JP2004514426A - Human G protein-coupled receptor and uses thereof - Google Patents

Abstract

The present invention relates to the IGS58 G protein-coupled receptor family and a polynucleotide encoding the IGS58 protein. The invention also relates to inhibiting or activating the action of such polynucleotides and polypeptides, vectors containing said polynucleotides, overexpression, misexpression, underexpression or suppression (knockout) of the IGS58 gene, It also relates to host cells and transgenic non-human animals containing such vectors. The present invention further provides methods of screening for compounds capable of acting as agonists or antagonists of the G protein-coupled receptor family IGS58, and IGS58 polypeptides and polypeptides in the treatment of a wide range of diseases and diagnostic tests for such conditions. The use of nucleotides as well as agonists or antagonists to the IGS58 receptor family. The invention is particularly applicable to testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (eg, fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, Screening for compounds capable of acting as agonists or antagonists of said G protein-coupled receptor family IGS58 in the treatment of dysfunctions, disorders or diseases associated with the hippocampus and thalamus, and in diagnostic tests of such conditions. And the use of IGS58 polypeptides and polynucleotides and agonists or antagonists to the IGS58 receptor family.

Description

【００１６】
【表２】

【００１７】
〔発明の記述〕
配列およびモチーフの文脈における構造的および化学的な類似が、本発明のＩＧＳ５８　ＧＰＣＲと他のヒトＧＰＣＲの間に存在する。さらに、ＩＧＳ５８は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）において発現される。したがって、ＩＧＳ５８はとりわけ上述の疾患において役割を演じることが暗示される。ＩＧＳ５８は特に、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患において役割を演じることが暗示される。
【００１８】
特に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的のおよび科学的な用語は、本発明が属する当該技術分野の通常の熟練者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記述されるものと類似もしくは等価なあらゆる方法および材料が、本発明の実施もしくは試験のために使用されうるものの、好ましい方法、装置および材料がこれから記述される。本明細書中で引用される刊行物はすべて、あたかも個々の各刊行物が引用することによって完全に記載されたかのように本明細書中に取り込まれるべきものと明確に、かつ個別的に表示されたかのように、引用することによって本明細書中に取り込まれている。
【００１９】
〔定義〕
以下の定義は、本明細書中でしばしば使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００２０】
「ＩＧＳ５８」は特に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に規定されるアミノ酸配列を含んで成るポリペチドもしくはそのバリアントを指す。
【００２１】
「受容体活性」もしくは「受容体の生物活性」とは、同様な活性もしくは向上した活性もしくは減少した望ましくない副作用を伴うこれらの活性を含む前記ＩＧＳ５８の代謝もしくは生理学的機能を指す。また、前記ＩＧＳ５８の抗原性および免疫原性の活性も含まれる。
【００２２】
「ＩＧＳ５８遺伝子」とは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドもしくはその各バリアント（例えば、その対立遺伝子バリアントおよび／もしくはそれらの相補物）を指す。
【００２３】
本明細書中で使用される「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、ヒト化抗体のほか、Ｆａｂもしくは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントを含む。
【００２４】
「単離された」とは、天然の状態から「人の手によって」変更され、および／もしくは天然の環境から分離されたことを意味する。よって、天然に生じる「単離された」組成物もしくは物質が「単離された」ならば、それはそのオリジナルの環境から変更され、もしくは除去され、もしくはその両方が行なわれている。たとえば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドもしくはポリペチドは「単離」されていないが、その天然状態で共に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドもしくはポリペチドは、この用語が本明細書中で使用されるように、「単離」されている。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」は、あらゆるポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドを一般に指し、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖または、より一般的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖の領域の混合でありうるＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成る混成分子を限定することなく含む。さらに、「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡとＤＮＡの両方を含んで成る三本鎖領域もまた含みうる。また、ポリヌクレオチドという用語には、安定性もしくは他の理由のために、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、および修飾された骨格を持つＤＮＡもしくはＲＮＡも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基および、イノシンのような通常は見られない塩基を含む。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行なわれている；よって、「ポリヌクレオチド」は天然に一般に見出されるような、化学的、酵素的、もしくは代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびに、ウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００２６】
「ポリペチド」とは、ペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合（すなわちペプチド・イソスター）によって互いに繋がれた２つ以上のアミノ酸を含んで成る、あらゆるペプチドもしくはタンパク質を指す。「ポリペチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドもしくはオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖、および／もしくはそれらの組み合わせを指す。ポリペチドは、遺伝子にコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含みうる。「ポリペチド」には、翻訳後プロセッシングのような天然の過程、もしくは、当該技術分野において公知の化学修飾技法のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は、基本的なテキストおよびより詳細な研究書のほか、豊富な研究論文中によく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および、アミノもしくはカルボキシル末端を含む、ポリペチド中のあらゆる所に生じうる。同じ型の修飾が、与えられたポリペチド中のいくつかの部位に同一もしくは変化する程度で存在しうることが理解されるであろう。また、与えられたポリペチドは多くの型の修飾を含みうる。ポリペチドはユビキチン結合の結果として分岐されることができ、また、それらは分枝を持つ環状もしくは分枝を持たない環状でありうる。環状、分枝状、分枝環状のポリペチドは、翻訳後の天然プロセスに起因して生じるか、もしくは合成的方法によって作製されうる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合；架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質に対するアミノ酸のｔ−ＲＮＡ媒介付加、ならびにユビキチン結合を含む。例としては、ＰＲＯＴＥＩＮＳ　−　ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９３　ａｎｄ　Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２　ｉｎ　ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ　ＣＯＶＡＬＥＮＴ　ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８３；　Ｓｅｉｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，″Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｆａｃｔｏｒｓ″，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎ　ｅｔ　ａｌ．，″Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ａｇｉｎｇ″，Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）６６３：４８−６２を見よ。
【００２７】
「バリアント」とは、本明細書中で用語が使用されるように、基準のポリヌクレオチドもしくはポリペチドからそれぞれ異なっているが、本質的な生物学的性質、構造的性質、制御もしくは生化学的性質といった本質的性質を保持しているポリヌクレオチドもしくはポリペチドである。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の、基準のポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペチドのアミノ酸配列を変えてもよいし、変えなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に議論されるように、基準配列によってコードされるポリペチドにおいて、アミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の、基準のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般には、基準ポリペチドとバリアントの配列が全体的に極めて類似で、多くの領域では同一となるように、差異は限定される。バリアントおよび基準ポリペチドは、あらゆる組み合わせの１つ以上の置換、付加および欠失によってアミノ酸配列が異なりうる。置換されたか、もしくは挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであっても、もしくは、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチドもしくはポリペチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントのような天然に生じるものでも、もしくは、それは天然に生じることが知られていないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペチドの天然には生じないバリアントは、突然変異生成技法によって、もしくは直接合成によって作製されうる。
【００２８】
「同一性」は、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最も高いオーダーの一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は、当該技術分野において認識された意味を有しており、公表された技法を用いて計算されうる。例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８８；　ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ　ＡＮＤ　ＧＥＮＯＭＥ　ＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．；　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９３；　ＣＯＭＰＵＴＥＲ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＯＦ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ　Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１を見よ。２つのポリヌクレオチドもしくはポリペチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在しており、「同一性」という用語は当業者にとって公知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３）。２つの配列間の同一性もしくは類似性を決定するために一般に使用される方法には、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｈｕｇｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ　Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，１９９４、およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３に開示されているものを、それらに限定することなく含む。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラムにコードされている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９８４）１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）を含むが、それらに限定されない。「相同性」という語は「同一性」という語に置換されうる。
【００２９】
例示として、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「同一性」を持つヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の基準ヌクレオチド配列各１００ヌクレオチドにつき、最高５つまでのヌクレオチドの違いを含みうること以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が基準配列と同一であることを意味する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％が同一なヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを得るためには、基準配列中のヌクレオチドの任意の５％までが削除され、もしくは別のヌクレオチドと置換されるか、または、基準配列の全ヌクレオチドの５％までの任意の数のヌクレオチドが基準配列中に挿入されるか、あるいは、基準配列の全ヌクレオチドの５％までの任意の数のヌクレオチドに、欠失、挿入および置換の組み合わせが起こりうる。これらの差異は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端、または、これら末端位の間のどこかにおいて、基準配列内のヌクレオチドの中に個別に分散して、もしくは基準配列中の１ヶ所以上の近接したグループ内に分散して生じうる。
【００３０】
同様に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の基準アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「同一性」を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の基準アミノ酸配列各１００アミノ酸につき、最高５つまでのアミノ酸の違いを含みうること以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が基準配列と同一であることを意味する。言い換えれば、基準アミノ酸配列に少なくとも９５％が同一なアミノ酸配列を持つポリペプチドを得るためには、基準配列中の５％までの任意のアミノ酸が削除されるか、もしくは別のアミノ酸と置換されるか、または、基準配列の全アミノ酸の５％までの任意の数のアミノ酸が基準配列中に挿入される。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、または、これら末端位置の間のどこかにおいて、基準配列内の残基の中に個別に分散して、もしくは基準配列内の１ヶ所以上の近接したグループ内に分散して生じうる。
【００３１】
〔本発明のポリペプチド〕
一つの態様では、本発明はＩＧＳ５８ポリペチド（ＩＧＳ５８タンパク質を含む）に関する。ＩＧＳ５８ポリペチドには、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドおよび、２００１年８月３０日にユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された受託番号ＣＢＳ１０９７１７中に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペチド、ならびにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列を含んで成るポリペチドおよび、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｉｔｕｒｅｓの受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペチド、ならびにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２および／もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７中に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペチドに対して、全長にわたり、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、そして、さらにより好ましくは前記アミノ酸配列対して少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを含む。さらに、少なくとも９７％、特に少なくとも９９％の同一性を持つものは非常に好ましい。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列を持つポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７中に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペチドに対して、全長にわたり、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、そして、さらにより好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペチドもまた、ＩＧＳ５８ポリペチドの範囲内に含まれる。さらに、少なくとも９７％、特に少なくとも９９％の同一性を持つものは非常に好ましい。好ましくは、ＩＧＳ５８ポリペチドは少なくとも一つの受容体生物活性を示す。
【００３２】
本発明のさらなる実施態様では、ＩＧＳ５８ポリペチドは融合タンパクのような、より大きなタンパク質の一部でありうる。分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のような精製を助ける配列、抗原性ペプチドタグ（ヘマグルチニン（ＨＡ）タグなど）のような検出を助ける配列、または、組換え体生産中の安定性のための付加的な配列を含むさらなるアミノ酸配列を含めることは、しばしば有利である。
【００３３】
ＩＧＳ５８ポリペチドのフラグメントもまた、本発明に含まれる。フラグメントとは、前記のＩＧＳ５８ポリペチドのアミノ酸配列の全部ではなく、一部と同一であるアミノ酸配列を有するポリペチドである。ＩＧＳ５８ポリペチドと同様に、フラグメントは「独立的（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」でありえ、つまり、最も好ましくは単一の連続した領域として、それらがその一部もしくは領域を形成する、より大きなポリペチドの中に含まれうる。発明のポリペチド・フラグメントの代表的な例は、例えば、アミノ酸番号がだいたい１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００および１０１からＩＧＳ５８ポリペチドの終わりまでのフラグメントを含む。この文脈において、「だいたい」には特に列挙された範囲からどちらかの端もしくは両方の端に、いくつか、５、４、３、２もしくは１アミノ酸だけより大きいもの、もしくはより小さいものを含む。
【００３４】
好ましいフラグメントには、例えば、アミノ末端を含む連続した一連の残基の欠失、もしくはカルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠失、もしくは一つがアミノ末端を含み、一つがカルボキシル末端を含む２つの連続した一連の残基の欠失を除き、ＩＧＳ５８ポリペチドのアミノ酸配列を持つ切り詰められたポリペチドを含む。また、αヘリックス、αへリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性部分、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可動領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原インデクス（ｈｉｇｈ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｉｎｄｅｘ）領域といった構造的もしくは機能的属性によって特徴付けられるフラグメントもまた好ましい。他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントとは、同様な活性もしくは向上した活性、もしくは減少した望ましくない活性をもつものを含む、受容体活性を媒介するものである。また、動物、特にヒトにおいて、抗原性もしくは免疫原性であるものも含まれる。
【００３５】
このように、本発明のポリペチドには、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２および／もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペチドと少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペチド、または対応するフラグメントと少なくとも８０％が同一であるそのフラグメントを含む。好ましくは、これらのポリペチド・フラグメントのすべてが、抗原活性を含む受容体の生物活性を保持する。また、定義された配列およびフラグメントのバリアントも本発明の一部を構成する。好ましいバリアントは、保存的なアミノ酸置換（すなわち、似た特性の別の残基によって残基を置換するもの）によって基準と異なっているものである。典型的なそのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間、ＳｅｒとＴｈｒの間、酸性残基のＡｓｐとＧｌｕの間、ＡｓｎとＧｌｎの間、塩基性残基のＬｙｓとＡｒｇの間、もしくは、芳香性残基のＰｈｅとＴｙｒの間のものである。特に好ましいものは、数個、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２個のアミノ酸があらゆる組み合わせで置換、欠失もしくは付加されているバリアントである。
【００３６】
本発明のＩＧＳ５８ポリペチドは、あらゆる適当な方法において調製されうる。そのようなポリペチドには、単離された天然に生じるポリペチド、組換えによって生産されたポリペチド、合成的に生産されたポリペチド、もしくは、これらの方法の組み合わせによって生産されたポリペチドを含む。そのようなポリペチドを調製する方法は、当該技術分野おいて公知である。
〔本発明のポリヌクレオチド〕
本発明のさらなる態様はＩＧＳ５８ポリヌクレオチドに関する。ＩＧＳ５８ポリヌクレオチドには、ＩＧＳ５８ポリペチドおよびフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびにそれらに密接に関係するポリヌクレオチドを含む。より明確には、本発明のＩＧＳ５８ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド（たとえば、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２のＩＧＳ５８ポリペチドをコードすることができるもの）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１の特定の配列を持つポリヌクレオチド、および、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートに本質的に対応するポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
ＩＧＳ５８ポリヌクレオチドはさらに、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペチドをコードするヌクレオチド配列に対し、全長にわたって、少なくとも８０％の同一性を持つヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列と全長にわたって少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、および、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートに本質的に対応するポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
この点については、少なくとも９０％の同一性を持つポリヌクレオチドは特に好ましく、少なくとも９５％の同一性を持つものは、ことのほか好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を持つものは非常に好ましく、少なくとも９８〜９９％の同一性を持つものは極めて非常に好ましく、少なくとも９９％の同一性を持つものは最も好ましい。また、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるヌクレオチド配列に対して、もしくは、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートに対して、増幅に使用可能な条件下でハイブリダイズするために、またはプローブもしくはマーカーとして使用するために十分な同一性を持つヌクレオチド配列もＩＧＳ５８ポリヌクレオチドの下に含まれる。本発明はまた、そのようなＩＧＳ５８ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
【００３９】
本発明のＩＧＳ５８は、ＢＬＡＳＴ検索の結果で示されるように、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク質と構造的に関連している。表２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）のアミノ酸配列は、ヒト白血球血小板活性化因子受容体をあらわすと主張される配列に最も類似していた（アライメントされた３１２残基について９２％の同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１４９６８；しかし、このタンパク質は３２２残基の長さしかない）。このように、本発明のＩＧＳ５８ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様な生物学的機能／性質を持つことが期待され、そして、それらの実用性は当該技術分野における熟練した誰にとっても明らかである。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのような天然の供給源から取得されうる。特に、特定のＧＰＣＲ遺伝子サブファミリー内で保存されている領域をコードする縮重ＰＣＲプライマーが設計されうる。縮重プライマーを用いたゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅反応は、考慮中の遺伝子ファミリーのいくつかのメンバー（既知と新規の両方）の増幅をもたらすであろう（ゲノム鋳型が用いられる場合は、縮重プライマーは同一エキソン内に位置しなければならない）（Ｌｉｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４：５６９−５７２）。また、本発明のポリヌクレオチドは、よく知られている商業的に利用可能な技法（たとえば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ，２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）を用いて合成されることもできる。
【００４１】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるポリペプチドコード配列（ヌクレオチド番号２６〜１４７１）と同一であってもよく、あるいは、それは、遺伝コードの冗長性（縮重）の結果として、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるペプチドコード配列に比べ変更も示すが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチドもコードする、異なるヌクレオチド配列であってもよい。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドがＩＧＳ５８ポリペチドの組換え体生産のために用いられる場合、ポリヌクレオチドには、成熟ポリペチドもしくはそのフラグメントのコード配列それ自体；リーダー配列もしくは分泌配列、プレもしくはプロもしくはプレプロ・タンパク質配列または他の融合ペプチド部分をコードするもののような他のコード配列と同じ読み枠にある成熟ポリペチドもしくはフラグメントのコード配列を含みうる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされうる。本発明のこの態様のいくつかの好ましい実施態様では、マーカー配列はｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供され、Ｇｅｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に記述されるようなヘキサヒスチジンペプチド、もしくはＨＡタグである。ポリヌクレオチドはまた、転写される非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化のシグナル、リボソーム結合部位および、ｍＲＮＡを安定化する配列といった、非コード性の５’および３’配列も含みうる。
【００４３】
さらなる好ましい実施態様は、数個、５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２もしくは１個のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、削除もしくは付加されているＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペチドのアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８バリアントをコードしているポリヌクレオチドである。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセッシングおよび／もしくは発現の修正を含むがそれらに限定されない種々の目的のためにＩＧＳ５８コード配列を変更するために、当該技術分野において一般に知られている方法を用いて操作されうる。遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのランダムな断片化とＰＣＲによる再集合によるＤＮＡシャッフリングが、ヌクレオチド配列を操作するために使用されうる。たとえば、オリゴヌクレオチドの媒介による部位特異的変異誘発が、アミノ酸置換を行ない、新たな制限部位を創出し、修飾（たとえば、グリコシル化もしくはリン酸化）のパターンを変化させ、コドン優先性を変更し、スプライシング・バリアントを生成するといった変異を導入するために使用されうる。
【００４５】
本発明はさらに、本明細書中において前述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点について、本発明は特に、ストリンジェントな条件下で前述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用される「ストリンジェントな条件」という用語は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、特には少なくとも９９％の同一性が、配列間に存在する場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００４６】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントと同一もしくは十分に同一である本発明のポリヌクレオチドは、ＩＧＳ５８をコードしている完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、および、ＩＧＳ５８遺伝子に対して高い配列類似を持つ他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローン（ヒト以外の種のホモログおよびオーソログをコードしている遺伝子を含む）を単離するための、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーション・プローブとして用いられうる。当該技術分野における熟練した人々は、そのようなハイブリダイゼーション技法をよく知っている。一般的に、これらのヌクレオチド配列は基準配列に対して８０％の同一性を持ち、好ましくは９０％の同一性を持ち、より好ましく９５％の同一性を持つ。プローブは一般に、少なくとも５ヌクレオチドを含んで成り、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、特には少なくとも１５ヌクレオチドを含んで成る。最も好ましくは、そのようなプローブは少なくとも３０ヌクレオチドを有し、少なくとも５０ヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０ヌクレオチドの範囲である。
【００４７】
ヒト以外の種からホモログおよびオーソログを含むＩＧＳ５８ポリペチドをコードするポリヌクレオチドを得るための一つの実施態様は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはそのフラグメントを有する標識プローブによりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、前記ポリヌクレオチド配列を含んで成る完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップを含んで成る。そのようなハイブリダイゼーション技法は、当該技術分野における熟練者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは上で定義された通り、あるいは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン（ｗ／ｖ）および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精液ＤＮＡを含んで成る溶液中において４２℃で一晩インキュベートした後、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄した下での条件である。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペチドは、動物およびヒトの疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として用いられうる。
【００４９】
〔ベクター、宿主細胞、発現〕
本発明はまた、ポリヌクレオチドもしくは本発明のポリヌクレオチドを含んで成るベクター、および本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、ならびに、組換え技術による本発明のポリペチドの製造にも関する。本発明のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを使って、そのようなタンパク質を合成するために、無細胞翻訳系もまた用いられうる。
【００５０】
組換え体の生産のためには、本発明のポリヌクレオチドのための発現系もしくはその一部を取り入れるために、宿主細胞が遺伝的に操作されうる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＡＳＩＣ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）のような多くの標準的な実験室マニュアルに記述されている方法（たとえば、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション法、電気穿孔法、トランスダクション、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入法（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、もしくは感染など）によって実施されうる。
【００５１】
適当な宿主の代表的な例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセスおよび枯草菌のような細菌細胞；酵母細胞およびコウジカビ細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびハスモンヨトウＳｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；および植物細胞を含む。
【００５２】
多種多様な発現系が用いられうる。そのような系には、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルスから誘導された系、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメントから誘導されたベクター、バキュロウイルス、パポバ・ウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウィルス、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスから誘導されたベクター、ならびに、プラスミドとバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するものやコスミドとファージミドに由来するものといった、それらの組み合わせから誘導されたベクターを含む。発現系は発現を発生させ、調節する制御領域を含みうる。一般に、宿主細胞中においてポリペチドを生成するためのポリヌクレオチドを維持、増殖もしくは発現するのに適したあらゆる系もしくはベクターが使用されうる。適当なヌクレオチド配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（前出）に述べられているもののような、公知のルーチン的な種々の技法のいずれによっても、発現系内に挿入されうる。
【００５３】
小胞体の内腔、細胞膜周辺腔もしくは細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適当な分泌シグナルが望みのポリペチドに取り込まれてもよい。これらのシグナルはポリペチドに内在するものであっても、もしくは異種性のもの（つまり異なる種に由来するもの）であってもよい。
【００５４】
ＩＧＳ５８ポリペチドがスクリーニングアッセイにおける使用のために発現されるものである場合には、一般に、ポリペチドは細胞の表面で生成されることが好ましい。この場合には、細胞はスクリーニングアッセイにおける使用の前に回収されうる。ＩＧＳ５８ポリペチドのアフィニティーもしくは機能活性が受容体活性修正タンパク質（ＲＡＭＰ）によって変更される場合には、最もありそうなことには細胞の表面における関連するＲＡＭＰの同時発現が好ましく、しばしば要求される。また、この場合、スクリーニングアッセイにおける使用の前に、ＩＧＳ５８ポリペチドおよび関連するＲＡＭＰを発現している細胞の回収が要求される。ＩＧＳ５８ポリペチドが培地に分泌される場合は、ポリペチドを回収し、精製するために、培地が回収されうる；細胞内に生成される場合は、ポリペチドが回収される前に、まず細胞が溶解されなければならない。ＩＧＳ５８ポリペチドを発現している膜は、当該技術分野における熟練者にとって公知の方法によって回収されることができる。一般に、そのような方法には、ＩＧＳ５８ポリペチドを発現している細胞の回収および、ポッタリング（ｐｏｔｔｅｒｉｎｇ）のような手法（これに限定はされない）による細胞のホモジナイゼーションを含む。膜は懸濁液を１回もしくは数回、洗浄することによって回収されうる。
【００５５】
ＩＧＳ５８ポリペチドは、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーおよびレクチン・クロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養から精製されうる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製のために使用される。ポリペチドが単離および／もしくは精製の間に変性する場合には、タンパク質の再フォールディングのためによく知られている技法が活性コンフォメーションを再生させるために用いられうる。
【００５６】
〔診断的アッセイ〕
本発明は診断試薬としての使用のためのＩＧＳ５８ポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関連したＩＧＳ５８遺伝子の変異型の検出は、ＩＧＳ５８の過少発現、過剰発現もしくは異常発現に起因する疾患もしくは疾患への感受性の診断に加えることができる診断ツール、もしくはそれを明確にすることができるツールを提供するであろう。また、この場合、望まれる品質の診断アッセイを得るためには、関連する受容体活性修正タンパク質の同時発現が要求されうる。ＩＧＳ５８遺伝子に突然変異を有する個体は、さまざまな技法によってＤＮＡレベルで検出されうる。
【００５７】
