JP2004516841A - プロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドについてスクリーニングする方法 - Google Patents

プロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドについてスクリーニングする方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、黄体ホルモンレセプターアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織特異的黄体ホルモンレセプターリガンドをスクリーニングする第1方法を提供し、両方の方法は黄体ホルモンレセプターアイソフォームAまたはBを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた細胞を包含するアッセイにより、黄体ホルモンレセプターアイソフォームAまたは黄体ホルモンレセプターアイソフォームB選択的リガンドを選択することを含んでなる。さらに、本発明は、所望のターゲット組織におけるin vivo試験を含んでなる、組織選択的黄体ホルモンレセプターリガンドをスクリーニングする第2方法を提供する。本発明は、また、本発明に従う方法により同定された黄体ホルモンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的リガンドに関する。本発明は、さらに、このトランス活性化アッセイに適当な細胞系統、それぞれのアッセイキット、および本発明によるアイソフォーム特異的および/または組織選択的黄体ホルモンレセプターリガンドの医学的使用に関する。

Description

【0001】
発明の分野
本発明は、プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBに対する選択性を有するプロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法に関する。本発明は、さらに、組織選択的、特に乳房/子宮選択的、プロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法に関する。本発明は、さらに、プロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングするアッセイキットに関する。
【0002】
さらに、本発明は、プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドおよびプロゲステロン誘導可能なリポーター遺伝子で安定にトレンスフェクトされたSK−N−MC細胞系統に関する。最後に、本発明は、また、本発明の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドに関する。本発明は、また、本発明の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドの医学的使用に関する。
【0003】
発明の背景
プロゲステロンは独特の増殖ホルモンであり、そして女性の増殖組織において決定的な役割を演ずる。その主要なターゲット器官は子宮、乳房、卵巣および視床下部脳下垂体軸である。新しいプロゲステロンの開発およびそれらの作用モードの理解は、物質 (ステロイド) の単一グループに対する最大の化学的および生物学的研究の努力の1つであった。女性の産児制限剤 (例えば、経口避妊薬 (OC))としての主要な用途に加えて、エストロゲンと組み合わせたプロゲスチンはホルモン置換療法 (HRT) において広く使用されている。
【0004】
また、プロゲスチンは、ホルモン欠乏または不均衡により引き起こされる、いくつかの婦人科学的障害、例えば、月経困難症、子宮内膜症、および機能障害的子宮出血の治療に使用される。望ましくない副作用または他のレセプターとの交差反応性のために、それらの選択性プロファイルを改良するプロゲスチンの新しい世代の開発は大きい課題であった。さらに、治療的応用、例えば、腫瘍学的探求は新しい活性プロファイルを有するプロゲスチンを必要とする。
【0005】
研究において、5−アリール−1,2−ジヒドロ−5H−クロメノ[ 3,4−f ]キノリンのクラスのメンバーである、いくつかの非ステロイドのプロゲスチンはある種の組織選択的プロゲステロン作用を表示するが明らかにされた (L. Zhi他、J. Mol. Chem. 1998、41、291−302)。特に、プロゲステロン活性の2つのin vivo齧歯類モデル、すなわち、妊娠維持アッセイおよび子宮湿潤重量アッセイにおいて、前記クラスの化合物の2メンバーは効力のあるプロゲステロン様作用を表示することが観測された。プロゲステロン活性についての第3モデルにおいて、乳末端芽アッセイ (mammary end bud assay) において、これらの化合物は有意に低い活性を有した (J. P. Edwards他、J. Mol. Chem. 1998、41、2779−2785)。
【0006】
分離したプロゲスチンに、例えば、乳房組織において抗増殖潜在的能力および、同時に、子宮内膜において有益な作用を付与することは特に望ましいように思われる。なぜなら、乳癌の発生率と組み合わせた経口的避妊薬 (COC) およびHRTの使用との間の関係について、特に延長した期間の使用に関して、多数の疫学的研究が存在するからである (例えば、下記文献を参照のこと、K. E. Malone他、Epidemiologic Reviews 1993、15、80−97およびStandford他、Epidemiologic Reviews 1993、15、98−107)。危険は矛盾し、議論の的であるが、多年の摂取は正常の乳房上皮細胞の成熟分裂活性を増強することがあるという明瞭な証拠が存在する。
【0007】
これらのデータが意味するように、内因的および外因的プロゲスチンは乳房組織に対して潜在的に危険な刺激であることがある (A. Brzezinski他、Gynecol. Endocrinol. 1997、11、357−364)。再び、最近の研究により確認できるように、HRTにプロゲスチンを添加すると、エストロゲン単独の使用に関して乳癌の危険が顕著に増加するという、強い証拠が存在する (R. K. Ross他、J. Natl. Cancer Inst. 2000、16、92(4)、328−332;また、下記の文献を参照のこと:C. Schairer他、JAMA 2000、283(4)、485−491)。こうして、革新的生殖能コントロールおよびHRTのための新規な、選択的プロゲステロンレセプターリガンドならびにこのような選択的リガンドを同定する方法およびキットが強く要求されている。
【0008】
他のステロイドホルモンレセプターと同様に、PRはヒトを包含するある種の生物において2つのアイソフォームで発現される (H. Gronemeijer他、J. Steroid Biochem. 1991、40、271−278;T. T. Ilenchuck他、Endocrinology 1987、120、1449−1456)。こうして、またヒト乳房腫瘍および子宮内膜細胞系統において、2つのPRアイソフォーム、hPR−AおよびhPR−Bが同定された (P. Estes他、Biochemistry 1987、26、6250−6262;L. Klein−Hitpass他、Nucleic Acids Res. 1991、19、1227−1234;K. Christensen他、Mol. Endocrinol. 1990、24、1465−1473)。ヒトPR−AはhPR−Aのトランケート型であり、N末端において164アミノ酸を欠如する (K. B. Horwitz他、Endocrinology 1983、113、2195−2201)。両方のアイソフォームはDNA結合性およびリガンド結合性ドメインにおいて同一であり、プロゲスチン仲介遺伝子転写を誘導する。しかしながら、それらは下において概説するように異なるトランス活性化挙動を有する。
【0009】
潜在的に、PR−AおよびPR−BアイソフォームのN末端長さが異なるために、PR−AまたはPR−Bに結合した同一リガンドは2つのアイソフォームの異なるコンフォメーションを誘導することができ、異なる組のコアクチベーター/コリプレッサーとの相互作用を生じ、これは引き続いて観測されるトランス活性化の差の理由であることがある。したがって、レセプターおよびコアクチベーターとの相互作用を誘導することによって一方のアイソフォームを選択的に活性化し、レセプターおよびコリプレッサーの相互作用を誘導することによって他方のアイソフォームを選択的に阻害する化合物を同定することができるであろう。この仮説はTetel他の最近の刊行物 (Mol. Endocrinol. 1999、13、910−924) から支持され、この刊行物にはPRのアミノ末端とカルボキシ末端との間のホルモン依存的分子内相互作用を報告されている。
【0010】
両方のPRアイソフォームはこれまで試験されたすべてのプロゲステロンターゲット器官 (例えば、乳房、子宮) において発現される。しかしながら、PR−AおよびPR−Bは組織特異的方法で機能して、プロゲステロンに対する応答を仲介するという強い証拠が存在する。アイソフォーム特異的ノックアウトマウスは、同一ターゲット器官においてPR−AおよびPR−Bの異なる機能を示す。これらの研究に基づいて、PR−Bは乳腺の増殖および分化について最も重要なレセプターであるが、子宮上皮および排卵に対するプロゲスチンの抗増殖作用はPR−Aことによって仲介される可能性が強い (B. Mulac−Jericevic、Science 2000、289、1751−1754;Oria Conneely、Endocrine Society Meeting、Toronto、June 2000)。
【0011】
PRアイソフォーム特異的リガンドを同定することが潜在的に望ましいにもにかかわらず、このようなリガンドを特別に同定する方法は先行技術において開示されてきていない。さらに、組織選択的PRリガンドを同定する方法は先行技術において提供されてきていない。したがって、先行技術はPR特異的および/または組織選択的PRリガンドを提供しない。
【0012】
リガンドに対して暴露されたとき、細胞内レセプターの転写活性を決定する一般的アッセイおよび方法が開発された。例えば、米国特許第5,071,773号には、ホルモン細胞内レセプター、これらのレセプターのリガンドおよびホルモン細胞内レセプターの転写活性化性質を有するタンパク質を同定することができるアッセイが記載されている。
【0013】
ヒトPR−AおよびPR−Bアイソフォームおよびプロゲステロンレセプター応答性リポーターの2工程トランスフェクション手法に基づいて、ホルモン依存的転写モジュレーション系が確立された (R. Dijkema他、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1998、64、147−156)。この研究において使用するhPRアイソフォームおよびPR応答性リポーターを発現するチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞系統は、in vitroにおいて (抗) プロゲスチンを定量する効率よい、正確なツールを提供できることが示された。しかしながら、試験したすべてのプロゲステロンのアゴニストおよびアンタゴニストは、同一の方法でないにしても、同様に個々のPRアイソフォームに対して活性であった。こうして、PRアイソフォーム特異的化合物の選択はこれまで実施されなかった。
【0014】
得られたトランス活性化データを、ウサギ子宮内膜のMcPhailステージング、ラットにおける排卵および妊娠中断を使用した相対結合アフィニティーおよびバイオポテンシイの推定値と比較した (W. G. E. J. Schoonen他、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1998、64、157−170)。in vitroおよびin vivo試験においてこれらは非常に類似するので、一般にPRのアゴニスト、アンタゴニストおよび部分的アンタゴニストの直接的前スクリーニングは可能であることが見出された。こうして、このトランス活性化アッセイは結合性アッセイを置換し、化学化合物の特定のクラスを包含するin vivo研究のための価値のある前スクリーニングツールである。
【0015】
本発明は、PR活性のアイソフォーム特異的リガンドがホルモン療法においてプロゲスチン活性の組織選択的モジュレーションを可能とするという、新しい理論に基づく。したがって、1つのアプローチは乳房組織の保護的PRリガンドに関する。しかしながら、PRリガンドは他のターゲット器官、例えば、子宮に対して所望の作用を維持する。
【0016】
このアプローチは、PR−Aトランス活性化を選択的に刺激する純粋なアゴニスト、またはPR−Bトランス活性化を選択的に阻害する純粋なアンタゴニスト、またはPR−Aに対して強いアゴニスト活性およびPR−Bに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニストを同定することができる。しかしながら、本発明は、このアプローチに限定されない。さらに、このアプローチはその上他の組織系に適用可能である。多数のプロゲスチンが販売されているが、好ましくは乳房組織に対して、無関係の抗増殖潜在的能力を有するプロゲスチンは現在利用可能である。
【0017】
発明の目的
上に概説したように、ターゲット組織特異性を有するプロゲステロンレセプター (PR) リガンドを設計すること、すなわち、例えば、乳房におけるそれから生殖管におけるプロゲステロン活性を分離し、これによりCOCおよびHRTの望ましくない作用、例えば、乳癌の危険の増加を減少し、こうして乳腺および子宮の両方を保護することが望ましい。さらに、PRアイソフォーム、PRアイソフォームAまたはPRアイソフォームBの1つに対する選択性を有するPRリガンドを同定することが望ましい。こうして、ある種の所望の組織選択性を示すPRリガンドをスクリーニングする方法が必要とされている。
【0018】
本発明の他の目的は、PRアイソフォーム特異的リガンド、すなわち、PRアイソフォームAまたはBに対する選択性を有するPRリガンドをスクリーニングする方法を提供することである。好ましくは、PRアイソフォーム特異的リガンドを同定する方法は、PR−Aトランス活性化を選択的に刺激する純粋なアゴニスト、またはPR−Bトランス活性化を選択的に阻害する純粋なアンタゴニスト、またはPR−Aに対して強いアゴニスト活性およびPR−Bに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニストであるリガンドの同定に適当である。
