細胞を意味するものとする。原核生物「宿主細胞」の場合に、「プラスミド」は、典型的には、「宿主細胞」複製物として自律性分子として複製される（従って一般に、「プラスミド」は、真核生物「宿主細胞」内への導入のために単離される）。真核生物「宿主細胞」の場合には、「プラスミド」は真核生物「宿主細胞」が複製された場合に「プラスミド」が複製されるように、「宿主細胞」の細胞ＤＮＡ中に組み込まれる。好ましくは、本明細書中に開示する本発明の目的のためには、「宿主細胞」は真核生物であり、さらに好ましくは、哺乳動物であり、そして最も好ましくは２９３、２９３ＴおよびＣＯＳ−７細胞からなる群より選ばれる。
【００２３】
「間接同定」または「間接同定された」は、内因性受容体に特異性の内因性リガンドの同定、リガンド−受容体相互作用を妨害および／またはこれと競合するものの決定のための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、および活性化受容体と関連する少なくとも１種の第二メッセンジャー経路に影響するための化合物の効力の評価を含む薬剤発見過程への伝統的な接近方法を意味する。
【００２４】
「阻害」または「阻害する」は、用語「反応」に関連して、化合物が存在しない場合の反対に、化合物が存在する場合には反応が低下または防止されることを意味するものとする。
【００２５】
「逆アゴニスト」は、受容体の内因性形または受容体の構成的活性化形のいずれかに結合し、そしてアゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合に観察される正常の活性基準レベル以下の受容体の活性形により開始される基礎細胞内反応を阻害し、または膜へのＧＴＰ結合を低下させる物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味するものとする。好ましくは、基礎細胞内反応は、逆アゴニストが存在しない場合の基準反応と比較して、逆アゴニストの存在においては少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは少なくとも７５％が阻害される。
【００２６】
「既知受容体」は、当該受容体に特異性の内因性リガンドが同定されている内因性受容体を意味するものとする。
【００２７】
「リガンド」は、内因性で本来的に存在する受容体に特異性の内因性で本来的に存在する分子を意味するものとする。
【００２８】
内因性受容体の核酸および／またはアミノ酸配列に関する「変異体」または「変異」は、内因性、非構成的活性化受容体の変異形が受容体の構成的活性化を明らかにするような内因性配列への特定の変化または多数の変化を意味するものとする。特定の配列の等価体に関して、（ａ）ヒト受容体の次の変異した形の構成的活性化のレベルが受容体の最初の変異により明らかにされたものと本質的に同じであり、そして（ｂ）受容体の次の変異形と受容体の最初の変異体との間の配列（アミノ酸および／または核酸）相同性の割合が少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％そして最も好ましくは少なくとも約９５％である場合に、ヒト受容体の次の変異形は、ヒト受容体の最初の変異に等価と考えられる。理想的には、そして構成的活性化を達成するために本明細書中で開示した最も好ましいカセットがＧＰＣＲの内因性と非内因性形との間の単一アミノ酸および／またはコドン変化を含むという事実のために、配列相同性の割合は少なくとも９８％でなければならない。
【００２９】
「非オーファン受容体」は、受容体へのリガンドの結合が分子内シグナル伝達経路を活性化する、内因性で本来的に存在するリガンドに特異性の内因性で本来的に存在する分子を意味するものとする。
【００３０】
「オーファン受容体」は、その受容体に特異性の内因性リガンドが同定されていないかまたは既知ではない内因性受容体を意味するものとする。
【００３１】
「薬剤組成物」は、少なくとも１種の活性成分を含んでなる組成物を意味するものとし、ここで組成物は哺乳動物（例えば、限定ではないがヒト）において特定の効力的な成果のための試験が可能である。通常の当該技術分野の熟練者は、活性成分が、熟練者の要求に基づいて所望の効力的な成果を有するかどうかを決定するために適当な技術を理解しそして認めるであろう。
【００３２】
「プラスミド」は、「ベクター」およびｃＤＮＡの組合せを意味するものとする。一般に、「プラスミド」は、タンパク質としてのｃＤＮＡの複製および／または発現の目的で「宿主細胞」内に導入される。
【００３３】
「第二メッセンジャー」は、受容体活性化の結果として生成した細胞内反応を意味するものとする。第二メッセンジャーは、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ_３ ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、およびサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を含むことができる。第二メッセンジャー反応は、受容体活性化の決定のために測定できる。さらに、第二メッセンジャー反応は、例えば逆アゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストおよびアンタゴニストを含む候補化合物の直接同定のために測定できる。
【００３４】
「刺激」または「刺激する」は、用語「反応」に関連して、反応が化合物の存在下で、これが存在しない場合の反対に増加することを意味するものとする。
【００３５】
ｃＤＮＡの関連する「ベクター」は、少なくとも１種のｃＤＮＡを組み込むことが可能でそして「宿主細胞」内に組み込むことが可能な環状ＤＮＡを意味するものとする。
【００３６】
以下の各セクションの順序は、説明の効率のために決定したものであり、下記の開示または請求の制限を意図せず、そしてそのように解釈してはならない。
Ａ．はじめに
受容体の伝統的な研究は、発見が受容体に影響できるアンタゴニストおよびその他の分子を発見できるまで進行する前に内因性リガンドが最初に同定されなければならないというアプリオリな仮定（歴史に基づく）から常に前進していた。アンタゴニストが最初に判明した場合でも、探索は直ちに内因性リガンドの探索に進んだ。この思考の様式は、構成的活性化受容体の発見の後でも受容体研究で継続された。これまで認められていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、および逆アゴニストの発見に最も有用なことは受容体の活性状態であることである。過剰活性の受容体または不足活性の受容体からもたらされる疾患に対して、治療薬剤に望まれるものは、それぞれ、受容体の活性状態を低下するかまたは受容体の活性を増強する化合物であり、必ずしも内因性リガンドに対するアンタゴニストである薬剤ではない。これは、活性受容体状態の活性を低下または増強する化合物は、内因性リガンドとして同じ部位に結合する必要はないためである。従って、本発明の方法により教示されるように、治療化合物のためのあらゆる探索もリガンドに依存しない活性状態に対する化合物をスクリーニングすることにから開始すべきである。
Ｂ．ヒトＧＰＣＲの同定
ヒトゲノムプロジェクトの研究は、ヒトゲノム内に位置する核酸配列に関する極めて多数の情報の同定をもたらした。この研究の場合に、ゲノム配列情報は、特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳するオープンリーディングフレーム情報を含むかまたは含まないかどうかに関する理解または認識を伴わずにに提供された。ヒトゲノム内の核酸配列を同定する数種の方法は、通常の当該技術分野を有する熟練者の認識範囲内にある。例えば、限定ではないが、本明細書中で開示される種々のヒトＧＰＣＲは、ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）^ＴＭデータベースを調査して発見された。下記の表Ｂは、我々が発見した数種類の内因性ＧＰＣＲを、開示ＧＰＣＲに相同である他のＧＰＣＲと共に表示する。
【００３７】
【表１】

【００３８】
受容体相同性は、ヒト身体内の受容体の役割の評価を得るために有用である。本明細書の記載の進行に応じて、我々は、これらの受容体の非内因性、構成的活性化型を確立するためにこれらの受容体を変異するための技術を開示するであろう。
【００３９】
本明細書中に開示される技術は、当該技術分野では既知の他のヒト、オーファンＧＰＣＲにも適用され、これは本明細書の記載の進行に従って明らかとなるであろう。
Ｃ．受容体スクリーニング
本明細書中で開示されるヒトＧＰＣＲの非内因性、構成的活性化型に対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内因性リガンドの使用を必要としないで、この細胞表面受容体に作用する候補化合物の直接同定を可能とする。慣用でしばしば商業的に利用できる技術を用いて、本明細書中で開示されるヒトＧＰＣＲの内因性型が発現および／または過剰発現される身体内の領域を決定できる。受容体の発現および／または過剰発現と関連する関連疾患／障害状態を決定するためにこれらの技術を用いることも可能であり、このような方法は、本特許明細書中に開示される。
【００４０】
本明細書中で開示されるヒトＧＰＣＲの構成的活性化を明らかにするであろう変異の創成に関しては、ＧＰＣＲのＴＭ６内に位置すると想定されるプロリン残基からの距離に基づいている。このアルゴリズム技術は、２０００年４月２０日付けＷＯ００／２２１２９として公開された同時係属および共通して譲渡された特許明細書ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３９３８号中に開示されており、これは本明細書中に表示する他の特許文献と一緒に引用することにより本明細書中に編入される。このアルゴリズム技術は、従来の配列「整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ） 」に基づいては断定されず、上記のＴＭ６プロリン残基（または、当然ではあるがこのようなプロリン残基の内因性構成的置換）からの指定の距離によりで決定される。この残基から１６アミノ酸残基に位置するアミノ酸（推定すると受容体のＩＣ３領域内に位置する）を最も好ましいリシン残基に変異することにより、このような活性化が得られるであろう。その他のアミノ酸残基は、この目的を達成するためにこの位置における変異に有用であろう。
Ｄ．疾患／障害同定および／または選択
以下に詳細に記載するように、最も好ましくは非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストは、本発明の方法論により同定できる。このような逆アゴニストおよびアゴニストは、本受容体に関連する疾患を治療するための薬剤発見プログラムにおけるリード化合物として理想の候補である。ＧＰＣＲに対する逆アゴニストを直接同定するための能力、これによる薬剤組成物の開発を可能とすることにより、ＧＰＣＲに関連する疾患および障害の探索が可能である。例えば、ＧＰＣＲの存在に関する疾患および正常組織試料の両方のスキャニングは、学問的な実験または特定のＧＰＣＲへの内因性リガンドを同定するための経路に沿って追跡する程度を越えてきている。組織スキャンは、健康および疾患組織の広い範囲にわたって行うことができる。このような組織スキャンは、特定の受容体を疾患および／または障害と関連させる場合の好ましい第一段階を提供する。
【００４１】
好ましくは、ヒトＧＰＣＲのＤＮＡ配列は、（ａ）組織−ｍＲＮＡに対するドット−ブロット分析、および／または（ｂ）組織試料中の受容体の発現のＲＴ−ＰＣＴ同定のためのプローブを作製するために使用される。組織採取元内の受容体の存在、または疾患組織、または正常組織と比較して疾患組織内の高い濃度にある受容体の存在は、限定はされないが治療方針とその疾患と関連する疾患との相関を同定するために好んで使用できる。受容体は、この技術により器官の領域に同様に良く定位できる。受容体が局在する特定組織の既知機能に基づいて、受容体の推定される機能的役割が推論できる。
Ｅ．候補化合物のスクリーニング
１．包括的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
Ｇタンパク質受容体が構成的活性となった場合に、これはＧタンパク質（例えばＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合しそしてＧタンパク質へのＧＴＰ結合を刺激する。従ってＧタンパク質はＧＴＰアーゼとして作用し、そしてゆっくりとＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、これにより正常の条件下で受容体は脱活性化する。しかし構成的活性化受容体は、ＧＤＰをＧＴＰに交換することを続ける。ＧＴＰの非加水分解性類似体である〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳは、構成的活性化受容体を発現する膜への増強された結合を測定するために使用できる。〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳが、リガンドが存在しないかまたは存在する場合に膜へのＧタンパク質共役を測定するために使用できることが報告されている。当該技術分野の熟練者に周知で使用できるその他の例の中でも、この測定の例は、Ｔｒａｙｎｏｒ およびＮａｈｏｒｓｋｉにより１９９５年に報告された。このアッセイ系の好ましい使用は、候補化合物の最初のスクリーニングであり、それは、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質にかかわらずすべてのＧタンパク質共役型受容体に系が包括的に適用できるからである。
２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
候補化合物が「包括的」Ｇタンパク質共役型受容体アッセイ（すなわち、アゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用いて同定され、さらに化合物が受容体部位で相互作用したことを確認するためのスクリーニングをすることが好ましい。例えば、「包括的」アッセイで同定された化合物は、受容体に結合しないであろうが、しかし細胞内ドメインからのＧタンパク質を単に「脱共役」するであろう。
ａ．Ｇｓ、ＧｚおよびＧｉ
Ｇｓは、酵素アデニル酸シクラーゼを刺激する。Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）は、反対にこの酵素を阻害する。アデニル酸シクラーゼは、ＡＴＰからｃＡＭＰへの変換に触媒作用する。従って、Ｇｓタンパク質に共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの増加した細胞レベルと関連する。反対に、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）タンパク質に共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの低下した細胞レベルと関連する。一般的には「シナプス伝達の間接機序」第８章（”Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，” Ｃｈｐｔ ８，Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（３ｒｄ Ｅｄ．） Ｎｉｃｈｏｌｓ， Ｊ．Ｇ． ｅｔ ａｌ ｅｄｓ， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． （１９９２）） 参照。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物が例えば受容体に対して逆アゴニストであるかどうかを決定するために使用できる（すなわちこのような化合物はｃＡＭＰのレベルを低下するであろう）。ｃＡＭＰを測定するために当該技術分野で既知の種々の方法が使用できる。最も好ましい方法は、ＥＬＩＳＡに基づくフォーマットでの抗−ｃＡＭＰ抗体の使用による。使用できる別のアッセイの種類は、全細胞第二メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子をコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ反応性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進して遺伝子発現を駆動し、転写因子は次いでｃＡＭＰ反応因子と呼ばれる特定部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前の多重ｃＡＭＰ反応因子を含むプロモーターを有するレポーター系が構築できる。従って、構成体活性化されたＧｓ−連結受容体は、次いで遺伝子を活性化するｃＡＭＰの蓄積およびレポータータンパク質の発現を起こす。レポータータンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼは、次いで標準生物化学アッセイを用いて検出できる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９５）。
ｂ．ＧｏおよびＧｑ
ＧｏおよびＧｑは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化と関連し、これは次いでリン脂質ＰＩＰ_２ を加水分解し、２個の細胞内メッセンジャー、ジアシクログリセロール（ｄｉａｃｙｃｌｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＡＧ）およびイノシトール １，４，５−トリリン酸（ＩＰ_３ ）を遊離する。ＩＰ_３ の増加した蓄積は、ＧｑおよびＧｏ関連受容体の活性化と関連する。一般的には「シナプス伝達の間接機序」第８章（”Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，” Ｃｈｐｔ ８，Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（３ｒｄ Ｅｄ．） Ｎｉｃｈｏｌｓ， Ｊ．Ｇ． ｅｔ ａｌ ｅｄｓ， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． （１９９２）） 参照。ＩＰ_３ 蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えばＧｑまたはＧｏ関連受容体に対する逆アゴニストであるかどうかを決定するために使用できる（すなわち、このような化合物がＩＰ_３ のレベルを低下する）。Ｇｑ関連受容体は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１因子を含む遺伝子の活性化を起こすＡＰ１レポーターアッセイを用いてでも試験できる。従って、活性化Ｇｑ関連受容体は、この遺伝子の発現の増加を明らかにし、これによりその逆アゴニストはこの発現の低下を明らかにし、そしてアゴニストはこの発現の増加を明らかにする。このアッセイのために商業的に利用できるアッセイが利用できる。
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
逆アゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングに使用するための内因性、構成的活性オーファンＧＰＣＲまたは非内因性、構成的活性化オーファンＧＰＣＲの使用は、その定義により、結合する内因性リガンドが存在しない場合でも受容体が活性であるという興味あるスクリーニング問題を提供する。従って、例えば候補化合物の存在における非内因性受容体と、その化合物が存在しない場合の非内因性受容体との間を区別するために、このような化合物が逆アゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストであるかどうかまたはこのような受容体に影響しないかどうかに関する理解を可能とさせるこのような区別の目的で、このような区別を増強できる方法を使用することが好ましい。好ましい方法は、「ＧＰＣＲ融合タンパク質」の使用である。
【００４２】
一般に、非内因性オーファンＧＰＣＲが上記のアッセイ技術（ならびのその他のもの）を用いて構成的に活性化されたことが一旦決定されると、内因性ＧＰＣＲと共役する優勢なＧタンパク質を決定できる。ＧＰＣＲへのＧタンパク質の共役は、評価できるシグナル伝達経路を提供する。スクリーニングが哺乳動物発現系を用いて行われることが最も好ましいので、このような系は、その中に内因性Ｇタンパク質を有すると期待される。従って、定義により、このような系内で、非内因性、構成的活性化オーファンＧＰＣＲは、連続的にシグナル発生する。この点に関して、例えば受容体への逆アゴニストの存在下でこのシグナルが増強されることが好ましく、特にはスクリーニングの範囲内で、逆アゴニストと接触した受容体の間でさらに容易に区別できる可能性があるようにシグナルが増強されることがさらに好ましい。
【００４３】
「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、非内因性ＧＰＣＲと共役したＧタンパク質の効力を増強することを意図する。「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲを用いるスクリーニングに好ましく、それは、このような方法がこのスクリーニング技術で最も好ましく使用される信号を増加するからである。これは、有意の「信号対雑音比」を容易に得るために重要である。このような有意の比は、本明細書中に開示する候補化合物のスクリーニングに有利に導入される。
【００４４】
「ＧＰＣＲ融合タンパク質」の発現のために有用な構築物の構築は、当該技術分野の通常の熟練を有する者の認識範囲内である。商業的に利用できる発現ベクターおよび系は、研究者の特定の要求を満足できる各種の方法を提供する。このような「ＧＰＣＲ融合タンパク質」構築物のために重要な基準は、内因性ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の両方がインフレームであり（好ましくは、内因性ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質配列の上流にある）そしてＧＰＣＲの「終止」コドンが、ＧＰＣＲの発現の際にＧタンパク質も発現できるように欠失または置換されていなければならないことである。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に直接連結してもよく、または２個の間のスペーサー残基があることもできる（好ましくは、約１２個を越えず、この数は当該技術分野の通常の熟練者には容易に確認できるものである）。我々は、使用されない幾つかの制限部位が、効果的に発現の際にスペーサーとなるスペーサーの使用を好む（便利さのために）。最も好ましくは、非内因性ＧＰＣＲに共役するＧタンパク質は、「ＧＰＣＲ融合タンパク質」構築物の創成の前に同定される。同定されたＧタンパク質は僅かしかないので、Ｇタンパク質の配列を含んでなる構築物（すなわち汎用Ｇタンパク質構築物）は、本明細書内の内因性ＧＰＣＲ配列の挿入のために利用できる。これは、異なる配列を有する種々の異なる内因性ＧＰＣＲの大規模スクリーニングの範囲内で効率を与える。
【００４５】
上記のように、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏに共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの形成を阻害すると期待され、問題のＧＰＣＲのこれらの種類に基づくアッセイを興味あるものとする（すなわちｃＡＭＰシグナルは活性化の際に低下し、従って例えば逆アゴニストの直接同定を行う（これはこのシグナルをさらに低下させるであろう））。本明細書中で開示するように、受容体のこれらの種類に対して、使用可能なシクラーゼに基づくアッセイを確立する研究において、内因性ＧＰＣＲの内因性Ｇタンパク質には基づかない「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を創成することが可能であることを我々は確認した。従って、例えば、内因性Ｇｉ共役型受容体はＧｓタンパク質に融合でき、我々はこのような融合構築物が発現されると、内因性ＧＰＣＲを、「本来的な」Ｇｉタンパク質ではなくて、例えばＧｓと共役するように「駆動」または「強制」し、シクラーゼに基づくアッセイを確立できると信じる。このように、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏ共役型受容体に対して、我々は、「ＧＰＣＲ融合タンパク質」が使用されそしてアッセイがアデニル酸シクラーゼ活性の検出に基づく場合に、融合構築物がＧｓ（または酵素アデニル酸シクラーゼの形成を刺激する等価Ｇタンパク質）を用いて確立されることを好む。
【００４６】
「Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚまたはＧｏタンパク質」と融合した「Ｇｑタンパク質」を用いる「Ｇタンパク質融合」構築物も同様に有効である。最も好ましい融合構築物は、「Ｇｑタンパク質」を用いて達成でき、ここで、Ｇタンパク質α−サブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６個のアミノ酸が欠失しそしてＧαｑのＣ−末端の最後の５個のアミノ酸が、関係するＧタンパク質のＧαの相当するアミノ酸を用いて置換される。例えば、融合構築物は、「Ｇｉタンパク質」と融合したＧｑ（アミノ酸６個欠失）を有するとができ、「Ｇｑ／Ｇｉ融合構築物」をもたらす。我々は、この融合構築物が内因性Ｇｉ共役型受容体を非内因性Ｇタンパク質、Ｇｑ、に共役させて、第二メッセンジャー、例えばイノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールがｃＡＭＰ産生の代わりに測定できるように強制すると信じる。
４．シグナルエンハンサーＧｓ共役型ＧＰＣＲを用いる標的Ｇｉ共役型ＧＰＣＲのコトランスフェクション（ｃＡＭＰに基づくアッセイ）
Ｇｉ共役型受容体はアデニル酸シクラーゼを阻害するとして知られており、従ってｃＡＭＰ産生のレベルを低下し、これはｃＡＭＰレベルの評価を興味深くさせることができる。活性化の際に主としてＧｉに共役する受容体の構成的活性化の指標としてｃＡＭＰの産生の低下を測定する有効な手段は、シグナルエンハンサー、例えば、Ｇｉ連結ＧＰＣＲを用いる活性化の際にＧｓと主として共役する非内因性、構成的活性化受容体（例えば以下の開示するＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）をコトランスフェクションして達成できる。明らかなように、Ｇｓ共役型受容体の構成的活性化は、ｃＡＭＰの産生の増加に基づいて決定できる。Ｇｉ共役型受容体の構成的活性化は、ｃＡＭＰ産生の低下に導く。従って、コトランスフェクション法は、これらの「反対」効果を有利に活用することを意図する。例えば、非内因性、構成的活性化Ｇｓ共役型受容体（「シグナルエンハンサー」）と内因性Ｇｉ共役型受容体（「標的受容体」）とのコトランスフェクションは、基準ｃＡＭＰシグナルを与える（すなわち、Ｇｉ共役型受容体はｃＡＭＰレベルを低下するけれども、この「低下」は、構成的活性化Ｇｓ共役型受容体シグナルエンハンサーにより確立されるｃＡＭＰレベルの本質的な増加と関連する）。その際、シグナルエンハンサーと標的受容体の構成的活性化型とのコトランスフェクションにより、ｃＡＭＰは、Ｇｉ標的の増加した機能的活性（すなわち、これはｃＡＭＰを低下する）によりそれ以上に低下（基準に対する）すると予想される。
【００４７】
ｃＡＭＰに基づくアッセイを用いる候補化合物のスクリーニングは、次いで２条件下で達成できる。第一条件は、Ｇｉ共役標的受容体に関して、「反対」効果をもたらし、すなわちＧｉ共役標的受容体の逆アゴニストは測定されるｃＡＭＰシグナルを増加し、一方Ｇｉ共役標的受容体のアゴニストはこのシグナルを低下する。第二条件は、明らかなように、この方法を用いて直接同定される候補化合物は、これらがシグナルエンハンシング受容体を標的としないことを確認するために独立して評価されるべきであることである（これはコトランスフェクションした受容体に対するスクリーニングの前または後に行うことができる）。
Ｆ．薬剤化学
必ずではないが一般的には、候補化合物の直接同定は、好ましくは、組合せ化学技術を介して生成された化合物と関連して行われ、これにより数千の化合物がこの分析のためにランダムに調製される。一般に、このようなスクリーニングの結果は、独自のコア構造を有する化合物である。その後、これらの化合物は、好ましくは、これらの薬剤的性質をさらに増強するために好ましいコア構造の周囲に追加の化学修飾が行われる。このような技術は、当該技術分野の熟練者には公知でありそして本明細書中では詳細には取り扱わない。
Ｇ．薬剤組成物
さらに開発するために選択された候補化合物は、当該技術分野の熟練者には周知の技術を用いて薬剤組成物に調剤できる。適当な薬剤的に許容できるキャリヤーは、当該技術分野の熟練者には利用できる。例えば、「レミントンの薬剤科学」（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ． Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， （Ｏｓｌｏ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．））参照。
Ｈ．その他の効用
本明細書に開示したヒトＧＰＣＲの非内因型の好ましい使用は、逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであるが（好ましくは薬剤としての使用のため）、ヒトＧＰＣＲのこれらの型は、研究設定にも使用できる。例えば、ＧＰＣＲを組み込んだ生体内および生体外系は、正常および疾患の両方のヒトの状態においてこれら受容体が演じる役割をさらに解明および理解するため、ならびにシグナル伝達カスケードを理解するめに適用された構成的活性化の役割を理解するために使用できる。非内因性ヒトＧＰＣＲの価値は、これらの独自の特徴により、非内因性ヒトＧＰＣＲが、内因性リガンドが同定される前にヒト身体内のこれら受容体の役割を理解するために使用できることにより、研究手段としてのこれらの有用性が高くなることである。開示された受容体のその他の利用は、なかでも本明細書を検討すると当該技術分野の熟練者には明らかとなるであろう。
【００４８】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の説明の目的で提示するものであり、これを制限するものではない。特定の核酸およびアミノ酸配列が本明細書中で開示されるが、当該技術分野の通常の熟練者は、これらの配列に小さい変更を加えて以下に報告すると同じかまたは実質的に同様の結果を得る能力を有する。一つの配列から他のものへの配列カセットの適用または理解の従来の方法（例えば、ラット受容体からヒト受容体へ、またはヒト受容体Ａからヒト受容体Ｂへ）は、一般に配列整列技術に基づいて断定され、その際、配列は、共通の領域を決定するため研究において整列される。本明細書中に開示する変異法はこの方法にはよらないが、しかしその代わりにアルゴリズム法およびヒトＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置する保存されたプロリン残基からの位置的距離に基づく。この方法が確立されると、当該技術分野の熟練者は、本明細書中に開示されると本質的に同じ結果（すなわち構成的活性化）を得るためにこれに小さい変更を加える能力を有すると信じられる。このような変更方法は、本開示の範囲内にあると考える。
【００４９】
実施例１
内因性ヒトＧＰＣＲ
１．ヒトＧＰＣＲの同定
開示される内因性ヒトＧＰＣＲは、ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）^ＴＭデータベース情報の調査に基づいて同定された。データベースを調査する間に、下記のｃＤＮＡクローンが下記に明らかなように同定された（表Ｃ）
【００５０】
【表２】