診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検もしくは死体解剖からの材料のような、被検者の細胞から得られうる。ゲノムＤＮＡは検出のために直接用いられるか、または、解析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることによって酵素的に増幅されうる。ＲＮＡもしくはｃＤＮＡもまた、同様な方法で使用されうる。欠失および挿入は正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化によって検出されうる。点変異は、増幅されたＤＮＡを標識ＩＧＳ５８ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって同定されうる。完全にマッチした配列はＲｎａｓｅ切断によって、もしくは融解温度の差異によってミスマッチを持つ二重鎖から区別されうる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤の存在下もしくは非存在下におけるゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化によって、もしくは、直接的なＤＮＡ塩基配列決定によって検出されうる。Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２を見よ。特定の位置の配列変化は、ヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１プロテクション、もしくは化学切断法）によっても明らかにされうる。Ｃｏｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１を見よ。別の実施態様では、ＩＧＳ５８ヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチド・プローブのアレイが、たとえば、遺伝的変異の効率的なスクリーニングを実施するために作製されうる。アレイテクノロジー法は公知であり、一般的な適用性を有しており、遺伝子発現、遺伝的連鎖、および遺伝的多様性を含む分子遺伝学における種々の問題について言及するために使用されうる（例えば、Ｍ．Ｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ　２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６）を見よ）。
【００５８】
診断的アッセイは、記述された方法によるＩＧＳ５８遺伝子の突然変異の検出を通して、とりわけ、上記のような疾患を診断し、もしくは、それに対する感受性を決定するための方法を提供する。この診断アッセイは特に、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患に対する感受性を、記述された方法によるＩＧＳ５８遺伝子中の変異の検出を通して、診断もしくは決定するための方法を提供する。
【００５９】
さらに、とりわけ、上記のような疾患は、被検者に由来するサンプルにおいて異常に減少もしくは増加したＩＧＳ５８ポリペチドもしくはＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの量を決定することを含んで成る方法によって診断されうる。特に、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（例えば、胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床）に関係する機能不全、障害もしくは疾患は、異常に減少もしくは増加したＩＧＳ５８ポリペチドもしくはＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの量を被検者に由来するサンプルから決定することを含んで成る方法によって診断されうる。
【００６０】
減少もしくは増加した発現は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション、ノーザンブロッティング、および他のハイブリダイゼーション法といったポリヌクレオチドの定量のために当該技術分野においてよく知られている方法のいずれかを用いて、ＲＮＡのレベルで測定されうる。宿主に由来するサンプル中のタンパク質（例えばＩＧＳ５８）の量を決定するために用いられうるアッセイ技法は、当該技術分野における熟練者にとって公知である。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、結合蛋白競合測定法、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００６１】
別の態様では、本発明は、とりわけ上述のような疾患もしくは疾患に対する感受性についての診断キットに関する。特に、本発明は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患についての診断キットに関する。
このキットは、
（ａ）　ＩＧＳ５８ポリヌクレオチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド配列、もしくはそのフラグメント；および／もしくは
（ｂ）　（ａ）の配列に相補的なヌクレオチド配列；および／もしくは
（ｃ）　ＩＧＳ５８ポリペプチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチド配列、もしくはそのフラグメント；および／もしくは
（ｄ）　ＩＧＳ５８ポリペチドに対する抗体、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドに対する抗体；および／もしくは
（ｅ）　ＩＧＳ５８ポリペチドの関連する生物学的もしくは抗原性の性状のために要求されるＲＡＭＰポリペチド；
を含んで成る。
【００６２】
あらゆるそのようなキットにおいて（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）もしくは（ｅ）が実質的な成分を構成しうることが認識されるであろう。
〔染色体アッセイ〕
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも価値を持つ。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置へと特異的に誘導され、ハイブリダイズできる。本発明に従う染色体への関連する配列のマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾患に関連させることにおける重要な第一段階である。いったん配列が正確な染色体の位置にマップされたならば、染色体上の配列の物理位置は遺伝子地図データと相関付けられることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで利用可能）に見出される。同じ染色体の領域にマップされた遺伝子と疾患の間の関係は、それから、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）を通して同定される。
【００６３】
罹患した個体と罹患していない個体の間のｃＤＮＡもしくはゲノム配列中の差異もまた決定されうる。罹患した個体の一部もしくは全部において変異が観察されるが、正常な個体ではまったく見られない場合には、この変異が疾患の原因因子である可能性が高い。
【００６４】
〔抗体〕
本発明のポリペチドもしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの類似体またはそれらを発現している細胞は、もし必要であれば関連するＲＡＭＰと共に、ＩＧＳ５８ポリペチドに免疫特異的な抗体を作製するために、免疫原としても使用されうる。「免疫特異的」という用語は、抗体が本発明のポリペチドに対して、先行技術における関連する他のポリペチドに対するアフィニティーよりも、実質的により大きなアフィニティーを有することを意味する。
【００６５】
ＩＧＳ５８ポリペチドに対して作製された抗体は、ポリペチドもしくはエピトープを含むフラグメント、類似体もしくは細胞を、ルーチン的なプロトコールを用いて動物に、好ましくはヒト以外の動物に投与することにより取得されうる。モノクローナル抗体の調製のためには、継続的な細胞株培養によって生産される抗体を提供する、あらゆる技法が使用されうる。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）を含む。
【００６６】
上述の抗体は、ポリペチドを発現しているクローンを単離するため、もしくは同定するため、もしくはアフィニティー・クロマトグラフィーによってポリペチドを精製するために利用されうる。
【００６７】
また、ＩＧＳ５８ポリペチド自体、もしくはＩＧＳ５８ポリペチドＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、とりわけ、上述のような疾患を処置するために使用されうる。特に、ＩＧＳ５８ポリペプチド自体に対する抗体もしくはポリペプチドＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患を処置するために使用されうる。
【００６８】
〔動物〕
本発明の別の態様は、ＩＧＳ５８の異常な発現もしくは活性から生じる疾患のモデルとして働くヒト以外の動物に基づく系に関する。ヒト以外の動物に基づくモデル系は、ＩＧＳ５８遺伝子の活性をさらに特徴づけるためにも使用されうる。そのような系は、とりわけ、上述の疾患のようなＩＧＳ５８に基づく疾患を処置することができる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部として利用されうる。特に、この系は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係するＩＧＳ５８に基づく機能不全、障害もしくは疾患を処置することのできる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部として利用されうる。
【００６９】
このようにして、動物に基づくモデルは、ＩＧＳ５８の異常な発現もしくは活性を持つ疾患の処置に有効な製薬化合物、治療、および介入を同定するために使用されうる。さらに、そのような動物モデルは、被検動物におけるＬＤ_５０およびＥＤ_５０を決定するために使用されうる。これらのデータは、潜在的なＩＧＳ５８疾患処置のｉｎ　ｖｉｖｏにおける効能を決定するために用いられうる。
【００７０】
異常なＩＧＳ５８の発現もしくは活性に基づく、ＩＧＳ５８に基づく疾患の動物に基づくモデル系は、非組換え動物および組換えにより操作されたトランスジェニック動物の両方を含みうる。
【００７１】
ＩＧＳ５８疾患のための動物モデルは、例えば、遺伝的モデルを含みうる。ＩＧＳ５８に基づく疾患のような症状を呈する動物モデルは、例えば、当該技術分野における熟練者に公知のトランスジェニック動物を生成するための技法と組み合わせて、上述のもののようなＩＧＳ５８配列を利用することによって操作されうる。たとえば、ＩＧＳ５８配列は、目的の動物のゲノム内に導入され、過剰発現され、および／もしくは誤発現されることができ、または、内在性のＩＧＳ５８配列が存在する場合には、それらは過剰発現され、誤発現され、あるいは、ＩＧＳ５８遺伝子発現を過少に発現もしくは不活性化させるために乱されることができる。
【００７２】
ＩＧＳ５８遺伝子配列を過剰発現もしくは誤発現させるために、ＩＧＳ５８遺伝子配列のコード部分は、高レベルな遺伝子発現もしくは、その遺伝子が目的の動物種において通常は発現されない細胞型における発現を駆動することのできる制御配列に連結されうる。そのような制御領域は当業者にとって公知であり、過度の実験を行なわずに使用されうる。
【００７３】
内在性ＩＧＳ５８遺伝子配列の過少発現のためには、そのような配列は、目的の動物のゲノム内に再導入されたときに、内在性ＩＧＳ５８遺伝子の対立遺伝子が不活性化つまり「ノックアウト」されるように単離され、操作されうる。好ましくは、操作されたＩＧＳ５８遺伝子の配列は、内在性ＩＧＳ５８配列が、操作されたＩＧＳ５８遺伝子配列の動物ゲノムへの組み込みに伴って乱されるように、遺伝子ターゲティングを介して導入される。
【００７４】
マウス、ラット、ウサギ、リス、モルモット、ブタ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ　ｐｉｇ）、ヤギおよびヒト以外の霊長類動物（たとえば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー）をそれらに限定することなく含む任意の種の動物が、ＩＧＳ５８関連疾患の動物モデルを生成するために用いられうる。
【００７５】
当該技術分野において知られているあらゆる技法が、トランスジェニック動物の初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）系統を生成するためにＩＧＳ５８導入遺伝子を動物に導入するために用いられうる。そのような技法には、前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｅ．，１９８９，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８７３，１９１）；レトロウイルスの媒介による生殖細胞系列への遺伝子導入（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８２：６１４８−６１５２，１９８５）；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　５６：３１３−３２１，１９８９）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４，１９８３）；および精子の媒介による遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　５７：７１７−７２３，１９８９）などを含むが、それらに限定はされない。そのような技法の総説については、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９，１９８９を見よ。
【００７６】
本発明は、そのすべての細胞中にＩＧＳ５８導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、および、そのすべての細胞ではなく、いくつかのものに導入遺伝子を持つ動物（すなわちモザイク動物）を提供する（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：７６１−７６３，１９９４によって記述された技法を見よ）。導入遺伝子は単一の導入遺伝子として、もしくはコンカテマー（例えば、先頭と先頭の向かい合ったタンデム型、もしくは先頭と尾部の並んだタンデム型）として組み込まれうる。導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏ　ｅｔ　ａｌの教えに従って、特定の細胞型に選択的に導入され、活性化されることもできる（Ｌａｓｋｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６，１９９２）。
【００７７】
そのような細胞型に特異的な活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当該技術分野における熟練者にとっては明白である。
【００７８】
ＩＧＳ５８導入遺伝子が内在性ＩＧＳ５８遺伝子の染色体の部位に組み込まれることが要求される場合には、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に述べると、そのような技術が利用される場合、目的の内在性ＩＧＳ５８遺伝子（例えば、マウスＩＧＳ５８遺伝子のヌクレオチド配列）に相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同遺伝子組換えを通して内在性ＩＧＳ５８遺伝子もしくは対立遺伝子のヌクレオチド配列内に組み込み、その機能を乱す目的で設計される。導入遺伝子はまた、たとえば、Ｇｕ　ｅｔ　ａｌ．の教えに従って、選択的に特定の細胞型に導入され、よって、その細胞型のみにおいて目的の内在性遺伝子を不活化することもできる。（Ｇｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：１０３−１０６，１９９４）。そのような細胞型に特異的な不活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当該技術分野における熟練者にとっては明白である。
【００７９】
いったんトランスジェニック動物が作製されると、組換えＩＧＳ５８遺伝子およびタンパク質の発現は、標準的な技法を利用して分析されうる。初期のスクリーニングは、導入遺伝子の組込みが起こったか否かを評価するために動物組織を分析するサザンブロット分析もしくはＰＣＲ手法によって達成されうる。また、トランスジェニック動物の組織中のＩＧＳ５８導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット解析、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、およびＲＴ−ＰＣＲをそれらに限定することなく含む技法を用いても評価されうる。また、標的遺伝子を発現している組織のサンプルは、目的の標的遺伝子の導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いた免疫細胞化学分析によっても評価されうる。ＩＧＳ５８遺伝子ｍＲＮＡもしくはＩＧＳ５８導入遺伝子ペプチドを容易に検出可能なレベルで発現するＩＧＳ５８トランスジェニック動物（標的遺伝子産物エピトープに対して作製された抗体を用いて、免疫細胞化学的に検出される）は、それから、ＩＧＳ５８に基づく特徴的な疾患症状を呈する動物を同定するために、さらに評価されうる。
【００８０】
いったんＩＧＳ５８トランスジェニック初代動物（つまり、目的の細胞もしくは組織においてＩＧＳ５８タンパク質を発現し、好ましくはＩＧＳ５８に基づく疾患の症状を示す動物）が作製された後は、それらは特定の動物のコロニーを生成するために飼育され、同系交配され、異系交配され、もしくは交雑育種される。そのような育種戦略の例には、別個の系統を確立するための、１つ以上の組み込み部位を持つ初代動物の異系交配；各ＩＧＳ５８導入遺伝子の相加的発現効果のための、目的のＩＧＳ５８導入遺伝子をより高いレベルで発現する複合ＩＧＳ５８トランスジェニック動物を生成するための個別の系統の同系交配；発現を高め、ＤＮＡ解析による動物のスクリーニングの必要の可能性を排除するために、与えられた組み込み部位についてホモ接合性の動物を生成するためのヘテロ接合性のトランスジェニック動物の交雑；合成的なヘテロ接合性もしくはホモ接合性の系統を生成するための別個のホモ接合性系統の交雑；対立遺伝子の修正がＩＧＳ５８導入遺伝子の発現およびＩＧＳ５８様症状の発生に与える影響を調べるための、異なる同系交配遺伝的背景への動物の育種；を含むがそれらに制限はされない。一つのそのようなアプローチは、上述のもののようなＩＧＳ５８関連疾患様症状を示すＦ１世代を生成するために、ＩＧＳ５８トランスジェニック初代動物と野生型系統を交配することである。Ｆ１世代はそれから、ホモ接合性の標的遺伝子トランスジェニック動物が生存可能であることが判明した場合には、ホモ接合性の系統を作製するために同系交配される。
【００８１】
〔ワクチン〕
発明の別の態様は、とりわけ上述の疾患から動物を保護する抗体および／もしくはＴ細胞免疫応答を生じるのに十分なＩＧＳ５８ポリペチドもしくはそのフラグメントを、もし必要であればＲＡＭＰポリペチドと一緒に、哺乳類に対して（たとえば、接種により）投与することを含んで成る、哺乳類において免疫応答を誘導する方法に関する。特に、本発明は精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺、および中枢神経系（例えば、胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床）に関係する機能不全、障害もしくは疾患から動物を保護する抗体および／もしくはＴ細胞免疫応答を生じるのに十分なＩＧＳ５８ポリペチドもしくはそのフラグメントを、もし必要であればＲＡＭＰポリペチドと一緒に、哺乳類に対して（たとえば、接種により）投与することを含んで成る、哺乳類において免疫応答を誘導する方法に関する。
【００８２】
本発明のさらに別の態様は、疾患から哺乳類を保護するための抗体を生成するような免疫応答を誘導するために、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＩＧＳ５８ポリヌクレオチドの発現を指示するベクターを通してＩＧＳ５８ポリペチドを送達することを含んで成る、前記動物において免疫応答を誘導する方法に関する。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物宿主内に導入されるとＩＧＳ５８ポリペチドに対する免疫応答をその哺乳類において誘導する、ＩＧＳ５８ポリペチドもしくはＩＧＳ５８遺伝子を含んで成る免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関する。そのような免疫学的／ワクチン製剤（組成物）は、治療用の免疫学的／ワクチン製剤、もしくは予防用の免疫学的／ワクチン製剤のいずれかでありうる。ワクチン製剤はさらに適当な担体を含んで成りうる。ＩＧＳ５８ポリペチドは胃の中で分解されうるため、非経口的に投与されることが好ましい（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、その他の注射を含む）。非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および、製剤を受容者の血液と等張性にする溶質を含みうる水性もしくは非水性の滅菌注射溶液、ならびに、懸濁剤もしくは増粘剤を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。この製剤は、例えば、封をされたアンプルおよびバイアルといった単位用量もしくは多用量容器に入れられて提示されることができ、また、使用の直前に無菌液体の添加のみを要求する凍結乾燥条件で保存されうる。ワクチン製剤はまた、たとえば水系中の油および当該技術分野おいて知られている他の系など、製剤の免疫原性を強化するためのアジュバント系を含みうる。投与量はワクチンの特異的な活性に依存し、ルーチン的な実験によって容易に決定されることができる。
【００８４】
〔スクリーニングアッセイ〕
本発明のＩＧＳ５８ポリペチドは、受容体を結合する化合物、および、活性化する化合物（アゴニスト）もしくは、本発明の受容体ポリペチドの活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）のスクリーニング・プロセスにおいて使用されうる。よって、本発明のポリペチドはまた、たとえば、細胞、無細胞調製液、ケミカルライブラリーおよび天然産物混合液における、小分子基質およびリガンドの結合を評価するためにも使用されうる。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドでありえ、または、構造的もしくは機能的な模倣物でありうる。
【００８５】
ＩＧＳ５８ポリペチドは病理を含む生物学的機能をもたらす。したがって、一方ではＩＧＳ５８を刺激し、他方ではＩＧＳ５８の機能を阻害することができる化合物および薬剤を見つけることが望ましい。一般に、アゴニストは、とりわけ上述の疾患のような状態に対する、治療的および予防的な目的のために利用される。特に、アゴニストは、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患に対する治療的および予防的な目的のために利用される。
【００８６】
アンタゴニストは、とりわけ上述の疾患のような状態に対する、さまざまな治療的および予防的な目的のために利用されうる。特に、アンタゴニストは、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患に対する、さまざまな治療的および予防的な目的のために利用されうる。
【００８７】
一般に、そのようなスクリーニング手順は、本発明の受容体ポリペチドをその表面に発現する適当な細胞を生成すること、および、もし必須であればその表面におけるＲＡＭＰの同時発現を含む。そのような細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエもしくは大腸菌からの細胞を含む。受容体を発現している細胞（もしくは発現された受容体を含む細胞膜）はそれから、結合もしくは刺激もしくは機能的反応の阻害を観察するために、試験化合物と接触させられる。
【００８８】
スクリーニング技法には、細胞外ｐＨ、細胞内ｐＨもしくは受容体の活性化に起因する細胞内カルシウムの変化を測定する系における、本発明の受容体を発現する細胞（例えば、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞）の使用を含む。この技法では、化合物は本発明の受容体ポリペチドを発現している細胞に接触させられうる。それから、潜在的な化合物が受容体を活性化するか、もしくは阻害するか否かを決定するために、二次メッセンジャー反応（例えば、シグナル伝達、ｐＨ変化もしくはカルシウム濃度の変化）が測定される。
【００８９】
別の方法は、受容体媒介シグナル（例えば、ｃＡＭＰの蓄積および／もしくはアデニル酸シクラーゼ活性）の変調を決定することによる受容体阻害剤のスクリーニングを含む。そのような方法には、細胞表面上に受容体を発現するために、本発明の受容体を真核細胞にトランスフェクトすることを含む。細胞はそれから、潜在的なアンタゴニストの存在下で、本発明の受容体に対するアゴニストに暴露される。潜在的なアンタゴニストが受容体に結合し、よって受容体結合を阻害するならば、アゴニスト媒介シグナルは変調される。
【００９０】
本発明の受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを検出する別の方法は、米国特許第５，４８２，８３５号に記述されているような、酵母に基づく技法である。
【００９１】
アッセイは単に、候補化合物の結合を試験してもよい。そして、ここにおいて、受容体を有する細胞への付着は、候補化合物に直接的もしくは間接的に結合する標識によって、または、標識競合物との競合を含むアッセイにおいて検出される。さらに、これらのアッセイは、受容体をその表面に有する細胞に適した検出系を使用して、候補化合物が受容体の活性化によって発生するシグナルをもたらすか否かを試験しうる。活性化の阻害剤は一般に既知のアゴニストの存在下で分析され、候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響が観察される。
【００９２】
さらに、アッセイは単に、混合液を形成するために候補化合物とＩＧＳ５８ポリペチドを含む溶液を混ぜ合わせるステップ、混合液中のＩＧＳ５８活性を測定するステップ、および、混合液のＩＧＳ５８活性を標準と比較するステップを含んで成りうる。
【００９３】
また、ＩＧＳ５８　ｃＤＮＡ、タンパク質およびタンパク質に対する抗体は、添加された化合物が細胞中のＩＧＳ５８　ｍＲＮＡおよびタンパク質の合成に与える影響を検出するためのアッセイを構成するためにも使用されうる。たとえば、ＥＬＩＳＡは、当該技術分野において知られている標準的な方法により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて、ＩＧＳ５８タンパク質の分泌レベル、もしくは細胞に結合したレベルを測定するために構築されることができ、これは、適当に操作された細胞もしくは組織からのＩＧＳ５８の合成を阻害もしくは増進しうる薬剤（それぞれ、アンタゴニストもしくはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために使用されうる。スクリーニング・アッセイを行なうための標準的な方法は、当該技術分野おいて公知である。
【００９４】
潜在的なＩＧＳ５８アンタゴニストの例には、抗体もしくは、いくつかの場合には、ＩＧＳ５８のリガンドに密接に関係したオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（たとえば、受容体の活性が妨げられるように受容体に結合するが、反応は引き出さないリガンドのフラグメントもしくは小分子）を含む。
【００９５】
このように、別の態様において、本発明はＩＧＳ５８ポリペチドに対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、または、ＩＧＳ５８ポリペチドの合成を減少、増加および／もしくは他の方法で高める化合物を同定するためのスクリーニング・キットであって、
（ａ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチド；
（ｂ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドを発現している組換え細胞；
（ｃ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドを発現している細胞膜；もしくは
（ｄ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチドに対する抗体；
を含んで成るスクリーニング・キットに関する。
【００９６】
そのようなあらゆるキットにおいて（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は実質的な成分を構成しうることが認識されるであろう。
【００９７】
〔予防および治療の方法〕
本発明は、過剰なＩＧＳ５８活性および不十分なＩＧＳ５８活性の両方に関係する異常状態を処置する方法を提供する。
【００９８】
ＩＧＳ５８の活性が過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用できる。一つのアプローチは、リガンドのＩＧＳ５８への結合をブロックすることによって、または、ＲＡＭＰペプチドもしくは二次シグナルとの相互作用を阻害することによって活性化を阻害し、それによって、異常な状態をやわらげるのに有効な量の上に記載されたような阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製薬学的に許容しうる担体と共に患者に投与することを含んで成る。
【００９９】
別のアプローチでは、内在性のＩＧＳ５８と競合してリガンドを結合することができる可溶性形態のＩＧＳ５８ポリペチドが投与されうる。そのような競合剤の典型的な実施態様は、ＩＧＳ５８ポリペチドのフラグメントを含んで成る。
【０１００】
さらに別のアプローチでは、内在性のＩＧＳ５８をコードしている遺伝子の発現が、発現ブロッキング技法を使って阻害されうる。既知のそのような技法には、内部で生成されるか、もしくは別個に投与されるアンチセンス配列の使用を含む。たとえば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ　ＵＳＡ（１９８８）を見よ。あるいは、遺伝子と三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドが供給されうる。たとえば、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；　Ｃｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；　Ｄｅｒｖａｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を見よ。これらのオリゴマーはそれ自体が投与されることができ、もしくは、関連するオリゴマーがｉｎ　ｖｉｖｏで発現されることができる。合成アンチセンスもしくは三重鎖オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基もしくは修飾された骨格を含んで成りうる。後者の例には、メチルホスホネート、ホスホロチオネートもしくはペプチド核酸骨格を含む。そのような骨格は、ヌクレアーゼによる分解からの保護を提供するために、アンチセンスもしくは三重鎖オリゴヌクレオチド中に取り入れられ、当該技術分野において公知である。これら、もしくは他の修飾骨格により合成されたアンチセンスおよび三重鎖分子もまた、本発明の一部を構成する。
【０１０１】
さらに、ＩＧＳ５８ポリペチドの発現は、ＩＧＳ５８　ｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを用いることによって妨げられうる。リボザイムとは、天然もしくは合成の触媒的に活性なＲＮＡである（たとえば、Ｕｓｍａｎ，Ｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ（１９９６）６（４），５２７−３３を見よ）。合成リボザイムは、選択された位置でＩＧＳ５８　ｍＲＮＡを特異的に切断し、それによって、ＩＧＳ５８　ｍＲＮＡが機能的なポリペチドに翻訳されるのを妨げるように設計されうる。リボザイムは、通常ＲＮＡ分子中に見い出だされるような天然型のリボース・リン酸骨格および天然型の塩基によって合成されうる。あるいは、リボザイムは、リボヌクレアーゼ分解からの保護を提供するために、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡなどの非天然骨格によって合成され、また、修飾された塩基を含んでもよい。
【０１０２】
また、ＩＧＳ５８の過少な発現およびその活性に関係する異常状態の処置のためには、数種のアプローチが利用できる。一つのアプローチは、治療的に有効な量の上述のようなＩＧＳ５８を活性化する化合物（すなわちアゴニスト）を薬学的に許容されうる担体と組み合わせて患者に投与し、それによって、異常状態をやわらげることを含んで成る。あるいは、遺伝子治療が患者の関連する細胞によるＩＧＳ５８の内因的合成をもたらすために使用されうる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上で述べたように、複製に欠陥を持つレトロウイルスベクターによる発現用に設計されうる。レトロウイルス発現コンストラクトはそれから単離され、パッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染力を持ったウィルス粒子を生成するように、本発明のポリペチドをコードしているＲＮＡを含むレトロウイルス・プラスミドベクターを形質導入されたパッケージング細胞へと導入されうる。これらの生産細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで細胞を操作するため、また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるポリペチドの発現のために患者に投与されうる。遺伝子治療の概要については、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｔｒａｃｈａｎ　Ｔ．ａｎｄ　Ｒｅａｄ　Ａ．Ｐ．，ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ（１９９６）の第２０章Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその中で引用されている参考文献）を見よ。
【０１０３】
上述の治療方法のいずれもが、そのような治療を必要としているあらゆる患者（たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルのような哺乳類、最も好ましくはヒトを含む）に適用されうる。
〔製剤および投与〕
ＩＧＳ５８ポリペチドの可溶な形態のようなペプチド、およびアゴニスト、およびアンタゴニスト・ペプチド、もしくは小分子は、適当な製薬学的担体と組み合わせて調合されうる。そのような製剤は、治療的に有効な量のポリペチドもしくは化合物、および製薬学的に許容されうる担体もしくは賦形剤を含んで成る。製剤は投与の様式に適合すべきであり、十分に当該技術分野の技術の範囲内である。発明はさらに、１種以上の本発明の前述の組成物の成分が充填された１つ以上の容器を含んで成る製薬学的パックおよびキットに関する。
【０１０４】
本発明のポリペチドおよび他の化合物は単独で、もしくは、治療薬化合物のような他の化合物との併用で使用されうる。
【０１０５】
本製薬組成物の全身投与の好ましい形態は、一般的には静脈内注射による注射を含む。皮下、筋肉内もしくは腹腔内のような他の注射経路も使用されうる。全身投与のための代替的な手段には、胆汁酸塩もしくはフシジン酸もしくは他の界面活性剤のような浸透剤を用いた経粘膜的および経皮的な投与を含む。さらに、腸溶性もしくは被包性の製剤に正しく調剤されたなら、経口投与もまた可能となりうる。
【０１０６】
必要な投与量の範囲は、ペプチドもしくは化合物の選択、投与の経路、製剤の性質、患者状態の性質、および担当医師の判断に依る。適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり０．１〜１００μｇの範囲にある。しかし、利用可能な化合物の種類およびさまざまな投与経路の異なる効率を考慮すると、必要とされる投与量の広い変動が予期される。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予期されるであろう。これらの投与量レベルの変動は、当該技術分野においてよく理解されているように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを使って調節されうる。
【０１０７】
処置に使われるポリペチドは、先に述べたように「遺伝子治療」としばしば呼ばれる処置様式において、患者中で内因的にも生成されうる。よって、例えば、患者由来の細胞は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのようなポリペチドをコードするポリヌクレオチドによって、例えば、レトロウイルス・プラスミドベクターを使用してｅｘ　ｖｉｖｏで操作されうる。細胞はそれから、患者内に導入される。
【０１０８】
【実施例】
以下の例は、本発明をより詳細にさらに具体的に示すことのみが意図されており、したがって、これらの例は決して本発明の範囲を限定するとはみなされない。
例１．新規Ｇタンパク質共役受容体をコードするｃＤＮＡのクローニング。
【０１０９】
未完成のハイスループット・ゲノムＤＮＡ配列（ｈｔｇｓ）のパブリックドメイン・データバンク中に、我々は潜在的に新規のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードするヒト・ゲノム配列（登録番号：ＡＬ１６２４７１）を同定した。我々はこの新規ＧＰＣＲをＩＧＳ５８と呼ぶ。ヒト組織からそのｃＤＮＡをクローニングすることを試みることによって、このゲノム配列が機能的な遺伝子をあらわしているか否かを調査することが決定された。ヒト精巣ポリＡ（＋）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ｃａｔ＃６５３５−１）は酵素の供給元によって推奨されるプロトコールに従って、まず、残存する微量のゲノムＤＮＡを破壊するためにＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって処置され、それから、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使い、逆転写を通してｃＤＮＡに変換された。ＰＣＲプライマーは推定上のＩＧＳ５８コード配列を増幅するように設計された。最初のＰＣＲ反応（５０μｌ体積）はＱｉａｇｅｎによって推奨される条件の下で、それぞれフォワードおよびリバースプライマーのＩＰ１５，０７３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）およびＩＰ１５，０７５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）と共にＨｏｔＳｔａｒＴａｑ^ＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ　＃２０３２０３）を使って、精巣ｃＤＮＡ鋳型（ＤＮａｓｅ　Ｉで処置され、逆転写された５０ｎｇのヒト精巣ポリＡ（＋）ＲＮＡに由来）に対して実施された。ＰＣＲ反応については、反応チューブは１５分間９５℃で加熱され、それから３５サイクルの変性（３０秒、９５℃）、アニーリング（１２０秒、６５℃）および伸長（９０秒、７２℃）に付された。１０分間、７２℃の最終的な伸長が行なわれた。最初のＰＣＲ反応の１／５０希釈の１μｌが、それぞれネステッド・フォワードプライマーＩＰ１５，０７４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）および最初のリバースプライマーＩＰ１５，０７５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）と共にＨｏｔｓｔａｒＴａｑ^ＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ　＃２０３２０３）を使用したセミネステッドＰＣＲ反応における鋳型として使用された。その後の便利なサブクローニングを可能とするために、ＢａｍＨＩクローニングサイトがＩＰ１５，０７４の５’末端に追加された。ネステッドＰＣＲ反応のためのサイクリング条件は、最初のＰＣＲのものと同一であった。ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動によって分析され、エチジウムブロマイドにより染色された。最初のＰＣＲ反応はシグナルを生じなかったが、セミネステッドＰＣＲ反応は約１６００ｂｐの明確なＤＮＡフラグメントを生成した。模擬逆転写したＲＮＡ（逆転写反応中にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＩＩを加えなかったもの）が使用された場合にはＤＮＡ産物は得られず、この１６００ｂｐフラグメントがｃＤＮＡに由来するものであることが示された。この±１６００ｂｐフラグメントは、Ｑｉａｑｕｉｃｋ^ＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製され、供給元によって推奨される手順に従って、ｐＧＥＭ−Ｔベクターに連結された（ｐＧＥＭ−Ｔ　ｓｙｓｔｅｍ，　Ｐｒｏｍｅｇａ）。組み換えプラスミドはそれから、コンピテント大腸菌株ＤＨ５αＦ’バクテリアを形質転換するために使用された。形質転換された細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）およびＸ−ｇａｌ（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗布された。プラスミドＤＮＡはＢｉｏＲｏｂｏｔ^ＴＭ　９６００核酸精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、個々の白色コロニーのミニ培養から精製され、シークエンシングされた。ＤＮＡシークエンシング反応は、インサートに隣接するプライマーと内部の（ＩＧＳ５８に特異的な）プライマーを使用し、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ　ＢｉｇＤｙｅ^ＴＭ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、精製されたプラスミドＤＮＡに対して実施された。サイクル・シークエンシング反応産物はＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈殿によって精製され、ＡＢＩ３７７自動シーケンサーにセットされた。クローンＩＧＳ５８．６は１６０４ｂｐのＤＮＡ配列を含み、４８２アミノ酸のタンパク質をコードしていた。我々は、このＤＮＡ配列（ＢａｍＨＩクローニングサイトを含まない）およびコードされるタンパク質をそれぞれＩＧＳ５８ＤＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）およびＩＧＳ５８ＰＲＯＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）と呼ぶ。ＩＧＳ５８ＤＮＡ配列は、１９番目（Ａの代わりにＧ）、３５番目（Ｃの代わりにＴ）および１４３１番目（Ｃの代わりにＴ）のヌクレオチド位置を除き、初めにゲノム・エントリＡＬ１６２４７１内に同定された部分と同一だった。１９番目のヌクレオチドは５’非コード領域中にあり、コードされるタンパク質には影響しない（ヌクレオチド位置１９は実際にはプライマーＩＰ１５，０７４の３’側の最後から２番目のヌクレオチドである。このプライマーはその位置に「Ａ」を持つように設計されたものの、合成中にその位置に「Ｇ」が導入されたらしい）。３５番目のヌクレオチドの変化はＩＧＳ５８のオープンリーディングフレーム内であるが、コードされるアミノ酸の同一性には影響を及ぼさない。しかし、１４３１番目のヌクレオチドの差異は、コードされるタンパク質の変化（Ｖａｌ−＞Ａｌａ）を導く。ＩＧＳ５８ＤＮＡ配列の３’末端と完全に重複するヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）配列エントリＡＷ１９６３３１およびＡＡ６３４４４６もまた、１４３１番目の位置にＴを有している。
【０１１０】
最新のタンパク質データバンクおよび翻訳されたＤＮＡデータバンクのＩＧＳ５８ＰＲＯＴ配列ホモロジー検索が、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．［１９９７］，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて実施された。これらの検索は、ＩＧＳ５８ＰＲＯＴ配列がヒト白血球血小板活性化因子受容体をあらわすと主張される配列に最も類似することを示した（アライメントされた３１２残基について９２％の同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１４９６８；しかし、このタンパク質は３２２残基の長さしかない）。ＤＮＡレベルでは、ＩＧＳ５８ＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋのＭ７６６７６配列と（アライメントされた１４２６ヌクレオチドについて）９８％が同一だった。ＩＧＳ５８ＤＮＡと比較すると、Ｍ７６６７６ＤＮＡ配列中には多くの挿入／欠失が存在しており、その結果、ＩＧＳ５８ＰＲＯＴ（の一部）と９２％のみが同一の、より短いコードされたタンパク質がもたらされている。
【０１１１】
【表３】