【0019】
さらに、本発明の目的は、薬剤として、例えば、生殖能コントロールおよびHRTにおいて使用するための組織選択的PRリガンドをスクリーニングする方法を提供することである。好ましくは、組織選択的PRリガンドをスクリーニングする所望の方法は、第1選択組織に対して阻害作用または少なくとも非刺激作用、および第2選択ターゲット組織、好ましくは子宮組織に対して保護的作用を示すPRリガンドのスクリーニングに適当である。
【0020】
望ましくは、スクリーニング法は比較的簡単、高度に選択性、効率的であり、こうして多分高い処理量の篩がけを可能とする。さらに、スクリーニング法はPRの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト/アンタゴニストに適用可能である。
本発明のそれ以上の目的は、in vitroにおいてアイソフォーム特異的PRリガンドをスクリーニングする方法を実施するために適当のアッセイキットを提供することである。
【0021】
本発明の他の目的は、アイソフォーム特異的および/または組織選択的PRリガンドをスクリーニングする方法において使用するために好ましい細胞系統であり、好ましくはアッセイキットの中に含まれる細胞系統の少なくとも1つの型を提供することである。
本発明のなお他の目的は、PRアイソフォームAまたはB特異的リガンドおよび/または組織選択的、好ましくは乳房/子宮特異的、PRリガンドを提供することである。これらはPRアイソフォームAまたはB特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドは薬剤として、例えば、生殖能コントロールおよびHRTにおいて使用するために適当である。
【0022】
最後に、本発明の目的は、PRアイソフォームAまたはBを選択的に阻害または刺激する方法を提供することである。そして、本発明の他の目的は、第1選択組織においてPR仲介症状を第2選択組織に関して選択的にモジューレートする方法を提供することであり、第1選択組織は好ましくは乳房組織であり、そして第2選択組織は好ましくは子宮組織である。
【0023】
すべてのこれらの目的は、特許請求の範囲において表現されている本発明に従い、PRアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドをスクリーニングする方法、アッセイキット、SK−N−MC細胞系統、PRアイソフォームAまたはB特異的および/または組織選択的PRリガンド、薬剤としてのそれぞれのリガンドの使用およびPR−AまたはPR−Bを選択的に阻害する方法ならびに選択した組織においてPR仲介作用を選択的にモジューレートする方法を準備することによって、驚くべきことには達成される。
【0024】
発明の要約
本発明は、PRアイソフォームAまたはB特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1および第2方法を提供する。本発明に従いPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法の両方は、基本的には、PR−AまたはPR−Bアイソフォームに対する選択性を有するPRリガンドを選択することを含んでなる。
【0025】
組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法は、本発明によるPRアイソフォーム特異性in vitro試験により同定されたPRアイソフォーム特異的リガンドを第1および第2ターゲット組織におけるin vivo試験に付し、所望の活性を有するリガンドを前記第1および第2ターゲット組織に関して選択することをさらに含む。組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法は、PRリガンドを所望のターゲット組織におけるin vivo試験に付し、所望のターゲット組織の1つのにおいてPR仲介作用を他の所望のターゲット組織に関して選択的にモジューレートするリガンドを選択することを含んでなる。
【0026】
こうして、本発明による組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法は、選択性アッセイ、好ましくは本発明によるトランス活性化アッセイにより証明されるように、選択的PR−AまたはPR−B特異的、純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト/アンタゴニストである、ある種のステロイドまたは非ステロイドのPRリガンドが組織選択的プロゲステロン作用を誘導するという、新しい、驚くべき概念に基づく。
【0027】
本発明による組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法は、異なるターゲット器官においてin vivo試験により同定された組織選択的PRリガンドにより誘導される、異なるプロゲステロンレセプター仲介作用に基づく。
本発明は、また、本発明に従う方法により同定された、PRアイソフォームAまたはB特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドを提供する。本発明によるPRアイソフォームAまたはB特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドは、薬剤として、例えば、生殖能コントロールまたはHRTにおいて使用するために適当である。
【0028】
好ましくは、本発明に従う方法により同定されたPRアイソフォーム特異的リガンドはPR−Bトランス活性化を選択的にブロックせず、または少なくともそれに影響を与えないが、なおPR−Aに対して強いアゴニストである。本発明に従い組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1および/または第2方法により同定された組織選択的PRリガンドは好ましくは乳房上皮の分化および増殖を阻害するが、生殖管におけるプロゲステロン活性は維持されるか、あるいはさらに増強される。こうして、本発明による組織選択的PRリガンドは、乳腺ならびに子宮の両方に対して保護作用を示す。
【0029】
他の面において、本発明は、本発明による方法、すなわち、PR−AまたはPR−Bアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法を実施するために適当なアッセイキットを提供する。
さらに、本発明は、PR−AまたはPR−Bを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされたSK−N−MC細胞系統を提供する。これらは細胞系統は、PRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに本発明による組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法において、および本発明によるアッセイキットの一部分として使用するために特に適当である。
【0030】
なお他の面において、本発明は、PRアイソフォームAまたはPRアイソフォームB仲介作用を選択的に阻害または刺激する方法を提供する。本発明は、また、選択した組織においてPR仲介症状を選択的にモジューレートする、好ましくは第1選択組織、好ましくは乳房組織においてPR仲介症状、好ましくはPR−B仲介症状に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、同時に、第2選択組織、好ましくは子宮組織においてPR仲介作用、好ましくはPR−A仲介作用を増強する方法を提供する。
【0031】
発明の詳細な説明
第1の面において、請求項1〜9に対応して、本発明は、プロゲステロンレセプター (PR) アイソフォームAまたはB特異的リガンドをスクリーニングする方法に関する。基本的には、この方法は、
(a) プロゲステロンレセプターアイソフォームAを発現するプラスミドで第1細胞を安定にトランスフェクトし;
(b) プロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドで第2細胞を安定にトランスフェクトし;
(c) ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第1および第2細胞をさらに安定にトランスフェクトし;
(d) 前記第1および第2細胞を試験すべきリガンドと接触させ;
(e) 前記第1および第2細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率(efficiency)および/または効力(potency)を決定し;そして
(f) プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBに対する選択性を有するリガンドを選択する;
工程を含んでなる。
【0032】
第2の面において、請求項10〜20に対応して、本発明は、組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを同定する第1方法に関する。基本的には、この方法は、上に説明したように本発明の第1面に従い、アイソフォーム特異的プロゲステロンレセプターリガンド、すなわち、プロゲステロンレセプターアイソフォームA (PR−A) またはプロゲステロンレセプターアイソフォームB (PR−B) に対する選択性を有するリガンドを選択することを含んでなる。さらに、組織選択的PRリガンドを同定する第1方法は、第1および第2組織において選択したPRアイソフォーム特異的リガンドをin vivo試験に付し、前記第1および第2組織において所望の活性を有するリガンドを選択することを含んでなる。
【0033】
こうして、組織選択的PRリガンドを同定する第1方法は、少なくとも下記の工程を含んでなる:
(a) プロゲステロンレセプターアイソフォームAを発現するプラスミドで第1細胞を安定にトランスフェクトし;
(b) プロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドで第2細胞を安定にトランスフェクトし;
(c) ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第1および第2細胞をさらに安定にトランスフェクトし;
(d) 前記第1および第2細胞を試験すべきリガンドと接触させ;
(e) 前記第1および第2細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率および/または効力を決定し;
(f) プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBに対する選択性を有するリガンドを選択し;
(g) 工程 (f) において選択したリガンドを第1および第2組織中のin vivo試験に付し;そして
(h) 前記第1および第2組織に関して所望の活性を有するリガンドを選択する。
【0034】
本発明において、上に説明した両方の方法、すなわち、PRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法および組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法の工程 (f) において決定した、1つのPRアイソフォーム、PR−AまたはPR−Bについての「選択性」は、前記第1および第2細胞においてある種の被験リガンドにより誘導される転写効率の差として定義される。好ましくは、この差は10%より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくは15%より大きいか、あるいはそれに等しく、最も好ましくはそれより高く、例えば、20%より大きいか、あるいはそれに等しくなくてはならない。
【0035】
本発明の関係において「転写効率」(efficiency)は、PR−AまたはPR−Bでトレンスフェクトされた細胞において標準に関して規定した濃度の被験リガンドを使用して達成される応答として定義される。
【0036】
PR−AまたはPR−Bに関して被験リガンドの活性、こうしてまた選択性を評価する他の潜在的パラメーターは、PR−AまたはPR−Bでトレンスフェクトされた細胞においてin vitroにおいて決定した、「効力」、すなわち、ED50 (作動性 (agonism) について) またはIC50 (拮抗性 (antagonism) について) 値である。こうして、前述の両方の方法の工程 (f) において決定される1つのPRアイソフォーム、PR−AまたはPR−Bについての「選択性」は、また、さらにまたは選択的に、前記第2細胞に関して前記第1細胞においてある種の被験リガンドにより達成される効力の差として定義することができる。好ましくは、この効力の差は10倍またはそれ以上の、より好ましくはこれ高い範囲である。
【0037】
こうして、本発明によるPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法の工程 (f) において規定される「選択性」は、前記第1および第2細胞における潜在的PRアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドについて決定された転写効率の差が好ましくは10%より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくは15%より大きいか、あるいはそれに等しく、最も好ましくは20%より大きいか、あるいはそれに等しく、および/または前記第1細胞において前記リガンドで達成される効力が前記第2細胞において前記リガンドで達成される効力と少なくとも10倍、より好ましくはこれより大きいように、定義される。こうして、効率および効力の両方は、前述の両方のスクリーニング法の工程 (f) に従うPR−A/PR−Bの選択性についての基準として、選択的にまたは組み合わせて使用することができる。
【0038】
第3の面において、請求項69〜73に対応して、本発明は、組織選択的PRリガンドを同定する第2方法に関する。この第2方法は異なる選択したターゲット組織におけるin vivo試験に基づき、これらのターゲット組織においてPR仲介作用を選択的にモジューレートするPRリガンドを提供する。
【0039】
こうして、本発明による組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法は、下記の工程を含んでなる:
(a) プロゲステロンレセプターリガンドを第1選択組織において少なくとも1つのin vivo試験に付し;