【００５１】
２．全長クローニング
ａ．ｈＲＵＰ８（配列番号１および２）
開示されるヒトＲＵＰ８は、ＥＳＴデータベース（ｄｂＥＳＴ）情報の使用に基づいて同定された。ｄｂＥＳＴを調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１２１７５５を有するｃＤＮＡクローンが、新規のＧＰＣＲをコードすると同定された。下記のＰＣＲプライマーがヒト精巣マラソン−レディー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＲＴ−ＰＣＲのために鋳型として用いられた。
５’−ＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号４１、センス）および
５’−ＧＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧ−３’（配列番号４２、アンチセンス）
ＰＣＲはアドヴァンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ） ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製造指針に従う）を用い、５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルにより行った：３０秒間９４℃、１０秒間９４℃、２０秒間６５℃、１．５分間７２℃、および７分間７２℃。サイクル２〜４を３５回反復した。
【００５２】
１．２ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ）（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて配列決定した。配列番号１参照、ＲＵＰ８の推定アミノ酸配列を配列番号２に記載する。
ｂ．ｈＲＵＰ９（配列番号３および４）
開示されるヒトＲＵＰ９は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１１３７５を有するｃＤＮＡクローンが、染色体５からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ９をプライマー
５’−ＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号４３、センス）、
５’−ＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号４４、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョン（Ｔａｑ Ｐｌｕｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を５％ＤＭＳＯを用いる１００μｌ反応物中で、下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、３０秒間９４℃、３０秒間５６℃、２分間７２℃、および５分間７２℃。
【００５３】
１．３ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に１％アガロースゲルからクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。配列番号３参照、ＲＵＰ８の推定アミノ酸配列を配列番号４に記載する。ヒトゲノムＤＮＡから単離したＲＵＰ９クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。
ｃ．ｈＲＵＰ１０（配列番号５および６）
開示されるヒトＲＵＰ１０は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ００８７５４を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１９からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１０をプライマー
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧ−３’（配列番号４５、センス）および
５’−ＧＣＴＡＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＣＴＴＧＴＧ−３’（配列番号４６、アンチセンス）
およびヒト白血球マラソンレディーｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５０μｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３０秒間９４℃、１０秒間９４℃、２０秒間６２℃、１．５分間７２℃、および７分間７２℃。１．０ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。新規のヒト受容体ＲＵＰ１０の核酸配列を配列番号５に記載し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号６に記載する。
ｄ．ｈＲＵＰ１１（配列番号７および８）
開示されるヒトＲＵＰ１１は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１３３９６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１１をプライマー
５’−ＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号４７、センス）、
５’−ＣＡＣＡＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号４８、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を５０μｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６７℃、１．５分間７２℃、および７分間７２℃。１．３ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。新規のヒト受容体ＲＵＰ１１の核酸配列を配列番号７に記載し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号８に記載する。
ｅ．ｈＲＵＰ１２（配列番号９および１０）
開示されるヒトＲＵＰ１２は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＰ０００８０８を有するｃＤＮＡクローンが、ラットＲＴＡおよびヒトｍａｓ１腫瘍遺伝子ＧＰＣＲと著しい相同性を有する新規のＧＰＣＲをコードすると同定された。全長ＲＵＰ１２をプライマー
５’−ＣＴＴＣＣＴＣＴＣＧＴＡＧＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣ−３’（配列番号４９、センス）
５’−ＣＴＣＧＣＡＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号５０、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６５℃、２分間７２℃、および７分間７２℃。１．０ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した（核酸配列に関しては配列番号９そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１０参照）。
ｆ．ｈＲＵＰ１３（配列番号１１および１２）
開示されるヒトＲＵＰ１３は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１１７８０を有するｃＤＮＡクローンが、ＧＰＣＲサカナＧＲＰＸ−ＯＲＹＬＡと著しい相同性を有する新規のＧＰＣＲをコードすると同定された。全長ＲＵＰ１３をプライマー
５’−ＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号５１、センス）
５’−ＣＡＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号５２、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６５℃、２分間７２℃、および７分間７２℃。１．３５ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した（核酸配列に関しては配列番号１１そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１２参照）。
ｇ．ｈＲＵＰ１４（配列番号１３および１４）
開示されるヒトＲＵＰ１４は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１３７１８８を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１３からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１４をプライマー
５’−ＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴＧＣＡＡＣＣ−３’（配列番号５３、センス）
５’−ＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＴＣＡＴＣＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣ−３’（配列番号５４、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および５％ＤＭＳＯを下記のサイクルでステップ２およびステップ３の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２分間５８℃、１０分間７２℃。
【００５４】
１．１ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した（核酸配列に関しては配列番号１３そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１４参照）。ヒトゲノムＤＮＡから単離したＲＵＰ１４クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。
ｈ．ｈＲＵＰ１５（配列番号１５および１６）
開示されるヒトＲＵＰ１５は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１６４６８を有するｃＤＮＡクローンが、ヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１５をプライマー
５’−ＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号５５、センス）
５’−ＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＡＧＡＡＣ−３’（配列番号５６、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６５℃、２分間７２℃および７分間７２℃。
【００５５】
１．５ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号１５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１６参照。ヒトゲノムＤＮＡから単離したＲＵＰ１５クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。ｉ．ｈＲＵＰ１６（配列番号１７および１８）
開示されるヒトＲＵＰ１６は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１３６１０６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１３からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１６をプライマー
５’−ＣＴＴＴＣＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号５７、センス、開始コドンの５’）
５’−ＧＴＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号５８、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒト骨格筋マラソンレディーｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：３０秒間９４℃、５秒間９４℃、１５秒間６９℃、１分間７２℃および５分間７２℃。
【００５６】
１．１ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＴ７シーケナーゼキット（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ） を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号１７そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１８参照。ＲＵＰ１６クローンの配列は、ＡＬ１３６１０６の４個の不規則断片と一致し、これはＲＵＰ１６ｃＤＮＡが４個のエキソンからなることを示す。
ｊ．ｈＲＵＰ１７（配列番号１９および２０）
開示されるヒトＲＵＰ１７は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２３０７８を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１１からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１７をプライマー
５’−ＴＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（配列番号５９、センス、開始コドンを含む）
５’−ＣＴＧＴＣＴＧＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号６０、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３０回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間６７℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００５７】
９７０ｂｐＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号１９そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２０参照。
ｋ．ｈＲＵＰ１８（配列番号２１および２２）
開示されるヒトＲＵＰ１８は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ００８５４７を有するｃＤＮＡクローンが、染色体５からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１８をプライマー
５’−ＧＧＡＡＣＴＣＧＴＡＴＡＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＣＧＣＴＣＣ−３’（配列番号６１、センス、開始コドンの５’）、
５’−ＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＣＣＴＴＡＧＣＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号６２、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：５分間９５℃、３０秒間９５℃、３０秒間６５℃、２分間７２℃および５分間７２℃。
【００５８】
１．３ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２１そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２２参照。
ｌ．ｈＲＵＰ１９（配列番号２３および２４）
開示されるヒトＲＵＰ１９は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６３３１を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１９をプライマー
５’−ＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号６３、センス、開始コドンの５’）
５’−ＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＡＣ−３’（配列番号６４、アンチセンス、終止コドンを含む）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を５％ＤＭＳＯを用い下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間７０℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００５９】
１．１ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２３そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２４参照。
ｍ．ｈＲＵＰ２０（配列番号２５および２６）
開示されるヒトＲＵＰ２０は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１６１４５８を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２０をプライマー
５’−ＴＡＴＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号６５、センス、開始コドンの５’）、
５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＡＴＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号６６、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５％ＤＭＳＯを用い下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９５℃、１５秒間９５℃、２０秒間６０℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００６０】
１．０ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２６参照。
ｎ．ｈＲＵＰ２１（配列番号２７および２８）
開示されるヒトＲＵＰ２１は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６７５６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１３からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２１をプライマー
５’−ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号６７、センス）
５’−ＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＣ−３’（配列番号６８、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３０回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間５５℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００６１】
１，０１４ｂｐＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２７そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２８参照。
ｏ．ｈＲＵＰ２２（配列番号２９および３０）
開示されるヒトＲＵＰ２２は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２７０２６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１１からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２２をプライマー
５’−ＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号６９、センス、開始コドンを含む）
５’−ＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣ−３’（配列番号７０、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３０回反復による増幅のために使用した：９４℃、１分間９４℃、１５秒間５５℃、２０秒間７２℃、１．５分間７２℃、５分間。
【００６２】
９７０ｂｐＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２９そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３０参照。
ｐ．ｈＲＵＰ２３（配列番号３１および３２）
開示されるヒトＲＵＰ２３は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ００７１０４を有するｃＤＮＡクローンが、染色体４からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２３をプライマー
５’−ＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号７１、センス、開始コドンとしてのＡＴＣ）
５’−ＡＴＧＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴ−３’（配列番号７２、アンチセンス、終止コドンとしてのＴＣＡ）
およびヒト胎盤マラソンレディーＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：３０秒間９５℃、１５秒間９５℃、２０秒間６６℃、１分２０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００６３】
１．０ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３１そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３２参照。
ｑ．ｈＲＵＰ２４（配列番号３３および３４）
開示されるヒトＲＵＰ２５は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６３３１を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２５をプライマー
５’−ＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＡＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号７３、センス、開始コドンの５’）
５’−ＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号７４、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５％ＤＭＳＯを用い、下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間５６℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００６４】
１．２ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３３そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３４参照。
ｒ．ｈＲＵＰ２５（配列番号３５および３６）
開示されるヒトＲＵＰ２５は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６３３１を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２５をプライマー
５’−ＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＡＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号７５、センス、開始コドンの５’）
５’−ＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号７６、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ） を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５％ＤＭＳＯを用い、下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間５６℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００６５】
１．２ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３６参照。
ｓ．ｈＲＵＰ２６（配列番号３７および３８）
開示されるヒトＲＵＰ２６は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２３０４０を有するｃＤＮＡクローンが、染色体２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２６をＲＵＰ２６特異性プライマー
５’−ＡＧＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号７７、センス、開始コドンを含む）
５’−ＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＧ−３’（配列番号７８、アンチセンス、終止コドンを含む）
およびヒト胎盤マラソンレディーｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：５分間９４℃、３０秒間９５℃、３０秒間６５℃、２分間７２℃および５分間７２℃。
【００６６】
１．１ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３７そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３８参照。
ｔ．ｈＲＵＰ２７（配列番号３９および４０）
開示されるヒトＲＵＰ２７は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２７６４３を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２７をＲＵＰ１７特異性プライマー
５’−ＡＧＴＣＣＡＣＧＡＡＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７９、センス、開始コドンを含む）
５’−ＡＴＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号８０、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒト成人脳マラソンレディーｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５％ＤＭＳＯを含む５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１０秒間９４℃、２０秒間５８℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００６７】
１．１ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３６参照。ヒト脳から単離されたＲＵＰ２７ｃＤＮＡクローンの配列は，ＡＣ０２７６４３の５個の不規則断片と一致することが決定され、ＲＵＰ２７ｃＤＮＡが５個のエキソンからなることを示す。
【００６８】
実施例２
非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲの調製
当該技術分野の熟練者は、核酸配列の変異のための技術を選択する能力を有すると信じられる。下記は、以上に開示した数種のヒトＧＰＣＲの非内因性型を創成するために使用される方法である。以下に開示される変異は、保存されるプロリン（またはこれの内因性の保存性置換基）残基（ＴＭ６／ＩＣ３界面近くのＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置する）から１６番目のアミノ酸（ＧＰＣＲのＩＣ３領域内に位置する）が、好ましくはアラニン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基に、最も好ましくはリシンアミノ酸残基に変異されるアルゴリスム法に基づく。
１．トランスフォーマーサイトディレクテッド^ＴＭ変異誘発
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、製造者の指針に従って、トランスフォーマーサイトディレクテッド（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ） ^ＴＭ変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ヒトＧＰＣＲについて行ってもよい。２個の変異誘発プライマーを使用し、最も好ましくはリシン変異を創成するリシン変異誘発オリゴヌクレオチド、および選択マーカーオリゴヌクレオチドを用いる。便宜のために、ヒトＧＰＣＲ内に組み込まれるべきコドン変異も標準形で記録する（表Ｄ）。
【００６９】
【表３】

【００７０】
２．クイクチェンジ^ＴＭサイトディレクテッド^ＴＭ変異誘発
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、クイクチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）^ＴＭサイトディレクテッド（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ） ^ＴＭ変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 、製造者の指針に従う）によっても行うことができる。内因性ＧＰＣＲが好ましい鋳型として使用され、そして２個の変異誘発プライマーを用い、ならびに最も好ましくはリシン変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド（キット内に含まれる）が使用される。便宜のために、新規のヒトＧＰＣＲ内に組み込まれたコドン変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドを標準形で記録する（表Ｅ）
【００７１】
【表４】

【００７２】
非内因性ヒトＧＰＣＲを次いで配列決定しそして誘導および確認された核酸およびアミノ酸配列を本特許明細書に添付した「配列表」に表示し、これを下記の表Ｆに要約した。
【００７３】
【表５】

