JP2004516037A - ヒト白血球受容体アンタゴニストのスクリーニング・アッセイ - Google Patents
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Abstract
免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法が記載される。前記免疫応答能のあるヒト細胞を、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導することができる条件下で、少なくとも一つの試験化合物の存在下においてインキュベートし、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制が決定される。また、このような方法を使用するためのキット、並びにリガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断することができる免疫調節剤が記載される。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法、前記化合物のスクリーニングに使用するためのキットおよびリガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断し、従ってリガンドで誘導される受容体インターナリゼーション(LIRI)を阻止することができる免疫調節剤に関する。
【0002】
【発明の背景】
成熟したTリンパ球の活性化は、抗原認識および二次性シグナルを必要とし、ひとまとめにして共刺激と呼ばれる(1)。現在、T細胞受容体(TCR)のみを介した抗原認識は、T細胞を活性化することができず、むしろアネルギーとして知られる不応答性状態を誘導すると考えられている。T細胞活性化を最適化するためには、共刺激経路の関与が必要である。静止T細胞に発現した最も特徴づけられた共刺激性受容体は、CD28である。そのリガンドであるCD80およびCD86とCD28との相互作用は、TCR結合を介して開始されるT細胞反応を増強して維持することにおいて重大な役割を演ずる(2)。また、CD2/LFA3、CD40L/CD40、LFA−1/ICAM経路を介した共刺激が実証されている(3)。近年、4−1BBおよびICOSは、共刺激分子として機能していることが発見された(4)。
【0003】
受容体のインターナリゼーションは、長く生物学者を魅了させていた(5)。基本的な機構は完全に解明されていないが、相当な知識が集積されている。特異的mAbsと結合した後の共刺激性受容体のインターナリゼーションが注目されている。近年、天然のリガンドで誘導される受容体のインターナリゼーションは、CD28/B7、CD40/CD154経路について報告されている(6)。
【0004】
共刺激シグナルは、T細胞活性化に対するT細胞による、またはアネルギーによる抗原認識の決定において中心的であるので、自己免疫反応の発生における共刺激の役割は明白である。共刺激シグナルは、これらがサイトカイン産生および細胞崩壊など、T細胞の増殖およびエフェクター細胞の機能を増強するので、TCR結合の結果を決定する二次シグナルを与える。静止している組織抗原提示細胞(APCs)に対する共刺激性因子の不存在下では、自己抗原に対するT細胞寛容性を誘導し、維持させることができ、そのAPCsの共刺激物質の異所性の発現は、自己反応性T細胞を刺激して、自己免疫を生じさせ得ることが示唆されている。実際に、共刺激の遮断により、いくつかの動物の疾患モデルにおける自己免疫反応が改善されることが示されている。また、共刺激分子の遺伝子が遺伝的に削除された「ノックアウトマウス」による証拠は、自己免疫疾患を発生しないか、または少し発生しただけであることを示している。
【0005】
ヒトにおける炎症および自己免疫疾患に共刺激が関与しているため、共刺激経路を遮断することによって異常な反応を改善しようとする多数の研究が行われてきた。無損傷かまたは遺伝的に操作された、受容体もしくはリガンドのいずれかに対するモノクロナール抗体、受容体に結合する免疫グロブリンあついは可溶性リガンドなどの種々の大きな生体分子は、インビトロにおける共刺激の阻害に対して有効であることが示されており、インビボにおける研究から有望な結果も得られている(1)。
【0006】
共刺激性受容体とそのリガンドとの間の結合を特異的に阻害することに焦点を合わせ、共刺激をダウンモジュレートすることができる小分子化合物を同定する努力が最近なされた。このような化合物を同定するために、単離した標的または細胞表面受容体の複雑な分子集合体を介した相互作用によって特徴づけられる細胞の相互作用に基づく方法が使用された。
【0007】
以前に知られている方法では、構成は、典型的にはせいぜい部分的に細胞に基づくだけである。シンチレーション近接アッセイ(SPA)において、たとえば受容体またはこれが存在する膜は、トレーサーを含むビーズに固定されるか、または捕らえられ、適切なリガンドは、放射標識を使って識別される。受容体がトレーサーに結合した場合、ビーズがシンチラントを刺激して光を放射するのためには十分に近くまでラジオアイソトープを連れていく。逆に、受容体結合部位においてラベルのないリガンドまたは競合する薬剤がトレーサーと置き換わる場合、より少ない放射活性がビーズに結合し、その結果としてより少ない光が放射される。したがって、平衡状態では、受容体に対して放射性トレーサーと競合することができる分子の存在を検出することもできるであろう。
【0008】
しかし、これらの従来技術は、試験される化合物のインビボにおける効率および分子相互作用を予測することができないという不利益を有する。さらに、これらは、発現およびタンパク質精製の工程を必要とするので、これらは時間がかかる。通常、該方法は、試験される化合物と長時間共インキュベーションすることを含み、試験化合物における毒性結果をその望ましい効果と区別することは困難であるので、結果として大きな背景「ノイズ」を引き起こす可能性がある。
【0009】
略号リスト
本文の残りの全体にわたって、以下の略記号を使用する:
ACAS 活性化された細胞の解析および分類
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CD 分化のクラスター
FCS ウシ胎仔血清
FACS 蛍光発色セルソーター
FTIC フルオレセインイソチオシアネート
HLA ヒト白血球抗原
ICAM 細胞間接着分子
ICOS 誘導性の共刺激性因子
LFA 白血球機能抗原
LIRI リガンドで誘導されるの受容体インターナリゼーション
PBMC 末しょう血液単核細胞
PFA パラホルムアルデヒド
PE フィコエリトリン
SEA ブドウ状球菌エンテロトキシンA
SPA シンチレーション近接アッセイ
【0010】
【発明の要旨】
本発明は、第一の側面において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法に関する。前記免疫応答性のある細胞を、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導することができる条件下で、少なくとも一つの試験化合物の存在下においてインキュベートし、次いでリガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定する。
【0011】
一つの態様において、本方法における免疫応答性のある細胞は、白血球である。さらなる態様において、前記白血球はリンパ球である。さらにもう一つの態様において、前記リンパ球は、T細胞である。さらにもう一つの態様において、前記T細胞は、Jurkat細胞である。
【0012】
もう一つの態様において、前記白血球は、抗原提示細胞である。さらにもう一つの態様において、前記抗原提示細胞は、B細胞である。
【0013】
さらなる態様において、前記本方法の条件は、少なくとも1つのヒトリガンドをコードするDNAがトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞と共に、免疫応答性のある細胞を培養することを含む。さらなる態様において、前記CHO細胞は、ICAM、CD54(LFA3)、CD40、CD80、CD86、CD154(CD40L)を含む群より選択される少なくとも一つのヒトリガンドまたは受容体をコードするDNAがトランスフェクションされる。
【0014】
本方法のもう一つの態様において、前記試験化合物は、低分子量化合物であり、これは、好ましくは約500までの分子量を有する。
【0015】
本方法のさらに別の態様において、抑制の決定は、細胞のフローサイトメトリまたはコンフォーカル顕微鏡観察によってなされる。
【0016】
本方法は、有利には高内容物スクリーニング(HCS)または培地スループットスクリーニング(MTS)のために自動化される。
【0017】
本方法のもう一つの態様において、前記経路がCD40/CD154(CD40L);CD2/LFA3;CD28/CD80、CD86;およびCD11/ICAMを含む受容体−リガンド対の群より選択される。
【0018】
もう一つの側面において、本発明は、免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングするキットであって、免疫応答能のあるヒト細胞を培養するための手段、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導するための手段、少なくとも一つの試験化合物と共に免疫応答能のあるヒト細胞をインキュベートするための手段、受容体をマーキングするための手段、およびリガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定するための手段を含むキットに関する。