【０１１２】
例２．哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｕＩＧＳ５８の作製。
【０１１３】
プラスミドｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ５８（ヒトＩＧＳ５８タンパク質の完全なコード配列を含む）を保有する大腸菌株ＩＧＳ５８．６が、ＬＢ寒天プレート（１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンを含む）上に再塗布された後に再クローニングされ、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社の細菌株コレクション（ＩＣＣＧ　４５８４）とオランダ・ユトレヒトの「Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）」（登録番号：１０９７１７）の両方に寄託された。再クローニングされた単離株から調製したプラスミドＤＮＡは再度シークエンシングされ、以前に決定されたＩＧＳ５８ＤＮＡコンセンサス配列に同一であることが見出された。
【０１１４】
完全なＩＧＳ５８コード配列を含んでいる１５６３ｂｐのＤＮＡフラグメントは、オリゴヌクレオチドプライマーＩＰ１５，０７４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびＩＰ１５，０７６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）を用いて、ｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ５８プラスミド鋳型からＰＣＲ増幅された。オリゴヌクレオチドＩＰ１５，０７４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびＩＰ１５，０７６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）は、それらの５’末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイトを含んでいた。増幅されたＰＣＲフラグメントはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化され、ゲルから精製された（ＭｉｎｉＥｌｕｔｅゲル抽出プロトコール、Ｑｉａｇｅｎ）。ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミド発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、直鎖状化された５４１３ｂｐのベクターフラグメントもまたゲルで精製された。消化されたプラスミドとＰＣＲフラグメントは連結され、ライゲーション混合液は熱ショックによってコンピテント大腸菌株ＤＨ５αＦ’バクテリア中に導入された。形質転換された細菌はＬＢ寒天プレート（１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンを含む）上に塗布され、３７℃で一晩インキューベートされた。個々の細菌コロニーが選択され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩で培養された。プラスミドＤＮＡが調製され、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断解析によって分析された。３つのクローン（クローン１７、２３、２６）は正しい制限プロファイルを示し、ＤＮＡ配列解析を通してさらに特徴づけられた。クローン２６はＩＣＣＧ　４７４８としてＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓの細菌培養コレクションに寄託された（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｕＩＧＳ５８を保持）。
【０１１５】
ＩＣＣＧ　４７４８株から調製されたプラスミドＤＮＡであるｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｕＩＧＳ５８のＤＮＡ配列解析は、インサートがＩＧＳ５８ＤＮＡコンセンサスｃＤＮＡ配列と完全に同一であることを示した。
例３．定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）による異なるヒト組織中のＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの発現解析。
【０１１６】
ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）およびＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの絶対的発現量は、Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ^ＴＭ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および遺伝子特異的ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブをヒトＲＮＡサンプルに対して用いて、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（Ｑ−ＰＣＲ）において決定された。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルが、異なるＲＮＡサンプルのｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅の効率のコントロールとして測定された。
【０１１７】
ｃＤＮＡは異なるヒト組織の総ＲＮＡ（ＣｌｏｎｔｅｃｈヒトＲＮＡパネルｃａｔ＃Ｋ４０００−１、Ｋ４００１−１、Ｋ４００２−１、Ｋ４００３−１およびＫ４００４−１）、もしくはヒト脳の異なる小領域に由来するポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ｃａｔ＃６５８０．１，６５７５．１，６５４３．１，６５７４．１，６５７７．１，６５７８．１および６５８２．１）のいずれかからの逆転写を通して合成された。逆転写の前に、ＲＮＡは可能な汚染性ゲノムＤＮＡを破壊するために、供給元によって推奨される手順に従って、ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｃａｔ＃１８０６８−０１５）で処置された。ＤＮａｓｅ　Ｉ反応はＥＤＴＡを添加し（最終濃度＝２．３ｍＭ）、６５℃で１０分間加熱することによって停止された。ＤＮａｓｅ　Ｉで処置されたＲＮＡ（５μｇの総ＲＮＡもしくは９４５ｎｇのポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡのいずれか）は、２．５μｇのオリゴ（ｄＴ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　＃１８４１８−０１２）にアニーリングさせられ、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ；１００μｌ反応体積；３７℃で１時間）を用いた逆転写に付された（＝ＲＴ^＋反応）。逆転写酵素は９３℃で５分間のインキュベーションによって不活化された。ＤＮａｓｅで処置されたＲＮＡの一部は逆転写にかけられず、残存性のゲノムＤＮＡの存在について調べるためのコントロールとして用いられた（ＲＴ⁻反応）。
【０１１８】
ゲノムＤＮＡの非存在のためのコントロールとして、総ＲＮＡのＲＴ⁻反応液に対してヒトβ_２ミクログロブリンＤＮＡに特異的なＰＣＲ増幅反応が実施された。ＰＣＲ反応は、２．５μｌのＧｅｎｅＡｍｐ^ＴＭ　１０×　ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各２００μＭのｄＮＴＰ、０．５μｌの、ＲＴ⁻　ｃＤＮＡ合成反応液、各５ｐｍｏｌのＰＣＲプライマーＩＰ３，９８１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）およびＩＰ３，９８２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）、ならびに１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ^ＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｃａｔ＃Ｎ８０８−０２４４）を含む、２５μｌ反応体積中で実施された。９５℃で１０分間の初期的なインキュベーションの後、反応は以下のようにして３０サイクルが行なわれた：９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリング、および７２℃で１分の伸長。最終的な伸長が７２℃で１０分間行なわれた。ポジティブコントロールとして、５０ｎｇのヒト・ゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　＃６５５１−１）が用いられた。予想される長さのアンプリコンが、ゲノムＤＮＡ鋳型から得られたが、ネガティブコントロール（Ｈ_２Ｏ）からも、また、ＲＴ⁻サンプルからも得られなかった（ＩＰ３，９８１／ＩＰ３９８２プライマー対が６１６ｂｐのイントロンを跨いでいるという事実のために、ｃＤＮＡ上およびゲノムＤＮＡで予想されるアンプリコンの長さはそれぞれ２６９ｂｐおよび８８５ｂｐである）。ＲＴ⁻ポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡサンプルは、０．８μｌのＲＴ⁻　ｃＤＮＡ合成反応液を用いたＧＡＰＤＨ特異的Ｑ−ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡの存在について分析された（下記参照）。ＧＡＰＤＨに特異的なシグナルは得られなかった。我々は、合成されたｃＤＮＡにはゲノムＤＮＡは含まれないと結論した。
【０１１９】
Ｑ−ＰＣＲ反応は、１×　ＴａｑＭａｎ^ＴＭＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｃａｔ＃４３０４４３７）、０．１２ｍｇ　ＢＳＡ／ｍｌ、９００ｎＭのＧＡＰＤＨもしくはＩＧＳ５８のいずれかに特異的なフォワードおよびリバースプライマー（ＧＡＰＤＨについてはＩＰ１５，５２９［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９］／ＩＰ１５，５３１［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０］、ＩＧＳ５８についてはＩＰ１５，７１４［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１］／ＩＰ１５，７１５［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２］）、２５０ｎＭの遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブ（それぞれ、ＧＡＰＤＨについてはＩＰ１５，５３０［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３］、ＩＧＳ５８についてはＩＰ１５，７０５［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４］）、および１．６μｌの総ＲＮＡ　ＲＴ^＋もしくはポリ（Ａ）^＋　ＲＴ^＋　ｃＤＮＡ合成反応液を含む、２０μｌの反応体積中で実施された。１×　ＴａｑＭａｎ^ＴＭ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘは、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ^ＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐＥｒａｓｅ^ＴＭウラシルＮグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ、Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　１、および最適化されたバッファー成分を含んだ。特異的なプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ）により設計された。遺伝子特異的標準曲線は、直鎖状のｐＧＥＭ−ＴｈｕＧＡＰＤＨ（完全長のヒトＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡを含む）もしくはｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ５８プラスミド（ＩＣＣＧ　４５８４）の一連の１／１０希釈（１反応あたり１０^８〜１０^２コピー）に基づき確立された。ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ^ＴＭ装置のガラスキャピラリーキュベット中で実施された。（ＡｍｐＥｒａｓｅ　ＵＮＧ反応を行なわせるための）５０℃で２分間の初期インキュベーションの後、９５℃で１０分間のＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ^ＴＭの活性化が続き、以下のようにして反応が５０サイクル行なわれた：９５℃で１５秒の変性、６０℃で６０秒のアニーリング／伸長（ＧＡＰＤＨおよび１ＧＳ５８の両方）。サンプルの定量はＬｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０を使って実施された。
【０１２０】
ヒトＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡの絶対発現量は、骨格筋（ポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約７．４×１０^６コピー）、心臓（ポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約２．３×１０^６コピー）、および膵臓、脾臓、肝臓および胃（それぞれ、ポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約４×１０^５〜約１．５×１０^６コピーの範囲）を除くほとんどの組織においてポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約１〜３×１０^５コピーの範囲であった（図１）。
【０１２１】
ＩＧＳ５８　ｍＲＮＡは、精巣においては、２番目に高い発現量を持つ組織（前立腺：ｍＲＮＡ　１ｎｇあたり６，５０１コピー）よりも、一桁多量に存在することが見出された（図２）。また、比較的高いレベル（ｍＲＮＡ　１ｎｇあたり１，０００〜４，０００コピー）が中枢神経系の組織（胎性脳、脳、小脳および脊髄）においても観察された。これは、異なる脳小領域から得られたポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡについて得られたＱ−ＰＣＲのデータによって確証された：この部分のＩＧＳ５８　ｍＲＮＡ発現量は、黒質（ｍＲＮＡ　１ｎｇあたり２９６コピー）を除き、ｍＲＮＡ　１ｎｇ　あたり５００〜１，０００コピーであった。また、かなりのレベルのＩＧＳ５８　ｍＲＮＡが、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎および甲状腺に見出された。
【０１２２】
【表４】