【００７４】
実施例３
受容体発現
種々の細胞がタンパク質の発現のために当該技術分野で利用できるが、哺乳動物細胞の使用が最も好ましい。この主要な理由は、実用性により定められ、すなわち例えばＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用は、可能な限り、哺乳動物系のために発展された受容体共役、遺伝機序および分泌経路を含まない（確かに酵母の場合には含まない）非哺乳動物細胞をプロトコール中に導入し、これにより非哺乳動物細胞で得られた結果は、利用可能な限り、哺乳動物細胞から得られたほどは好ましくない。使用される特定の哺乳動物細胞は熟練者の特定の要求により決定できるけれども、哺乳動物細胞のなかでは、ＣＯＳ−７、２９３および２９３Ｔ細胞が特に好ましい。
ａ．一過性トランスフェクション
第一日目に、６ｘ１０^６ ／（２９３細胞のウエル１０ｃｍ皿）をプレートアウトした。第二日目に、２本の反応管を調製した（それぞれの管についての下記の比率はプレートあたりである）。管Ａは、４μｇＤＮＡ（例えばｐＣＭＶベクター、受容体ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクターなど）を０．５ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） 中で混合して調製した。管Ｂは、２４μｌリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） を０．５ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ中で混合して調製した。管ＡおよびＢを倒置（数回）により混合し、次いで室温で３０〜４５分間インキュベーションした。この混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレーティングした２９３細胞を１ＸＰＢＳを用いて洗浄し、次いで０．５ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭを加えた。トランスフェクション混合物１ｍｌを細胞に加え、次いで３７℃／５％ＣＯ_２ で４時間インキュベーションした。トランスフェクション混合物を吸引して取り出し、次いでＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清の１０ｍｌを加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２ でインキュベーションした。４８時間インキュベーションした後、細胞を採取しそして分析に使用した。
ｂ．安定細胞株：Ｇｓ融合タンパク質
約１２ｘ１０^６ ２９３細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上にプレーティングした。１０％ウシ胎児血清および１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含むＤＭＥハイ・グルコース媒体（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｅｄｉｕｍ） 中で培養した。プレーティングした２４時間後に２９３細胞は約８０％集密度となり、細胞をＤＮＡ１２μｇを用いてトランスフェクションした。ＤＮＡ１２μｇを、リポフェクタミン６０ｕｌおよび血清を含まないＤＭＥハイ・グルコース媒体２ｍＬと混合した。媒体をプレートから吸引しそして細胞を血清を含まない媒体を用いて一回洗浄した。ＤＮＡ、リポフェクタミン、および媒体混合物を血清を含まない媒体１０ｍＬと一緒にプレートに加えた。３７℃で４〜５時間のインキュベーションの後に、媒体を吸引し、そして血清を含む媒体２５ｍｌを加えた。トランスフェクションの２４時間後に媒体を再度吸引し、そして血清を含む新しい媒体を加えた。トランスフェクションの４８時間後に、媒体を吸引しそして血清を含みゲネチシン（Ｇ４１８薬剤）を含む媒体を加え、最終濃度５００μｇ／ｍＬまで加えた。トランスフェクションした細胞は、ここでＧ４１８耐性遺伝子を含む陽性にトランスフェクションされた細胞に関して選択する。選択が起きる度に媒体を４〜５日毎に交換した。選択の間に、細胞は安定なプールを創成するために増殖するか、または安定クローン選択のためにスプリットする。
【００７５】
実施例４ 非内因性ＧＰＣＲの構成的活性の決定のためのアッセイ
種々の方法が非内因性ヒトＧＰＣＲの構成的活性の評価のために利用でされ。以下は例示である。当該技術分野の通常の熟練者は、熟練者の要求に優先的に役立つこのような技術を決定する能力を有すると信じられる。
１．膜結合アッセイ：〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質共役型受容体がその活性状態にある場合に、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として、受容体はＧタンパク質に結合しそしてＧＤＰの遊離およびその後のＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質共役型受容体複合体のαサブユニットは、ＧＴＰアーゼとして作用しそしてＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、その時点で受容体は通常は脱活される。構成的活性化受容体はＧＴＰをＧＤＰへ交換することを続ける。非−加水分解性ＧＴＰ類似体である〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳは、構成的活性化受容体を発現する膜への〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳの増強された結合を証明するために使用できる。構成的活性化を測定するために〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合を用いる利点は、（ａ）これがすべてのＧタンパク質共役型受容体に包括的に適用される、（ｂ）これが、膜表面の近くで細胞内カスケードに影響する分子を取り上げることを困難とすることである。
【００７６】
このアッセイは、関係する受容体を発現する膜に結合する〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳを刺激するＧタンパク質共役型受容体の能力を利用する。従って、このアッセイは、既知のオーファンおよび構成的活性化Ｇタンパク質共役型受容体への候補化合物をスクリーニングするための直接同定法に使用できる。アッセイは包括的であり、そしてすべてのＧタンパク質共役型受容体における薬剤発見に適用される。
【００７７】
〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１〜約２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ （この量は、２０ｍＭが好ましいけれども、結果の最適化のために調節できる）ｐＨ７．４、約０．３〜約１．２ｎＭ 〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ（この量は、１．２が好ましいけれども、結果の最適化のために調節できる）を含む結合緩衝液および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（例えばＧｓ融合タンパク質を発現する２９３細胞、この量は最適化のために調節できる）および１０μＭ ＧＤＰ（この量は最適化のために調節できる）中で１時間インキュベーションした。次いでコムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えそして混合物をさらに３０分間、室温でインキュベーションした。次いで管を１５００ ｘ ｇで５分間、室温で遠心分離し次いでシンチレーションカウンターでカウントした。
２．アデニル酸シクラーゼ
細胞に基づくアッセイのために設計されたフラッシュ・プレート（Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ） ^ＴＭアデニル酸シクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、粗血漿膜と共に用いるために変更できる。フラッシュ・プレートウエルは、ｃＡＭＰを認識する特定の抗体も含むシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ） コーティングを含むことができる。ウエル内で産生されたｃＡＭＰはｃＡＭＰ抗体に対する放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合に関する直接競合により定量できる。以下の記載は、受容体を発現する全細胞内のｃＡＭＰレベル内の変化の測定のための簡単なプロトコールとして役立つ。
【００７８】
トランスフェクションされた細胞を一過性トランスフェクションの約２４時間後に採取した。媒体を注意して吸引して取り出し廃棄した。ＰＢＳ１０ｍｌを細胞のそれぞれの皿におだやかに加え次いで注意して吸引した。Ｓｉｇｍａ 細胞分離緩衝液１ｍｌおよびＰＢＳ３ｍｌをそれぞれのプレートに加えた。細胞を皿からピペットで取り出しそして細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐型遠心分離管内に集めた。次いで細胞を室温、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを注意して適当な体積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）内に再懸濁した。次いで細胞を血球計数器を用いて計数しそして追加のＰＢＳを加えて細胞の概略数を与えた（最終体積約５０μｌ／ウエル）。
【００７９】
ｃＡＭＰ標準および「検出緩衝液」（「検出緩衝液」１１ｍｌにトレーサー〔^１２５ ＩｃＡＭＰ（５０μｌ〕の１μＣｉを含んでなる）を調製し、そして製造者の指示に従って維持した。「アッセイ緩衝液」をスクリーニングのために新たに調製しそしてこれは「刺激緩衝液」５０μｌ、試験化合物３ｕｌ（１２ｕＭの最終アッセイ濃度）および細胞５０μｌを含み、「アッセイ緩衝液」は使用するまで氷上に保管した。アッセイは、適当なウエルにｃＡＭＰ標準５０μｌの添加から始まり、次いでウエルＨ−１１およびＨ−１２へＰＢＳＡ５０ｕｌを加えた。「刺激緩衝液」５０μｌをすべてのウエルに加えた。ＤＭＳＯ（または選択した候補化合物）を化合物溶液３μｌの供給ができるピン器具を用いて適当なウエルに加え、１２μＭ試験化合物の最終アッセイ濃度および全アッセイ体積１００μｌとした。次いで細胞をウエルに加えそして６０分間、室温でインキュベーションした。次いでトレーサーｃＡＭＰを含む「検出混合物」１００μｌをウエルに加えた。次いでプレートをさらに２時間インキュベーションし、次いでウオラック・マイクロベータ（Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ）シンチレーションカウンター内で計数した。次いでｃＡＭＰ／ウエルの値をそれぞれのアッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿した。
３．Ｇｉ共役型標的ＧＰＣＲのための細胞に基づくｃＡＭＰ
ＴＳＨＲは、活性化の際にｃＡＭＰの蓄積を起こすＧｓ共役型ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を変異すること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変化する）により構成的に活性化される。Ｇｉ共役型受容体は、アデニル酸シクラーゼを阻害すると予想され、そして、そのために、ｃＡＭＰ産生のレベルを低下し、これはｃＡＭＰレベルの問題の評価を可能とする。Ｇｉ共役型受容体の構成的活性化の指標としてのｃＡＭＰの産生の低下を測定するために有効な技術は、ｃＡＭＰの基準レベルを確立するためのＧｉ連結標的ＧＰＣＲを用いる「シグナルエンハンサー」として、最も好ましくは非内因性、構成的活性化ＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３１）（または内因性、構成的活性Ｇｓ共役型受容体）を同時トランスフェクションすることにより達成できる。Ｇｉ共役型受容体の非内因性型が創成されると、次いで標的ＧＰＣＲのこの非内因性型は、シグナルエンハンサーと一緒に同時トランスフェクションされ、そしてスクリーニングに使用できるのはこの物質である。我々は、ｃＡＭＰアッセイを使用する場合にシグナルを効率的に発生するためにこの方法を使用した。この方法は、好ましくはＧｉ共役型受容体に対する候補化合物の直接同定に使用される。この方法を使用した場合に、Ｇｉ共役型受容体にとって標的ＧＰＣＲの逆アゴニストはｃＡＭＰシグナルを増加しそしてアゴニストはｃＡＭＰシグナルを低下するであろう。
【００８０】
第一日目に、２Ｘ１０^４ ２９３および２９３細胞／ウエルをプレートアウトする。第二日目に、２個の反応管を調製する（それぞれの管についての下記の比率はプレートあたりである）。管Ａは、哺乳動物細胞内にトランスフェクションされたそれぞれの受容体の２μｇＤＮＡを、１．２１の血清を含まないＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ） 中で全体で４μｇＤＮＡ（例えばｐＣＭＶベクター、変異ＴＨＳＲ（ＴＨＳＲ−Ａ６２３１Ｉ）を含むｐＣＭＶベクター、ＴＨＳＲ−Ａ６２３１ＩおよびＧＰＣＲなど）と混合して調製する。管Ｂは、１２０μｌリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） を１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ中で混合して調製する。次いで、管ＡおよびＢを倒置（数回）してよく混合し、次いで室温で３０〜４５分間インキュベーションした。混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレーティングした２９３細胞を１ＸＰＢＳを用いて洗浄し、次いで血清を含まないＤＭＥＭ１０ｍｌを加える。次いでトランスフェクション混合物２．４ｍｌを細胞に加え、次いで４時間、３７℃／５％ＣＯ_２ でインキュベーションする。次いでトランスフェクション混合物を吸引して取り出し、次いでＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清２５ｍｌを加える。次いで細胞を３７℃／５％ＣＯ_２ でインキュベーションする。２４時間インキュベーションの後、細胞を採取しそして分析に使用する。
【００８１】
しかし、細胞に基づくアッセイのために設計されたフラッシュ・プレート^ＴＭアデニル酸シクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ ）は、熟練者の要求に従って粗血漿膜と用いるために変更できる。フラッシュ・プレートウエルは、ｃＡＭＰを認識する特定の抗体も含むシンチラントコーティングを含むことができる。ウエル内で産生されたｃＡＭＰはｃＡＭＰ抗体に対する放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合に関する直接競合により定量できる。以下の記載は、受容体を発現する全細胞内のｃＡＭＰレベル内の変化の測定のための簡単なプロトコールとして役立つ。
【００８２】
トランスフェクションされた細胞を一過性トランスフェクションの約２４時間後に採取する。媒体を注意して吸引して取り出して廃棄する。ＰＢＳ１０ｍｌを細胞のそれぞれの皿におだやかに加え次いで注意して吸引する。Ｓｉｇｍａ細胞分離緩衝液１ｍｌおよびＰＢＳ３ｍｌをそれぞれのプレートに加える。細胞を皿からピペットで取り出しそして細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐型遠心分離管内に集める。次いで細胞を室温、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを注意して適当な体積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）内に再懸濁する。次いで細胞を血球計数器を用いて計数しそして追加のＰＢＳを加えて細胞の概略数を与える（最終体積約５０μｌ／ウエル）。
【００８３】
ｃＡＭＰ標準および「検出緩衝液」（「検出緩衝液」１１ｍｌにトレーサー〔^１２５ ＩｃＡＭＰ（５０μｌ〕の１μＣｉを含んでなる）を調製し、そして製造者の指示に従って維持する。「アッセイ緩衝液」をスクリーニングのために新たに調製しなればならずそしてこれは「刺激緩衝液」５０μｌ、試験化合物３ｕｌ（１２ｕＭ最終アッセイ濃度）および細胞５０μｌを含み、「アッセイ緩衝液」は使用するまで氷上で保管できる。アッセイは、適当なウエルにｃＡＭＰ標準５０μｌの添加から始めることができ、次いでウエルＨ−１１およびＨ−１２へＰＢＳＡ５０ｕｌを加える。刺激緩衝液５０μｌをウエルに加える。選択した化合物（例えばＴＳＨ）を化合物溶液３μｌの供給ができるピン器具を用いて適当なウエルに加え、１２μＭ試験化合物の最終アッセイ濃度および全アッセイ体積１００μｌとする。次いで細胞をウエルに加えそして６０分間、室温でインキュベーションする。次いでトレーサーｃＡＭＰを含む「検出混合物」１００μｌをウエルに加える。次いでプレートをさらに２時間インキュベーションし、次いでウオラック・マイクロベータシンチレーションカウンター内で計数する。次いでｃＡＭＰ／ウエルの値をそれぞれのアッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
４．レポーターに基づくアッセイ
ａ．Ｇｒｅ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ−関連受容体）
２９３および２９３ｔ細胞をウエルあたりに２ｘ１０^４ 細胞の密度で９６ウエルプレート上にプレートアウトし、そして製造者の指示に従って次の日にリポフェクタミン試薬（ＢＲＬ） を用いてトランスフェクションした。ＤＮＡ／脂質混合物をそれぞれ６ウエルトランスフェクション物について次のように調製した：ＤＭＥＭ１００μｌ中のプラスミドＤＮＡ２６０ｎｇをＤＭＥＭ１００μｌ中の脂質２μｌとおだやかに混合した（８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド２００ｎｇ、内因性受容体または非内因性受容体を含んでなるｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独の５０ｎｇ、およびＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３中のＧＰＲＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））１０ｎｇから成るプラスミドＤＮＡ２６０ｎｇ）。８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、以下のようにして調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ｐβｇａｌ−ベーシックベクター（Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位でラット・ソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングして得られた。ｃＡＭＰ反応因子の８個のコピーは、アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（７ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８８３（１９９６）参照）からＰＣＲにより得られそしてＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位でＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクター内にクローニングすると、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターが得られた。８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポタープラスミドは、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位におけるｐＧＬ３−ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ） から得たルシフェラーゼ遺伝子と置換して生成した。３０分、室温でのインキュベーションの後に、ＤＮＡ／脂質混合物をＤＭＥＭ４００μｌを用いて希釈し、そして希釈混合物１００μｌをそれぞれのウエルに加えた。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ１００μｌを、細胞カルチャーインキュベーター中での４時間のインキュベーションの後にそれぞれのウエルに加えた。次の日に、トランスフェクションした細胞を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ２００μｌ／ウエルに交換した。８日後に、ＰＢＳを用いる洗浄１回の後にフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ１００μｌ／ウエルにウエルを交換した。ルシフェラーゼ活性は、ルクライト（ＬｕｃＬｉｔｅ）^ＴＭレポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ） を用い製造者の指示に従いそして１４５０マイクロベータ（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ） ^ＴＭシンチレーションおよび蛍光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いて読み取って次の日に測定した。
ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための方法は、これらのプロモーター中にＡＰ１因子を含む遺伝子の活性化を起こすＧｑ−依存性ホスホリパーゼＣの既知の性質に依存する。パスデテクト（Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ） ^ＴＭ ＡＰ−１ ｃｉｓ−レポーティングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 、カタログ番号＃２１９０７３）が、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して以上に記載したプロトコールにしたがって使用できるが、リン酸カルシウム沈降物の成分が４１０ｎｇ ｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇ ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ ＣＭＶ−ＳＥＡＰであった点が異なる。
ｃ．Ｓｒｆ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための一つの方法は、そのプロモーター中に血清反応因子を含む遺伝子の活性化を起こすＧｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の性質に依存する。パスデテクト^ＴＭＳＲＦ−Ｌｕｃ−レポーティングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が、例えばＣＯＳ７細胞中のＧｑ共役活性のアッセイに使用できる。細胞を系のプラスミド成分を用いてトランスフェクションしそして哺乳動物トランスフェクション（Ｍａｎｎｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ） ^ＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 、カタログ番号＃２００２８５）を製造者の指示に従って使用して内因性または非内因性ＧＰＣＲをコードする発現プラスミドを示す。要約すると、４１０ｎｇ ＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ ＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリホスファターゼ発現プラスミド。アルカリホスファターゼ活性は試料間のトランスフェクション効果における変動を制御するためにトランスフェクションされた細胞の媒体中で測定する）を、製造者の指示に従ってリン酸カルシウム沈降物中に混和する。沈降物の半分を９６−ウエルプレート中の３ウエル上に均等に分布させ、血清を含まない媒体中の細胞上に２４時間保持する。最後の５時間に、指示された場合に、細胞を１μＭアンギオテンシンを用いてインキュベーションする。次いで、細胞を溶解しそしてルシライト（Ｌｕｃｉｌｉｔｅ）^ＴＭキット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ番号＃６０１６９１１） および「トリラックス（Ｔｒｉｌｕｘ）１４５０マイクロベータ（Ｍｉｃｒｅｂｅｔａ） 」液体シンチレーションおよび蛍光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いて、製造者の指示に従ってルシフェラーゼ活性をアッセイする。データはグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）^ＴＭ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて分析できる。
ｄ．細胞内ＩＰ_３ 蓄積アッセイ（Ｇｗ−関連受容体）
第一日目に、受容体（内因性および／または非内因性）を含んでなる細胞を２４ウエルプレート上に、通常は１ｘ１０^５ 細胞／ウエルでプレーティングできる（この数は最適化できるが）。第二日目に、細胞を最初、血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌ／ウエル中の０．２５μｇＤＮＡおよび血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌ／ウエル中の２μｌリポフェタミンと混合してトランスフェクションできる。溶液をおだやかに攪拌しそして１５〜３０分間、室温でインキュベーションする。細胞を０．５ｍｌ ＰＢＳを用いて洗浄し、血清を含まない媒体４００μｌをトランスフェクション媒体と混合しそして細胞に加える。次いで細胞を３〜４時間、３７℃／５％ＣＯ_２ でインキュベーションし次いでトランスフェクション媒体を除きそして通常の増殖媒体１ｍｌ／ウエルで置き換えた。第三日目に、細胞を ^３Ｈ−ミオ−イノシトールを用いて標識する。要約すると、媒体を除きそして細胞を０．５ｍｌＰＢＳを用いて洗浄する。次いで、０．５ｍｌイノシトール不含／血清不含媒体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ） を、ウエルあたりに ^３Ｈ−ミオ−イノシトールの０．２５μＣｉと一緒にウエルあたりに加えそして細胞を１６〜１８時間、３７℃／５％ＣＯ_２ でインキュベーションする。第四日目に、細胞を０．５ｍｌＰＢＳで洗浄し、そしてイノシトール不含／血清不含媒体１０μＭパルジリン１０ｍＭ塩化リチウムを含むアッセイ媒体０．４５ｍｌもしくはアッセイ媒体０．４ｍｌおよび１０ｘケタンセリン（ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ 、ｋｅｔ）５０μｌを最終濃度１０μＭとしたものを加える。次いで細胞を３０分間３７℃でインキュベーションする。次いで細胞をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄しそして新規／氷冷却停止溶液（１Ｍ ＫＯＨ；１８ｍＭホウ酸Ｎａ；３．８ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌをウエルあたりに加える。溶液を氷上で５〜１０分間、または細胞が溶解するまで保持し、次いで新規／氷冷中和溶液（７．５％ＨＣＬ）２００μｌにより中和する。次いで１．５ｍｌエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ） 管内に溶解物を移しそしてクロロホルム／メタノール（１：２）１ｍｌを管当たりに加える。溶液を１５秒間ウズ攪拌し、上相をバイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）ＡＧ１−Ｘ８^ＴＭアニオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に加える。最初に樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖの水を用いて洗浄しそして上相０．９ｍｌをカラム上に加える。カラムを５ｍＭミオ−イノシトール１０ｍｌおよび５ｍＭ ホウ酸Ｎａ／６０ｍＭギ酸Ｎａ １０ｍｌを用いて洗浄する。イノシトール・三リン酸が０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムの２ｍｌを含むシンチレーションカクテル１０ｍｌを含むシンチレーションバイアル内で溶離する。カラムを０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムの１０ｍｌを用いて洗浄しそして２回、ｄｄＨ_２ Ｏを用いてリンスしそして４℃水中で保管する。
【００８４】
例示的な結果を以下の表Ｇに示す。
【００８５】
【表６】

【００８６】
上記の実施例４（１）で開示した構成的活性化を検出するためのＧＴＰγＳアッセイの例示的な結果は、ヒトＲＵＰ１３およびＲＵＰ１５上での「Ｇｓ：融合タンパク質構築物」を用いて達成された。下記の表Ｈは、このアッセイから生成されたシグナルおよび示したようなシグナルの相違を表示する。
【００８７】
【表７】