【0019】
前記キットの一態様において、受容体をマーキングするために、同位元素または蛍光性タンパク質との複合物を使用する。
【0020】
前記キットのもう一つの態様において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定することのためにフローサイトメトリー解析またはコンフォーカル顕微鏡解析を使用する。
【0021】
さらにもう一つの側面において、本発明は、リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断することにより、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを阻止することができる免疫調節剤に関する。
【0022】
一つの態様において、免疫調節性薬剤は、低分子量化合物である。さらなる態様において、化合物は約500までの分子量を有する。
【0023】
【発明の詳細な記載】
共刺激は、ヒトTおよびBリンパ球活性化の両者において重大な役割を演ずる。共刺激性経路の遮断は、たとえば異常なT細胞およびB細胞の活性化によって特徴づけられる自己免疫性疾患を改善するであろう。
【0024】
リガンドと受容体との間の相互作用により、受容体のインターナリゼーションを必然的に生じることが確認されるという観察が、特異的且つ高感受性の方法でなされた。競合的結合剤、たとえば受容体またはリガンドに対するモノクロナール抗体の添加により、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーション(LIRI)が遮断された。
【0025】
本発明は、ヒトリンパ球における共刺激性受容体のアンタゴニストを発見するための新規スクリーニング方法を含む。本方法は、たとえばフローサイトメトリー解析に基づいており、このアッセイにより、多数の化合物がスクリーニングされるであろう。たとえば、この方法により、低分子量化合物の分子量321.39のプテリジン誘導体である物質Lが、リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを特異的に遮断することが見出された。
【0026】
このアッセイによって見出された化合物は、LIRIを特異的に抑制し、免疫調節剤のための候補物質とみなされる。
【0027】
現在、物質Lによって例証される小分子量化合物が、特異的にLIRIを抑制することが示されている。これは、小分子量化合物が、天然のリガンドで誘導される膜結合受容体インターナリゼーションを遮断することができるという最初の観測である。これは、該試験化合物をスクリーニングするための方法の有用性を示している。
【0028】
本発明に従った方法は、通常の化合物をスクリーニングする方法である単離された標的または細胞の標品の代わりに、無処理の生細胞を使用する。本発明の方法を使用することにより、細胞表面受容体の複雑な分子集合体を介した相互作用によって特徴づけられる細胞−細胞相互作用の複雑度を考慮することができる。試験した化合物の有効性は、生物学的挙動および機能を測定することによって予測することができる。
【0029】
さらに、該分子の相互作用は、細胞の天然環境内で評価することができ、毒性および非特異的作用を同定することができ、且つ選択的な細胞タイプに対する薬剤の効果を識別することができる。全体細胞アッセイにより、他の方法で必要とされるタンパク質の精製および発現の工程が不要となる。
【0030】
本発明に従った方法において共インキュベーション時間が短いことは、化合物の試験において起こりうる毒性の影響を減軽するが、他の方法では、結果に背景の「ノイズ」を引き起こす可能性がある。
【0031】
【実験的部分】
材料及び方法
細胞
ヒトJurkat T白血病細胞株を、2mMグルタミンおよび10%FCSを補ったRPMI 1640中で培養した。JurkatのサブラインであるCD40L+Jurkat(>95%陽性である)およびCD40L−Jurkat(>99%陰性である)を、FACSソーティングによって確立し、同じ条件下で培養した。
【0032】
ヒトSEA維持T細胞株は、ヒトPBMCをSEA(5nM)で刺激して、SEAを補った培地を5日ごとに交換することによって確立した。
【0033】
Ramos 2G6 4C10(ヒトB細胞株)は、10%FCSを補ったRPMI 1640において培養した。
【0034】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、ヒトHLA−DR4、ICAM−1、CD80、CD86、LFA−3(CD58)、CD40およびCD40L(CD154)をコードするcDNAをトランスフェクションして、細胞株を選択培地中で維持した。本研究において使用した形質転換体細胞株は、以下の通りである:CHO−DR4、CHO−CD28、CHO−LFA3、CHO−CD40、CHO−CD40L、CHO−ICAM1、CHO−DR4−CD80−LFA3。
【0035】
試薬
以下のモノクロナール抗体(mAbs)を使用した:αCD2−FITC(30054X、PharMingen)、αCD3−FITC(30140X、PharMingen)、αCDlla−PE(30425X、PharMingen)、αCD28(クローンCD28.2、Immunotech)、αCD28−FITC(33744X、PharMingen)、αCD28−PE(348047、Becton Dikinson)、αCD40L(33585X、PharMingen)、αCD40−FITC(22074X、PharMingen)、αCD80−PE(340294、Becton Dikinson)、αCD86−PE(33435X、Phar Mingen)、αLFA3−FITC(AHS5808、BioSource)、αICAM−PE(31625X、PharMingen)、αHLA−DR PE(347367Becton Dikinson)、ヤギ−αmIgGl−FITC(M32101、CALTAG)およびウサギ−αmIg−FITC(F0261、DAKO)。
【0036】
分子量321.39のプテリジン誘導体である物質Lは、合成した。
【0037】
細胞培養
Jurkat細胞(lxlO6/ml)は、CHO形質転換体(2xlO5/ml)と共に、12×75mmの培養試験管(ファルコン2052)内で37℃および5%CO2雰囲気において種々の時間培養した。LIRI、CHO形質転換体またはJurkat細胞に対するモノクロナール抗体または物質の効果を観察するために、対応するmAbsまたは物質と共に37℃で30分間インキュベートし、次いでJurkat細胞またはCHO形質転換体と共に培養した。
【0038】
フロー・サイトメーター・アッセイおよびソートを伴う接着細胞解析(ACAS)アッセイ。
【0039】
培養後、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で一回洗浄し、0.5×106/50μlの細胞密度で蛍光結合抗体により4℃で30分間染色した。細胞を二回洗浄してPBSに再懸濁した。FACSにかける前は、細胞を4℃で保持した。細胞サンプルをFACSort(Becton Dikinson)にかけて、Cell Questソフトウェア(Becton Dikinson)で解析した。また、細胞サンプルの一部を双方向レーザ血球計算器(ACAS 570、Ameridian)で解析した。
【0040】
実施例1
CD80およびCD86で誘導されるCD28のダウンモジュレーション。
【0041】
ヒトT細胞は、細胞表面にCD28受容体を発現しており、リガンド(CD80またはCD86)と受容体の結合は、T細胞活性化のための重要な共刺激シグナルを構成する。ヒトT細胞株のJurkat細胞およびリガンドをトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、受容体の運命を観察するために利用した。30分間共インキュベーションした後、細胞を洗浄して、PE結合αCD28 mAbで染色した。FACS解析の結果は、CD80がCD28ダウンモジュレーションを強力に誘導し、CD86は、より低い能力を有することを示す。対照細胞株CHO−DRは、受容体発現を妨げない(図1)。
【0042】
CD28のダウンモジュレーションは、インキュベーション系におけるリガンド数と相関があるかどうか調査するために、Jurkat細胞(0.5xl06/ml)を、Jurkat細胞対CHO/CD80の比が2.5−10:1であるような種々の数のCHO/CD80細胞と共に30分間インキュベートした。結果は、細胞表面にCD80リガンドが多く、CD28受容体が少ないことを明らかに示している(図2A)。対照細胞株(CHO/DR)では、細胞数が多い場合でさえCD28発現をダウンモジュレートすることはない。もう一つの実験セットでは、CD80がCD28ダウンモジュレーションをすみやかに誘導することを示している。Jurkat細胞をCHO/CD80と5:1の比で種々の時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収してFACSで解析した。共インキュベーションから30分後では、表面CD28受容体の約70%がインターナリゼーションされた。2つのタイプの細胞を混合して直ちに遠心分離して染色したとき(「0」時間)でさえ、受容体の約15%はすでにインターナリゼーションされた(図2B)。知っている限り、これは、CD28が天然のリガンドであるCD80と結合することによってすみやかにインターナリゼーションすることを示した最初である。
【0043】
実施例2
