JP2004500039A - Human G-protein coupled receptor - Google Patents

Abstract

The present invention relates to the IGS3G protein-coupled receptor family and a polynucleotide encoding the IGS3 protein. The present invention relates to inhibiting or activating the action of these polynucleotides and polypeptides, overexpressing a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the vector and the IGS3 gene, underexpressing under non-pressure reduced pressure, or It also relates to transgenic non-human animals (knockout animals) that are either suppressors. The present invention further provides methods for screening compounds that can act as agonists or antagonists of the G protein-coupled receptor family IGS3 and IGS3 in the treatment of a wide range of diseases and diagnostic assays for such conditions. It relates to the use of IGS3 polypeptides and polypeptide nucleotides and agonists or antagonists for the receptor family.

Description

【００１５】
【表２】

【００１６】
発明の詳細な説明
構造および化学的類似性は、配列およびモチーフの範囲内で、本発明のＩＧＳ３　ＧＰＣＲとその他のヒトＧＰＣＲとの間に存在する。従って、ＩＧＳ３はなかでも上記の「疾患」に関与すると考えられる。
【００１７】
別途に断らない限り、本明細書中に使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の通常の熟練者により共通して理解されると同様の意味を有する。本明細書中に記載のものに類似または等価なあらゆる方法および物質が本発明の実施または試験に使用できるけれども、好ましい方法、装置および物質をここに記載する。本明細書中に引用したすべての公開文献は、すべての公開文献を特定して個別に完全に記載すると同様に本明細書中に引用して組み込むと同様に、引用することにより本明細書中に編入される。
【００１８】
定義
以下の定義は、本明細書中にしばしば使用される一部の用語の理解を助けるために記載される。
【００１９】
「ＩＧＳ３」は、なかでも、配列番号２中に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはその変種を呼ぶ。
【００２０】
「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」は、該ＩＧＳ３の代謝または生理的機能を呼び、同様の活性または改善された活性または低下した望ましくない副作用を有するこれらの活性を含む。該ＩＧＳ３の抗原性および免疫原性活性も含まれる。
【００２１】
「ＩＧＳ３遺伝子」は、配列番号１中に記載のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれらの変種および／またはこれらの補体を呼ぶ。
【００２２】
本明細書中に使用される「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、および人体適応化された抗体、ならびにＦａｂ断片を含み、これにはＦａｂまたはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物も含まれる。
【００２３】
「単離された」は、「人手により」本来（天然）の状態から改変および／または本来の環境から分離されたことを意味する。従って、本来的に存在する「単離された」組成物または物質が「単離」されると、その当初の環境から変化または移動または両方を受ける。例えば、本来的に生きた動物内に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、しかしその本来の状態で一緒に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ており、このように本明細書中で用語が使用される。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」は、一般に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよいあらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを呼ぶ。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖状ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖状ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖またはさらに典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の領域の混合であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を含むが、これに限定はされない。さらに「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる三本鎖領域も含んでもよい。用語ポリヌクレオチドは、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性またはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾された」塩基は、例えばトリチル化された塩基および通常ではない塩基、例えばイノシンを含む。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ、従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された、典型的に天然に見いだされるポリヌクレオチドの形、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学的の形を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００２５】
「ポリペプチド」は、たがいにペプチド結合または変形ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターで結合された２個またはそれ以上のアミノ酸を含んでなるあらゆるペプチドまたはタンパク質を呼ぶ。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および一般にタンパク質と呼ばれるさらに長い鎖、および／またはこれらの組み合わせを呼ぶ。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、天然の過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野では周知の化学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的教科書中およびさらに長大な論文中ならびに大量の研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる場所で起きることができる。同じ形式の修飾が、与えられたポリペプチド中の種々の部位において同一または異なる程度で存在してもよいことが認められる。また、与えられたポリペプチドは多数の形式の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝してもよく、そしてこれらは分枝を有するかまたは有していない環状であってもよい。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセシングからもたらされてもよくまたは合成法により作製されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスホチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加例えばアルギニル化、およびユビキチン化を含む。例えば、「タンパク質−構造および分子的性質」（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３）および「翻訳後タンパク質修飾− 前途および予想」（Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， ｐｇｓ． １−１２ ｉｎ ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３） 、「タンパク質修飾および非タンパク質補因子の分析」（Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９９０） １８２：６２６−６４６）および「タンパク質合成：翻訳後修飾および熟成」（Ｒａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９２） ６６３：４８−６２）を参照。
【００２６】
本明細書中に使用される用語としての「変種」は、比較するポリヌクレオチドまたはポリペプチドとはそれぞれ異なるが、本質的な性質、例えば本質的な生物学的、構造的、調節的または生化学的性質は保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、他の比較ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列中の変化は、比較ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもしなくてもよい。ヌクレオチド変化は、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を比較配列によりコードされるポリペプチド中にもたらしてもよく、これは以下に考察する。ポリペプチドの典型的な変種は、アミノ酸配列が他の比較ポリペプチドと異なる。一般に、相違は、比較ポリペプチドおよび変種の配列が全体的には密接に類似しそして多くの領域で一致している程度に限定される。変種および比較ポリペプチドは、アミノ酸配列内であらゆる組み合わせにより１個またはそれ以上の置換、付加、および欠失で異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子暗号によりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、天然に存在する例えば対立遺伝子変種であってもよく、またはこれは天然に存在するとは知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非−天然存在変種は、突然変異誘発技術または直接合成により作製されてもよい。
【００２７】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最高度の一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は、当該技術分野で認められた意味を有しそして公開された技術を用いて算出できる。例えば下記参照：「コンピューターによる分子生物学」（ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８）；「バイオコンピューティング： 情報学およびゲノムプロジェクト」（ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ： ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３）；「配列データのコンピューター分析、第一部」（ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ， ＰＡＲＴ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４）； 「分子生物学における配列解析」（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７）；および「配列解析プライマー」（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥＲ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の一致を測定する多数の方法が存在するけれども、用語「同一性」は、当該技術分野の熟練者には周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， （１９８８） ４８：１０７３）。２個の配列の間の同一性または類似を決定するために一般的に使用される方法は、「大型コンピューターへのガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９４） およびＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ， （１９８８） ４８：１０７３ 中に開示されたものを含むが、これに限定はされない。同一性および類似を決定するための方法は、コンピュータープログラム中にコード化されている。２個の配列間の同一性および類似を決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９８４） １２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． （１９９０） ２１５：４０３）を含むが、これに限定はされない。用語「相同」は、「同一性」に互換可能である。
【００２８】
説明として、配列番号１の比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９５％「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が配列番号１の比較ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個それぞれに対して５個以下のヌクレオチド相違を含んでもよいことを除いて、比較配列と一致することを意味する。換言すると、比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一するヌクレオチド配列を有すポリヌクレオチドを得るためには、比較配列中のヌクレオチドの５％以下が欠失または他のヌクレオチドにより置換されてもよいか、または比較配列中の全ヌクレオチドの５％以下の数のヌクレオチドが比較配列内に挿入されてもよいか、または比較配列内の全ヌクレオチドのいずれかの５％以下のヌクレオチドの数において欠失、挿入および置換の組み合わせがあってもよい。比較配列のこれらの変異は、比較ヌクレオチド配列の５または３末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のいかなる位置でも、比較配列中のヌクレオチドの間で個別に、または比較配列内の１個またはそれ以上の連続基内のヌクレオチドのいずれかに散布して起きてもよい。
【００２９】
同様に、例えば、配列番号２の比較アミノ酸配列に対して少なくとも９５％「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が配列番号２の比較配列のアミノ酸１００個のそれぞれに対して５個以下のアミノ酸変化を含んでもよいことを除いてポリペプチドのアミノ酸配列が比較配列と一致すること意味する。換言すると、比較アミノ酸配列に少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、比較配列内のアミノ酸残基の５％以下が欠失または他のアミノ酸で置換されていてもよいか、または比較配列内の全アミノ酸残基の５％以下の数のアミノ酸が比較配列中に挿入されてもよい。比較配列のこれらの変更は、比較アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のあらゆる位置で、比較配列内の残基間に個別にまたは比較配列内の１個またはそれ以上の隣接基内のいずれかに散在して存在してもよい。
本発明のポリペプチド
一つの態様では、本発明は、ＩＧＳ３ポリペプチド（ＩＧＳ３タンパク質も含む）に関する。ＩＧＳ３ポリペプチドは配列番号２のポリペプチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）に１９９９年９月１５日付けで寄託された寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号２のものとおよび／またはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、そしてさらに好ましくは、少なくとも９０％の同一性、そしてその上にさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を該アミノ酸配列に対して有するポリペプチドを含む。さらに、少なくとも９７％、特には少なくとも９９％のものが高度に好ましい。ＩＧＳ３ポリペプチド内には、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを有し、そしてさらに好ましくは、配列番号２に少なくとも９０％の同一性、そしてその上にさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドも含む。さらに、少なくとも９７％、特には少なくとも９９％のものが高度に好ましい。好ましくは、ＩＧＳ３ポリペプチドは受容体の少なくとも一つの生物学的活性を示す。
【００３０】
本発明の別の態様では、ＩＧＳ３ポリペプチドは、さらに大きいタンパク質、例えば融合タンパク質の一部分であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製において支援する配列、例えば重複ヒスチジン残基を含む追加のアミノ酸配列、検出を支援する配列、例えば抗原性ペプチドタグ（例えばヘマグルチニン（ＨＡ）タグ）または組換え物産生の間の安定性のための追加の配列を含むとしばしば有利である。
【００３１】
ＩＧＳ３ポリペプチドの断片も本発明中に含まれる。断片とは、上記のＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸配列の一部分ではあるが全体ではないものと同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＩＧＳ３ポリペプチドと同様に、断片は「自立」、すなわちこれらが部分または領域を形成するさらに大きいポリペプチド内で、最も好ましくは単独の連続領域を含んでなってもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例は、例えば、ＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸番号約１−２０、２１−４０、４１−６０、６１−８０、８１−１００、および１０１から末端までよりの断片を含む。この範囲内で、「約」は一方の端または両端のいずれかにおける数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸ほど大きいかまたは小さい特定の列挙の範囲を含む。
【００３２】
好ましい断片は、例えば、アミノ末端を含む残基の一連の連続物もしくはカルボキシ末端を含む残基の一連の連続物の欠失、またはアミノ末端を含むものおよびカルボキシ末端を含むものの残基の２個の連続物の欠失を除き、ＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを含む。構造的または機能的属性、例えばアルファらせんおよびアルファらせん形成性領域、ベータシートおよびベータシート形成性領域、ターンおよびターン形成性領域、コイルおよびコイル形成性領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両性領域、ベータ両性領域、フレキシブル領域、表面形成性領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含んでなる断片により特徴付けられる断片も好ましい。その他の好ましい断片は、生物学的活性の断片である。生物学的活性の断片は、受容体活性を媒介するものであり、類似した活性もしくは改善された活性を有するか、または低下した望ましくない活性を有するものを含む。動物中特にはヒト中で抗原性または免疫原性であるものも含まれる。
【００３３】
従って、本発明のポリペプチドは、配列番号２のものおよび／またはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または相当する断片に少なくとも８０％同一であるこれらの断片を含む。好ましくは、これらのポリペプチド断片のすべては、抗原活性を含む受容体の生物学的活性を保持する。定義された配列および断片の変種も本発明の一部を形成する。好ましい変種は、保存的アミノ酸置換により比較物とは異なるもの、すなわち別または類似した特性の残基を置換するものである。典型的なこのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間、ＳｅｒとＴｈｒとの間、酸残基ＡｓｐとＧｌｕとの間、ＡｓｎとＧｌｎとの間、および塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの間、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間である。特に好ましくは、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が、いずれかの組み合わせで置換、欠失、または追加されている変種である。
【００３４】
本発明のＩＧＳ３ポリペプチドは、あらゆる適当な方法で作製できる。このようなポリペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え作製されたポリペプチド、合成して作製されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせで作製されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドの作製方法は、当該技術分野では周知である。
本発明のポリヌクレオチド
本発明の別の態様はＩＧＳ３ポリヌクレオチドに関する。ＩＧＳ３ポリヌクレオチドは、ＩＧＳ３ポリペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、およびこれに密接に関連するポリヌクレオチドを含む。さらに具体的には、本発明のＩＧＳ３ポリヌクレオチドは、配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、例えば配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードできるもの、配列番号１の特定の配列を有するポリヌクレオチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物に本質的に相当するポリヌクレオチドを含む。
【００３５】
ＩＧＳ３ポリヌクレオチドは、配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、配列番号１のものにその全長にわたって少なくとも８０％同一性であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物に本質的に相当するポリヌクレオチドをさらに含む。
【００３６】
これに関して、少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、そして少なくとも９５％同一であるものがさらに好ましい。さらに、少なくとも９７％のものが高度に好ましく、少なくとも９８−９９％のものが最も高度に好ましく、少なくとも９９％のものが最も好ましい。ＩＧＳ３ポリヌクレオチドとして、配列番号１内に含まれるヌクレオチド配列に対しまたはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物に対して十分な一致性を有するヌクレオチド配列も、増幅のためまたはプローブまたはマーカーとしての使用のために使用可能な条件下でハイブリダイズするために含まれる。本発明は、これらのＩＧＳ３ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
【００３７】
本発明のＩＧＳ３は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの他のタンパク質に構造的に関連し、これは公開データベース中のＢＬＡＳＴサーチの結果により示される。表２のアミノ酸配列（配列番号２）は、約３５％一致（ＢＬＡＳＴ使用、Ａｌｔｓｃｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９７）， ２５：３３８９−３４０２）をその長さの大部分（２−３０６アミノ酸残基）において、ヒトｍａｓ腫瘍遺伝子によりコードされるタンパク質（特許出願ＷＯ８７０７４７２号中の配列１）と有する。この配列は、３７％の同一性（アミノ酸残基３５−３１５）を特許出願ＷＯ９６１６０８７号中に公開されたＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＥＮＥＳＥＱ９６Ｐ−Ｒ９７２２２）に対して有する。表１のヌクレオチド配列（配列番号１）は、５２％および５４％の同一性を２個の上記の受容体（それぞれＧＥＮＥＳＥＱ８７Ｎ−７０６８５および９６Ｎ−Ｔ２８８０７）の長さの大部分で有する。さらに、残基１０４−１１４４内でヒトソマトスタチン−３−受容体（ＷＯ９３１３１３０号；９３Ｎ−Ｑ４５６５７）に４８％同一である。ＩＧＳ３タンパク質配列のヒドロパシー分析（Ｋｙｔｅ Ｊ． ｓｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９８２） １５７：１０５−１３２； Ｋｌｅｉｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９８５）８１５： ４６８−４７６）は、予想通りに７個の膜貫通ドメインの存在を示した。従って、本発明のＩＧＳ３ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、なかでもこれらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに類似した生物学的機能／性質を有すると予想され、そしてこれらの有用性は当該技術分野のすべての熟練者には明白である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、天然資源、例えばゲノムＤＮＡから得ることができる。特に、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ） ＰＣＲプライマーは、特定のＧＰＣＲ遺伝子サブファミリー内で保存された領域をコードするように設計できる。縮重プライマーを用いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ上のＰＣＲ増幅反応は、考慮している遺伝子ファミリーの数種のメンバー（公知および新規の両方）の増幅をもたらす（ゲノム鋳型を用いる場合には、縮重プライマーは同じエキソン内に位置しなければならない）（Ｌｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ２４４：５６９−５７２ ）。本発明のポリヌクレオチドは、周知で商業的に利用できる技術を用いて合成もできる。
【００３９】
配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１（ヌクレオチド番号１４９〜１１３８）中に含まれる配列をコードするポリペプチドと一致してもよいか、またはこれは、遺伝子コードの重複（縮重）の結果として、配列番号１内に含まれるポリペプチドをコードする配列と比較して変化を示す異なるヌクレオチド配列であってもよいが、しかし配列番号２のポリペプチドをコードしてもよい。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドがＩＧＳ３ポリペプチドの組換え産生に使用される場合には、ポリペプチドは成熟ポリペプチドのためのコーディング配列またはその断片それ自体、成熟ポリペプチドのためのコーディング配列または他のコーディング配列を有する読み取り枠内の断片、例えばリーダーまたは分泌配列、プレ−、またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列またはその他の融合ペプチド部分をコードするものを含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー配列がコードされることができる。本発明のこの実施におけるある好ましい態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、これはｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）内に提供され、そしてＧｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８９） ８６：８２１−８２４に記載されており、またはＨＡタグである。ポリヌクレオチドは、非−コーディング５’および３’配列、例えば転写された非−翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列を含んでもよい。
【００４１】
さらに好ましい態様は、その中で数個、５−１０、１−５、１−３、１−２または１個のアミノ酸残基があらゆる組み合わせで置換、欠失または付加された、配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるＩＧＳ３変種をコードするポリヌクレオチドである。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現の変化を含むが、これに限定はされない種々の目的のためにＩＧＳ３コード化配列を改変するために、当該技術分野では一般に公知の方法を用いて操作することができる。ランダムフラグメンテーションによるＤＮＡシャフリングおよび遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構築を、ヌクレオチド配列を操作するために使用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒介の部位指定突然変異誘発は、アミノ酸置換の創成、新規の制限部位の創成、修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）パターンの改変、コドン優先の変化、スプライス変種の産生などの変異を導入するために使用してもよい。
【００４３】
本発明は、さらに、本明細書中に以上に記載した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、ストリンジェントな条件下で本明細書中に以上に記載したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに特に関する。本明細書中に使用される用語「ストリンジェント条件」は、少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに好ましくは少なくとも９５％、それ以上に好ましくは少なくとも９７％、特には少なくとも９９％の同一性が配列間で存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起きることを意味する。
【００４４】
配列番号１またはその断片中に含まれるヌクレオチド配列に一致または十分に一致する本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、全長ｃＤＮＡおよびＩＧＳ３をコードするゲノムクローンを単離するためおよびＩＧＳ３遺伝子に高度の配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために使用してもよい。当該技術分野の熟練者は、このようなハイブリダイゼーション技術を熟知している。典型的にはこれらのヌクレオチド配列は、比較物のものと８０％同一、好ましくは９０％同一、さらに好ましくは９５％同一である。プローブは、一般に、少なくとも５個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも８個のヌクレオチド、そしてさらに好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド、もっと好ましくは少なくとも１２個のヌクレオチド、特には少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなる。最も好ましくは、このようなプローブは少なくとも３０個のヌクレオチドを有しそして少なくとも５０個のヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブは、３０から５０個の範囲内のヌクレオチドである。
【００４５】
一つの態様は、ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体を含むＩＧＳ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１またはその断片を有する標識プローブを用いる適当なライブラリーのスクリーニング、および全長ＤＮＡならびに該ポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離する段階を含んでなる。このようなハイブリダイゼーション技術は当該技術分野の熟練者には周知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記に定義されたもの、または４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン（ｗ／ｖ）、および２０μｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションし、次いで０．１ｘＳＳＣ中、約６５℃でフィルターを洗浄する条件と定義される。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒト疾患に対する治療法および診断法の発見のための研究用試薬および材料として使用してもよい。
ベクター、宿主細胞、発現
本発明は、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および本発明のベクターを用いて遺伝子的に操作された宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。細胞を含まない翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いるこのようなタンパク質の産生に使用できる。
【００４７】
組換え産生のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドのための発現系またはこれらの部分を組み込むために遺伝子的に操作できる。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入は、多数の標準的実験マニュアル、例えば「分子生物学における基本的方法」（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６））および「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）） に記載された方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスヴェクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、ミクロ注入、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（Ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または感染により行うことができる。
【００４８】
適当な宿主の代表的な例は、細菌細胞、例えば連鎖球菌属、ブドウ状球菌、大腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボウズ・メラノーマ（Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞、および植物細胞を含む。
【００４９】
広範な各種の発現系が使用できる。このような系は、なかでも、染色体、エピソームおよびウイルス誘導系、例えば細菌プラスミドから、バクテリオファージから、トランスポソンから、酵母エピソームから、挿入因子から、酵母染色体因子から、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、およびこれらの組み合わせから誘導されたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子、例えばコスミドおよびファジェミドから誘導されたものを含む。発現系は、発現を調節ならびに発生する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中にポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するために適するあらゆる系またはベクターを使用してもよい。適当なヌクレオチド配列は、各種の周知で慣用の技術、例えば「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、上記）に記載のもののいずれを用いてでも発現系内に挿入してもよい。
【００５０】
小胞体の内腔内へ、細胞周辺腔内へまたは細胞外環境内への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド内に組み込んでもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに内在性であってもよくまたは非相同性シグナル、例えば異なる種から誘導されたものであってもよい。
【００５１】
スクリーニングアッセイで使用するためにＩＧＳ３ポリペプチドを発現すべき場合に、一般にポリペプチドが細胞の表面で産生されることが好ましい。このイベントにおいて、細胞をスクリーニングアッセイに使用する前に採取してもよい。ＩＧＳ３ポリペプチドのアフィニティーまたは機能的活性が受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ）により変性される場合に、細胞表面における関係するＲＡＭＰの同時発現が好ましいと考えられ、しばしば要求される。このイベントの場合にも、ＩＧＳ３ポリペプチドおよび関係するＲＡＭＰを発現する細胞の採取がスクリーニングアッセイ使用の前に要求される。ＩＧＳ３ポリペプチドが培地内に分泌される場合には、培地は、ポリペプチドを回収および精製するために回収できる。細胞内で産生される場合には、ポリペプチドを回収する前に細胞を先ず溶解しなければならない。ＩＧＳ３ポリペプチドを発現する膜は、当該技術分野の熟練者に周知の方法により回収できる。一般にこのような方法は、ＩＧＳ３ポリペプチドを発現する細胞の採取および例えば限定はされないがポッタリング（ｐｏｔｔｅｒｉｎｇ） のような方法により細胞をホモジナイズすることを含む。膜は懸濁液を一回または数回洗浄して回収してもよい。
【００５２】
ＩＧＳ３ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回収および精製できる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。タンパク質をリフォールディングするための周知の技術は、ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性される場合に活性コンホメーションを再生するために使用してもよい。
診断アッセイ
本発明は、診断試薬としての使用のためのＩＧＳ３ポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全と関連するＩＧＳ３遺伝子の変異形の検出は、ＩＧＳ３の過少発現、過剰発現または改変された発現からもたらされる疾患または疾患への罹病性の診断に追加またはこれを決定することができる診断手段を提供する。このイベントにおいても、関連する受容体活性調節タンパク質の同時発現は、所望の品質の診断アッセイを得るために要求できる。ＩＧＳ３遺伝子内に変異を有する個体を、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出してもよい。