【００８８】
実施例５
融合タンパク質調製
ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物
構成的活性化ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計は、以下のように行った：ラットＧタンパク質Ｇｓα（長形；Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， ８３ ＰＮＡＳ ３７７６ （１９８６））の５’および３’末端の両方を、この上にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を含むように操作した。正しい配列（近接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む）の確認の後に、全配列を、そのベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてサブクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号Ｖ７９５−２０）中にシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ） した。Ｇｓα配列の正しい方向は、ｐｃＤＮＡ３．１（−）中へのサブクローニングの後に決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ配列で変更したラットＧｓα遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１（−）を次いで確認した。これでこのベクターは、「汎用」Ｇｓαタンパク質ベクターとして利用できた。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは種々の周知の制限部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に含み、従ってＧｓタンパク質の上流に、内因性、構成的活性ＧＰＣＲのコーディング配列を挿入する能力を有利に与える。この同じ方法は、他の「汎用」Ｇ−タンパク質ベクターを創成するためにも利用でき、そして当然ながら、その他の商業的に利用可能、または熟練者に既知の独自のベクターも使用可能であり、その際、重要な基準は、ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質のものの上流でそしてインフレームであることである。
【００８９】
ＲＵＰ１３は、Ｇｓを介して共役する。下記の例示的「ＧＰＣＲ融合タンパク質」について、Ｇｓαへの融合が達成された。
【００９０】
ＲＵＰ１３−「Ｇｓα融合タンパク質」構築物を以下のようにして作製した。プライマーは以下のように設計した。
５’−ｇａｔｃ〔ＴＣＴＡＧＡＡＴ〕ＧＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号９７、センス）
５’−ｇａｔｃ〔ＧＡＴＡＴＣ〕ＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＴＧＡＧＧＣＧＧＣ−３’（配列番号９８、アンチセンス）
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＲＵＰ１３との間の制限部位（括弧内に示す）内のスペーサーとして含まれる。センスおよびアンチセンスプライマーは、スペーサー（制限部位に帰属する）がＧタンパク質とＲＵＰ１５との間に存在するように、それぞれＸｂａＩとＥｃｏＲＶのための制限部位を含んでいた。
【００９１】
次いで、上記に開示したＧｓα汎用ベクター内の融合ためのそれぞれの受容体配列を確保するためにＰＣＲを使用し、それぞれ下記のプロトコールを用いた。ＲＵＰ１５のための１００ｎｇ ｃＤＮＡを、それぞれプライマー（センスおよびアンチ−センス）２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ３μＬ、１０Ｘタックプラス^ＴＭプレシジョン緩衝液（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）１０μＬ、タックプラス^ＴＭプレシジョンポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ： ＃６００２１１） １μＬ、および水８０μＬを含む別々の管に加えた。ＲＵＰ１５のための反応温度およびサイクル時間は、サイクルステップ２〜４の３５回反復を含んで下記であった。１分間９４℃、３０秒間９４℃、２０秒間６２℃、１分４０秒間７２℃、および５分間７２℃。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上を流し次いで精製した（データは記載しない）。精製した産物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化しそして所望の内挿物を精製しそしてそれぞれの制限部位でＧｓ汎用ベクター内に連結した。陽性クローンを形質転換の後に単離しそして制限酵素消化により決定した。２９３細胞を用いる発現が、本明細書内に記載したプロトコールを用いて達成された。ＲＵＰ１５−「Ｇｓ融合タンパク質」のそれぞれの陽性クローンを正確さを確認するために配列決定した。（核酸配列に関しては配列番号９９、そしてアミノ酸配列に関しては配列番号１００参照）。
【００９２】
ＲＵＰ１５は、Ｇｓを介して共役する。下記の例示的「ＧＰＣＲ融合タンパク質」について、Ｇｓαへの融合が達成された。
【００９３】
ＲＵＰ１５−「Ｇｓα融合タンパク質」構築物を以下のようにして作製した。プライマーは以下のように設計した。
５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１０１、センス）
５’−ｇａｔａｔｃＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＧＴＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１０２、アンチセンス）
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＲＵＰ１５との間の制限部位内のスペーサーとして含まれる。センスおよびアンチセンスプライマーは、スペーサー（制限部位に帰属する）がＧタンパク質とＲＵＰ１５との間に存在するように、それぞれＥｃｏＲＶとＸｂａＩのための制限部位を含んでいた。
【００９４】
次いで、上記に開示したＧｓα汎用ベクター内の融合ためのそれぞれの受容体配列を確保するためにＰＣＲを使用し、それぞれ下記のプロトコールを用いた。ＲＵＰ１５のための１００ｎｇ ｃＤＮＡを、それぞれプライマー（センスおよびアンチ−センス）２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ３μＬ、１０Ｘタックプラス^ＴＭプレシジョン緩衝液１０μＬ、タックプラス^ＴＭプレシジョンポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ： ＃６００２１１） １μＬ、および水８０μＬを含む別々の管に加えた。ＲＵＰ１５のための反応温度およびサイクル時間は、サイクルステップ２〜４の３５回反復を含んで下記であった。１分間９４℃、３０秒間９４℃、２０秒間６２℃、１分４０秒間７２℃、および５分間７２℃。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上を流し次いで精製した（データは記載しない）。精製した産物を消化した。）精製した産物をＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩを用いて消化しそして所望の内挿物を精製しそしてそれぞれの制限部位でＧｓ汎用ベクター内に連結した。陽性クローンを形質転換の後に単離しそして制限酵素消化により決定した。２９３細胞を用いる発現が、本明細書内に記載したプロトコールを用いて達成された。ＲＵＰ１５−「Ｇｓ融合タンパク質」のそれぞれの陽性クローンを正確さを確認するために配列決定した。（核酸配列に関しては配列番号１０３、そしてアミノ酸配列に関しては配列番号１０４参照）。
ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物
Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ融合構築物の設計は、以下のようにして達成できた。Ｎ−末端の６個のアミノ酸（ＴＥＬＳＩＭの配列（配列番号１２９）Ｇαｑ−サブユニットを有する２〜７のアミノ酸を欠失しそして配列ＥＹＮＬＢ（配列番号１３０）を有するＣ−末端の５個のアミノ酸を、配列ＤＣＧＬＦ（配列番号１３１）を有する「ＧαＩタンパク質」の相当するアミノ酸と置き換える。この融合構築物は、下記のプライマー
５’−ｇａｔｃａａｇｃｔｔｃＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１３２）および
５’−ｇａｔｃｇｇａｔｃｃＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１３３）
およびマウスＧαｑ−野生型を含むプラスミド６３３１３を用い、鋳型として血球凝集素タグを用いるＰＣＲにより得られる。小文字のヌクレオチドはスペーサーとして含まれる。
【００９５】
タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、ステップ２〜４の３５回反復を含む下記のサイクルによる複製に使用される。２分間９５℃、２０秒間９５℃、２０秒間５６℃、２分間７２℃、および７分間７２℃。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングしそしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） を用いて配列決定した。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローンからの挿入物を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位で２段クローニング法によりシャトルした。
【００９６】
実施例６
開示したヒトＧＰＣＲの組織分布：ＲＴ−ＰＣＲ
数種の新規のヒトＧＰＣＲの発現を確認しそして組織分布を決定するためにＲＴ−ＰＣＲを適用した。使用したオリゴヌクレオチドは、鋳型としてＧＰＣＲ特異性そしてヒト多重組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） であった。タック ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の指示に従う４０μｌ反応物内の増幅のために使用した。反応物２０μｌを１．５％アガロースゲル上に加えてＲＴ−ＰＣＲ産物を分析した。下記の表Ｊは、受容体、サイクル条件および使用したプライマーを表示する。
【００９７】
【表８】

【００９８】
【表９】

【００９９】
実施例７
プロトコール：逆アゴニストおよびアゴニストの直接同定
Ａ．〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイ
我々は内因性、構成的活性ＧＰＣＲを候補化合物、例えば逆アゴニストの直接同定のために完全には理解されていない理由から使用したけれども、アッセイ内の変動が大きくなることがある。次いで好ましくは、以上に公開したように「ＧＰＣＲ融合タンパク質」も非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲと一緒に使用される。我々は、このようなタンパク質を使用する場合にアッセイ内変動が本質的に安定化され、これにより効果的な信号対騒音比が得られるように見えることを認めた。これは候補化合物のさらに強固な同定を可能とする有利な結果を有する。このように、直接同定のために「ＧＰＣＲ融合タンパク質」が使用されそして利用する場合には下記のアッセイプロトコールを利用することが望ましい。
１．膜調製
関係する構成的活性オーファン「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を含んでなりそして逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定に使用するための膜は、好ましくは下記のように調製される。
ａ．材料
「膜スクレープ緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含んでなる。「膜洗浄緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含んでなる。「結合緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 、ｐＨ７．４を含んでなる。
ｂ．操作
操作の間を通じてすべての材料を氷上に保持する。第一に、媒体を細胞の集密単層から吸引し、次いで１０ｍｌ冷ＰＢＳを用いてリンスし、次いで吸引する。その後、「膜スクレープ緩衝液」５ｍｌをスクレープ細胞に加える、これに続いて、５０ｍｌ遠心分離管内に細胞抽出物を移す（２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃で遠心分離する）。その後、上清を吸引しそしてペレットを膜「洗浄緩衝液」３０ｍｌ中に再懸濁し、次いで２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃で遠心分離する。次いで、上清を吸引しそしてペレットを「結合緩衝液」内に再懸濁する。次いでこれをブリンクマン・ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｐｏｌｙｔｒｏｎ） ^ＴＭホモジナイザーを用いてホモジナイジングする（すべての材料が懸濁するまで１５〜２０秒間バースト）。これを本明細書中では「膜タンパク質」と呼ぶ。
２．ブラドフォードタンパク質アッセイ
ホモジナイゼーションに次いで、膜のタンパク質濃度をブラドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイを用いて決定する（タンパク質は約１．５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、アリコートに入れ、以後の使用のために冷凍（−８０℃）できる。冷凍した場合に、使用のためのプロトコールは以下である：アッセイの日に、冷凍した「膜タンパク質」を室温で解凍し、次いでウズ攪拌しそして約１２ｘ１．０００ｒｐｍで約５〜１０秒間ポリトロンを用いてホモジナイズする。複数の調製のためには、異なる調製物のホモジナイゼーションの間でホモジナイザーを完全に清浄化することに注意すること）
ａ．材料
「結合緩衝液」（上記の通り）、「ブラドフォード染色試薬」、「ブラドフォードタンパク質標準」を製造者の指示に従って使用する（Ｂｉｏｒａｄ カタログ番号５００−０００６） 。
ｂ．操作
２本の管を調製し、一方は膜を含みそして他方は対照の「ブランク」とする。それぞれは「結合緩衝液」８００ｕｌを含む。その後、「ブラドフォードタンパク質標準」（１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌをそれぞれの管に加え、次いで膜「タンパク質」１０μｌを一本の管（ブランク以外）を除いて加える。その後、「ブラドフォード染色試薬」２００μｌをそれぞれの管に加え、次いでそれぞれウズ攪拌する。５分後に、管を再びウズ攪拌しそしてその中の材料をキュベットに移す。次いでキュベットをＣＥＣＩＬ３０４１分光光度計を用いて波長５９５で読み取る。
３．直接同定アッセイ
ａ．材料
「ＧＤＰ緩衝液」は、３７．５ｍｌ「結合緩衝液」および２ｍｇ ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ−７１２７） から成り、次いで「結合緩衝液」中の一連の希釈により０．２μＭ ＧＤＰが得られる（それぞれのウエル内のＧＤＰの最終濃度は、０．１μＭ ＧＤＰ）。候補化合物を含んでなるそれぞれのウエルは１００μｌ「ＤＰＧ緩衝液」（最終濃度、０．１μＭ ＧＤＰ）、「結合緩衝液」中の「膜タンパク質」５０ｕｌ、および「結合緩衝液」中の〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌ（１０ｍｌ「結合緩衝液」あたり２．５μｌ〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ）から成る２００ｕｌの最終体積を有する。
ｂ．操作
候補化合物は、好ましくは９６ウエルプレートフォーマットを用いてスクリーニングされる（これらは−８０℃で冷凍できる）。「膜タンパク質」（または対照として「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を含まない発現ベクターを有する膜）を懸濁するまで短時間ホモジナイズする。次いで、タンパク質濃度を上記の「ブラドフォードタンパク質アッセイ」セットを用いて決定する。次いで「膜タンパク質」（および対照）を「結合緩衝液」中で０．２５ｍｇ／ｍｌまで希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇウエル）。その後、「ＧＤＰ緩衝液」１００μｌをウオラックシンチストリップ（Ｗａｌｌａｃ Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ） ^ＴＭ （Ｗａｌｌａｃ）のそれぞれのウエルに加えた。次いで候補化合物５ｕｌをこのウエル内に移すために５ｕｌピン器具を用いる（すなわち２００μｌの全アッセイ体積中の５ｕｌは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が１０μＭであるような１：４０の比である）。再度、汚染を防ぐために、それぞれの移動ステップの後、水（１Ｘ）、エタノール（１Ｘ）および水（２Ｘ）を含んでなる３基の容器内でピン器具を洗浄すること。過剰の液体をそれぞれのリンスの後に器具から振り払いそして紙およびキムワイプ（ｋｉｍｗｉｐｅ） を用いて乾燥すること。その後、「膜タンパク質」５０μｌをそれぞれのウエルに加え（「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を含まない膜を含んでなる対照ウエルも使用する）、そして５〜１０分間、室温で予備インキュベーションする。その後、「結合緩衝液」中の〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌをそれぞれのウエルに加え、次いで振とう器内で６０分間、室温でインキュベーションする（この実施例でもプレートをフォイルで覆う）。次いで、プレートを４００ｒｐｍで１５分間、２２℃で回転してアッセイを停止する。次いでプレートを８チャンネルマニホルドを用いて吸引しそしてプレートカバーを用いてシールする。次いで、ワラック１４５０で設定「Ｐｒｏｔ．＄３７」を用いてプレートを読み取る（製造者の指定に従う）
Ｂ．サイクリックＡＭＰアッセイ
候補化合物を直接同定するための別のアッセイ方法は、シクラーゼに基づくアッセイを用いて達成される。直接同定に加えて、このアッセイ法は、上記のような〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ法からの結果の確認を与えるための独立した方法としても使用できる。
【０１００】
変更したフラッシュプレート^ＴＭアデニル酸シクラーゼ・キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ， カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）が、下記のプロトコールに従う構成的活性化オーファンＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストとしての候補化合物の直接同定のために好ましくは使用された。
【０１０１】
トランスフェクションされた細胞をトランスフェクションの約３日後に採取した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ を含む緩衝液中に懸濁した細胞のホモジナイゼーションにより膜を調製した。ホモジナイゼーションは、ブリンクマンポリトロン^ＴＭを約１０秒間使用して氷上で行った。得られたホモジネートを４９，０００Ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離する。次いで得られたペレットを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中に再懸濁し、１０秒間ホモジナイズし、次いで４９，０００Ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離した。次いで得られたペレットを−８０℃で、使用するまで保管した。直接同定スクリーニングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと解凍し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ を含む緩衝液中に再懸濁すると、０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度が得られた（再懸濁した膜は使用まで氷上に置く）。
【０１０２】
ｃＡＭＰ標準および「検出緩衝液」（「検出緩衝液」１１ｍｌにトレーサー〔^１２ＩｃＡＭＰ（１００μｌ〕の２μＣｉを含んでなる）を調製しそして製造者の指示に従って維持した。「アッセイ緩衝液」をスクリーニングのために調製し、これは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 、２０ｍＭホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ） 、０．１単位／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ） 、および０．２ｍＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ） を含んでいた。次いで「アッセイ緩衝液」を使用まで氷上で保管した。
【０１０３】
上記のようにして同定された候補化合物（冷凍された場合には、室温で解凍）を、４０μｌ「膜タンパク質」（３０μｇ／ウエル）および「アッセイ緩衝液」５０μｌと一緒に、好ましくは９６プレートウエルに加えた（３μｌ／ウエル、１２μＭ最終アッセイ濃度）。次いでこの混合物を３０分間、室温で穏やかに振とうしてインキュベーションした。
【０１０４】
インキュベーションの後、「検出緩衝液」１００μｌをそれぞれのウエルに加え、次いで２〜２４時間インキュベーションした。次いでプレートをワラック・マイクロベータ^ＴＭプレートリーダーで「Ｐｒｏｔ＃３１」を用いて計数した（製造者の指示に従う）。
【０１０５】
代表的なスクリーニングアッセイプレート（９６ウエルフォーマット）結果を図１２に示す。それぞれの棒は、それぞれのウエル内の種々の化合物と、上記の実施例５（ａ）で調製したＲＵＰ１３−ＧαＡ融合タンパク質に対する結果を示す。図１２に示した代表的な結果は、それぞれのプレートの平均結果（「ｍ」）に基づいた標準偏差および平均も与え、そして一次スクリーンから「リード」としての逆アゴニストの選択のための平均プラス２個の任意選択は、少なくとも平均プレート反応による反応百分率から標準偏差の二倍を差し引いて減らした候補化合物の選択を含む。反対に、一次スクリーンから「リード」としてのアゴニストの選択のため任意選択は、少なくとも平均プレート反応による反応百分率に標準偏差の二倍を加えて増加した候補化合物の選択を含む。これらの選択手順に基づいて、以下のウエル内の候補化合物は、ウエルＡ２およびＧ９それぞれの中のＲＵＰ１３に対する推定逆アゴニスト（化合物Ａ）およびアゴニスト（化合物Ｂ）として直接同定された。図１２参照。明確化のために以下を記す。これらの化合物はこのＧＰＣＲのための内因性リガンドのいかなる知識も持たないで直接同定された。受容体機能に基づくアッセイ技術を中心とし、そして化合物結合親和性ではなくて、我々はこの受容体の機能的活性を低下でき（化合物Ａ）ならびに受容体の機能的活性を増加できる（化合物Ｂ）化合物を確認できる。肺組織内のこれら受容体の位置に基づいて（例えば実施例６のｈＲＵＰ１３およびｈＲＵＰ２１参照）、薬剤が肺ガンの可能な治療処置のために開発できる。
【０１０６】
本明細書内で引用された文献は、同時係属および関連特許を含み、特に断らない限り、引用することにより全体を本明細書中に編入される。熟練者の判断の範囲内にある開示された本発明の変更および延長は、上記の開示および特許請求範囲の範囲内に包含される。
【０１０７】
種々の発現ベクターが当該技術分野の熟練者により利用可能であるが、内因性および非内因性ヒトＧＰＣＲの両者のための使用の目的で、使用されるベクターがｐＣＭＶであることが最も好ましい。このベクターは、１９９８年１０月１３日付けで、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ） 。ＤＮＡはＡＴＣＣＤにより試験されそして利用可能と決定された。ＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに下記の寄託番号を割り当てた：ＡＴＣＣ＃２０３３５１。
【図面の簡単な説明】
【図１】
対照（「ＣＭＶ」）と比較した内因性型ＲＵＰ１２（「ＲＵＰ１２」）からの第二メッセンジャーＩＰ_３ 産生の説明である。
【図２】
内因性ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１３」）と対照ベクター（「ＣＭＶ」）との構成的シグナル伝達の比較結果を与える第二メッセンジャー細胞基礎サイクリックＡＭＰアッセイの結果の図示である。
【図３】
ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１３ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１３（Ａ２６８Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図４】
ＲＵＰ１３：「Ｇｓ融合タンパク質」（「ＲＵＰ１３−Ｇｓ」）と対照ベクター（「ＣＭＶ」）による構成的シグナル伝達の比較結果を与える〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイの結果の図示である。
【図５】
ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ１４（「ＲＵＰ１４ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１４（Ｌ２４６Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図６】
ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ１５（「ＲＵＰ１５ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ１５（「ＲＵＰ１５（Ａ３９８Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図７】
内因性ＲＵＰ１５（「ＲＵＰ１５ｗｔ」）、ＲＵＰ１５の非内因性、構成的活性化型（「ＲＵＰ１５（Ａ３９８Ｋ）」）および対照ベクター（「ＣＭＶ」）の構成的シグナル伝達の比較結果を与える第二メッセンジャー細胞基礎サイクリックＡＭＰアッセイの結果の図示である。
【図８】
ＲＵＰ１５：「Ｇｓ融合タンパク質」（「ＲＵＰ１５−Ｇｓ」）と対照ベクター（「ＣＭＶ」）による構成的シグナル伝達の比較結果を与える〔^３５Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイの結果の図示である。
【図９】
対照（「ＣＭＶ」）と比較した内因性型ＲＵＰ１７（「ＲＵＰ１７」）からの第二メッセンジャーＩＰ_３ 産生の説明である。
【図１０】
対照（「ＣＭＶ」）と比較した内因性型ＲＵＰ２１（「ＲＵＰ２１」）からの第二メッセンジャーＩＰ_３ 産生の説明である。
【図１１】
ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ２３（「ＲＵＰ２３ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ２３（「ＲＵＰ２３（Ｗ２７５Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図１２】
ＲＵＰ１３に対する各種の候補化合物の一次スクリーニングからの結果の図示である。「化合物Ａ」の結果はウエルＡ２に示されそして「化合物Ｂ」の結果はウエルＧ９に示される。[0001]
FIELD OF THE INVENTION
The invention disclosed in this patent specification relates to transmembrane receptors, and more specifically to human G protein-coupled receptors, and in particular to establish or enhance constitutive activity of the receptors. An endogenous human GPCR with particular emphasis on the non-endogenous version of the modified GPCR. Preferably, the modified GPCRs are used for the direct identification of candidate compounds as receptor agonists, inverse agonists or partial agonists with potential applicability as therapeutic agents.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Although a number of receptor types exist in humans, the most abundant and therapeutically relevant are particularly represented by G protein-coupled receptor (GPCR or GPCRs) types. It is estimated that there are about 100,000 genes in the human genome, of which about 2%, or 2,000 genes, encode GPCRs. Receptors that include a GPCR for which an endogenous ligand has been identified are termed "known" receptors, while those for which an endogenous ligand has not been identified are termed "orphan" receptors. GPCRs are an important area for drug product development, with about 60% out of about 20 out of 100 known GPCRs being all developed with prescription drugs.
[0003]
GPCRs share a common structural motif. All these receptors have seven sequences of 22-24 hydrophobic amino acids that form seven alpha helices, each of which spans the membrane (each span being numbered). (Ie, transmembrane-1 (TM-1), transmembrane-1 (TM-1), etc.) transmembrane spirals are transmembrane-2 and transmembrane-3, transmembrane The outside of the cell membrane, ie, the “extracellular” side, is linked by the amino acid chain between the transmembrane part-4 and the transmembrane part-5 and the transmembrane part-6 and the transmembrane part-7 (these are called “ "Regions 1, 2 and 3 (designated EC-1, EC-2 and EC-3, respectively)). The transmembrane spiral is formed by the chains of amino acids between transmembrane part-1 and transmembrane part-2, transmembrane part-3 and transmembrane part-4, and transmembrane part-5 and transmembrane part-6. (Also referred to as "intracellular" regions 1, 2 and 3 (IC-1, IC-2 and IC-3), respectively). The "carboxy" ("C") terminus of the receptor is in the intracellular space inside the cell, and the "amino" ("N") terminus of the receptor is in the extracellular space outside the cell.
[0004]
Generally, when an endogenous ligand binds the receptor (often referred to as “activation” of the receptor), a subcellular domain that permits coupling between the intracellular domain and the intracellular “G protein”. There is a change in home formation. GPCRs are "much-related" with respect to G proteins, that is, GPCRs are reported to be able to interact with more than one G protein. Kenakin, T .; , 43 Life Science 1095 (1988). Currently, Gq, Gs, Gi, Gz and Go are the identified G proteins, although other G proteins also exist. Endogenous ligand-activated GPCR coupling with G proteins initiates a signaling cascade process (referred to as "signaling"). Under normal conditions, signaling ultimately results in cell activation or inhibition. It is believed that the IC-3 loop as well as the carboxy terminus of the receptor interact with the G protein.
[0005]
Under physiological conditions, GPCRs exist in the cell membrane in equilibrium between two different conformations, an "inactive" state and an "active" state. Receptors in an inactive state cannot link to intracellular signaling pathways to generate a biological response. Changes in the receptor conformation to the active state allow for linking to signaling pathways (via G proteins) and produce a biological response.
[0006]
The receptor may be stabilized in an active state by a compound such as an endogenous ligand or drug. Recent discoveries, including but not limited to alteration of the amino acid sequence of the receptor, provide a means other than endogenous ligands or drugs for promoting and stabilizing the receptor in an active state conformation. These measures effectively stabilize the active receptor by mimicking the action of an endogenous ligand that binds to the receptor. Stabilization by such ligand-dependent means is called "constitutive receptor activation".
[0007]
Summary of the Invention
Disclosed herein are endogenous and non-endogenous forms of human GPCRs and uses thereof.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The scientific literature published on receptors has adopted a number of terms relating to ligands having various effects on the receptor. For clarity and unity, the following definitions will be used throughout this patent specification. In the event that these definitions conflict with other definitions for these terms, the following definitions will control.
[0009]
“Agonist” shall mean a substance (eg, a ligand, a candidate compound) that activates an intracellular response when the substance binds to a receptor or enhances GTP binding to a membrane.
[0010]
"Amino acid abbreviations" as used herein are set forth in Table A.