LFA3(CD58)で誘導されるCD2のダウンモジュレーション。
【0044】
T細胞上のCD2とAPC細胞上のLFA3との間の相互作用は、T−APC細胞において細胞接着およびT細胞共刺激に重要な役割を演ずる。この実験において、我々は、LFA3が受容体レベルでCD2発現をダウンモジュレートすることを示した。Jurkat細胞を種々のヒト分子をトランスフェクションしたCHO細胞と共に30分間共インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収してαCD2−PEで染色し、CD2の発現をFACSで解析した。CHO形質転換体は、LFA3をトランスフェクションした場合にのみ、CD2ダウンモジュレーションを誘導した(図3)。CHO細胞にトランスフェクションしたその他のヒト分子は、CD2発現を妨害しなかった。CHO/LFA3形質転換体は、CD28またはその他のT細胞受容体の発現を妨害しなかった。LFA3は、通常、CD80がCD28発現に対して誘導するよりも劇的にCD2のダウンモジュレーションを誘導する。我々は文献を検索したが、これは、CD2の天然のリガンドであるLFA3によって誘導されるCD2インターナリゼーションについての最初の観測である。
【0045】
実施例3
CD40およびCD40Lで誘導される互いにダウンモジュレーションを誘導する。
【0046】
CD40L/CD40経路は、TおよびB細胞の両者の活性化のためのもう1つの共刺激経路を誘導し、ヒト自己免疫性疾患に関与している。ヒトB細胞株のRamos 2G6 4C10細胞をCHO/CD40Lまたはコントロール形質転換体と共に2時間インキュベートし、次いでCD40の発現をFACSで解析した。インキュベーション後、その他の接着分子、たとえばCD80、CD86、LFA3、ICAM−1の向上された表面発現と共に、CD40のダウンモジュレーションを観察した。(図4A)。
【0047】
一方、Jurkat細胞におけるCD40Lの発現は、CHO/CD40と種々の時間インキュベーションした後に非常に減少していた。インキュベーション後、CD40Lの発現をFACSで解析した。図4Bの結果は、1時間共インキュベーションした後、Jurkat細胞におけるCD40Lの発現が約80%減少していることを示した。
【0048】
実施例4
初代細胞におけるリガンドで誘導される受容体ダウンモジュレーション。
【0049】
受容体モジュレーションを研究するするために、我々は、ヒト細胞株を使用した。SEA刺激したヒト末しょう血液単核細胞(PBMC)を、種々のヒト分子をトランスフェクションしたCHO細胞と共に30分間共インキュベーションした。細胞をαCD2−PEまたはαCD28−PEで染色して、FACSで解析した。図5の結果は、ヒト初代T細胞の受容体も、リガンドによってダウンモジュレートされることを示す。ヒトPBMCの培養液を超抗原SEAによって維持した。2−3週間後、細胞の99%以上は、CD3+CD8+およびCD2+CD28+であった。これらの細胞をCHO/DR形質転換体と共に培養したときに、CD2またはCD28の発現は影響を受けなかった(図5)。CD2の発現は、CHO/LFA3形質転換体との培養によりダウンモジュレートされ、CD28発現は、細胞をCHO/CD80に暴露することによってダウンモジュレートされた。交叉反応は観察されず、Jurkat/CHO系における特異性がすでに示された。
【0050】
次いで、ヒトSEA刺激したPBMCをCHO形質転換体またはCD54を発現しているヒトB細胞株のRaji細胞と30分間共インキュベートした。CHO細胞およびRaji細胞の一部を4℃において30分間、αICAM−1モノクロナール抗体であらかじめ処理し、二回洗浄した。共インキュベーションした後、細胞をαCDlla−PEで染色してCD11α発現について解析した。図6は、SEA刺激したT細胞上のヒトCDllα(LFA−1)が、リガンドCD54(ICAM−1)をトランスフェクションしたCHO細胞によって適度にダウンモジュレーションされることを示す。また、Raji細胞は、CD11αのダウンモジュレーションを誘導した。両細胞株は、αCD54 mAbで前処理した後に機能を失い、CD11αとCD54のライゲーションがCD11αのダウンモジュレーションを誘導するという強力な証拠となる。我々が知る限り、我々は、CD54がヒトにおいてCD11αのダウンモジュレーションを誘導するという最初の報告をする。
【0051】
実施例5
受容体ダウンモジュレーションの遮断。
【0052】
我々は、受容体とリガンドの相互作用が、活性化シグナルの伝達に必要な、受容体のインターナリゼーションを引き起こすことを示した。理論的には、相互作用を遮断することができる試薬は、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを自然に遮断するであろう。この実験において、我々は、受容体CD28またはリガンドCD80を認識するmAbsがLIRIを抑制することができることを示す(図7)。
【0053】
CHO/CD80形質転換体をαCD80 mAbまたはコントロールmAbと4℃で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄して、Jurkat細胞と37℃において30分間共インキュベートした。CD28受容体の発現をFACSで解析した。
【0054】
次いで、Jurkat細胞をαCD28 mAbと4℃において30分間インキュベートした。2回洗浄した後、Jurkat細胞をCHO/DRまたはCHO/CD80と37℃において30分間インキュベートした。細胞を飽和したαCD28 mAb濃度(10μg/ml)で、再び4℃で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞をFITC結合ウサギ抗マウスIgで染色した。CD28受容体の総発現をFACSで解析した。
【0055】
CHO/CD80をαCD80で処理した場合(図7A)またはJurkat細胞をαCD28 mAb出前処理した場合(図7B)、受容体インターナリゼーションは抑制された。すなわち、Jurkat細胞上により多くの受容体が保持された。コントロールmAbsは、いずれの効果も示さなかった。
【0056】
CHO/CD40およびRaji細胞をマウス抗ヒトCD40 mAb(5μg/ml)またはコントロールmIgGで30分間前処理した。次いで、CD40L+Jurkat細胞を、前処理した細胞と30分間インキュベートした。CD40L+Jurekat細胞におけるCD40Lの発現をFACSで解析した。αCD40 mAbでCHO/CD40またはRaji細胞を前処理することにより、CD40の機能が減少されてCD40Lダウンモジュレーションを誘導した(図8)。
【0057】
実施例6
T細胞活性化の遮断。
【0058】
SEAの存在下でCHO/DR/CD80細胞と培養した場合には、Jurkat細胞は、完全に活性化されて、最も重要なT細胞増殖因子のうちの1つであるIL−2を産生するであろう。この培養系において、SEAは、HLA−DR分子に結合して、CHO/DR/CD80細胞表面にSEA−DRの複合体が形成される。Jurkat細胞の表面のCD3/TCRは、複合体を認識し、2つの部分の相互作用がT細胞に対する第一の活性化シグナルを構成する。共刺激シグナルは、CD28(Jurkat細胞上の)とCD80(CHO/DR/CD80上の)との間の結合によって完了される完全なT細胞活性化に必要である。
【0059】
種々の濃度のαCD28 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞を、CHO/DR/CD80形質転換体および超抗原SEA(5nM)と18時間共培養した。培養上清中に放出されたIL−2をELISAで決定した。
【0060】
αCD2 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞を、CHO/DR/LFA3形質転換体と18時間共培養した。上澄のIL−2をELISAで決定した。
【0061】
Jurkat細胞をmAbsで前処理した場合、リガンドで誘導されるの受容体インターナリゼーションを遮断できることが示されており、T細胞活性化は弱められた。αCD28 mAbsは、Jurkat−CHO/DR/CD80系におけるIL−2産生をすっかり消失させ、αCD2 mAbも、濃度依存的にJurkat CHO/DR/LFA3系におけるT細胞活性化を抑制した。コントロールmAb(aEMBP)は、いずれの系においてもT細胞活性化を妨害しなかった(図9)。また、リガンド(CD80またはLFA3)に対するmAbsは、IL−2産生を減少したが、あまりよく効かなかった。
【0062】
実施例7
リガンドと相互作用した後の共刺激性受容体インターナリゼーション。
【0063】
リガンドによって誘導されるヒトリンパ球表面受容体のダウンモジュレーションは、複雑なプロセスであり、含まれる機構は完全に説明されていない。この実験において、我々は、CD2およびCD40Lが該リガンドと相互作用した後にインターナリゼーションされることを示す。
【0064】
Jurkat細胞をCHO/LFA3またはCHO/CD40と1時間培養した。培養後、細胞の一部を4%のPFAで固定化して、0.1%サポニンで透過化処理し、αCD2またはαCD40L mAbsで染色した。細胞内に保持された受容体のパーセンテージを表した。陽性細胞の頻度を表した。
【0065】