【００５３】
診断のための核酸は、患者の細胞から、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検物質から得てもよい。ゲノムＤＮＡは検出のために直接使用してもよくまたは分析の前にＰＣＲまたはその他の増幅技術を使用して酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様の方法で使用してもよい。欠失および挿入は、正常の遺伝子型と比較して増幅産物の大きさの変化により検出できる。点変異は、増幅したＤＮＡを標識ＩＧＳ３ヌクレオチド配列にハイブリダイズして同定できる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼ消化によりまたは融解温度の相違によりミスマッチ二本鎖から区別できる。ＤＮＡ配列の相違は、変性剤を加えまたは加えないゲル内のＤＮＡ断片の電気泳動の移動性の改変により、または直接のＤＮＡ配列決定により検出してもよい。例えばＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） ２３０：１２４２ 参照。特定の位置における配列変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学切断法により解明してもよい。Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８５） ８５： ４３９７−４４０１参照。別の態様では、ＩＧＳ３ヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを例えば遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うために構築することができる。アレイ技術の方法は周知であり、そして一般的な用途を有しそして遺伝子発現、遺伝子連結、および遺伝子変化を含む分子遺伝学における各種の問題を解明するために使用できる（例えばＭ． Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ ２７４， ｐｐ６１０−６１３（１９９６） 参照）。
【００５４】
診断アッセイは、記載の方法によるＩＧＳ３遺伝子内の変異の検出を通じて、なかでも上記の「疾患」の診断または罹患性決定のための方法を提供する。
【００５５】
さらに、なかでも上記の「疾患」は、患者より誘導された試料からＩＧＳ３ポリペプチドまたはＩＧＳ３ ｍＲＮＡの異常な低下または増加したレベルを決定することを含んでなる方法により診断できる。
【００５６】
低下または上昇した発現は、ポリヌクレオチドの定量のために当該技術分野で周知の方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定できる。宿主から誘導された試料中のタンパク質、例えばＩＧＳ３のレベルを決定するために使用できるアッセイ技術は、当該技術分野の熟練者には周知である。このようなアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競合−結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００５７】
別の態様では、本発明はなかでも上記の「疾患」または「疾患」の一つへの罹病性のための診断キットに関する。
キットは、
（ａ）ＩＧＳ３ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列、またはその断片、および／または
（ｂ）（ａ）のものに対して相補的なヌクレオチド配列、および／または
（ｃ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、またはその断片、および／または
（ｄ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチドに対する抗体、および／または
（ｅ）ＩＧＳ３ポリペプチドの関連する生物学的または抗原的性質のために必要なＲＡＭＰポリペプチド
を含んでなってもよい。
【００５８】
このようないずれもキットでも、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）は本質的な成分を含んでなってもよいことが認められる。
染色体アッセイ
本発明のヌクレオチド配列は、染色体同定のためにも価値がある。配列は、個別のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的設定されそしてこれとハイブリダイズできる。本発明による染色体の関連配列の地図作製は、これらの配列を遺伝子関連疾患と相関させるために重要な第一段階である。配列が正確に染色体位置に場所決定された場合に、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝子地図データと相関できる。このようなデータは、例えばＶ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能）内に見いだされる。次いで、同じ染色体領域に場所決定された遺伝子と疾患との関係は、連鎖分析により同定される（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）。
【００５９】
影響および非影響個体の間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違も決定できる。変異が影響を受けた個体の一部またはすべてに観察されるがしかしいずれの正常個体内にも観察されない場合には、変異は疾患の原因因子であろう。
抗体
本発明のポリペプチドもしくはこれらの断片もしくはこれらの類似体、または関連ＲＡＭＰと一緒に要求される場合にこれらを発現する細胞は、ＩＧＳ３ポリペプチドに対して免疫特異性に抗体を産生する免疫原として使用してもよい。用語「免疫特異性」は、抗体が、従来技術の他の関連ポリペプチドへのこれらのアフィニティーよりも本質的に大きい本発明のポリペプチドへのアフィニティーを有することを意味する。
【００６０】
ＩＧＳ３ポリペプチドに対して生成した抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ−保持断片、類似体または細胞を動物、好ましくはヒト以外に慣用のプロトコールを用いて投与して得てもよい。モノクローナル抗体の作製のために、連続細胞株培養により産生される抗体を供給するあらゆる技術を使用してもよい。その例は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７５） ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ （１９８３） ４：７２） およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， ｐｐ７７−９６， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８５）を含む。
【００６１】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定するためまたはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために使用してもよい。
【００６２】
ＩＧＳ３ポリペプチド自体に対する抗体、またはＩＧＳ３ポリペプチド−ＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、なかでも上記の「疾患」を治療するために使用してもよい。
動物
本発明の別の態様は、ＩＧＳ３の異常な発現または活性から起きる障害のためのモデルとして挙動するヒト以外の動物に基づく系に関する。ヒト以外の動物に基づくモデル系は、ＩＧＳ３遺伝子の活性をさらに特徴付けるために使用してもよい。このような系は、ＩＧＳ３に基づく疾患、例えばなかでも上記の「疾患」を治療できる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分として使用してもよい。
【００６３】
この方法で、動物に基づくモデルは、ＩＧＳ３の異常な発現または活性の障害の治療において有効であるような薬剤化合物、治療および介入を同定するために使用してもよい。さらにこのような動物モデルは、動物患者内のＬＤ_５０およびＥＤ_５０を決定するために使用してもよい。これらのデータは、潜在的ＩＧＳ３障害治療の生体内効力を決定するために使用してもよい。
【００６４】
異常なＩＧＳ３発現また活性に基づくＩＧＳ３に基づく障害の動物に基づくモデル系は、非−組換え動物ならびに組換え操作トランスジェニック動物の両方を含んでもよい。
【００６５】
ＩＧＳ３障害のための動物モデルは、例えば遺伝子モデルを含んでもよい。ＩＧＳ３に基づく障害類似症候群を示す動物モデルは、例えばＩＧＳ３配列、例えば上記のもののような配列を、当該技術分野の熟練者に周知のトランスジェニック動物作製のための技術と組み合わせて使用して操作してもよい。例えば、ＩＧＳ３配列は、関係する動物のゲノム内に導入、そして過剰発現および／または非発現であってもよく、または内在性ＩＧＳ３配列が存在する場合には、これらを過剰発現、非発現のいずれでもよく、または、その代わりに、ＩＧＳ３遺伝子発現を過少発現または不活性化するために破壊してもよい。
【００６６】
ＩＧＳ３遺伝子配列を過剰発現または非発現とするために、ＩＧＳ３遺伝子配列のコーディング部分は、高レベル遺伝子発現または関係する動物種内で遺伝子が正常では発現されない細胞種内での発現を駆動することが可能な調節配列に連結されてもよい。このような調節領域は、当該技術分野の熟練者には周知であり、そして不当に多くの実験を行わないで使用してもよい。
【００６７】
内在性ＩＧＳ３遺伝子配列の過少発現のために、このような配列を単離および操作して、関係する動物のゲノム内に再導入された場合に、内在性ＩＧＳ３遺伝子対立遺伝子が不活性化、すなわち「ノックアウト」されてもよい。好ましくは、操作されたＩＧＳ３遺伝子配列は、遺伝子標的法を介して、例えば動物ゲノム内へ操作されたＩＧＳ３遺伝子配列の組込みの際に内在性ＩＧＳ３配列が破壊されるように導入される。
【００６８】
マウス、ラット、ラビット、リス、モルモット、ブタ、小型ブタ、ヤギ、およびヒト以外の霊長類、例えばヒヒ、サル、および類人猿を含むが、これに限定はされないあらゆる種の動物を、ＩＧＳ３関連障害の動物モデルを作製するために使用してもよい。
【００６９】
当該技術分野で公知のあらゆる技術は、ＩＧＳ３導入遺伝子を動物内に導入してトランスジェニック動物の創始株を作製するために使用してもよい。このような技術は、前核ミクロ注入（Ｈｏｐｐｅ， Ｐ．Ｃ． ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｔ．Ｅ． １９８９， 米国特許（ＵＳ）第４，８７３，１９１ 号）；レトロウイルス媒介の生殖細胞系内への遺伝子導入（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２， １９８５）； 胚幹細胞内での遺伝子標的法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１， １９８９）； 胚の電気穿孔（Ｌｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：１８０３−１８１４， １９８３）； および精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３， １９８９） 等を含み、これらに限定はされない。このような技術の概説は、Ｇｏｒｄｏｎ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５：１７１−２２９， １９８９ に記載されている。
【００７０】
本発明は、すべてのこれらの細胞内にＩＧＳ３導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、ならびに一部であるがすべてではない細胞内に導入遺伝子を有する動物、すなわちモザイク動物を提供する （例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｚ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ４： ７６１−７６３， １９９４に記載の技術参照） 。導入遺伝子は、単独の導入遺伝子として、またはコンカテマー、例えば頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム内に組み込まれてもよい。導入遺伝子は、例えばラスコらの教示（Ｌａｓｋｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６， １９９２） に従って、特定の細胞種内に選択的に導入、そして活性化されてもよい。
【００７１】
このような細胞タイプ特異性活性化のために必要な調節配列は、関係する特定の細胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者には明らかである。
【００７２】
ＩＧＳ３導入遺伝子を内在性ＩＧＳ３遺伝子の染色体部位内に組み込むことを望む場合には、遺伝子標的法が好ましい。要約すると、この技術を用いる場合には、関係する内在性ＩＧＳ３遺伝子に相同なあるヌクレオチド配列（例えばマウスＩＧＳ３遺伝子のヌクレオチド配列）を含むベクターを、染色体配列との相同組換えを介して、内在性ＩＧＳ３遺伝子または遺伝子対立遺伝子のヌクレオチド配列内に組込み、そしてその機能を破壊する目的で設計する。導入遺伝子は、特定の細胞タイプ内に選択的に導入されてもよく、これによりその細胞タイプ内でのみ関係する内在性遺伝子を不活性化し、これは例えばグらの教示に従う（Ｇｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６， １９９６）。このような細胞タイプ特異性不活性化のために必要な調節配列は、関係する特定の細胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者には明らかであろう。
【００７３】
トランスジェニック動物が作製されると、組換えＩＧＳ３遺伝子およびタンパク質の発現を標準技術を用いてアッセイしてもよい。最初のスクリーニングは、導入遺伝子の組込みが起きたかどうかをアッセイするために動物組織を分析するために、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術により行ってもよい。トランスジェニック動物の組織内のＩＧＳ３導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルは、動物から得た組織試料のノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション技術，およびＲＴ−ＰＣＲを含むがこれに限定はされない技術を用いて評価してもよい。標的遺伝子−発現組織の試料を、関係する標的遺伝子導入遺伝子産物に対して特異性の抗体特異性を用いて免疫細胞化学的に評価してもよい。容易に検出できるレベルでＩＧＳ３遺伝子ｍＲＮＡまたはＩＧＳ３導入遺伝子ペプチドを発現するＩＧＳ３トランスジェニック動物（標的遺伝子産物エピトープに対する抗体を用いて免疫細胞化学的に検出）を、次いでさらに、特徴的なＩＧＳ３に基づく障害症候群を示すこれらの動物を同定するために続いて評価してもよい。
【００７４】
ＩＧＳ３トランスジェニック創始動物（すなわち、関係する細胞または組織内にＩＧＳ３タンパク質を発現し、そしてこれは好ましくは、ＩＧＳ３に基づく障害の症候群を示す動物）が作製されると、特定の動物のコロニーを作製するためにこれらを育種、同系交配、異系交配、または交雑交配してもよい。このような育種戦略の例は、分離した株を確立するために１種を越える組込み部位を有する創始動物の異系交配、それぞれのＩＧＳ３導入遺伝子の付加発現の効果のために高いレベルで関係するＩＧＳ３導入遺伝子を発現する複合ＩＧＳ３トランスジェニックを産生するための分離した株の同系交配、増加した発現およびＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの考えられる必要性を除くために、与えられた組込み部位に対して同型接合の動物を作製するための異型接合トランスジェニック動物の交雑、複合異型接合または同型接合株を作製するための別々の同型接合株の交雑、ＩＧＳ３導入遺伝子の発現およびＩＧＳ３様症候群の発生に対する対立遺伝子変性の効果を検討するための種々の同系交配遺伝子背景への動物の育種を含むがこれらの限定はされない。このような方法の一つは、ＩＧＳ３関連障害様症候群、例えば上記のものを示すＦ１世代を作製するために、ＩＧＳ３トランスジェニック創始動物と野生型株との交雑である。次いで、異型接合標的遺伝子トランスジェニック動物が生育可能である場合に、異型接合株を発生させるためにＦ１世代を同型交配してもよい。
ワクチン
本発明の別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に関し、これは、哺乳類にＩＧＳ３ポリペプチドまたはその断片を、所要の場合には抗体および／またはＴ細胞免疫反応を発生するために適するＲＡＭＰポリペプチドと一緒に投与（例えば接種）して、なかでも上記の「疾患」から該動物を保護することを含んでなる。
【００７５】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に関し、これは該動物を疾患から保護するための抗体を産生する免疫学的反応を誘導するために、ＩＧＳ３ポリペプチドを生体内でのＩＧＳ３ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して供給することを含んでなる。
【００７６】
本発明の別の態様は、哺乳類宿主内に導入された場合に、ＩＧＳ３ポリペプチドに対する哺乳類内の免疫学的反応を誘導する免疫学的／ワクチン調剤（組成物）に関し、ここでその組成物はＩＧＳ３ポリペプチドまたはＩＧＳ３遺伝子を含んでなる。このような免疫学的／ワクチン調剤（組成物）は、治療用の免疫学的／ワクチン調剤または予防用の免疫学的／ワクチン調剤のいずれかであってもよい。ワクチン調剤は、さらに適当なキャリヤーを含んでなってもよい。ＩＧＳ３ポリペプチドは胃内で分解されることがあるので、これは好ましくは非経口的に投与される（皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む）。非経口投与のために適する調剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調剤をレシピエントの血液と等張性とするための溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射液剤、および懸濁剤または増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含む。調剤は、単位投与または複数投与容器、例えば封をしたアンプルおよびバイアル内に存在してもよく、そして使用の直前に滅菌液体キャリヤーを加えるだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵してもよい。ワクチン調剤は、調剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油系およびその他の当該技術分野では公知の系を含んでもよい。用量はワクチンの活性に依存しそして日常的な試験により容易に決定できる。
スクリーニングアッセイ
本発明のＩＧＳ３ポリペプチドは、受容体を結合しそして本発明の受容体ポリペプチドを活性化（アゴニスト）または活性化を阻害（アンタゴニスト）する化合物のためのスクリーニングプロセス中に使用してもよい。従って、本発明のポリペプチドは、小分子基質および例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学ライブラリー、および天然産物混合物内のリガンドの結合を評価するために使用してもよい。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドであってもまたは構造的または機能的疑似体であってもよい。
【００７７】
ＩＧＳ３ポリペプチドは、病理学を含む生物学的機能の原因となる。従って、一方ではＩＧＳ３を刺激し、そして他方ではＩＧＳ３の機能を阻害できる化合物および薬剤を発見することが望ましい。一般に、アゴニストは、なかでも上記の「疾患」のような病状のための治療および予防の目的に使用される。
【００７８】
アンタゴニストは、なかでも上記の「疾患」のような病状のための種々の治療および予防の目的に使用してもよい。
【００７９】
一般に、このようなスクリーニング手順は、本発明の受容体ポリペプチドをその表面に発現しそして、必須の場合にはその表面にＲＡＭＰの同時発現をするために適する細胞の産生を含む。このような細胞は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞を含む。次いで、受容体を発現する細胞（または発現された受容体を含む細胞膜）を試験化合物と接触させ、結合、または機能性反応の刺激もしくは阻害を観察する。
【００８０】
一つのスクリーニング技術は、受容体活性化により起きる細胞外ｐＨ、細胞内ｐＨ、または細胞内カルシウム変化を測定する系内での本発明の受容体を発現する細胞（例えばトランスフェクションされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。この技術において、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させてもよい。第二メッセンジャー反応、例えばシグナル伝達、ｐＨ変化、またはカルシウムレベルの変化を次いで測定して、潜在的化合物が受容体を活性化または阻害するかどうかを決定する。
【００８１】
別の方法は、受容体−媒介シグナル、例えばｃＡＭＰ蓄積および／またはアデニル酸シクラーゼ活性の調節を決定することによる受容体阻害剤に関するスクリーニングを含む。このような方法は、真核細胞を本発明の受容体を用いてトランスフェクションして細胞表面上に受容体を発現させることを含む。次いで、細胞を潜在的アンタゴニストの存在下で本発明の受容体に対するアゴニストに暴露する。潜在的アンタゴニストが受容体を結合しこれにより受容体結合を阻害する場合には、アゴニスト媒介シグナルが調節されるであろう。
【００８２】
本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出する別の方法は、米国特許（ＵＳ）第５，４８２，８３５号に記載の酵母に基づく技術である。
【００８３】
アッセイは、単なる候補化合物の試験結合でもよく、ここで受容体を有する細胞への接着は、候補化合物と直接または間接に結合した標識によるか、または標識競合物との競合を含むアッセイにより検出される。さらに、これらのアッセイは、候補化合物が受容体の活性化により発生するシグナルをもたらすかどうかを試験してもよく、これにはその表面に受容体を有する細胞に適する検出系を用いる。活性化の阻害剤は、一般に、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する効果を観察される。
【００８４】
さらに、アッセイは、混合物を形成するためにＩＧＳ３ポリペプチドを含む溶液と候補化合物とを混合し、混合物中のＩＧＳ３活性を測定し、そして混合物のＩＧＳ３活性を標準と比較する段階を単に含んでなってもよい。
【００８５】
ＩＧＳ３　ｃＤＮＡ、タンパク質およびタンパク質に対する抗体は、細胞内のＩＧＳ３　ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加した化合物の効果を検出するためのアッセイを構成するために使用してもよい。例えば、ＥＬＩＳＡは、当該技術分野に公知の標準方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてＩＧＳ３タンパク質の分泌または細胞関連レベルを測定するために構築されてもよく、そしてこれは適当に操作された細胞または組織からのＩＧＳ３の産生を阻害または促進するであろう薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために使用できる。スクリーニングアッセイを行うための標準方法は、当該技術分野では周知である。
【００８６】
潜在的ＩＧＳ３アンタゴニストの例は、抗体または、ある場合にはＩＧＳ３のリガンド、例えばリガンドの断片に密接に関係したオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、または受容体に結合するが反応は行わないで、受容体の活性を阻止する小分子を含む。
【００８７】
従って、別の態様では、本発明は、
（ａ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のもの、
（ｂ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものを発現する組換え細胞、
（ｃ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものを発現する細胞膜、または
（ｄ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものに対する抗体
を含んでなる、ＩＧＳ３ポリペプチドに対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはＩＧＳ３ポリペプチドの産生を低下、増加および／または促進する化合物を同定するためのスクリーニングキットに関する。
【００８８】
あらゆるこのようなキット内に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は本質的な成分を含んでなってもよいことが認められる。
予防および治療方法
本発明は、ＩＧＳ３活性の過剰および／または不十分な量の両方に関連する異常な状態を治療するための方法を提供する。
【００８９】
ＩＧＳ３の活性が過剰な場合には、数種の方法が利用できる。一つの方法は、以上に記載した阻害化合物（アンタゴニスト）を、薬剤的に許容できるキャリヤーと一緒に、ＩＧＳ３へのリガンドの結合を遮断することにより、またはＲＡＭＰポリペプチドまたは第二シグナルとの相互作用を阻害することにより活性化を阻害し、これにより異状状態を緩和するために有効な量を患者の投与することを含んでなる。
【００９０】
他の方法では、内在性ＩＧＳ３と競合してリガンドをまだ結合できるＩＧＳ３ポリペプチドの可溶性の形を投与してもよい。このような競合物の典型的な態様は、ＩＧＳ３ポリペプチドの断片を含んでなる。
【００９１】
さらに別の方法では、内在性ＩＧＳ３をコードする遺伝子の発現は、発現遮断技術を用いて阻害できる。既知のこのような技術は、内部産生または別途に投与されるアンチセンス配列の使用を含む。例えばＯ’Ｃｏｎｎｅｒ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． （１９９１） ５６：５６０ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ ＵＳＡ （１９８８）参照。あるいは、遺伝子と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給できる。例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９７９） ６：３０７３； Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８） ２４１：４５６； Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５１： １３６０参照。これらのオリゴマーは、それ自体を投与できるかまたは関連するオリゴマーを生体内で発現できる。合成したアンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基または修飾された骨格を含んでなってもよい。後者の例は、メチルホスホナート、ホスホロチオアートまたはペプチド核酸骨格を含む。このような骨格は、ヌクレアーゼによる分解からの保護を与えるためにアンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチド内に組み込まれ、これは当該技術分野には周知である。これらまたはその他の修飾された骨格を用いる合成されたアンチセンスおよび三重らせん分子は、本発明の一部を形成する。
【００９２】
さらに、ＩＧＳ３ポリペプチドの発現は、ＩＧＳ３ ｍＲＮＡ配列に特異性のリボザイムを用いて回避してもよい。リボザイムは、天然または合成であることができる触媒活性ＲＮＡである（例えばＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． （１９９６） ６（４）， ５２７−３３ 参照）。合成リボザイムは、選択された位置で特異的にＩＧＳ３ ｍＲＮＡを開裂し、これによりＩＧＳ３ ｍＲＮＡの機能性ポリペプチド内への翻訳を避けるように設計できる。リボザイムは天然リン酸リボース骨格および天然塩基、例えばＲＮＡ分子中に通常見いだされるものを用いて合成してもよい。あるいは、リボヌクレアーゼ分解からの保護を与えるように、リボザイムは非天然骨格、例えば２’−Ｏ−メチル ＲＮＡを用いて合成してもよくそして修飾塩基を含んでもよい。
【００９３】
ＩＧＳ３およびその活性の低い発現に関連する異常な状態を治療するために、種々の方法も利用できる。一つの方法は、ＩＧＳ３を活性化する化合物、すなわち上記のようなアゴニストの治療的に有効な量を薬剤的に許容できるキャリヤーと一緒に患者に投与して、これにより異常な状態を緩和することを含んでなる。あるいは、患者内の関連細胞によるＩＧＳ３の内在的産生を行うために遺伝子治療を利用してもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記に考察した複製欠失レトロウイルスベクター内の発現に関して操作してもよい。次いでレトロウイルス発現構築物を単離して、そして本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージング細胞内に導入してもよく、これによりパッケージング細胞は関係する遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生体細胞は、生体内における細胞の操作および生体内におけるポリペプチドの発現のために患者に投与してもよい。遺伝子治療の概説については、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｓｔｒａｃｈａｎ Ｔ．ａｎｄ Ｒｅａｄ Ａ．Ｐ．， ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｌｔｄ（１９８６） 中の第２０章「遺伝子治療およびその他の分子遺伝子に基づく治療方法」（Ｃｈａｐｔｅｒ ２０， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ） およびその中の引用文献を参照のこと。
【００９４】
上記のあらゆる治療方法は、例えば哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラビット、サル、および最も好ましくはヒトを含む、このような治療が必要なあらゆる患者に適用してもよい。
調剤および投与
ペプチド、例えばＩＧＳ３ポリペプチドの可溶性形、およびアゴニストおよびアンタゴニストペプチドまたは小分子は、適当な薬剤キャリヤーと組み合わせて調剤してもよい。このような調剤は、治療的に有効な量のポリペプチドまたは化合物、および薬剤的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含んでなる。調剤は投与の形態に適合しなければならず、そして当該技術分野の熟練者の範囲内に十分に入る。本発明は、さらに、本発明の上記の組成物の１種またはそれ以上の成分を充填した１個またはそれ以上の容器を含んでなる薬剤包装物およびキットにも関する。
【００９５】
本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独または他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
【００９６】
薬剤組成物の全身投与の好ましい形は、注射、典型的には静脈内注射を含む。他の注射経路、例えば皮下、筋肉内、または腹腔内が使用できる。全身投与の別の手段は、浸透剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸またはその他の界面活性剤を用いる粘膜経由または経皮投与を含む。さらに、経口およびカプセル化調剤に適当に調剤された場合には、経口投与も可能であろう。
【００９７】
所要の投与範囲は、ペプチドまたは化合物の選択、投与の経路、調剤の性質、患者の病状の性質、および担当医師の判断に依存する。適当な用量は、０．１〜１００μｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲内である。しかし、種々の使用化合物および投与の種々の経路の異なる効率を考慮して、所要用量の広範な変化も予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い用量を必要とすると予想される。これらの用量レベルの変化は、最適化のための標準的な経験慣行を用いて調整でき、これは当該技術分野では良く理解されている。
【００９８】
治療に使用されるペプチドは、上記のようにしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる治療モダリティーにおいて、患者内に内在的に生成させることもできる。従って、例えば、患者からの細胞は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを用いて生体外で、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いてポリペプチドをコードするように操作してもよい。次いで細胞を患者内に導入する。
【００９９】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することのみを意図するものであり、従ってこれらの実施例は本発明をいかなる意味でも制限するとはみなされない。
【０１００】
【実施例】
実施例１．新規のＧ−タンパク質共役型受容体をコードするゲノムＤＮＡのクローニング
実施例１ａ．新規のＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードするゲノム断片の相同性ＰＣＲクローニング
ＰＣＲに基づく相同性クローニング戦略を、新規のＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードする部分ゲノムＤＮＡ配列を単離するために使用した。前進（Ｆ２０）および後退（Ｒ４２、Ｒ４３）縮重ＰＣＲプライマーを、ニューロテンシン受容体遺伝子ファミリー（Ｖｉｔａ Ｎ． ｅｔ ａｌ． ［１９９３］ Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ． ３１７， １３９−１４２；Ｖｉｔａ Ｎ． ｅｔ ａｌ． ［１９９８］ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３６０， ２６５−２７２） の保存領域内で、細胞内ループ１（Ｉ１）と膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）との境界および膜貫通ドメイン３と細胞内ループ２の間の境界（ＴＭ３／Ｉ２）においてそれぞれ設計した。
Ｆ２０（Ｉ１／ＴＭ２）：
５’−ＣＴＧＣＡＣＴＡＣＣＡＣＧＴＧＣＴＣ（ＡまたはＴ）（ＧまたはＣ）（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）（ＣまたはＴ）Ｔ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）ＧＣ−３’
（配列番号３）
Ｒ４２（ＴＭ３／Ｉ２）：
５’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡ（ＡまたはＧ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）Ａ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）Ｃ（ＧまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＴＣ（Ｃまたはイノシン）（Ｃ，ＧまたはＴ） （配列番号４）
Ｒ４３（ＴＭ３／Ｉ２）：
５’−ＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＧ（ＡまたはＧ）ＴＣ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）（ＡまたはＧ）Ｃ（ＡまたはＧ）ＣＴ（Ａ，ＧまたはＴ）−３’ （配列番号５）
ニューロテンシン受容体ファミリーの既知のメンバーの増幅を抑制するために、プライマーＲ４２およびＲ４３の３’最終ヌクレオチド位置を、ヒトＮＴＲ１ ｃＤＮＡの相当する位置（Ｒ４２）またはＮＴＲ１およびＮＴＲ２ ｃＤＮＡの両方の相当する位置（Ｒ４３）にいずれかに相補的とならないように選択した。
【０１０１】
一次ＰＣＲ反応は、体積６０μｌ中で行いそして１００ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、６μｌジーンアンプ^ＴＭ（ＧｅｎｅＡｍｐ）１０ｘＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３；５００ｍＭ ＫＣｌ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、３．６μｌ ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．３６μｌ ｄＮＴＰ類（それぞれのｄＮＴＰの２５ｍＭ）、１．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑ−Ｇｏｌｄ^ＴＭポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）および縮重前進（Ｆ２０）および後退プライマー（Ｒ４２）それぞれ３０ピコモルを含んでいた。反応管を９５℃で１０分間加熱し、次いで変性（９５℃、１分間）、アニーリング（５５℃、２分間）および伸展（７２℃、３分間）の３５サイクルを行った。最後に反応管を１０分間、７２℃で加熱した。
【０１０２】
半−ネスト（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ） ＰＣＲ反応のために、一次ＰＣＲ反応物の１／５０希釈物の１μｌを、それぞれ縮重前進および後退プライマーＦ２０およびＲ４３を用いる鋳型として用いた。半−ネストＰＣＲ反応は、一次ＰＣＲ反応と同じ条件下で行った。
【０１０３】
半−ネストＰＣＲ反応産物をアガロースゲル上でサイズ分別し、そして臭化エチジウムを用いて染色した。±２２０ｂｐの断片が同定され、これをＱｉａｅｘ−ＩＩ^ＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから精製しそして供給者（ｐＧＥＭ−Ｔ キット、Ｐｒｏｍｅｇａ）の推奨する方法に従ってｐＧＥＭ−Ｔプラスミド中に連結した。このようにして作製した組換えプラスミドを適合する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＳＵＲＥ^ＴＭ２細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。形質転換した細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢアガープレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ ２０ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて個別コロニーのミニ培養物から精製した。ＤＮＡ配列決定反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭＢｉｇＤｙｅ^ＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ キット（ＰＥ−ＡＢＩ）を用い、挿入−近接を用いて精製したプラスミドＤＮＡ上で行った。配列決定反応産物をＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈降を用いて精製し、そしてＡＢＩ３７７自動化配列決定装置で分析した。
【０１０４】
公開ドメイン配列データバンク（Ｂｌａｓｔｎ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． ［１９９７］， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）に対するクローンＨＮＴ１３７０の挿入配列のコンピューター支援相同性サーチは、これがＧＰＣＲファミリーの新規のメンバー（の一部分）をコードすることの強い徴候を明らかにした。ＨＮＴ１３７０は±２２０ｂｐ断片からクローニングされたけれども、クローン人工操作の結果挿入サイズは±１３０ｂｐに過ぎなかった。我々はこの新規のＧＰＣＲをＩＧＳ３と呼ぶ。
【０１０５】
【表３】