【０１２３】
例４．ＩＧＳ５８をトランスフェクトした細胞の作製。
【０１２４】
ＩＧＳ５８のリガンドを同定するためには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、ＩＧＳ５８オーファン受容体のｃＤＮＡによって安定にトランスフェクトされる。ＩＧＳ５８受容体のＧタンパク質共役機構は未だ不明であるので、ＧＰＣＲのための「万能アダプター」として知られるＧタンパク質Ｇα１６を発現する特異的なＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）が用いられる（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　Ｇ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１７：２３５−７）。この細胞株はまた、ミトコンドリアへと誘導されるアポエクオリンを安定に発現する。
【０１２５】
材料には、ＩＧＳ５８　ｐｃＤＮＡ３．１ベクター［ＩＣＣＧ　＃４７４８］；ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）；培養培地：１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、ハイグロマイシンＢ　４００μｇ／ｍｌを補充したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）；選択培地：１０％　ＦＣＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、ハイグロマイシンＢ　４００μｇ／ｍｌおよびジェネテシン５００μｇ／ｍｌを補充したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）；ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、２Ｕ／μｌ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　２００Ｕ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を含む。
【０１２６】
ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６／ｍｔＡＥＱ細胞は、製造業者により記述されたようにして、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトされる。トランスフェクションは２４穴プレート中で行なわれる。培養培地中で２４時間後、培地は取り除かれ、選択培地と取り替えられる。選択培地中でコンフルエントになるまで培養された後、このポリクローナルは一度、２４穴プレート中で継代される。
【０１２７】
ポリクローナルの選抜はＱ−ＰＣＲによって行なわれる。ＲＮＡは、供給されるプロトコールに従って、Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により、モノクローナル（２４穴プレートの１つのコンフルエントなウェル）から単離される。ＲＮＡはサンプルあたり１ＵのＤＮａｓｅ　Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、２Ｕ／μｌ）で処理される。ＲＮＡサンプルの半分はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いたＲＴ−ＰＣＲに使用される。プライマーのアニーリングはＲＮＡとオリゴｄＴ１６（０．６μＭ）によって、６５℃から１５℃で１０分間実施される。Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）と各０．４３ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、２０Ｕ　ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、４０Ｕ／μｌ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　２００Ｕ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、２００Ｕ／μｌ）が３０μｌの最終体積にまで添加され、その後、４２℃で１時間のインキュベーションが続く。
【０１２８】
Ｑ−ＰＣＲはＩＧＳ５８受容体に特異的なＱ−ＰＣＲプライマーを用いて実施される。ＰＣＲ産物の量は、ｄｓＤＮＡに結合するＳｙｂｒ　Ｇｒｅｅｎの蛍光を測定することによって、各サイクルの後に決定される。ＩＧＳの相対発現量は、染色体ＤＮＡの４つの異なる希釈の標準曲線と関係する。相対的定量はハウスキーピング遺伝子のβチューブリンに対して標準化される。
【０１２９】
２つの最良のポリクローナルが、モノクローナルを得るために用いられる。細胞は限界希釈で播種される。先に述べたように、モノクローナルの選抜はＱ−ＰＣＲによって為される。６種の最良のモノクローナルが、Ｔ７５フラスコ中でコンフルエントになるまで培養され、１０％のＤＭＳＯを含む培養培地中で凍結される。
例５．リガンドの探索。
【０１３０】
特定のＧタンパク質共役受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６−ｍｔＡＥＱ細胞が、例４に記述されるようにして培養され、多くの化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いられる。化合物は１もしくは１０μＭの濃度で試験される。エクオリン・スクリーニングアッセイでは、ＡＴＰ（１０μＭ）もしくはジギトニン（５０μＭ）が、ポジティブコントロールとして用いられる。スクリーニングは下記のように、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ　Ｊｅｔ　１４５０（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使って半自動的に実施される。
【０１３１】
一度、化合物が見出されたなら、シグナル活性は第二のエクオリン実験によって確かめられる。その後、それらは用量反応実験において、さらに特徴づけられる。
【０１３２】
ＩＧＳ５８受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６細胞とアポエクオリンを用いてリガンドを見出すことに成功しない場合には、Ｇタンパク質Ｇα１６を持たない対応する細胞株が同様にして作製されることができ（例４参照）、その後、化合物の試験が続く。
【０１３３】
【表５】

【０１３４】
【表６】

【０１３５】
【表７】

【図面の簡単な説明】
【図１】
異なるヒト組織におけるＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ発現のＱ−ＰＣＲ分析。報告されている値（＃コピー／ｎｇ　ｍＲＮＡ）は、２回のＱ−ＰＣＲアッセイ（各アッセイは独立に調製したｃＤＮＡに対するもの）の平均値をあらわす。ｍＲＮＡは総ＲＮＡの２％を占め、そのｃＤＮＡ合成は１００％の効率であると仮定された。真の効率はおそらく２０〜５０％に近いことから、実際のコピー数は２〜５倍少なく見積もられている可能性が高い。「＊」の印の付けられた組織ではポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡが用いられたが、他の全ての組織では総ＲＮＡが用いられた。
【図２】
異なるヒト組織におけるＩＧＳ５８　ｍＲＮＡ発現のＱ−ＰＣＲ分析。報告されている値（＃コピー／ｎｇ　ｍＲＮＡ）は単一の測定からのものである。ｍＲＮＡは総ＲＮＡの２％を占め、そのｃＤＮＡ合成は１００％の効率であると仮定された。真の効率はおそらく２０〜５０％に近いことから、実際のコピー数は２〜５倍少なく見積もられている可能性が高い。「＊」の印の付けられた組織ではポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡが用いられたが、他の全ての組織では総ＲＮＡが用いられた。精巣におけるＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの発現量は、前立腺のものよりも一桁大きく、棒グラフ上にはあらわされていない。[0001]
The present invention relates to newly identified polynucleotides, the polypeptides encoded by them, and the use of such polynucleotides and polypeptides, and their production. More specifically, the polynucleotides and polypeptides of the present invention relate to G protein-coupled receptors (GPCRs), hereinafter referred to as IGS58. The present invention also relates to inhibiting or activating the action of such polynucleotides and polypeptides, vectors containing said polynucleotides, overexpression, misexpression, underexpression, and / or suppression (knockout) of the IGS58 gene. The invention also relates to host cells and transgenic animals containing such vectors. The present invention further relates to a method for screening a compound capable of acting as an agonist or antagonist of the G protein-coupled receptor IGS58.
[0002]
[Background of the Invention]
It is well established that many medically important biological processes are mediated by proteins that participate in signaling pathways, including G proteins and / or secondary messengers (eg, cAMP) (Lefkowitz). , Nature, 1991, 351: 353-354). These proteins are described herein as proteins that participate in pathways involving G proteins. Some examples of these proteins include GPC receptors such as those for adrenergic substances and dopamine (Kobilka, BK, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987, 84). Kobilka, BK, et al., Science, 1987, 238: 650-656; Bunzow, JR, et al., Nature, 1988, 336: 783-787), G protein As such, effector proteins (eg, phospholipase C, adenylate cyclase and phosphodiesterase), actuator proteins (eg, protein kinase A and protein kinase C) (Simon, MI, et al., Science, 1991,). 52: 802-8), including the.
[0003]
For example, in one form of signal transduction, upon binding of a hormone to a GPCR, its receptor interacts with a heterotrimeric G protein to induce dissociation of GDP from the guanine nucleotide binding site. At normal intracellular concentrations of guanine nucleotides, GTP immediately fills the site. Binding of GTP to the α subunit of the G protein causes dissociation of the G protein from the receptor and dissociation of the G protein into the α and βγ subunits. The form carrying GTP then binds to the activated adenylate cyclase. Hydrolysis of GTP to GDP catalyzed by the G protein itself (the α subunit has endogenous GTPase activity) returns the G protein to its basal, inactive form. The GTPase activity of the α subunit is, in essence, an internal clock that controls the on / off switch. The GDP-bound form of the α subunit has a high affinity for βγ, and subsequent recombination of αGDP and βγ returns the system to the ground state. Thus, the G protein plays a dual role as an intermediate that relays the signal from the receptor to the effector (adenylate cyclase in this example) and as a clock that controls the duration of the signal.
[0004]
The membrane-bound superfamily of G protein-coupled receptors has been characterized as having a putative seven transmembrane domain. This domain is thought to represent a transmembrane α-helix tethered to an extracellular or cytoplasmic loop. G protein-coupled receptors include a wide range of biologically active receptors, such as hormones, viruses, growth factors and neuronal receptors.
[0005]
The G protein-coupled receptor family includes dopamine receptors that bind to neuroleptic drugs used in treating CNS disease. Other examples of members of this family include calcitonin, adrenaline, neuropeptide Y, somatostatin, neurotensin, neurokinin, capsaicin, VIP, CGRP, CRF, CCK, bradykinin, galanin, motilin, nociceptin, endothelin, cAMP. , Adenosine, muscarinic, acetylcholine, serotonin, histamine, thrombin, kainin, follicle stimulating hormone, opsin, endothelial differentiation gene 1, rhodopsin, odorants, and receptors for cytomegalovirus.
[0006]
Most G protein-coupled receptors have a single conserved cysteine residue in each of the first two extracellular loops, which are disulfide bonds believed to stabilize functional protein structure To form The seven transmembrane regions are named TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 and TM7. The intracytoplasmic loop connecting TM5 and TM6 is a major component of the G protein binding domain.
[0007]
Most G protein-coupled receptors contain potential phosphorylation sites in the third cytoplasmic loop and / or at the carboxy terminus. For some G protein-coupled receptors, such as the β-adrenergic receptor, phosphorylation by protein kinase A and / or specific receptor kinases mediates receptor desensitization.
[0008]
Recently, it has been discovered that some GPCRs, such as the calcitonin receptor-like receptor, can interact with a small single transmembrane protein called the receptor activity modifying protein (RAMP). The interaction of this GPCR with a particular RAMP determines which natural ligand has the appropriate affinity for that GPCR and RAMP combination and modulates the functional signal activity of the complex (McLathier, L.). M. et al., Nature (1998) 393: 333-339).
[0009]
For some receptors, the ligand binding site of a G protein-coupled receptor comprises a hydrophilic socket formed by several G protein-coupled receptor transmembrane regions, said socket comprising a G protein-coupled receptor. It is believed that it is surrounded by hydrophobic residues. The hydrophilic side of each G protein-coupled receptor transmembrane helix is oriented inward and is assumed to form a polar ligand binding site. TM3 has been implicated in some G protein-coupled receptors as having a ligand binding site, such as the aspartic acid residue of TM3. TM5 serine, TM6 asparagine, and TM6 or TM7 phenylalane or tyrosine have also been implicated in ligand binding.
[0010]
G protein-coupled receptors can be coupled intracellularly by heterotrimeric G proteins to various intracellular enzymes, ion channels and transporters (Johnson et al., Endoc. Rev., 1989, 10: 317). -331). Different G-protein α subunits preferentially stimulate specific effectors to regulate various biological functions in cells. Phosphorylation of cytoplasmic residues of G protein-coupled receptors has been identified as an important mechanism in regulating G protein coupling of some G protein-coupled receptors. G protein-coupled receptors are found at numerous sites in mammalian hosts.
[0011]
Receptors (primarily the GPCR class) led more than half of the currently known drugs (Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516). This indicates that these receptors have an established and proven history as therapeutic targets. The novel IGS58 GPCRs described in the present invention identify and characterize additional receptors that may play a role in diagnosing, preventing, ameliorating or correcting a dysfunction, disorder or disease (hereinafter generally referred to as "disease") Clearly satisfy the need that exists in the art. Disorders include schizophrenia, obsessive-compulsive disorder (OCD), post-traumatic stress disorder (PTSD), phobias and intermittent paroxysmal anxiety (EPA) disorders such as panic, major depressive disorder, dual station Sexual disorders, Parkinson's disease, general anxiety disorders, autism, delirium, multiple sclerosis, Alzheimer's disease / dementia and other neurodegenerative disorders, severe mental retardation, dyskinesia, Huntington's disease, Tourette's syndrome, tics, tremors, CNS disorders including dystonia, spasm, anorexia nervosa, bulimia, seizures, addiction / dependence / craving, sleep disorders, epilepsy, migraine, attention deficit / hyperactivity disorder (ADHD); heart failure, angina, Irregularity, myocardial infarction, cardiac hypertrophy, hypotension, hypertension (such as essential hypertension, renal hypertension or pulmonary hypertension), thrombosis, arteriosclerosis, cerebral vasospasm, subarachnoid hemorrhage, cerebral ischemia, brain Infarction, peripheral Cardiovascular diseases including vascular disease, Raynaud's disease, kidney disease (such as renal failure); obesity; vomiting; irritable bowel syndrome (IBS), inflammatory bowel disease (IBD), gastroesophageal reflux disease (GERD), postoperative Dysmotility and gastric emptying conditions, such as gastric paresis or gastric paresis, and gastrointestinal diseases including diabetes, ulcers (such as gastric ulcers); diarrhea; other diseases including osteoporosis; inflammation; bacterial, fungal, Infections such as protozoan and viral infections (especially those caused by HIV-1 or HIV-2); pain; cancer; chemotherapy-induced injury; tumor invasion; immunological disorders; urinary retention; asthma; Arthritis; prostatic hyperplasia; endotoxin shock; sepsis; complications of diabetes mellitus; and gynecological disorders.
[0012]
In particular, the new IGS58 GPCRs described in the present invention are testes, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, tail) For the identification and characterization of additional receptors that may play an important role in diagnosing, preventing, ameliorating or correcting dysfunctions, disorders or diseases related to the nucleus, amygdala, corpus callosum, hippocampus and thalamus Satisfy the needs existing in the art.
[0013]
[Summary of the Invention]
In one aspect, the present invention relates to polypeptides, polynucleotides, and recombinants of IGS58, and methods of making them. Another aspect of the invention relates to methods of using such IGS58 polypeptides, polynucleotides and recombinant materials. Such uses include, but are not limited to, use as a therapeutic target, and use for the treatment of one of the above-mentioned diseases. In particular, this use includes testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum) , Hippocampus and thalamus, etc.).
[0014]
In yet another aspect, the present invention relates to methods for identifying agonists and antagonists using the agents provided by the present invention, and treatment of conditions associated with IGS58 imbalance by the identified compounds. Yet another aspect of the invention relates to diagnostic tests for detecting diseases associated with inappropriate IGS58 activity or levels. A further aspect of the invention relates to an animal-based system that serves as a model for a disease resulting from aberrant expression or activity of IGS58.
[0015]
[Table 1]