表面発現は、CD2について70%およびCD40Lについて80%まで、これらのリガンドとインキュベーションした後に減少していた。細胞を透過化処理して、細胞内受容体に結合したmAbsを取り込ませた。透過化処理後、CD2およびCD40L発現は、それぞれ約60%増加し、受容体インターナリゼーション(エンドサイトーシスとも呼ばる)が、表面受容体の消失の原因であることの手堅い証拠である(図10A)。Jurkat細胞は、どちらの受容体も細胞内に発現していない(データ示さず)。80%以上のCD40L+−Jurkat細胞は、表面CD40Lを発現し、約30%だけがリガンド結合後も陽性のままであった。透過化処理後、αCD40L染色では、細胞の60%以上がCD40L陽性であることをを示した(図10B)。
【0066】
実施例8
物質Lは、リガンドAで誘導される受容体Aのダウンモジュレーションを遮断する。
【0067】
生化学スクリーニング・プログラムにより、分子量321.39を有するプテリジン誘導体である物質Lは、受容体とそのリガンドとの間の結合を遮断することが示されている。該物質を本システムのLIRIアッセイで試験した。
【0068】
Jurkat細胞をCHO/リガンドAまたはCHO/リガンドBの形質転換体と共に、種々の濃度の物質Lを添加して15分間共インキュベートした。受容体A(CHO/リガンドAとの培養において)および受容体B(CHO/リガンドBとの培養において)の発現をFACSで分析した。
【0069】
結果は、リガンドAで誘導される受容体Aのダウンモジュレーションは、リガンドAを有するCHO細胞を物質Lで前処理することにより濃度依存的に阻害されたこと、または該物質で前処理された、リガンドを有するCHO細胞とインキュベーションした後に、より多くの受容体Aが細胞表面に保持されたことを示した。物質Lは、リガンドBで誘導される受容体Bのダウンモジュレーションを妨害しなかった(図11)。
【0070】
実施例9
ヒトCD80は、CTLA−4のダウンモジュレーションを誘導する。
【0071】
材料および方法
細胞培養
ヒト末しょう血単核細胞(PBMC)をバフィーコートから分離して、10%仔ウシ胎児血清およびSEE(5nM)を補ったRPMI 1640中で72時間培養した。リガンドCD80によるCTLA−4のモジュレーションを研究するために、SEEで活性化した細胞をCHO/C80形質転換体と共に、5:1の比で37℃において30分間インキュベートした。細胞を洗浄してPE結合αCTLA−4で染色し(PharMingen、カタログ番号555853)、FACSで解析した。
【0072】
結果
CD80によるCTLA−4のダウンモジュレーション
ヒト静止T細胞は、細胞表面にCTLA−4を発現しない(データ示さず)。SEEで活性化した後、ヒトPBMCは、細胞サイズによって2群に分けることができる。図12による結果は、80%程度の大細胞は、その他のT活性化マーカー(CD25、CD56、CD69)の向上された発現とともに、CTLA−4を発現する。小細胞は、静止PBMCと同様の表現型のままであった。
【0073】
活性化後、PBMC細胞をCHO/CD80細胞と混合して、さらに30分間インキュベートした。CTLA−4のモジュレーションをFACSで解析した。図13による結果は、CTLA−4の発現がCD80によってダウンモジュレートされたことを示す。並行して培養した結果では、CD28およびCD2も、それぞれCD80およびLFA3形質転換体によってダウンモジュレートされ、LFA3は、CTLA−4の発現をモジュレートしないことを示した(データ示さず)。これらの結果は、誘導性のヒトT細胞共刺激性受容体であるCTLA−4は、対受容体(counterreceptor)のCD80と相互作用することによってもダウンモジュレートされ、CTLA−4のモジュレーションに厳密な特異性が存在することを示している。
【0074】
【参照文献】
1. Tivol, A E et al,”Co−stimulation and autoimmunity”, Current Opinion in Immunology, 8, pp 822−830 (1996).
2. June, C H et al,”Role of the CD28 receptor in T cell activation”, Immunology Today, 11, pp 211−216 (1990).
3. Wingren, A G et al,”T cell activation pathways: B7, LFA−3, and ICAM−1 shape unique T cell profiles”, Crit Rev Immunol, 15, pp 235−253 (1995).
4. Melero, I et al,”Monoclonal antibodies against 4−1 BB T cell activation molecule eradicate established tumors”, Nature Medicine, 6 pp 682−685 (1997).
5. Marsh, M et al,”The structural era of endocytosis”, Science, 285, pp 215−220 (July 1999).
6. Eck, S C et al,”Differential down−regulation of CD28 by B7−1 and B7−2 engagement”, Transplantation, 64, pp 1497−1499 (Nov 1997).
【図面の簡単な説明】
【図1】
ヒトCD80およびCD86は、CD28受容体のダウンレギュレーションを誘導する。
【図2A】
CD80によって誘導されるCD28のダウンレギュレーションの用量依存および時間経過。A:Jurkat細胞を種々の数のCHO/CD80細胞と培養した。
【図2B】
CD80によって誘導されるCD28のダウンレギュレーションの用量依存および時間経過。B:Jurkat細胞を5:1の比のCHO/CD80と共に種々の時間インキュベートした。
【図3】
LFA3(CD58)は、T細胞におけるCD2発現をダウンモジュレートする。
【図4A】
ヒトCD40LおよびCD40は、各々をダウンレギュレートする。A:ヒトB細胞株Ramos 2G6 4C10細胞をCHO形質転換体と共インキュベートした。
【図4B】
ヒトCD40LおよびCD40は、各々をダウンレギュレートする。B:CD40L+−Jurkat細胞をCHO/DRまたはCHO/DR/CD40細胞と種々の時間インキュベートした。
【図5】
LFA−3およびCD80は、ヒトPBMCにおいてCD2およびCD28受容体のダウンモジュレーションを誘導する
【図6】
ヒトICAM1(CD54)は、CDlla(LFA−1)をダウンモジュレートし、αICAM1 mAbは、効果を遮断する。
【図7A】
CHO/CD80におけるCD80またはJurkatにおけるCD28のmAbsによる前処理は、CD80誘導のCD28ダウンモジュレーションを遮断する。A:CHO/CD80形質転換体をαCD80 mAbまたはコントロールmAbとインキュベートした。
【図7B】
CHO/CD80におけるCD80またはJurkatにおけるCD28のmAbsによる前処理は、CD80誘導のCD28ダウンモジュレーションを遮断する。B:Jurkat細胞をαCD28 mAbとインキュベートした。
【図8】
αCD40 mAbによるCHO/CD40またはRaji細胞の前処理。
【図9A】
共刺激性受容体のダウンモジュレーションを遮断するmAbsは、T細胞活性化も遮断する。A:種々の濃度のαCD28 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞をCHO/DR/CD80形質転換体および超抗原SEEと共培養した。
【図9B】
共刺激性受容体のダウンモジュレーションを遮断するmAbsは、T細胞活性化も遮断する。B:αCD2 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞をCHO/DR/LFA3形質転換体と共培養した。
【図10A】
細胞内染色では、受容体がリガンドと相互作用した後にインターナリゼーションすることを示す。A:Jurkat細胞をCHO/LFA3またはCHO/CD40と培養した。
【図10B】
細胞内染色では、受容体がリガンドと相互作用した後にインターナリゼーションすることを示す。B:培養条件及び細胞内染色の手順はAの記載と同様である。
【図11】
物質Lは、リガンドA誘導の受容体Aのダウンモジュレーションを特異的に抑制する。
【図12】
ヒトT細胞におけるCTLA−4の誘導。ヒトPBMCをSEE(5nM)で72時間活性化して、FACSによって表現型的に分析した。
【図13】
CD80は、SEEで活性化されたヒトPBMCにおけるCTLA−4の発現をダウンモジュレートする。SEE(5nM)で72時間活性化されたヒトPBMCをCHO/CD80と混合して30分間インキュベートした。CTLA−4の発現をFACSによって分析した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法、前記化合物のスクリーニングに使用するためのキットおよびリガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断し、従ってリガンドで誘導される受容体インターナリゼーション(LIRI)を阻止することができる免疫調節剤に関する。
【0002】
【発明の背景】
成熟したTリンパ球の活性化は、抗原認識および二次性シグナルを必要とし、ひとまとめにして共刺激と呼ばれる(1)。現在、T細胞受容体(TCR)のみを介した抗原認識は、T細胞を活性化することができず、むしろアネルギーとして知られる不応答性状態を誘導すると考えられている。T細胞活性化を最適化するためには、共刺激経路の関与が必要である。静止T細胞に発現した最も特徴づけられた共刺激性受容体は、CD28である。そのリガンドであるCD80およびCD86とCD28との相互作用は、TCR結合を介して開始されるT細胞反応を増強して維持することにおいて重大な役割を演ずる(2)。また、CD2/LFA3、CD40L/CD40、LFA−1/ICAM経路を介した共刺激が実証されている(3)。近年、4−1BBおよびICOSは、共刺激分子として機能していることが発見された(4)。