【０１０６】
実施例１ｂ．　完全ＩＧＳ３コーディング配列を含むゲノムＤＮＡ断片のクローニング
ＩＧＳ３の完全コーディング配列は、ヒトゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを介して得た。ラムダＥＭＢＬ３　ＳＰ６／Ｔ７ファージベクター中で構築されたヒトゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃ＨＬ１０６７）を、ＩＧＳ３特異性プローブを用いるハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。このプローブは、ＨＮＴ１３５５プラスミド（これはＨＮＴ１３７０と同じ挿入物を含んでいた）からＩＧＳ３特異性プライマーＩＰ１１９６９（配列番号６）およびＩＰ１２００８（配列番号７）を用いて増幅した１３０ｂｐＰＣＲ断片から誘導した（図１）。１３０ｂｐ断片をゲルからＱｉａｅｘ ＩＩ^ＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして〔α−^３２Ｐ〕ｄＣＴＰのランダムプライム組込み（Ｒａｎｄｏｎ ｐｒｉｍｄｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を介して、比放射能＞１０^９ｃｐｍ／μｇまで、プライムイット（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ）ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、供給者から提供された指針に従って放射能標識した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈのラムダライブラリー・ユーザーマニュアル（ＰＴ１０１０−１）に従って、１３０ｂｐプローブを用いて約５５０，０００個のプラークがスクリーニングされた。３個の陽性クローン（λ−ＩＧＳ３．１、λ−ＩＧＳ３．３およびλ−ＩＧＳ３．５）がプラーク精製されそしてマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ［１９８９］， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））による記載のようにして小規模液体培養物から組換えファージＤＮＡが作製された。
【０１０７】
ＩＧＳ３特異性プライマーを用いる組換えファージＤＮＡの配列分析は、３個すべてのラムダクローンの挿入物が，３３０アミノ酸の新規の推定（イントロンを含まない）ＧＰＣＲをコードする長いオープンリーディングフレームを含んでいた（翻訳の前提とする開始にはインフレーム終止コドンが前置された）。ＩＧＳ３コーディング配列をＰＣＲ増幅の後にプラスミドベクター内にサブクローンした。ＰＣＲ反応は、エクスパンド^ＴＭ（Ｅｘｐａｎｄ）ハイフィデリティーＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いてＩＰ１２９３６（配列番号８）およびＩＰ１２９３７（配列番号９）オリゴヌクレオチドプライマーを用い、単離されたλ−ＩＧＳ３．１、λ−ＩＧＳ３．３およびλ−ＩＧＳ３．５ファージＤＮＡ（５００ｎｇ）上で行った。ＰＣＲ反応管を９５℃に２分間加熱し、次いで変性（９５℃、３０秒間）、アニーリング（５８℃、３０秒間）および伸展（７２℃、１分間）の３５サイクルを行った。最後に最終伸展工程を１０分間、７２℃で行った。±１，２００ＢＰ ＰＣＲ産物をゲルから精製しそしてｐＧＥＭ−Ｔベクター内に連結した。次いで組換えＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５αＦ’を形質転換するために使用した。これから細菌クローンＨＢ４９７１、ＨＢ４９７２（両方共にλ−ＩＧＳ３．１からサブクローンされたもの）、ＨＢ４９７３およびＨＢ４９７４（両方共にλ−ＩＧＳ３．３からサブクローンされたもの）およびＨＢ４９７５およびＨＢ４９７６（両方共にλ−ＩＧＳ３．５からサブクローンされたもの）が得られた。すべてのプラスミドクローンの挿入物を完全に配列決定した。すべての配列データを混成（ｍｅｌｄ）させると、共通配列が生まれ、これは推定新規ＧＰＣＲ受容体（ＩＧＳ３）をコードする３３０アミノ酸の長いオープンリーディングフレームの存在を確認した（図１）。ＩＧＳ３の共通ｃＤＮＡおよびタンパク質配列をそれぞれＩＧＳ３ＤＮＡ（配列番号１）およびＩＧＳ３ＰＲＯＴ（配列番号２）として本明細書に記載する。ＩＧＳ３ＤＮＡ配列を用いるＤＮＡデータバンクの相同性サーチは、１個のＥＳＴ配列（受入（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ） 番号ＡＦ００３８２８号）を示し、これは３’末端でＩＧＳ３ＤＮＡと部分的に重複する（図１）。
【０１０８】
プラスミドＨＮＴ４９７１（ＩＧＳ３ＤＮＡ配列を含む）を内包する細菌株を、１００μｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢアガープレート上に再プレーティングした後に再クローニングしそしてインノゲネティクス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｎ．Ｖ．株表（ＩＣＣＧ４３１９）および”Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ （ＣＢＳ）”（Ｂａａｒｎ 、オランダ国、受入番号第１０２１９６号）の両方に寄託した。プラスミドＤＮＡは、再クローニングした単離物から調製しそして挿入物を配列決定しそしてＩＧＳ３ＤＮＡ配列と同一であることを見いだした。
【０１０９】
【表４】

