JP2004512530A - 血管活性腸管ペプチド受容体を用いて筋量または筋機能を調節する化合物を同定するための方法 - Google Patents
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Abstract
骨格筋萎縮若しくは肥大を調節する化合物、血管活性腸管ペプチド受容体(VPAC)の活性若しくは発現を調節する化合物、または血管活性腸管ペプチド(VIP)若しくはVIP類縁体の発現を調節する化合物を同定するための、スクリーニング方法を提供する。介入のための標的としてVPACを使用する、骨格筋萎縮の予防的または治療的処置のための方法について説明する。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、骨格筋の量若しくは機能を調節する候補化合物、血管活性腸管ペプチド受容体(VPAC)の活性若しくは発現を調節する候補化合物、または血管活性腸管ペプチド(VIP)若しくはVIP類縁体の発現を調節する候補化合物を同定するための方法に関する。本発明はまた、介入のための標的としてVPAC受容体を使用する、骨格筋萎縮を処置するための方法、または骨格筋肥大を誘発するための方法に関する。
【0002】
(配列表の説明)
配列表に含まれる各VPAC受容体タンパク質配列を、対応するジェンバンク受入番号およびクローン元の動物種と併せて表Iに示す。
【0003】
【表1】
【0004】
(背景)
VPACおよびリガンド
血管活性腸管ペプチド(VIP)並びにその機能的および構造的関連類縁体(VIP類縁体)は、平滑筋弛緩(気管支拡張、腸管運動)、微小血管トーン(血管抑制)および透過性の調整、粘液分泌の調整、様々な免疫機能(抗炎症、免疫細胞防護)の変調、神経影響(記憶増進、催眠、食事摂取、概日リズム制御、性的行動)、唾液腺機能の維持、発育成長の調節、およびホルモン分泌(プロラクチン、成長ホルモン、インスリン)の刺激を含め、多くの生理的機能を有することで知られている。VIPおよびVIP類縁体は、ニューロン経路(推定の神経伝達物質として)および神経内分泌経路を介して、その効果を血管活性腸管ペプチド受容体を通じて媒介する。今日までに2つのVPAC受容体が特定されている(VPAC1およびVPAC2)。VPAC1受容体は、ヒト、マウス(ハツカネズミ(Mus musculus))、ラット(ドブネズミ(Rattus norvegicus)およびクマネズミ(Rattus sp.))、ブタ(イノシシ(Sus scrofa))、カエル(ワライガエル(Rana ridibunda))、キンギョ(Carassius auratus)、およびシチメンチョウ(Meleagris gallopavo)をクローン元としてきた。VPAC2受容体は、ヒト、マウス(ハツカネズミ(Mus musculus))、およびラット(ドブネズミ(Rattus norvegicus))をクローン元としてきた。
【0005】
VPAC1およびVPAC2受容体は、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド(PACAP)ファミリーの他のメンバに対する配列相同性に基づいて、PACAP受容体ファミリーに分類される。PACAPファミリーの受容体は、さらにリガンド親和性に基づいて、2つのサブクラスに細分される。PACAPタイプI受容体は、VIPよりもPACAPにはるかに強い親和性を有し、一方PACAPタイプII受容体は、PACAPとVIPにほぼ等しい親和性を有する。VPAC1およびVPAC2受容体は、PACAPとVIPに同様の親和性を有するので、PACAPタイプII受容体として分類される。選択的作動薬および拮抗薬は、PACAPタイプI受容体同様に、分子的かつ薬理的にVPAC1およびVPAC2受容体を区別することができる。これらの作動薬および拮抗薬は、生物活性を特定のVPAC受容体サブクラスに合致させるのに有用であった。
【0006】
VPAC1およびVPAC2受容体は、共にGタンパク質結合受容体(GPCR)クラスに属する。VPAC1およびVPAC2受容体の、特定のGタンパク質への結合の特異性は、検査する組織によって異なるように思われる。筋肉などの組織では、VPAC1またはVPAC2受容体の作動薬活性化が、アデニル酸シクラーゼのGαs活性化をまねく。アデニル酸シクラーゼは、cAMPの形成に触媒作用を及ぼし、それが次には、タンパク質キナーゼAの活性化、細胞内カルシウム放出、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPキナーゼ)活性化を含む、多数の効果を有する。他の研究では、VPAC受容体の作動薬活性後の細胞内イノシトール3リン酸合成の強化が、GαiまたはGαqに結合するVPAC受容体を示唆する。
【0007】
VPAC1およびVPAC2受容体の発現は組織特異性であり、各受容体の発現パターンには差異がある。ヒトでは、VPAC1受容体は、脳、脂肪、肝臓、および心臓で発現され、VPAC2受容体は、肺、膵臓、脳、腎臓、骨格筋、胃、心臓、および胎盤で発現することがわかっている。ラットでは、VPAC1受容体の発現は、松果腺、小腸、肝臓、脾臓、膵臓、肺、大動脈、輸精管、および脳で見られ、VPAC2受容体の発現は、胃、腸、骨格筋、脾臓、膵臓、胸腺、副腎、心臓、肺、大動脈、脳、下垂体、および嗅球で見られる。
【0008】
骨格筋萎縮および肥大
骨格筋は、仕事のための生理的要求または代謝的需要の変化に容易に適合する塑性組織である。肥大は、骨格筋量の増加を指し、骨格筋萎縮は、骨格筋量の減少を指す。急性の骨格筋萎縮は、手術、ベッド休養、または骨折による不使用;脊髄損傷、自己免疫疾患、または感染病による神経除去/神経損傷;無関係条件に対する糖質コルチコイド使用;感染または他の原因による敗血症;病気または飢餓による栄養制限;および宇宙旅行を含めて、様々な原因を追跡可能であるが、これに限るものではない。骨格筋萎縮は、正常な生物学的プロセスを通じて起こるが、ある医療状況では、この正常な生物学的プロセスが衰弱レベルの筋萎縮を引き起こす。例えば、急性の骨格筋萎縮は、整形外科的処置に付随するものを含め、患者の運動抑制状態からのリハビリテーションにおける顕著な制限を与えるが、これに限るものではない。このような場合、骨格筋萎縮を改善するのに必要なリハビリテーション期間は、しばしば、本来の損傷を修復するのに要する期間よりもはるかに長くなる。このような急性の不使用萎縮は、永久的な障害および早死にをまねくことがあるので、既に筋機能および筋量にかなりの加齢性欠損を患っている可能性のある高齢者では特に問題となる。
【0009】
骨格筋萎縮はまた、癌性悪液質、慢性炎症、AIDS性悪液質、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、うっ血性心不全、遺伝病(例えば筋ジストロフィー)、神経変性病、筋肉減少症(年齢に関係する筋肉の喪失)など、慢性的な状態にも起因することがある。これらの慢性状態では、骨格筋萎縮が運動能力の早期喪失をまねき、その結果、疾病関連発症率を増加させる可能性がある。
【0010】
骨格筋の萎縮または肥大を制御する分子的プロセスについては、ほとんど知られていない。骨格筋萎縮を開始させる引き金となるものは、様々な萎縮開始事象に関して異なるが、患部の骨格筋線維では、タンパク質合成の減少およびタンパク質分解の増加、ならびに遅線維(きわめて酸化的な代謝/遅い収縮性タンパク質イソ型)から速線維(きわめて解糖的な代謝/速い収縮性タンパク質イソ型)への転換の収縮性および代謝性酵素タンパク質アイソザイム特徴における変化を含め、いくつかの共通する生化学的変化が生じる。発生する骨格筋での他の変化には、脈管構造の喪失および細胞外マトリックスの再構築が含まれる。速攣縮筋および遅攣縮筋は、相対的な筋肉喪失が特定の萎縮刺激または条件に依存する適切な条件下で、萎縮を実証する。重要なことは、これらの変化すべてが調和して調節され、生理的および代謝的需要の変化に応じて始動または停止することである。
【0011】
萎縮および肥大が生じるプロセスは、哺乳類種にわたって維持されている。多数の研究により、萎縮時に、げっ歯類とヒトで同一の基本的な分子的、細胞的、および生理的プロセスが起こることが実証されている。従って、骨格筋萎縮のげっ歯類モデルをうまく利用して、ヒトの萎縮反応が理解および予測されてきた。例えば、げっ歯類とヒトの両方で様々な手段によって誘発される萎縮は、筋肉の解剖学的構造、断面積、機能、線維タイプ転換、収縮性タンパク質の発現、および組織学的に同様の変化をもたらす。加えて、いくつかの薬剤が、げっ歯類とヒトの両方で骨格筋萎縮を調節することが実証されている。これらの薬剤としては、タンパク質同化ステロイド、成長ホルモン、インスリン様成長因子I、およびβアドレナリン作動薬が挙げられる。総合して、これらのデータは、骨格筋萎縮がげっ歯類とヒトで共通の機構に起因することを実証している。
【0012】
いくつかの薬剤が骨格筋萎縮を調節することがわかり、この徴候に関するヒトでの使用を承認されているが、これらの薬剤は、心筋肥大、腫瘍形成、多毛症、女性の男性化、疾病率および死亡率の増加、肝臓障害、低血糖症、筋骨格系疼痛、組織膨張の増加、頻脈、浮腫など、望ましくない副作用を有する(医師用卓上参考書(Physicians Desk Reference)第54版、2000年)。現在、急性または慢性の骨格筋萎縮のための、きわめて有効かつ選択的な処置が存在しない。従って、骨格筋萎縮を調節する他の治療用薬剤の同定が必要とされている。
骨格筋萎縮の処置で使用する化合物の同定に関する問題の1つは、そのような化合物を同定するための優れたスクリーニング方法がないことであった。本出願人らは、VPAC1およびVPAC2受容体が、骨格筋の量または機能の調節に関与し、VPAC1およびVPAC2受容体の作動薬が、骨格筋萎縮を阻止、かつ/または骨格筋の肥大を誘発することを見出した。
【0013】
(発明の概要)
本発明は、骨格筋萎縮の処置で潜在的に有用、および/または骨格筋肥大の誘発に有用な候補化合物を同定するための、VPAC受容体の使用に関する。特に、本発明は、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するための生体外の方法を提供する。本発明の一実施形態では、この方法は、VPAC受容体に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体に結合するかどうかを決定する工程とを含み、VPAC受容体に結合する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する。本発明の他の実施形態では、この方法は、VPAC受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体を活性化するかどうかを決定する工程とを含み、VPAC受容体を活性化する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する。本発明のさらに他の実施形態では、この方法は、さらに候補化合物のリストを作成する工程を含む。
【0014】
他の態様では、本発明は、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物を同定するための、VPAC受容体の使用に関する。特に、本発明は、VPAC受容体に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体に結合するかどうかを決定する工程と、前の工程でVPAC受容体に結合すると決定された試験化合物またはVPAC受容体に結合することが予めわかっている化合物を非ヒト動物に投与する工程と、試験化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含む方法を提供する。骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。本発明の他の実施形態では、この方法は、VPAC受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体を活性化するかどうかを決定する工程と、前の工程でVPAC受容体を活性化すると決定された試験化合物またはVPAC受容体を活性化することが予めわかっている化合物を非ヒト動物に投与する工程と、試験化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含む。生体内で骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0015】
本発明は、さらに、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するための方法を提供する。これらの方法は、(i)機能的VPAC受容体を発現する細胞を、受容体を脱感作するのに十分な作動薬の濃度および作動薬−受容体暴露期間で、VPAC受容体作動薬に接触させる工程と、(ii)試験化合物に細胞を接触させる工程と、(iii)VPAC受容体の活性化レベルを決定する工程とを含む。本発明の前述の実施形態では、工程(ii)は、工程(i)の前または後に実施することができる。特定の一実施形態では、本発明は、VPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる候補化合物を、単独でまたはVPAC受容体作動薬と組み合わせて非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するために使用できるかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0016】
本発明は、さらに、VPAC受容体遺伝子調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に試験化合物を接触させる工程と、レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含む、VPAC受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するための方法を提供する。レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、VPAC受容体の発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の一実施形態では、本発明は、VPAC受容体の発現を増加させる候補化合物を非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するために使用できるかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0017】
その他の実施形態では、本発明は、VPAC受容体に特異的な抗体を提供する。特に、本発明は、VPAC受容体に特異的なキメラ抗体またはヒト抗体を提供する。
【0018】
本発明は、さらに、VIPまたはVIP類縁体遺伝子調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に試験化合物を接触させる工程と、レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含む、VIPまたはVIP類縁体の発現を増加させる化合物を同定するための方法を提供する。レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、VIPまたはVIP類縁体の発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の一実施形態では、本発明は、VIPまたはVIP類縁体の発現を増加させる候補化合物を非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0019】
本発明はまた、骨格筋の量または機能を増加させるための治療用標的としてのVPAC受容体の使用に関する。この使用には、骨格筋の量または機能を増加、および/または骨格筋萎縮を処置するための、VPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化合物、またはVIP類縁体の発現を増加させる化合物の使用が含まれる。特に、本発明は、骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体で骨格筋の量または機能を増加させるための方法であって、骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体を特定する工程と、その被験体に、安全かつ有効な量の、VPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化号物、またはVIP類縁体の発現を増加させる化合物を投与する工程とを含む方法を提供する。その他の実施形態では、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で骨格筋萎縮を処置する方法であって、その被験体に、有効な量のVPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化合物、またはVIP類縁体の発現を増加させる化合物を投与する工程を含む方法を提供する。
【0020】