【0003】
受容体のインターナリゼーションは、長く生物学者を魅了させていた(5)。基本的な機構は完全に解明されていないが、相当な知識が集積されている。特異的mAbsと結合した後の共刺激性受容体のインターナリゼーションが注目されている。近年、天然のリガンドで誘導される受容体のインターナリゼーションは、CD28/B7、CD40/CD154経路について報告されている(6)。
【0004】
共刺激シグナルは、T細胞活性化に対するT細胞による、またはアネルギーによる抗原認識の決定において中心的であるので、自己免疫反応の発生における共刺激の役割は明白である。共刺激シグナルは、これらがサイトカイン産生および細胞崩壊など、T細胞の増殖およびエフェクター細胞の機能を増強するので、TCR結合の結果を決定する二次シグナルを与える。静止している組織抗原提示細胞(APCs)に対する共刺激性因子の不存在下では、自己抗原に対するT細胞寛容性を誘導し、維持させることができ、そのAPCsの共刺激物質の異所性の発現は、自己反応性T細胞を刺激して、自己免疫を生じさせ得ることが示唆されている。実際に、共刺激の遮断により、いくつかの動物の疾患モデルにおける自己免疫反応が改善されることが示されている。また、共刺激分子の遺伝子が遺伝的に削除された「ノックアウトマウス」による証拠は、自己免疫疾患を発生しないか、または少し発生しただけであることを示している。
【0005】
ヒトにおける炎症および自己免疫疾患に共刺激が関与しているため、共刺激経路を遮断することによって異常な反応を改善しようとする多数の研究が行われてきた。無損傷かまたは遺伝的に操作された、受容体もしくはリガンドのいずれかに対するモノクロナール抗体、受容体に結合する免疫グロブリンあついは可溶性リガンドなどの種々の大きな生体分子は、インビトロにおける共刺激の阻害に対して有効であることが示されており、インビボにおける研究から有望な結果も得られている(1)。
【0006】
共刺激性受容体とそのリガンドとの間の結合を特異的に阻害することに焦点を合わせ、共刺激をダウンモジュレートすることができる小分子化合物を同定する努力が最近なされた。このような化合物を同定するために、単離した標的または細胞表面受容体の複雑な分子集合体を介した相互作用によって特徴づけられる細胞の相互作用に基づく方法が使用された。
【0007】
以前に知られている方法では、構成は、典型的にはせいぜい部分的に細胞に基づくだけである。シンチレーション近接アッセイ(SPA)において、たとえば受容体またはこれが存在する膜は、トレーサーを含むビーズに固定されるか、または捕らえられ、適切なリガンドは、放射標識を使って識別される。受容体がトレーサーに結合した場合、ビーズがシンチラントを刺激して光を放射するのためには十分に近くまでラジオアイソトープを連れていく。逆に、受容体結合部位においてラベルのないリガンドまたは競合する薬剤がトレーサーと置き換わる場合、より少ない放射活性がビーズに結合し、その結果としてより少ない光が放射される。したがって、平衡状態では、受容体に対して放射性トレーサーと競合することができる分子の存在を検出することもできるであろう。
【0008】
しかし、これらの従来技術は、試験される化合物のインビボにおける効率および分子相互作用を予測することができないという不利益を有する。さらに、これらは、発現およびタンパク質精製の工程を必要とするので、これらは時間がかかる。通常、該方法は、試験される化合物と長時間共インキュベーションすることを含み、試験化合物における毒性結果をその望ましい効果と区別することは困難であるので、結果として大きな背景「ノイズ」を引き起こす可能性がある。
【0009】
略号リスト
本文の残りの全体にわたって、以下の略記号を使用する:
ACAS 活性化された細胞の解析および分類
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CD 分化のクラスター
FCS ウシ胎仔血清
FACS 蛍光発色セルソーター
FTIC フルオレセインイソチオシアネート
HLA ヒト白血球抗原
ICAM 細胞間接着分子
ICOS 誘導性の共刺激性因子
LFA 白血球機能抗原
LIRI リガンドで誘導されるの受容体インターナリゼーション
PBMC 末しょう血液単核細胞
PFA パラホルムアルデヒド
PE フィコエリトリン
SEA ブドウ状球菌エンテロトキシンA
SPA シンチレーション近接アッセイ
【0010】
【発明の要旨】
本発明は、第一の側面において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法に関する。前記免疫応答性のある細胞を、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導することができる条件下で、少なくとも一つの試験化合物の存在下においてインキュベートし、次いでリガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定する。
【0011】
一つの態様において、本方法における免疫応答性のある細胞は、白血球である。さらなる態様において、前記白血球はリンパ球である。さらにもう一つの態様において、前記リンパ球は、T細胞である。さらにもう一つの態様において、前記T細胞は、Jurkat細胞である。
【0012】
もう一つの態様において、前記白血球は、抗原提示細胞である。さらにもう一つの態様において、前記抗原提示細胞は、B細胞である。
【0013】
さらなる態様において、前記本方法の条件は、少なくとも1つのヒトリガンドをコードするDNAがトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞と共に、免疫応答性のある細胞を培養することを含む。さらなる態様において、前記CHO細胞は、ICAM、CD54(LFA3)、CD40、CD80、CD86、CD154(CD40L)を含む群より選択される少なくとも一つのヒトリガンドまたは受容体をコードするDNAがトランスフェクションされる。
【0014】
本方法のもう一つの態様において、前記試験化合物は、低分子量化合物であり、これは、好ましくは約500までの分子量を有する。
【0015】
本方法のさらに別の態様において、抑制の決定は、細胞のフローサイトメトリまたはコンフォーカル顕微鏡観察によってなされる。
【0016】
本方法は、有利には高内容物スクリーニング(HCS)または培地スループットスクリーニング(MTS)のために自動化される。
【0017】
本方法のもう一つの態様において、前記経路がCD40/CD154(CD40L);CD2/LFA3;CD28/CD80、CD86;およびCD11/ICAMを含む受容体−リガンド対の群より選択される。
【0018】
もう一つの側面において、本発明は、免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングするキットであって、免疫応答能のあるヒト細胞を培養するための手段、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導するための手段、少なくとも一つの試験化合物と共に免疫応答能のあるヒト細胞をインキュベートするための手段、受容体をマーキングするための手段、およびリガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定するための手段を含むキットに関する。
【0019】
前記キットの一態様において、受容体をマーキングするために、同位元素または蛍光性タンパク質との複合物を使用する。
【0020】
前記キットのもう一つの態様において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定することのためにフローサイトメトリー解析またはコンフォーカル顕微鏡解析を使用する。
【0021】
さらにもう一つの側面において、本発明は、リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断することにより、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを阻止することができる免疫調節剤に関する。
【0022】
一つの態様において、免疫調節性薬剤は、低分子量化合物である。さらなる態様において、化合物は約500までの分子量を有する。
【0023】
【発明の詳細な記載】
共刺激は、ヒトTおよびBリンパ球活性化の両者において重大な役割を演ずる。共刺激性経路の遮断は、たとえば異常なT細胞およびB細胞の活性化によって特徴づけられる自己免疫性疾患を改善するであろう。
【0024】
リガンドと受容体との間の相互作用により、受容体のインターナリゼーションを必然的に生じることが確認されるという観察が、特異的且つ高感受性の方法でなされた。競合的結合剤、たとえば受容体またはリガンドに対するモノクロナール抗体の添加により、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーション(LIRI)が遮断された。
【0025】