【０１１０】
【表５】

【０１１１】
【表６】

【０１１２】
【表７】

【図面の簡単な説明】
【図１】
共通ＩＧＳ３　ｃＤＮＡ配列を生成するために単離された種々のＤＮＡクローンの相対位置の図示。ＨＮＴ１３７０は、「創始（ｆｏｕｎｄｉｎｇ）」ゲノムクローンを表す。λ−ＩＧＳ３．１Ａ、Ｂなどは、ラムダクローンＩＧＳ３．１からのＤＮＡの配列分析から得られた別々の（ほとんど）重複した配列コンティグを示す。本文書中に記載したＰＣＲプライマーは、（ＩＰ＃）で示す。ＣＯＮＳＥＮＳＵＳは、すべての得られた配列を混成（ｍｅｒｇｅ） した後に得られたコンティグを示す。少なくとも３個の独立したクローンの配列分析により完全に確認されたＣＯＮＳＥＮＳＵＳコンティグの部分は、ＩＧＳ３ＤＮＡにより表される（配列番号１）。ＩＧＳ３ＤＮＡ中に存在する３３０アミノ酸長さのオープンリーディングフレームは、「＊＊」で示す。ＥＳＴ ＡＦ００３８２８の位置は「＝＝」で示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to newly identified polynucleotides, polypeptides encoded by them and the use of these polynucleotides and polypeptides, and their production. More specifically, the polynucleotides and polypeptides of the present invention relate to G protein-coupled receptors (GPCRs), hereinafter referred to as IGS3. The present invention relates to the inhibition or activation of the action of these polynucleotides and polypeptides, the vectors containing the polynucleotides, the host cells containing these vectors and the overexpression, non-expression, underexpression and / or suppression of the IGS3 gene. It also relates to any transgenic animal (knockout animal). The present invention further relates to a method for screening a compound capable of acting as an agonist or antagonist of the G protein-coupled receptor IGS3.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
It is well documented that many medically important biological processes are mediated by G proteins and / or proteins involved in signal transduction pathways, including second messengers such as cAMP (Lefkowitz, Nature 1991, 1991). 351: 353-354). These proteins are referred to herein as proteins involved in the pathway together with G proteins. Some examples of these proteins are for GPC receptors, such as adrenergic agonists and dopamine (Kobilka, BK et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 1987, 84:46). Kobilka, BK et al., Science, 1987, 238: 650-656; Bunzow, JR, et al., Nature, 1988, 336: 783-787), G protein itself, effector Proteins, such as phospholipase C, adenylate cyclase, and phosphodiesterase, and actuator proteins, such as protein kinase A and protein kinase C (Simon, MI, et al., Science, 1991, 52: 802-8), including the.
[0003]
For example, upon hormonal binding to a GPCR in one form of signaling, the receptor interacts with a heterotrimeric G protein and induces the separation of GDP from a guanine nucleotide-binding site. At normal cellular concentrations of guanine nucleotides, GTP immediately fills the site. Binding of GTP to the α-subunit of the G protein results in separation of the G protein from the receptor and separation of the G protein into the α and βγ subunits. The form with GPT then binds and activates adenylate cyclase. Hydrolysis of GTP to GDP catalyzed by the G protein itself (the α subunit has an intrinsic GTPase activity) returns the G protein to its basal, inactive form. The GTPase activity of the α subunit is essentially an internal clock that controls the on / off switch. The GDP-bound form of the α subunit has a high affinity for βγ and subsequent rebinding of αGDP with βγ returns the system to the ground state. Thus, the G protein has a dual role: as an intermediate that relays the signal from the receptor to the effector (adenylate cyclase in this example) and as a clock that controls the duration of the signal.
[0004]
The membrane-bound superfamily of G protein-coupled receptors has been characterized as having seven putative transmembrane domains. Domains are thought to represent transmembrane alpha helices connected by extracellular or cytoplasmic loops. G protein-coupled receptors include a wide range of biologically active receptors, such as hormones, viruses, growth factors and neuroreceptors.
[0005]
The G protein-coupled receptor family includes dopamine receptors that bind to neuroleptic drugs used to treat CNS disorders. Another example of members of this family are calcitonin, adrenergic agonists, neuropeptide Y, somasstatin, neurotensin, neurokinin, capsaicin, VIP, CGRP, CRF, CCK, bradykinin, galanin, motilin, nociceptin, endothelin, cAMP, Including but not limited to adenosine, muscarinic agonists, acetylcholine, serotonin, histamine, thrombin, kinin, follicle stimulating hormone, opsin, endothelial differentiation gene-1, rhodopsin, odorant, and cytomegalovirus receptor.
[0006]
Most G protein-coupled receptors have a solely conserved cysteine residue in each of the first two extracellular loops that form disulfide bonds, which are believed to stabilize functional protein structure. The seven transmembrane regions are called TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 and TM7. The cytoplasmic loop connecting TM5 and TM6 may be a major component of the G protein binding domain.
[0007]
Most G protein-coupled receptors contain potential phosphorylation sites within the third cytoplasmic loop and / or carboxy terminus. In some G protein-coupled receptors, such as the β-adrenergic receptor, phosphorylation by protein kinase A and / or certain receptor kinases mediates receptor desensitization.
[0008]
Recently, it has been discovered that certain GPCRs, like the calcitonin receptor-like receptor, will interact with a small single pass transmembrane protein called the receptor activity modulatory protein (RAMP). This interaction of GPCRs with certain RAMPs is crucial for the natural ligand to have an associated affinity for the GPCR-RAMP combination and to modulate the functional signaling activity of the complex (McLathier, LM et al., Nature (1998) 393: 333-339).
[0009]
For certain receptors, the ligand binding site of a G protein-coupled receptor comprises a hydrophilic socket formed by several G protein-coupled receptor transmembrane domains, the socket comprising a G protein-coupled receptor. It is thought to be surrounded by the hydrophobic residues of the conjugated receptor. It is believed that the hydrophilic side of each G protein-coupled receptor transmembrane helix faces inward and forms a polar ligand-binding site. TM3 is thought to have a ligand-binding site in several G protein-coupled receptors, for example, a TM3 aspartic acid residue. TM5 serine, TM6 asparagine and TM6 and TM7 phenylalanine or tyrosine are also involved in ligand binding.
[0010]
G protein-coupled receptors can be intracellularly bound to various intracellular enzymes, ion channels and transporters by heterotrimeric G proteins (see Johnson et al., Endoc. Rev., 1989, 10: 317-331). . Various G protein α subunits preferentially stimulate specific effectors to regulate various biological functions in cells. Phosphorylation of cytoplasmic residues of G protein-coupled receptors has been identified as an important mechanism for the regulation of G protein binding of certain G protein-coupled receptors. G protein-coupled receptors have been found at numerous sites within mammalian hosts.
[0011]
Receptors, mainly of the GPCR class, induced more than half of the currently known drugs (Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516). This indicates that these receptors have been established as therapeutic targets and have a proven history. The novel IGS3 GPCRs described in the present invention identify and characterize other receptors that can be useful in diagnosing, preventing, ameliorating or correcting a dysfunction, disorder or disease (hereinafter collectively referred to as "disease") Clearly satisfies the need in the art for a decision. “Disease” includes schizophrenia, intermittent seizure anxiety (EPA) disorders such as obsessive-compulsive disorder (OCD), post-traumatic stress disorder (PTSD), phobia and panic, severe depressive disorder, bipolar disorder, Parkinson's disease , General anxiety disorder, autism, delirium, multiple sclerosis, Alzheimer's disease / dementia and other neurodegenerative diseases, severe mental retardation, movement disorders, Huntington's disease, Tourette's syndrome, tics, tremors, dystonia, convulsions, appetite Anorexia, hyperphagia, stroke, addiction / dependence / craving, sleep disorders, tencan, psychiatric and CNS disorders including migraine, distraction / hyperactivity disorder (ADHD), heart failure, angina, arrhythmias, myocardial infarction, heart Hypertrophy, hypotension, hypertension-e.g. essential hypertension, renal hypertension or pulmonary hypertension, thrombosis, arteriosclerosis, cerebral vasospasm, subarachnoid hemorrhage, cerebral ischemia, cerebral infarction , Peripheral vascular disease, cardiovascular disease including Raynaud's disease, kidney disease-eg renal failure, dyslipidemia, obesity, vomiting, irritable bowel syndrome (IBS), inflammatory bowel disease (IBD), gastroesophageal reflex disease (GERD) ), Motility disorders and delayed gastrointestinal symptoms, such as postoperative or diabetic gastroparesis, and diabetes, ulcers-gastrointestinal disorders including gastric ulcers, other diseases including diarrhea, osteoporosis, inflammation, infections, e.g. Bacterial, fungal, protozoan and viral infections, especially HIV-1 or HIV-2 infections, pain, cancer, chemotherapy-induced disorders, tumor invasion, immune disorders, residual urine, asthma, allergies, arthritis, benign prostatic hyperplasia , Endotoxin shock, sepsis, complications of diabetes mellitus, and gynecological disorders.
[0012]
SUMMARY OF THE INVENTION
In one aspect, the invention relates to IGS3 polypeptides, polynucleotides and recombinant materials and methods for their production. Another aspect of the invention relates to methods for using such IGS3 polypeptides, polynucleotides and recombinant materials. Such uses include, but are not limited to, use as a therapeutic target for one of the above “diseases” and for treatment.
[0013]
In yet another aspect, the present invention relates to methods for identifying agonists and antagonists using the agents provided by the present invention and for treating conditions associated with IGS3 imbalance using the identified compounds. Yet another aspect of the invention relates to diagnostic assays for detecting diseases associated with inappropriate IGS3 activity or levels. Yet another aspect of the invention relates to an animal-based system that acts as a model for disorders arising from abnormal expression or activity of IGS3.
[0014]
[Table 1]