本発明はまた、骨格筋の量または機能を増加、および/または骨格筋萎縮を処置するための、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物の使用に関する。特に、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で、骨格筋萎縮を処置する方法であって、安全かつ有効な量の、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物を、単独でまたはVPAC受容体作動薬と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。
【0021】
(詳細な説明)
I.用語および定義
以下は、本明細書で使用する用語に関する定義の一覧である。
「作動薬」とは、受容体を活性化するいかなる化合物をも意味する。
「対立形質の変異型」とは、所与の遺伝子または遺伝子生成物の変異形態を意味する。多数の遺伝子が個体群中に2つまたはそれ以上の対立形態で存在し、多数の対立遺伝子を有する遺伝子もあることが、当技術の習熟者には認識されている。
【0022】
「抗体」とは、その文法的な様々な形において、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を意味する。「精製抗体」とは、それが生来付随するタンパク質および自然発生有機分子から、部分的または完全に分離された抗体を意味する。好ましくは、乾燥重量で少なくとも60%抗体、より好ましくは少なくとも75%抗体、さらに好ましくは少なくとも90%抗体、最も好ましくは少なくとも99%抗体を調製する。
「結合親和性」とは、リガンドが受容体と相互作用する傾向を意味し、特異的なVIPリガンド−VPAC相互作用に関する解離定数に反比例する。解離定数は、標準的な飽和、競合、若しくは動的結合技術を介して直接的に、または機能的アッセイおよびエンドポイントに関する薬理学的技術を介して間接的に測定することができる。
【0023】
「キメラ抗体」とは、2つまたはそれ以上の異なる抗体分子由来、すなわち異なる動物種由来の構造要素を含有する抗体を意味する。キメラ抗体には、「ヒト化抗体」として知られる抗体が含まれるが、これに限るものではなく、これには相補的決定領域移植として知られる技術によって生成されるキメラ抗体が含まれるが、これに限るものではない。
「融合」とは、1つのハイブリッドタンパク質をコード化するように、作用可能に結合する2つまたはそれ以上のDNAコード配列を意味する。従って、「融合タンパク質」とは、そのようなハイブリッドタンパク質を指す。
「阻害」とは、特定のプロセスまたは活性を部分的または完全に阻止することを意味する。例えば、完全または部分的に筋萎縮を妨げる場合、その化合物は、骨格筋萎縮を阻害する。
【0024】
本明細書で使用する時、2つのDNA配列は、その間の連鎖の性質が、(1)フレームシフト変異の移入を引き起こさず、(2)プロモーター領域がコード配列の転写を方向づける能力に干渉せず、または(3)対応するRNA転写産物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合に、「作用可能に結合する」と言われる。例えば、コード配列および調節配列は、コード配列の転写を調節配列の影響下または制御下におくようにそれらが共有結合する時に、作用可能に結合する。従って、プロモーター領域は、得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳できるように、そのDNA配列の転写をもたらすことができる時には、コード配列と作用可能に結合する。
「PACAP」とは、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドを意味する。
【0025】
「パーセント同一性」とは、以下のように計算される、2つの配列が共通に有するヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率を意味する。特異的配列(クエリー)のパーセント同一性を計算するには、ジェネティクスコンピュータグループ社(Genetics Computer Group, Inc.)から入手可能なベストフィット(BestFit)比較コンピュータプログラムである、ウィスコンシンパッケージ(Wisconsin Package)、バージョン10.1を用いて、クエリー配列の関連部分をリファレンス配列と比較する。このプログラムは、スミス(Smith)およびウォーターマン(Waterman)の、応用数学の進歩(Advances in Applied Mathematics)、第2号:482〜489(1981年)のアルゴリズムを使用する。パーセント同一性は、ベストフィットプログラムに関する以下の初期設定パラメータで計算する:スコアリングマトリックス(scoring matrix)がblosum62.cmp、ギャップクリエーションペナルティ(gap creation penalty)が8、ギャップエクステンションペナルティ(Gap extension penalty)が2。配列をリファレンス配列と比較する時には、クエリー配列の関連部分は、VPAC配列由来のものになる。例えば、クエリーがVPAC/精製タグ融合タンパク質の場合、パーセント同一性スコアを計算するために、配列のVPACポリペプチド部分だけを整合させる。
【0026】
「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾(例えば、リン酸化反応またはグリコシル化)に関わらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。
「プロモーター」とは、転写の開始、および遺伝子またはコード領域からの転写速度を制御するDNA配列を意味する。
「予防的処置」とは、現時点では骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体の、骨格筋萎縮の発生を完全にまたは部分的に阻止するための防止的な処置を意味する。本明細書の背景の項で説明したように、骨格筋萎縮の恐れのある人がいることが当技術の習熟者には認識されよう。さらに、骨格筋萎縮をまねく生化学的変化を適切に調節すれば、その危険のある個人での萎縮の発生が防止または低減されることが、当技術の習熟者には認識されよう。
「調節」とは、文法的なすべての形において、増加、減少、または維持することを意味し、例えば骨格筋の量または機能を調節するとは、骨格筋の量または機能のレベルを増加、減少、または維持することを意味する。
【0027】
「骨格筋の量または機能の調節」には、骨格筋量の調節、骨格筋機能の調節、またはその両方が含まれる。
「調節要素」とは、作用可能に結合するDNA配列からの転写のレベルを制御できるDNA配列を意味する。調節要素のこの定義には、プロモーターおよびエンハンサーが含まれる。例えば、VPAC受容体遺伝子調節要素とは、VPAC受容体遺伝子からの転写レベルを制御できるDNA配列である。
「レポーター遺伝子」とは、その生成物を好ましくは定量的に検出できるコード配列を意味し、レポーター遺伝子は、測定すべき信号に応答性のある異種プロモーターまたはエンハンサー要素と作用可能に結合する。この状況でのプロモーターまたはエンハンサー要素は、本明細書では「応答要素」と呼ぶ。
【0028】
「選択的作動薬」とは、作動薬が、ある受容体(類)に、他の受容体に比べて顕著に大きい活性を有することを意味するもので、それが他の受容体に関して完全に不活性であることではない。
「骨格筋肥大」とは、骨格筋量の増加、骨格筋機能の増加、またはその両方を意味する。
「骨格筋萎縮」とは、「筋消耗」と同一で、骨格筋量の減少、骨格筋機能の低下、またはその両方を意味する。
「スプライス変異型」とは、代替的なエクソン使用の結果得られるmRNAまたはタンパク質を意味する。細胞のタイプに応じて、または単一の細胞タイプ内でさえ、mRNAがわずかに異なる形態でスプライス変異型として発現されることがあり、従って発現されるmRNAに応じて、翻訳されるタンパク質が異なることが当技術の習熟者には認識されている。
【0029】
物質の「治療的に有効な量」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳類における許容可能な利益対危険比で、処置を受ける被験体で医学的に望ましい結果、例えば骨格筋萎縮の軽減、骨格筋量または骨格筋機能の増加を実現することのできる量である。
「治療的処置」とは、筋量または筋機能の増加が望まれる被験体の処置を意味する。例えば、既に発生した骨格筋萎縮を部分的または完全に改善、またはさらなる骨格筋萎縮の発生を完全または部分的に阻止するための、現在骨格筋萎縮の徴候を示す被験体の処置が、その被験体の治療的処置である。「治療的処置」という用語は、また、例えば、骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体に骨格筋肥大を誘発させる処置、例えば筋量を増加させるための家畜動物の処置を含む。
【0030】
「処置」という用語は、予防的または治療的処置を意味する。
「VIP」は、血管活性腸管ペプチドを意味する。
「VIP類縁体」は、VPAC受容体のリガンドとして作用するポリペプチドを意味する。好ましいVIP類縁体は、PACAP−27、PACAP−38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド(PHI)、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド(PHV)、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15、Arg21)VIP、[(Arg15、20、21Leu17)−VIP−Gly−Lys−Arg−NH2]、[K15、R16、L27、VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25−1553、Ro25−1392、またはPACAP(6−38)である。より好ましいVIP類縁体は、VIP、PACAP−27、PACAP−38、PHI、PHV、Ro25−1553、Ro25−1392、および[K15、R16、L27、VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]である。
【0031】
「VPAC受容体作動薬」とは、VPAC1若しくはVPAC2受容体、またはその両方を活性化することのできる化合物または分子を意味する。VPAC受容体の活性化は、本明細書で以下に説明するように測定することができる。
本明細書で用いるVPAC受容体に関する専門用語は、ハーマー(Harmar)らの薬理学総説(Pharmacological Reviews)(1998年)50(2):265〜270で提案された規約に従う。
「VPAC受容体」とは、VPAC1受容体またはVPAC2受容体を意味する。
【0032】
「VPAC1受容体」とは、任意の動物種由来のVPAC1受容体を意味する。VPAC1受容体は、これまでに、「VIP受容体」、「VIP1受容体」(ラッツ(Lutz)ら、FEBS Lett(1993年)334:3−8)、「VIP/PACAPタイプII受容体」(チッカレリ(Ciccarelli)ら、Regul Pept(1994年)54:397−407)、「HIVR」または「ヒト腸VIP受容体」(A・クービノー(Couvineau)ら、生化学・生物理学研究通信(Biochem. Biophys. Res. Commun.)(1994年)200(2)、769−776)、および「PVR2」(ローリングス(Rawlings)ら、内分泌学(Endocrinology)(1995年)136:2088−2098)と呼ばれてきた。
【0033】
VPAC1受容体の定義には、それに関するcDNAまたは受容体をコード化するゲノム配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これに限るものではない。これらの配列には、受入番号L13288、X75299、M86835、NM_011703、U49434、AF100644、I28734、U31991(部分的cDNA配列)、U56391、E05551、および806702が含まれる。これらのVPAC1受容体のタンパク質配列は、これらのDNA配列のコード領域を翻訳することによって得られ、一般にデータベース登録の一部分として利用可能である。
「VPAC2受容体」とは、任意の動物種由来のVPAC2受容体を意味する。VPAC2受容体はまた、「VIP2」(ラッツ(Lutz)ら、1993年)、「PACAPR−3」(イナガキ(Inagaki)ら、Proc Natl Academy Sci USA(1994年)91:2679−2683)、および「PVR3」(ローリングス(Rawlings)ら、内分泌学(Endocrinology)(1995年)136:2088−2098)とも呼ばれてきた。
【0034】
VPAC2受容体の定義には、それに関する受容体をコード化するDNA配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これに限るものではない。これらの配列には、受入番号X95097、L40764、L36566、Y18423、U18810、D28132、Z25885、U09631、およびA43808が含まれる。これらのVPAC2受容体のタンパク質配列は、これらのDNA配列のコード領域を翻訳することによって得られ、一般にデータベース登録の一部分として利用可能である。
【0035】
「VPAC受容体」という用語には、欠損型および/または変異型タンパク質が含まれ、リガンド結合または信号伝達に必要のない受容体分子の領域は、削除または修飾されてきた。例えば、主要なアミノ酸配列に1つまたはそれ以上の同類変化を有するVPAC受容体が本発明で有用であることが、当技術の習熟者には認識されよう。特定のアミノ酸の、同様の構造または特性を有する異なるアミノ酸による置換(同類置換)が、静止変化(silent change)、すなわち、機能を顕著に変えない変化を引き起こす可能性があることが、当該技術分野で公知である。同類置換は、当該技術分野では周知である。例えば、GPCRは、膜貫通型αヘリックス中のアミノ酸残基の置換を許容でき、これは他の疎水性アミノ酸と共に脂肪の方を向き、機能性を残すものである。欠損および/または同類アミノ酸置換などの変異により自然発生する配列とは異なるVPAC1受容体は、VPAC1受容体の定義に含まれる。欠損および/または同類アミノ酸置換などの変異により自然発生する配列とは異なるVPAC2受容体は、VPAC2受容体の定義に含まれる。
【0036】
当技術の習熟者には、また、上述した以外の種、特に哺乳類種由来のVPAC受容体が本発明で有用であることも認識されよう。当技術の習熟者には、さらに、公知のVPAC種の配列からのプローブを使用することによって、cDNAまたは公知の配列に相同なゲノム配列が、公知のクローニング方法によって同じまたは代替的な種から得られることがあることも認識されよう。このようなVPAC1受容体は、VPAC1の定義に含まれ、このようなVPAC2受容体は、VPAC2の定義に含まれる。
加えて、当技術の習熟者には、VPAC受容体の対立形質変異型またはスプライス変異型が特定の種に存在する可能性があり、これらの変異型が本発明で有用であることが認識されよう。このようなVPAC1受容体の変異型は、VPAC1の定義に含まれ、このようなVPAC2受容体の変異型は、VPAC2の定義に含まれる。
【0037】
VPAC1若しくはVPAC2受容体ポリペプチド、またはVPAC1若しくはVPAC2受容体ポリペプチド断片の、非VPACポリペプチドとの融合体は、VPAC受容体融合タンパク質と呼ばれる。公知の方法を用いて、当技術の習熟者には、VPAC1受容体またはVPAC2受容体の融合タンパク質を製造することができ、これは、天然のVPAC1およびVPAC2受容体とは異なるが、本発明での有用性を残している。VPAC1受容体融合タンパク質は、VPAC1受容体の定義の範囲に含まれ、VPAC2受容体融合タンパク質は、VPAC2受容体の定義の範囲に含まれる。
「機能的VPAC受容体」とは、生体内または生体外で、VIPまたはVIP類縁体に結合するVPAC受容体を指し、リガンド結合の結果として活性化する。
【0038】
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、タンパク質化学、薬理学、または分子生物学の技術者に一般に理解されているのと同一の意味を有する。本明細書で述べる、方法、材料、および実施例は、制限的なものではない。本明細書に記載のものと同様または等価の、他の方法および材料は、本発明の実施または試験で使用することができる。
【0039】
II.骨格筋量の調節におけるVPAC受容体の役割
本発明を利用すると、従来技術における情報が得られ、以下のことが教示されることが、当技術の習熟者には認識されよう。本明細書の結果は、VPAC受容体の作動薬が、骨格筋肥大を誘発、並びに/または神経除去、不使用、および副腎皮質ホルモンによって誘発される骨格筋萎縮を阻害することを示しており、従って骨格筋萎縮プロセスにおけるVPAC受容体の調節的役割または機能が実証される。理論に縛られることを意図しないが、VPAC受容体作動薬が骨格筋萎縮および肥大に及ぼす効果は、筋肉細胞への直接的な効果によるものと考えられている。ただし、この効果を、全体または一部分で、作動薬の非筋肉組織への分泌促進効果を通じて媒介することも可能である。
【0040】