本発明は、ヒトリンパ球における共刺激性受容体のアンタゴニストを発見するための新規スクリーニング方法を含む。本方法は、たとえばフローサイトメトリー解析に基づいており、このアッセイにより、多数の化合物がスクリーニングされるであろう。たとえば、この方法により、低分子量化合物の分子量321.39のプテリジン誘導体である物質Lが、リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを特異的に遮断することが見出された。
【0026】
このアッセイによって見出された化合物は、LIRIを特異的に抑制し、免疫調節剤のための候補物質とみなされる。
【0027】
現在、物質Lによって例証される小分子量化合物が、特異的にLIRIを抑制することが示されている。これは、小分子量化合物が、天然のリガンドで誘導される膜結合受容体インターナリゼーションを遮断することができるという最初の観測である。これは、該試験化合物をスクリーニングするための方法の有用性を示している。
【0028】
本発明に従った方法は、通常の化合物をスクリーニングする方法である単離された標的または細胞の標品の代わりに、無処理の生細胞を使用する。本発明の方法を使用することにより、細胞表面受容体の複雑な分子集合体を介した相互作用によって特徴づけられる細胞−細胞相互作用の複雑度を考慮することができる。試験した化合物の有効性は、生物学的挙動および機能を測定することによって予測することができる。
【0029】
さらに、該分子の相互作用は、細胞の天然環境内で評価することができ、毒性および非特異的作用を同定することができ、且つ選択的な細胞タイプに対する薬剤の効果を識別することができる。全体細胞アッセイにより、他の方法で必要とされるタンパク質の精製および発現の工程が不要となる。
【0030】
本発明に従った方法において共インキュベーション時間が短いことは、化合物の試験において起こりうる毒性の影響を減軽するが、他の方法では、結果に背景の「ノイズ」を引き起こす可能性がある。
【0031】
【実験的部分】
材料及び方法
細胞
ヒトJurkat T白血病細胞株を、2mMグルタミンおよび10%FCSを補ったRPMI 1640中で培養した。JurkatのサブラインであるCD40L+Jurkat(>95%陽性である)およびCD40L−Jurkat(>99%陰性である)を、FACSソーティングによって確立し、同じ条件下で培養した。
【0032】
ヒトSEA維持T細胞株は、ヒトPBMCをSEA(5nM)で刺激して、SEAを補った培地を5日ごとに交換することによって確立した。
【0033】
Ramos 2G6 4C10(ヒトB細胞株)は、10%FCSを補ったRPMI 1640において培養した。
【0034】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、ヒトHLA−DR4、ICAM−1、CD80、CD86、LFA−3(CD58)、CD40およびCD40L(CD154)をコードするcDNAをトランスフェクションして、細胞株を選択培地中で維持した。本研究において使用した形質転換体細胞株は、以下の通りである:CHO−DR4、CHO−CD28、CHO−LFA3、CHO−CD40、CHO−CD40L、CHO−ICAM1、CHO−DR4−CD80−LFA3。
【0035】
試薬
以下のモノクロナール抗体(mAbs)を使用した:αCD2−FITC(30054X、PharMingen)、αCD3−FITC(30140X、PharMingen)、αCDlla−PE(30425X、PharMingen)、αCD28(クローンCD28.2、Immunotech)、αCD28−FITC(33744X、PharMingen)、αCD28−PE(348047、Becton Dikinson)、αCD40L(33585X、PharMingen)、αCD40−FITC(22074X、PharMingen)、αCD80−PE(340294、Becton Dikinson)、αCD86−PE(33435X、Phar Mingen)、αLFA3−FITC(AHS5808、BioSource)、αICAM−PE(31625X、PharMingen)、αHLA−DR PE(347367Becton Dikinson)、ヤギ−αmIgGl−FITC(M32101、CALTAG)およびウサギ−αmIg−FITC(F0261、DAKO)。
【0036】
分子量321.39のプテリジン誘導体である物質Lは、合成した。
【0037】
細胞培養
Jurkat細胞(lxlO6/ml)は、CHO形質転換体(2xlO5/ml)と共に、12×75mmの培養試験管(ファルコン2052)内で37℃および5%CO2雰囲気において種々の時間培養した。LIRI、CHO形質転換体またはJurkat細胞に対するモノクロナール抗体または物質の効果を観察するために、対応するmAbsまたは物質と共に37℃で30分間インキュベートし、次いでJurkat細胞またはCHO形質転換体と共に培養した。
【0038】
フロー・サイトメーター・アッセイおよびソートを伴う接着細胞解析(ACAS)アッセイ。
【0039】
培養後、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で一回洗浄し、0.5×106/50μlの細胞密度で蛍光結合抗体により4℃で30分間染色した。細胞を二回洗浄してPBSに再懸濁した。FACSにかける前は、細胞を4℃で保持した。細胞サンプルをFACSort(Becton Dikinson)にかけて、Cell Questソフトウェア(Becton Dikinson)で解析した。また、細胞サンプルの一部を双方向レーザ血球計算器(ACAS 570、Ameridian)で解析した。
【0040】
実施例1
CD80およびCD86で誘導されるCD28のダウンモジュレーション。
【0041】
ヒトT細胞は、細胞表面にCD28受容体を発現しており、リガンド(CD80またはCD86)と受容体の結合は、T細胞活性化のための重要な共刺激シグナルを構成する。ヒトT細胞株のJurkat細胞およびリガンドをトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、受容体の運命を観察するために利用した。30分間共インキュベーションした後、細胞を洗浄して、PE結合αCD28 mAbで染色した。FACS解析の結果は、CD80がCD28ダウンモジュレーションを強力に誘導し、CD86は、より低い能力を有することを示す。対照細胞株CHO−DRは、受容体発現を妨げない(図1)。
【0042】
CD28のダウンモジュレーションは、インキュベーション系におけるリガンド数と相関があるかどうか調査するために、Jurkat細胞(0.5xl06/ml)を、Jurkat細胞対CHO/CD80の比が2.5−10:1であるような種々の数のCHO/CD80細胞と共に30分間インキュベートした。結果は、細胞表面にCD80リガンドが多く、CD28受容体が少ないことを明らかに示している(図2A)。対照細胞株(CHO/DR)では、細胞数が多い場合でさえCD28発現をダウンモジュレートすることはない。もう一つの実験セットでは、CD80がCD28ダウンモジュレーションをすみやかに誘導することを示している。Jurkat細胞をCHO/CD80と5:1の比で種々の時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収してFACSで解析した。共インキュベーションから30分後では、表面CD28受容体の約70%がインターナリゼーションされた。2つのタイプの細胞を混合して直ちに遠心分離して染色したとき(「0」時間)でさえ、受容体の約15%はすでにインターナリゼーションされた(図2B)。知っている限り、これは、CD28が天然のリガンドであるCD80と結合することによってすみやかにインターナリゼーションすることを示した最初である。
【0043】
実施例2
LFA3(CD58)で誘導されるCD2のダウンモジュレーション。
【0044】
T細胞上のCD2とAPC細胞上のLFA3との間の相互作用は、T−APC細胞において細胞接着およびT細胞共刺激に重要な役割を演ずる。この実験において、我々は、LFA3が受容体レベルでCD2発現をダウンモジュレートすることを示した。Jurkat細胞を種々のヒト分子をトランスフェクションしたCHO細胞と共に30分間共インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収してαCD2−PEで染色し、CD2の発現をFACSで解析した。CHO形質転換体は、LFA3をトランスフェクションした場合にのみ、CD2ダウンモジュレーションを誘導した(図3)。CHO細胞にトランスフェクションしたその他のヒト分子は、CD2発現を妨害しなかった。CHO/LFA3形質転換体は、CD28またはその他のT細胞受容体の発現を妨害しなかった。LFA3は、通常、CD80がCD28発現に対して誘導するよりも劇的にCD2のダウンモジュレーションを誘導する。我々は文献を検索したが、これは、CD2の天然のリガンドであるLFA3によって誘導されるCD2インターナリゼーションについての最初の観測である。
【0045】
実施例3
CD40およびCD40Lで誘導される互いにダウンモジュレーションを誘導する。
【0046】
CD40L/CD40経路は、TおよびB細胞の両者の活性化のためのもう1つの共刺激経路を誘導し、ヒト自己免疫性疾患に関与している。ヒトB細胞株のRamos 2G6 4C10細胞をCHO/CD40Lまたはコントロール形質転換体と共に2時間インキュベートし、次いでCD40の発現をFACSで解析した。インキュベーション後、その他の接着分子、たとえばCD80、CD86、LFA3、ICAM−1の向上された表面発現と共に、CD40のダウンモジュレーションを観察した。(図4A)。
【0047】