(b) 前記同一プロゲステロンレセプターリガンドを第2選択組織において少なくとも1つのin vivo試験に付し;そして
(c) 前記第2選択組織に関して前記第1選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を選択的にモジューレートするプロゲステロンレセプターリガンドを選択する。
【0040】
用語「リガンド」は、レセプター (本発明において、好ましくはプロゲステロンレセプター) に結合し、活性化または阻害を誘導する任意の化合物またはこのレセプターと相互作用する任意の他の潜在的形態を包含することを意味する。また、用語「リガンド」は、レセプターの潜在的リガンドであるが、レセプターにおけるそれらのアフィニティーおよび/または活性がまだ知られていず、本発明による方法で試験しなくてはならない化合物について使用される。
本発明における用語「プラスミド」は、「プラスミドベクター」を包含することを意図する。
【0041】
こうして、本発明の1つの達成は、最初にPRリガンドのPR−A/PR−Bアイソフォーム特異性PRリガンドの組織選択性、特に乳房/子宮選択性との相関を可能としたことである。さらに、本発明の方法により組織選択的、特に乳房/子宮選択的PRリガンドを同定することが可能となった。既知の療法の欠点、例えば、乳癌の発生率の増加を回避するために、生殖能コントロールおよびホルモン (置換) 療法するとき使用するための組織選択的プロゲスチンを設計することは特に好都合である。
【0042】
本発明による方法により同定されたアイソフォーム特異的および/または組織選択的PRリガンドは、他の、望ましくない組織ではなく、特異的ターゲット組織において、プロゲステロンレセプターのみを活性化し、こうしてこれらの治療を十分に許容可能しかつ重大な副作用またはそれ以上の健康の問題の誘導に対する傾向を減少させる。さらに、それらのプロゲスチンは、現在 (組み合わせた) 経口的避妊薬およびHRTにおいて使用されるプロゲスチンよりも、非常に少ない投与量で投与することができる。
【0043】
その上、本発明は、PRアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドを使用することによってPR仲介症状の調整されたモジュレーションを可能とし、こうしてPRが関係する治療において、プロゲスチン、特にプロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト/アンタゴニストをさらに有益に使用する道を開くことができる。本発明による方法により同定されるアイソフォーム特異的および/または組織選択的PRリガンドは、細胞内レセプター、例えば、一般にプロゲステロンレセプター、特にPRアイソフォームに関係するある種の病理学症状を含む、生物学的経路のそれ以上の解明に寄与するであろう。
【0044】
しかしながら、本発明によるPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法および組織選択的PRリガンドをスクリーニングする本発明による第1方法は、異なる型のレセプターを含む他のレセプター/リガンド系および/または選択したターゲット器官 (例えば、アンドロゲンレセプター系) における異なるレセプター仲介作用に準用することができる。さらに、組織選択的PRリガンドをスクリーニングする本発明による両方の方法もまた他の所望の組織またはターゲット器官に必要な変更を加えて適用することができる。
【0045】
下記において、PRアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドをスクリーニングする本発明による方法をいっそう詳しく説明する。工程 (a) 〜 (f) はPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法および組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法においてそれらの最も広いならびにそれらの好ましい意味が同一であるので、これらの工程 (a) 〜 (f) はPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法を参照してのみ詳細に説明する。組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法の中に含まれる追加の工程 (g) および (h) を以後詳細に説明する。
【0046】
本発明の第1面に従うPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法は、好ましくはトランス活性化アッセイであり、複数の安定なトランスフェクション、すなわち、上において定義した工程 (a) 〜 (c) を含んでなる。好ましくは、本発明の第1面に従うこのスクリーニング法において使用する細胞ならびに本発明によるアッセイキット (本明細書において後述する) の中に含まれる細胞は、SK−N−MC細胞 (ヒト神経芽細胞腫細胞) である。この細胞系統は本発明の目的に対して特に十分に適合する。
【0047】
なぜなら、それは単一特異的細胞、すなわち、PRのみを発現するが、他のホルモンレセプター、例えば、アンドロゲン、グルココルチコイドまたは他のステロイドレセプターを発現しない細胞を含んでなるからである。さらに、これらの特異的細胞において、PRアイソフォームAはPRアイソフォームBのように等しく活性である。これは本発明による新規な発明的細胞の明瞭な利点であり、下記においていっそう詳しく説明する。しかしながら、本発明の第1および第2面に従うスクリーニング法ならびに本発明によるアッセイキットのために、他の細胞系統、例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞またはCV−1細胞は等しく適当である。
【0048】
本発明によるPRアイソフォームAまたはB特異的リガンドをスクリーニングする方法において、前述の細胞をそれぞれPR−AまたはPR−Bを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトする (本発明による安定にトランスフェクトされた細胞を得る典型的な方法の詳細な説明は実施例5に記載されている)。換言すると、PR−Aを特異的に発現する「第1細胞」(工程 (a) に対応する) およびPR−Bを特異的に発現する「第2細胞」(工程 (b) に対応する) を得る。本発明の第1および第2面に従うスクリーニング法および本発明によるアッセイキットにおいて使用する最も好ましい細胞は、SK−N−MC細胞である。トランス活性化アッセイのために、ヒトPR−AまたはPR−B (hPR−AまたはhPR−B) を発現するプラスミドで細胞を安定にトランスフェクトすることは最も好ましい。
【0049】
それぞれPR−AまたはPR−Bを発現するプラスミドは、好ましくはそれぞれプラスミドpRSVhPR−neo (PR−Bプラスミド;PR−Bを特異的に発現する細胞について) ならびにphPR−2 (PR−Aプラスミド) およびpRSV−neo (PR−Aを特異的に発現する細胞について) である。これらのプラスミドを得る方法および/または場合を実施例5において詳細に説明する。それらはラウス肉腫ウイルス (RSV) の長い末端反復から発現されたPR−AまたはPR−Bの全長のコーディング配列を含有する。SV40初期プロモーターから発現されるネオマイシン耐性遺伝子は、安定なトランスフェクタントのネオマイシン選択を可能とする。しかしながら、また、他の構築物、例えば、本発明の目的に対して適当な、任意の他の抗生物質耐性遺伝子を含んでなる構築物が考慮される。
【0050】
さらに、本発明の第1および第2面のスクリーニング法本発明において、かつ本発明によるアッセイキットの一部分として、使用するために適当な、本発明による第1および第2細胞 (好ましくは前述のSK−N−MC細胞) は、工程 (c) においてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドでさらに安定にトランスフェクトされる。好ましくは、このプラスミドはpMTV−LUCプラスミドであり、ここでホルモン的に応答性のプロモーターは、ルシフェラーゼ (LUC) リポーター遺伝子に連鎖された、マウス乳房腫瘍ウイルス (MTV) プロモーターである (詳細な説明については、実施例5参照)。しかしながら、また、本発明の目的に対して適当な他のプロモーター/リポーター遺伝子系が考慮される。
【0051】
さらに、PR−AまたはPR−Bプラスミドおよびプロモーター/リポーター遺伝子で安定にトレンスフェクトされた細胞を、例えば、実施例5に記載されているように、他の抗生物質耐性遺伝子、例えば、プロマイシン耐性遺伝子 (例えば、pSV2pac) でさらに安定にトランスフェクトする。前述したように、本発明の目的に対して適当な、任意の他の抗生物質耐性遺伝子をその上使用することができる。最後に、PR−AおよびMTV−LUCまたはPR−BおよびMTV−LUC (または、MTV−LUCの代わりに、上に説明したように、任意の他の適当なプロモーター/リポーター遺伝子系) を安定に発現する抗生物質耐性SK−N−MCクローンを、トランス活性化研究のために、すなわち、本発明によるPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法のために選択する。
【0052】
本発明によるPR−AまたはPR−Bアイソフォーム選択的リガンドをスクリーニングする方法の工程 (d) において、前記第1および第2の安定にトランスフェクトされた細胞 (すなわち、それぞれPR−AまたはPR−Bを発現する細胞) を試験すべきリガンド、すなわち、潜在的にPRアイソフォーム特異的リガンドである化合物と接触させる。試験すべきリガンドはステロイドまたは非ステロイドの特質を有することができる。この方法は、一般にPRアフィニティー/活性について既に試験した化合物を使用して、また、それらのPRリガンドが未知である化合物を使用して実施することができる。試験すべき化合物が既にPRリガンドとして適否試験されている場合、それはPRの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト/アンタゴニストであることができる。
【0053】
前記第1および第2の安定にトランスフェクトされた細胞を工程 (d) において試験すべきリガンドとインキュベートした後、前記第1および第2細胞における潜在的PR−AまたはPR−B選択的リガンドの転写効率および/または効力を本発明によるスクリーニング法の工程 (e) において決定する。上において定義した前記潜在的PRアイソフォーム特異的リガンドの効率および/または効力は、発現されたリポーター遺伝子産物のレベルを介して決定することができる (実施例1参照) 。リポーター遺伝子が本発明の好ましい態様として前述したLUCリポーター遺伝子である場合、LUCリポーター遺伝子産物のレベルを細胞ライゼイト中で決定し、RLU (相対光単位) として測定する。しかしながら、前記第1および第2細胞において転写効率および/または効力を決定する任意の他の方法は、本発明によるスクリーニング法ならびにアッセイキットにおいて等しく適用可能である。
【0054】
特に、前記第1または第2細胞においてリガンドのアゴニスト活性を決定するために、ルシフェラーゼアッセイの前に (リポーター遺伝子が前述のLUCリポーター遺伝子である場合) または本発明の目的に対して適当な任意の他のアッセイの前に、それぞれの細胞 (PR−AおよびPR−Bを発現する細胞であるが、各グループを別々に) を増加する濃度の、好ましくは0.01 nmol/l〜1 μmol/lの試験すべきリガンドの存在下に培養する。
【0055】
リポーター遺伝子誘導の陽性対照として、同一型の細胞を標準プロゲスチン、好ましくは合成プロゲスチンR5020 (プロメゲストン) で、好ましくは0.01 nmol/l〜1 μmol/lの濃度において処理する。リポーター遺伝子誘導の陰性対照として、同一型の細胞を好ましくは1%のエタノール中で培養する。アゴニスト活性を決定するために、すべての得られたデータ点を標準プロゲスチンに関して、好ましくは細胞を10−7 mol/lのR5020で処理することによって得られたLUC活性の誘導に関して計算する。アゴニスト効力[nM]を決定するために、ED50値 (すなわち、このリガンドの最大アゴニスト作用の半分を提供するリガンドの量[nM]) をグラフで決定する (例えば、実施例1参照)。
【0056】
アンタゴニスト活性を決定するために、それぞれの細胞 (PR−AおよびPR−Bを発現する細胞であるが、各グループを別々に) を標準プロゲスチン、好ましくは0. 1 nmol/lのR5020およびさらに増加する量の試験すべきリガンドで処理する。リポーター遺伝子転写阻害の陽性対照として、同一型の細胞を増加する量の標準抗プロゲスチン、好ましくは既知の抗プロゲスチンであるミフェプリストン中で、好ましくは1 pmol/l〜100 nmol/lの濃度において、培養する。アンタゴニスト効率を決定するために、すべての得られたデータ点を標準プロゲスチンに関して、好ましくは細胞を0.1 nmol/lのR5020で処理することによって得られたLUC活性の誘導に関して計算する。アンタゴニスト効力[nM]を決定するために、ED50値 (すなわち、このリガンドの最大アンタゴニスト作用の半分を提供するリガンドの量[nM]) をグラフで決定する (例えば、実施例1参照)。
【0057】
前記第1および第2細胞、すなわち、PR−A特異的細胞およびPR−B特異的細胞について、あるレベルの発現されたリポーター遺伝子産物を試験すべきリガンドについて獲得し、こうして前記リガンドで誘導された前記第1および第2細胞において、リポーター遺伝子の確かな転写効率および/または効力を決定する。本発明の第1および第2面に従うスクリーニング法の工程 (f) に従い、上において定義したPR−AまたはPR−Bに対する選択性を有するリガンドを選択しなくてはならない。
【0058】
好ましくは、本明細書の目的に対して、純粋にPR−Aのアゴニスト活性または純粋にPR−Bのアンタゴニスト活性を有するリガンド、またはPR−Aに対して強い部分的アゴニスト活性またはPR−Bに対して強い部分的アンタゴニスト活性を有するリガンドを選択する。本発明のそれらの方法により選択すべき他の典型的なリガンドは、純粋にPR−Aアンタゴニスト活性および純粋にPR−Bアゴニスト活性を有するリガンド、または部分的PR−Aアンタゴニスト活性/部分的PR−Bアゴニスト活性を有するリガンドである。
【0059】