"Partial agonists" are those that either activate an intracellular response to a lesser extent / range below the action of an agonist when they are bound to a receptor, or A substance that enhances binding (eg, a ligand, a candidate compound) is meant.
[0011]
An "antagonist" competitively binds to a receptor at the same site as an agonist, but does not activate the intracellular response initiated by the active form of the receptor, and thereby inhibits the intracellular response by the agonist or partial agonist. It refers to a substance that can be inhibited (eg, a ligand, a candidate compound). "Antagonists" do not reduce the reference intracellular response in the absence of an agonist or partial agonist.
[0012]
"Candidate compound" shall mean a molecule (e.g., but not limited to a chemical compound) applicable to the screening techniques. Preferably, the phrase “candidate compound” is one that has been previously determined by an indirect identification process (“indirectly identified compound”) and is selected from the group consisting of an inverse agonist, agonist or antagonist at the receptor. Free of compounds commonly known as compounds, more preferably free of indirectly identified compounds previously determined to have therapeutic efficacy in at least one mammal, and most preferably Does not include indirectly identified compounds previously determined to have therapeutic efficacy in humans.
[0013]
"Composition" means a substance comprising at least one component. "Drug composition" is an example of a composition.
[0014]
"Compound potency" shall mean a measure of the ability of a compound to inhibit or stimulate receptor functionality, as opposed to receptor binding affinity. Exemplary means for detecting compound potency are disclosed in the Examples section herein.
[0015]
"Codons" generally refer to nucleosides that bind to phosphate groups and, when translated, encode amino acids (adenosine (A), guanosine (G), cytidine (C), uridine (U) and thymidine (T)). And a group of three nucleotides (or nucleotide equivalents) comprising
[0016]
"Constitutively activated receptor" shall mean a receptor that undergoes constitutive receptor activation. Constitutively activated receptors can be endogenous or non-endogenous.
[0017]
“Constitutive receptor activation” shall mean the stabilization of the receptor in an active state by means other than the binding of the receptor to its endogenous ligand or its chemical equivalent.
[0018]
"Contact" or "contacting" shall mean bringing together at least two parts, either in an in vitro or in vivo system.
[0019]
The term “directly identify” or “directly identify” in connection with the phrase “candidate compound” refers to a constitutively activated receptor, preferably a constitutively activated orphan receptor, and most preferably a constitutively activated G protein-coupled cell It shall mean screening candidate compounds for surface orphan receptors and evaluating the compound potency of this compound. This phrase is in no way interpreted or understood to be encompassed or encompassed by the phrase “indirectly identified” or “indirectly identified”.
[0020]
“Endogenous” shall mean a substance that is naturally produced by a mammal. For example, and without limitation, "endogenous" with respect to the term "receptor" is intended to mean one that is naturally produced by a mammal (eg, but not limited to a human) or a virus. Conversely, the term “non-endogenous” within this scope shall mean something that is not naturally produced by a mammal (eg, but not limited to a human) or a virus. For example, and without limitation, a receptor that is not constitutively active in its endogenous form, but that, when engineered, is constitutively active is referred to herein as a "non-endogenous, constitutively activated receptor" Most preferably, it is called Both terms can be used to describe both "in vivo" and "in vitro" systems. For example, but not limited to, in a screening method, an endogenous or non-endogenous receptor may be associated with an in vivo screening system. As another example and not by way of limitation, when a mammalian genome has been engineered to contain a non-endogenous, constitutively activated receptor, screening of candidate compounds by in vivo means is applicable. is there.
[0021]
"G protein-coupled receptor fusion protein" and "GPCR fusion protein" are each within the scope of the invention disclosed herein at least one G protein, most preferably such a G protein. A non-endogenous protein comprising an endogenous, constitutively activated GPCR or a non-endogenous, constitutively activated GPCR fused to an alpha (α) subunit, which is a subunit that binds GTP. Here, the G protein is preferably of the same type as the G protein that naturally couples to the endogenous orphan GPCR. For example, but not limited to, in the endogenous state, where the G protein “Gsα” is the predominant G protein coupled to a GPCR, a particular GPCR-based “GPCR fusion protein” includes a GPCR fused to Gsα. Non-endogenous proteins. In some cases, as described below, a non-predominant G protein can be fused to a GPCR. The G protein can be fused directly to the c-terminus of the constitutively active GPCR or there can be a spacer between the two.
[0022]
"Host cell" shall mean a cell into which a "plasmid" and / or "vector" can be incorporated. In the case of a prokaryotic "host cell", a "plasmid" is typically replicated as an autonomous molecule as a "host cell" replica (thus, in general, a "plasmid" is a eukaryotic "host cell" Isolated for introduction into). In the case of a eukaryotic "host cell", the "plasmid" is integrated into the "host cell" cellular DNA such that the "plasmid" is replicated when the eukaryotic "host cell" is replicated. . Preferably, for the purposes of the invention disclosed herein, a "host cell" is eukaryotic, more preferably a mammal, and most preferably 293, 293T and COS-7. It is selected from the group consisting of cells.
[0023]
"Indirect identification" or "indirectly identified" refers to the identification of an endogenous ligand specific for an endogenous receptor, to a receptor for interfering with and / or competing with a ligand-receptor interaction. It refers to the traditional approach to the drug discovery process, including screening candidate compounds and assessing the efficacy of the compound to affect at least one alternative messenger pathway associated with the activating receptor.
[0024]
“Inhibit” or “inhibit” in the context of the term “reaction” is intended to mean that the reaction is reduced or prevented when a compound is present, as opposed to in the absence of the compound.
[0025]
An “inverse agonist” is a receptor that binds to either the endogenous form of the receptor or a constitutively activated form of the receptor, and is below the normal baseline activity level observed in the absence of an agonist or partial agonist. A substance (eg, ligand, candidate compound) that inhibits the basal intracellular response initiated by the active form of or reduces GTP binding to the membrane. Preferably, the basal intracellular response is inhibited by at least 30%, more preferably at least 50%, and most preferably at least 75%, in the presence of the inverse agonist, as compared to a baseline response in the absence of the inverse agonist. You.
[0026]
“Known receptor” shall mean an endogenous receptor for which an endogenous ligand specific for the receptor has been identified.
[0027]
“Ligand” shall mean an endogenous, naturally occurring molecule specific for an endogenous, naturally occurring receptor.
[0028]
A “variant” or “mutation” with respect to the nucleic acid and / or amino acid sequence of an endogenous receptor is an endogenous, non-constitutively activated receptor such that a variant form of the receptor reveals constitutive activation of the receptor. A particular change or multiple changes to the sexual sequence shall be meant. For a particular sequence equivalent, (a) the level of constitutive activation of the next mutated form of the human receptor is essentially the same as revealed by the first mutation of the receptor, and ( b) the percentage of sequence (amino acid and / or nucleic acid) homology between the next variant of the receptor and the first variant of the receptor is at least about 80%, more preferably at least about 90% and most preferably If it is at least about 95%, the next variant of the human receptor is considered equivalent to the first mutation of the human receptor. Ideally, and to achieve constitutive activation, the most preferred cassette disclosed herein comprises a single amino acid and / or codon change between the endogenous and non-endogenous forms of the GPCR. By fact, the percentage of sequence homology must be at least 98%.
[0029]
A “non-orphan receptor” is an endogenous, naturally occurring molecule specific for an endogenous, naturally occurring ligand whose binding to the receptor activates an intramolecular signaling pathway. Shall mean.
[0030]
“Orphan receptor” shall mean an endogenous receptor for which no endogenous ligand specific for that receptor has been identified or is unknown.
[0031]
“Pharmaceutical composition” is intended to mean a composition comprising at least one active ingredient, wherein the composition is for a particular efficacious outcome in a mammal (eg, but not limited to a human). Can be tested. Those of ordinary skill in the art will understand and appreciate the appropriate techniques for determining whether an active ingredient has the desired efficacious outcome based on the needs of the skilled artisan.
[0032]
“Plasmid” shall mean the combination of “vector” and cDNA. Generally, a "plasmid" is introduced into a "host cell" for the purpose of replicating and / or expressing cDNA as a protein.
[0033]
“Second messenger” shall mean the intracellular response produced as a result of receptor activation. The second messenger is, for example, inositol triphosphate (IP₃ ), Diacylglycerol (DAG), cyclic AMP (cAMP), and cyclic GMP (cGMP). Second messenger response can be measured to determine receptor activation. In addition, second messenger responses can be measured for direct identification of candidate compounds, including, for example, inverse agonists, agonists, partial agonists and antagonists.
[0034]
"Stimulus" or "stimulate", in relation to the term "response", shall mean that the response increases in the presence of the compound, as opposed to in the absence thereof.
[0035]
A related "vector" of cDNA is intended to mean a circular DNA capable of incorporating at least one cDNA and capable of being incorporated into a "host cell".
[0036]
The order of the following sections has been determined for the sake of clarity and is not intended and should not be construed as limiting the disclosure or claims below.
A. INTRODUCTION
Traditional studies of receptors have been based on a priori (historical) assumption that endogenous ligands must first be identified before discovery can proceed to discover antagonists and other molecules that can affect the receptor. He was always moving forward. The search immediately proceeded to the search for the endogenous ligand, even if the antagonist was first identified. This mode of thinking was continued in receptor research even after the discovery of constitutively activated receptors. What has not previously been observed is that the most useful for the discovery of receptor agonists, partial agonists, and inverse agonists is the active state of the receptor. For diseases that result from overactive or underactive receptors, what is desired for a therapeutic agent is a compound that decreases the activity of the receptor or enhances the activity of the receptor, respectively. It is not necessarily a drug that is an antagonist to the endogenous ligand. This is because compounds that reduce or enhance the activity of the active receptor state need not bind to the same site as the endogenous ligand. Thus, as taught by the methods of the present invention, any search for a therapeutic compound should begin with screening the compound for a ligand-independent active state.
B. Identification of human GPCR
Studies of the Human Genome Project have resulted in the identification of a great deal of information about nucleic acid sequences located within the human genome. In the case of this study, genomic sequence information was provided without understanding or recognition as to whether a particular genomic sequence contains or does not contain open reading frame information that translates a human protein. Several methods for identifying nucleic acid sequences in the human genome are within the purview of those of ordinary skill in the art. For example, but not by way of limitation, the various human GPCRs disclosed herein are available from GeneBank.^TMA search of the database was found. Table B below lists some of the endogenous GPCRs we have discovered, along with other GPCRs that are homologous to the disclosed GPCRs.
[0037]
[Table 1]

[0038]
Receptor homology is useful for gaining an estimate of the role of the receptor in the human body. In accordance with the progress described herein, we will disclose techniques for mutating these receptors to establish non-endogenous, constitutively activated forms of these receptors.
[0039]
The techniques disclosed herein also apply to other human, orphan GPCRs known in the art, which will become apparent as the description proceeds herein.
C. Receptor screening
The screening of candidate compounds for the non-endogenous, constitutively activated form of the human GPCR disclosed herein does not require the use of an endogenous ligand for the receptor, and the candidate acting on this cell surface receptor Enables direct identification of compounds. Conventional and often commercially available techniques can be used to determine regions in the body where the endogenous forms of the human GPCRs disclosed herein are expressed and / or overexpressed. These techniques can also be used to determine related disease / disorder states associated with receptor expression and / or overexpression, and such methods are disclosed herein.
[0040]
The creation of mutations that would reveal constitutive activation of the human GPCRs disclosed herein is based on the distance of the GPCR from proline residues that are assumed to be located within TM6. This algorithmic technique is disclosed in co-pending and commonly assigned patent specification PCT / US99 / 23938, published April 20, 2000 as WO 00/22129, which is incorporated herein by reference. It is incorporated herein by reference along with other patent documents cited in the specification. This algorithmic technique is not predicated on the traditional sequence "alignment", but rather from the TM6 proline residues described above (or, of course, the endogenous constitutive substitutions of such proline residues). Determined by the specified distance. Mutation of the amino acids located 16 amino acid residues from this residue (presumably located within the IC3 region of the receptor) to the most preferred lysine residue would result in such activation. Other amino acid residues would be useful for mutation at this position to achieve this purpose.
D. Disease / disorder identification and / or selection
As described in detail below, most preferably, inverse agonists and agonists for non-endogenous, constitutively activated GPCRs can be identified by the methodology of the present invention. Such inverse agonists and agonists are ideal candidates as lead compounds in drug discovery programs for treating diseases associated with this receptor. The ability to directly identify inverse agonists for GPCRs, thereby enabling the development of pharmaceutical compositions, allows the search for diseases and disorders associated with GPCRs. For example, scanning of both diseased and normal tissue samples for the presence of GPCRs has gone beyond scholarly experiments or the path to identify endogenous ligands to particular GPCRs. Tissue scans can be performed over a wide range of healthy and diseased tissues. Such a tissue scan provides a preferred first step in linking a particular receptor to a disease and / or disorder.
[0041]
Preferably, the DNA sequence of the human GPCR is used to generate probes for (a) dot-blot analysis on tissue-mRNA and / or (b) RT-PCT identification of receptor expression in tissue samples. used. The presence of the receptor in the tissue source, or the presence of the receptor at a higher concentration in the diseased tissue as compared to the diseased or normal tissue, is not limited, but may limit the therapeutic strategy and the disease associated with the disease. Can be used to identify correlations. Receptors can be similarly localized to organ areas by this technique. Based on the known function of the particular tissue in which the receptor is located, the putative functional role of the receptor can be inferred.
E. FIG. Screening candidate compounds
1. Comprehensive GPCR screening assay technology
When the G protein receptor becomes constitutively active, it binds to G proteins (eg, Gq, Gs, Gi, Gz, Go) and stimulates GTP binding to G proteins. Thus, the G protein acts as a GTPase and slowly hydrolyzes GTP to GDP, thereby deactivating the receptor under normal conditions. However, constitutively activated receptors continue to exchange GDP for GTP. It is a non-hydrolysable analog of GTP [³⁵[S] GTPγS can be used to measure enhanced binding to membranes expressing constitutively activated receptors. [³⁵It has been reported that [S] GTPγS can be used to measure G protein coupling to membranes in the absence or presence of ligand. Among other examples that are well known and available to those skilled in the art, an example of this measurement was reported in 1995 by Traynor and Nahorski. A preferred use of this assay system is the initial screening of candidate compounds, which is a comprehensive system for all G protein-coupled receptors, regardless of the particular G protein that interacts with the intracellular domain of the receptor. Because it can be applied.
2. Specific GPCR screening assay technology
Candidate compounds are identified using a "global" G protein-coupled receptor assay (ie, an assay for selecting compounds that are agonists, partial agonists, or inverse agonists), and the compounds interact at the receptor site It is preferable to carry out screening to confirm that the measurement has been performed. For example, compounds identified in a "global" assay will not bind to the receptor, but will simply "uncouple" G proteins from the intracellular domain.
a. Gs, Gz and Gi
Gs stimulates the enzyme adenylate cyclase. Gi (and Gz and Go), on the contrary, inhibit this enzyme. Adenylate cyclase catalyzes the conversion of ATP to cAMP. Thus, constitutively activated GPCRs that couple to Gs proteins are associated with increased cellular levels of cAMP. Conversely, constitutively activated GPCRs that couple to Gi (or Gz, Go) proteins are associated with reduced cellular levels of cAMP. In general, Chapter 8 of “Indirect Mechanism of Synaptic Transmission” (“Indirect Mechanism of Synchronic Transmission,” Chpt 8,From Neuron To Brain(3rd Ed.) Nichols, J. et al. G. FIG. et al eds, Sinauer Associates, Inc. (1992)). Thus, assays that detect cAMP can be used to determine whether a candidate compound is, for example, an inverse agonist for the receptor (ie, such a compound would reduce the level of cAMP). Various methods known in the art can be used to measure cAMP. The most preferred method is by using an anti-cAMP antibody in an ELISA-based format. Another assay type that can be used is the whole cell second messenger reporter-based assay. Promoters on genes drive the expression of proteins encoding particular genes. Cyclic AMP drives the binding of cAMP-reactive DNA binding protein or transcription factor (CREB) to drive gene expression, which in turn binds to the promoter at a specific site called the cAMP responsive element and regulates gene expression. Drive. A reporter system can be constructed that has a promoter that includes multiple cAMP response elements in front of a reporter gene, for example, β-galactosidase or luciferase. Thus, the construct-activated Gs-linked receptor then causes the accumulation of cAMP, which activates the gene, and the expression of the reporter protein. Reporter proteins, such as β-galactosidase or luciferase, can then be detected using standard biochemical assays (Chen et al. 1995).
b. Go and Gq
Go and Gq are associated with the activation of the enzyme phospholipase C, which in turn₂ Is hydrolyzed to produce two intracellular messengers, diacycloglycerol (DAG) and inositol 1,4,5-triphosphate (IP₃ ) Is released. IP₃ Increased accumulation is associated with activation of Gq and Go-related receptors. In general, Chapter 8 of “Indirect Mechanism of Synaptic Transmission” (“Indirect Mechanism of Synchronic Transmission,” Chpt 8,From Neuron To Brain(3rd Ed.) Nichols, J. et al. G. FIG. et al eds, Sinauer Associates, Inc. (1992)). IP₃ Assays that detect accumulation can be used to determine whether a candidate compound is an inverse agonist, for example, for a Gq or Go-related receptor (ie, if such a compound is IP₃ Lower the level of). Gq-related receptors can also be tested using an AP1 reporter assay in which Gq-dependent phospholipase C causes activation of genes including the AP1 factor. Thus, an activated Gq-related receptor reveals an increase in the expression of this gene, whereby its inverse agonist reveals a decrease in this expression, and an agonist reveals an increase in this expression. Commercially available assays are available for this assay.
3. GPCR fusion protein
The use of endogenous, constitutively active orphan GPCRs or non-endogenous, constitutively activated orphan GPCRs for use in screening candidate compounds for the direct identification of inverse agonists, agonists and partial agonists is by definition Provides an interesting screening problem where the receptor is active even when there is no endogenous ligand to bind. Thus, for example, to distinguish between a non-endogenous receptor in the presence of a candidate compound and a non-endogenous receptor in the absence of the compound, such a compound is an inverse agonist, agonist, partial agonist For the purpose of such a distinction, which allows an understanding as to whether it does or does not affect such a receptor, it is preferred to use a method which can enhance such a distinction. A preferred method is the use of a "GPCR fusion protein".
[0042]
Generally, once it is determined that a non-endogenous orphan GPCR has been constitutively activated using the assay techniques described above (and others), the predominant G protein coupled to the endogenous GPCR is determined. it can. Coupling of G proteins to GPCRs provides an evaluable signaling pathway. Such systems are expected to have endogenous G proteins therein, as it is most preferred that the screening be performed using a mammalian expression system. Thus, by definition, in such systems, non-endogenous, constitutively activated orphan GPCRs signal continuously. In this regard, it is preferred that this signal be enhanced, for example, in the presence of an inverse agonist at the receptor, and in particular within the scope of the screen, the possibility of more easily distinguishing between the receptor in contact with the inverse agonist It is further preferred that the signal is enhanced as there is.
[0043]
"GPCR fusion protein" is intended to enhance the potency of a G protein coupled to a non-endogenous GPCR. "GPCR fusion proteins" are preferred for screening with non-endogenous, constitutively activated GPCRs, since such methods increase the signals most preferably used in this screening technique. This is important in order to easily obtain a significant "signal to noise ratio". Such a significant ratio is advantageously introduced into the screening for candidate compounds disclosed herein.
[0044]
The construction of useful constructs for the expression of "GPCR fusion proteins" is within the purview of those of ordinary skill in the art. Commercially available expression vectors and systems provide a variety of methods that can meet the specific needs of researchers. An important criterion for such a "GPCR fusion protein" construct is that both the endogenous GPCR sequence and the G protein sequence are in frame (preferably, the sequence of the endogenous GPCR is upstream of the G protein sequence). And the "stop" codon of the GPCR must be deleted or replaced so that the G protein can also be expressed during expression of the GPCR. The GPCR may be linked directly to the G protein, or may have between two spacer residues (preferably no more than about 12; this number is within the skill of the ordinary artisan). Can be easily confirmed). We prefer the use of spacers (for convenience) where some unused restriction sites are spacers for efficient expression. Most preferably, G proteins that couple to non-endogenous GPCRs are identified prior to the creation of a “GPCR fusion protein” construct. Since only a few G proteins have been identified, constructs comprising sequences of G proteins (ie, universal G protein constructs) are available for insertion of endogenous GPCR sequences herein. This provides efficiency within large-scale screening of a variety of different endogenous GPCRs having different sequences.
[0045]
As described above, constitutively activated GPCRs that couple to Gi, Gz, and Go are expected to inhibit cAMP formation, making interesting assays based on these types of GPCRs of interest (ie, cAMP signal is Decreases upon activation, thus for example direct identification of the inverse agonist (this will further reduce this signal). As disclosed herein, in studies establishing cyclase-based assays that can be used for these types of receptors, "GPCR fusion proteins" that are not based on the endogenous G protein of endogenous GPCRs We have confirmed that it is possible to create Thus, for example, an endogenous Gi-coupled receptor can be fused to a Gs protein, and when such a fusion construct is expressed, the endogenous GPCR can be linked to, for example, Gs instead of the “native” Gi protein. We believe that we can “drive” or “force” to couple and establish a cyclase-based assay. Thus, for Gi, Gz and Go-coupled receptors, we find that when a “GPCR fusion protein” is used and the assay is based on the detection of adenylate cyclase activity, the fusion construct is Gs (or the enzyme adenyl). (Equivalent G protein that stimulates the formation of acid cyclase).
[0046]
A “G protein fusion” construct using a “Gq protein” fused to a “Gs, Gi, Gz or Go protein” is equally effective. The most preferred fusion construct can be achieved using a "Gq protein", wherein the first six amino acids of the G protein α-subunit (“Gαq”) are deleted and the last at the C-terminus of Gαq. Five amino acids are replaced with the corresponding amino acids of Gα of the G protein concerned. For example, a fusion construct can have Gq (6 amino acids deleted) fused to a “Gi protein”, resulting in a “Gq / Gi fusion construct”. We linked this endogenous Gi-coupled receptor to a non-endogenous G protein, Gq, so that a second messenger, such as inositol triphosphate or diacylglycerol, could be measured instead of cAMP production. Believe to force.
4. Co-transfection of target Gi-coupled GPCR using signal enhancer Gs-coupled GPCR (cAMP based assay)
Gi-coupled receptors are known to inhibit adenylate cyclase, and thus reduce the level of cAMP production, which can make cAMP level assessments interesting. An effective means of measuring a decrease in cAMP production as an indicator of constitutive activation of Gi-coupled receptors upon activation is a signal enhancer, such as Gs upon activation using a Gi-linked GPCR. This can be achieved by co-transfection of a predominantly coupled non-endogenous, constitutively activated receptor (eg, TSHR-A623I disclosed below). As is evident, constitutive activation of a Gs-coupled receptor can be determined based on increased cAMP production. Constitutive activation of Gi-coupled receptors leads to reduced cAMP production. Thus, the co-transfection method intends to take advantage of these "opposite" effects. For example, co-transfection of a non-endogenous, constitutively activated Gs-coupled receptor (“signal enhancer”) with an endogenous Gi-coupled receptor (“target receptor”) provides a reference cAMP signal (ie, , Gi-coupled receptors reduce cAMP levels, but this "reduction" is associated with a substantial increase in cAMP levels established by constitutively activated Gs-coupled receptor signal enhancers). In doing so, due to co-transfection of the signal enhancer and a constitutively activated form of the target receptor, cAMP is further reduced by the increased functional activity of the Gi target (ie, it reduces cAMP) (standard To).
[0047]
Screening for candidate compounds using a cAMP-based assay can then be accomplished under two conditions. The first condition has an "opposite" effect on the Gi-coupled target receptor, i.e., an inverse agonist of the Gi-coupled target receptor increases the measured cAMP signal, while an agonist of the Gi-coupled target receptor produces this signal. descend. The second condition is that, apparently, candidate compounds that are directly identified using this method should be independently evaluated to ensure that they do not target the signal-enhancing receptor. (This can be done before or after screening for the co-transfected receptor).
F. Drug chemistry
Generally, but not necessarily, direct identification of candidate compounds is preferably performed in connection with compounds generated via combinatorial chemistry techniques, whereby thousands of compounds are randomly assigned for this analysis. Be prepared. Generally, the result of such screening is a compound having a unique core structure. These compounds are then preferably subjected to additional chemical modifications around the preferred core structure to further enhance their pharmaceutical properties. Such techniques are known to those skilled in the art and will not be dealt with in detail herein.
G. FIG. Pharmaceutical composition
Candidate compounds selected for further development can be formulated into pharmaceutical compositions using techniques well known to those skilled in the art. Suitable pharmaceutically acceptable carriers are available to those skilled in the art. See, for example, "Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th. Edition, 1980, Mack Publishing Co., (Oslo et al., Eds.)".
H. Other utilities
The preferred use of the non-endogenous form of the human GPCRs disclosed herein is for the direct identification of candidate compounds as inverse agonists, agonists or partial agonists (preferably for use as pharmaceuticals), but for human GPCRs. These types can also be used in research settings. For example, in vivo and in vitro systems incorporating GPCRs have been adapted to further elucidate and understand the role played by these receptors in both normal and diseased human conditions, and to understand signaling cascades Can be used to understand the role of strategic activation. The value of non-endogenous human GPCRs is that due to their unique characteristics, non-endogenous human GPCRs can be used to understand the role of these receptors in the human body before endogenous ligands are identified. Their usefulness as research tools is to increase. Other uses of the disclosed receptors will be apparent to those of skill in the art upon reviewing this specification, among others.
[0048]
【Example】
The following examples are presented for the purpose of illustrating the invention and are not intended to be limiting. Although specific nucleic acid and amino acid sequences are disclosed herein, those of ordinary skill in the art will be able to obtain the same or substantially similar results as reported below with minor modifications to these sequences. Have the ability to gain. Conventional methods of applying or understanding sequence cassettes from one sequence to another (eg, from rat receptor to human receptor, or from human receptor A to human receptor B) generally involve sequence alignment techniques. The sequences are aligned in a study to determine common regions. The mutation methods disclosed herein do not rely on this method, but instead are based on algorithmic methods and positional distances from conserved proline residues located within the TM6 region of human GPCRs. Once this method is established, one skilled in the art will have the ability to make minor changes to it to achieve essentially the same result (ie, constitutive activation) as disclosed herein. I can believe it. Such alterations are considered to be within the scope of the present disclosure.
[0049]
Example 1
Endogenous human GPCR
1. Identification of human GPCR
Disclosed endogenous human GPCRs are available from GeneBank.^TMIdentified based on a survey of database information. While searching the database, the following cDNA clones were identified as apparent below (Table C):
[0050]
[Table 2]