[0016]
[Table 2]

[0017]
[Description of the Invention]
Structural and chemical similarities in the context of sequence and motif exist between the IGS58 GPCR of the present invention and other human GPCRs. In addition, IGS58 is used in testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, hippocampus) And thalamus). Thus, it is implied that IGS58 plays a role, inter alia, in the above-mentioned diseases. IGS58 is particularly useful in testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, hippocampus and Play a role in dysfunctions, disorders or diseases related to the thalamus).
[0018]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods, devices and materials will now be described. All publications cited herein are clearly and individually indicated to be incorporated herein as if each individual publication was fully set forth by reference. As if incorporated herein by reference.
[0019]
[Definition]
The following definitions are provided to facilitate understanding of certain terms used frequently herein.
[0020]
“IGS58” particularly refers to a polypeptide comprising the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 2 or a variant thereof.
[0021]
“Receptor activity” or “biological activity of a receptor” refers to the metabolic or physiological function of said IGS58 that includes those activities with similar or enhanced activities or with reduced undesirable side effects. It also includes the antigenic and immunogenic activities of IGS58.
[0022]
“IGS58 gene” refers to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence as defined in SEQ ID NO: 1 or each variant thereof (eg, its allelic variants and / or their complements).
[0023]
"Antibodies" as used herein include polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric, single chain, humanized antibodies, as well as Fab fragments, including Fab or other products of an immunoglobulin expression library.
[0024]
"Isolated" means altered "by the hand of man" from the natural state and / or separated from the natural environment. Thus, if a naturally occurring "isolated" composition or substance is "isolated", it has been altered or removed from its original environment, or both. For example, a polynucleotide or polypeptide naturally occurring in a living animal is not "isolated", but the same polynucleotide or polypeptide separated from materials that coexist in its natural state is referred to herein as the term. As used herein, "isolated".
[0025]
"Polynucleotide" generally refers to any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, and can be unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA. "Polynucleotide" includes single- and double-stranded DNA, DNA that is a mixture of single- and double-stranded regions, single- and double-stranded RNA, single- and double-stranded DNA. Includes without limitation RNA, single stranded, or more generally double stranded or mixed components comprising DNA and RNA which may be a mixture of single stranded and double stranded regions . Further, "polynucleotide" may also include triple-stranded regions comprising RNA or DNA or both RNA and DNA. The term polynucleotide also includes DNAs or RNAs containing one or more modified bases, and DNAs or RNAs with a modified backbone, for stability or other reasons. "Modified" bases include, for example, tritylated bases and unusual bases such as inosine. Various modifications have been made to DNA and RNA; thus, "polynucleotides" are polynucleotides in chemically, enzymatically, or metabolically modified forms, as commonly found in nature, and Includes DNA and RNA chemical forms unique to viruses and cells. "Polynucleotide" also embraces relatively short polynucleotides, often referred to as oligonucleotides.
[0026]
"Polypeptide" refers to any peptide or protein comprising two or more amino acids joined together by peptide bonds or modified peptide bonds (ie, peptide isosteres). "Polypeptide" refers to short chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides or oligomers, and to longer chains, commonly referred to as proteins, and / or combinations thereof. Polypeptides can contain amino acids other than the 20 gene-encoded amino acids. "Polypeptides" include amino acid sequences that have been modified by natural processes, such as post-translational processing, or by any of the chemical modification techniques known in the art. Such modifications are well documented in basic texts and more detailed monographs, as well as in extensive research articles. Modifications can occur anywhere in the polypeptide, including the peptide backbone, amino acid side chains, and amino or carboxyl termini. It will be appreciated that the same type of modification may be present in the same or varying degrees at several sites in a given polypeptide. Also, a given polypeptide may contain many types of modifications. Polypeptides can be branched as a result of ubiquitin conjugation, and they can be branched or unbranched cyclic. Cyclic, branched, branched cyclic polypeptides may result from post-translation natural processes or may be made by synthetic methods. Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent attachment of flavin, covalent attachment of heme moieties, covalent attachment of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent attachment of lipids or lipid derivatives, covalent attachment of phosphatidylinositol; Crosslinking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, covalent crosslink formation, cystine formation, pyroglutamic acid formation, formylation, γ-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodination, methylation, Includes t-RNA mediated addition of amino acids to proteins such as myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, arginylation, and ubiquitin conjugation. For example, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed. , T .; E. FIG. Creighton, W.M. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F.C. , Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Products, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed. , Academic Press, New York, 1983; Seifter et al. , "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646 and Rattan et al. , "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 663: 48-62.
[0027]
"Variant", as the term is used herein, differs from a reference polynucleotide or polypeptide, respectively, but by an essential biological, structural, regulatory or biochemical property. Polynucleotides or polypeptides having such essential properties. A typical variant of a polynucleotide differs in nucleotide sequence from another, reference polynucleotide. Changes in the nucleotide sequence of the variant may or may not alter the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. Nucleotide changes may result in amino acid substitutions, additions, deletions, fusions, and truncations in the polypeptide encoded by the reference sequence, as discussed below. A typical variant of a polypeptide differs in amino acid sequence from another, reference polypeptide. Generally, differences are limited so that the sequences of the reference polypeptide and the variant are closely similar overall and, in many regions, identical. Variants and reference polypeptides may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, additions and deletions in any combination. The substituted or inserted amino acid residue may or may not be one encoded by the genetic code. The variant of the polynucleotide or polypeptide may be naturally occurring, such as an allelic variant, or it may be a variant that is not known to occur naturally. Non-naturally occurring variants of polynucleotides and polypeptides may be made by mutagenesis techniques, or by direct synthesis.
[0028]
"Identity" is a measure of the identity of nucleotide or amino acid sequences. Generally, the sequences are aligned so that the highest order match is obtained. "Identity" per se has an art-recognized meaning and can be calculated using published techniques. See, for example, COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A .; M. , Ed. , Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPINGING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D .; W. , Ed. Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A .; M. , And Griffin, H .; G. FIG. , Eds. , Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G .; And Academic Press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M .; and Devereux, J. et al. , Eds. , M Stockton Press, New York, 1991. There are many methods for determining the identity between two polynucleotide or polypeptide sequences, and the term "identity" is well known to those skilled in the art (Carillo, H., and Lipton, D., et al. SIAM J. Applied Math. (1988) 48: 1073). Methods commonly used to determine identity or similarity between two sequences include the methods described in Guide to Huge Computers, Martin J .; Bishop, ed. , Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H .; , And Lipton, D .; , SIAM J. et al. Applied Math. (1988) 48: 1073, including, but not limited to. Methods for determining identity and similarity are codified in computer programs. Preferred computer programming methods for determining identity and similarity between two sequences include the GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12 (1): 387), BLASTP. , BLASTN and FASTA (Atschul, SF et al., J. Molec. Biol. (1990) 215: 403). The term "homology" can be replaced by the word "identity".
[0029]
By way of illustration, a polynucleotide having at least a nucleotide sequence with “identity” of, for example, 95% to the reference nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a reference nucleotide sequence having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It means that the nucleotide sequence of the polynucleotide is identical to the reference sequence, except that each 100 nucleotides can include up to 5 nucleotide differences. In other words, to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to the reference nucleotide sequence, up to any 5% of the nucleotides in the reference sequence may be deleted or replaced with another nucleotide, Alternatively, any number of nucleotides up to 5% of the total nucleotides of the reference sequence may be inserted into the reference sequence, or any number of nucleotides up to 5% of the total nucleotides of the reference sequence may be deleted or inserted. And combinations of substitutions can occur. These differences may be individually dispersed within the nucleotides in the reference sequence at the 5 'or 3' end of the reference nucleotide sequence, or anywhere between these terminal positions, or at one or more positions in the reference sequence. May be distributed within adjacent groups.
[0030]
Similarly, a polypeptide having an amino acid sequence having at least 95% “identity” to the reference amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a reference amino acid sequence having the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2. It means that the amino acid sequence of the polypeptide is identical to the reference sequence, except that each 100 amino acids can include up to five amino acid differences. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence at least 95% identical to the reference amino acid sequence, up to 5% of any amino acid in the reference sequence is deleted or replaced with another amino acid. Alternatively, any number of amino acids up to 5% of all amino acids of the reference sequence are inserted into the reference sequence. These alterations in the reference sequence may be individually distributed among the residues in the reference sequence at the amino or carboxy terminal positions of the reference amino acid sequence, or anywhere between these terminal positions, or It can be distributed within one or more close groups.
[0031]
(Polypeptide of the present invention)
In one aspect, the invention relates to IGS58 polypeptides, including IGS58 proteins. The IGS58 polypeptide has the polypeptide of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717, deposited with the Centraalbureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands) on August 30, 2001. A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a polypeptide having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in the accession number CBS109717 of Centraalbureau voor Schimmelcuitses of Utrecht (Netherlands), and SEQ ID NO: 2 and / or Centraalbureau, Utrecht (Netherlands) over at least 80% identity, more preferably at least 90% identity, and even more preferably, over the entire length, to a polypeptide having an amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in accession number CBS109717 in the oor Schemamelcules. Comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 95% identity to said amino acid sequence. Furthermore, those with at least 97%, especially at least 99%, identity are highly preferred. At least 80% over the entire length of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the polypeptide having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centralalureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands) Polypeptides having an amino acid sequence having identity, more preferably at least 90% identity, and even more preferably at least 95% identity to SEQ ID NO: 2 are also included within the scope of IGS58 polypeptides. It is. Furthermore, those with at least 97%, especially at least 99%, identity are highly preferred. Preferably, the IGS58 polypeptide exhibits at least one receptor biological activity.
[0032]
In a further embodiment of the invention, the IGS58 polypeptide may be part of a larger protein, such as a fusion protein. Secretory or leader sequences, prosequences, sequences that aid purification such as multiple histidine residues, sequences that aid detection such as antigenic peptide tags (eg, hemagglutinin (HA) tags), or stability during recombinant production It is often advantageous to include additional amino acid sequences, including additional sequences for gender.
[0033]
Fragments of the IGS58 polypeptide are also included in the present invention. A fragment is a polypeptide having an amino acid sequence that is identical, but not entirely, to the amino acid sequence of the IGS58 polypeptide described above. Like IGS58 polypeptides, fragments can be "free-standing", that is, most preferably as a single contiguous region within a larger polypeptide of which they form a part or region. May be included. Representative examples of polypeptide fragments of the invention include, for example, fragments from about amino acid number 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100 and 101 to the end of IGS58 polypeptide. In this context, "approximately" includes a matter that is greater or less than 5, 5, 3, 3, 2 or 1 amino acids at either or both ends from the specifically recited range.
[0034]
Preferred fragments include, for example, a contiguous series of residues including the amino terminus, or a contiguous series of residues including the carboxyl terminus, or one containing the amino terminus and one containing the carboxyl terminus. Includes truncated polypeptides having the amino acid sequence of IGS58 polypeptide, except for the deletion of two consecutive series of residues. Α-helix, α-helix forming region, β sheet and β sheet forming region, turn and turn forming region, coil and coil forming region, hydrophilic region, hydrophobic portion, α amphiphilic region, β amphiphilic region Also preferred are fragments characterized by structural or functional attributes, such as mobile, surface-forming, substrate-binding, and high antigenic index regions. Other preferred fragments are biologically active fragments. Biologically active fragments are those that mediate receptor activity, including those with a similar activity or an enhanced activity, or a decreased undesirable activity. Also included are those that are antigenic or immunogenic in animals, particularly humans.
[0035]
Thus, the polypeptides of the present invention include at least 80% of a polypeptide having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in SEQ ID NO: 2 and / or the accession number CBS109717 in Centraalbureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands). Polypeptides having the same amino acid sequence, or fragments thereof that are at least 80% identical to the corresponding fragment. Preferably, all of these polypeptide fragments retain the biological activity of the receptor, including antigenic activity. Variants of the defined sequences and fragments also form part of the invention. Preferred variants are those that differ from a reference by conservative amino acid substitutions (ie, replacing a residue with another residue of similar characteristics). Typical such substitutions are between Ala, Val, Leu and Ile, between Ser and Thr, between the acidic residues Asp and Glu, between Asn and Gln, between the basic residues Lys and Arg. Or between the aromatic residues Phe and Tyr. Particularly preferred are variants in which several, 5-10, 1-5, or 1-2 amino acids have been substituted, deleted or added in any combination.
[0036]
The IGS58 polypeptide of the present invention can be prepared in any suitable way. Such polypeptides include isolated naturally occurring polypeptides, recombinantly produced polypeptides, synthetically produced polypeptides, or polypeptides produced by a combination of these methods. Methods for preparing such polypeptides are known in the art.
(Polynucleotide of the present invention)
A further aspect of the invention relates to an IGS58 polynucleotide. IGS58 polynucleotides include isolated polynucleotides encoding IGS58 polypeptides and fragments, as well as polynucleotides closely related thereto. More specifically, the IGS58 polynucleotides of the present invention include polynucleotides comprising the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1 (eg, those capable of encoding the IGS58 polypeptide of SEQ ID No: 2), SEQ ID NO: 2. Includes a polynucleotide having the specific sequence of ID No. 1 and a polynucleotide that essentially corresponds to the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 at Centraalbureau voor Schemmelcultures, Utrecht, The Netherlands.
[0037]
The IGS58 polynucleotide further comprises a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 80% identity over its entire length to the nucleotide sequence encoding the IGS58 polypeptide of SEQ ID NO: 2, the sequence of SEQ ID NO: 1. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that is at least 80% identical over its entire length, and a polynucleotide that essentially corresponds to the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 at Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands).
[0038]
In this regard, polynucleotides with at least 90% identity are particularly preferred, and those with at least 95% identity are particularly preferred. Further, those with at least 97% identity are highly preferred, those with at least 98-99% identity are highly highly preferred, and those with at least 99% identity are most preferred. It hybridizes to the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1 or to the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in the Centraalbureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands) under conditions usable for amplification. Nucleotide sequences of sufficient identity to be used for or as probes or markers are also included below the IGS58 polynucleotide. The invention also provides a polynucleotide that is complementary to such an IGS58 polynucleotide.
[0039]
IGS58 of the present invention is structurally related to other proteins of the G protein-coupled receptor family, as shown by the results of a BLAST search. The amino acid sequence in Table 2 (SEQ ID NO: 2) was most similar to the sequence claimed to represent the human leukocyte platelet activator receptor (92% identity for 312 residues aligned; GenBank). Accession number Q14968; however, this protein is only 322 residues long). Thus, the IGS58 polypeptides and polynucleotides of the present invention are expected to have, among other things, similar biological functions / properties as their homologous polypeptides and polynucleotides, and their practicability It is clear to anyone skilled in the technical field.
[0040]
A polynucleotide of the invention can be obtained from a natural source, such as genomic DNA. In particular, degenerate PCR primers can be designed that encode regions that are conserved within a particular GPCR gene subfamily. A PCR amplification reaction of genomic DNA or cDNA using degenerate primers will result in the amplification of some members of the gene family under consideration (both known and novel) (degenerate if genomic templates are used). Heavy primers must be located in the same exon) (Libert et al., Science, 1989, 244: 569-572). The polynucleotide of the present invention can also be synthesized using well-known commercially available techniques (for example, FM Ausubel et al, 2000, Current Protocols in Molecular Biology).
[0041]
The nucleotide sequence encoding the IGS58 polypeptide of SEQ ID NO: 2 may be identical to the polypeptide coding sequence contained in SEQ ID NO: 1 (nucleotide numbers 26-1471), or As a result of the redundancy (degeneracy), a different nucleotide sequence may also be present as compared to the peptide coding sequence contained in SEQ ID NO: 1, but also encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2.
[0042]
When the polynucleotide of the present invention is used for recombinant production of an IGS58 polypeptide, the polynucleotide includes the coding sequence itself of the mature polypeptide or a fragment thereof; a leader or secretory sequence, a pre- or pro- or pre-pro-protein sequence. Alternatively, it may include the coding sequence of a mature polypeptide or fragment in the same reading frame as other coding sequences, such as those encoding other fusion peptide portions. For example, a marker sequence that facilitates purification of the fusion polypeptide can be encoded. In some preferred embodiments of this aspect of the invention, the marker sequence is provided in a pQE vector (Qiagen, Inc.), and Gentz et al, Proc. Natl. Acad. Hexahistidine peptide as described in Sci USA (1989) 86: 821-824, or an HA tag. A polynucleotide may also include non-coding 5 'and 3' sequences, such as untranslated sequences to be transcribed, splicing and polyadenylation signals, ribosome binding sites, and sequences that stabilize mRNA.
[0043]
Further preferred embodiments are those of SEQ ID NO: 2 in which several, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 or one or more amino acid residues are substituted, deleted or added in any combination. A polynucleotide encoding an IGS58 variant comprising the amino acid sequence of an IGS58 polypeptide.
[0044]
The polynucleotides of the present invention are generally known in the art to alter an IGS58 coding sequence for a variety of purposes, including, but not limited to, modifying the cloning, processing and / or expression of a gene product. It can be operated using the method. DNA shuffling by random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and reassembly by PCR can be used to manipulate nucleotide sequences. For example, oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis can make amino acid substitutions, create new restriction sites, alter the pattern of modifications (eg, glycosylation or phosphorylation), alter codon preferences, It can be used to introduce mutations, such as generating splicing variants.
[0045]
The invention further relates to polynucleotides that hybridize to the herein above-described sequences. In this regard, the invention particularly relates to polynucleotides that hybridize under stringent conditions to the aforementioned polynucleotides. As used herein, the term "stringent conditions" refers to an identity of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, even more preferably at least 97%, especially at least 99%. Means that hybridization occurs only when present between the sequences.
[0046]
A polynucleotide of the present invention that is identical or sufficiently identical to the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof is used to isolate full-length cDNA and genomic clones encoding IGS58 and Hybridization for cDNA and genomic DNA to isolate cDNA and genomic clones of other genes with high sequence similarity to, including genes encoding homologs and orthologs of non-human species -Can be used as a probe. Those skilled in the art are familiar with such hybridization techniques. Generally, these nucleotide sequences will have 80% identity to the reference sequence, preferably 90% identity, and more preferably 95% identity. Probes generally comprise at least 5 nucleotides, preferably at least 8 nucleotides, more preferably at least 10 nucleotides, even more preferably at least 12 nucleotides, especially at least 15 nucleotides. Most preferably, such probes have at least 30 nucleotides and may have at least 50 nucleotides. Particularly preferred probes range from 30 to 50 nucleotides.
[0047]
One embodiment for obtaining polynucleotides encoding IGS58 polypeptides, including homologs and orthologs, from non-human species is to use a labeled probe having SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof under suitable stringent hybridization conditions. Screening the library and isolating full-length cDNA and genomic clones comprising said polynucleotide sequence. Such hybridization techniques are well known to those skilled in the art. Stringent hybridization conditions are as defined above, or 50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, After overnight incubation at 42 ° C. in a solution comprising 10% dextran sulfate (w / v) and 20 μg / ml denatured sheared salmon semen DNA, the filters were washed in 0.1 × SSC at about 65 ° C. Condition.
[0048]
The polynucleotides and polypeptides of the present invention can be used as research reagents and materials for the discovery of treatment and diagnosis for animal and human disease.
[0049]
(Vector, host cell, expression)
The present invention also relates to polynucleotides or vectors comprising the polynucleotides of the invention, and host cells genetically engineered with the vectors of the invention, and the production of the polypeptides of the invention by recombinant techniques. Cell-free translation systems can also be used to synthesize such proteins using RNA derived from the DNA constructs of the present invention.
[0050]
For recombinant production, host cells can be genetically engineered to incorporate expression systems or portions thereof for the polynucleotides of the invention. Introduction of a polynucleotide into a host cell is described in Davis et al. , BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) and Sambrook et al. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NJ. Y. (1989), for example, calcium phosphate transfection, DEAE dextran mediated transfection, transfection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, It can be performed by electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction, or infection.
[0051]
Representative examples of suitable hosts include bacterial cells such as streptococci, staphylococci, E. coli, Streptomyces and Bacillus subtilis; fungal cells such as yeast and Aspergillus cells; Drosophila S2 and Spodoptera litura Sf9 cells. Animal cells such as CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293 and Bowes melanoma cells; and plant cells.
[0052]
A wide variety of expression systems can be used. Such systems include, inter alia, systems derived from chromosomes, episomes and viruses, such as bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, yeast episomes, insertion elements, vectors derived from yeast chromosomal elements, baculovirus, Papova virus. Vectors derived from viruses such as virus, SV40, vaccinia virus, adenovirus, infectious epithelioma virus, pseudorabies virus and retrovirus, as well as those derived from plasmid and bacteriophage genetic elements and from cosmids and phagemids And vectors derived from such combinations. The expression system may include control regions that generate and regulate expression. Generally, any system or vector suitable to maintain, propagate or express a polynucleotide for producing a polypeptide in a host cell may be used. Suitable nucleotide sequences are described, for example, in Sambrook et al. , MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) can be inserted into the expression system by any of a variety of known routine techniques.
[0053]
For secretion of translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, a suitable secretion signal may be incorporated into the desired polypeptide. These signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous (ie, from different species).
[0054]
Where the IGS58 polypeptide is to be expressed for use in screening assays, it is generally preferred that the polypeptide be produced on the surface of cells. In this case, the cells can be harvested before use in the screening assay. When the affinity or functional activity of an IGS58 polypeptide is altered by a receptor activity modifying protein (RAMP), co-expression of the relevant RAMP on the surface of cells is most likely preferred and often required. Also, this requires collection of cells expressing the IGS58 polypeptide and related RAMP prior to use in the screening assay. If the IGS58 polypeptide is secreted into the medium, the medium can be recovered to recover and purify the polypeptide; if produced intracellularly, the cells must first be lysed before the polypeptide is recovered. Must. Membrane expressing IGS58 polypeptide can be recovered by methods known to those skilled in the art. Generally, such methods include harvesting cells expressing the IGS58 polypeptide and homogenizing the cells by techniques such as, but not limited to, pottering. The membrane can be recovered by washing the suspension once or several times.
[0055]
IGS58 polypeptide can be prepared by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, cellulose phosphate chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography. It can be purified from recombinant cell culture by known methods, including: Most preferably, high performance liquid chromatography is used for purification. If the polypeptide denatures during isolation and / or purification, well known techniques for protein refolding can be used to regenerate the active conformation.
[0056]
(Diagnostic assay)
The invention also relates to the use of IGS58 polynucleotides for use as diagnostic reagents. Detection of a variant form of the IGS58 gene associated with dysfunction may be a diagnostic tool that can be added to the diagnosis of a disease or susceptibility to a disease resulting from underexpression, overexpression or aberrant expression of IGS58, or to clarify it Will provide tools that can Also, in this case, co-expression of the relevant receptor activity modifying protein may be required to obtain a diagnostic assay of the desired quality. Individuals having a mutation in the IGS58 gene can be detected at the DNA level by various techniques.
[0057]
Nucleic acids for diagnosis can be obtained from cells of a subject, such as blood, urine, saliva, material from tissue biopsy or necropsy. Genomic DNA can be used directly for detection or can be amplified enzymatically by using PCR or other amplification techniques prior to analysis. RNA or cDNA can also be used in a similar manner. Deletions and insertions can be detected by a change in size of the amplified product relative to the normal genotype. Point mutations can be identified by hybridizing the amplified DNA to a labeled IGS58 nucleotide sequence. Perfectly matched sequences can be distinguished from mismatched duplexes by Rnase cleavage or by differences in melting temperatures. DNA sequence differences can also be detected by changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in the gel in the presence or absence of denaturing agents, or by direct DNA sequencing. Myers et al. , Science (1985) 230: 1242. Sequence changes at specific positions may also be revealed by nuclease protection assays (eg, RNase and S1 protection, or chemical cleavage methods). Cotton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401. In another embodiment, an array of oligonucleotide probes comprising an IGS58 nucleotide sequence, or a fragment thereof, can be created, for example, to perform efficient screening for genetic mutations. Array technology methods are known and have general applicability and can be used to address various issues in molecular genetics, including gene expression, genetic linkage, and genetic diversity (eg, , M. Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)).
[0058]
Diagnostic assays, through detection of mutations in the IGS58 gene by the described methods, provide, inter alia, methods for diagnosing or determining susceptibility to such diseases. This diagnostic assay is particularly useful for testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, Provided are methods for diagnosing or determining susceptibility to dysfunction, disorder or disease associated with the hippocampus and thalamus, etc., through detection of mutations in the IGS58 gene by the described methods.
[0059]
Further, among others, diseases as described above can be diagnosed by a method comprising determining the amount of IGS58 polypeptide or IGS58 mRNA abnormally reduced or increased in a sample from a subject. In particular, testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (eg, fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, hippocampus and A dysfunction, disorder or disease associated with the thalamus can be diagnosed by a method comprising determining the amount of abnormally reduced or increased IGS58 polypeptide or IGS58 mRNA from a sample derived from a subject.