こうして、上において定義したように、PRアイソフォーム特異的細胞の両方のグループ、すなわち、前記第1および第2細胞において試験したリガンドにより誘導された転写効率の差は、好ましくは10%より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくは15%より大きいか、あるいはそれに等しく、最も好ましくはそれより高く、例えば、20%より大きいか、あるいはそれに等しくなくてはならず、および/または前記第1細胞においてこのようなリガンドにより達成される効力は、前記第2細胞においてこのようなリガンドにより達成される効力と、好ましくは少なくとも10倍異なるべきである。
【0060】
本発明の1つの好ましい態様は、例えば、実施例1に従うアッセイであり、ここで本発明による典型的なPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法が記載されている。実施例1において、上に定義した本発明による方法により同定されたいくつかの典型的な結果が要約されている。本発明に従う方法により同定された、いくつかのPR−AまたはPR−Bアイソフォーム選択的リガンドについて得られた、いくつかの典型的な結果が要約されている。さらに、実施例5において、安定なトランスフェクションが詳細に説明されている。
【0061】
上に説明したように、本発明の第2面に従う組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法は、前述したPRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法と同一の工程 (a) 〜 (f) を含んでなる。こうして、組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法 (これは本発明の第2面である) の工程 (a) 〜 (f) を、本発明の第1面、すなわち、PRアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法に関して開示する。しかしながら、本発明の第2面に従う組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法は、後述する工程 (g) および (h) をさらに含んでなる。
【0062】
PRアイソフォームの特異性および組織選択性の新規な、驚くべき概念に従い、いったん組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法の工程 (f) において、PR−AまたはPR−Bについて前述した所望の選択性を有するリガンドが選択されると、このリガンドをこの方法の工程 (g) において第1および第2選択組織において、好ましくは乳房および子宮組織においてin vivo試験に付す。これらのin vivo試験は、第1および第2選択組織においてPR仲介作用を決定する試験であることが好ましい。
【0063】
例えば、可能なin vivo試験は実施例2、3および4に記載されている試験、すなわち、乳房組織の増殖/分化についての齧歯類アッセイ、妊娠維持試験または齧歯類における子宮内膜増殖/分化試験、および排卵阻害試験または齧歯類における過剰排卵試験である。しかしながら、選択した第1および第2組織におけるin vivo試験における、任意の他のPR仲介作用の決定は、本発明の目的に対して等しく適当であり、そして選択した組織および所望の組織選択性プロファイルに従い選択することができる。
【0064】
in vivo試験後において、本発明の第2面に従う組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1方法において再び選択工程 (工程 (h))を実施し、ここで第1および第2ターゲット組織に関して所望の活性を有するリガンドを選択する。こうして、例えば、本発明の1つの好ましい態様において、「所望の活性」は、第1ターゲット組織、好ましくは乳房組織においてPR仲介作用に影響を及ぼさず、または阻害し、同時に、第2ターゲット組織、好ましくは子宮組織においてPR仲介作用を維持するリガンドが選択されることを意味する。例えば、乳房組織において分化/増殖を刺激しない、または阻害するが、生殖管に対してその有益な (保護的) 作用を維持または増強する、すなわち、子宮に対して抗増殖活性を示すリガンドを選択する。
【0065】
このようなリガンドは、生殖能コントロール、例えば、経口避妊薬、およびホルモン置換療法 (HRT) において使用するために適当であるように思われる。しかしながら、当業者にとって明らかなように、本発明の適合は生殖能コントロールまたはHRTの分野に限定されず、本発明はその上レセプター仲介症状を包含する他の分野において有益に適用することができる。等しく、本発明の主題はPRに限定されず、また、他のレセプター/リガンド系において使用することができる。さらに、本発明は、また、2より多いターゲット組織に拡張することができる。
【0066】
本発明の第3面、すなわち、組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法によれば、この方法の工程 (a) において、第1選択組織中の、少なくとも1つのin vivo試験、好ましくはPR仲介作用を決定することに向けられた少なくとも1つのin vivo試験に付さなくてはならない。好ましくは、第1選択組織は乳房または子宮であるが、また、PR仲介作用が観測される、問題の任意の他の組織であることができる。
【0067】
本発明のこの第3面の目的に適当なin vivo試験は、例えば、実施例2、3および4に記載されている試験、すなわち、乳房組織の増殖/分化についての齧歯類アッセイ、妊娠維持試験または齧歯類における子宮内膜増殖/分化試験、および排卵阻害試験または齧歯類における過剰排卵試験である。最後に、本発明に従う組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法は任意の他のレセプターリガンドについて同様に実施することができ、任意の他のターゲット組織におけるin vivo試験を含むことができることが認められる。本明細書に記載する方法を他のレセプター系および/またはターゲット組織に転移するために必要な、適当な変化は平均の当業者の技量の範囲内に入る。
【0068】
本発明による組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法の工程 (b) によれば、前述の第1選択組織において既にin vivo試験したPRリガンドを第2選択組織において少なくとも他のin vivo試験に付す。好ましくは、再びin vivo試験はPR仲介作用の決定に適当な試験であるべきである。このような適当な試験は、第1選択組織の工程 (a) に関して前述した通りである。再び、工程 (b) に従う第2選択組織は好ましくは乳房または子宮組織であり、これらのいずれも工程 (a) において試験されなかったものである。
【0069】
第1および第2選択組織におけるin vivo試験後、本発明の第3面に従う組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法の工程 (c) において、前記第1および第2組織において試験したリガンドにより誘導されたPR仲介作用を比較し、そして前記第1選択組織におけるPR仲介作用を前記第2選択組織に関して選択的にモジューレートするPRリガンドを選択する。
【0070】
本発明のこの面の目的に対するPR仲介作用の「選択的モジュレーション」は、選択したリガンドが第1選択組織において1または2以上の作用を達成することを意味し、ここでこのような作用は、第2所望組織において前記リガンドにより誘導される1または2以上の作用に比較して、種類が異なり (すなわち、アゴニスト、アンタゴニストまたは、換言すると、阻害し、刺激しまたは影響を及ぼさない) および/または強度が異なる (すなわち、より弱いまたはより強い、または固有により長いまたはより短い) ことである。
【0071】
好ましくは、選択したリガンドは前記第1選択組織、好ましくは乳房組織においてPR仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第2組織、好ましくは子宮組織においてPR仲介作用を増強または維持する。最も好ましくは、選択したリガンドは乳房上皮の増殖/分化を阻害し、または少なくともそれに影響を及ぼさないが、それは生殖管において有益な (すなわち、保護的) PR仲介作用を維持する (実施例2、3および4参照) 、例えば、子宮組織に対して抗増殖作用を発揮する。
【0072】
ある種の被験リガンドが規定したターゲット組織における規定したPR仲介作用を他のターゲット組織に関して実際に選択的にモジューレートするかどうかを決定するために、前記リガンドにより誘導される作用のタイプ (すなわち、リガンドがPR仲介作用を阻害し、それに影響を及ぼさず、増強しまたは維持するかどうか) ならびに誘導された作用の強度を、好ましくは既知の「標準」PRリガンド、例えば、標準プロゲスチンR5020 (プロメゲストン) に関して測定する。次いで第1および第2ターゲット組織においてある種の被験リガンドで達成された作用を、好ましくは所望の医学的適用 (例えば、HRTおよびその他) の考慮下に、比較し、評価する。最後に、1つのターゲット組織に対する所望の選択性を他のターゲット組織に関して示すPR被験リガンドを選択する。
【0073】
上において定義した好ましい組織以外のある種の所望のターゲット組織において上において定義した適当なin vivo試験を選択し、実施すること、および適当な標準リガンドに関してある種の被験リガンドにより誘導される作用を決定することは確かに当業者の知識の範囲内に入る。
【0074】
また、前述のすべての方法 (すなわち、PRアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドをスクリーニングする方法) は、多数の潜在的PRアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンドの自動化高い処理量のスクリーニングに適用可能であることは本発明の範囲内に入ると考慮される。本発明による方法に基づいて高い処理量のスクリーニングに適当な自動化プロセスを設計することは当業者の知識の範囲内に入る。
【0075】
本発明の他の面は、本発明の第1、第2または第3面に従うスクリーニング法により同定された、PR−AまたはPR−B特異的リガンドならびに組織選択的PRリガンドを提供することである。前述したように、本発明の第1面に従う方法により同定されたアイソフォーム特異的PRリガンドは、PR−AまたはPR−Bに対する純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト/アンタゴニストであることができる。好ましくは、本発明に従う方法により同定されたアイソフォーム特異的PRリガンドは、PR−Aに対する選択的アゴニストおよびPR−Bに対する選択的アンタゴニスト、またはPR−Aに対して強いアゴニスト活性およびPR−Bに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニストである。本発明による他の典型的なリガンドは、選択的PR−Aアンタゴニストおよび選択的PR−Bアゴニストまたは部分的PR−Aアンタゴニスト/PR−Bアゴニストである。
【0076】
本発明の第2および第3面に従う組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第1および第2方法により同定された組織選択的PRリガンドは、好ましくは乳房組織または子宮組織に対して選択的である。より好ましくは、それらはPR仲介作用に対して衝撃をもたず、または乳房組織におけるPR仲介作用 (例えば、乳腺の増殖/分化) を阻害するが、子宮組織においてPR仲介作用を増強または維持する、すなわち、子宮組織において保護的、例えば、抗増殖的、作用を発揮する。
【0077】
こうして、例えば、子宮卵巣において所望の、有益な作用を有する組織選択的PRリガンドおよび/またはPRアイソフォーム特異的リガンドが得られ、これらのリガンドは乳房において不適当なまたは危険な副作用を誘導しない、例えば、乳房組織の増殖/分化 (これは乳腺における末端芽の形成の増加により証明され、これは乳癌を誘導することがある) を誘導しない。しかしながら、既に前述したように、本発明の利益は乳房/子宮組織および/またはプロゲステロンレセプターに限定されず、他のターゲット組織および/またはレセプター/リガンド系にその上適用することができる。
【0078】
好ましくは、本発明の第3面に従う組織選択的PRリガンドをスクリーニングする第2方法により誘導される組織選択的、好ましい乳房/子宮選択的PRリガンドは、PR−AまたはPR−B選択的リガンドであり、より好ましくは、純粋なPR−Aアゴニスト、純粋なPR−Bアンタゴニスト、またはPR−Aに対して強いアゴニスト活性およびPR−Bに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニスト/アンタゴニストである。こうして、選択した組織選択的リガンドは好ましくは第1選択組織においてPR−Aトランス活性化を活性化または維持し、第2組織においてPR−Bトランス活性化を阻害し、またはそれに影響を及ぼさない。
【0079】
本発明の第1、第2および第3面に従う方法により同定されたPRリガンドの有益な作用のために、これらのリガンド (PRアイソフォーム特異的リガンドおよび/または組織選択的PRリガンド) は薬剤として、特に第1選択組織においてPR仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、同時に、第2ターゲット組織においてPR仲介作用を増強または維持し、ここで第1組織は好ましくは乳房組織であり、そして第2組織は好ましくは子宮または卵巣組織である。これらの薬剤は好ましくは生殖能コントロール (例えば、経口避妊薬) またはHRTにおいて使用することができる。好ましくは、同定されたPRリガンドは乳房組織において増殖/分化を阻害し、またはそれに影響を及ぼさないために、そして子宮組織において保護的、例えば、抗増殖的、作用を増強または維持すると同時に排卵に対して潜在的に所望の作用を維持するために使用することができる。
【0080】
本発明の第1、第2および第3面に従う方法により同定されたPRリガンドは、また、第1ターゲット組織、好ましくは乳房組織においてPR仲介作用 (例えば、増殖/分化) に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、そして第2ターゲット組織、好ましくは子宮または卵巣組織において有益な (例えば、抗増殖) PR仲介作用を増強または維持する (例えば、生殖能コントロールまたはHRTにおいて使用するための) 薬剤の製造に使用することができる。しかしながら、本発明によるリガンドまたは本発明によるリガンドから製造された薬剤の他の関係する使用が考慮される。