生体内でのVPAC受容体の固有の役割を、PACAP受容体、VPAC1受容体、またはVPAC2受容体のいずれかに対して選択的な作動薬である薬理学的薬剤を用いて、以下に説明される骨格筋萎縮の様々なモデルで調査した。使用した選択的作動薬には、PACAP−38(VPAC1/VPAC2/PAC1受容体には非選択的)(バッケムバイオサイエンス社(Bachem Biosciences Inc.)(ペンシルベニア州キングオブプルシア);グーレット(Gourlet)、バートンゲン(Vertongen)らの、ペプチド(Peptides)18(1997年)403〜408の方法に従って合成された[K15、R16、L27、VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](PACAP38と同様の効力を有するVPAC1受容体選択的作動薬);およびシンペップ社(Synpep Inc.)(カリフォルニア州ダブリン)から購入したRo25−1553(PACAP38と同様の効力を有するVPAC2受容体選択的作動薬)が含まれる。使用前に、薬剤を、HPLCによって純度に関して、質量分析法によって組成物に関して調べた。これらの薬剤は、科学文献(グーレット(Gourlet)、ヴァンダーミアズ(Vandermeers)らの、ペプチド(Peptides)18(1997年)1539〜1545;グーレット(Gourlet)、バートンゲン(Vertongen)らの、ペプチド(Peptides)18(1997年)403〜408;ゴーゼス(Gozes)らの、現代医療化学(Curr. Med. Chem.)6(1999年)1019〜1034)で十分に特徴付けられ、記載されてきた。
【0041】
図1〜5は、VPAC1またはVPAC2受容体のための作動薬の投与が、統計的に有意に、骨格筋萎縮の阻害、または肥大の誘発を引き起こすことを実証する、実験の結果を示す。VPAC1またはVPAC2受容体作動薬を、1日に2回、テオフィリンと組み合わせて投与すると、骨格筋萎縮の動物モデルで骨格筋萎縮が阻害された。テオフィリンは、VPAC1およびVPAC2受容体作動薬の作用の期間および大きさを増強するために添加され、従ってこれらの化合物の有効性が高められる。これらの萎縮モデルにテオフィリンを単独で投与しても効果はなく、VPAC1およびVPAC2受容体作動薬をテオフィリンと組み合わせた抗萎縮効果が、VPAC受容体作動薬の効果によるものであることが実証された。さらに、浸透性ミニポンプを介して、テオフィリンを含まずに、VPAC1およびVPAC2受容体作動薬を連続投与すると、やはり骨格筋萎縮が阻害、および/または骨格筋肥大が引き起こされた。
【0042】
具体的には、図1は、VPAC1受容体選択的作動薬である、[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](VPAC1R作動薬)、VPAC2受容体選択的作動薬である、Ro25−1553(VPAC2R作動薬)、またはVPAC1/VPAC2受容体非選択的作動薬である、PACAP−38を利用したマウス神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、1日に2回、図1Aおよび1Bに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。これらの作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した(VPAC受容体作動薬によって誘発されたcAMP信号の作用の大きさおよび期間を増加させるために含める)。9日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、非特異的VPAC受容体作動薬であるPACAP−38が、神経除去した前脛骨筋(図1A)および内側腓腹筋(図1B)の萎縮を阻害することが実証された。VPAC1受容体選択的作動薬である[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]は、神経除去した内側腓腹筋(図1B)の萎縮を阻害した。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、神経除去した前脛骨筋(図1A)および内側腓腹筋(図1B)の萎縮を阻害した。この結果の統計的有意性は、ANCOVA(ダグラス・C・モンゴメリ(Douglas C. Montgomery)の、実験の設計と分析(Design and Analysis of Experiments)、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley and Sons)(ニューヨーク)(第2版、1984年))を用いて決定した。
【0043】
図2は、VPAC1受容体選択的作動薬である、[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](VPAC1R作動薬)、VPAC2受容体選択的作動薬である、Ro25−1553(VPAC2R作動薬)、またはVPAC1/VPAC2受容体非選択的作動薬である、PACAP−38を利用したマウス神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスに、実験期間の終わりまで、ALZeT浸透性ミニポンプを用いた5μl/時間の連続注入によって、上述の薬剤または対照ビヒクル(生理食塩水)を投薬した。薬剤の1日の供給量は、図2Aおよび2Bに示す通りである。ミニポンプの埋め込みは、坐骨神経摘出と同時に実施した。9日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、神経除去した前脛骨筋(図2A)の萎縮を阻害した。加えて、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、神経除去していない(対照)前脛骨筋(図2A)および内側腓腹筋(図2B)の肥大を誘発した。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0044】
図3は、VPAC1受容体選択的作動薬である、[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](VPAC1R作動薬)、VPAC2受容体選択的作動薬である、Ro25−1553(VPAC2R作動薬)、またはVPAC1/VPAC2受容体非選択的作動薬である、PACAP−38を利用したマウスの糖質コルチコイド誘発性萎縮研究の結果を示す。糖質コルチコイドであるデキサメタゾンを飲用水に添加後(1.2mg/kg/日)に、オスのマウスの肩甲骨間領域に、1日に2回、図3Aおよび3Bに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。これらの作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した。VPAC受容体作動薬およびデキサメタゾンの投与開始から9日で、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、非特異的VPAC受容体作動薬であるPACAP−38が、糖質コルチコイド投与によって誘発される内側腓腹筋の萎縮を阻害することが実証される(図3B)。VPAC1受容体選択的作動薬である[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]は、糖質コルチコイド投与によって誘発された前脛骨筋の筋萎縮を阻害した(図3A)。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、糖質コルチコイド投与によって誘発された前脛骨筋(図3A)および内側腓腹筋(図3B)の筋萎縮を阻害した。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0045】
図4は、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553(VPAC2R作動薬)を利用した、マウスの不使用(キャスト固定)萎縮研究の結果を示す。右後肢のキャスト固定後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、1日に2回、図4Aおよび4Bに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。VPAC2R作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した。9日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、前脛骨筋(図4A)の不使用誘発性萎縮を阻害した。加えて、Ro251553は、内側腓腹筋の肥大を誘発した。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0046】
図5は、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553(VPAC2R受容体)を利用した、ラットの神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのラットの肩甲骨間領域に、1日に2回、図5Aおよび5Bに記載の用量でVPAC2R受容体作動薬のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。VPAC2R受容体作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した。9日目に、前脛骨筋および足の長指伸筋(EDL)を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553が、神経除去した前脛骨筋(図5A)およびEDL筋(図5B)の萎縮を阻害することが実証された。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0047】
III.VPAC受容体、VIPまたはVIP類縁体、あるいはVPAC受容体を発現する細胞株の調製
VPAC1受容体、VPAC2受容体、VIPおよびVIP類縁体は、抗体の生成、本発明のスクリーニングアッセイでの試薬としての使用、および骨格筋萎縮の処置のための医薬品試薬としての使用を含めて、様々な使用に関して調製することができるが、これに限るものではない。本発明の特定の実施形態には、精製ポリペプチドが最も有用であり、他の実施形態には、ポリペプチドを発現する細胞株が最も有用であることが、当技術の習熟者には明白である。例えば、VPAC受容体の構造的及び機能的特徴を保持することが重要な状況、例えばVPAC受容体を活性化する候補化合物を同定するスクリーニング方法では、機能的VPAC受容体を発現する細胞を使用することが望ましい。
【0048】
VIPおよびVIP類縁体が短鎖ポリペプチドであるので、これらのポリペプチドが、組換え手段によってではなく、当該技術分野で周知の技術を用いて直接合成によって最も好都合に得られることが当技術の習熟者には認識されよう。加えて、これらの分子の多くが市販されている。
VPAC受容体源がポリペプチドを発現する細胞株である場合、細胞は、例えば内生的にVPAC受容体を発現させることができ、内生VPAC受容体の発現を増加させるように刺激され、またはVPAC受容体を発現するように遺伝子操作されてきた。細胞株が対象のポリペプチドを発現するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、適切な抗体によるポリペプチドの検出、タンパク質をコード化するmRNAを検出するためのDNAプローブの使用(例えば、ノーザンブロットまたはPCR技術)、または対象のポリペプチドに選択的な薬剤の結合の測定(例えば、放射性同位体標識した選択的作動薬)がある。
【0049】
VPAC1、VPAC2、またはこれらのポリペプチドを発現する細胞株の調製で組換えDNA技術を用いることが、特に企図されている。このような組換え方法は、当該技術分野では周知である。組換えVPAC1またはVPAC2受容体を発現するには、1つまたはそれ以上の調節要素の制御下で対象のポリペプチドをコード化する核酸を含む発現ベクターを調製する。いくつかの種由来のVPAC1およびVPAC2受容体をコード化するゲノムまたはcDNA配列は、ジェンバンク(GenBank)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で入手可能)に記載されており、そこから容易に入手可能である。VPAC1受容体配列に関する受入番号としては、L13288(ヒト);ヒトVPAC1受容体に関する完全な遺伝子配列を併せて構築する(収集リストは806702にある)、U11079、U11080、U11081、U11082、U11083、U11084、U11085、U11086、U11087;X75299(ヒト);M86835(ドブネズミ(Rattus norvegicus));NM_011703(ハツカネズミ(Mus musculus))、U49434(イノシシ(Sus scrofa))、AF100644(ワライガエル(Rana ridibunda))、I28734(ブタ(Porcine))、E05551(クマネズミ(Rattus sp.))、およびU56391(キンギョ(Carassius auratus))が挙げられる。VPAC2受容体配列に関する受入番号としては、X95097(ヒト)、L40764(ヒト)、L36566(ヒト)、Y18423(ヒト)、U18810(ヒト)、D28132(ハツカネズミ(Mus musculus))、Z25885(ドブネズミ(Rattus norvegicus))、U09631(ドブネズミ(Rattus norvegicus))、およびA43808(ラット)が挙げられる。この公的に利用可能な配列情報を用いて、VPAC1またはVPAC2受容体をコード化する核酸分子を単離する手段の1つは、天然のDNAプローブ、または当該技術分野で周知の方法、例えば適切なライブラリからの配列のPCR増幅によって人工的に合成したDNAプローブによる、ゲノムDNAまたはcDNAライブラリのスクリーニングである。その他の方法は、対象の受容体に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、特定の組織(骨格筋など)から単離されたmRNAから、直接的にcDNAをPCR増幅することである。このように単離されたmRNAは、市販されている。当技術の習熟者には、さらに、公知のVPAC受容体配列の一部分に対応する核酸プローブを使用することによって、相同なcDNAまたは他の種からのゲノム配列を、公知の方法を用いて得ることができることも認識されよう。本発明の方法に特に有用であるのは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル、チンパンジー、マーモセット、イヌ、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、ニワトリ、およびシチメンチョウを含めた種由来のVPAC受容体であるが、これに限るものではない。次いで、当該技術分野で周知の方法によって、対象のVPAC受容体をコード化する単離核酸分子を、適切な発現ベクターに連結させる。このようにして調製される発現ベクターが宿主細胞中で発現し、受容体を発現する宿主細胞は、スクリーニングアッセイで直接的に使用されるか、または、受容体を発現する宿主細胞から受容体を単離し、単離された受容体をスクリーニングアッセイで使用する。
【0050】
本発明の目的で使用できる宿主発現ベクター系としては、VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換させた細菌(例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B.subtilis))などの微生物;VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換え酵母発現ベクターによって形質転換させた酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピヒア(Pichia));VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス(baculovirus))で感染させた昆虫細胞系;VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス)で感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)によって形質転換させた植物細胞系;または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)若しくは哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、レトロウイルスLTR)を含有し、さらにVPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換え発現構造を有する哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、HEK293、NIH3T3)が挙げられるが、これに限るものではない。
【0051】
宿主細胞を用いて、対象のポリペプチドを産生する。VPAC受容体は膜結合分子であるので、宿主細胞膜から精製、またはVPAC受容体を細胞膜中に固定して使用、すなわち、細胞全体または細胞の膜断片を使用する。このような発現系からのVPAC受容体の精製または濃縮は、当技術の習熟者に周知の方法によって、適切な界面活性剤または脂質ミセルを用いて達成される。
細菌系では、多数の発現ベクターが、発現する遺伝子生成物に意図される用途に応じて有利に選択される。例えば、VPAC受容体に対する抗体の生成のためにこのようなタンパク質を大量に産生する時には、高レベルのタンパク質生成物の発現を導くベクターが望ましい。当技術の習熟者は、このようなベクター構成を生成し、融合タンパク質選択的カラムや抗体カラムなどの選択的な精製技術、および非選択的精製技術を含めた様々な方法によって、タンパク質を精製することができる。