[0051]
2. Full length cloning
a. hRUP8 (SEQ ID NOS: 1 and 2)
The disclosed human RUP8 was identified based on the use of EST database (dbEST) information. While investigating dbEST, a cDNA clone with accession number AL121755 was identified as encoding a novel GPCR. The following PCR primers were used as templates for RT-PCR using human testis marathon-ready cDNA (Clontech).
5'-CTTGCAGACATCACCCATGCAGCC-3 '(SEQ ID NO: 41, sense) and
5'-GTGATGTCTCTGAGTACTGACTGG-3 '(SEQ ID NO: 42, antisense)
PCR was performed using the Advantage cDNA polymerase (Clontech, according to manufacturing guidelines) in a 50 ul reaction with the following cycle: 94 ° C for 30 seconds, 94 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 20 seconds, 65 ° C for 1.5 minutes. 72 ° C, and 72 ° C for 7 minutes. Cycles 2 to 4 were repeated 35 times.
[0052]
The 1.2 kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced using the ABI Big Dye Terminator kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 1, the deduced amino acid sequence of RUP8 is set forth in SEQ ID NO: 2.
b. hRUP9 (SEQ ID NOs: 3 and 4)
The disclosed human RUP9 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC011375 was identified as the human genomic sequence from chromosome 5. Primer with full length RUP9
5'-GAAGCTGTGAAGAGTGATGC-3 '(SEQ ID NO: 43, sense),
5'-GTCAGCAATAATTGATAAGCAGCAG-3 '(SEQ ID NO: 44, antisense)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Taq Plus Precision polymerase (Stratagene) was used in a 100 μl reaction with 5% DMSO for amplification by 35 replicates of steps 2 to 4 in the following cycle: 1 minute at 94 ° C. 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 5 minutes.
[0053]
The 1.3 Kb PCR fragment was isolated and cloned from a 1% agarose gel into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 3, the deduced amino acid sequence of RUP8 is set forth in SEQ ID NO: 4. The sequence of the RUP9 clone isolated from human genomic DNA was consistent with the sequence obtained from the database.
c. hRUP10 (SEQ ID NOS: 5 and 6)
The disclosed human RUP10 was identified based on the use of Genebank database information. During the search, a cDNA clone with accession number AC008754 was identified as a human genomic sequence from chromosome 19. Primer with full length RUP10
5'-CCATGGGGGAACGATTCTGTCAGCTACCG-3 '(SEQ ID NO: 45, sense) and
5'-GCTATGCCTGAAGCCAGTCTGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 46, antisense)
And cloned by RT-PCR using human leukocyte marathon ready cDNA (Clontech) as a template. Advantage cDNA polymerase (Clontech) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2 to 4 in the following cycle in a 50 μl reaction: 94 ° C. for 30 seconds, 94 ° C. for 10 seconds, 62 ° C. for 20 seconds, 1 ° C. .5 minutes 72 ° C, and 7 minutes 72 ° C. The 1.0 Kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). The nucleic acid sequence of the new human receptor RUP10 is set forth in SEQ ID NO: 5, and its deduced amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 6.
d. hRUP11 (SEQ ID NOs: 7 and 8)
The disclosed human RUP11 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC013396 was identified as a human genomic sequence from chromosome 2. Primer with full length RUP11
5'-CCAGGATGGTGTGTTCACCGTGGTGGGC-3 '(SEQ ID NO: 47, sense);
5'-CACACGCGCTGCAGCCCTGCAGCTGGC-3 '(SEQ ID NO: 48, antisense)
And cloned by PCR using human genomic DNA (Clontech) as a template. Tack Plus Precision DNA Polymerase (Stratagene) was used in a 50 μl reaction for amplification by 35 repetitions of steps 2 to 4 in the following cycle: 3 min 94 ° C., 20 sec 94 ° C., 20 sec 67 ° C., 72 ° C. for 1.5 minutes, and 72 ° C. for 7 minutes. The 1.3 Kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). The nucleic acid sequence of the new human receptor RUP11 is set forth in SEQ ID NO: 7, and its deduced amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 8.
e. hRUP12 (SEQ ID NOs: 9 and 10)
The disclosed human RUP12 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AP000808 was identified as encoding a novel GPCR with significant homology to rat RTA and the human mas1 oncogene GPCR. Primer for full length RUP12
5'-CTTCCTCTCGTAGGGATGAACCAGAC-3 '(SEQ ID NO: 49, sense)
5'-CTCGCACAGGGTGGGAAGCACCTGTGGG-3 '(SEQ ID NO: 50, antisense)
And cloned by PCR using human genomic DNA (Clontech) as a template. Tack Plus Precision DNA Polymerase (Stratagene) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2 to 4 in the following cycle: 3 minutes at 94 ° C, 20 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 65 ° C, 2 minutes at 72 ° C, And 7 minutes at 72 ° C. The 1.0 kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and completely sequenced using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem) (for the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9) For the deduced amino acid sequence, see SEQ ID NO: 10).
f. hRUP13 (SEQ ID NOS: 11 and 12)
The disclosed human RUP13 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC011780 was identified as encoding a novel GPCR with significant homology to the GPCR fish GRPX-OLYLA. Primer with full length RUP13
5'-GCCTGTGACAGGAGGTACCCTGG-3 '(SEQ ID NO: 51, sense)
5'-CATATCCCTCCGAGTGTCCAGCGGC-3 '(SEQ ID NO: 52, antisense)
And cloned by PCR using human genomic DNA (Clontech) as a template. Tack Plus Precision DNA Polymerase (Stratagene) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2 to 4 in the following cycle: 3 minutes at 94 ° C, 20 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 65 ° C, 2 minutes at 72 ° C, And 7 minutes at 72 ° C. The 1.35 kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and fully sequenced using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem) (SEQ ID NO: 11 for nucleic acid sequences). And for the deduced amino acid sequence, see SEQ ID NO: 12).
g. hRUP14 (SEQ ID NOs: 13 and 14)
The disclosed human RUP14 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AL137188 was identified as the human genomic sequence from chromosome 13. Primer for full length RUP14
5'-GCATGGAGAGAAAAATTTATGTCCTTGCAACC-3 '(SEQ ID NO: 53, sense)
5'-CAAGAACAGGTCTCATCTAAGAGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 54, antisense)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Tack Plus Precision Polymerase (Stratagene) and 5% DMSO were used for amplification by 35 repetitions of steps 2 and 3 in the following cycle: 3 min 94 ° C, 20 sec 94 ° C, 2 min 58 ° C, 10 min 72 ° C.
[0054]
The 1.1 Kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and completely sequenced using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem) (for the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13) For the deduced amino acid sequence, see SEQ ID NO: 14). The sequence of the RUP14 clone isolated from human genomic DNA was consistent with the sequence obtained from the database.
h. hRUP15 (SEQ ID NOS: 15 and 16)
The disclosed human RUP15 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC016468 was identified as a human genomic sequence. Primer with full length RUP15
5'-GCTGTTGCCATGACGTCCCACTGCAC-3 '(SEQ ID NO: 55, sense)
5'-GGACAGTTCAAGGTTTGCCTTAGAAC-3 '(SEQ ID NO: 56, antisense)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Tack Plus Precision Polymerase (Stratagene) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2-4 in the following cycle: 3 min 94 ° C, 20 sec 94 ° C, 20 sec 65 ° C, 2 min 72 ° C and 7 min. 72 ° C.
[0055]
The 1.5 Kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 15 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 16 for deduced amino acid sequences. The sequence of the RUP15 clone isolated from human genomic DNA was consistent with the sequence obtained from the database. i. hRUP16 (SEQ ID NOS: 17 and 18)
The disclosed human RUP16 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AL136106 was identified as a human genomic sequence from chromosome 13. Primer with full length RUP16
5'-CTTTCGATACTGCTCCTATAGCTC-3 '(SEQ ID NO: 57, sense, 5' of start codon)
5'-GTAGTCCACTGAAAGTCCAGTGATCC-3 '(SEQ ID NO: 58, antisense, 3' of stop codon)
And human skeletal muscle marathon ready cDNA (Clontech) as a template for cloning by PCR. Advantage cDNA polymerase (Clontech) was used for amplification by 35 iterations of steps 2 to 4 in the following cycle in a 50 ul reaction: 94 ° C for 30 seconds, 94 ° C for 5 seconds, 69 ° C for 15 seconds, 69 ° C for 1 minute. 72 ° C and 5 minutes at 72 ° C.
[0056]
The 1.1 Kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the T7 sequencenase kit (Amersham). See SEQ ID NO: 17 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 18 for deduced amino acid sequences. The sequence of the RUP16 clone was consistent with four random fragments of AL136106, indicating that the RUP16 cDNA consists of four exons.
j. hRUP17 (SEQ ID NOs: 19 and 20)
The disclosed human RUP17 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC023078 was identified as a human genomic sequence from chromosome 11. Primer with full length RUP17
5'-TTTCTGGAGCATGGATCCAACCCATCTC-3 '(SEQ ID NO: 59, including sense and start codon)
5'-CTGTCTGACAGGGCAGAGGCTCTC-3 '(SEQ ID NO: 60, antisense, 3' of stop codon)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Advantage cDNA polymerase mix (Clontech) was used for amplification by 30 repetitions of steps 2 to 4 in a 100 ul reaction containing 5% DMSO with the following cycle: 1 minute at 94 ° C, 15 seconds at 94 ° C, 20 minutes. 67 ° C for 1 second, 72 ° C for 1 minute 30 seconds and 72 ° C for 5 minutes.
[0057]
The 970 bp PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 19 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 20 for deduced amino acid sequences.
k. hRUP18 (SEQ ID NOs: 21 and 22)
The disclosed human RUP18 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC008547 was identified as a human genomic sequence from chromosome 5. Primer with full length RUP18
5'-GGAACTCGTATAGACCCAGCGTCGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 61, sense, 5' of start codon),
5'-GGAGGTTGCGCCTTAGCGACAGATGACC-3 '(SEQ ID NO: 62, antisense, 3' of stop codon)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Tack Plus Precision DNA Polymerase (Stratagene) was used for amplification by 35 iterations of steps 2-4 in a 100 ul reaction containing 5% DMSO with the following cycle: 95 ° C for 5 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 30 ° C for 30 seconds. 65 ° C for 2 seconds, 72 ° C for 2 minutes and 72 ° C for 5 minutes.
[0058]
The 1.3 kb PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 21 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 22 for deduced amino acid sequences.
l. hRUP19 (SEQ ID NOS: 23 and 24)
The disclosed human RUP19 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC026331 was identified as the human genomic sequence from chromosome 12. Primer for full length RUP19
5'-CTGCACCCGGACACTTGCTCTG-3 '(SEQ ID NO: 63, sense, 5' of start codon)
5'-GTCTGCTTGTGTTCAGTGCCCACTCAAC-3 '(SEQ ID NO: 64, including antisense and stop codon)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Tack Plus Precision DNA Polymerase (Stratagene) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2 to 4 using 5% DMSO in the following cycle: 1 minute at 94 ° C, 15 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 70 ° C, Min 30 sec 72 ° C and 5 min 72 ° C.
[0059]
The 1.1 kb PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 23 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 24 for deduced amino acid sequences.
m. hRUP20 (SEQ ID NOS: 25 and 26)
The disclosed human RUP20 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AL161458 was identified as the human genomic sequence from chromosome 1. Primer with full length RUP20
5'-TATCTGCAATTCTATTCTAGCTCCTG-3 '(SEQ ID NO: 65, sense, 5' of start codon),
5'-TGTCCCTAATAAAGTCACATGAATGC-3 '(SEQ ID NO: 66, antisense, 3' of stop codon)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. The Advantage cDNA polymerase mix (Clontech) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2 to 4 using 5% DMSO in the following cycle: 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 1 second. Min 30 sec 72 ° C and 5 min 72 ° C.
[0060]
A 1.0 kb PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 25 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 26 for deduced amino acid sequences.
n. hRUP21 (SEQ ID NOs: 27 and 28)
The disclosed human RUP21 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC026756 was identified as a human genomic sequence from chromosome 13. Primer with full length RUP21
5'-GGAGACAACCATGAATGAGCCAC-3 '(SEQ ID NO: 67, sense)
5'-TATTTCAAGGGTTGTTTGAGGTAAC-3 '(SEQ ID NO: 68, antisense)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Tack Plus Precision Polymerase (Stratagene) was used for amplification by 30 repetitions of steps 2 to 4 in the following cycle in a 100 ul reaction containing 5% DMSO: 1 min 94 ° C, 15 sec 94 ° C, 20 sec 55 ° C, 1 minute 30 seconds 72 ° C and 5 minutes 72 ° C.
[0061]
A 1,014 bp PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 27 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 28 for deduced amino acid sequences.
o. hRUP22 (SEQ ID NOs: 29 and 30)
The disclosed human RUP22 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC027026 was identified as a human genomic sequence from chromosome 11. Primer for full length RUP22
5'-GGCACCAGTGGAGGTTTTCTGAGCATG-3 '(SEQ ID NO: 69, including sense and start codon)
5'-CTGATGGAAGTAGAGGCTGTCCATCTC-3 '(SEQ ID NO: 70, antisense, 3' of stop codon)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. Tack Plus Precision DNA Polymerase (Stratagene) was used for amplification by 30 repetitions of steps 2-4 in a 100 ul reaction containing 5% DMSO with the following cycle: 94 ° C, 1 minute 94 ° C, 15 seconds 55 ° C, 20 seconds 72 ° C, 1.5 minutes 72 ° C, 5 minutes.
[0062]
The 970 bp PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 29 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 30 for deduced amino acid sequences.
p. hRUP23 (SEQ ID NOS: 31 and 32)
The disclosed human RUP23 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC007104 was identified as the human genomic sequence from chromosome 4. Primer with full length RUP23
5'-CCAGGCGAGCCGCTAGCGCCATG-3 '(SEQ ID NO: 71, sense, ATC as start codon)
5'-ATGAGCCCTGCCAGGCCCTCAGT-3 '(SEQ ID NO: 72, antisense, TCA as stop codon)
And human placenta marathon ready DNA (Clontech) as a template. Advantage cDNA polymerase (Clontech) was used for amplification by 35 iterations of steps 2 to 4 in the following cycle in a 50 ul reaction: 95 ° C for 30 seconds, 95 ° C for 15 seconds, 66 ° C for 20 seconds, 1 minute. 72 ° C. for 20 seconds and 72 ° C. for 5 minutes.
[0063]
A 1.0 kb PCR fragment was isolated and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 31 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 32 for deduced amino acid sequences.
q. hRUP24 (SEQ ID NOs: 33 and 34)
The disclosed human RUP25 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC026331 was identified as the human genomic sequence from chromosome 12. Primer with full length RUP25
5'-GCTGGAGCATTCACTAGGCGAG-3 '(SEQ ID NO: 73, sense, 5' of start codon)
5'-AGATCCTGGTTCTTGGGTGACAATG-3 '(SEQ ID NO: 74, antisense, 3' of stop codon)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. The Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech) was used for amplification by 35 repeats of steps 2-4 using 5% DMSO in the following cycle: 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 15 seconds, 56 ° C for 20 seconds, 56 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds and 72 ° C for 5 minutes.
[0064]
The 1.2 kb PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 33 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 34 for deduced amino acid sequences.
r. hRUP25 (SEQ ID NOs: 35 and 36)
The disclosed human RUP25 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC026331 was identified as the human genomic sequence from chromosome 12. Primer with full length RUP25
5'-GCTGGAGCATTCACTAGGCGAG-3 '(SEQ ID NO: 75, sense, 5' of start codon)
5'-AGATCCTGGTTCTTGGTGACAATG-3 '(SEQ ID NO: 76, antisense, 3' of stop codon)
And human genomic DNA (Promega) as a template for cloning by PCR. The Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech) was used for amplification by 35 repeats of steps 2-4 using 5% DMSO in the following cycle: 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 15 seconds, 56 ° C for 20 seconds, 56 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds and 72 ° C for 5 minutes.
[0065]
The 1.2 kb PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 35 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 36 for deduced amino acid sequences.
s. hRUP26 (SEQ ID NOs: 37 and 38)
The disclosed human RUP26 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC023040 was identified as the human genomic sequence from chromosome 2. Use full length RUP26 as a RUP26 specific primer
5'-AGCCATCCCTGCCAGGAAGCATGG-3 '(SEQ ID NO: 77, including sense and start codon)
5'-CCAGACTGTGGACTCAAGAACTCTAGG-3 '(SEQ ID NO: 78, including antisense, stop codon)
And human placenta marathon ready cDNA (Clontech) as a template by RT-PCR. The Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2-4 in a 100 ul reaction containing 5% DMSO with the following cycle: 94 ° C for 5 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 30 ° C for 30 seconds. 65 ° C for 2 seconds, 72 ° C for 2 minutes and 72 ° C for 5 minutes.
[0066]
The 1.1 kb PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 37 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 38 for deduced amino acid sequences.
t. hRUP27 (SEQ ID NOs: 39 and 40)
The disclosed human RUP27 was identified based on the use of Genebank database information. During the investigation, a cDNA clone with accession number AC027643 was identified as a human genomic sequence from chromosome 12. Use full length RUP27 as a RUP17 specific primer
5'-AGTCCACGAACAATGAATCCATTTTCATG-3 '(SEQ ID NO: 79, including sense and start codon)
5'-ATCATGTCTTAGACTCATGGTGATCC-3 '(SEQ ID NO: 80, antisense, 3' of stop codon)
And human adult brain marathon ready cDNA (Clontech) as a template. The Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech) was used for amplification by 35 repetitions of steps 2-4 in a 50 ul reaction containing 5% DMSO with the following cycle: 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 10 seconds, 20 minutes 58 ° C for 1 second, 72 ° C for 1 minute 30 seconds and 72 ° C for 5 minutes.
[0067]
The 1.1 kb PCR fragment was isolated from a 1% agarose gel and cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced completely using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystem). See SEQ ID NO: 35 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 36 for deduced amino acid sequences. The sequence of the RUP27 cDNA clone isolated from human brain was determined to be consistent with the five irregular fragments of AC027643, indicating that the RUP27 cDNA consists of five exons.
[0068]
Example 2
Preparation of non-endogenous, constitutively activated GPCR
Those skilled in the art are believed to have the ability to select techniques for mutation of a nucleic acid sequence. The following are methods used to create non-endogenous forms of some of the human GPCRs disclosed above. The mutations disclosed below are based on the conserved proline (or its endogenous conservative substituent) residue at the 16th amino acid (located within the TM6 region of the GPCR near the TM6 / IC3 interface) (the GPCR (Located within the IC3 region) is based on an algorithm which is preferably mutated to alanine, histidine, arginine or lysine amino acid residues, most preferably to lysine amino acid residues.
1. Transformer Site Directed^TMMutagenesis
The preparation of non-endogenous human GPCRs was performed according to the manufacturer's guidelines, using Transformer Site-Directed.^TMIt may be performed on human GPCRs using a mutagenesis kit (Clontech). Two mutagenic primers are used, most preferably a lysine mutagenesis oligonucleotide that creates a lysine mutation, and a selectable marker oligonucleotide. For convenience, the codon variation to be incorporated into the human GPCR is also recorded in standard form (Table D).
[0069]
[Table 3]