【0081】
本発明の他の面は、患者においてPR−AまたはPR−Bを選択的に阻害し、または選択的に決定する方法である。この方法は、治療的有効量の本発明の方法により同定されたPRアイソフォームAまたはB特異的リガンドを患者に投与する工程を含んでなる。
【0082】
本発明の他の関係する面は、選択したターゲット組織においてPR仲介症状を選択的にモジューレートする方法である。この方法は、治療的有効量の本発明の方法の1つにより同定された組織選択的および/またはアイソフォーム特異的PRリガンドを患者に投与する工程を含んでなる。好ましくは、PR仲介症状のモジュレーションは、第1選択組織、好ましくは乳房組織においてPR仲介、好ましくはPR−B仲介、作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして第2選択組織、好ましくは子宮または卵巣組織においてPR仲介、好ましくはPR−A仲介、作用を増強または維持することを含んでなる。
【0083】
こうして、本発明によるPR仲介症状を選択的にモジューレートする方法において、好ましくは保護的PR−A仲介作用 (例えば、抗増殖作用) を増強または維持し、そして潜在的に危険なPR−B仲介作用 (例えば、増殖/分化) を阻害し、またはそれに影響を及ぼさない。しかしながら、また、PR−A仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさない方法は、本発明による典型的な方法である。
【0084】
本発明のそれ以上の面は、PRアイソフォームAまたはB選択的リガンドをスクリーニングアッセイキットである。このキットは、PR−Aを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第1細胞と、またはPR−Bを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第2細胞とを含んでなり、前記第1および第2細胞はホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドプラスミドでさらに安定にトレンスフェクトされ、ここで前記第1および第2細胞と試験すべきリガンドとの接触は前記第1細胞および前記第2細胞についてあるレベルの発現されたリポーター遺伝子産物を生じ、そしてこれらの産物レベルの比較は前記第1および第2細胞においてリガンドにより誘導された転写効率および/または効力の差を生じ、ここで転写効率および/または効力の差はPR−AまたはPR−Bに対する選択性を示す。
【0085】
好ましくは、キットの中に含まれる細胞は本発明の第1および第2面に従うスクリーニング法について前述したすべての性質を有するSK−N−MC細胞である。また、本発明によるアッセイキットにおいて試験すべきリガンドの効率および/または効力の決定を、それぞれのスクリーニング法について正確に前述したように実施する。再び、本発明によるアッセイキットにより同定された潜在的アイソフォーム特異的PRリガンドは、ステロイドまたは非ステロイドの自然を有することができる。このキットは一般にPRアフィニティー/活性について既に試験し、PRに結合し、活性化または阻害することが見出された化合物のスクリーニングに有用であるが、また、それらのPRリガンドの可能性が未知である化合物のスクリーニングに有用である。
【0086】
このアッセイにおいて試験すべき化合物がPRリガンドとして既に適否試験されている場合、それらはPRの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト/アンタゴニストであることができる。好ましくは、アイソフォーム特異的PRリガンドは純粋なPR−Bアンタゴニストおよび純粋なPR−Aアゴニストまたは部分的PR−Bアンタゴニスト/PR−Aアゴニストであり、こうして子宮および/または卵巣においてそれらの有益な作用を発揮するが、例えば、乳房組織の分化/増殖のための、乳房における不適当な、潜在的に危険の副作用は防止される。しかしながら、また、純粋なPR−Bアゴニストおよび純粋なPR−Aアンタゴニストまたは部分的PR−Bアゴニスト/PR−Aアンタゴニストであるアイソフォーム特異的PRリガンドは本発明に従う。
【0087】
既に前述したように、本発明のそれ以上の面はそれら自体SK−N−MC細胞系統、すなわち、好ましくは本発明による方法および本発明の第2面および本発明によるアッセイキットにおいて使用する細胞系統である。本発明によるSK−N−MC細胞系統は、本発明の第1および第2面に従うスクリーニング法に関して既に詳細に説明された。本発明によるSK−N−MC細胞系統を得る典型的な方法は、実施例5に記載されている。
【0088】
前述した本発明によるアッセイ法およびキットはアイソフォーム特異的PRリガンドのスクリーニングに適当であるばかりでなく、かつまた、適当な変更を加えて、原理的には他のレセプター系に適用することができる。このようなそれ以上の考慮されるレセプター系は、2またはそれ以上の異なるアイソフォームで存在する他の細胞内レセプター、例えば、アンドロゲンレセプターであることができる。それ以上の考慮されるレセプターのアイソフォーム選択的リガンドおよび/または組織選択的リガンドをスクリーニングするために、必要な変更を加えて本明細書に記載する方法およびキットを調節することは当業者の技量の範囲内に入る。
【0089】
本発明の第1面に従うPR−AまたはPR−B特異的リガンドをスクリーニングする方法の適合は、いくつかの典型的なPRリガンドに関して実施例1において証明されている。in vivo試験の例は実施例2、3および4に記載されている。実施例5は、安定なトランスフェクションにより本発明によるPRアイソフォーム特異的細胞系統の産生に関する。
【0090】
実施例
実施例 .アイソフォーム特異的 PR リガンドをスクリーニングする方法
hPR−A (第1細胞) またはhPR−B (第2細胞) を発現するプラスミドおよびホルモン的に応答性のMTVプロモーターに連鎖されたLUCリポーター遺伝子で安定にトレンスフェクトされた第1および第2細胞を使用して、本発明によるアイソフォーム特異的PRリガンドをスクリーニングする方法実施する。本発明による細胞系統およびこの実施例において使用する細胞系統を得る方法は、実施例5に詳細に説明されている。
【0091】
10%ウシ胎児血清 (FCS)、ペニシリン100 U/ストレプトマイシン100 μg/ml (Biochrom、no. A2213)、L−グルタミン4 mmol/l (Gibco BRL、no. 25030−024)、ピルビン酸ナトリウム1 mmol/l (Biochrom、no. L0473) および1×非必須アミノ酸 (Biochrom、no. K0293) を補充した、アール塩 (Earl’ Salts) を含む最小必須培地 (S−MEM、L−グルタミンを含まない;Gibco BRL、no. 21090−022) の中の37 ℃の温度において5%二酸化炭素の雰囲気下に、細胞を培養する。
【0092】
トランス活性化アッセイのために、細胞を96ウェルの皿上に播種し (2×10細胞/皿) 前述したように培地中で培養し、ただしFCSの代わりに3%活性炭ストリップしたFCSを使用する。48時間後、細胞を前希釈被験化合物と接触させる。アゴニスト活性を決定するために、細胞を増加する濃度 (10−6〜10−11 mol/l) の被験化合物の存在下に培養する。リポーター遺伝子誘導の陽性対照として、細胞を10−6〜10−11 mol/lのR5020 (プロメゲストン) で処理する。リポーター遺伝子誘導の陰性対照として、細胞を1%エタノール中で培養する。アンタゴニスト活性を決定するために、細胞を10−10 mol/lのR5020およびさらに増加する濃度 (10−6〜10−11 mol/l) の被験化合物で処理する。リポーター遺伝子転写の誘導の陽性対照として、細胞を増加する濃度 (10−7〜10−12 mol/l) の抗プロゲステロンのミフェプリストンの存在下に培養する。リポーター遺伝子転写の誘導の陰性対照として、細胞を1%エタノール中で培養する。
【0093】
被験化合物と24時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞を20 μlの溶解緩衝液 (ルシフェラーゼアッセイ系E 153A;Promega) でプレートを攪拌しながら10分間溶解する。30 μlのルシフェラーゼ試薬 (ルシフェラーゼアッセイ系E 151A + 152A;Promega) を30秒/プレート以内に添加した後、ルシフェラーゼリポーター遺伝子産物の活性をMicrolite ML 3000マイクロタイタープレートルミノメーター (Dynatech) によりサイクルモードで測定する。
【0094】
応答の評価は作動性および拮抗性の両方について効率[%]を与え、そしてED50 (拮抗性について) およびIC50 (拮抗性について) 値は効力[nM]を与える。これらの値の計算は次のようにして実施する:
【0095】
【数1】
Figure 2004516841
【0096】
こうして、各被験リガンドについての効率[%]および効力[nM]を計算することができる。異なる被験リガンドについて達成された、いくつかの効率の結果を下に記載する:
上に説明したように、PRアイソフォームの1つ、AまたはBについて試験したリガンドの選択性は、PR−AおよびPR−Bについて達成された転写の差として定義され、これは10%より大きいか、あるいはそれに等しく、好ましくは15%より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくはなおより高く、例えば、20%より大きいか、あるいはそれに等しくなくてはならず、および/またはこのようなリガンドについて達成された効力の差として定義され、これは少なくとも10倍でなくてはならない。
【0097】
結果:
PR−Aに対する選択性を有する純粋なアゴニスト:
【0098】
a) 13−エチル−9,11−ジヒドロ−17−ヒドロキシ−(11α,17α)−6’H−ベンゾ[10,9,11]−18,19−ジノルプレグナ−4,9(11),20−トリエン−3−オン (WO 95/27725およびWO 94/09025に開示されている):
【化1】
Figure 2004516841
【0099】
作動性効率 (PR−A) :132%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :108%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−A − PR−B) :24% (PR−A選択性を示す)。
【0100】
b) 13−エチル−9,11−ジヒドロ−17−ヒドロキシ−(11α,17α)−6’H−ベンゾ[10,9,11]−18,19−ジノルプレグナ−4,9(11)−ジエン−20−イン−3−オン:
【化2】
Figure 2004516841
【0101】
作動性効率 (PR−A) :129%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :108%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−A − PR−B) :21% (PR−A選択性を示す)。
【0102】
c) 9,11−ジヒドロ−17−ヒドロキシ−(11α,17α)−6’H−ベンゾ[10,9,11]−19−ノルプレグナ−4,9(11),15−トリエン−20−イン−3−オン (WO 95/27725およびWO 94/09025に開示されている):
【化3】
Figure 2004516841
【0103】
作動性効率 (PR−A) :131%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :114%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−A − PR−B) :17% (PR−A選択性を示す)。
PR−Bに対する選択性を有する純粋なアゴニスト:
【0104】
a) 17−アセトキシ−6−メチル−4,6−プレグナジエン−3,20−ジオン:
【化4】
Figure 2004516841
【0105】
作動性効率 (PR−A) :35%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :81%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−B − PR−A) :17% (PR−B選択性を示す)。
【0106】
b) 17−(アセチルオキシ)−9,11−ジヒドロ−6−メチル−(6α,11α)−6’H−ベンゾ[10,9,11]−19−ノルプレグナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン (WO 95/27725およびWO 94/09025に開示されている):
【化5】
Figure 2004516841
【0107】
作動性効率 (PR−A) :50%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :90%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−B − PR−A) :40% (PR−B選択性を示す)。
【0108】
c) 1−(3−ブロモフェニル)−N−(1,3−ジヒドロ−1−オキソ−5−イソベンゾフラニル)−α−ヒドロキシ−α−(トリフルオロメチル)−シクロプロパンプロパナミド (WO 98/54159に開示されている):
【化6】
Figure 2004516841
【0109】
作動性効率 (PR−A) :81%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :106%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−B − PR−A) :25% (PR−B選択性を示す)。
【0110】
d) 13−ジエチル−5’,9−ジヒドロ−17−ヒドロキシ−(17α)−6’H−ベンゾ[10,9,11]−18,19−ジノルプレグナ−4,9(11),15−トリエン−20−イン−3−オン (WO 94/09025に開示されている):
【化7】
Figure 2004516841
【0111】