【0052】
昆虫タンパク質発現系では、バキュロウイルスA.カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcNPV)は、ヨトウガ(S.frugiperda)細胞で異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。この場合、VPAC受容体ヌクレオチド配列は、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、AcNPVプロモーターの管理下に置かれる。次いで、組換えウイルスを使用して、挿入した遺伝子を発現させる細胞を感染させ、当技術の習熟者に公知の多くの技術のうちの1つによってタンパク質を精製する。
【0053】
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を使用することができる。これらの発現系の使用には、しばしば、挿入したヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために、ベクター中で特定の開始信号を形成する必要がある。これは、内生的な開始信号を含まないVPAC受容体遺伝子の一部分を使用する場合に、特に重要である。挿入したヌクレオチド配列のコード領域の枠内でのこの開始信号の配置、ならびに転写および翻訳促進要素の添加、および組換えタンパク質の精製は、当技術の習熟者に公知の多くの方法の1つによって達成される。哺乳類宿主細胞では、組換えタンパク質の必須な翻訳後修飾ができる適切な細胞タイプを選択することも重要である。このような修飾、例えば、開裂、リン酸化反応、グリコシル化などには、修飾酵素を含有する適切な宿主細胞の選択が必要である。このような宿主細胞としては、CHO、HEK293、NIH3T3、COSなどが挙げられるが、これに限るものではなく、当技術の習熟者には公知である。
【0054】
長期的で組換えタンパク質の高い発現には、安定な発現が好ましい。例えば、安定してVPAC受容体を発現する細胞株が作りだされてもよい。当技術の習熟者は、電気穿孔法、リン酸カルシウムトランスフェクション、またはリポソーム媒介トランスフェクションなどの公知の方法に従って、安定してVPAC受容体を発現する細胞株を生成することができる。これは、通常、適切な発現制御要素(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写終止端配列、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位など)を含む、発現ベクター、選択マーカ、および対象の遺伝子を用いて、細胞をトランスフェクションすることによって達成される。選択マーカは、対象の遺伝子として同じベクター内に含有されるか、またはVPAC配列含有ベクターと共にトランスフェクションする別個のベクター上に含有されることができる。発現ベクター中の選択マーカは、選択に対する耐性を与えることができ、細胞がベクターを安定的にその染色体に組み入れるようにし、細胞を成長させて、次にクローニングされ細胞株に拡張することができる増殖巣を形成させる。あるいは、発現ベクターにより、マーカの物理的特質を用いて選択可能マーカを発現する細胞を選択することができ、すなわち、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現により、蛍光活性細胞分類(FACS)分析を用いてマーカを発現する細胞を選択することができる。
【0055】
当技術の習熟者は、対象の遺伝子がうまく組み入れられた細胞を選択できるようにするために、トランスフェクションに適した細胞タイプを選択することができる。例えば、選択マーカが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの場合、適した細胞のタイプは、それぞれ、tk−、hgprt−、またはaprt−細胞になる。または、選択マーカが、メトトレキサート、ミコフェノリン酸、G−418、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える、それぞれdhfr、gpt、neo、またはhygroの場合、野生型細胞を使用することができる。このような組換え型細胞株は、VPAC受容体の活性に影響を及ぼす候補化合物の同定に有用である。
【0056】
IV.VPAC受容体抗体の調製
VPAC受容体の1つまたはそれ以上のエピトープを選択的に認識する抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab発現ライブラリを用いて産生される分子、トランスジェニックマウスで産生されるヒト抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)、および上述のいずれかの断片に結合するエピトープが挙げられる。治療的な使用の場合、キメラ抗体またはヒト抗体が好ましく、ヒト抗体が最も好ましい。
【0057】
抗体は、試験化合物の評価、例えばVPAC受容体ポリペプチドの不動化に関して、本明細書で説明する化合物スクリーニングスキームと組み合わせて使用でき、または、このような抗体を、遺伝子治療技術と組み合わせて使用し、細胞内で、またはこれらの遺伝子を導入する患者の組織内で直接、例えばVPAC受容体の発現を評価することができる。加えて、本発明の抗体は、骨格筋萎縮の処置で有用である。VPAC受容体に選択的な抗体は、VPAC受容体作動薬である抗体の部分集合を同定するために、本発明の方法によってスクリーニングすることができる。加えて、VIPまたはVIP類縁体に特異的な抗体に対して生成される抗イディオタイプ抗体は、VPAC受容体作動薬として有用な可能性があり、抗VPAC抗体と同様に、本発明の方法によってVPAC受容体を活性化する能力に関してスクリーニングすることができる。
【0058】
抗体の産生では、当該技術分野で周知の方法によって、VPAC、VIP若しくはVIP類縁体、抗VIP抗体、抗VIP類縁体抗体、またはこれらの免疫原性断片で注射することにより、様々な宿主動物を免疫化することができる。抗イディオタイプ抗体の調製では、免疫原は、抗VIP抗体または抗VIP類縁体抗体である。抗イディオタイプ抗体の産生については、例えば米国特許第4,699,880号に記載されており、これを参考として本明細書に組み込む。適切な宿主動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、およびウマが挙げられるが、これに限るものではない。免疫化技術は、当該技術分野で周知である。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から精製することができ、またはモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法によって生成することができる。これらの技術には、クーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)の周知のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術が含まれるが、これに限るものではない。モノクローナル抗体は、κまたはλ軽鎖を含有する、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgDを含めて、いかなる免疫グロブリンのクラスのものでもよい。
【0059】
ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性のため、ヒトの患者の治療的処置に使用する時には、非ヒト抗体に対してはキメラ抗体が好ましい。キメラ抗体を産生および使用する技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、バズワニ(Vaswani)らのアレルギー喘息免疫学年報(Ann. Allergy Asthma Immunol.)(1998年)81:105〜119、ファラー(Farah)らの真核生物遺伝子発現総評(Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression)(1998年)8(3−4):321−56、米国特許第5,807,715号、同第4,816,397号、同第4,816,567号、および同第5,824,307号に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。
【0060】
完全ヒト抗体は、非ヒト抗体よりも免疫原性が低いので、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。このような抗体を、内生免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は実質的に発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現できる、トランスジェニックマウスを用いて産生することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばVPACのすべてまたは一部分によって通常の様式で免疫化される。抗原に反する指向性のあるモノクローナル抗体は、これらの免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて得られる。この技術は、米国特許第5,874,299号、同第5,877,397号、同第5,569,825号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、および同第6,075,181号に詳細に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。ヒト免疫グロブリンをハイブリドーマ細胞の培養によって直接得る代替案として、ハイブリドーマ細胞を、その後の発現または遺伝子操作のための再配列重鎖および軽鎖部位源として使用することができる。高レベルの適切なmRNAが利用可能であるので、このような抗体産生細胞からの遺伝子の単離は、容易である。再生し、再配置した部位は、所望通りに操作することができる。例えば、一定領域をなくすか、若しくは異なるイソタイプのもので置き換えることができ、または単鎖Fv領域をコード化するために様々な領域を連結させることができる。このような技術については、PCT国際公開特許WO96/33735およびWO96/34096に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。
【0061】
V.試験化合物の選択
本発明のアッセイに従ってスクリーニングできる化合物としては、植物や動物抽出物などの天然生成物、合成化学物質、ならびにタンパク質、ランダムペプチドライブラリのメンバおよびD−またはL−型アミノ酸から成る順列組み合わせ的化学由来の分子ライブラリを含むがこれには限定されない可溶性ペプチド、ホスホペプチド(ランダムまたは部分的に変性した、指向性ホスホペプチドライブラリのメンバを含むが、これには限定されない)などのペプチド、抗体(ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、抗イディオタイプ、または単鎖抗体、ならびにFab、F(ab’)2及びFab発現ライブラリ断片、ならびにこれらのエピトープ結合断片を含むが、これには限定されない)、有機及び無機分子を含めた生物学的活性材料を含めて公知の化合物ライブラリが挙げられるが、これに限るものではない。
【0062】
試験化合物のより伝統的な供給源に加え、コンピュータモデルおよびサーチ技術により、VPACのリガンド結合部位から、または既に同定したVPAC受容体の作動薬からの構造的な情報を用いることによって、試験化合物の理論的選択が可能になる。試験化合物のこのような理論的選択により、治療用候補化合物を同定するためにスクリーニングしなければならない試験化合物の数を減らすことができる。VPAC受容体はGPCRであり、従ってVPACタンパク質配列の知識が、潜在的リガンドのスクリーニングのために使用できる結合部位のモデル生成を可能にする。このプロセスは、いくつかの様式で達成することができる。最も確固たる手法とは、テンプレート(バクテリオロドプシンまたはロドプシン結晶構造または他のGPCRモデルから得られる)へのVPAC受容体配列の配列整合の生成、アミノ酸構造の変換、および分子力学および視覚的検査によるモデルのリファイニングを伴うものである。強い配列整合を得られない場合、疎水性ヘリックスのモデル構築によって、モデルを生成することもできる。次いで、既知のロドプシン構造の一般的なレイアウトから開始する他のものに対して相対的に各ヘリックスを回転させ翻訳することによって、これらを組み合わせる。残基と残基の接触を示す変異型データも使用することができ、これらの接触が達成されるように、ヘリックスを互いに対して相対的に位置決めすることができる。このプロセス中、既知のリガンドの、ヘリックス内の結合部位空洞内へのドッキングを用いて、リガンドの結合を安定化させる相互作用を発生させることによって、ヘリックスの位置決めに役立たせることもできる。モデルは、分子力学を用いた精製、ならびに標準的な相同性モデリング技術を用いた細胞内および細胞外ループのループ構築によって完成させることができる。GPCR構造およびモデリングに関する一般的な情報は、T・シェーンベルグ(Schoneberg)らの分子および細胞内分泌学(Molecular and Cellular Endocrinology)、151(1999年)、181〜193、D・フラワー(Flower)の生物化学および生物理学公報(Biochimica et Biophysica Acta)、1422(1999年)、207〜234、およびP・M・セクストン(Sexton)の薬物の発見と開発における最新の見解(Current Opinion in Drug Discovery and Development)、2(5)(1999年)、440〜448に見ることができ、これらを参考として本明細書に組み込む。
【0063】
モデルを完成させた後は、いくつかの既存のコンピュータプログラムの1つを用いることによって、例えば潜在的リガンドのスクリーニングに使用することができる。これらの最も一般的なものは、DOCKプログラム(UCSF分子設計インスティテュート(UCSF Molecular Design Institute)(カリフォルニア州サンフランシスコ私書箱0446、パルナサスアヴェニュー533、U−64、94143−0446)である。その変異型のいくつかのものにおいては、立体的適合および結合部位への大まかな静電相補性のために、市販および/または専売化合物のデータベースをスクリーニングすることができる。しばしば、DOCKで優れた得点の分子が、リガンドになる高い可能性を有することがわかっている。使用できるその他のプログラムは、FLEXX(トライポス社(Tripos Inc.)、ミズーリ州セントルイス、サウスハンリーロード(South Hanley Rd.)1699、63144−2913 www.tripos.com)である。このプログラムはかなり遅いので、化合物のより小規模のデータベースを通す検索に通常制限されている。FLEXX内のスコアリングスキームは、より詳細にわたっており、通常、DOCKよりも結合能力の優れた推測が得られる。FLEXXは、DOCKの提案を確認するために、または既知のリガンド若しくはテンプレートから組み合わせて生成される化合物のライブラリを調査するために最もよく使用される。
【0064】
VI.骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
VPAC受容体が骨格筋萎縮を調節する役割を果たすことがわかったことで、骨格筋萎縮の予防的または治療的処置に最終的に使用することができる候補化合物を同定するための、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする様々な方法が可能になる。本発明は、VPAC受容体に結合し、VPAC受容体を活性化し、VPAC受容体若しくはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続若しくは増大させ、VPAC受容体遺伝子の発現を増加させ、またはVIP若しくはVIP類縁体遺伝子の発現を増加させる能力に関して、試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【0065】
ヒトにおいて、VPAC1受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、初期の生体外スクリーニングを、60%より多くがヒトVPAC1受容体(受入番号L13288(配列ID番号:1))の配列と同一のアミノ酸配列を有するVPAC1受容体を用いて実施することが好ましい。より好ましくは、VPAC1受容体の配列が、配列ID番号:1に70%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:1に80%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:1に90%より多くが同一である。試験化合物を、ヒトVPAC1受容体に対してスクリーニングすることが最も好ましい。非ヒト種において、VPAC1を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のVPAC1受容体を使用することが好ましい。