一方、Jurkat細胞におけるCD40Lの発現は、CHO/CD40と種々の時間インキュベーションした後に非常に減少していた。インキュベーション後、CD40Lの発現をFACSで解析した。図4Bの結果は、1時間共インキュベーションした後、Jurkat細胞におけるCD40Lの発現が約80%減少していることを示した。
【0048】
実施例4
初代細胞におけるリガンドで誘導される受容体ダウンモジュレーション。
【0049】
受容体モジュレーションを研究するするために、我々は、ヒト細胞株を使用した。SEA刺激したヒト末しょう血液単核細胞(PBMC)を、種々のヒト分子をトランスフェクションしたCHO細胞と共に30分間共インキュベーションした。細胞をαCD2−PEまたはαCD28−PEで染色して、FACSで解析した。図5の結果は、ヒト初代T細胞の受容体も、リガンドによってダウンモジュレートされることを示す。ヒトPBMCの培養液を超抗原SEAによって維持した。2−3週間後、細胞の99%以上は、CD3+CD8+およびCD2+CD28+であった。これらの細胞をCHO/DR形質転換体と共に培養したときに、CD2またはCD28の発現は影響を受けなかった(図5)。CD2の発現は、CHO/LFA3形質転換体との培養によりダウンモジュレートされ、CD28発現は、細胞をCHO/CD80に暴露することによってダウンモジュレートされた。交叉反応は観察されず、Jurkat/CHO系における特異性がすでに示された。
【0050】
次いで、ヒトSEA刺激したPBMCをCHO形質転換体またはCD54を発現しているヒトB細胞株のRaji細胞と30分間共インキュベートした。CHO細胞およびRaji細胞の一部を4℃において30分間、αICAM−1モノクロナール抗体であらかじめ処理し、二回洗浄した。共インキュベーションした後、細胞をαCDlla−PEで染色してCD11α発現について解析した。図6は、SEA刺激したT細胞上のヒトCDllα(LFA−1)が、リガンドCD54(ICAM−1)をトランスフェクションしたCHO細胞によって適度にダウンモジュレーションされることを示す。また、Raji細胞は、CD11αのダウンモジュレーションを誘導した。両細胞株は、αCD54 mAbで前処理した後に機能を失い、CD11αとCD54のライゲーションがCD11αのダウンモジュレーションを誘導するという強力な証拠となる。我々が知る限り、我々は、CD54がヒトにおいてCD11αのダウンモジュレーションを誘導するという最初の報告をする。
【0051】
実施例5
受容体ダウンモジュレーションの遮断。
【0052】
我々は、受容体とリガンドの相互作用が、活性化シグナルの伝達に必要な、受容体のインターナリゼーションを引き起こすことを示した。理論的には、相互作用を遮断することができる試薬は、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを自然に遮断するであろう。この実験において、我々は、受容体CD28またはリガンドCD80を認識するmAbsがLIRIを抑制することができることを示す(図7)。
【0053】
CHO/CD80形質転換体をαCD80 mAbまたはコントロールmAbと4℃で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄して、Jurkat細胞と37℃において30分間共インキュベートした。CD28受容体の発現をFACSで解析した。
【0054】
次いで、Jurkat細胞をαCD28 mAbと4℃において30分間インキュベートした。2回洗浄した後、Jurkat細胞をCHO/DRまたはCHO/CD80と37℃において30分間インキュベートした。細胞を飽和したαCD28 mAb濃度(10μg/ml)で、再び4℃で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞をFITC結合ウサギ抗マウスIgで染色した。CD28受容体の総発現をFACSで解析した。
【0055】
CHO/CD80をαCD80で処理した場合(図7A)またはJurkat細胞をαCD28 mAb出前処理した場合(図7B)、受容体インターナリゼーションは抑制された。すなわち、Jurkat細胞上により多くの受容体が保持された。コントロールmAbsは、いずれの効果も示さなかった。
【0056】
CHO/CD40およびRaji細胞をマウス抗ヒトCD40 mAb(5μg/ml)またはコントロールmIgGで30分間前処理した。次いで、CD40L+Jurkat細胞を、前処理した細胞と30分間インキュベートした。CD40L+Jurekat細胞におけるCD40Lの発現をFACSで解析した。αCD40 mAbでCHO/CD40またはRaji細胞を前処理することにより、CD40の機能が減少されてCD40Lダウンモジュレーションを誘導した(図8)。
【0057】
実施例6
T細胞活性化の遮断。
【0058】
SEAの存在下でCHO/DR/CD80細胞と培養した場合には、Jurkat細胞は、完全に活性化されて、最も重要なT細胞増殖因子のうちの1つであるIL−2を産生するであろう。この培養系において、SEAは、HLA−DR分子に結合して、CHO/DR/CD80細胞表面にSEA−DRの複合体が形成される。Jurkat細胞の表面のCD3/TCRは、複合体を認識し、2つの部分の相互作用がT細胞に対する第一の活性化シグナルを構成する。共刺激シグナルは、CD28(Jurkat細胞上の)とCD80(CHO/DR/CD80上の)との間の結合によって完了される完全なT細胞活性化に必要である。
【0059】
種々の濃度のαCD28 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞を、CHO/DR/CD80形質転換体および超抗原SEA(5nM)と18時間共培養した。培養上清中に放出されたIL−2をELISAで決定した。
【0060】
αCD2 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞を、CHO/DR/LFA3形質転換体と18時間共培養した。上澄のIL−2をELISAで決定した。
【0061】
Jurkat細胞をmAbsで前処理した場合、リガンドで誘導されるの受容体インターナリゼーションを遮断できることが示されており、T細胞活性化は弱められた。αCD28 mAbsは、Jurkat−CHO/DR/CD80系におけるIL−2産生をすっかり消失させ、αCD2 mAbも、濃度依存的にJurkat CHO/DR/LFA3系におけるT細胞活性化を抑制した。コントロールmAb(aEMBP)は、いずれの系においてもT細胞活性化を妨害しなかった(図9)。また、リガンド(CD80またはLFA3)に対するmAbsは、IL−2産生を減少したが、あまりよく効かなかった。
【0062】
実施例7
リガンドと相互作用した後の共刺激性受容体インターナリゼーション。
【0063】
リガンドによって誘導されるヒトリンパ球表面受容体のダウンモジュレーションは、複雑なプロセスであり、含まれる機構は完全に説明されていない。この実験において、我々は、CD2およびCD40Lが該リガンドと相互作用した後にインターナリゼーションされることを示す。
【0064】
Jurkat細胞をCHO/LFA3またはCHO/CD40と1時間培養した。培養後、細胞の一部を4%のPFAで固定化して、0.1%サポニンで透過化処理し、αCD2またはαCD40L mAbsで染色した。細胞内に保持された受容体のパーセンテージを表した。陽性細胞の頻度を表した。
【0065】
表面発現は、CD2について70%およびCD40Lについて80%まで、これらのリガンドとインキュベーションした後に減少していた。細胞を透過化処理して、細胞内受容体に結合したmAbsを取り込ませた。透過化処理後、CD2およびCD40L発現は、それぞれ約60%増加し、受容体インターナリゼーション(エンドサイトーシスとも呼ばる)が、表面受容体の消失の原因であることの手堅い証拠である(図10A)。Jurkat細胞は、どちらの受容体も細胞内に発現していない(データ示さず)。80%以上のCD40L+−Jurkat細胞は、表面CD40Lを発現し、約30%だけがリガンド結合後も陽性のままであった。透過化処理後、αCD40L染色では、細胞の60%以上がCD40L陽性であることをを示した(図10B)。
【0066】
実施例8
物質Lは、リガンドAで誘導される受容体Aのダウンモジュレーションを遮断する。
【0067】
生化学スクリーニング・プログラムにより、分子量321.39を有するプテリジン誘導体である物質Lは、受容体とそのリガンドとの間の結合を遮断することが示されている。該物質を本システムのLIRIアッセイで試験した。
【0068】
Jurkat細胞をCHO/リガンドAまたはCHO/リガンドBの形質転換体と共に、種々の濃度の物質Lを添加して15分間共インキュベートした。受容体A(CHO/リガンドAとの培養において)および受容体B(CHO/リガンドBとの培養において)の発現をFACSで分析した。
【0069】
結果は、リガンドAで誘導される受容体Aのダウンモジュレーションは、リガンドAを有するCHO細胞を物質Lで前処理することにより濃度依存的に阻害されたこと、または該物質で前処理された、リガンドを有するCHO細胞とインキュベーションした後に、より多くの受容体Aが細胞表面に保持されたことを示した。物質Lは、リガンドBで誘導される受容体Bのダウンモジュレーションを妨害しなかった(図11)。
【0070】
実施例9
ヒトCD80は、CTLA−4のダウンモジュレーションを誘導する。
【0071】
材料および方法
細胞培養