作動性効率 (PR−A) :85%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :108%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−B − PR−A) :23% (PR−B選択性を示す)。
【0112】
e) 5−{[2−ヒドロキシ−4−フェニル−2−(トリフルオロメチル)フェニル]アミノ}−1(3H)−イソベンゾフラノン (WO 98/54159に開示されている):
【化8】
Figure 2004516841
【0113】
作動性効率 (PR−A) :39.9%;拮抗性効率 (PR−A) :なし。
作動性効率 (PR−B) :56.8%;拮抗性効率 (PR−B) :なし。
作動性効率の差 (PR−B − PR−A) :17% (PR−B選択性を示す)。
PR−Bに対する選択性 (作動性) およびPR−Aに対する選択性 (拮抗性) を有する部分的アゴニスト:
【0114】
a) α−ヒドロキシ−N−[4−ニトロ−3−(トリフルオロメチル)フェニル]−α−(トリフルオロメチル)−ベンゼンブタンアミド (EP 253 503に開示されている):
【化9】
Figure 2004516841
【0115】
作動性効率 (PR−A) :18%;拮抗性効率 (PR−A) :59%。
作動性効率 (PR−B) :59%;拮抗性効率 (PR−B) :36%。
作動性効率の差 (PR−B − PR−A) :41% (PR−B選択性を示す)。
拮抗性効率の差 (PR−A − PR−B) :23% (PR−A選択性を示す)。
【0116】
b) 17−(アセチルオキシ)−6−クロロ−9,11−ジヒドロ− (11α)−シクロペンタ[10,9,11]−19−ノルプレグナ−4,6,9(11)−トリエン−3,20−ジオン (WO 95/11915に開示されている):
【化10】
Figure 2004516841
【0117】
作動性効率 (PR−A) :29%;拮抗性効率 (PR−A) :45%。
作動性効率 (PR−B) :50%;拮抗性効率 (PR−B) :30%。
作動性効率の差 (PR−B − PR−A) :21% (PR−B選択性を示す)。
拮抗性効率の差 (PR−A − PR−B) :15% (PR−A選択性を示す)。
【0118】
実施例 .ラット乳房上皮における増殖/分化作用についてのバイオアッセイ この試験の目的は、乳腺の発生、原理的には、エストロゲンプライムドラットにおける乳腺の末端芽 (terminal end buds) の形成に対するプロゲスチン (PRリガンド) の作用を評価することである。
【0119】
未熟雌ラット (Wistar Han、SPF) を21日の日齢において処置開始前4〜6日に卵巣摘出する。動物を標準エストロゲン (エストロン、70 μg/kg) および被験リガンド (適用体積:0.1 ml/50g体重;賦形剤:ベンジルベンゾエート/ヒマシ油 (1 + 4 v/v) ;皮下) で6日間処置する。対照群は、例えば、賦形剤、プロゲスチンを含まないエストラジオール、エストラジオール + 既知のプロゲスチン、例えば、R5020である。6日の処置後、動物を二酸化炭素で殺す。
【0120】
ホールマウント染色のために、動物の左腹鼠径乳房領域において毛を剃り、この領域を皮膚と一緒に体から切断する。組織学的/免疫組織化学的分析のために、右腹鼠径乳腺をそれに付着する結合組織と一緒に切断し、PBS (リン酸緩衝生理食塩水;Ca2+/Mg2+を含まない) 中の3.7%ホルマリン中で固定する。
【0121】
ホールマウント染色:
調製物をTellyesniczkyの方法 (下文参照) に従いアルコール−ホルマリン中で一夜固定する。次いで乳腺およびそれに付着する皮下組織を皮膚からストリップし、調製物を再び一夜固定する。それ以上の工程は次の通りである:エタノール70%:1.5時間;アセトン:3×1.5時間;アセトン:一夜;イソプロパノール:1.5時間;エタノール96%:2時間;ヘマトキシリン−鉄:3時間;VE水:まず調製物をすすぎ、次いで2×0.5時間;エタノール70%:一夜;エタノール80%:1.5時間;エタノール96%:1.5時間;イソプロパノール:1.5時間。次いで調製物をペトリ皿に移し、トルエンの中にほぼ1時間、すなわち、調製物が浮かぶのを止めるまで放置する。次いで調製物をヒマラヤスギ油 (Merk、no. 1.06965) で処理する。上記インキュベーション時間は最小時間であり、延長できる。特に、固定後のエタノール70%中のインキュベーションは少なくとも2.5週に延長することができる。
【0122】
ホールマウント染色に必要な溶液の調製:
a) Tellyesniczkyに従うアルコール−ホルマリン:ホルムアルデヒド37%:81.8 ml、エタノール70%:1636 ml、氷酢酸 (使用直前に添加すべきである):81.8 ml (合計:1800 ml)。
b) ヘマトキシリン母液:ヘマトキシリン (Merk、no. 1.15938):10 g、エタノール96%:100 ml。この溶液を使用前に37℃において48時間放置しなくてはならない。それはほとんど無限時間の間暗所に保持することができる。
【0123】
c) 使用するためのヘマトキシリン−鉄溶液:ヘマトキシリン母液 (濾過した) :15.2 ml、エタノール96%:1374 ml、FeCl×6HO (s. 4):91.1 ml、1 mol/l HCl:220 ml (合計:1700 ml);2 mol/l NaOHでpH 1.25に調節する。
d) FeCl×6HO溶液:FeCl×6HO (Merk、no. 1.03943):1.07 g、VE水:90.2 ml、HCl:37%:0.92 ml (合計:91.1 ml)。
40倍の倍率により、尾の方向における乳首付近の末端芽を計数する。研究すべき面積は約1.8 mmすべきである。十分に分化した調製物について、この面積を減少させることができ、少なくとも250芽が計数される。計数後、末端芽の数/mmが計算される。
【0124】
評価:
被験化合物のプロゲステロン作用を限界値 (有意なプロゲステロン作用が最初に認められる濃度) として決定するか、あるいは0.3 mg/kg/日に等しい効率である投与量を決定する。
【0125】
MIB−5免疫組織化学 (C. Gerlach他、Lab. Invest. 1997、77(6)、697−698、変更を伴う):
乳腺を4%ホルムアルデヒド/PBS中で24時間固定し、パラフィンの中に埋め込む。4 μmの切片をスライド上に広げ、脱パラフィンし、クエン酸塩緩衝液pH 6.0中で10分間マイクロ波処理し、PBSですすぐ。次いでスライドを3%H/メタノールで15分間、Blockingkit (Vector、no. SP−2001) で10分間、そしてPBS中で1:2に希釈したラット血清 (Sigma、no. S−7648) で30分間処理して非特異的染色を減少させ、PBS中ですすぐ。
【0126】
スライドをモノクローナル抗体MIB−5 (Dianova、no. Dia−5055) (これはラットKi−67抗原に対して特異的である) (PBS/0.2%BSA中で1:200に希釈した) と1時間インキュベートする。次いで、スライドをPBS/0.2%ツイーン20中で2回洗浄し、ビオチニル化ラット抗マウス二次抗体 (Dianova、no. 425−066−100) (PBS/0.2%ツイーン20中で1:200に希釈した) と1時間インキュベートし、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体 (Vecstain Elite ABC Kit no.PK−6100) と1時間インキュベートした後、再びPBS/0.2%ツイーン20中で2回洗浄する。ジアミノベンジジン (Zymed Substrate Kit) により、染色を実施する。すべての工程を室温において実施する。
【0127】
評価:
被験化合物を特性決定するために、乳房上皮を染色したMIB−5の百分率を決定する。
【0128】
実施例 .ラットにおける妊娠維持試験
ラットにおいて、卵巣除去は妊娠の停止を誘導する。プロゲスチン (エストロゲンと組み合わせた) は卵巣除去した動物における妊娠を維持することができる。しかしながら、卵巣除去ラットにおける妊娠維持の程度は規定した投与量範囲においてのみ最適である。したがって、より高いならびにより低い投与量は一般に弱い作用を誘導する。規定投与量のエストロン (E) による付随する処置は、プロゲスチンの妊娠維持作用を増加させる。
【0129】
190〜220 gの妊娠ラット (Wistar Han、SPF) (5〜8動物/投与) を妊娠8日に、最初の物質投与後2時間に卵巣摘出する。8〜14日に、ラットを毎日被験化合物と標準投与量のEとの組み合わせで処置する。1日後、動物を二酸化炭素で殺す。各動物について、胚の心拍に従い生きている胎児および死亡した胎児の数を決定する。子宮が空の場合において、10%硫化アンモニウム溶液を使用する染色により着床部位の数を決定する。
【0130】
被験化合物およびエストロンの処方および適用:
s.c. (皮下) 適用:被験化合物をベンジルベンゾエート/ヒマシ油 (1 + 4 v/v) 中に溶解し、1日量を1 ml/kg体重の体積で投与する。
p.o. (経口) 適用:被験化合物をキャリヤー液体 (100 mlの0.9%w/v NaCl溶液中の85 mgのMyrj) の中に懸濁させ、1日量を2 ml/kg体重の体積で投与する。
l.p. (腹腔内) 適用:被験化合物をポリプロピレングリコール中に溶解し、ラットの腹腔内に配置された微小浸透圧ポンプ (200I型、10 μl/時、7日間) の中に供給する。
エストロンの標準投与量は0.005 mg/kg体重s.c.であり、ベンジルベンゾエート/ヒマシ油 (1.4 v/v) 中に溶解する。
【0131】
評価:
妊娠維持/動物[%]、妊娠維持/投与量 (単一値のメジアン) およびED50 (妊娠が動物の50%において維持される投与量;100%は卵巣摘出しない対照動物に対応する) が決定される。
【0132】
実施例 .ラットにおける排卵阻害試験
処置を開始する前に、雌ラット (Wistar Han、SPF;体重:190〜210 g) の2月経サイクルを監視する。規則的4日サイクルを有する動物のみを引き続く試験のために使用する。発情後期において開始して、被験化合物を4日間 (第1〜4日) 投与し、その後サイクルをコントロールする。
【0133】
皮下適用のために、被験化合物をベンジルベンゾエート/ヒマシ油 (1 + 9 v/v) 中に溶解し、1日量を1 ml/kg体重の体積で投与する。
経口 適用のために、被験化合物をキャリヤー液体 (100 mlの0.9%w/v NaCl溶液中の85 mgのMyrj) の中に懸濁させ、1日量を2 ml/kg体重の体積で投与する。
第4日に、被験化合物の適用後、発情期または発情後期の動物を1つ側においてエーテル麻酔下に卵巣摘出する。管調製物を調製し、顕微鏡により卵巣を検査する。第5日に、すべての動物 (完全なおよび部分的に卵巣摘出した) を二酸化炭素で殺し、管を保存し、同一方法で分析する。
評価:
どれだけの数の動物の排卵が阻害されるかを、百分率として、決定する。
【0134】
実施例 .安定なトランスフェクション
リポフェクタミン試薬 (Gibco BRL、ベルリン)を使用して、安定なトランスフェクションを実施した。SK−N−MC細胞を6ウェルの皿上に5×10細胞/皿の密度で播種する。典型的には、細胞は24時間後に約80%のコンフルエントであった。トランスフェクション前に、細胞を1 mlのOpti−MEM (Gibco BRL、ベルリン)/皿で2回洗浄した。各皿について、それぞれ5 μgのDNA (pRSVhPR−neo:PR−Bプラスミド) または10 μgのDNA (5 μgのphPR−2:PR−Aプラスミドおよび5 μgのpRSV−neo) を500 μlのOpti−MEMで希釈した。
【0135】
次に、DNAおよびリポフェクタミン試薬の希釈物をポリスチレン製スナップキャップ管中で組み合わせて、1 mlのトランスフェクション溶液/皿を調製し、おだやかに混合し、室温において45分間インキュベートし、洗浄した細胞に添加した。5時間後、10%FCSを補充した2mlのS−MEMでトランスフェクション溶液を置換した。48時間後、細胞をトリプシン処理し、100皿上にそれぞれ3×10および1.5×10の密度で再プレートした。
【0136】
800 μgのG418を補充した培地中で、pRSVhPR−neoまたはphPR−2およびpRSV−neoで安定にトランスフェクトされたSK−N−MC細胞クローンを選択した。ネオマイシン耐性クローンはpMTV−LUCおよびpSV2pacで安定にトレンスフェクトされ、400 mg/mlのG418および0.2 mg/mlのプロマイシンを補充した培地中で選択した。最後に、クローンSK−N−MC C 23.43 (PR−AおよびMTV−LUCを安定に発現する) およびクローンSK−N−MC VIII 1.1 (PR−BおよびMTV−LUCを安定に発現する) をトランス活性化研究のために選択した。
【0137】
前述した安定なトランスフェクションのためのプラスミドを次のようにして得た:
PR−Aについて:
phPR−2: Kastner他、J. Biol. Chem. 1990、265、12163−12167に従う。
pMTV−LUC: A. Cato、Institut fuer Genetik、Kemforschungszentrum Karlsruheから入手した。
pRSV−neo: a) SV2−CATからのpRSV−CATの構築(Gorman他、Proc. Natl. Acad. Sci. 1982、79、6777−6781参照) 。
b) pRSV−CATからのpRSV−neoの構築(Gorman他、Science 1983、221、551−555)。
pSV2pac: P. Artelt、Gene 1988、68、213−219に従う。
【0138】
PR−Bについて:
pRSVhPR−neo: pRC/RSV (SV40初期プロモーターから発現されたネオマイシン耐性遺伝子を含有する;Invitrogen、サンディエゴ、から入手した) およびhPR−1 (Kastner他、J. Biol. Chem. 1990、265、12163−12167) から構築した。
ベクターpRC/RSVをNotIおよびXbaIで消化する;インサートのために、hPR−1をEcoRIで消化し、NotIでリンカー結合し、NotIおよびXbaIで制限消化して2.8 kbのフラグメントを形成し、これを単離し、上記ベクターの中に結合する。
pMTV−LUC: A. Cato、Institut fuer Genetik、Kemforschungszentrum Karlsruheから入手した。