【0066】
ヒトにおいて、VPAC2受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、初期の生体外スクリーニングを、60%より多くがヒトVPAC2受容体(受入番号X95097(配列ID番号:10))の配列と同一のアミノ酸配列を有するVPAC2受容体を用いて実施することが好ましい。より好ましくは、VPAC2受容体の配列が、配列ID番号:10に70%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:10に80%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:10に90%より多くが同一である。試験化合物を、ヒトVPAC2受容体に対してスクリーニングすることが最も好ましい。非ヒト種において、VPAC2受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のVPAC2受容体を使用することが好ましい。
【0067】
本発明の方法は、大量処理用途を実施するが、この方法でわずか1つの試験化合物を使用することは、スクリーニングという用語に包含される。VPAC受容体を活性化し、VPAC受容体若しくはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続若しくは増大させ、VPAC受容体遺伝子の発現を増加させ、またはVIP若しくはVIP類縁体遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、本発明の方法によって決定されるように、本明細書では「候補化合物」と呼ぶ。このような候補化合物を使用して、骨格筋の量または機能を調節することができる。ただし、より典型的には、生体外スクリーニングのこの第1レベルは、追加的なレベルのスクリーニングでさらに調査するに値する化合物、すなわち候補化合物を、より狭い範囲で選択するための手段を提供するものである。本発明の使用が、1つまたはそれ以上の試験化合物の群から、さらなる調査に値する化合物の部分集合を同定するためのものであることが、当事者には認識されよう。また、本発明のアッセイが、他の候補化合物に対して相対的に、特定の候補化合物の予想される有用性をランク付けするのに有用であることも、当技術の習熟者には認識されよう。例えば、10nMでVPACを活性化する候補化合物は、1000nMでVPACを活性化する(しかし10nMでは活性化しない)ものより関心が高い。このような情報を用いて、当技術の習熟者は、さらなる調査に関してスクリーニングの第1レベルで同定された候補化合物の部分集合を選択することができる。ほんの一例であるが、200nM未満の濃度でVPACを活性化する化合物には骨格筋萎縮の動物モデルでさらに試験を実施し、閾値より高いものにはそれ以上の試験を実施しない。また、試験化合物群の選択方法、および陽性のものの選択方法に応じて、試験化合物のある割合だけが候補化合物として同定され、この割合が非常に小さいものであることも、当事者には認識されよう。
【0068】
以下で説明するアッセイシステムは、VPAC受容体、またはVPAC受容体を発現する細胞を含むキットに形成してもよく、それは様々な容器、例えばバイアル瓶、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなどに詰めることができる。その他の試薬は、別個の容器に入れて、キット、例えば陽性対照試料、陰性対照試料、緩衝液、および細胞培養媒質と合わせて提供することができる。
【0069】
一実施形態では、本発明は、VPAC受容体に結合する候補化合物を同定するために、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。化合物の受容体への結合を決定する方法は、当該技術分野では周知である。通常、このアッセイには、試験化合物を含むまたは含まない環境で受容体に結合することがわかっている標識化合物と共に、VPAC受容体源をインキュベートする工程と、結合した標識化合物の量を決定する工程とを含む。本明細書に記載されるように、VPAC受容体源は、VPAC受容体を発現する細胞、またはある形態の単離VPAC受容体であることができる。標識化合物は、好ましくは定量的に測定できるように、VIPまたはいかなるVIP類縁体標識(例えば、125I標識、ユーロピウム標識、フルオレセイン標識、GFP標識、35S−メチオニン標識)でもあることができる。このような標識技術は、当該技術分野では周知である。VPAC受容体に結合する試験化合物は、受容体に結合する標識リガンドの量を低減させるので、対照試料(試験化合物を含まない)からのものに比べて信号レベルが低下する。この技術の変形形態が記載されており、これは、Gタンパク質非連結剤を含むまたは含まない環境で結合する受容体(例えば、グアニンヌクレオチド類縁体、すなわちGpppNHpを含むまたは含まない環境で結合)が、作動薬と拮抗薬を区別できるものである。M・キーン(Keen)の受容体シグナルトランスダクションプロトコルにおける膜調製および完全な状態の細胞のための放射性リガンド結合方法(Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact cells in Receptor Signal Transduction Protocols)、R.A.J.チャリス(Challis)(編集)、ヒュマナプレス社(Humana Press Inc.)、ニュージャージー州トトウェイ(1997年)を参照されたい。
【0070】
VPAC1またはVPAC2に特異的に結合する(すなわち、1つのタイプの受容体には結合するが他のタイプには結合しない)化合物を区別することが望まれる時には、上述のアッセイは、VPAC受容体の一方だけ発現する細胞若しくは細胞由来の膜を使用して実施、またはアッセイを特定の受容体の組換え源によって実施すべきである。2つ以上の形態のVPACを発現する細胞は、対象外のVPAC受容体遺伝子を不活性または無効にするために、相同組換えを用いて修飾することができる。あるいは、VPAC源が2つ以上のVPAC受容体タイプを含有する場合、アッセイで得られる信号から、対象外の受容体によって産生されたバックグラウンド信号を差し引かなければならない。バックグラウンド反応は、アンチセンス、抗体、または選択的拮抗薬を使用することによって、対象外のVPAC受容体からの信号を排除することを含めて、多数の方法によって決定することができる。
【0071】
その他の実施形態では、本発明は、VPAC受容体を活性化する候補化合物を同定するために、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。通常、このアッセイは、細胞ベースのものであるが、上述のように作動薬と拮抗薬を区別できる細胞不使用アッセイも知られている。細胞ベースのアッセイは、VPAC1またはVPAC2受容体を発現する細胞を試験化合物または対照に接触させる工程と、VPAC受容体シグナルトランスダクション経路の化合物の発現または活性を測定することによってVPAC受容体の活性化を測定する工程とを含む。
【0072】
上述の背景の項で述べたように、VPAC受容体は、細胞のタイプに応じて、Gα s、Gα q、またはGα iを含む、いくつかの異なる経路を通じて連結するように思われる。必要な経路成分が特定の細胞タイプに存在すれば、VPACの作動薬活性化により、受容体がこれらの経路のいずれかを介して信号を発することができると考えられる。従って、VPAC活性化に関してスクリーニングするために、処置に関係のある細胞タイプが生体内で異なる経路を介してVPACを骨格筋萎縮に連結させる場合でも、アッセイでは、読出しとして、いずれのシグナルトランスダクション経路も使用することができる。スクリーニングアッセイが、受容体活性化を測定する経路とは関係なく、有用なVPAC作動薬を同定するのに有効であることが、当技術の習熟者には認識されよう。これらの信号伝達経路の活性化を測定するためのアッセイは、当該技術分野では公知である。
【0073】
例えば、試験化合物に接触させた後で、cAMP誘発のために細胞の溶解物を調製し分析することができる。cAMPは、Gα s活性化に応答して誘発される。Gα sがVPAC以外の受容体によって活性化され、試験化合物がVPAC受容体を通してまたは他の機構によってその効果を与えるので、2つの対照比較物は、試験化合物がVPAC受容体の活性化によってcAMPのレベルを増加させるかどうかを決定するのに関係する。一方の対照は、試験化合物に接触させた細胞のcAMPレベルと、対照化合物(すなわち、試験化合物を溶解させたビヒクル)に接触させた細胞のcAMPレベルとを比較するものである。試験化合物が対照化合物に対して相対的にcAMPレベルを増加させる場合、これは、試験化合物がいくつかの機構によってcAMPを増加させることを示す。もう一方の対照は、VPACを発現する細胞株のcAMPレベルと、VPAC受容体を発現しないことを除いて本質的に同一の細胞株のcAMPレベルとを、両方の細胞株を試験化合物で処置して、比較するものである。試験化合物が、VPAC受容体を発現しない細胞株に対して相対的に、VPAC受容体を発現する細胞株におけるcAMPレベルを高める場合、これは、試験化合物がVPAC受容体の活性化によってcAMPを高めることを示す。
【0074】
本発明の特定の実施形態では、様々なレポーター遺伝子のいずれかに連結されたcAMP応答要素を含有する構成を、VPAC受容体を発現する細胞に導入することができる。このようなレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、グルクロニドシンセターゼ、成長ホルモン、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質)、またはアルカリ性ホスファターゼが挙げられるが、これに限るものではない。細胞を試験化合物に暴露した後、レポーター遺伝子発現のレベルを計量して、試験化合物がVPAC受容体を活性化する能力を決定することができる。
【0075】
このアッセイで有用な細胞は、上述のVPAC受容体結合アッセイに関するものと同一であるが、活性化アッセイで使用される細胞が、好ましくはVIPまたは1つ若しくはそれ以上のVIP類縁体に統計的に有意に応答する機能的受容体を発現する点で異なる。完全長のVPAC受容体を発現する細胞の使用に加えて、レポーター要素に連結された、またはレポーター要素を含むように若しくは信号伝達タンパク質と相互作用するように物理的に修飾された、受容体のリガンド結合領域を含むVPAC受容体を発現する細胞は操作されることができる。例えば、野生型VPACまたはVPAC断片をGタンパク質に融合させて、融合タンパク質のVPAC部分に結合する作動薬で融合させたGタンパク質の活性化を引き起こすことができる。R・シーフェルト(Siefert)らの薬理科学の風潮(Trends Pharmacol.Sci.)(1999年)、20:383〜389。この細胞はまた、例えばCREレポーター遺伝子の強い誘発を検出するためのVIPまたはVIP類縁体による誘導応答を最大限にするために、読出しに応じて、好ましくは多数の特徴を有するべきであり、(a)低い天然レベルのcAMP、(b)VPAC受容体と相互作用できるGタンパク質、(c)高レベルのアデニリルシクラーゼ、(d)高レベルのタンパク質キナーゼA、(e)低レベルのホスホジエステラーゼ、および(f)高レベルのcAMP応答要素結合タンパク質が有利である。VIPまたはVIP類縁体に対する応答を高めるために、宿主細胞を操作して、望ましい因子の発現量をより多くし、または望ましくない因子の発現量をより少なくすることができる。加えて、CREレポーターの誘発のための代替的な経路を排除して、基礎レベルを低下させることができる。
【0076】
場合によっては、作動薬への長期暴露後に、Gタンパク質連結受容体反応が弱まり、または感度が低下する。本発明の他の実施形態は、VPAC受容体作動薬に応答して、VPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる化合物を同定するための方法を提供する。このような化合物は、骨格筋萎縮を処置するために、例えば単独でまたはVPAC受容体作動薬と組み合わせて使用することができる。通常、この方法は、(i)機能的VPAC受容体を発現する細胞を、受容体を脱感作するのに十分な作動薬の濃度および作動薬−受容体暴露の期間で、VPAC受容体作動薬によって処置する工程と、(ii)細胞を試験化合物に接触させる工程と、(iii)VPAC受容体の活性化レベルを決定する工程とを含む、細胞ベースのアッセイを使用する。いくつかの機構は、これに限るものではないが、受容体リン酸化反応、受容体内在化または分解、およびVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の下方調節を含む、受容体脱感作に寄与することが、当技術の習熟者には認識されよう。当技術の習熟者は、脱感作のどの機構を標的にするかに応じて、細胞を試験化合物に接触させる適切な時間(すなわち、作動薬処置前、処置時、または処置後)を決定することができる。例えば、作動薬処置後に細胞を試験化合物に接触させると、受容体のリン酸化反応の結果として起こる受容体脱感作を阻止する試験化合物を検出することができる。
【0077】
その他の実施形態では、本発明は、VPAC遺伝子の転写またはVPAC受容体発現を調節する候補化合物を同定するために、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。VPAC遺伝子の転写活性を調節する候補化合物は、VPAC受容体調節領域(レポーター遺伝子構成)に作用可能に結合するレポーター遺伝子を用いて同定することができる。このような方法は、当該技術分野では公知である。このような方法の1つでは、細胞因子源が存在する環境でレポーター遺伝子構造を試験化合物に接触させ、レポーター遺伝子発現のレベルを決定する。対照試料に比べて発現レベルの増加を引き起こす試験化合物は、VPAC遺伝子の転写を増加させる候補化合物の指標である。生体外または生体内転写に必要な細胞因子を提供するには、通常VPAC受容体を発現する任意の細胞タイプから、適切な細胞または細胞抽出物を調製する。
【0078】
VPAC受容体発現を調節する候補化合物は、また、細胞を試験化合物に接触させてVPACの発現を決定する方法で同定することもできる。試験化合物を含む環境でのVPAC受容体の発現レベルを、試験化合物を含まない環境での発現レベルと比較する。VPACの発現を増加させる試験化合物を、筋量または筋機能を増加させる候補化合物として同定する。このような方法は、VPAC受容体の転写若しくは翻訳を増加させ、またはmRNA若しくはVPAC受容体の安定性を増加させる候補化合物を検出する。
その他の実施形態では、本発明は、VIPまたはVIP類縁体の発現を調節する候補化合物を同定するために、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。このようなアッセイは、後の修飾によってVPAC受容体の発現を調節する候補化合物を同定するためのアッセイに関して本質的に上述したように実施される。VIP遺伝子またはVIP類縁体遺伝子からの転写を調節する候補化合物を同定するには、レポーター遺伝子は、対象のVIP遺伝子またはVIP類縁体遺伝子の調節領域に作用可能に結合し、細胞因子源は、対象の遺伝子を発現する細胞タイプ由来であるべきである。
【0079】
VII.骨格筋萎縮モデルを用いる候補化合物のスクリーニング
上述のように、生体外アッセイによって、1つまたはそれ以上の試験化合物から選択される候補化合物は、骨格筋萎縮および/または肥大モデル系で骨格筋の量または機能を調節する能力に関してさらに試験を実施することができる。このような骨格筋萎縮または肥大モデルには、骨格筋萎縮の生体外細胞培養モデルと生体内動物モデルの両方が含まれる。このようなスクリーニングの追加的なレベルは、追加的な調査、例えば治験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用である。
【0080】
筋肉萎縮の細胞培養モデル
骨格筋萎縮の生体外モデルは、当該技術分野では公知である。このようなモデルについては、例えば、H・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)の生体外(In Vitro)(1988年)24:609−619、H・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)らの生体力学雑誌(J of Biomechanics)(1991年)24Suppl1:91−9、H・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)らの生体外細胞発生生物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.)(1988年)24(3):166−74、J・A・クロミアック(Chromiak)らの生体外細胞発生生物学・動物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)(1998年)34(9):694−703、J・シャンスキー(Shansky)らの生体外細胞発生生物学・動物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)(1997年)33(9):659−61、C・E・ペロン(Perrone)らの生化学雑誌(J.Biol.Chem.)(1995年)270(5):2099−106、J・A・クロミアック(Chromiac)およびH・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)の細胞生理学雑誌(J.Cell.Physiol.)(1994年)159(3):407−14、およびH・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)およびP・カーリッシュ(Karlisch)の生体外細胞発生生物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.)(1989年)25(7):607−16に記載されている。このようなモデルは、前述の生体外スクリーニングに従って動物モデルでの試験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用であるが、必要ではない。細胞培養モデルを候補化合物によって処置し、処置に対するモデルの応答を、筋肉タンパク質合成または分解、骨格筋量または収縮機能における変化など、筋肉マーカの変化を評価することによって測定する。筋肉マーカで有意な変化を誘発する化合物には、通常、骨格筋萎縮の動物モデルでさらにスクリーニングを実施する。