[0015]
[Table 2]

[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Structural and chemical similarities exist within the sequence and motif between the IGS3Δ GPCR of the present invention and other human GPCRs. Therefore, IGS3 is considered to be involved in the above-mentioned "disease".
[0017]
Unless defined otherwise, technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods, devices and materials are now described. All publications cited herein are hereby incorporated by reference as if all publications were identified and fully described individually and as if incorporated herein by reference. Will be transferred to.
[0018]
Definition
The following definitions are provided to aid in understanding some terms that are often used herein.
[0019]
"IGS3" refers to, among other things, a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a variant thereof.
[0020]
"Receptor activity" or "biological activity of a receptor" refers to the metabolic or physiological function of the IGS3 and includes those activities with similar or improved activity or with reduced undesirable side effects. Also included are the antigenic and immunogenic activities of the IGS3.
[0021]
"IGS3 gene" refers to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variant thereof and / or a complement thereof.
[0022]
As used herein, “antibody” includes polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric, single chain, and humanized antibodies, and Fab fragments, including Fab or other immunoglobulin expression libraries. Are also included.
[0023]
"Isolated" means altered "by hand" from its original (native) state and / or separated from its original environment. Thus, when an "isolated" composition or substance that is naturally present is "isolated," it undergoes change or movement or both from its original environment. For example, a polynucleotide or polypeptide that is naturally present in a living animal is not "isolated," but the same polynucleotide or polypeptide that has been separated from materials that are together in its natural state is " Isolated ", and as such, the terms are used herein.
[0024]
"Polynucleotide" generally refers to any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, which may be unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA. "Polynucleotide" refers to single-stranded and double-stranded DNA, DNA that is a mixture of single- and double-stranded regions, single- and double-stranded RNA, and single- and double-stranded RNA. RNA, which is a mixture of regions, single-stranded or more typically double-stranded or hybrid molecules comprising DNA and RNA which may be a mixture of single- and double-stranded regions, Is not limited to this. Further, "polynucleotide" may also include triple-stranded regions comprising RNA or DNA or both RNA and DNA. The term polynucleotide also includes DNAs or RNAs containing one or more modified bases and DNAs or RNAs with backbones modified for stability or for other reasons. "Modified" bases include, for example, tritylated bases and unusual bases such as inosine. Various modifications are made to DNA and RNA, and thus "polynucleotide" refers to chemically, enzymatically or metabolically modified, typically naturally occurring forms of polynucleotides, as well as viruses and cells. DNA and RNA properties of the chemical. "Polynucleotide" also embraces relatively short polynucleotides, often referred to as oligonucleotides.
[0025]
"Polypeptide" refers to any peptide or protein that comprises two or more amino acids joined by peptide bonds or modified peptide bonds, ie, peptide isosteres. "Polypeptide" refers to short chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides or oligomers, and to longer chains, generally referred to as proteins, and / or combinations thereof. Polypeptides may contain amino acids other than the 20 genetically encoded amino acids. "Polypeptides" include amino acid sequences that have been modified by natural processes, for example, post-translational processing, or by any of the chemical modification techniques well known in the art. Such modifications are well described in basic textbooks and in longer articles, as well as in extensive research literature. Modifications can occur anywhere in the polypeptide, including the peptide backbone, amino acid side chains, and the amino or carboxyl terminus. It will be appreciated that the same type of modification may be present in the same or varying degrees at various sites in a given polypeptide. Also, a given polypeptide may contain many forms of modification. Polypeptides may be branched as a result of ubiquitination, and they may be cyclic, with or without branching. Cyclic, branched and branched cyclic polypeptides may result from post-translation natural processing or may be made by synthetic methods. Modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, covalent addition of flavin, covalent addition of heme moieties, covalent addition of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent addition of lipids or lipid derivatives, phosphotidyl Inositol covalent addition, cross-linking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, formation of covalent cross-links, formation of cystine, formation of pyroglutamic acid, formylation, gamma carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation , Iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, transfer RNA-mediated addition of amino acids to proteins such as arginylation, and ubiquitination. For example, "Protein-Structure and Molecular Properties" (PROTEINS-STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., TE Creighton, WH Freeman and Company, New York, 1993) and "Translation after" Forecast "(Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Products, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION FOUNDATION CO., LTD. Quality Modifications and Non-Protein Cofactor Analysis "(Seifter et al.," Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors ", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646) and" Protein synthesis: (Ratten et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 663: 48-62).
[0026]
A "variant" as the term is used herein, is different from the polynucleotide or polypeptide to which it is compared, but has an essential property, such as an essential biological, structural, regulatory or biochemical. The characteristic property is the polynucleotide or polypeptide to be retained. A typical variant of a polynucleotide differs in nucleotide sequence from another, comparative polynucleotide. Changes in the nucleotide sequence of the variant may or may not alter the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the comparison polynucleotide. Nucleotide changes may result in amino acid substitutions, additions, deletions, fusions and truncations in the polypeptide encoded by the comparison sequence, as discussed below. A typical variant of a polypeptide differs in amino acid sequence from other, comparable polypeptides. Generally, differences are limited so that the sequences of the comparative polypeptide and the variant are closely similar overall and, in many regions, identical. Variant and comparative polypeptides may differ in one or more substitutions, additions and deletions by any combination within the amino acid sequence. The substituted or inserted amino acid residue may or may not be one encoded by the genetic code. The variant of the polynucleotide or polypeptide may be a naturally occurring, eg, an allelic variant, or it may be a variant that is not known to occur naturally. Non-naturally occurring variants of polynucleotides and polypeptides may be made by mutagenesis techniques or by direct synthesis.
[0027]
"Identity" is a measure of the identity of nucleotide or amino acid sequences. Generally, the sequences are aligned for best match. "Identity" per se has an art-recognized meaning and can be calculated using published techniques. See, for example, "Molecular Biology by Computer" (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, New York, 1988); "Biocomputing: Informatics and Genome Project" (BIOCOMP). INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; "Computer analysis of sequence data, part 1" (COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA. , And Griffin, HG, eds., Humana Press, New Jersey, 1994); "Sequence Analysis in Molecular Biology", MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G. Academic Press, 1987); Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991). Although there are a number of ways to determine the match between two polynucleotide or polypeptide sequences, the term "identity" is well known to those skilled in the art (Carillo, H., and Lipton). , D., SIAM J. Applied Math., (1988) 48: 1073). A method commonly used to determine identity or similarity between two sequences is described in "Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego." , 1994) and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math, (1988) 48: 1073, including, but not limited to, determining identity and similarity. A preferred computer program method for determining the identity and similarity between two sequences is the GCG program package (Devereux, J. et al., Nuc. leic Acids Research (1984) 12 (1): 387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, SF et al., J. Molec. Biol. (1990) 215: 403). The term “homology” is interchangeable with “identity”.
[0028]
By way of illustration, a polynucleotide having a nucleotide sequence that has at least, for example, 95% “identity” to the comparison nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is defined as a polynucleotide having the nucleotide sequence of the polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. And that they may contain no more than 5 nucleotide differences for each 100 nucleotides of the comparison sequence. In other words, to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the comparison nucleotide sequence, may less than 5% of the nucleotides in the comparison sequence be deleted or replaced by another nucleotide? Or no more than 5% of the total nucleotides in the comparison sequence may be inserted into the comparison sequence, or a deletion in no more than 5% of the nucleotides in any of the total nucleotides in the comparison sequence, There may be combinations of insertions and substitutions. These mutations in the comparison sequence may be at the 5 or 3 terminal positions of the comparison nucleotide sequence or at any position between these terminal positions, individually between nucleotides in the comparison sequence, or one or more of the nucleotides in the comparison sequence. It may occur by spraying on any of the nucleotides in the above continuous groups.
[0029]
Similarly, for example, a polypeptide having an amino acid sequence having at least 95% "identity" to the comparative amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is defined as a polypeptide sequence in which each of the 100 amino acids of the comparative amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 In contrast, it means that the amino acid sequence of the polypeptide matches the comparison sequence, except that it may contain up to 5 amino acid changes. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to the comparison amino acid sequence, may 5% or less of the amino acid residues in the comparison sequence be deleted or replaced with another amino acid? Alternatively, no more than 5% of all amino acid residues in the comparison sequence may be inserted into the comparison sequence. These alterations in the comparison sequence may occur at the amino or carboxy terminal positions of the comparison amino acid sequence, or at any position between these terminal positions, individually between residues in the comparison sequence or one or more in the comparison sequence. May be interspersed in any of the adjacent groups.
The polypeptide of the present invention
In one aspect, the present invention relates to IGS3 polypeptides (including IGS3 proteins). The IGS3 polypeptide comprises the amino acid sequence encoded by the polypeptide of SEQ ID NO: 2 and the DNA insert contained within the deposit number CBS102196, deposited on September 15, 1999 with the Centralalureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands). A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a polypeptide having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained within the deposit number CBS102196 in Centraalbureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands); And / or that of SEQ ID NO: 2 and / or Centralalureau voor Schimmelculture A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the DNA insert contained in Deposit No. CBS102196 (Baarn, The Netherlands) and an amino acid sequence having at least 80% identity over its entire length; and More preferably, it comprises a polypeptide having at least 90% identity, and even more preferably at least 95% identity to the amino acid sequence. Furthermore, those with at least 97%, especially at least 99%, are highly preferred. Included within the IGS3 polypeptide are a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a polypeptide having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained within the deposit number CBS102196 at Centraalureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands). Having a polypeptide with an amino acid sequence having at least 80% identity over its entire length, and more preferably, at least 90% identity to SEQ ID NO: 2, and more preferably still at least 95% identity And a polypeptide having Furthermore, those with at least 97%, especially at least 99%, are highly preferred. Preferably, the IGS3 polypeptide exhibits at least one biological activity of the receptor.
[0030]
In another aspect of the invention, the IGS3 polypeptide may be part of a larger protein, eg, a fusion protein. Secretory or leader sequences, prosequences, sequences that aid in purification, eg, additional amino acid sequences containing overlapping histidine residues, sequences that aid in detection, eg, antigenic peptide tags (eg, hemagglutinin (HA) tags) or recombinant production It is often advantageous to include additional sequences for stability during
[0031]
Fragments of the IGS3 polypeptide are also included in the present invention. A fragment is a polypeptide having an amino acid sequence that is similar, but not entirely, to the amino acid sequence of the IGS3 polypeptide described above. As with IGS3 polypeptides, fragments may be "self-supporting", ie, comprise a single continuous region, most preferably within a larger polypeptide of which they form a part or region. Representative examples of polypeptide fragments of the invention include, for example, fragments from about amino acid number 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, and 101 to the end of an IGS3 polypeptide. including. Within this range, “about” includes the particular recited range, which is as large or small as several, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acids at either or both ends.
[0032]
Preferred fragments are, for example, deletions of a series of residues containing the amino terminus or a series of residues containing the carboxy terminus, or two residues of those containing the amino terminus and those containing the carboxy terminus. And truncated polypeptides having the amino acid sequence of the IGS3 polypeptide, except for the deletion of the sequence Structural or functional attributes such as alpha helix and alpha helix forming regions, beta sheets and beta sheet forming regions, turns and turn forming regions, coils and coil forming regions, hydrophilic regions, hydrophobic regions, alpha amphoteric Also preferred are fragments characterized by fragments comprising a region, a beta amphoteric region, a flexible region, a surface forming region, a substrate binding region, and a high antigen index region. Other preferred fragments are biologically active fragments. Fragments of biological activity are those that mediate receptor activity and include those that have similar or improved activity, or have reduced undesirable activity. Also included are those that are antigenic or immunogenic in animals, especially humans.
[0033]
Accordingly, the polypeptides of the present invention can be either those of SEQ ID NO: 2 and / or polypeptides having the amino acid sequence encoded by the DNA insert contained within the deposit number CBS102196 at Centralalureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands). Polypeptides having an amino acid sequence that is at least 80% identical to the same, or those fragments that are at least 80% identical to the corresponding fragment. Preferably, all of these polypeptide fragments retain the biological activity of the receptor, including antigenic activity. Variants of the defined sequences and fragments also form part of the invention. Preferred variants are those that differ from a comparator by conservative amino acid substitutions, i.e., those that substitute a residue of another or similar nature. Typical such substitutions are between Ala, Val, Leu and Ile, between Ser and Thr, between the acid residues Asp and Glu, between Asn and Gln, and between the basic residues Lys. Arg or between the aromatic residues Phe and Tyr. Particularly preferred are variants in which several, 5 to 10, 1 to 5 or 1 to 2 amino acids are substituted, deleted or added in any combination.
[0034]
IGS3 polypeptides of the present invention can be made by any suitable method. Such polypeptides include isolated naturally occurring polypeptides, recombinantly produced polypeptides, synthetically produced polypeptides, or polypeptides produced by a combination of these methods. Methods for making such polypeptides are well-known in the art.
Polynucleotide of the present invention
Another aspect of the present invention relates to IGS3 polynucleotides. IGS3 polynucleotides include isolated polynucleotides that encode IGS3 polypeptides and fragments, and polynucleotides closely related thereto. More specifically, an IGS3 polynucleotide of the present invention is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1, for example, one capable of encoding the IGS3 polypeptide of SEQ ID NO: 2, a specific sequence of SEQ ID NO: 1 And polynucleotides corresponding essentially to the DNA insert contained within the deposit number CBS102196 in the Centraalbureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands).
[0035]
An IGS3 polynucleotide is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 80% identity over its entire length to a nucleotide sequence encoding an IGS3 polypeptide of SEQ ID NO: 2, at least over its entire length to that of SEQ ID NO: 1 It further comprises a polynucleotide comprising a nucleotide sequence that is 80% identical and a polynucleotide essentially corresponding to the DNA insert contained within the deposit number CBS102196 at Centraalbureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands).
[0036]
In this regard, polynucleotides that are at least 90% identical are particularly preferred, and those that are at least 95% identical are even more preferred. Furthermore, at least 97% is highly preferred, at least 98-99% is most highly preferred, and at least 99% is most preferred. As an IGS3 polynucleotide, a nucleotide sequence having sufficient identity to the nucleotide sequence contained within SEQ ID NO: 1 or to the DNA insert contained within the deposit number CBS102196 at Centralalureau voor Schimmelcules (Baarn, The Netherlands) , For hybridization or under conditions available for use as a probe or marker. The present invention also provides polynucleotides that are complementary to these IGS3 polynucleotides.
[0037]
The IGS3 of the present invention is structurally related to other proteins in the G protein-coupled receptor family, as shown by the results of a BLAST search in public databases. The amino acid sequence in Table 2 (SEQ ID NO: 2) is approximately 35% identical (using BLAST, Altscul SF et al., Nucleic Acids Res. (1997), 25: 3389-3402) for most of its length. (2-306 amino acid residues) and a protein encoded by the human mas oncogene (sequence 1 in patent application WO8707472). This sequence has 37% identity (amino acid residues 35-315) to the G-protein coupled receptor (GENESEQ96P-R97222) published in patent application WO9616087. The nucleotide sequence in Table 1 (SEQ ID NO: 1) has 52% and 54% identity over most of the length of the two above-mentioned receptors (GENESEQ 87N-70685 and 96N-T28807, respectively). Furthermore, it is 48% identical to the human somatostatin-3-receptor (WO9313130; 93N-Q45657) within residues 104-1144. Hydropathy analysis of IGS3 protein sequence (Kyte J. sta., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132; Klein P. et al., Biochem. Biophys. Acta (1985) 815: 468-476). Showed the presence of seven transmembrane domains as expected. Thus, the IGS3 polypeptides and polynucleotides of the invention are expected to have biological functions / properties similar to those of the homologous polypeptides and polynucleotides, and their usefulness is determined by all techniques in the art. It is obvious to the skilled person.
[0038]
The polynucleotide of the present invention can be obtained from natural resources such as genomic DNA. In particular, degenerate PCR primers can be designed to encode conserved regions within a particular GPCR gene subfamily. A PCR amplification reaction on genomic DNA or cDNA using degenerate primers results in the amplification of several members (both known and novel) of the gene family under consideration (degenerate primers when using genomic templates). Must be located in the same exon) (Libert et al., Science, 1989, 244: 569-572). The polynucleotides of the present invention can also be synthesized using well-known and commercially available techniques.
[0039]
The nucleotide sequence encoding the IGS3 polypeptide of SEQ ID NO: 2 may be identical to the polypeptide encoding the sequence contained in SEQ ID NO: 1 (nucleotides 149-1138), or may be a duplicate of the genetic code As a result of (degeneracy), it may be a different nucleotide sequence that shows an alteration as compared to the sequence encoding the polypeptide contained within SEQ ID NO: 1, but may encode the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Good.
[0040]
When the polynucleotide of the present invention is used for recombinant production of an IGS3 polypeptide, the polypeptide may be a coding sequence for a mature polypeptide or a fragment thereof per se, a coding sequence for a mature polypeptide or other coding. It may include fragments in reading frame with the sequence, such as those encoding leader or secretory sequences, pre- or pro- or pre-pro-protein sequences or other fusion peptide portions. For example, a marker sequence that facilitates purification of the fusion polypeptide can be encoded. In one preferred embodiment of this practice of the invention, the marker sequence is a hexa-histidine peptide, provided in the pQE vector (Qiagen, Inc.) and Gentz et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 821-824, or an HA tag. Polynucleotides may include non-coding 5 'and 3' sequences, such as transcribed non-translated sequences, splicing and polyadenylation signals, ribosome binding sites, and sequences that stabilize mRNA.
[0041]
In a further preferred embodiment, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has several, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 or 1 amino acid residues substituted, deleted or added in any combination. A polynucleotide encoding an IGS3 variant comprising the amino acid sequence of an IGS3 polypeptide.
[0042]
Polynucleotides of the invention are generally used in the art to modify an IGS3 coding sequence for a variety of purposes, including, but not limited to, altering the cloning, processing, and / or expression of a gene product. It can be operated using a known method. DNA shuffling by random fragmentation and PCR reconstruction of gene fragments and synthetic oligonucleotides may be used to manipulate nucleotide sequences. For example, oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis may involve mutations such as creating amino acid substitutions, creating new restriction sites, altering the pattern of modifications (eg, glycosylation or phosphorylation), changing codon preferences, generating splice variants, and the like. May be used to introduce
[0043]
The present invention further relates to polynucleotides that hybridize to the sequences described herein above. In this regard, the invention is particularly directed to polynucleotides that hybridize under stringent conditions to the herein above-described polynucleotides. As used herein, the term “stringent conditions” refers to at least 80%, and preferably at least 90%, and more preferably at least 95%, more preferably at least 97%, especially at least 99%. It means that hybridization occurs only when identity exists between the sequences.
[0044]
Polynucleotides of the invention that match or sufficiently match the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof can be used to isolate full-length cDNA and genomic clones encoding IGS3 as hybridization probes for cDNA and genomic DNA. Also used to isolate cDNA and genomic clones of other genes with a high degree of sequence similarity to the IGS3 gene, including genes encoding homologs or orthologs from non-human species. Good. Those skilled in the art are familiar with such hybridization techniques. Typically, these nucleotide sequences are 80% identical, preferably 90% identical, more preferably 95% identical to those of the comparison. Probes generally comprise at least 5 nucleotides, and preferably at least 8 nucleotides, and more preferably at least 10 nucleotides, more preferably at least 12 nucleotides, especially at least 15 nucleotides. . Most preferably, such probes will have at least 30 nucleotides and may have at least 50 nucleotides. Particularly preferred probes are in the range of 30 to 50 nucleotides.
[0045]
One embodiment provides a labeled probe having SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof under stringent hybridization conditions to obtain a polynucleotide encoding an IGS3 polypeptide comprising a homolog or ortholog from a non-human species. And screening of a suitable library using E. coli and isolating a full-length DNA and a genomic clone containing the polynucleotide sequence. Such hybridization techniques are well known to those skilled in the art. Stringent hybridization conditions were as defined above, or at 42 ° C., 50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, Defined as conditions of overnight incubation in a solution containing 10% dextran sulfate (w / v), and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, and then washing the filters at about 65 ° C. in 0.1 × SSC.
[0046]
The polynucleotides and polypeptides of the present invention may be used as research reagents and materials for the discovery of therapeutics and diagnostics for animal and human diseases.
Vectors, host cells, expression
The present invention also relates to polynucleotides or vectors comprising the polynucleotides of the present invention, and host cells that have been genetically engineered with vectors of the present invention and the production of polypeptides of the present invention by recombinant techniques. Cell-free translation systems can also be used to produce such proteins using RNA derived from the DNA constructs of the present invention.
[0047]
For recombinant production, host cells can be genetically engineered to incorporate expression systems or portions thereof for the polynucleotides of the invention. The introduction of polynucleotides into host cells is described in a number of standard laboratory manuals, such as "Basic Methods in Molecular Biology" (Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986)) and "Molecular Cloning: Experimental Manual. (Sambrook et al., MOLECULARCLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Transformation in Calcium Phosphate, Trans. Transduction, microinjection Cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading (scrape loading), can be carried out by ballistic introduction (Ballistic introduction) or infection.
[0048]
Representative examples of suitable hosts include bacterial cells such as Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces and Bacillus subtilis cells, fungal cells such as yeast cells and Aspergillus cells, insect cells such as Drosophila S2 and Includes Spodoptera Sf9 cells, animal cells such as CHO, COS, Hela, C127, 3T3, BHK, HEK293 and Bowes melanoma cells, and plant cells.
[0049]
A wide variety of expression systems can be used. Such systems are, inter alia, chromosomal, episomal and virus-derived systems, such as from bacterial plasmids, from bacteriophages, from transposons, from yeast episomes, from insertion factors, from yeast chromosomal factors, from viruses, such as baculoviruses, papovaviruses. For example, vectors derived from SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus and retrovirus, and vectors derived from combinations thereof, such as plasmids and bacteriophage genetic elements, such as cosmids and phagemids. Including those that have been done. The expression system may include control regions that regulate as well as engender expression. In general, any system or vector suitable to maintain, propagate or express a polynucleotide for producing a polypeptide in a host may be used. Suitable nucleotide sequences can be introduced into the expression system using any of a variety of well-known and conventional techniques, such as those described in "Molecular Cloning: An Experimental Manual" (Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, supra). May be inserted.
[0050]
Appropriate secretion signals may be incorporated into the desired polypeptide for secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment. These signals may be endogenous to the polypeptide or may be heterologous signals, eg, derived from different species.
[0051]
When an IGS3 polypeptide is to be expressed for use in a screening assay, it is generally preferred that the polypeptide be produced on the surface of cells. In this event, cells may be harvested prior to use in a screening assay. Where the affinity or functional activity of an IGS3 polypeptide is altered by a receptor activity modulatory protein (RAMP), co-expression of the relevant RAMP on the cell surface is considered preferred and is often required. In this event, harvesting of cells expressing the IGS3 polypeptide and related RAMP is also required prior to using the screening assay. If the IGS3 polypeptide is secreted into the medium, the medium can be recovered to recover and purify the polypeptide. If produced intracellularly, the cells must first be lysed before the polypeptide is recovered. The membrane expressing the IGS3 polypeptide can be recovered by methods well known to those skilled in the art. In general, such methods include harvesting cells that express the IGS3 polypeptide and homogenizing the cells, such as, but not limited to, by potting. The membrane may be recovered by washing the suspension once or several times.
[0052]
The IGS3 polypeptide can be purified by well-known methods including ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography. Can be recovered and purified from recombinant cell culture. Most preferably, high performance liquid chromatography is used for purification. Well-known techniques for refolding proteins may be used to regenerate the active conformation when the polypeptide is denatured during isolation and / or purification.
Diagnostic assays
The invention also relates to the use of an IGS3 polynucleotide for use as a diagnostic reagent. Detection of a variant form of the IGS3 gene associated with dysfunction may be in addition to or determining a disease or susceptibility to a disease resulting from underexpression, overexpression or altered expression of IGS3. I will provide a. Even in this event, co-expression of the relevant receptor activity modulatory protein can be required to obtain a diagnostic assay of the desired quality. Individuals having a mutation in the IGS3 gene may be detected at the DNA level by various techniques.