ヒト末しょう血単核細胞(PBMC)をバフィーコートから分離して、10%仔ウシ胎児血清およびSEE(5nM)を補ったRPMI 1640中で72時間培養した。リガンドCD80によるCTLA−4のモジュレーションを研究するために、SEEで活性化した細胞をCHO/C80形質転換体と共に、5:1の比で37℃において30分間インキュベートした。細胞を洗浄してPE結合αCTLA−4で染色し(PharMingen、カタログ番号555853)、FACSで解析した。
【0072】
結果
CD80によるCTLA−4のダウンモジュレーション
ヒト静止T細胞は、細胞表面にCTLA−4を発現しない(データ示さず)。SEEで活性化した後、ヒトPBMCは、細胞サイズによって2群に分けることができる。図12による結果は、80%程度の大細胞は、その他のT活性化マーカー(CD25、CD56、CD69)の向上された発現とともに、CTLA−4を発現する。小細胞は、静止PBMCと同様の表現型のままであった。
【0073】
活性化後、PBMC細胞をCHO/CD80細胞と混合して、さらに30分間インキュベートした。CTLA−4のモジュレーションをFACSで解析した。図13による結果は、CTLA−4の発現がCD80によってダウンモジュレートされたことを示す。並行して培養した結果では、CD28およびCD2も、それぞれCD80およびLFA3形質転換体によってダウンモジュレートされ、LFA3は、CTLA−4の発現をモジュレートしないことを示した(データ示さず)。これらの結果は、誘導性のヒトT細胞共刺激性受容体であるCTLA−4は、対受容体(counterreceptor)のCD80と相互作用することによってもダウンモジュレートされ、CTLA−4のモジュレーションに厳密な特異性が存在することを示している。
【0074】
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【図面の簡単な説明】
【図1】
ヒトCD80およびCD86は、CD28受容体のダウンレギュレーションを誘導する。
【図2A】
CD80によって誘導されるCD28のダウンレギュレーションの用量依存および時間経過。A:Jurkat細胞を種々の数のCHO/CD80細胞と培養した。
【図2B】
CD80によって誘導されるCD28のダウンレギュレーションの用量依存および時間経過。B:Jurkat細胞を5:1の比のCHO/CD80と共に種々の時間インキュベートした。
【図3】
LFA3(CD58)は、T細胞におけるCD2発現をダウンモジュレートする。
【図4A】
ヒトCD40LおよびCD40は、各々をダウンレギュレートする。A:ヒトB細胞株Ramos 2G6 4C10細胞をCHO形質転換体と共インキュベートした。
【図4B】
ヒトCD40LおよびCD40は、各々をダウンレギュレートする。B:CD40L+−Jurkat細胞をCHO/DRまたはCHO/DR/CD40細胞と種々の時間インキュベートした。
【図5】
LFA−3およびCD80は、ヒトPBMCにおいてCD2およびCD28受容体のダウンモジュレーションを誘導する
【図6】
ヒトICAM1(CD54)は、CDlla(LFA−1)をダウンモジュレートし、αICAM1 mAbは、効果を遮断する。
【図7A】
CHO/CD80におけるCD80またはJurkatにおけるCD28のmAbsによる前処理は、CD80誘導のCD28ダウンモジュレーションを遮断する。A:CHO/CD80形質転換体をαCD80 mAbまたはコントロールmAbとインキュベートした。
【図7B】
CHO/CD80におけるCD80またはJurkatにおけるCD28のmAbsによる前処理は、CD80誘導のCD28ダウンモジュレーションを遮断する。B:Jurkat細胞をαCD28 mAbとインキュベートした。
【図8】
αCD40 mAbによるCHO/CD40またはRaji細胞の前処理。
【図9A】
共刺激性受容体のダウンモジュレーションを遮断するmAbsは、T細胞活性化も遮断する。A:種々の濃度のαCD28 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞をCHO/DR/CD80形質転換体および超抗原SEEと共培養した。
【図9B】
共刺激性受容体のダウンモジュレーションを遮断するmAbsは、T細胞活性化も遮断する。B:αCD2 mAbまたはコントロールmAbで前処理したJurkat細胞をCHO/DR/LFA3形質転換体と共培養した。
【図10A】
細胞内染色では、受容体がリガンドと相互作用した後にインターナリゼーションすることを示す。A:Jurkat細胞をCHO/LFA3またはCHO/CD40と培養した。
【図10B】
細胞内染色では、受容体がリガンドと相互作用した後にインターナリゼーションすることを示す。B:培養条件及び細胞内染色の手順はAの記載と同様である。
【図11】
物質Lは、リガンドA誘導の受容体Aのダウンモジュレーションを特異的に抑制する。
【図12】
ヒトT細胞におけるCTLA−4の誘導。ヒトPBMCをSEE(5nM)で72時間活性化して、FACSによって表現型的に分析した。
【図13】
CD80は、SEEで活性化されたヒトPBMCにおけるCTLA−4の発現をダウンモジュレートする。SEE(5nM)で72時間活性化されたヒトPBMCをCHO/CD80と混合して30分間インキュベートした。CTLA−4の発現をFACSによって分析した。
Claims (20)
- 免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法であって、
前記免疫応答能のあるヒト細胞を、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導することができる条件下で、少なくとも一つの試験化合物の存在下においてインキュベートすることと、
リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定することと、
によって特徴づけられる方法。 - 前記免疫応答性のある細胞が白血球である、請求項1に記載の方法。
- 前記白血球がリンパ球である、請求項2に記載の方法。
- 前記リンパ球がT細胞である、請求項3に記載の方法。
- 前記T細胞がJurkat細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記白血球が抗原提示細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞がB細胞である、請求項6に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法であって、前記条件は、少なくとも1つのヒト・リガンドをコードするDNAがトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞と共に免疫応答性のある細胞を培養することを含む方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記CHO細胞は、ICAM、CD54(LFA3)、CD40、CD80、CD86、CD154(CD40L)を含む群より選択される少なくとも一つのヒト・リガンドまたは受容体をコードするDNAがトランスフェクションされる方法。
- 前記試験化合物が低分子量化合物である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験化合物が約500までの分子量を有する、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法であって、前記抑制の決定は、細胞をフローサイトメトリー解析またはコンフォーカル顕微鏡解析することによってなされる方法。
- 高内容物スクリーニング(HCS)または培地スループット・スクリーニング(MTS)のために自動化された、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法であって、前記経路がCD40/CD154(CD40L);CD2/LFA3;CD28/CD80、CD86;およびCD11/ICAMを含む受容体−リガンド対の群より選択される方法。
- 免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングするキットであって、
免疫応答能のあるヒト細胞を培養するための手段;
共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導するための手段;
少なくとも一つの試験化合物と共に免疫応答能のあるヒト細胞をインキュベートするための手段;
受容体をマーキングするための手段;および
リガンドで誘導されるの共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定するための手段;
を含むキット。 - 受容体をマーキングするために同位元素または蛍光性タンパク質との複合物を使用する、請求項15に記載のキット。
- リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定するためにフローサイトメトリー解析またはコンフォーカル顕微鏡解析を使用する、請求項15または16に記載のキット。
- リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断することによりリガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを阻止することができる免疫調節剤。
- 低分子量化合物である、請求項18に記載の免疫調節剤。
- 約500までの分子量を有する化合物である、請求項18または19に記載の免疫調節剤。
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