[0060]
Decreased or increased expression can be achieved using any of the methods well known in the art for quantification of a polynucleotide, for example, PCR, RT-PCR, RNase protection, Northern blotting, and other hybridization methods. At the level of RNA. Assay techniques that can be used to determine the amount of a protein (eg, IGS58) in a sample derived from a host are known to those of skill in the art. Such assay methods include radioimmunoassays, binding protein competition assays, western blot analysis and ELISA assays.
[0061]
In another aspect, the invention relates to a diagnostic kit for a disease or susceptibility to a disease as described above, among others. In particular, the present invention relates to testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, Diagnostic kit for dysfunction, disorder or disease related to the hippocampus and thalamus.
This kit is
(A) an IGS58 polynucleotide, preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof; and / or
(B) a nucleotide sequence complementary to the sequence of (a); and / or
(C) an IGS58 polypeptide, preferably the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof; and / or
(D) an antibody to the IGS58 polypeptide, preferably to the polypeptide of SEQ ID NO: 2; and / or
(E) RAMP polypeptide required for the relevant biological or antigenic properties of the IGS58 polypeptide;
Comprising.
[0062]
It will be appreciated that in any such kit, (a), (b), (c), (d) or (e) may constitute a substantial component.
[Chromosome assay]
The nucleotide sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. This sequence is specifically directed to specific locations on individual human chromosomes and is capable of hybridizing. Mapping related sequences to chromosomes according to the present invention is an important first step in relating those sequences to gene-related diseases. Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data is available, for example, from V.A. McKusick, found in Mendelian Inheritance in Man (available online through Johns Hopkins University Welch Medical Library). The relationship between the gene and the disease mapped to the same chromosomal region is then identified through linkage analysis (co-inheritance of physically adjacent genes).
[0063]
Differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals can also be determined. If the mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in normal individuals, then the mutation is likely to be the causative agent of the disease.
[0064]
〔antibody〕
The polypeptides of the present invention or fragments thereof or analogs thereof or cells expressing them, together with the associated RAMP, if necessary, may be used as an immunogen to generate antibodies immunospecific for the IGS58 polypeptide. Can also be used. The term "immunospecific" means that the antibody has a substantially greater affinity for the polypeptides of the invention than for other related polypeptides in the prior art.
[0065]
Antibodies raised against IGS58 polypeptides can be obtained by administering fragments, analogs or cells containing the polypeptides or epitopes to animals, preferably non-human animals, using routine protocols. For preparation of monoclonal antibodies, any technique which provides antibodies produced by continuous cell line cultures can be used. Examples include hybridoma technology (Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497), trioma technology, human B cell hybridoma technology (Kozbor et al., Immunology Today (1983)). 4:72), and EBV hybridoma technology (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
[0066]
The antibodies described above can be used to isolate or identify clones expressing the polypeptide, or to purify the polypeptide by affinity chromatography.
[0067]
Also, antibodies against the IGS58 polypeptide itself, or the IGS58 polypeptide RAMP complex, can be used, inter alia, to treat diseases as described above. In particular, antibodies against the IGS58 polypeptide itself or against the polypeptide RAMP complex include testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum). , Spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, hippocampus and thalamus, etc.).
[0068]
〔animal〕
Another aspect of the invention pertains to non-human animal-based systems that serve as models for diseases arising from aberrant expression or activity of IGS58. Model systems based on non-human animals can also be used to further characterize the activity of the IGS58 gene. Such a system can be utilized, among other things, as part of a screening strategy designed to identify compounds that can treat IGS58-based diseases, such as those mentioned above. In particular, this system comprises the testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, (Eg, hippocampus and thalamus) and can be used as part of a screening strategy designed to identify compounds that can treat dysfunction, disorder or disease based on IGS58.
[0069]
In this way, animal-based models can be used to identify pharmaceutical compounds, therapies, and interventions that are effective in treating diseases that have abnormal expression or activity of IGS58. In addition, such animal models can be used to control LD in test animals. ₅₀ And ED ₅₀ Can be used to determine These data can be used to determine the in vivo efficacy of potential IGS58 disease treatments.
[0070]
Animal-based model systems of IGS58-based disease based on abnormal IGS58 expression or activity can include both non-recombinant animals and recombinantly engineered transgenic animals.
[0071]
Animal models for IGS58 disease can include, for example, genetic models. Animal models that exhibit symptoms such as an IGS58-based disease can be obtained by utilizing IGS58 sequences, such as those described above, in combination with techniques for generating transgenic animals known to those of skill in the art. Can be manipulated. For example, an IGS58 sequence can be introduced, overexpressed, and / or mis-expressed into the genome of the animal of interest, or if endogenous IGS58 sequences are present, they are overexpressed. Can be mis-expressed or disturbed to under-express or inactivate IGS58 gene expression.
[0072]
To over- or mis-express the IGS58 gene sequence, the coding portion of the IGS58 gene sequence can drive high levels of gene expression or expression in cell types where the gene is not normally expressed in the animal species of interest. It can be linked to a control sequence. Such control regions are known to those skilled in the art and can be used without undue experimentation.
[0073]
Due to underexpression of endogenous IGS58 gene sequences, such sequences are inactivated or "knocked out" of alleles of the endogenous IGS58 gene when reintroduced into the genome of the animal of interest. Can be isolated and manipulated. Preferably, the sequence of the engineered IGS58 gene is introduced via gene targeting such that the endogenous IGS58 sequence is disrupted upon integration of the engineered IGS58 gene sequence into the animal genome.
[0074]
Animals of any species, including but not limited to mice, rats, rabbits, squirrels, guinea pigs, pigs, micro pigs, goats and non-human primates (eg, baboons, monkeys and chimpanzees) , Can be used to generate animal models of IGS58-related diseases.
[0075]
Any technique known in the art can be used to introduce an IGS58 transgene into an animal to generate a founder line of the transgenic animal. Such techniques include pronuclear microinjection (Hoppe, PC and Wagner, TE, 1989, US Pat. No. 4,873,191); Gene introduction into lineages (van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152, 1985); Gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., Cell 56: 313-321). Electroporation of embryos (Lo, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814, 1983); and sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57: 717-723, 1989). But including it To but are not limited to. For a review of such techniques, see Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev .. Cytol. 115: 171-229, 1989.
[0076]
The present invention provides transgenic animals having the IGS58 transgene in all of its cells, and animals having the transgene in some, but not all of the cells (ie, mosaic animals) (eg, Jakobovits). , Curr. Biol. 4: 761-763, 1994). The transgene can be integrated as a single transgene or as a concatamer (eg, tandem head-to-head or tandem head-to-tail). Transgenes can also be selectively introduced and activated in particular cell types, eg, according to the teachings of Lasko et al (Lasko, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 89: 6232-6236, 1992).
[0077]
The regulatory sequences required for such cell type-specific activation will depend on the particular cell type of interest and will be apparent to those skilled in the art.
[0078]
Gene targeting is preferred when it is required that the IGS58 transgene be integrated at the chromosomal site of the endogenous IGS58 gene. Briefly, if such a technique is utilized, a vector containing several nucleotide sequences homologous to the endogenous IGS58 gene of interest (eg, the nucleotide sequence of the mouse IGS58 gene) will have It is designed to integrate into the nucleotide sequence of the endogenous IGS58 gene or allele through recombination and disrupt its function. The transgene is also described, for example, in Gu et al. According to the teachings of US Pat. No. 6,064,064, the gene of interest can be selectively introduced into a specific cell type, and thus the endogenous gene of interest can be inactivated only in that cell type. (Gu, H. et al., Science 265: 103-106, 1994). The regulatory sequences required for inactivation specific to such cell types will depend on the particular cell type of interest and will be apparent to those skilled in the art.
[0079]
Once transgenic animals have been produced, expression of the recombinant IGS58 gene and protein can be analyzed using standard techniques. Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques that analyze animal tissues to assess whether transgene integration has occurred. In addition, mRNA expression levels of the IGS58 transgene in tissues of transgenic animals can be determined by techniques including, but not limited to, Northern blot analysis, in situ hybridization analysis, and RT-PCR of tissue samples obtained from animals. It can be evaluated even if used. In addition, a sample of a tissue expressing the target gene can also be evaluated by immunocytochemical analysis using an antibody specific to the transgene product of the target gene of interest. IGS58 transgenic animals (detected immunocytochemically using antibodies raised against the target gene product epitope) expressing IGS58 gene mRNA or IGS58 transgene peptide at readily detectable levels are then isolated , Can be further evaluated to identify animals exhibiting characteristic disease symptoms based on IGS58.
[0080]
Once primary IGS58 transgenic animals (ie, animals that express the IGS58 protein in the cell or tissue of interest and preferably exhibit symptoms of a disease based on IGS58), they generate specific animal colonies. Bred, inbred, outbred, or cross bred. Examples of such breeding strategies include outcrossing of primary animals with one or more integration sites to establish separate strains; of interest for additive expression effects of each IGS58 transgene. Inbred individual strains to generate composite IGS58 transgenic animals expressing higher levels of the IGS58 transgene; given to enhance expression and eliminate the need for screening animals by DNA analysis. Hybridizing a heterozygous transgenic animal to generate an animal homozygous for the integrated site; crossing a separate homozygous line to generate a synthetic heterozygous or homozygous line; Different inbreeds to determine the effect of allele correction on IGS58 transgene expression and onset of IGS58-like symptoms Breeding animals to Den backgrounds; including but are not limited to them. One such approach is to breed a wild-type strain with an IGS58 transgenic primary animal to generate an F1 generation that exhibits IGS58-related disease-like symptoms, such as those described above. The F1 generation is then inbred to create a homozygous line if the homozygous target gene transgenic animal is found to be viable.
[0081]
〔vaccine〕
Another aspect of the invention is to provide a mammal with an IGS58 polypeptide or fragment thereof sufficient to generate an antibody and / or T cell immune response, particularly if necessary, together with a RAMP polypeptide, to protect the animal from the above-mentioned diseases. A method of inducing an immune response in a mammal comprising administering to the subject (eg, by inoculation). In particular, the invention relates to testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid, and central nervous system (eg, fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, brain Antibodies, and / or sufficient IGS58 polypeptide or fragment thereof to produce a T cell immune response, together with RAMP polypeptide, if necessary, to protect the animal from dysfunction, disorder or disease associated with the (beam, hippocampus and thalamus). A method of inducing an immune response in a mammal, comprising administering to the mammal (eg, by inoculation).
[0082]
Still another aspect of the invention is to deliver an IGS58 polypeptide through a vector that directs the expression of an IGS58 polynucleotide in vivo to induce an immune response such as generating antibodies to protect the mammal from disease. A method of inducing an immune response in said animal, comprising:
[0083]
A further aspect of the invention relates to an immunological / vaccine formulation (composition) comprising an IGS58 polypeptide or an IGS58 gene that, when introduced into a mammalian host, induces an immune response to the IGS58 polypeptide in the mammal. Such immunological / vaccine formulations (compositions) can be either therapeutic immunological / vaccine formulations or prophylactic immunological / vaccine formulations. The vaccine formulation may further comprise a suitable carrier. Because IGS58 polypeptide can be broken down in the stomach, it is preferably administered parenterally (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, and other injections). Formulations suitable for parenteral administration include sterile injectable aqueous or non-aqueous solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats and solutes which render the formulation isotonic with the blood of the recipient. And sterile aqueous and non-aqueous suspensions which may contain agents or thickening agents. The formulation can be presented in unit-dose or multi-dose containers, for example, sealed ampules and vials, and stored in lyophilized conditions requiring only the addition of sterile liquid immediately before use. Can be done. Vaccine formulations may also include adjuvant systems to enhance the immunogenicity of the formulation, for example, oils in water and other systems known in the art. The dosage will depend on the specific activity of the vaccine and can be readily determined by routine experimentation.
[0084]
[Screening assay]
The IGS58 polypeptides of the invention can be used in screening processes for compounds that bind to and activate receptors (agonists) or compounds that inhibit the activation of the receptor polypeptides of the invention (antagonists). Thus, the polypeptides of the invention can also be used to evaluate the binding of small molecule substrates and ligands, for example, in cells, cell-free preparations, chemical libraries and natural product mixtures. These substrates and ligands can be natural substrates and ligands, or can be structural or functional mimetics.
[0085]
IGS58 polypeptides provide biological functions, including pathology. Therefore, it is desirable to find compounds and agents that can stimulate IGS58 on the one hand and inhibit IGS58 function on the other. In general, agonists are utilized for therapeutic and prophylactic purposes, especially for conditions such as those mentioned above. In particular, agonists include testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, hippocampus) And for thalamic and other dysfunctions, disorders or diseases.
[0086]
Antagonists may be utilized for a variety of therapeutic and prophylactic purposes, especially for conditions such as those mentioned above. In particular, antagonists include testis, prostate, uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland, thyroid and central nervous system (fetal brain, brain, cerebellum, spinal cord, caudate nucleus, amygdala, corpus callosum, hippocampus And for the dysfunction, disorder or disease associated with the thalamus, etc.) for a variety of therapeutic and prophylactic purposes.
[0087]
In general, such screening procedures involve producing suitable cells which express the receptor polypeptide of the present invention on its surface, and, if necessary, co-expression of RAMP on its surface. Such cells include cells from mammals, yeast, Drosophila or E. coli. Cells expressing the receptor (or cell membrane containing the expressed receptor) are then contacted with a test compound to observe binding or stimulation or inhibition of a functional response.
[0088]
Screening techniques include cells expressing the receptor of the invention (eg, transfected CHO cells) in a system that measures changes in extracellular pH, intracellular pH, or intracellular calcium due to receptor activation. Including the use of In this technique, compounds can be contacted with cells expressing the receptor polypeptide of the present invention. The second messenger response (eg, signal transduction, pH change or calcium concentration change) is then measured to determine whether the potential compound activates or inhibits the receptor.
[0089]
Another method involves screening for receptor inhibitors by determining the modulation of receptor-mediated signals (eg, cAMP accumulation and / or adenylate cyclase activity). Such methods include transfecting a receptor of the invention into a eukaryotic cell to express the receptor on the cell surface. The cells are then exposed to an agonist for the receptor of the present invention in the presence of a potential antagonist. If a potential antagonist binds to the receptor and thus inhibits receptor binding, the agonist-mediated signal will be modulated.
[0090]
Another method for detecting agonists or antagonists of the receptor of the present invention is a yeast-based technique, as described in US Pat. No. 5,482,835.
[0091]
The assay may simply test the binding of the candidate compound. And, here, attachment to the cells bearing the receptor is detected by a label that binds directly or indirectly to the candidate compound, or in an assay that involves competition with a labeled competitor. In addition, these assays can test whether a candidate compound results in a signal generated by activation of the receptor, using a detection system appropriate for the cell bearing the receptor on its surface. Inhibitors of activation are generally analyzed in the presence of a known agonist and the effect of the presence of the candidate compound on activation by the agonist is observed.
[0092]
In addition, the assay simply comprises combining the candidate compound with a solution comprising the IGS58 polypeptide to form a mixture, measuring the IGS58 activity in the mixture, and comparing the IGS58 activity of the mixture to a standard. May be included.
[0093]
IGS58 cDNA, proteins and antibodies to proteins can also be used to construct assays to detect the effect of added compounds on IGS58 mRNA and protein synthesis in cells. For example, an ELISA can be constructed to measure the secreted level of the IGS58 protein, or the level bound to cells, using monoclonal and polyclonal antibodies, by standard methods known in the art. This can be used to find agents (also called antagonists or agonists, respectively) that can inhibit or enhance the synthesis of IGS58 from suitably engineered cells or tissues. Standard methods for performing screening assays are known in the art.
[0094]
Examples of potential IGS58 antagonists include antibodies or, in some cases, oligonucleotides or proteins that are closely related to the ligand of IGS58 (eg, bind to a receptor such that the activity of the receptor is prevented). The reaction does not elicit a ligand fragment or small molecule).
[0095]
Thus, in another aspect, the present invention identifies agonists, antagonists, ligands, receptors, substrates, enzymes, etc., for IGS58 polypeptides, or compounds that decrease, increase and / or otherwise increase the synthesis of IGS58 polypeptides. A screening kit for performing
(A) an IGS58 polypeptide, preferably a polypeptide of SEQ ID NO: 2;
(B) a recombinant cell expressing an IGS58 polypeptide, preferably a polypeptide of SEQ ID NO: 2;
(C) a cell membrane expressing an IGS58 polypeptide, preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2; or
(D) an antibody against the IGS58 polypeptide, preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2;
And a screening kit comprising:
[0096]
It will be appreciated that in any such kit, (a), (b), (c) or (d) may constitute a substantial component.
[0097]
[Prevention and treatment methods]
The present invention provides methods for treating abnormal conditions involving both excessive and insufficient IGS58 activity.
[0098]
If the activity of IGS58 is in excess, several approaches are available. One approach is to block activation by blocking the binding of the ligand to IGS58 or by inhibiting its interaction with the RAMP peptide or secondary signal, thereby relieving abnormal conditions. Comprising administering to the patient an effective amount of an inhibitor compound (antagonist) as described above together with a pharmaceutically acceptable carrier.
[0099]
In another approach, a soluble form of the IGS58 polypeptide capable of binding the ligand in competition with endogenous IGS58 may be administered. An exemplary embodiment of such a competitor comprises a fragment of the IGS58 polypeptide.
[0100]
In yet another approach, expression of the gene encoding endogenous IGS58 can be inhibited using expression blocking techniques. Known such techniques include the use of internally generated or separately administered antisense sequences. See, for example, O'Connor, J Neurochem (1991) 56: 560, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Florida 19 A. Alternatively, an oligonucleotide that forms a triplex with the gene can be provided. For example, Lee et al. , Nucleic Acids Res (1979) 6: 3073; Cooney et al. , Science (1988) 241: 456; Dervan et al, Science (1991) 251: 1360. These oligomers can be administered per se, or the relevant oligomers can be expressed in vivo. Synthetic antisense or triplex oligonucleotides can comprise modified bases or modified backbones. Examples of the latter include methylphosphonates, phosphorothionates or peptide nucleic acid backbones. Such scaffolds are incorporated into antisense or triple stranded oligonucleotides to provide protection from nuclease degradation and are known in the art. Antisense and triplex molecules synthesized with these or other modified backbones also form part of the invention.
[0101]
In addition, expression of the IGS58 polypeptide can be prevented by using a ribozyme specific for the IGS58 mRNA sequence. Ribozymes are natural or synthetic, catalytically active RNAs (see, eg, Usman, N, et al., Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6 (4), 527-33). Synthetic ribozymes can be designed to specifically cleave IGS58 mRNA at selected locations, thereby preventing IGS58 mRNA from being translated into a functional polypeptide. Ribozymes can be synthesized with a naturally occurring ribose-phosphate backbone and a naturally occurring base, such as are commonly found in RNA molecules. Alternatively, a ribozyme may be synthesized with a non-natural backbone, such as, for example, 2'-O-methyl RNA, and include modified bases to provide protection from ribonuclease degradation.
[0102]
Also, several approaches are available for treating abnormal conditions related to under-expression of IGS58 and its activity. One approach involves administering to a patient a therapeutically effective amount of an IGS58-activating compound (ie, an agonist) as described above in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, thereby relieving the abnormal condition. Comprising. Alternatively, gene therapy can be used to effect endogenous synthesis of IGS58 by relevant cells of the patient. For example, a polynucleotide of the invention can be designed for expression by a replication defective retroviral vector, as described above. The retroviral expression construct is then isolated and transformed with a retroviral plasmid vector containing RNA encoding the polypeptide of the present invention so that the packaging cells produce infectious viral particles containing the gene of interest. It can be introduced into the introduced packaging cells. These producer cells can be administered to patients for engineering cells in vivo and for expression of polypeptides in vivo. For an overview of gene therapy, see Human Molecular Genetics, Strachan T .; and Read A. P. , BIOS Scientific Publishers Ltd (1996), Chapter 20, Gene Therapy and of the Molecular Genetically Based Therapeutic Approaches (and references cited therein).
[0103]
Any of the treatment methods described above can be applied to any patient in need of such treatment (eg, including mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and most preferably humans).
(Formulation and administration)
Peptides, such as soluble forms of IGS58 polypeptides, and agonists and antagonist peptides, or small molecules, can be formulated in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Such formulations comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide or compound, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. The formulation should suit the mode of administration and is well within the skill of the art. The invention further relates to pharmaceutical packs and kits comprising one or more containers filled with one or more components of the aforementioned composition of the invention.
[0104]
The polypeptides and other compounds of the present invention can be used alone or in combination with other compounds, such as therapeutic compounds.
[0105]
Preferred forms of systemic administration of the pharmaceutical compositions generally include injection by intravenous injection. Other injection routes such as subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal can also be used. Alternative means for systemic administration include transmucosal and transdermal administration with penetrants such as bile salts or fusidic acid or other surfactants. In addition, if properly formulated in enteric or encapsulated formulations, oral administration may also be possible.
[0106]
The required range of dosage depends on the choice of peptide or compound, the route of administration, the nature of the formulation, the nature of the patient's condition and the judgment of the attending physician. Suitable dosages are in the range of 0.1-100 μg / kg of patient weight. However, given the variety of compounds available and the different efficiencies of the various routes of administration, wide variations in the required dosage are expected. For example, oral administration would be expected to require higher dosages than administration by intravenous injection. Variation in these dosage levels can be adjusted using standard empirical routines for optimization, as is well understood in the art.
[0107]
The polypeptides used in the treatment can also be produced endogenously in the patient in a treatment modality often referred to as "gene therapy", as described above. Thus, for example, cells from a patient can be engineered ex vivo using a polynucleotide encoding a polypeptide, such as DNA or RNA, for example, using a retroviral plasmid vector. The cells are then introduced into the patient.
[0108]
【Example】
The following examples are only intended to illustrate the invention in more detail, and therefore these examples are not in any way considered to limit the scope of the invention.
Example 1 Cloning of a cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor.
[0109]
In a public domain databank of unfinished high-throughput genomic DNA sequences (htgs), we have identified a human genomic sequence (accession number: AL162471) encoding a potentially novel G protein-coupled receptor (GPCR). Identified. We call this new GPCR IGS58. By attempting to clone the cDNA from human tissue, it was decided to investigate whether this genomic sequence represented a functional gene. Human testis poly A (+) RNA (Clontech cat # 6355-1) is first treated with DNase I (Life Technologies) to destroy residual traces of genomic DNA according to the protocol recommended by the enzyme supplier. And then Superscript ^TM It was converted to cDNA through reverse transcription using II reverse transcriptase (Life Technologies). PCR primers were designed to amplify the putative IGS58 coding sequence. The first PCR reaction (50 μl volume) was performed under the conditions recommended by Qiagen with HotStarTaq with the forward and reverse primers IP15,073 (SEQ ID NO: 3) and IP15,075 (SEQ ID NO: 4), respectively. ^TM Performed on DNA testis template (derived from 50 ng human testis poly A (+) RNA treated with DNase I and reverse transcribed) using DNA polymerase (Qiagen # 203203). For the PCR reaction, the reaction tubes were heated at 95 ° C. for 15 minutes, and then subjected to 35 cycles of denaturation (30 seconds, 95 ° C.), annealing (120 seconds, 65 ° C.) and extension (90 seconds, 72 ° C.). . A final extension at 72 ° C. was performed for 10 minutes. 1 μl of a 1/50 dilution of the first PCR reaction was combined with HotstarTaq with nested forward primer IP15,074 (SEQ ID NO: 5) and first reverse primer IP15,075 (SEQ ID NO: 4), respectively. ^TM Used as a template in a semi-nested PCR reaction using DNA polymerase (Qiagen # 203203). A BamHI cloning site was added at the 5 'end of IP15,074 to allow for subsequent convenient subcloning. The cycling conditions for the nested PCR reaction were identical to those of the original PCR. PCR reaction products were analyzed by agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide. The initial PCR reaction did not produce a signal, but the semi-nested PCR reaction produced a distinct DNA fragment of approximately 1600 bp. Mock reverse transcribed RNA (Superscript during reverse transcription reaction) ^TM If no II was used, no DNA product was obtained, indicating that the 1600 bp fragment was derived from cDNA. This ± 1600 bp fragment was used as a Qiaquick ^TM Purified using a purification kit (Qiagen) and ligated into the pGEM-T vector according to the procedure recommended by the supplier (pGEM-T system, Promega). The recombinant plasmid was then used to transform competent E. coli strain DH5αF 'bacteria. Transformed cells were plated on LB agar plates containing ampicillin (100 μg / ml), IPTG (0.5 mM) and X-gal (50 μg / ml). Plasmid DNA is BioRobot ^TM Individual white colonies were purified from mini-cultures and sequenced using the 9600 nucleic acid purification system (Qiagen). The DNA sequencing reaction uses primers adjacent to the insert and an internal (IGS58-specific) primer, ABI Prism ^TM BigDye ^TM Performed on purified plasmid DNA with the Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems). Cycle sequencing reaction products were purified by EtOH / NaOAc precipitation and set on an ABI377 automated sequencer. Clone IGS58.6 contained a 1604 bp DNA sequence and encoded a 482 amino acid protein. We refer to this DNA sequence (not including the BamHI cloning site) and the encoded protein as IGS58 DNA (SEQ ID NO: 1) and IGS58PROT (SEQ ID NO: 2), respectively. The IGS58 DNA sequence was initially identified in genomic entry AL162471 except for nucleotide positions 19 (G for A), 35 (T for C) and 1431 (T for C). The parts were identical. The 19th nucleotide is in the 5 'non-coding region and does not affect the encoded protein (nucleotide position 19 is actually the 3' penultimate nucleotide 3 'to primer IP15,074. This primer Was designed to have an "A" at that position, but "G" was likely introduced at that position during synthesis). The change at nucleotide 35 is within the open reading frame of IGS58 but does not affect the identity of the encoded amino acids. However, a difference at nucleotide 1431 leads to a change in the encoded protein (Val-> Ala). The human expressed sequence tag (EST) sequence entries AW196331 and AA634446 that completely overlap the 3 'end of the IGS58 DNA sequence also have a T at position 1431.
[0110]
IGS58PROT sequence homology searches of the latest protein and translated DNA databanks were performed using the BLAST algorithm (Altschul SF et al. [1997], Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). . These searches indicated that the IGS58PROT sequence was most similar to the sequence claimed to represent the human leukocyte platelet activator receptor (92% identity for aligned 312 residues; GenBank accession number Q14968; However, this protein is only 322 residues long). At the DNA level, IGS58 DNA was 98% identical (for aligned 1426 nucleotides) to the GenBank M76676 sequence. Compared to IGS58 DNA, there are many insertions / deletions in the M76676 DNA sequence, resulting in a shorter encoded protein that is only 92% identical to (part of) IGS58PROT. I have.
[0111]
[Table 3]