[0053]
Nucleic acids for diagnosis may be obtained from cells of a patient, for example from blood, urine, saliva, tissue biopsy or autopsy material. Genomic DNA may be used directly for detection or may be amplified enzymatically using PCR or other amplification techniques prior to analysis. RNA or cDNA may be used in a similar manner. Deletions and insertions can be detected by a change in size of the amplified product as compared to the normal genotype. Point mutations can be identified by hybridizing the amplified DNA to a labeled IGS3 nucleotide sequence. Perfectly matched sequences can be distinguished from mismatched duplexes by RNase digestion or by differences in melting temperatures. DNA sequence differences may be detected by altering the electrophoretic mobility of the DNA fragments in the gel, with or without denaturing agents, or by direct DNA sequencing. See, for example, Myers et al. , Science (1985) 230: 1242. Sequence changes at specific positions may be revealed by nuclease protection assays, such as RNase and S1 protection or chemical cleavage methods. Cotton et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401. In another embodiment, an array of oligonucleotide probes comprising an IGS3 nucleotide sequence or a fragment thereof can be constructed, for example, to perform efficient screening for genetic mutations. Methods of array technology are well known and have general use and can be used to elucidate various problems in molecular genetics, including gene expression, gene ligation, and genetic alteration (eg, M. Chee et al. , Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)).
[0054]
Diagnostic assays provide a method for the diagnosis or susceptibility determination of the above "diseases", among others, through the detection of mutations in the IGS3 gene by the described methods.
[0055]
Furthermore, among others, the "disorder" described above can be diagnosed by a method comprising determining an abnormally reduced or increased level of an IGS3 polypeptide or IGS3 mRNA from a sample derived from a patient.
[0056]
Decreased or increased expression can be achieved at the RNA level using any of the methods well known in the art for quantification of polynucleotides, such as PCR, RT-PCR, RNase protection, Northern blotting and other hybridization methods. Can be measured. Assay techniques that can be used to determine levels of a protein, such as IGS3, in a sample derived from a host are well-known to those of skill in the art. Such assay methods include radioimmunoassays, competition-binding assays, western blot analysis and ELISA assays.
[0057]
In another aspect, the invention relates to a diagnostic kit for susceptibility to one of the above "diseases" or "diseases".
The kit is
(A) an IGS3 polynucleotide, preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof, and / or
(B) a nucleotide sequence complementary to that of (a), and / or
(C) an IGS3 polypeptide, preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof, and / or
(D) an antibody against an IGS3 polypeptide, preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2, and / or
(E) RAMP polypeptide required for relevant biological or antigenic properties of IGS3 polypeptide
May be included.
[0058]
It is recognized that in any such kit, (a), (b), (c), (d) or (e) may comprise essential components.
Chromosome assay
The nucleotide sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. Sequences can be specifically targeted to and hybridize to specific locations on individual human chromosomes. Mapping related sequences of chromosomes according to the present invention is an important first step in correlating these sequences with gene-related diseases. If the sequence is located at a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data, for example, McKusick, found in Mendelian Inheritance in Man (available online from Johns Hopkins University Welch Medical Library). The relationship between the disease and the gene located in the same chromosomal region is then identified by linkage analysis (simultaneous inheritance of physically adjacent genes).
[0059]
Differences in cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals can also be determined. If the mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in any of the normal individuals, the mutation may be a causative agent of the disease.
antibody
Cells expressing the polypeptides of the present invention or fragments thereof or analogs thereof, or together with the associated RAMP, when required, may be used as immunogens to produce antibodies immunospecifically against the IGS3 polypeptide. May be used. The term "immunospecificity" means that the antibodies have an affinity for a polypeptide of the invention that is substantially greater than their affinity for other related polypeptides in the prior art.
[0060]
Antibodies raised against an IGS3 polypeptide may be obtained by administering the polypeptide or epitope-retaining fragment, analog or cell using animals, preferably non-human, using conventional protocols. For the production of monoclonal antibodies, any technique which provides antibodies produced by continuous cell line cultures may be used. Examples include hybridoma technology (Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497), trioma technology, human B-cell hybridoma technology (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72) and EBV-Hybridoma technology (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
[0061]
The above antibodies may be used to isolate or identify clones expressing the polypeptide or to purify the polypeptide by affinity chromatography.
[0062]
Antibodies against the IGS3 polypeptide itself or against the IGS3 polypeptide-RAMP complex may be used to treat, among other things, the above "diseases".
animal
Another aspect of the invention relates to non-human animal-based systems that act as models for disorders arising from aberrant expression or activity of IGS3. Model systems based on non-human animals may be used to further characterize the activity of the IGS3 gene. Such a system may be used as part of a screening strategy designed to identify compounds that can treat an IGS3-based disease, such as, inter alia, the aforementioned “diseases”.
[0063]
In this way, animal-based models may be used to identify drug compounds, treatments and interventions that are effective in treating disorders of abnormal expression or activity of IGS3. In addition, such animal models have been developed for LD in animal patients.₅₀And ED₅₀May be used to determine These data may be used to determine the in vivo efficacy of treatment of a potential IGS3 disorder.
[0064]
Animal-based model systems of IGS3-based disorders based on abnormal IGS3 expression or activity may include both non-recombinant animals as well as recombinantly engineered transgenic animals.
[0065]
Animal models for IGS3 disorders may include, for example, genetic models. Animal models exhibiting IGS3-based disorder-like syndromes are manipulated using, for example, IGS3 sequences, such as those described above, in combination with techniques for producing transgenic animals well known to those skilled in the art. You may. For example, the IGS3 sequence may be introduced into the genome of the animal of interest and over-expressed and / or non-expressed, or, if endogenous IGS3 sequences are present, either over-expressed or non-expressed. Alternatively, or alternatively, IGS3 gene expression may be disrupted to underexpress or inactivate.
[0066]
In order to overexpress or non-express the IGS3 gene sequence, the coding portion of the IGS3 gene sequence may drive high level gene expression or expression in a cell type where the gene is not normally expressed in the animal species concerned. It may be linked to possible regulatory sequences. Such regulatory regions are well known to those skilled in the art and may be used without undue experimentation.
[0067]
Due to the under-expression of the endogenous IGS3 gene sequence, such sequences are isolated and manipulated to inactivate the endogenous IGS3 gene allele when reintroduced into the genome of the animal concerned, ie, It may be "knocked out". Preferably, the engineered IGS3 gene sequence is introduced via a gene targeting method such that upon integration of the engineered IGS3 gene sequence into the animal genome, the endogenous IGS3 sequence is destroyed.
[0068]
All species of animals, including but not limited to mice, rats, rabbits, rabbits, squirrels, guinea pigs, pigs, small pigs, goats, and non-human primates, such as baboons, monkeys, and apes, can be treated for IGS3-related disorders. It may be used to generate animal models.
[0069]
Any technique known in the art may be used to introduce the IGS3 transgene into the animal to create a founder strain of the transgenic animal. Such techniques include pronuclear microinjection (Hoppe, PC and Wagner, TE 1989, U.S. Pat. No. 4,873,191); retrovirus-mediated germline injection. Gene transfer (van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152, 1985); Gene targeting method in embryonic stem cells (Thompson et al., Cell 56: 313-321, 1989). ); Embryo electroporation (Lo, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814, 1983); and sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57: 717-723, 1989). There is no limitation. A review of such techniques can be found in Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev .. Cytol. 115: 171-229, 1989.
[0070]
The present invention provides transgenic animals that have the IGS3 transgene in all of these cells, as well as animals that have the transgene in some but not all of the cells, ie, mosaic animals (eg, Jakobovitz, Curr. Biol. 4: 761-763, 1994). The transgene may be integrated as a single transgene or in a concatamer, such as a head-to-head or head-to-tail tandem. The transgene can be selectively introduced into a particular cell type and activated according to, for example, the teachings of Lasco et al. (Lasko, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236, 1992). May be used.
[0071]
The regulatory sequences required for such cell type-specific activation will depend on the particular cell type involved, and will be apparent to those skilled in the art.
[0072]
If it is desired to integrate the IGS3 transgene into the chromosomal site of the endogenous IGS3 gene, the gene targeting method is preferred. In summary, when using this technique, a vector containing a nucleotide sequence homologous to the relevant endogenous IGS3 gene (eg, the nucleotide sequence of the mouse IGS3 gene) is transformed into an endogenous homologous recombination with a chromosomal sequence. Designed to integrate into the nucleotide sequence of the IGS3 gene or gene allele and disrupt its function. The transgene may be selectively introduced into a particular cell type, thereby inactivating endogenous genes that are only relevant within that cell type, for example according to the teachings of Gu et al. et al., Science 265: 103-106, 1996). The regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation will depend on the particular cell type involved, and will be apparent to those skilled in the art.
[0073]
Once the transgenic animal has been produced, expression of the recombinant IGS3 gene and protein may be assayed using standard techniques. Initial screening may be performed by Southern blot analysis or PCR techniques to analyze animal tissues to assay whether transgene integration has occurred. The level of mRNA expression of the IGS3 transgene in the tissue of the transgenic animal can be determined using techniques including, but not limited to, Northern blot analysis of tissue samples obtained from the animal, in situ hybridization techniques, and RT-PCR. May be evaluated. A sample of the target gene-expressing tissue may be assessed immunocytochemically using the antibody specificity of specificity for the relevant target gene transgene product. IGS3 transgenic animals expressing IGS3 gene mRNA or IGS3 transgene peptide at readily detectable levels (detected immunocytochemically using antibodies to the target gene product epitope), and then further characterized IGS3-based disorders Subsequent evaluations may be made to identify those animals that show the syndrome.
[0074]
When an IGS3 transgenic founder (ie, an animal that expresses the IGS3 protein in the cells or tissues involved and preferably exhibits the syndrome of an IGS3-based disorder), a colony of a particular animal is created. They may be bred, inbred, outbred, or crossbred to do so. Examples of such breeding strategies involve high levels of outcrossing of founders with more than one integration site to establish an isolated strain, the effect of additional expression of each IGS3 transgene. To eliminate the possible need for inbred, increased expression and screening of animals by DNA analysis of isolated strains to produce a composite IGS3 transgenic expressing the IGS3 transgene, the given integration site Crosses of heterozygous transgenic animals to generate homozygous animals, crosses of separate homozygous strains to generate compound heterozygous or homozygous strains, expression of the IGS3 transgene and allergy to the development of IGS3-like syndrome This includes breeding animals into various inbred genetic backgrounds to study the effects of genetic alterations. Of but are not limited to. One such method is the crossing of an IGS3 transgenic founder with a wild-type strain to produce an IGS3-related disorder-like syndrome, such as the F1 generation described above. Then, if the heterozygous target gene transgenic animal is viable, the F1 generation may be inbred to generate a heterozygous strain.
vaccine
Another aspect of the present invention relates to a method for inducing an immunological response in a mammal, comprising eliciting an IGS3 polypeptide or fragment thereof in a mammal, and optionally, an antibody and / or T cell immune response. Administering together (eg, inoculating) a RAMP polypeptide suitable for development to protect the animal from the above “diseases”, among others.
[0075]
Yet another aspect of the present invention relates to a method for inducing an immunological response in a mammal, the method comprising the steps of eliciting an IGS3 antibody to induce an immunological response that produces antibodies to protect the animal from disease. Supplying the polypeptide via a vector that directs expression of the IGS3 polynucleotide in vivo.
[0076]
Another aspect of the invention relates to immunological / vaccine preparations (compositions) that, when introduced into a mammalian host, induce an immunological response in a mammal to an IGS3 polypeptide. Comprising an IGS3 polypeptide or IGS3 gene. Such immunological / vaccine preparations (compositions) may be either therapeutic immunological / vaccine preparations or prophylactic immunological / vaccine preparations. The vaccine preparation may further comprise a suitable carrier. Since the IGS3 polypeptide may be broken down in the stomach, it is preferably administered parenterally (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal etc. injection). Formulations suitable for parenteral administration include sterile aqueous and non-aqueous injection solutions, which may include antioxidants, buffers, bacteriostats and solutes to make the formulation isotonic with the blood of the recipient. It includes aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain suspending agents or thickening agents. The preparations may be presented in unit-dose or multi-dose containers, for example, sealed ampules and vials, and may be stored in the lyophilized state, which only requires the addition of a sterile liquid carrier immediately before use. Vaccine preparations may include adjuvant systems to enhance the immunogenicity of the preparation, such as oil-in-water and other systems known in the art. The dose depends on the activity of the vaccine and can be easily determined by routine tests.
Screening assay
The IGS3 polypeptides of the invention may be used during a screening process for compounds that bind the receptor and activate (agonist) or inhibit (antagonist) the receptor polypeptide of the invention. Thus, the polypeptides of the present invention may be used to assess the binding of small molecule substrates and ligands in, for example, cells, cell-free preparations, chemical libraries, and natural product mixtures. These substrates and ligands can be natural substrates and ligands or structural or functional mimetics.
[0077]
IGS3 polypeptides are responsible for biological functions, including pathology. Therefore, it is desirable to find compounds and agents that can stimulate IGS3 on the one hand and inhibit IGS3 function on the other. In general, agonists are used for therapeutic and prophylactic purposes, inter alia, for conditions such as "diseases" as described above.
[0078]
Antagonists may be used for various therapeutic and prophylactic purposes, inter alia, for conditions such as the "diseases" described above.
[0079]
In general, such screening procedures involve the production of cells suitable for expressing the receptor polypeptide of the invention on its surface and, where necessary, co-expressing RAMP on its surface. Such cells include cells from mammals, yeast, Drosophila or E. coli. The cells expressing the receptor (or the cell membrane containing the expressed receptor) are then contacted with a test compound and binding, or stimulation or inhibition of a functional response, is observed.
[0080]
One screening technique involves cells expressing the receptor of the invention (eg, transfected CHO cells) in a system that measures extracellular pH, intracellular pH, or intracellular calcium changes caused by receptor activation. Including the use of In this technique, a compound may be contacted with a cell that expresses a receptor polypeptide of the present invention. A second messenger response, eg, signal transduction, pH change, or change in calcium level is then measured to determine whether the potential compound activates or inhibits the receptor.
[0081]
Another method involves screening for receptor inhibitors by determining the modulation of receptor-mediated signals, such as cAMP accumulation and / or adenylate cyclase activity. Such methods include transfecting a eukaryotic cell with a receptor of the invention to express the receptor on the cell surface. The cells are then exposed to an agonist for the receptor of the present invention in the presence of a potential antagonist. If a potential antagonist binds the receptor and thereby inhibits receptor binding, the agonist-mediated signal will be modulated.
[0082]
Another method for detecting agonists or antagonists to the receptor of the present invention is the yeast-based technique described in US Pat. No. 5,482,835.
[0083]
The assay may be merely test binding of the candidate compound, wherein adhesion to the receptor-bearing cell is detected by a label directly or indirectly bound to the candidate compound or by an assay involving competition with a labeled competitor. You. In addition, these assays may test whether a candidate compound results in a signal generated by activation of the receptor, using a detection system suitable for cells having the receptor on its surface. Inhibitors of activation are generally assayed in the presence of a known agonist, and the effect on activation by the agonist due to the presence of the candidate compound is observed.
[0084]
Further, the assay simply comprises mixing the candidate compound with a solution containing the IGS3 polypeptide to form a mixture, measuring the IGS3 activity in the mixture, and comparing the IGS3 activity of the mixture to a standard. You may.
[0085]
The IGS3Δ cDNA, protein and antibodies to the protein may be used to construct an assay to detect the effect of added compounds on the production of IGS3Δ mRNA and protein in cells. For example, an ELISA may be constructed to measure secretion or cell-associated levels of the IGS3 protein using monoclonal and polyclonal antibodies by standard methods known in the art, and this may be performed using appropriately engineered cells or It can be used to find agents (also called antagonists or agonists, respectively) that will inhibit or enhance the production of IGS3 from tissues. Standard methods for performing screening assays are well-known in the art.
[0086]
Examples of potential IGS3 antagonists are antibodies or, in some cases, ligands of IGS3, such as oligonucleotides or proteins closely related to fragments of the ligand, or receptors that bind to, but do not react with, the activity of the receptor. Including small molecules that block
[0087]
Thus, in another aspect, the invention provides:
(A) an IGS3 polypeptide, preferably of SEQ ID NO: 2,
(B) a recombinant cell expressing an IGS3 polypeptide, preferably of SEQ ID NO: 2,
(C) a cell membrane expressing an IGS3 polypeptide, preferably of SEQ ID NO: 2, or
(D) an antibody against the IGS3 polypeptide, preferably that of SEQ ID NO: 2
A screening kit for identifying an agonist, antagonist, ligand, receptor, substrate, enzyme, etc. for an IGS3 polypeptide, or a compound that decreases, increases and / or enhances the production of an IGS3 polypeptide, comprising:
[0088]
It will be appreciated that in any such kit, (a), (b), (c) or (d) may comprise essential components.
Prevention and treatment methods
The present invention provides methods for treating abnormal conditions associated with both excess and / or inadequate amounts of IGS3 activity.
[0089]
If the activity of IGS3 is excessive, several methods are available. One method is to use the inhibitory compounds (antagonists) described above together with a pharmaceutically acceptable carrier to block ligand binding to IGS3, or to interact with a RAMP polypeptide or a second signal. Inhibiting the activation thereby inhibiting the activation and thereby alleviating the abnormal condition.
[0090]
In another method, a soluble form of an IGS3 polypeptide that can compete with endogenous IGS3 and still bind the ligand may be administered. A typical embodiment of such a competitor comprises a fragment of an IGS3 polypeptide.
[0091]
In yet another method, expression of the gene encoding endogenous IGS3 can be inhibited using expression blocking techniques. Known such techniques include the use of internally produced or separately administered antisense sequences. For example, O'Conner, J. et al. Neurochem. (1991) 56: 560 in Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Florida USA (1988). Alternatively, oligonucleotides that form a triple helix with the gene can be provided. See, for example, Lee et al. , Nucleic Acids Res. (1979) 6: 3073; Cooney et al. , Science (1988) 241: 456; Dervan et al. , Science (1991) 251: 1360. These oligomers can be administered per se or can express the relevant oligomer in vivo. Synthetic antisense or triple helix oligonucleotides may comprise modified bases or modified backbones. Examples of the latter include a methylphosphonate, phosphorothioate or peptide nucleic acid backbone. Such scaffolds are incorporated into antisense or triple helix oligonucleotides to provide protection from nuclease degradation, which is well known in the art. Synthetic antisense and triple helix molecules using these or other modified backbones form part of the present invention.
[0092]
In addition, expression of the IGS3 polypeptide may be avoided by using a ribozyme specific for the IGS3 mRNA sequence. Ribozymes are catalytically active RNAs that can be natural or synthetic (see, eg, Usman et al., Curr. Opin. Struct. Biol. (1996) 6 (4), 527-33). Synthetic ribozymes can be designed to specifically cleave IGS3 mRNA at selected locations, thereby avoiding translation of IGS3 mRNA into a functional polypeptide. Ribozymes may be synthesized using a natural phosphate ribose backbone and natural bases, such as those commonly found in RNA molecules. Alternatively, the ribozyme may be synthesized with a non-natural backbone, such as 2'-O-methyl RNA, and may contain modified bases to provide protection from ribonuclease degradation.
[0093]
Various methods are also available for treating abnormal conditions related to the low expression of IGS3 and its activity. One method involves administering to a patient a therapeutically effective amount of a compound that activates IGS3, ie, an agonist as described above, together with a pharmaceutically acceptable carrier, thereby alleviating the abnormal condition. Comprising. Alternatively, gene therapy may be used to effect the endogenous production of IGS3 by relevant cells in the patient. For example, a polynucleotide of the invention may be engineered for expression in a replication defective retroviral vector discussed above. The retroviral expression construct may then be isolated and introduced into packaging cells transduced with a retroviral plasmid vector containing RNA encoding a polypeptide of the present invention, whereby the packaging cells become involved. Produce infectious virions containing the genes involved. These producer cells may be administered to a patient for manipulation of the cells in vivo and expression of the polypeptide in vivo. For a review of gene therapy, see Human Molecular Genetics, Strachan T .; and Read A. P. , BIOS Scientific Publishers, Ltd. (1986), Chapter 20, "Gene Therapy and Other Molecular Gene-Based Therapies" (Chapter 20, Gene Therapy and the Other Molecular Generic-based References and References in Therapeutic References in Therapeutic References in the Molecular Generic-based References of Molecular Therapeutics). That.
[0094]
Any of the above methods of treatment may be applied to any patient in need of such treatment, including, for example, mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and most preferably humans.
Dispensing and administration
Peptides, eg, soluble forms of IGS3 polypeptides, and agonist and antagonist peptides or small molecules, may be formulated in combination with a suitable drug carrier. Such formulations comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide or compound, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. The formulation must suit the mode of administration and is well within the skill of the art. The invention further relates to pharmaceutical packages and kits comprising one or more containers filled with one or more components of the above composition of the invention.
[0095]
The polypeptides and other compounds of the present invention may be used alone or together with other compounds, for example, therapeutic compounds.
[0096]
Preferred forms of systemic administration of the pharmaceutical composition include injections, typically intravenous. Other injection routes can be used, for example, subcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal. Another means of systemic administration involves transmucosal or transdermal administration with penetrants such as bile salts or fusidic acid or other surfactants. In addition, if properly formulated in oral and encapsulated preparations, oral administration may be possible.
[0097]
The required dosage range will depend on the choice of peptide or compound, the route of administration, the nature of the preparation, the nature of the condition of the patient, and the judgment of the attending physician. A suitable dose is in the range of 0.1-100 μg / kg (patient weight). However, wide variations in the required dosage are anticipated in view of the different efficiencies of the different compounds used and the different routes of administration. For example, oral administration would be expected to require higher doses than administration by intravenous injection. These dose level changes can be adjusted using standard empirical practices for optimization, which are well understood in the art.
[0098]
The peptides used for therapy can also be generated endogenously in the patient in therapeutic modalities, often referred to as "gene therapy", as described above. Thus, for example, cells from a patient may be engineered in vitro with a polynucleotide, eg, DNA or RNA, and to encode the polypeptide, eg, using a retroviral plasmid vector. The cells are then introduced into the patient.
[0099]
The following examples are only intended to illustrate the invention in more detail, and therefore these examples are not deemed to limit the invention in any way.
[0100]
【Example】
Embodiment 1 FIG. Cloning of genomic DNA encoding a novel G-protein coupled receptor
Example 1a. Homology PCR cloning of genomic fragments encoding novel G-protein coupled receptors (GPCRs)
A PCR-based homology cloning strategy was used to isolate a partial genomic DNA sequence encoding a novel G-protein coupled receptor (GPCR). The forward (F20) and reverse (R42, R43) degenerate PCR primers were used for the neurotensin receptor gene family (Vita N. et al. [1993] Febs Lett. 317, 139-142; Vita N. et al. [1998]. Eur. J. Pharmacol. 360, 265-272), the boundary between intracellular loop 1 (I1) and transmembrane domain 2 (TM2) and between transmembrane domain 3 and intracellular loop 2 Each was designed at the boundary (TM3 / I2).
F20 (I1 / TM2):
5'-CTGCACTACCACGTGCTC (A or T) (G or C) (A, C, G or T) (C or T) T (A, C, G or T) GC-3 '
(SEQ ID NO: 3)
R42 (TM3 / I2):
5'-GGGTGGCAGATGGCCA (A or G) (A or G) (C or T) A (A, C, G or T) C (G or T) (C or T) TC (C or inosine) (C, G Or T) (SEQ ID NO: 4)
R43 (TM3 / I2):
5'-GTGGCAGATGGCGAGCAGCG (A or G) TC (A, C, G or T) (A or G) C (A or G) CT (A, G or T) -3 '(SEQ ID NO: 5)
To suppress amplification of known members of the neurotensin receptor family, the 3 'last nucleotide position of primers R42 and R43 should be changed to the corresponding position in human NTR1 cDNA (R42) or the corresponding position in both NTR1 and NTR2 cDNA. (R43) was selected so as not to be complementary to any of them.
[0101]
The primary PCR reaction was performed in a volume of 60 μl and 100 ng human genomic DNA (Clontech), 6 μl gene amplifier^TM(GeneAmp) 10 × PCR buffer II (100 mM Tris-HCl pH 8.3; 500 mM KCl, Perkin Elmer), 3.6 μl 2.5 mM MgCl₂, 0.36 μl dNTPs (25 mM of each dNTP), 1.5 units AmpliTaq-Gold^TMThe polymerase (Perkin Elmer) and the degenerate forward (F20) and reverse primer (R42) each contained 30 pmol. The reaction tube was heated at 95 ° C for 10 minutes, followed by 35 cycles of denaturation (95 ° C, 1 minute), annealing (55 ° C, 2 minutes) and extension (72 ° C, 3 minutes). Finally, the reaction tube was heated at 72 ° C. for 10 minutes.
[0102]
For a semi-nested PCR reaction, 1 μl of a 1/50 dilution of the primary PCR reaction was used as a template with degenerate forward and reverse primers F20 and R43, respectively. The half-nest PCR reaction was performed under the same conditions as the primary PCR reaction.
[0103]
The half-nest PCR reaction products were size fractionated on agarose gels and stained with ethidium bromide. A ± 220 bp fragment was identified, which was identified as Qiaex-II.^TMThe gel was purified using a purification kit (Qiagen) and ligated into the pGEM-T plasmid according to the method recommended by the supplier (pGEM-T kit, Promega). E. coli SURE compatible with the recombinant plasmid thus prepared is used.^TM2 bacteria (Stratagene). Transformed cells were plated on LB agar plates containing ampicillin (100 μg / ml). Plasmid DNA was purified from mini-cultures of individual colonies using the Qiagen-tip 20 miniprep kit (Qiagen). The DNA sequencing reaction was performed using ABI Prism.^TMBigDye^TMUsing a Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE-ABI), the procedure was performed on plasmid DNA purified using insertion-proximity. The sequencing reaction products were purified using EtOH / NaOAc precipitation and analyzed on an ABI377 automated sequencer.
[0104]
Computer-assisted homology search of the insertion sequence of clone HNT1370 against the public domain sequence data bank (Blastn; Altschul SF et al. [1997], Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) is a novel GPCR family member. Revealed strong signs of coding (part of) members. Although HNT1370 was cloned from a ± 220 bp fragment, the insert size was only ± 130 bp as a result of the cloning procedure. We call this new GPCR IGS3.
[0105]
[Table 3]