【0081】
骨格筋萎縮の動物モデル
候補化合物を非ヒト動物に投与し、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉または筋線維断面積、収縮タンパク質含量、非収縮タンパク質含量、または骨格筋の量若しくは機能変化と相関のある生化学または遺伝子マーカなど、萎縮または肥大のマーカの変化を評価することによって、動物の応答を監視する。骨格筋肥大を誘発し、または骨格筋萎縮のいかなる側面も防止する候補化合物は、ヒトの骨格筋萎縮を処置するための見込みの治療用候補と考えるべきであり、本明細書では治療用候補化合物と呼ぶ。候補化合物が骨格筋萎縮を調節する能力の評価に加えて、毒性などの望ましくない副作用も、このようなスクリーニングで検出することができる。許容不可能な高レベルの副作用がないことを、治療用候補化合物の選択のためのさらなる基準として使用することができる。
【0082】
骨格筋萎縮に関する様々な動物モデルが当該技術分野で知られており、G・J・ハービソン(Herbison)ら(1979年)の物理療法医学リハビリ文書(Arch.Phys.Med.Rehabil.)60:401〜404、H−J・アッペル(Appell)(1990年)のスポーツ医学(Sports Medicine)10:42〜58、P−O・ハッセルグレン(Hasselgren)およびJ・E・フィッシャー(Fischer)(1998年)の世界外科雑誌(World J.Surg.)22:203〜208、E・T・アグベニーガ(Agbenyega)およびA・C・ウェアハム(Wareham)(1992年)の計算生化学・生理学(Comp.Biochem.Physiol.)102A:141〜145、D・B・トマソン(Thomason)およびF・W・ブース(Booth)(1990年)の応用生理学雑誌(J.Appl.Physiol.)68:1〜12、R・H・フィッツ(Fitts)ら(1986年)の応用生理学雑誌(J.Appl.Physiol.)60:1946−1953、P・ブラマンティ(Bramanti)ら(1998年)の国際解剖発生学雑誌(Int.J.Anat.Embryol.)103:45〜64、G・D・カーティー(Cartee)(1995年)のアメリカ老年学会生物科学医用科学雑誌(J.Gerontol.A Biol.Sci.Med.Sci.)50:137〜141、L・C・コーク(Cork)ら(1987年)の発展臨床生物学研究(Prog.Clin.Biol.Res.)229:241〜269、F・W・ブース(Booth)およびP・D・ゴールニック(Gollnick)(1983年)の医用科学スポーツ運動学(Med.Sci.Sports Exerc.)15:415〜420、S・A・ブルームフィールド(Bloomfield)(1997年)の医用科学スポーツ運動学(Med.Sci.Sports Exerc.)29:197〜206などに記載されている。これらのモデルに好ましい動物は、マウスおよびラットである。これらのモデルには、例えば、肢のキャスト固定または不動化、後肢懸架、動物の完全不動化、および低重力状況などの不使用誘発萎縮モデルが含まれる。神経損傷誘発萎縮モデルには、例えば、神経圧挫、特定の筋肉を刺激する神経部分の除去、神経への毒素適用、およびウイルス性、細菌性、または真核生物感染性剤による神経感染が含まれる。糖質コルチコイド誘発萎縮モデルには、動物への外因性糖質コルチコイドの萎縮誘発用量の適用、および、例えば、視床下−下垂体−副腎(HPA)軸を活性化するホルモンの適用による外因性副腎皮質ホルモン産生の刺激が含まれる。敗血症誘発萎縮モデルには、例えば、細菌などの敗血症誘発有機体の接種、細菌細胞壁抽出物または内毒素などの免疫活性化化合物による動物の処置、および腸壁の穿刺が含まれる。悪液質誘発萎縮モデルには、例えば、悪液質形成の可能性を有する腫瘍形成細胞による動物の接種、悪液質をまねく感染性剤(AIDSを引き起こすウイルスなど)による動物の感染、悪液質を誘発するホルモンまたはCNTF、TNF、IL−6、IL−1などのサイトカインによる動物の処置が含まれる。心機能不全誘発萎縮モデルには、心機能不全が骨格筋萎縮を付随して発生するような動物の操作が含まれる。神経変性病誘発萎縮モデルには、ニューロンの構成要素による動物の免疫化で得られるものなど、自己免疫動物モデルが含まれる。筋ジストロフィー誘発萎縮モデルには、自然または人工の遺伝的誘発筋ジストロフィーモデル、例えばMdxマウスで発生するジストロフィン遺伝子の変異などが含まれる。
【0083】
骨格筋肥大の動物モデルには、例えば、対向肢の不活性化による肢筋肉高使用モデル、不使用萎縮誘発事象後の再測定モデル、一時的神経損傷のために萎縮した筋肉の再使用モデル、協力筋の不活性化による選択的な筋肉高使用(例えば相補的肥大)モデル、筋肉に置かれた高荷重による筋肉高使用モデル、および糖質コルチコイド誘発萎縮後の糖質コルチコイド除去によって誘発される肥大モデルが含まれる。好ましい動物萎縮モデルには、坐骨神経除去萎縮モデル、糖質コルチコイド誘発萎縮モデル、および足キャスト固定不使用萎縮モデルが含まれ、これらは以下で詳細に説明する。
【0084】
坐骨神経除去萎縮モデルは、動物への麻酔、およびその後の右または左坐骨神経の小断片の外科的除去を伴うものであり、例えばマウスにおける坐骨神経は、大腿に沿ったほぼ中間点で単離し、3〜5mmの断片を摘出する。これにより、下位後肢筋肉組織の神経が除去され、これらの筋肉の萎縮を生じさせる。通常、実質的に正常歩行のために膝の満足な動きを提供するように、大腿二頭筋に対する神経支配は完全な状態で残される。通常、未処置動物では、神経除去10日後に、神経除去した筋肉の筋量が30〜50%減少する。神経除去後、神経除去誘発骨格筋萎縮に対する効果を決定するために、試験化合物を、例えば注射によって、または例えば浸透性ミニポンプ(例えば、カリフォルニア州パロアルトのアルザ(Alza))の埋め込みを介した連続注入によって投与する。神経除去後の様々な時点で、動物を安楽死させ、神経除去した足と神経除去していない足の両方から下肢筋肉を迅速に解剖して、腱と結合組織を取り除いた筋肉の重量を測定する。例えば、筋量、筋肉断面積、筋線維断面積、または収縮タンパク質含量を測定することによって、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
【0085】
糖質コルチコイド誘発萎縮モデルは、試験動物への糖質コルチコイド(例えば飲用水中でデキサメタゾン1.2mg/kg/日)の投与を伴う。通常、未処置動物では、骨格筋量は、10日間のデキサメタゾン投与後に30〜50%減少する。糖質コルチコイド投与に付随して、またはその後に、糖質コルチコイド誘発骨格筋萎縮への影響を決定するために、例えば注射または連続注入によって、試験化合物を投与する。糖質コルチコイド投与後の様々な時点で、神経除去モデルに関して上述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
足キャスト固定不使用萎縮モデルは、動物の一方の後肢の、膝から足の先までのキャスト固定を伴う。通常、10日間のキャスト固定後に、筋量が20〜40%減少する。キャスト固定後、足キャスト固定誘発骨格筋萎縮への効果を決定するために、試験化合物を、例えば注射によって、または例えば浸透性ミニポンプ(例えば、カリフォルニア州パロアルトのアルザ(Alza))の埋め込みを介した連続注入によって投与する。足キャスト固定後の様々な時点で、神経除去モデルに関して上述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
【0086】
ヒトで使用する化合物のスクリーニングでは、ヒトVPAC受容体と他の動物種由来のVPAC受容体との間に相違があるので、非ヒトVPAC受容体を用いてスクリーニングを実施した時に、偽陽性または陰性の結果がいくつか現れる可能性があるということが、当技術の習熟者には認識されよう。従って、初期の生体外スクリーニングを、ヒトVPAC受容体を用いて実施することが好ましい。ある環境では、同定した候補化合物は、ヒト受容体にだけ活性があって、非ヒト受容体には活性がないことがある。このような環境では、これらの候補化合物がスクリーニングの第2レベルで骨格筋の量または機能を調節できるかどうかを決定することが望ましい場合がある。これらの候補は、非ヒトVPACを活性化しないので、非ヒト動物による標準生体内スクリーニングは勧められない。このような環境では、これらの候補に関するスクリーニングの第2レベルは、ヒトVPAC受容体を発現するトランスジェニック動物で実施することができる。
【0087】
これに限るものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヤギ、イヌ、およびヒト以外の霊長類を含めた任意の種の動物を使用して、VPAC受容体トランスジェニック動物を生成することができる。マウスおよびラットが好ましく、マウスが最も好ましい。当該技術分野では様々な技術が知られており、それを使用して、トランスジェニック動物の創始株を産生するために、動物にヒトVPAC導入遺伝子を導入することができる。このような技術としては、前核マイクロインジェクション、レトロウイルス媒介遺伝子の生殖細胞系への転移、胚幹細胞での遺伝子標的化、胚の電気穿孔法、および精子媒介遺伝子転移が挙げられるが、これに限るものではない。
【0088】
VIII.骨格筋萎縮の処置のための遺伝子治療方法
VPAC、VIP、およびVIP類縁体の発現は、遺伝子治療手法を用いて生体内で制御することができる。VPAC、VIP、およびVIP類縁体遺伝子の発現および/または活性は、VPAC受容体、構造的活性型VPAC、VIP、またはVIP類縁体遺伝子を適切な組織内に導入することによって増加させることができる。これらの遺伝子の過剰発現は、総細胞VPAC活性を高め、従って骨格筋萎縮を調節する。遺伝子又は対象の遺伝子を、被験体での発現に適切なベクターに挿入する。これらのベクターには、DNAを細胞内に導入する他の粒子(例えば、リポソーム、金粒子など)、または対象の遺伝子を含有するDNA発現ベクターのヒト組織(例えば筋肉)への直接注射に加えて、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これに限るものではない。
【0089】
全体的なVIPまたはVIP類縁体遺伝子発現レベルを増加させるために使用できる他の方法には、患者へのVIPまたはVIP類縁体発現細胞、好ましくは自家細胞の導入が含まれる。これらの細胞は、組換え型(例えば、VIPまたはVIP類縁体を発現するように操作したもの)または非組換え型(例えば、内生的にVIPまたはVIP類縁体を発現する細胞)であることができる。細胞は、骨格筋萎縮の処置のため、体内の多数の部位(例えば筋肉)に送られることができる。細胞ベースの遺伝子治療技術は、当該技術の習熟者には公知である。
【0090】
IX.医薬品の配合および使用方法
スクリーニング方法によって同定される候補化合物または治療用候補化合物は、骨格筋萎縮を処置するために個人に投与することができる。このために、本発明は、これに限るものではないが、手術、ベッド休養、骨折による不使用;脊髄損傷による神経除去/神経損傷;自己免疫疾患;感染病;無関係状況での糖質コルチコイド使用;感染症または他の原因による敗血症;病気または飢餓による栄養制限;癌性悪液質;慢性炎症;AIDS性悪液質;COPD;うっ血性心不全;例えば、筋ジストロフィー、神経変性病などのサルコペニアおよび遺伝病によって誘発される骨格筋萎縮を含む、骨格筋萎縮を変調させるための方法および組成物を包含する。VPACの作動薬を用いて、骨格筋萎縮を阻害することができる。必ずしも、有効な化合物が、対象のVPACまたはVPAC受容体サブタイプに完全な特異性を示す必要はない。他の病変受容体の特異的拮抗薬を、有効であるが特異性のない作動薬と合わせて共投与できることが企図されている。あるいは、投薬量のみ、または投薬計画の調節によって、この特異性の欠如に対処してもよい。
【0091】
本発明のスクリーニング方法によって同定される候補化合物または治療用候補化合物は、VPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物と組み合せて投与してもよい。これらは、公知の化合物、例えばテオフィリンであってもよく、または本発明のスクリーニング方法によって、これらの化合物がVPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させることを同定してもよい。
【0092】
用量の決定
VPACに害を与える化合物の安全性および治療的有効性は、生体外または生体内技術を用いる標準的な手順によって決定することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましいが、副作用のレベルが許容可能であれば、治療指数の低い化合物も有用である。生体外および生体内の毒性学的および薬理学的技術から得られるデータを使用して、有用な可能性のあるヒトの用量範囲を配合することができる。好ましい用量は、化合物の循環濃度が、許容可能な安全性を備えて、治療的に最大限になる範囲内にある。化合物の循環濃度は、投薬形態、投薬後の時間、投与経路などに応じて変更することができる。副作用が許容可能であれば、この範囲から外れる用量も有用である。患者の年齢や体重などの事項を用いて、従来の様式でこのような事項を決定することができる。薬理遺伝学的手法が、臨床群における化合物の選択、用量、および投薬計画の最適化に有用な可能性がある。
【0093】
配合および使用
本発明による骨格筋萎縮の調節で使用するための医薬組成物は、製薬上許容可能な担体および賦形剤を使用し、従来の方法を用いて配合することができる。本発明の組成物は、単位剤形で提供することが好ましい。本明細書で使用する時、「単位剤形」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験者への投与に適切な、優れた医療慣習に基づく1回用量のVPAC受容体作動薬を含有する本発明の組成物である。医薬組成物は、例えば、経鼻投与、経皮投与、吸入投与、非経口投与、皮膚投与、経口投与、または直腸投与による供給のために配合することができる。経口投与の場合、医薬組成物は、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、結合剤、充填剤、潤沢剤、崩壊剤、または湿潤剤を含む添加物を含有する錠剤またはカプセル剤形であることができる。錠剤は、コーティングすることができる。経口投与のための液体製剤には、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル、防腐剤、緩衝塩、香料、着色剤、甘味剤などを含む添加物を含有する、シロップ、懸濁液、または使用前に液体で再構成される乾燥製品が含まれるが、これに限るものではない。経口投与用の医薬組成物は、口、胃、または腸管における薬理学的活性化合物の放出を制御するように配合することができる。
【0094】
吸入投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、液体、粉末、ゲル、または、事前測定または非事前測定用量の加圧または非加圧噴射剤を利用するエアロゾル噴霧の形態によって供給することができるが、これに限るものではない。薬理学的に活性な化合物は、適切な充填剤、ビヒクル、防腐剤、緩衝剤などと併せて配合することができる。非経口投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと合わせて配合でき、ボーラス注射または注入のための懸濁液、溶液、エマルション、すぐに構成可能な粉末などとして調製することができる。これらの化合物の投薬は、皮下注射針、高圧装置などを含め、様々な技術によって投与することができる。直腸投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、座薬、浣腸などとして供給するために、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと併せて配合することができる。皮膚投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、ローション、皮膚軟化剤などを含む許容可能な生理学的担体と併せて配合することができ、またはパッチタイプの手段に組み込むことができる。長期的な投与の場合、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、ポリマー、疎水性材料、樹脂などの適切な添加物は、これに限定されないが、筋肉内または皮下の位置を含む多数の部位に注射または埋め込むための持続性製剤として配合することができる。加えて、薬理学的に活性な化合物は、分配装置によって投与することができる。