[0112]
Example 2. Construction of mammalian expression vector pcDNA3.1 (-) huIGS58.
[0113]
The E. coli strain IGS58.6 carrying the plasmid pGEM-ThsIGS58 (containing the complete coding sequence of the human IGS58 protein) was re-cloned after re-plating on LB agar plates (containing 100 μg of ampicillin per ml) and re-cloned by Innogenetics Deposits have been deposited in both the bacterial strains collection (ICCG 4584) and the "Centralalbureau voor Schimmelcultures (CBS)" (Accession No. 109717) in Utrecht, The Netherlands. Plasmid DNA prepared from the recloned isolate was resequenced and found to be identical to the previously determined IGS58 DNA consensus sequence.
[0114]
A 1563 bp DNA fragment containing the complete IGS58 coding sequence was amplified from the pGEM-ThsIGS58 plasmid template using oligonucleotide primers IP15,074 (SEQ ID NO: 5) and IP15,076 (SEQ ID NO: 6). Amplified. Oligonucleotides IP15,074 (SEQ ID NO: 5) and IP15,076 (SEQ ID NO: 6) contained BamHI and HindIII cloning sites at their 5 'end, respectively. The amplified PCR fragment was digested with BamHI / HindIII and purified from gel (MiniElute gel extraction protocol, Qiagen). The pcDNA3.1 (-) plasmid expression vector (Invitrogen) was digested with BamHI / HindIII, and the linearized 5413 bp vector fragment was also gel purified. The digested plasmid and the PCR fragment were ligated and the ligation mixture was introduced by heat shock into competent E. coli strain DH5αF ′ bacteria. The transformed bacteria were spread on LB agar plates (containing 100 μg of ampicillin per ml) and incubated at 37 ° C. overnight. Individual bacterial colonies were selected and cultured overnight in LB medium containing 100 μg / ml ampicillin. Plasmid DNA was prepared and analyzed by BamHI / HindIII cleavage analysis. Three clones (clone 17, 23, 26) showed the correct restriction profile and were further characterized through DNA sequence analysis. Clone 26 was deposited with the Innogenetics bacterial culture collection as ICCG 4748 (retaining plasmid pcDNA3.1 (-) huIGS58).
[0115]
DNA sequence analysis of pcDNA3.1 (-) huIGS58, a plasmid DNA prepared from ICCG 4748 strain, showed that the insert was completely identical to the IGS58 DNA consensus cDNA sequence.
Example 3 Expression analysis of IGS58 mRNA in different human tissues by quantitative PCR (Q-PCR).
[0116]
Absolute expression levels of human GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and IGS58 mRNA were measured using the Light Cycler. ^TM Instrument (Roche Diagnostics) and gene-specific PCR primers and TaqMan ^TM Probes were used on human RNA samples and determined in a real-time quantitative RT-PCR assay (Q-PCR). MRNA levels of the housekeeping gene GAPDH were measured as controls for the efficiency of cDNA synthesis and PCR amplification of different RNA samples.
[0117]
The cDNA may be total RNA from different human tissues (Clontech human RNA panel cat # K4000-1, K4001-1, K4002-1, K4003-1 and K4004-1) or poly (A) derived from different small regions of the human brain ⁺ Synthesized through reverse transcription from any of the RNAs (Clontech cat # 6580.1, 6575.1, 6543.1, 6574.1, 6577.1, 6578.1 and 6582.1). Prior to reverse transcription, RNA was treated with DNase I (Life Technologies cat # 18068-015) according to the procedure recommended by the supplier to destroy possible contaminating genomic DNA. The DNase I reaction was stopped by adding EDTA (final concentration = 2.3 mM) and heating at 65 ° C. for 10 minutes. RNA treated with DNase I (5 μg total RNA or 945 ng poly (A) ⁺ RNA) was annealed to 2.5 μg of oligo (dT) (Life Technologies # 18418-012) and used for reverse transcription using Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen; 100 μl reaction volume; 1 hour at 37 ° C.). (= RT ⁺ reaction). Reverse transcriptase was inactivated by incubation at 93 ° C for 5 minutes. Some of the RNA treated with DNase was not subjected to reverse transcription and was used as a control to check for the presence of residual genomic DNA (RT ⁻ reaction).
[0118]
As a control for the absence of genomic DNA, total RNA RT ⁻ Human β to the reaction solution ₂ A PCR amplification reaction specific for microglobulin DNA was performed. The PCR reaction was performed with 2.5 μl of GeneAmp ^TM 10 × PCR buffer (Applied Biosystems), 200 μM each dNTP, 0.5 μl, RT ⁻ cDNA synthesis reaction, 5 pmol each of PCR primers IP3,981 (SEQ ID NO: 7) and IP3,982 (SEQ ID NO: 8), and 1.25 U of AmpliTaq Gold ^TM The reaction was performed in a 25 μl reaction volume containing DNA polymerase (Applied Biosystems cat # N808-0244). After an initial incubation at 95 ° C. for 10 minutes, the reaction was run for 30 cycles as follows: denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute. Extension. Final extension was performed at 72 ° C. for 10 minutes. As a positive control, 50 ng of human genomic DNA (Clontech # 6551-1) was used. An amplicon of the expected length was obtained from the genomic DNA template, but a negative control (H ₂ O) and also RT ⁻ Also not obtained from the sample (due to the fact that the IP3, 981 / IP3982 primer pair spans a 616 bp intron, the expected amplicon lengths on cDNA and genomic DNA are 269 bp and 885 bp, respectively. ). RT ⁻ Poly (A) ⁺ RNA samples were prepared with 0.8 μl RT ⁻ The presence of genomic DNA was analyzed by GAPDH-specific Q-PCR using a cDNA synthesis reaction (see below). No signal specific to GAPDH was obtained. We concluded that the synthesized cDNA did not include genomic DNA.
[0119]
The Q-PCR reaction was performed with 1 × TaqMan ^TM Forward and reverse primers specific to Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems cat # 4304437), 0.12 mg BSA / ml, 900 nM GAPDH or IGS58 (IP15,529 [SEQ ID NO: 9 for GAPDH] IP15, 531 [SEQ ID NO: 10], IP15, 714 [SEQ ID NO: 11] / IP15, 715 [SEQ ID NO: 12] for IGS58, 250 nM gene-specific TaqMan probe (each for GAPDH) IP15,530 [SEQ ID NO: 13], IP15,705 for IGS58 [SEQ ID NO: 14]), and 1.6 μl of total RNA RT ⁺ Or poly (A) ⁺ RT ⁺ The reaction was performed in a 20 μl reaction volume containing the cDNA synthesis reaction. 1x TaqMan ^TM Universal PCR Master Mix is available from AmpliTaq Gold ^TM DNA polymerase, AmpErase ^TM Included uracil N glycosylase (UNG), dNTPs including dUTP, Passive Reference 1, and optimized buffer components. Specific primers and TaqMan probes were purchased from Primer Express ^TM Designed by software (Applied Blosystems). A gene-specific standard curve was developed using a series of 1/10 dilutions (10 per reaction) of linear pGEM-ThuGAPDH (containing full-length human GAPDH cDNA) or pGEM-ThsIGS58 plasmid (ICCG 4584). ⁸ -10 ² Copy). PCR reaction is Light Cycler ^TM Performed in the glass capillary cuvette of the instrument. After an initial incubation at 50 ° C for 2 minutes (to allow the AmpErase UNG reaction to take place), the AmpliTaq Gold at 95 ° C for 10 minutes. ^TM Followed by 50 cycles of reaction as follows: denaturation at 95 ° C. for 15 seconds, annealing / extension at 60 ° C. for 60 seconds (both GAPDH and 1GS58). Sample quantification was performed using Light Cycler Software version 3.0.
[0120]
The absolute expression level of human GAPDH mRNA was determined by skeletal muscle (poly (A) ⁺ About 7.4 × 10 per ng of RNA ⁶ Copy), heart (poly (A) ⁺ About 2.3 × 10 per 1 ng of RNA ⁶ Copy), and pancreas, spleen, liver and stomach (poly (A) ⁺ About 4 × 10 per 1 ng of RNA ⁵ ~ About 1.5 × 10 ⁶ Poly (A) in most organizations except for the ⁺ About 1 to 3 × 10 per 1 ng of RNA ⁵ It was the range of the copy (FIG. 1).
[0121]
IGS58 mRNA was found to be an order of magnitude higher in testis than in tissues with the second highest expression (prostate: 6,501 copies per ng of mRNA) (FIG. 2). Relatively high levels (1,000-4,000 copies / ng of mRNA) were also observed in central nervous system tissues (fetal brain, brain, cerebellum and spinal cord). This is because poly (A) obtained from different brain regions ⁺ The Q-PCR data obtained for RNA confirmed this: IGS58 mRNA expression in this part was 500-1,000 copies per ng mRNA except for the substantia nigra (296 copies per ng mRNA). Also, significant levels of IGS58 mRNA were found in the uterus, heart, kidney, lung, trachea, skeletal muscle, adrenal gland and thyroid.
[0122]
[Table 4]