[0106]
Example 1b.ク ロ ー ニ ン グ Cloning of genomic DNA fragment containing complete IGS3 coding sequence
The complete coding sequence of IGS3 was obtained via hybridization screening of a human genomic library. A human genomic DNA library (Clontech # HL1067) constructed in the lambda EMBL3 @ SP6 / T7 phage vector was screened by hybridization using an IGS3 specific probe. This probe was derived from a 130 bp PCR fragment amplified from the HNT1355 plasmid, which contained the same insert as HNT1370, using the IGS3 specific primers IP11969 (SEQ ID NO: 6) and IP12008 (SEQ ID NO: 7) (FIG. 1). ). The 130 bp fragment was separated from the gel by Qiaex II.^TMPurify using a purification kit (Qiagen) and [α-³²P] Specific radioactivity> 10 via Random primed incorporation of dCTP⁹Radiolabeled to cpm / μg using the Prime-It II kit (Stratagene) according to the guidelines provided by the supplier. Approximately 550,000 plaques were screened using a 130 bp probe according to Clontech's Lambda Library User Manual (PT1010-1). Three positive clones (λ-IGS3.1, λ-IGS3.3 and λ-IGS3.5) were plaque purified and Maniatis et al., (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A. Laboratory Manual Second Edition [1989], CSH Laboratory Press)), recombinant phage DNA was produced from small-scale liquid cultures.
[0107]
Sequence analysis of recombinant phage DNA using IGS3 specific primers revealed that all three lambda clone inserts contained a long open reading frame encoding a novel putative (intron-free) GPCR of 330 amino acids. (The prerequisite for translation was preceded by an in-frame stop codon). The IGS3 coding sequence was subcloned into a plasmid vector after PCR amplification. PCR reaction is expanded^TM(Expand) Isolated λ-IGS3.1, λ-IGS3.3 and λ were isolated using IP12936 (SEQ ID NO: 8) and IP12937 (SEQ ID NO: 9) oligonucleotide primers using a high fidelity PCR system (Boehringer). -Performed on IGS3.5 phage DNA (500 ng). The PCR tube was heated to 95 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of denaturation (95 ° C, 30 seconds), annealing (58 ° C, 30 seconds) and extension (72 ° C, 1 minute). Finally, a final extension step was performed at 72 ° C. for 10 minutes. The ± 1,200 BP PCR product was purified from the gel and ligated into the pGEM-T vector. The recombinant DNA was then used to transform E. coli strain DH5αF '. The bacterial clones HB4971, HB4972 (both subcloned from λ-IGS3.1), HB4973 and HB4974 (both subcloned from λ-IGS3.3) and HB4975 and HB4976 (both λ-IGS3) .5 subclone). The inserts of all plasmid clones were completely sequenced. Melding of all sequence data yielded a consensus sequence, which confirmed the presence of a 330 amino acid long open reading frame encoding a putative novel GPCR receptor (IGS3) (FIG. 1). The IGS3 consensus cDNA and protein sequences are described herein as IGS3 DNA (SEQ ID NO: 1) and IGS3PROT (SEQ ID NO: 2), respectively. A homology search of the DNA data bank using the IGS3 DNA sequence revealed one EST sequence (accession number AF003828), which partially overlaps the IGS3 DNA at the 3 'end (Figure 1).
[0108]
Bacterial strains harboring plasmid HNT4971 (containing the IGS3 DNA sequence) were re-cloned after replating on LB agar plates containing 100 μg ampicillin / ml and reconstituted with Innogenetics N.C. V. Deposits were made with both the stock list (ICCG4319) and "Centralalureau voor Schimmelculturen (CBS)" (Baarn, Netherlands, accession number 102196). Plasmid DNA was prepared from the recloned isolate and the insert was sequenced and found to be identical to the IGS3 DNA sequence.
[0109]
[Table 4]