pMPSVEH: P. Artelt、Gene 1988、68、213−219に従う。

Claims (100)

  1. プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンドをスクリーニングする方法において、
    (a) プロゲステロンレセプターアイソフォームAを発現するプラスミドで第1細胞を安定にトランスフェクトし;
    (b) プロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドで第2細胞を安定にトランスフェクトし;
    (c) ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第1および第2細胞をさらに安定にトランスフェクトし;
    (d) 前記第1および第2細胞を試験すべきリガンドと接触させ;
    (e) 前記第1および第2細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率(efficiency)および/または効力(potency)を決定し;そして
    (f) プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBに対する選択性を有するリガンドを選択する;
    工程を含んでなる方法。
  2. 前記第1および第2細胞中の前記リガンドについて決定された転写効率の差が10%より大きいか、あるいはそれに等しくそして/または前記第1細胞中の前記リガンドで達成される効力が前記第2細胞中の前記リガンドで達成される効力と少なくとも10倍異なるように、工程 (f) における選択性が定義される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記細胞が、SK−N−MC細胞である、請求項1に記載の方法。
  4. 前記ホルモン的に応答性のプロモーターが、マウス乳房腫瘍ウイルス (MMTV) プロモーターである、請求項1に記載の方法。
  5. 前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ (LUC) リポーター遺伝子である、請求項1に記載の方法。
  6. 前記第1および第2細胞における転写効率および/または効力をルシフェラーゼ活性の測定により決定する、請求項1に記載の方法。
  7. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項1に記載の方法。
  8. 前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項7に記載の方法。
  9. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項8に記載の方法。
  10. 組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法において、
    (a) プロゲステロンレセプターアイソフォームAを発現するプラスミドで第1細胞を安定にトランスフェクトし;
    (b) プロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドで第2細胞を安定にトランスフェクトし;
    (c) ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第1および第2細胞をさらに安定にトランスフェクトし;
    (d) 前記第1および第2細胞を試験すべきリガンドと接触させ;
    (e) 前記第1および第2細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率(efficiency)および/または効力(potency)を決定し;
    (f) プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBに対する選択性を有するリガンドを選択し;
    (g) 工程 (f) において選択したリガンドを第1および第2組織中のin vivo試験に付し;そして
    (h) 前記第1および第2組織に関して所望の活性を有するリガンドを選択する;
    工程を含んでなる方法。
  11. 前記第1組織が、子宮組織である、請求項10に記載の方法。
  12. 前記in vivo試験が、前記第1および第2組織におけるプロゲステロン仲介作用を決定する試験である、請求項10に記載の方法。
  13. 前記第1および第2細胞中の前記リガンドについて決定された転写効率の差が10%より大きいか、あるいはそれに等しくおよび/または前記第1細胞中の前記リガンドで達成される効力が前記第2細胞中の前記リガンドで達成される効力と少なくとも10倍異なるように、工程 (f) における選択性が定義される、請求項10に記載の方法。
  14. 前記細胞が、SK−N−MC細胞である、請求項10に記載の方法。
  15. 前記ホルモン的に応答性のプロモーターが、マウス乳房腫瘍ウイルス (MMTV) プロモーターである、請求項10に記載の方法。
  16. 前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ (LUC) リポーター遺伝子である、請求項10に記載の方法。
  17. 前記第1および第2細胞における転写効率および/または効力をルシフェラーゼ活性の測定により決定する、請求項16に記載の方法。
  18. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項10に記載の方法。
  19. 前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項18に記載の方法。
  20. プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項19に記載の方法。
  21. 請求項1に記載の方法により同定された、プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  22. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンドが、プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト/アンタゴニストである、請求項21に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  23. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンドが、プロゲステロンレセプターアイソフォームA選択的アゴニストまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームB選択的アンタゴニストまたは部分的プロゲステロンレセプターアイソフォームAアゴニストおよびプロゲステロンレセプターアイソフォームBアンタゴニストである、請求項22に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  24. 請求項10に記載の方法により同定された、組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  25. 前記組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドが、乳房組織または子宮組織である、請求項24に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  26. 前記組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドが、乳房組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、そして子宮組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項25に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  27. プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされたSK−N−MC細胞系統。
  28. ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドでさらに安定にトレンスフェクトされた、請求項27に記載のSK−N−MC細胞系統。
  29. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項28に記載のSK−N−MC細胞系統。
  30. 前記抗生物質耐性遺伝子がネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項29に記載のSK−N−MC細胞系統。
  31. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項30に記載のSK−N−MC細胞系統。
  32. 前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ (LUC) リポーター遺伝子であり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターがマウス乳房腫瘍ウイルス (MMTV) プロモーターである、請求項28に記載のSK−N−MC細胞系統。
  33. プロゲステロンレセプターアイソフォームAを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第1細胞と、プロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第2細胞とを含んでなるプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンドをスクリーニングするアッセイキットであって、前記第1および第2細胞がホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドでさらに安定にトレンスフェクトされており、ここで試験すべきリガンドと前記第1および第2細胞を接触させると、前記第1細胞および前記第2細胞について発現された遺伝子産物があるレベルで産生され、これらの遺伝子産物のレベルを比較すると、前記第1および第2細胞により誘導される転写効率および/または効力が異なり、ここでこの転写効率の差はプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBに対する選択性を示す、アッセイキット。
  34. 前記第1および第2細胞中の前記リガンドについて決定された転写効率の差が10%より大きいか、あるいはそれに等しくおよび/または前記第1細胞中の前記リガンドで達成される効力が前記第2細胞中の前記リガンドで達成される効力と少なくとも10倍異なる、請求項33に記載のアッセイキット。
  35. 前記細胞が、SK−N−MC細胞である、請求項33に記載のアッセイキット。
  36. 前記ホルモン的に応答性のプロモーターが、マウス乳房腫瘍ウイルス (MMTV) プロモーターである、請求項33に記載のアッセイキット。
  37. リポーター遺伝子がルシフェラーゼ (LUC) リポーター遺伝子である、請求項33に記載のアッセイキット。
  38. 前記第1および第2細胞における転写効率および/または効力をルシフェラーゼ活性の測定により決定する、請求項37に記載のアッセイキット。
  39. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項33に記載のアッセイキット。
  40. 前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項39に記載のアッセイキット。
  41. 前記プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームBを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項40に記載のアッセイキット。
  42. 薬剤として使用するための請求項1に記載の方法により同定された、プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  43. プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームB仲介作用を選択的に阻害または刺激するとき使用するための請求項42に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  44. プロゲステロンレセプターアイソフォームBに影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そしてプロゲステロンレセプターアイソフォームA仲介作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項43に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  45. 第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第2選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項42に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  46. 生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用するための、請求項42に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  47. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項45に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  48. 乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項45に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンド。