[0123]
Example 4. Preparation of cells transfected with IGS58.
[0124]
To identify the ligand for IGS58, Chinese hamster ovary (CHO) cells are stably transfected with the cDNA for the IGS58 orphan receptor. Since the G protein coupling mechanism of the IGS58 receptor is still unknown, a specific CHO cell line (CHO-K1-Gα16, Molecular Devices) expressing the G protein Gα16, known as a “universal adapter” for GPCRs, was used. (Milligan G. et al. (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17: 235-7). This cell line also stably expresses apoaequorin, which is induced into mitochondria.
[0125]
Materials included IGS58 pcDNA3.1 vector [ICCG # 4748]; SuperFect transfection reagent (Qiagen); culture medium: 10% fetal calf serum (FCS, Gibco BRL), 2 mM L-glutamine, 400 μg / ml hygromycin B CHO-S-SFM II (Gibco BRL) supplemented with CHO-S-SFM II (Gibco BRL); selection medium: 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 400 μg / ml hygromycin B and 500 μg / ml Geneticin. Including RNeasy Mini Kit (Qiagen), DNase I (Ambion, 2U / μl), SuperScript II (Gibco BRL), SuperScript II 200U (Gibco BRL) No.
[0126]
CHO-K1-Gα16 / mtAEQ cells are transfected using SuperFect (Qiagen) as described by the manufacturer. Transfection is performed in 24-well plates. After 24 hours in the culture medium, the medium is removed and replaced with a selection medium. After culturing to confluence in the selection medium, the polyclonal is passaged once in a 24-well plate.
[0127]
Polyclonal selection is performed by Q-PCR. RNA is isolated from the monoclonals (one confluent well of a 24-well plate) by the Rneasy Mini Kit (Qiagen) according to the supplied protocol. RNA is treated with 1 U of DNase I (Ambion, 2 U / μl) per sample. One half of the RNA sample is used for RT-PCR using SuperScript II (Gibco BRL). Annealing of the primers is performed with RNA and oligo dT16 (0.6 μM) at 65 ° C. to 15 ° C. for 10 minutes. First Strand Buffer (Gibco BRL) with 0.43 mM dNTPs, 10 mM DTT, 20 U RNasin (Promega, 40 U / μl) and SuperScript II 200 U (Gibco BRL, 200 U / μl to final volume, then 30 μl to final volume). Followed by a 1 hour incubation at 42 ° C.
[0128]
Q-PCR is performed using Q-PCR primers specific for the IGS58 receptor. The amount of PCR product is determined after each cycle by measuring the fluorescence of Sybr Green binding to dsDNA. The relative expression of IGS is related to a standard curve of four different dilutions of chromosomal DNA. Relative quantification is normalized to the housekeeping gene β-tubulin.
[0129]
The two best polyclonals are used to obtain a monoclonal. Cells are seeded at limiting dilution. As mentioned above, selection of the monoclonal is done by Q-PCR. The six best monoclonals are grown to confluence in T75 flasks and frozen in culture medium containing 10% DMSO.
Example 5 Search for ligand.
[0130]
CHO-K1-Gα16-mtAEQ cells expressing a particular G protein-coupled receptor are cultured as described in Example 4 and used to screen a large library of compounds. Compounds are tested at a concentration of 1 or 10 μM. In the aequorin screening assay, ATP (10 μM) or digitonin (50 μM) is used as a positive control. Screening is performed semi-automatically using MicroBeta Jet 1450 (Perkin Elmer) as described below.
[0131]
Once the compound is found, the signal activity is confirmed by a second aequorin experiment. Thereafter, they are further characterized in dose response experiments.
[0132]
If the ligand is not successfully found using CHO-K1-Gα16 cells expressing the IGS58 receptor and apoaequorin, a corresponding cell line without the G protein Gα16 may be produced in a similar manner. Yes (see Example 4), followed by compound testing.
[0133]
[Table 5]

[0134]
[Table 6]

[0135]
[Table 7]

[Brief description of the drawings]
FIG.
Q-PCR analysis of GAPDH mRNA expression in different human tissues. Reported values (# copies / ng mRNA) represent the average of two Q-PCR assays, each assay on independently prepared cDNA. mRNA accounts for 2% of total RNA, and its cDNA synthesis was assumed to be 100% efficient. Since the true efficiency is probably close to 20-50%, the actual copy number is likely to be underestimated 2-5 times. In the organizations marked with “*”, poly (A) ⁺ RNA was used, but total RNA was used in all other tissues.
FIG. 2
Q-PCR analysis of IGS58 mRNA expression in different human tissues. Reported values (# copies / ng mRNA) are from a single measurement. mRNA accounts for 2% of total RNA, and its cDNA synthesis was assumed to be 100% efficient. Since the true efficiency is probably close to 20-50%, the actual copy number is likely to be underestimated 2-5 times. In the organizations marked with “*”, poly (A) ⁺ RNA was used, but total RNA was used in all other tissues. Expression of IGS58 mRNA in testis is an order of magnitude higher than that of prostate and is not represented on the bar graph.

Claims (43)

a) a nucleotide sequence encoding an IGS58 polypeptide according to SEQ ID NO: 2;
b) a nucleotide sequence encoding the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands), in particular the nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1;
c) a nucleotide sequence having at least 80% (preferably at least 90%) sequence identity to nucleotide sequence (a) or (b) over its entire length;
d) a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of (a) or (b) or (c);
An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: a) a nucleotide sequence encoding an IGS58 polypeptide according to SEQ ID NO: 2;
b) a nucleotide sequence encoding the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands), in particular the nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1;
c) a nucleotide sequence having at least 90% (preferably at least 95%) sequence identity to nucleotide sequence (a) or (b) over its entire length;
d) a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of (a) or (b) or (c);
An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: a) a nucleotide sequence encoding an IGS58 polypeptide according to SEQ ID NO: 2;
b) a nucleotide sequence encoding the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands), in particular the nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1;
c) a nucleotide sequence having at least 95% (preferably at least 98%) sequence identity to nucleotide sequence (a) or (b) over its entire length;
d) a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of (a) or (b) or (c);
An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: a) a nucleotide sequence encoding an IGS58 polypeptide according to SEQ ID NO: 2;
b) a nucleotide sequence encoding the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands), in particular the nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1;
c) a nucleotide sequence having at least 98% (preferably at least 99%) sequence identity to the nucleotide sequence (a) or (b) over its entire length;
d) a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of (a) or (b) or (c);
An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: The polynucleotide according to any of claims 1 to 4, comprising the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1 encoding the IGS58 polypeptide of SEQ ID NO: 2. 5. The sequence according to claims 1-4, comprising a sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence which is at least 80% identical over its entire length to the sequence of the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands). The polynucleotide according to any one of the above. 5. The sequence according to claim 1, comprising a sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence which is at least 90% identical over its entire length to the sequence of the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands). The polynucleotide according to any one of the above. 5. The sequence according to claims 1-4, comprising a sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence which is at least 95% identical over its entire length to the sequence of the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands). The polynucleotide according to any one of the above. 5. The sequence according to claims 1-4, comprising a sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence which is at least 98% identical over its entire length to the sequence of the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcules of Utrecht (Netherlands). The polynucleotide according to any one of the above. 5. The sequence according to claims 1 to 4, comprising a sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence that is at least 99% identical over its entire length to the sequence of the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands). The polynucleotide according to any one of the above. The polynucleotide according to any of claims 5 to 10, which is SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide of the DNA insert contained in the accession number CBS109717 in Utrecht (Netherlands) at Centraalbureau vood Schimmelcultures. The polynucleotide according to any one of claims 1 to 11, which is DNA or RNA. A hybridization probe comprising the polynucleotide according to claim 1. When present in a compatible host cell, the expression system is at least 80% identical to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 at Centraalbureau vood Schimmelcules, Utrecht (Netherlands). A DNA or RNA molecule constituting said expression system capable of producing an IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence. When present in a compatible host cell, the expression system is at least 90% identical to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 at Centraalbureau vood Schimmelcules, Utrecht (Netherlands). A DNA or RNA molecule constituting said expression system capable of producing an IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence. When the expression system is present in a compatible host cell, it is at least 95% identical to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 at Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands). A DNA or RNA molecule constituting said expression system capable of producing an IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence. When present in a compatible host cell, the expression system is at least 98% identical to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 at Centraalbureau vood \ Shimmelcultures, Utrecht (Netherlands). A DNA or RNA molecule constituting said expression system capable of producing an IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence. When the expression system is present in a compatible host cell, it is at least 99% identical to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 at Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands). A DNA or RNA molecule constituting said expression system capable of producing an IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence. A host cell comprising the expression system according to any one of claims 14 to 18. 20. The host cell according to claim 19, which is a yeast cell. The host cell according to claim 19, which is an animal cell. An IGS58 receptor membrane preparation derived from the cells according to any of claims 19 to 21. 22. A method for producing an IGS58 polypeptide, comprising culturing the host of claims 19-21 under conditions sufficient for the production of the polypeptide and recovery of the polypeptide from the culture. 19. A method for producing IGS58 polypeptide, comprising transforming or transfecting a cell with the expression system of any of claims 14-18, such that the cell is capable of producing IGS58 polypeptide under appropriate culture conditions. A method for producing cells to be treated. An IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence that is at least 80% identical over its entire length to the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands). An IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence that is at least 90% identical over its entire length to the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands). An IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence that is at least 95% identical over its entire length to the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcultures, Utrecht (Netherlands). An IGS58 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence that is at least 98% identical over its entire length to the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcules, Utrecht, The Netherlands. An IGS58 polypeptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence that is at least 99% identical over its entire length to the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcules, Utrecht (Netherlands). 30. The polypeptide according to any one of claims 25 to 29, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau vood Schimmelcules of Utrecht (Netherlands). . An antibody immunospecific for the IGS58 polypeptide according to any one of claims 25 to 30. (A) administering to the patient a therapeutically effective amount of an agonist for said receptor; and / or (b) accession number CBS109717 at IGS58 polypeptide of SEQ ID NO: 2 or at Centraalbureau voor Schimmelcules of Utrecht (Netherlands). An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 80% identity over its entire length to the nucleotide sequence encoding the polypeptide encoded by the included DNA insert, or a nucleotide sequence complementary to said nucleotide sequence. Providing the nucleotide to the patient in a form capable of effecting the production of said receptor activity in vivo;
31. A method for treating a patient in need of enhanced activity or expression of an IGS58 polypeptide receptor according to any of claims 25 to 30, comprising the step of: (A) administering to the patient a therapeutically effective amount of an antagonist to the receptor; and / or (b) administering to the patient a polynucleotide that inhibits the expression of a nucleotide sequence encoding the receptor; And / or (c) administering to the patient a therapeutically effective amount of a polypeptide that competes for the receptor and its ligand.
31. A method for treating a patient in need of inhibiting the activity or expression of an IGS58 polypeptide receptor according to any of claims 25 to 30, comprising: (A) determining the presence or absence of a mutation in the nucleotide sequence encoding the IGS58 polypeptide in the patient's genome in a sample derived from the patient; and / or (b) expressing IGS58 polypeptide in the sample derived from the patient. Analyzing for the presence or amount of
31. A method for diagnosing in a patient a disease or a susceptibility to a disease associated with expression or activity in a patient of the IGS58 polypeptide of any of claims 25-30, comprising the step of: (A) contacting a test compound with a cell that produces IGS58 polypeptide; and (b) determining whether the test compound results in a signal generated by activation of the IGS58 polypeptide;
31. A method for identifying an agonist for an IGS58 polypeptide according to any of claims 25 to 30, comprising: An agonist identified by the method of claim 35. (A) contacting an agonist with a cell that produces an IGS58 polypeptide; and (b) determining whether the signal generated by the agonist is reduced in the presence of the candidate compound;
31. A method for identifying an antagonist to an IGS58 polypeptide according to any of claims 25 to 30, comprising: An antagonist identified by the method of claim 37. A recombinant host cell expressing an IGS58 polypeptide or a membrane thereof produced by the method of claim 24. A method of producing a genetically engineered non-human animal, comprising:
a) Amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid sequence encoding a protein having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands) or a biologically active fragment thereof Linking the coding portion of the polynucleotide essentially comprising a control sequence capable of driving high level gene expression or expression in a cell type in which the gene is not normally expressed in said animal; or b) amino acids Sequence SEQ ID NO: 2 or accession number CBS10971 at Centraalbureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands) Altering the coding portion of the polynucleotide essentially comprising the nucleic acid sequence encoding the protein or biologically active fragment thereof having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence SEQ ID NO: : 2 or the endogenous allele encoding the protein or biologically active fragment having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in Centraalbureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands), or Reintroducing said sequence into said animal's genome in such a way as to be partially inactivated;
A method comprising: 38. A method for the manufacture of a pharmaceutical composition, comprising the method of claim 35 or 37, and then comprising admixing a compound that is considered a pharmaceutically acceptable carrier. (A) a therapeutically effective amount of an agonist for an IGS58 receptor polypeptide of any of claims 25-30; and / or (b) an activity of an IGS58 polypeptide of any of claims 25-30, or Such that the production of said receptor activity can be effected in vivo for the production of a drug for the treatment of a patient suffering from a disease associated with the expression or activity of an IGS58 receptor polypeptide which requires increased expression. SEQ ID NO: 2 in full length, relative to the nucleotide sequence encoding the polypeptide encoded by the DNA insert contained in Accession No. CBS109717 in the IGS58 polypeptide or in Centralalureau voor Schimmelcultures of Utrecht (Netherlands). An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 80% identity; or a nucleotide sequence complementary to said nucleotide sequence;
Use of. (A) a therapeutically effective amount of an antagonist to the IGS58 receptor polypeptide of any of claims 25-30; and / or (b) an IGS58 receptor polypeptide of any of claims 25-30. A nucleic acid molecule that inhibits the expression of an encoding nucleotide sequence; and / or (c) the expression or activity of an IGS58 receptor polypeptide, which has the need to inhibit the activity or expression of an IGS58 polypeptide according to any of claims 25-30. A therapeutically effective amount of an IGS58 receptor polypeptide of any of claims 25 to 30 and a polypeptide that competes for its ligand for the preparation of a medicament for the treatment of a patient suffering from a disease associated with
Use of.

Images