[0110]
[Table 5]

[0111]
[Table 6]

[0112]
[Table 7]

[Brief description of the drawings]
FIG.
Illustration of the relative positions of various DNA clones isolated to generate a common IGS3 cDNA sequence. HNT1370 represents a "founding" genomic clone. λ-IGS3.1A, B, etc. show separate (almost) overlapping sequence contigs obtained from sequence analysis of DNA from lambda clone IGS3.1. The PCR primers described in this document are denoted by (IP #). CONSENSUS indicates the contig obtained after merging all the obtained sequences. The portion of the CONSENSUS contig that was completely confirmed by sequence analysis of at least three independent clones is represented by IGS3 DNA (SEQ ID NO: 1). The open reading frame of 330 amino acids in length present in the IGS3 DNA is indicated by “**”. The position of EST AF003828 is indicated by “==”.

Claims (25)

a) a nucleotide sequence encoding the IGS3 polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2;
b) a nucleotide sequence encoding the polypeptide encoded by the DNA insert contained in the deposit number CBS102196 in Centralalureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands), in particular the nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1;
c) a nucleotide sequence having at least 80% (preferably at least 90%) sequence identity over its entire length to the nucleotide sequence of (a) or (b);
d) An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of (a) or (b) or (c). 2. The polynucleotide of claim 1, wherein said polynucleotide comprises a nucleotide sequence contained within SEQ ID NO: 1 encoding the IGS3 polypeptide of SEQ ID NO: 2. 2. The polynucleotide of claim 1, wherein said polynucleotide comprises a nucleotide sequence that is at least 80% identical over its entire length to that of SEQ ID NO: 1. The polynucleotide according to claim 3, which is the polynucleotide of SEQ ID NO: 1. The polynucleotide according to claim 1, which is DNA or RNA. A hybridization probe comprising the polynucleotide of claim 1 or a fragment thereof of at least 5 nucleotides and preferably between 30 and 50 nucleotides. An expression system capable of producing an IGS3 polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80% identity to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 when present in a compatible host cell. A DNA or RNA molecule comprising the system. A host cell comprising the expression system of claim 7. 9. The host cell according to claim 8, which is a yeast cell. 9. The host cell according to claim 8, which is an animal cell. An IGS3 receptor membrane preparation derived from the cells of claims 8 to 10. 9. A method for producing an IGS3 polypeptide, comprising culturing the host of claim 8 under conditions sufficient for the production of said polypeptide and recovering the polypeptide from the culture. 9. Producing a cellular IGS3 polypeptide comprising transforming or transfecting the cell with an expression system of claim 7 so that the cell is capable of producing an IGS3 polypeptide under appropriate culture conditions. A method for producing a cell. An IGS3 polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 80% identical over its entire length to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 15. The polypeptide of claim 14, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. An antibody immunospecific for the IGS3 polypeptide of claim 14. (A) administering to the patient a therapeutically effective amount of an agonist for the receptor, and / or
(B) a nucleotide sequence having at least 80% identity over its entire length to the nucleotide sequence encoding the IGS3 polypeptide of SEQ ID NO: 2, or such a nucleotide sequence as to effect production of the receptor activity in vivo. 17. requiring enhanced activity or expression of an IGS3 polypeptide receptor of claim 14, comprising providing to the patient an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to Methods for treatment of patients. (A) administering to the patient a therapeutically effective amount of an antagonist to the receptor, and / or (b) administering to the patient a polynucleotide that inhibits the expression of a nucleotide sequence encoding the receptor, and / or 15. The need to inhibit the activity or expression of an IGS3 polypeptide receptor of claim 14, comprising (c) administering to the patient a therapeutically effective amount of a polypeptide that competes with said receptor for its ligand. Methods for the treatment of patients having. (A) determining the presence or absence of a mutation in the nucleotide sequence encoding the IGS3 polypeptide in the patient's genome, and / or (b) determining the expression of the IGS3 polypeptide in a sample derived from the patient. 15. A method for diagnosing a disease or susceptibility to a disease in a patient associated with the expression or activity of the IGS3 polypeptide of claim 14 in said patient, comprising analyzing the presence or amount. Claims: (a) contacting a cell producing an IGS3 polypeptide with a test compound, and (b) determining whether the test compound results in a signal generated by activation of the IGS3 polypeptide. A method for identifying an agonist for 14 IGS3 polypeptides. An agonist identified by the method of claim 20. Claims: comprising: (a) contacting a cell producing an IGS3 polypeptide with an agonist; and (b) determining whether the signal generated by the agonist is reduced in the presence of the candidate compound. A method for identifying antagonists to 14 IGS3 polypeptides. An antagonist identified by the method of claim 22. 14. A recombinant host cell produced by the method of claim 13 or a membrane thereof expressing an IGS3 polypeptide. a) a nucleic acid sequence encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a coding portion of a polynucleotide consisting essentially of a biologically active portion thereof, wherein high levels of gene expression or Linked to regulatory sequences capable of driving expression in non-expressed cell types, or b) essentially consisting of a nucleic acid sequence encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a biologically active portion thereof. The coding portion of the resulting polynucleotide, such that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an endogenous gene allele encoding a protein having a biologically active portion is completely or partially inactivated. A genetically engineered human comprising reintroducing the sequence into the genome of the animal in an efficient manner. Method of creating an animal other than.