  49. プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームB仲介作用を選択的に阻害または刺激する薬剤を製造するための、請求項1に記載の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンドの使用。
  50. 第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第2選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項49に記載の使用。
  51. 薬剤を生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用する、請求項49に記載の使用。
  52. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項50に記載の使用。
  53. 乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項49に記載の使用。
  54. 薬剤として使用するための請求項10に記載の方法により同定された、組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  55. 第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第2選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項54に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  56. 生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用するための、請求項54に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  57. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項55に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  58. 乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項54に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  59. 第1および第2組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を選択的にモジューレートする薬剤を製造するための、請求項10に記載の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはB特異的リガンドの使用。
  60. 第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第2選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項59に記載の使用。
  61. 薬剤を生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用する、請求項59に記載の使用。
  62. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項59に記載の使用。
  63. 乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項59に記載の使用。
  64. 治療的有効量の請求項1に記載の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはBを患者に投与する工程を含んでなる、プロゲステロンレセプターアイソフォームAまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームB仲介作用を選択的に阻害または刺激する方法。
  65. 治療的有効量の請求項10に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを患者に投与する工程を含んでなる、選択した組織におけるプロゲステロンレセプター仲介症状を選択的にモジューレートする方法。
  66. プロゲステロンレセプター仲介症状のモジュレーションが第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第2選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持することを含んでなる、請求項65に記載の方法。
  67. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項66に記載の方法。
  68. 乳房組織の増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持することを含んでなる、請求項66に記載の方法。
  69. 組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法において、
    (a) プロゲステロンレセプターリガンドを第1選択組織において少なくとも1つのin vivo試験に付し;
    (b) 前記リガンドを第2選択組織において少なくとも1つのin vivo試験に付し;そして
    (c) 前記第2選択組織に関して前記第1選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を選択的にモジューレートするプロゲステロンレセプターリガンドを選択する;
    工程を含んでなる方法。
  70. 前記プロゲステロンレセプターリガンドが、プロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト/アンタゴニストから成る群から選択される、請求項69に記載の方法。
  71. 工程 (c) において選択したプロゲステロンレセプターリガンドが、前記第1選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第2選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項69に記載の方法。
  72. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項69に記載の方法。
  73. 工程 (c) において選択したプロゲステロンレセプターリガンドが、乳房組織における増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項69に記載の方法。
  74. 請求項69に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  75. プロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト/アンタゴニストから成る群から選択される、請求項74に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  76. 前記プロゲステロンレセプターリガンドが、前記第1選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第2選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項74に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  77. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項76に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  78. 前記リガンドが乳房組織における増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項74に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  79. プロゲステロンレセプターアイソフォームAの転写を選択的に活性化または維持し、そしてプロゲステロンレセプターアイソフォームBの転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項74に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  80. 薬剤として使用するための請求項69に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  81. プロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト/アンタゴニストから成る群から選択される、請求項80に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  82. 前記第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を前記第2選択組織に関して選択的にモジューレートするとき使用するための、請求項80に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  83. 前記第1選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第2選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項82に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  84. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項83に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  85. 前記リガンドが乳房組織における増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項80に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  86. PR−Aの転写を選択的に活性化または維持し、そしてPR−Bの転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項80に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
  87. 第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を第2選択組織に関して選択的にモジューレートする薬剤を製造するための、請求項69に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドの使用。
  88. 前記第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第2選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項87に記載の使用。
  89. 前記第1選択組織が乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項88に記載の使用。
  90. 乳房組織の増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項87に記載の使用。
  91. 薬剤を生殖能のコントロールおよびホルモン置換療法において使用する、請求項87に記載の使用。
  92. 組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがプロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト/アンタゴニストから成る群から選択される、請求項87に記載の使用。
  93. 組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがPR−A転写を選択的に活性化し、そしてPR−B転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項87に記載の使用。
  94. 治療的有効量の請求項69に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを患者に投与する工程を含んでなる、第1選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を第2選択組織に関して選択的にモジューレートする方法。
  95. 前記第1選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第2選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項94に記載の方法。
  96. 前記第1選択組織を乳房組織であり、そして前記第2選択組織が子宮組織である、請求項94に記載の方法。
  97. 組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがプロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト/アンタゴニストから成る群から選択される、請求項94に記載の方法。
  98. 組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがPR−A転写を選択的に活性化し、または維持し、そしてPR−B転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項94に記載の方法。
  99. 乳房組織の増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および/または子宮組織において抗増殖性を選択的に増強または維持することを含んでなる、請求項94に記載の方法。
  100. 請求項69に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを含んでなる医薬組成物。
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