[0070]
2. Quick Change^TMSite directed^TMMutagenesis
The preparation of non-endogenous human GPCR was performed using QuikChange.^TMSite-Directed^TMMutagenesis kits (Stratagene, according to manufacturer's guidelines) can also be used. An endogenous GPCR is used as a preferred template, and two mutagenic primers are used, and most preferably a lysine mutagenesis oligonucleotide and a selectable marker oligonucleotide (included in the kit). For convenience, the codon mutations and each oligonucleotide incorporated into the new human GPCR are recorded in standard form (Table E).
[0071]
[Table 4]

[0072]
The non-endogenous human GPCR was then sequenced and the derived and confirmed nucleic acid and amino acid sequences are listed in the "Sequence Listing" attached to this patent specification, which is summarized in Table F below.
[0073]
[Table 5]

[0074]
Example 3
Receptor expression
A variety of cells are available in the art for expression of the protein, but the use of mammalian cells is most preferred. The primary reason for this is dictated by practicality, i.e., the use of yeast cells, for example, for the expression of GPCRs, has made possible, as far as possible, the developed receptor coupling, genetic mechanisms and secretory pathways for mammalian systems. Non-mammalian cells that are free (and certainly not in the case of yeast) are introduced into the protocol, and the results obtained with the non-mammalian cells are as good as possible when obtained from mammalian cells. Is not preferred. COS-7, 293 and 293T cells are particularly preferred among the mammalian cells, although the particular mammalian cell used can be determined by the specific needs of the skilled practitioner.
a. Transient transfection
On the first day, 6x10⁶ / (293 cm cell well 10 cm dish) was plated out. On the second day, two reaction tubes were prepared (the ratios below for each tube are per plate). Tube A was prepared by mixing 4 μg DNA (eg, pCMV vector, pCMV vector containing receptor cDNA, etc.) in 0.5 ml serum-free DMEM (Gibco BRL). Tube B was prepared by mixing 24 μl Lipofectamine (Gibco BRL) in 0.5 ml serum-free DMEM. Tubes A and B were mixed by inversion (several times) and then incubated at room temperature for 30-45 minutes. This mixture is called "transfection mixture". The plated 293 cells were washed with 1 × PBS, and then 0.5 ml of serum-free DMEM was added. 1 ml of the transfection mixture is added to the cells, then 37 ° C./5% CO 2₂ For 4 hours. The transfection mixture was aspirated off and then 10 ml of DMEM / 10% fetal calf serum was added. Cells at 37 ° C / 5% CO₂ And incubated. After a 48 hour incubation, cells were harvested and used for analysis.
b. Stable cell line: Gs fusion protein
About 12x10⁶ 293 cells were plated on 15 cm tissue culture plates. Cultured in DME High Glucose Medium containing 10% fetal calf serum and 1% sodium pyruvate, L-glutamine, and antibiotics. Twenty-four hours after plating, 293 cells were approximately 80% confluent and cells were transfected with 12 μg of DNA. 12 μg of DNA was mixed with 60 ul of lipofectamine and 2 mL of DME high glucose medium without serum. The medium was aspirated from the plate and the cells were washed once with serum free medium. The DNA, lipofectamine, and vehicle mixture was added to the plate along with 10 mL of serum-free medium. After 4-5 hours incubation at 37 ° C., the medium was aspirated and 25 ml of medium containing serum was added. The medium was aspirated again 24 hours after transfection and fresh medium containing serum was added. Forty-eight hours after transfection, the medium was aspirated and medium containing serum and geneticin (G418 drug) was added to a final concentration of 500 μg / mL. Transfected cells are now selected for positively transfected cells containing the G418 resistance gene. The medium was changed every 4-5 days each time a selection occurred. During selection, cells are expanded to create a stable pool, or split for stable clone selection.
[0075]
Example 4 Assay for Determination of Constitutive Activity of Non-Endogenous GPCR
Various methods are available for assessing the constitutive activity of non-endogenous human GPCRs. The following is an example. It is believed that one of ordinary skill in the art will have the ability to determine such techniques to serve priority to the needs of the skilled artisan.
1. Membrane binding assay: [³⁵S] GTPγS assay
When a G protein-coupled receptor is in its active state, as a result of either ligand binding or constitutive activation, the receptor binds to the G protein and releases GDP and subsequently GTP to the G protein. Stimulates binding. The α subunit of the G protein-coupled receptor complex acts as a GTPase and slowly hydrolyzes GTP to GDP, at which point the receptor is usually deactivated. Constitutively activated receptors continue to exchange GTP for GDP. A non-hydrolysable GTP analog [³⁵[S] GTPγS binds [M] to membranes that express constitutively activated receptors.³⁵S] GTPγS can be used to demonstrate enhanced binding. To measure constitutive activation [³⁵The advantage of using S] GTPγS binding is that (a) it applies globally to all G protein-coupled receptors, and (b) it addresses molecules that affect the intracellular cascade near the membrane surface. It is difficult.
[0076]
This assay binds to a membrane that expresses the receptor of interest [³⁵[S] Utilizes the ability of G protein-coupled receptors to stimulate GTPγS. Thus, this assay can be used in a direct identification method to screen candidate compounds for known orphan and constitutively activated G protein-coupled receptors. The assay is comprehensive and applies to drug discovery at all G protein-coupled receptors.
[0077]
[³⁵S] GTPγS assay comprises 20 mM HEPES and 1 to about 20 mM MgCl₂ (This amount is preferably 20 mM, but can be adjusted for optimal results) pH 7.4, about 0.3 to about 1.2 nM [³⁵S] GTPγS (this amount is preferably 1.2, but can be adjusted for optimal results) and 12.5-75 μg membrane protein (eg 293 cells expressing a Gs fusion protein, The amount was incubated for 1 hour in 10 μM GDP (this amount can be adjusted for optimization) and 10 μM GDP (this amount can be adjusted for optimization). Then wheat germ agglutinin beads (25 μl, Amersham) were added and the mixture was incubated for an additional 30 minutes at room temperature. The tubes were then centrifuged at 1500 xg for 5 minutes at room temperature and counted in a scintillation counter.
2. Adenylate cyclase
Flash Plate designed for cell-based assays^TMThe adenylate cyclase kit (New England Nuclear; catalog number SMP004A) can be modified for use with crude plasma membranes. Flash plate wells can include a scintillant coating that also includes certain antibodies that recognize cAMP. CAMP produced in the wells can be quantified by direct competition for binding of the radioactive cAMP tracer to the cAMP antibody. The following description serves as a simple protocol for measuring changes in cAMP levels in whole cells expressing the receptor.
[0078]
Transfected cells were harvested approximately 24 hours after transient transfection. The media was carefully suctioned out and discarded. 10 ml of PBS was gently added to each dish of cells and then carefully aspirated. 1 ml of Sigma cell separation buffer and 3 ml of PBS were added to each plate. The cells were pipetted off the dish and the cell suspension was collected in a 50 ml conical centrifuge tube. The cells were then centrifuged at room temperature at 1,100 rpm for 5 minutes. The cell pellet was carefully resuspended in an appropriate volume of PBS (about 3 ml / plate). Cells were then counted using a hemocytometer and additional PBS was added to give an approximate number of cells (final volume about 50 μl / well).
[0079]
cAMP standard and "Detection buffer" (tracer [11 mL of "Detection buffer")¹²⁵ IcAMP (comprising 1 μCi of 50 μl) was prepared and maintained according to the manufacturer's instructions. An "assay buffer" was prepared fresh for screening and contains 50 [mu] l of "stimulation buffer", 3 ul of test compound (12 uM final assay concentration) and 50 [mu] l of cells; "assay buffer" is on ice until use. Was stored. The assay started with the addition of 50 μl of cAMP standard to the appropriate wells and then 50 ul of PBSA to wells H-11 and H-12. 50 μl of “stimulation buffer” was added to all wells. DMSO (or selected candidate compounds) was added to the appropriate wells using a pin device capable of supplying 3 μl of the compound solution to a final assay concentration of 12 μM test compound and a total assay volume of 100 μl. The cells were then added to the wells and incubated for 60 minutes at room temperature. Then 100 μl of the “detection mixture” containing the tracer cAMP was added to the wells. The plates were then incubated for a further 2 hours and then counted in a Wallac MicroBeta scintillation counter. The cAMP / well values were then extrapolated from the standard cAMP curves contained within each assay plate.
3. Cell-based cAMP for Gi coupled target GPCR
TSHR is a Gs-coupled GPCR that causes the accumulation of cAMP upon activation. TSHR is constitutively activated by mutating amino acid residue 623 (ie, changing an alanine residue to an isoleucine residue). Gi-coupled receptors are expected to inhibit adenylate cyclase, and thus reduce the level of cAMP production, which allows the assessment of cAMP level problems. An effective technique to measure reduced cAMP production as an indicator of constitutive activation of Gi-coupled receptors is as a "signal enhancer" using a Gi-linked target GPCR to establish a reference level of cAMP. Most preferably, it can be achieved by co-transfection of non-endogenous, constitutively activated TSHR (TSHR-A6231) (or endogenous, constitutively active Gs-coupled receptor). Once a non-endogenous form of the Gi-coupled receptor has been created, this non-endogenous form of the target GPCR is then co-transfected with a signal enhancer and it is this substance that can be used for screening. We used this method to efficiently generate a signal when using the cAMP assay. This method is preferably used for the direct identification of candidate compounds for Gi coupled receptors. Using this method, for a Gi-coupled receptor, an inverse agonist of the target GPCR will increase the cAMP signal and an agonist will decrease the cAMP signal.
[0080]
On the first day, 2X10⁴ Plate out 293 and 293 cells / well. On the second day, prepare two reaction tubes (the following ratios for each tube are per plate). Tube A contains a total of 4 μg DNA (eg, pCMV vector, mutated THSR) of 2 μg DNA of each receptor transfected into mammalian cells in 1.21 serum free DMEM (Irvine Scientific, Irvine, CA). (PCMV vector containing (THSR-A6231I), THSR-A6231I, GPCR, etc.). Tube B is prepared by mixing 120 μl Lipofectamine (Gibco BRL) in 1.2 ml serum-free DMEM. Tubes A and B were then inverted (several times) to mix well and then incubated at room temperature for 30-45 minutes. The mixture is called "transfection mixture". Wash the plated 293 cells with 1 × PBS, then add 10 ml of serum-free DMEM. Then 2.4 ml of the transfection mixture was added to the cells and then for 4 hours at 37 ° C./5% CO 2.₂ Incubate with. The transfection mixture is then aspirated off and 25 ml of DMEM / 10% fetal calf serum are added. The cells are then incubated at 37 ° C / 5% CO₂ Incubate with. After a 24 hour incubation, the cells are harvested and used for analysis.
[0081]
However, flash plates designed for cell-based assays^TMThe adenylate cyclase kit (New England Nuclear; catalog number SMP004A) can be modified for use with crude plasma membranes according to the needs of the skilled practitioner. Flash plate wells can include a scintillant coating that also includes certain antibodies that recognize cAMP. CAMP produced in the wells can be quantified by direct competition for binding of the radioactive cAMP tracer to the cAMP antibody. The description below serves as a simple protocol for measuring changes in cAMP levels in whole cells expressing the receptor.
[0082]
Transfected cells are harvested approximately 24 hours after transient transfection. Carefully aspirate the media and remove and discard. Gently add 10 ml of PBS to each dish of cells and then carefully aspirate. Add 1 ml Sigma cell separation buffer and 3 ml PBS to each plate. The cells are pipetted off the dish and the cell suspension is collected in a 50 ml conical centrifuge tube. The cells are then centrifuged at room temperature at 1,100 rpm for 5 minutes. Carefully resuspend the cell pellet in the appropriate volume of PBS (about 3 ml / plate). The cells are then counted using a hemocytometer and additional PBS is added to give an approximate number of cells (final volume about 50 μl / well).
[0083]
cAMP standard and "Detection buffer" (tracer [11 mL of "Detection buffer")¹²⁵ Prepare IcAMP (comprising 1 μCi of 50 μl) and maintain according to manufacturer's instructions. The "assay buffer" must be prepared fresh for screening and contains 50 [mu] l of "stimulation buffer", 3 ul of test compound (12 uM final assay concentration) and 50 [mu] l of cells; Keep on ice until ready. The assay can start with the addition of 50 μl of cAMP standard to the appropriate wells, then add 50 ul of PBSA to wells H-11 and H-12. Add 50 μl of stimulation buffer to the wells. The selected compound (eg, TSH) is added to the appropriate wells using a pin device capable of supplying 3 μl of the compound solution to a final assay concentration of 12 μM test compound and a total assay volume of 100 μl. The cells are then added to the wells and incubated for 60 minutes at room temperature. Then 100 μl of the “detection mixture” containing the tracer cAMP is added to the wells. The plates are then incubated for a further 2 hours and then counted in a Wallac microbeta scintillation counter. The cAMP / well values are then extrapolated from the standard cAMP curves contained within each assay plate.
4. Reporter-based assays
a. Gre-Luc reporter assay (Gs-related receptor)
293 and 293t cells at 2 x 10 per well⁴ Cells were plated out on a 96-well plate at the density of the cells and transfected the following day with Lipofectamine reagent (BRL) according to the manufacturer's instructions. A DNA / lipid mixture was prepared for each 6-well transfection as follows: 260 ng of plasmid DNA in 100 μl of DMEM was gently mixed with 2 μl of lipid in 100 μl of DMEM (200 ng of 8 × CRE-Luc reporter plasmid, endogenous receptor or non-endogenous receptor). Plasmid DNA consisting of 50 ng of pCMV or pCMV alone comprising the sex receptor and 10 ng of the GPRS expression plasmid (GPRS (Invitrogen) in pcDNA3) (260 ng of plasmid DNA). The 8XCRE-Luc reporter plasmid was prepared as follows: The vector SRIF-β-gal was constructed using the rat somatostatin promoter (-71 / + 51) at the BglV-HindIII site in pβgal-Basic Vector (Clontech). ) Was obtained by cloning. Eight copies of the cAMP response factor were obtained by PCR from the adenovirus template AdpCF126CCRE8 (see 7 Human Gene Therapy 1883 (1996)) and cloned into the SRIF-β-gal vector at the Kpn-BglV site to give 8 × CRE-β. A -gal reporter vector was obtained. The 8xCRE-Luc reporter plasmid was generated by replacing the beta-galactosidase gene in the 8xCRE-β-gal reporter vector with the luciferase gene from the pGL3-basic vector (Promega) at the HindIII-BamHI site. After incubation for 30 minutes at room temperature, the DNA / lipid mixture was diluted with 400 μl of DMEM and 100 μl of the diluted mixture was added to each well. 100 μl of DMEM containing 10% FCS was added to each well after 4 hours of incubation in a cell culture incubator. The following day, transfected cells were replaced with 200 μl / well of DMEM containing 10% FCS. Eight days later, the wells were replaced with 100 μl / well of DMEM without phenol red after one wash with PBS. Luciferase activity was determined by LucLite.^TMUse the Reporter Gene Assay Kit (Packard) according to the manufacturer's instructions and 1450 MicroBeta (MicroBeta)^TMReadings were taken using a scintillation and fluorescence counter (Wallac) and measured the next day.
b. AP1 reporter assay (Gq-related receptor)
Methods for detecting Gq stimulation rely on the known properties of Gq-dependent phospholipase C to cause activation of genes containing the AP1 element in these promoters. Path detect (Pathdetect)^TM The AP-1 cis-reporting system (Stratagene, catalog number # 219073) can be used according to the protocol described above for the CREB reporter assay, but the components of the calcium phosphate precipitate are 410 ng pAP1-Luc, 80 ng pCMV-receptor expression plasmid , And 20 ng CMV-SEAP.
c. Srf-Luc reporter assay (Gq-related receptor)
One method for detecting Gq stimulation relies on the known properties of Gq-dependent phospholipase C, which causes activation of a gene containing a serum response factor in its promoter. Path detect^TMThe SRF-Luc-reporting system (Stratagene) can be used, for example, for assaying Gq-coupled activity in COS7 cells. Cells are transfected with the plasmid components of the system and mammalian transfection (Mannmarian Transfection)^TMThe expression plasmid encoding endogenous or non-endogenous GPCR is shown using the kit (Stratagene, catalog number # 200285) according to the manufacturer's instructions. In summary, 410 ng SRF-Luc, 80 ng pCMV-receptor expression plasmid, and 20 ng CMV-SEAP (secreted alkaline phosphatase expression plasmid. Alkaline phosphatase activity was transfected to control for variations in transfection effect between samples. (Measured in the medium of the cells that have been removed) are incorporated into the calcium phosphate precipitate according to the manufacturer's instructions. Half of the sediment is evenly distributed on 3 wells in a 96-well plate and kept on cells in medium without serum for 24 hours. In the last 5 hours, when indicated, cells are incubated with 1 μM angiotensin. The cells are then lysed and Lucilite^TMAssay luciferase activity using the kit (Packard, Catalog No. # 6016911) and "Trilux 1450 Microbeta" liquid scintillation and fluorescence counter (Wallac) according to the manufacturer's instructions. Data is GraphPad Prism^TM2.0a (GraphPad Software Inc.).
d. Intracellular IP₃ Accumulation assay (Gw-related receptor)
On the first day, cells comprising the receptor (endogenous and / or non-endogenous) are placed on a 24-well plate, usually at 1 × 10 6⁵ Can be plated in cells / well (although this number can be optimized). On the second day, cells can be transfected by first mixing with 0.25 μg DNA in serum-free DMEM 50 μl / well and serum-free DMEM 50 μl / well 2 μl lipofetamine. The solution is gently agitated and incubated for 15-30 minutes at room temperature. The cells are washed with 0.5 ml PBS, 400 μl of serum free medium is mixed with the transfection medium and added to the cells. The cells are then incubated for 3-4 hours at 37 ° C./5% CO 2.₂ And the transfection medium was removed and replaced with 1 ml / well of normal growth medium. On the third day, cells³Label with H-myo-inositol. Briefly, the medium is removed and the cells are washed with 0.5 ml PBS. Then 0.5 ml of inositol-free / serum-free medium (GIBCO BRL) was added per well³Add per well with 0.25 μCi of H-myo-inositol and allow cells to grow for 16-18 hours at 37 ° C./5% CO 2.₂ Incubate with. On the fourth day, cells are washed with 0.5 ml PBS and 0.45 ml or 0.4 ml assay medium containing 10 μM pargyline 10 mM lithium chloride without inositol / serum and 10 × ketanserin (ketanserin). Add 50 μl to a final concentration of 10 μM. The cells are then incubated for 30 minutes at 37 ° C. The cells are then washed with 0.5 ml of PBS and 200 μl of a fresh / ice-cold stop solution (1 M KOH; 18 mM Na borate; 3.8 mM EDTA) are added per well. The solution is kept on ice for 5-10 minutes or until the cells are lysed, then neutralized with 200 μl of a fresh / ice-cold neutralization solution (7.5% HCL). The lysate is then transferred into a 1.5 ml eppendorf tube and 1 ml of chloroform / methanol (1: 2) is added per tube. The solution was vortexed for 15 seconds, and the upper phase was Biorad AG1-X8^TMAdd to anion exchange resin (100-200 mesh). First the resin is washed with 1: 1.25 W / V water and 0.9 ml of the upper phase is loaded on the column. The column is washed with 10 ml of 5 mM myo-inositol and 10 ml of 5 mM Na borate / 60 mM Na formate. Inositol triphosphate elutes in a scintillation vial containing 10 ml of a scintillation cocktail containing 2 ml of 0.1 M formic acid / 1 M ammonium formate. The column is washed with 10 ml of 0.1 M formic acid / 3 M ammonium formate and twice with ddH₂ Rinse with O and store in 4 ° C. water.
[0084]
Exemplary results are shown in Table G below.
[0085]
[Table 6]