【0095】
治験時の効果の監視
VPACの発現または活性に対する化合物(例えば薬物)の影響の監視は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、治験においても実施することができる。例えば、スクリーニングアッセイによってVPAC受容体活性またはVPAC受容体発現を増加させると決定した化合物の効果は、骨格筋萎縮の患者または骨格筋萎縮の危険性のある患者の治験において評価することができる。試験化合物または擬薬投与後の様々な時点で、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉破壊の生化学的マーカ、または生活水準指標の変化を観察することによって、患者に対する化合物の効果を決定することができる。ヒト被験体で骨格筋量を測定する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、肢の周囲の測定、例えばコンピュータ断層撮影法、MRI、若しくは超音波による筋肉の厚さの測定、または、形態学的および生化学的パラメータ(例えば、断面線維面積、線維直径、または酵素活性)を検査するための筋肉生検が挙げられる。さらに、骨格筋量は骨格筋機能と相関があるので、筋機能は、筋量の代用マーカとして使用でき、筋量の変化は、機能的測定、例えば、強度、協力筋群の力、または筋電図記録で見られる収縮特徴を用いて評価することができる。加えて、筋萎縮の結果生じる筋肉タンパク質喪失は、被験体の尿または血液中のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、すなわち3−メチルヒスチジンのレベルの定量化によって測定することができる。このような方法の概観については、アッペル(Appell)のスポーツ医学(Sports Med.)10:42〜58(1990年)を参照されたい。生活水準指標としては、椅子からの立ち上がりの容易さ、疲労前の歩数、または階段昇降能力が挙げられるが、これに限るものではない。
【0096】
(実施例)
実施例1 ヒトVPAC2受容体発現に関するベクターの構成
ヒトVPAC2受容体(hVPAC2R)DNA配列(受入番号X95097)を取り出し、1つが開始コドンで開始する遺伝子の5’末端(5’オリゴヌクレオチド)で、1つが停止コドンを含有する遺伝子の3’末端(3’オリゴヌクレオチド)の、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、5’オリゴヌクレオチド内に1つの固有部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、hVPAC2遺伝子には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するように設計される。加えて、3’オリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化添加信号配列を含有する。ヒト骨格筋由来の二重鎖cDNAは、ユニバーサルクイッククローンcDNAコレクション(Universal QUICK−Clone cDNA collection)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)から購入される。上述の5’および3’オリゴヌクレオチドを用いて、hVPAC2R cDNAは、アドバンタックPCRキット(AdvanTaq PCR kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いたヒト骨格筋cDNAのPCRによって増幅される。hVPAC2遺伝子PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hVPAC2遺伝子DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。
【0097】
pIRESneoベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)へのhVPAC2R PCR生成物のクローニングは、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVPAC2R PCR生成物とpIRESneoベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて、pIRESneoベクターDNAをhVPAC2R PCR生成物DNAにライゲーションする。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成(pIRESneo/hVPAC2R)を用いて、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を形質転換させる。形質転換させた細胞を、寒天を含むLB/X−gal/IPTGおよびアンピシリン上に塗布する。白色コロニー(陽性クローン)を選択し、LB培地で個々に培養する。ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、プラスミドDNAを単離する。少なくとも1つのクローンからの挿入を配列させて、確実にhVPAC2R配列が正しくなるようにする。安定統合型マーキュリーCRE−LUCプラスミド(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を含有するHEK293細胞を、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(Mammalian Transfection Kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、正しい配列挿入を有する精製pIRESneo/hVPAC2R DNAによってトランスフェクションする。pIRESneo/hVPAC2R
【0098】
DNAによって安定にトランスフェクションした細胞を、G418中で細胞を培養することによって選択する。安定にトランスフェクションした細胞(HEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R細胞)を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、および非必須アミノ酸(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)を含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。クローンは、実施例2および実施例3で説明するように、VIPへの暴露後に、VIP結合およびCRE−LUC活性化に関して特徴付ける。次いで、適切なレベルでhVPAC2受容体を発現し、CRE−LUCレポーター系に適切に連結される細胞を、さらなる分析で使用する。
【0099】
実施例2 受容体結合アッセイ
化合物の受容体結合分析は、実施例1のHEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R細胞を96ウェルポリリシンコーティングプレートで平板培養することによって細胞全体に実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、および非必須アミノ酸を含有するDMEM培地に播種し、一晩インキュベートする。培養培地を取り除き、MEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中のユーロピウム(Eu−VIP)+10%シーブロック(Seablock)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)で共有標識した適切な量のVIPを添加する。細胞をEu−VIPと共に室温で90分インキュベートし、次いでマグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で4回洗浄する。最後の洗浄の後、強化溶液(ワラック社(Wallac Inc.)、メリーランド州ゲイサーズバーグ)を添加し、バイオワークスユーロピウムプログラム(BioWorks Europium program)を用いてワラックプレートリーダ(Wallac plate reader)(ワラック社(Wallac Inc.)、メリーランド州ゲイサーズバーグ)でプレートを読み取る。飽和結合分析の場合、10(−12)〜10(−3)Mの範囲のEu−VIPの記録用量(log doses)を細胞に添加し、非特異的結合の評価のために、非標識VIPの飽和濃度を含まない環境と含む環境の両方で結合を分析する。競合的結合の場合、対象の化合物の濃度の変更に加えて、結合に対する最大値の半分であるEu−VIP濃度を添加する。
【0100】
実施例3 受容体活性化アッセイ
受容体活性化分析は、実施例1のHEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R細胞をパッカードビュープレート(Packard View Plate)−96(パッカード社(Packard Inc.)、カリフォルニア州)に播種して実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、および非必須アミノ酸を含有するDMEM培地に播種し、一晩インキュベートする。次いで、培地を取り除き、対象の化合物を含有する、0.01%ウシアルブミン断片V(シグマ(SIGMA)、ミズーリ州セントルイス)を含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で置き換える。次いで、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で4時間インキュベートし、その後培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で細胞を2回洗浄する。次いで、洗浄した細胞に溶解試薬(Lysis Reagent)(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を加え、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。次いで、細胞を−80℃に20分間置き、その後37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液およびルシフェラーゼ分析基質(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を細胞溶解物に加え、照度計を用いてルシフェラーゼ活性を定量化する。化合物暴露後の増加を、化合物暴露後の、hVPAC2受容体なしでCRE−LUC構成を含有するHEK細胞中のルシフェラーゼのレベルと比較することによって、化合物の相対的な活性を評価する。10倍超過のhVPAC2受容体拮抗薬を含む環境および含まない環境で、hVPAC2受容体/CRE−LUC HEK細胞の化合物へのルシフェラーゼ応答を評価することによって、応答の特異性についても確認する。
【0101】
実施例4 hVPAC 2 受容体またはVPAC 2 受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するためのスクリーニング
VPAC2受容体またはVPAC2受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる化合物の同定は、実施例3で説明した受容体活性化アッセイの変形形態に関与する。具体的には、このアッセイは、HEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R受容体細胞をパッカードビュープレート(Packard View Plate)−96(パッカード社(Packard Inc.)、カリフォルニア州)に播種することによって実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、非必須アミノ酸、およびVIPの飽和量を含むDMEM培地に播種し、48時間インキュベートする。次いで、培地を取り除き、対象の化合物に加えて0.01%ウシアルブミン断片V(シグマ(SIGMA)、ミズーリ州セントルイス)およびVIPを含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で置き換える。次いで、細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で4時間インキュベートし、その後、培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で細胞を2回洗浄する。次いで、洗浄した細胞に溶解試薬(Lysis Reagent)(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を加え、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。次いで、細胞を−80℃に20分間置き、その後37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液およびルシフェラーゼ分析基質(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を細胞溶解物に加え、照度計を用いてルシフェラーゼ活性を定量化する。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光性を刺激する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物とする。最も対象の化合物は、相対的に高レベルの蛍光性を誘発するものである。
【0102】
実施例5 hVPAC 2 受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するためのスクリーニング
適切な組織中のhVPAC2受容体遺伝子の生理的発現に必要なすべての調節要素を含有するように、転写開始部位の十分に上流で開始するhVPAC2受容体遺伝子のプロモーター領域を含有する配列を、ヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方がプロモーター領域の5’末端を含有し(5’オリゴヌクレオチド)、他方が転写開始部位を含むプロモーター領域の3’末端を含有する(3’オリゴヌクレオチド)、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、5’オリゴヌクレオチド内に1つの固有部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、hVPAC2遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。5’および3’オリゴヌクレオチドは、PCRキットである、アドバンテージ(Advantage)(登録商標)ゲノムPCRキット(Genomic PCR kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使って、ヒトDNA(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)由来のhVPAC2遺伝子調節領域のPCR増幅のために使用される。hVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hVPAC2遺伝子調節領域DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。pECFP−1ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)へのhVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物のクローニングは、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物とpECFP−1ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。pECFP−1ベクターDNAのhVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成を用いて、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。