[0086]
Exemplary results of the GTPγS assay for detecting constitutive activation disclosed in Example 4 (1) above were achieved using “Gs: fusion protein construct” on human RUP13 and RUP15. Table H below displays the signals generated from this assay and the differences in the signals as indicated.
[0087]
[Table 7]

[0088]
Example 5
Preparation of fusion protein
a. GPCR: Gs fusion construct
The design of the constitutively activated GPCR-G protein fusion construct was performed as follows: both the 5 'and 3' ends of the rat G protein Gsα (long form; Itoh et al., 83 PNAS 3776 (1986)). Was manipulated to include the HindIII (5'-AAGCTT-3 ') sequence thereon. After confirmation of the correct sequence (including the flanking HindIII sequence), the entire sequence was subcloned using the HindIII restriction site of the vector into pcDNA3.1 (-) (Invitrogen cat. Shuttle. The correct orientation of the Gsα sequence was determined after subcloning into pcDNA3.1 (-). PcDNA3.1 (-) containing the rat Gsα gene modified with the HindIII sequence was then identified. This vector was now available as a "universal" Gsα protein vector. The pcDNA3.1 (-) vector contains various well-known restriction sites upstream of the HindIII site, and thus advantageously provides the ability to insert an endogenous, constitutively active GPCR coding sequence upstream of the Gs protein. This same method can be used to create other "universal" G-protein vectors, and of course, other commercially available or proprietary vectors known to the skilled artisan can be used, An important criterion is that the sequence of the GPCR is upstream and in frame of that of the G protein.
[0089]
RUP13 is conjugated via Gs. For the exemplary "GPCR fusion proteins" described below, fusion to Gsα was achieved.
[0090]
The RUP13- "Gsα fusion protein" construct was made as follows. Primers were designed as follows.
5'-gat [TCTAGAAT] GGAGTCCCCACCCATCCCCCAG-3 '(SEQ ID NO: 97, sense)
5'-gatch [GATATC] CGTGACTCCAGCCGGGGTGAGGCGGC-3 '(SEQ ID NO: 98, antisense)
Lowercase nucleotides are included as spacers within the restriction site (shown in parentheses) between the G protein and RUP13. The sense and antisense primers contained restriction sites for XbaI and EcoRV, respectively, such that a spacer (attributed to the restriction site) was present between the G protein and RUP15.
[0091]
Then, PCR was used to secure the respective receptor sequences for fusion in the Gsα universal vector disclosed above, each using the following protocol. 100 ng cDNA for RUP15 was combined with 2 μl of each primer (sense and anti-sense), 3 μL of 10 mM dNTP, and 10 × Tack Plus.^TMPrecision buffer (Precision Buffer) 10 μL, Tack Plus^TM1 μL of Precision Polymerase (Stratagene: # 600211) and 80 μL of water were added to separate tubes. The reaction temperature and cycle time for RUP15 were as follows, including 35 repetitions of cycle steps 2-4. 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 1 minute and 40 seconds, and 72 ° C for 5 minutes. The PCR product was run on a 1% agarose gel and purified (data not shown). The purified product was digested with XbaI and EcoRV and the desired insert was purified and ligated at each restriction site into a Gs universal vector. Positive clones were isolated after transformation and determined by restriction digestion. Expression using 293 cells was achieved using the protocol described herein. Each positive clone of RUP15- "Gs fusion protein" was sequenced to confirm accuracy. (See SEQ ID NO: 99 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 100 for amino acid sequences).
[0092]
RUP15 is conjugated via Gs. For the exemplary "GPCR fusion proteins" described below, fusion to Gsα was achieved.
[0093]
The RUP15- "Gsα fusion protein" construct was made as follows. Primers were designed as follows.
5'-TCTAGAATGACGTCCCCTGCACCAACAGC-3 '(SEQ ID NO: 101, sense)
5'-gatatcGCAGGAAAAGTAGCAGAATCGTAGGAAG-3 '(SEQ ID NO: 102, antisense)
Lowercase nucleotides are included as spacers within the restriction site between the G protein and RUP15. The sense and antisense primers contained restriction sites for EcoRV and XbaI, respectively, such that a spacer (attributable to the restriction site) was present between the G protein and RUP15.
[0094]
Then, PCR was used to secure the respective receptor sequences for fusion in the Gsα universal vector disclosed above, each using the following protocol. 100 ng cDNA for RUP15 was combined with 2 μl of each primer (sense and anti-sense), 3 μL of 10 mM dNTP, and 10 × Tack Plus.^TMPrecision buffer 10 μL, Tack Plus^TM1 μL of Precision Polymerase (Stratagene: # 600211) and 80 μL of water were added to separate tubes. The reaction temperature and cycle time for RUP15 were as follows, including 35 repetitions of cycle steps 2-4. 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 1 minute and 40 seconds, and 72 ° C for 5 minutes. The PCR product was run on a 1% agarose gel and purified (data not shown). The purified product was digested. 3.) The purified product was digested with EcoRV and XbaI and the desired insert was purified and ligated into the Gs universal vector at each restriction site. Positive clones were isolated after transformation and determined by restriction digestion. Expression using 293 cells was achieved using the protocol described herein. Each positive clone of RUP15- "Gs fusion protein" was sequenced to confirm accuracy. (See SEQ ID NO: 103 for nucleic acid sequences and SEQ ID NO: 104 for amino acid sequences).
b. Gq (6 amino acid deletion) / Gi fusion construct
The design of a Gq (deletion) / Gi fusion construct could be achieved as follows. N-terminal 6 amino acids (sequence of TELSIM (SEQ ID NO: 129) 2-7 amino acids with Gαq-subunit deleted and C-terminal 5 amino acids with sequence EYNLB (SEQ ID NO: 130) With the corresponding amino acids of the "GαI protein" having the sequence DCGLF (SEQ ID NO: 131).
5'-gttacaagctttCATGGCGGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 132) and
5'-gatcggatccTTAGACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3 '(SEQ ID NO: 133)
And plasmid 63313 containing mouse Gαq-wild type, and obtained by PCR using a hemagglutinin tag as a template. Lowercase nucleotides are included as spacers.
[0095]
Tack Plus Precision DNA Polymerase (Stratagene) is used for replication by the following cycle, which includes 35 repeats of steps 2-4. 95 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 20 seconds, 56 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 7 minutes. The PCR product was cloned into the pCRII-TOPO vector (Invitrogen) and sequenced using the ABI Big Dye Terminator Kit (PE Biosystems). The insert from the TOPO clone containing the sequence of the fusion construct was shuttled into the expression vector pcDNA3.1 (+) at the HindIII / BamHI site by a two-step cloning procedure.
[0096]
Example 6
Tissue distribution of the disclosed human GPCR: RT-PCR
RT-PCR was applied to confirm the expression of several new human GPCRs and to determine tissue distribution. Oligonucleotides used were GPCR specific as a template and a human multiple tissue cDNA panel (MTC, Clontech). Tack DNA polymerase (Stratagene) was used for amplification in a 40 μl reaction according to the manufacturer's instructions. 20 μl of the reaction was run on a 1.5% agarose gel to analyze the RT-PCR products. Table J below lists the receptors, cycling conditions and primers used.
[0097]
[Table 8]

[0098]
[Table 9]

[0099]
Example 7
Protocol: Direct Identification of Inverse Agonists and Agonists
A. [³⁵S] GTPγS assay
Although we have used endogenous, constitutively active GPCRs for the direct identification of candidate compounds, eg, inverse agonists, for reasons that are not fully understood, variability within the assay can be significant. Then, preferably, as disclosed above, "GPCR fusion proteins" are also used with non-endogenous, constitutively activated GPCRs. We have observed that when using such proteins, the intra-assay variability is essentially stabilized, which appears to provide an effective signal-to-noise ratio. This has the advantageous result of allowing a more robust identification of the candidate compound. Thus, if a "GPCR fusion protein" is used and utilized for direct identification, it is desirable to utilize the following assay protocol.
1. Membrane preparation
Membranes comprising the relevant constitutively active orphan "GPCR fusion protein" and used for direct identification of candidate compounds as inverse agonists, agonists or partial agonists are preferably prepared as described below.
a. material
"Membrane scrape buffer" comprises 20 mM HEPES and 10 mM EDTA, pH 7.4. "Membrane wash buffer" comprises 20 mM HEPES and 0.1 mM EDTA, pH 7.4. "Binding buffer" was 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, and 10 mM MgCl.₂ , PH 7.4.
b. operation
Keep all materials on ice throughout the run. First, the medium is aspirated from the confluent monolayer of cells, then rinsed with 10 ml cold PBS and then aspirated. Thereafter, 5 ml of "membrane scrape buffer" is added to the scraped cells, followed by transferring the cell extract into a 50 ml centrifuge tube (centrifugation at 20,000 rpm for 17 minutes at 4 ° C.). Thereafter, the supernatant is aspirated and the pellet is resuspended in 30 ml of membrane “wash buffer” and then centrifuged at 20,000 rpm for 17 minutes at 4 ° C. The supernatant is then aspirated and the pellet resuspended in "binding buffer". This is then used to add Brinkman polytron.^TMHomogenize using a homogenizer (burst 15-20 seconds until all material is suspended). This is referred to herein as "membrane protein".
2. Bradford protein assay
Following homogenization, the protein concentration of the membrane is determined using a Bradford protein assay (protein diluted to about 1.5 mg / ml, aliquoted and frozen (-80 for further use). C.) When frozen, the protocol for use is as follows: On the day of the assay, the frozen "membrane protein" is thawed at room temperature, then vortexed and at about 12 x 1.000 rpm for about 5-10. Homogenize using a Polytron for 2 s. Note that for multiple preparations, thoroughly clean the homogenizer between homogenizations of different preparations)
a. material
"Binding buffer" (as described above), "Bradford staining reagent", "Bradford protein standard" are used according to the manufacturer's instructions (Biorad Cat # 500-0006).
b. operation
Two tubes are prepared, one containing the membrane and the other as the control "blank". Each contains 800ul of "binding buffer". Thereafter, 10 μl of “Bradford Protein Standard” (1 mg / ml) is added to each tube, and then 10 μl of membrane “protein” is added except for one tube (other than blank). Thereafter, 200 μl of “Bradford Staining Reagent” is added to each tube, and then each is mixed with quail. After 5 minutes, the tube is again vortexed and the material therein is transferred to a cuvette. The cuvette is then read at a wavelength of 595 using a CECIL 3041 spectrophotometer.
3. Direct identification assay
a. material
"GDP Buffer" consists of 37.5 ml "Binding Buffer" and 2 mg GDP (Sigma Catalog No. G-7127), followed by a series of dilutions in "Binding Buffer" to give 0.2 μM GDP (respectively). The final concentration of GDP in the wells is 0.1 μM GDP). Each well comprising the candidate compound was 100 μl “DPG buffer” (final concentration, 0.1 μM GDP), 50 ul “membrane protein” in “binding buffer”, and [³⁵S] GTPγS (0.6 nM) 50 μl (2.5 μl per 10 ml “binding buffer”³⁵S] GTPγS) with a final volume of 200 ul.
b. operation
Candidate compounds are preferably screened using a 96-well plate format (these can be frozen at -80 ° C). Homogenize briefly until the “membrane protein” (or membrane with the expression vector without the “GPCR fusion protein” as a control) is suspended. The protein concentration is then determined using the "Bradford Protein Assay" set described above. The “membrane protein” (and control) is then diluted in “binding buffer” to 0.25 mg / ml (final assay concentration, 12.5 μg well). Thereafter, 100 μl of “GDP buffer” was added to Wallac Scintistrip.^TM (Wallac) was added to each well. A 5 ul pin instrument is then used to transfer 5 ul of the candidate compound into this well (ie, 5 ul in a total assay volume of 200 μl is a 1:40 ratio such that the final screening concentration of the candidate compound is 10 μM). Again, after each transfer step, wash the pin implement in three containers comprising water (1X), ethanol (1X) and water (2X) to prevent contamination. Excess liquid is shaken off the appliance after each rinse and dried using paper and a Kimwipe. Thereafter, 50 μl of “membrane protein” is added to each well (a control well comprising a membrane without “GPCR fusion protein” is also used) and pre-incubated for 5-10 minutes at room temperature. Then, the [binding buffer] [³⁵S] Add 50 μl of GTPγS (0.6 nM) to each well, then incubate for 60 minutes at room temperature in a shaker (again, the plate is covered with foil). The assay is then stopped by rotating the plate at 400 rpm for 15 minutes at 22 ° C. The plate is then aspirated using an 8-channel manifold and sealed using a plate cover. The plate is then read on the Wallac 1450 using the setting "Prot. $ 37" (according to the manufacturer's specifications)
B. Cyclic AMP assay
Another assay method for directly identifying candidate compounds is achieved using a cyclase-based assay. In addition to direct identification, this assay can be used as described above [³⁵S] can also be used as an independent method to provide confirmation of results from the GTPγS method.
[0100]
Modified flash plate^TMThe adenylate cyclase kit (New England Nuclear, catalog number SMP004A) was preferably used for the direct identification of candidate compounds as inverse agonists and agonists for constitutively activated orphan GPCRs according to the following protocol.
[0101]
Transfected cells were harvested about 3 days after transfection. 20 mM HEPES, pH 7.4 and 10 mM MgCl₂ A membrane was prepared by homogenization of cells suspended in a buffer containing Homogenization is performed by Brinkman Polytron^TMFor about 10 seconds on ice. The resulting homogenate is centrifuged at 49,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. The resulting pellet was then resuspended in a buffer containing 20 mM HEPES, pH 7.4 and 0.1 mM EDTA, homogenized for 10 seconds, and then centrifuged at 49,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. The resulting pellet was then stored at -80 C until use. On the day of the direct identification screen, the membrane pellet was slowly thawed at room temperature, and washed with 20 mM HEPES, pH 7.4 and 10 mM MgCl2.₂ Resuspension in a buffer containing a final protein concentration of 0.60 mg / ml (resuspended membrane on ice until use).
[0102]
cAMP standard and "Detection buffer" (tracer [11 mL of "Detection buffer")¹²IcAMP (comprising 2 μCi of 100 μl) was prepared and maintained according to the manufacturer's instructions. An "assay buffer" was prepared for screening, which contained 20 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM MgCl2.₂ , 20 mM phosphocreatine (Sigma), 0.1 units / ml creatine phosphokinase (Sigma), 50 μM GTP (Sigma), and 0.2 mM ATP (Sigma). The "assay buffer" was then stored on ice until use.
[0103]
The candidate compound identified above (thaw at room temperature if frozen) is combined with 40 μl “membrane protein” (30 μg / well) and 50 μl “assay buffer”, preferably in 96 plate wells. (3 μl / well, 12 μM final assay concentration). The mixture was then incubated for 30 minutes at room temperature with gentle shaking.
[0104]
After incubation, 100 [mu] l of "detection buffer" was added to each well and then incubated for 2-24 hours. Then transfer the plate to Wallac Microbeta^TMCounting was performed on a plate reader using "Prot # 31" (following manufacturer's instructions).
[0105]
Representative screening assay plate (96-well format) results are shown in FIG. Each bar shows the results for the various compounds in each well and for the RUP13-GαA fusion protein prepared in Example 5 (a) above. The representative results shown in FIG. 12 also give the standard deviation and mean based on the mean result ("m") for each plate, and the mean plus the mean for selection of inverse agonist as "lead" from the primary screen The two options include the selection of candidate compounds at least reduced by a factor of two standard deviations from the percent reaction from the average plate reaction. Conversely, options for selecting an agonist as a "lead" from the primary screen include selecting candidate compounds that have been increased by at least twice the standard deviation to the percent response by average plate response. Based on these selection procedures, the candidate compounds in the following wells were directly identified as putative inverse agonists (Compound A) and agonists (Compound B) for RUP13 in wells A2 and G9, respectively. See FIG. The following is provided for clarity. These compounds were directly identified without any knowledge of the endogenous ligand for this GPCR. Focusing on assay technology based on receptor function, and not compound binding affinity, we can reduce the functional activity of this receptor (Compound A) as well as increase the functional activity of the receptor (Compound B) The compound can be confirmed. Based on the location of these receptors in lung tissue (see, for example, hRUP13 and hRUP21 in Example 6), drugs can be developed for possible therapeutic treatment of lung cancer.
[0106]
The documents cited within this specification, including co-pending and related patents, are hereby incorporated by reference in their entirety, unless otherwise indicated. Modifications and extensions of the disclosed invention that are within the skill of the artisan are included within the scope of the above disclosure and claims.
[0107]
A variety of expression vectors are available to those skilled in the art, but for the purpose of use for both endogenous and non-endogenous human GPCRs, it is most preferred that the vector used is pCMV. This vector was deposited on October 13, 1998 with the American Type Culture Collection (ATCC) under the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure (10801 University Blvd., Manassas. , VA 20110-2209 USA). DNA was tested by the ATCCD and determined to be available. The ATCC has assigned the following deposit number to pCMV: ATCC # 203351.
[Brief description of the drawings]
FIG.
Second messenger IP from endogenous RUP12 ("RUP12") compared to control ("CMV")₃ Description of production.
FIG. 2
FIG. 9 is a graphical representation of the results of a second messenger cell-based cyclic AMP assay that provides a comparison of constitutive signaling between endogenous RUP13 (“RUP13”) and a control vector (“CMV”).
FIG. 3
Figure 4 is a graphical representation of the signals measured comparing CMV, endogenous RUP13 ("RUP13wt") and non-endogenous, constitutively activated RUP13 ("RUP13 (A268K)") using the 8XCRE-Luc reporter plasmid.
FIG. 4
RUP13: Gives a comparison of constitutive signaling by "Gs fusion protein" ("RUP13-Gs") and control vector ("CMV") [³⁵[S] GTPγS assay.
FIG. 5
FIG. 4 is a graphical representation of signals measured comparing CMV, endogenous RUP14 (“RUP14wt”) and non-endogenous, constitutively activated RUP13 (“RUP14 (L246K)”) using the 8XCRE-Luc reporter plasmid.
FIG. 6
Figure 4 is a graphical representation of the signals measured comparing CMV, endogenous RUP15 ("RUP15wt") and non-endogenous, constitutively activated RUP15 ("RUP15 (A398K)") using the 8XCRE-Luc reporter plasmid.
FIG. 7
Second messenger cells giving comparative results of constitutive signaling of endogenous RUP15 ("RUP15wt"), non-endogenous, constitutively activated form of RUP15 ("RUP15 (A398K)") and control vector ("CMV") 4 is an illustration of the results of a basic cyclic AMP assay.
FIG. 8
RUP15: gives a comparison of constitutive signaling by "Gs fusion protein" ("RUP15-Gs") and control vector ("CMV") [³⁵[S] GTPγS assay.
FIG. 9
Second messenger IP from endogenous RUP17 ("RUP17") compared to control ("CMV")₃ Description of production.
FIG. 10
Second messenger IP from endogenous RUP21 ("RUP21") compared to control ("CMV")₃ Description of production.
FIG. 11
FIG. 4 is a graphical representation of signals measured comparing CMV, endogenous RUP23 (“RUP23wt”) and non-endogenous, constitutively activated RUP23 (“RUP23 (W275K)”) using the 8XCRE-Luc reporter plasmid.
FIG.
FIG. 3 is a graphical representation of the results from the primary screening of various candidate compounds for RUP13. The results for "Compound A" are shown in well A2 and those for "Compound B" are shown in well G9.

Claims (80)

A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 1. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 1 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 3. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 5. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 3 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 7. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 9. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 5 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 11. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 13. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 7 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 15. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 17. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 9 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 19. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. 22. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 21 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 11 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 23. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. 26. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 25 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 13 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 27. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. 30. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 29 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 15 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 31. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. 34. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 33. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 17 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 35. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. 38. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 37. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 19 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 39. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. 42. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 41. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 21 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 43. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 45. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 23 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 47. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26. 50. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 49. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 25 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 51. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28. 54. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 53. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 27 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 55. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30. 58. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 57. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 29 and cDNA. 60. A host cell comprising the plasmid of claim 59. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32. 63. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 61 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 95 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 63. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34. 66. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 65. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 33 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 67. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36. 70. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 69. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 35 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 71. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38. 74. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 73. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 37 and cDNA. A host cell comprising the plasmid of claim 75. A G protein-coupled receptor encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. 78. A non-endogenous, constitutively activated form of the G protein-coupled receptor of claim 77. A plasmid comprising the vector of SEQ ID NO: 39 and cDNA. 80. A host cell comprising the plasmid of claim 79.

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