細胞をLBおよびカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のために、カナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてプラスミドDNAを単離し、hVPAC2遺伝子調節領域を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、hVPAC2遺伝子調節領域を含有する、精製した構成プラスミドDNAを、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(Mammalian Transfection Kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使用し、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて、HEK293細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、G418を用いて選択し、単離して、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境中で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、非必須アミノ酸(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、およびG418(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)を含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。G418耐性クローンは、それがhVPAC2遺伝子プロモーター配列を確実に含有するように、サザンブロット法(Southern blotting)によって特徴化し、さらに、hVPAC2遺伝子調節領域の活性化を、適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでhVPAC2遺伝子調節領域−ECFPを発現する細胞を、以下のように、hVPAC2遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、hVPAC2遺伝子調節領域−ECFP含有HEK293細胞を、適切な密度で、黒色で透明底の96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、一晩成長させることによって実施する。翌日、培地を取り除き、試験化合物を新たな成長培地に加える。細胞を、37℃で5%二酸化炭素/95%空気環境で16時間インキュベートし、その後蛍光を測定する(蛍光光度計(バイオルミン(biolumin)(商標)960、モルキュラーダイナミクス/アマーシャムファーマシアバイオテック(Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech)、ニュージャージー州ピスカタウェイ)使用、検出放射475(501)nmによる励起433(453)nm)。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光性を刺激する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物とする。最も対象の化合物は、相対的に高レベルの蛍光性を誘発するものである。
【0103】
実施例6 ヒトVIP発現を増加させる化合物を同定するためのスクリーニング
ヒトVIP(hVIP)発現を増加させる化合物を同定するための方法は、使用される調節領域がhVIP遺伝子のためのものであることを除き、本質的には、hVPAC2受容体の発現を増加させる化合物を同定するための方法と同一である。適切な組織中のhVIP遺伝子の生理学的発現に必要なすべての調節要素を含有するように、転写開始部位の十分に上流で開始するhVIP遺伝子の調節領域を含有する配列を、ヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方が調節領域の5’末端を含有し(5’オリゴヌクレオチド)、他方が転写開始部位を含む調節領域の3’末端を含有する(3’オリゴヌクレオチド)、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドはまた、5’オリゴヌクレオチド内に1つの固有部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、hVIP遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。5’および3’オリゴヌクレオチドは、アドバンテージ(Advantage)(登録商標)ゲノムPCRキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使って、ヒトDNA(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)由来のhVIP遺伝子調節領域のPCR増幅のために使用する。hVIP遺伝子調節領域PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hVIP遺伝子調節領域DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。pECFP−1ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)へのhVIP遺伝子調節領域PCR生成物のクローニングは、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVIP遺伝子調節領域PCR生成物とpECFP−1ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。pECFP−1ベクターDNAのhVIP遺伝子調節領域PCR生成物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成を使用して、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。細胞をLBおよびカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のために、カナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてプラスミドDNAを単離し、hVIP遺伝子調節領域を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、hVIP遺伝子調節領域を含有する、精製した構成プラスミドDNAを、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使用し、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて、HEK293細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、G418を用いて選択し、単離して、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、非必須アミノ酸(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、およびG418(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)を含むDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。G418耐性クローンは、それがhVIP遺伝子調節領域配列を確実に含有するように、サザンブロット法(Southern blotting)によって特徴化し、さらに、hVIP遺伝子調節領域の活性化を、適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでhVIP遺伝子調節領域−ECFPを発現する細胞を、以下のように、hVIP遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、hVIP遺伝子調節領域構成を含有するクローンを使用することを除いて、実施例5と同様に実施する。
【0104】
実施例7 hVPAC 2 受容体を活性化するヒト抗体の製造方法
hVPAC2受容体を活性化する完全なヒトモノクローナル抗体は、以下のように最初に組換えhVPAC2受容体タンパク質を形成することによって産生する。実施例1からの手順に従い、hVPAC2PCR生成物を得る。次いで、このhVPAC2PCR生成物を、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVPAC2遺伝子PCR生成物とpHAT20ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって、pHAT20ベクターにクローニングする。pHAT20ベクターDNAのhVPAC2遺伝子PCR生成物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクター/挿入構成を使用し、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。形質転換させた細胞をLBおよびアンピシリン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにアンピシリン耐性コロニーを選択する。陽性のクローンをアンピシリン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてプラスミドDNAを単離し、hVPAC2遺伝子を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、hVPAC2−pHAT20ベクターDNAを、HAT配列の開始部とhVPAC2−pHAT20構成には存在しない固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む5’オリゴヌクレオチド、および既に使用した3’hVPAC2オリゴヌクレオチドを使用することによって、さらなるPCRクローニングに使用する。オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、hVPAC2−pHAT20構成からのHAT−hVPAC2融合遺伝子をPCR増幅し、上述のようにPCR生成物を精製する。次いで、HAT−hVPAC2融合遺伝子生成物を、クローンテック製BacPAKバキュロウイルス発現システム(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、pBacPAK8ベクターへのクローニングに使用する。HAT−hVPAC2融合遺伝子のpBacPAK8ベクターへのライゲーションは、本質的には上述の通りである。次いで、hVPAC2/HAT−pBacPAK8構成をTOP10’Fコンピテント大腸菌(E. coli)細胞にトランスフェクションし、アンピシリン耐性細胞を選択し、プラスミドDNAを単離して上述のように構成の一体性を確認する。次いで、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、この構成を線形化BacPAK6DNAと共に、Sf21昆虫宿主細胞に共トランスフェクションする。次いで、昆虫細胞を2〜3日インキュベートし、その後、個々の透明なプラークからウイルスを採取する。その後、すべて製造業者(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)の推奨に従って、BacPAK昆虫細胞培地を用い、ウイルスをsf21細胞内で増幅させ、採取したウイルスを力価測定し、力価測定したウイルスをSf21細胞の大規模感染に使用する。次いで、製造業者が推奨する条件を用いて、TALON(登録商標)クローンテック製セルスルー(CellThru)精製キット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使用して、組換えHAT−VPAC2融合タンパク質を精製する。簡潔には、感染の48時間後に、感染させたSf21細胞を採取し、抽出/ローディング緩衝液内で超音波分解する。次いで、細胞溶解物をTALON(登録商標)セルスルー(CellThru)カラムの中に通す。カラムを抽出/ローディング緩衝液で2回洗浄し、結合したHAT−hVPAC2タンパク質を溶出緩衝液で溶出させる。溶出したタンパク質を、製造業者(Bio−Radラボラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、カリフォルニア州ハーキュレス)の推奨に従って、Bio−Rad SDS−PAGEシステムおよびタンパク質定量化システムを用い、一体性に関してSDS−PAGEによって分析し、タンパク質濃度を定量化する。その後、精製したHAT−hVPAC2融合タンパク質を、以下のようにヒトモノクローナル抗体産生のために異種マウス(XenoMouse)動物の免疫化に使用する。10μgの精製した組換えHAT−hVPAC2融合タンパク質を、25μgの補助剤モノホスホリル脂質A(シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス)と組み合わせて使用して、8週間にわたり、何度も10匹の異種マウス(XenoMouse)動物に接種する。接種した動物から血清を取得し、HAT−hVPAC2融合タンパク質でポリスチレンELISAプレート(コーニンググラスワークス(Corning Glass Works)、ニューヨーク州コーニング)を塗布することによってHAT−hVPAC2タンパク質に対する抗体を検出するために、精製したHAT−hVPAC2融合タンパク質を用いる抗原回収ELISAで使用して、PBS−1%BSAでブロッキングし、洗浄して、血清試料の1:50希釈液と共に37℃で1時間インキュベートする。PBSで5回洗浄後、プレートはヒト免疫グロブリンGに対するアルカリ性ホスファターゼ抱合ヤギ抗体と合わせて、37℃で1時間インキュベートする。次いで、プレートをPBSで5回洗浄し、緩衝液中のp−ニトロフェニルホスフェート基質(シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス)によって抗体を検出する。プレートリーダを使用して405nmでの光学密度を測定し、信号を定量化した。高い抗体産生が実証されたマウスを、ハイブリドーマ形成のために使用する。ハイブリドーマは、異種マウス(XenoMouse)動物からの脾臓細胞と非分泌骨髄腫細胞株NSA−bcl2を、30%ポリエチレングリコールPEG450の存在下で、比率4:1の脾臓細胞とNSA−bcl2細胞を用いて融合させることによって生成される。融合細胞を、96ウェルプレートへの希釈を制限することによりクローニングし、10%ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、L−グルタミン、100u/mlペニシリン−ストレプトマイシン、およびヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(すべてライフテクノロジーズ(Life Technologies)(メリーランド州ロックビル)から入手)を含有するRPMI−1640培地内で培養する。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン選択ハイブリドーマからの上清を、前述のようにELISAによってヒト抗体産生に関してスクリーニングした。HAT−hVPAC2融合タンパク質に対するヒト抗体を産生するハイブリドーマは、大規模な抗体産生のため選択される。モノクローナル抗体を、タンパク質G−セファロース(Sepharose)クロマトグラフィーによって精製する。簡潔には、培養したハイブリドーマクローンからの上清を、ローディング緩衝液中でタンパク質G−セファロースカラム(シグマ(SIGMA)、ミズーリ州セントルイス)上に置き、3回洗浄し、IgGを溶出緩衝液で溶出させる。次いで、これらの抗体を、hVPAC2活性化(作動性)潜在性を評価するためのスクリーニングで使用する。これは、実施例3で概略した方法を用いて実施する。hVPAC2受容体に対する作動薬活性を示すそれらのヒトモノクローナル抗体は、指定の候補化合物である。
【0105】
実施例8 VPAC 2 受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の治 療的処置
体重50kgで、長期のベッド休養による腕および足の重度筋萎縮を患うヒト男性被験者に、骨格筋萎縮を改善させるための処置を行う。3ヶ月間、週に1度、抗VPAC2受容体を含むpH6の水溶液15mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【0106】
【表2】
【0107】
処置期間の終わりに、被験者は、腕と足の筋量、強度、および可動性の測定可能な増加を示す。
【0108】
実施例9 VPAC 2 受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
体重55kgのヒト女性被験者に、1ヶ月以内に臀部関節置換手術を計画する。術後回復時の筋肉不使用による骨格筋萎縮のレベルを最終的に低減させるために、手術の前と後で、被験者に骨格筋量を増加させるための処置をする。具体的には、手術前の1か月間および手術後の2ヶ月間、週に1度、抗VPAC2受容体を含むpH6.0の水溶液18mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【0109】
【表3】
【0110】
処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない場合の被験者の予想される状態に比べて、腕と足の筋量、強度、可動性の測定可能な維持を示す。
【0111】
実施例10 VPAC 1 受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
体重45kgのヒト女性被験者に、落下後の上腕の単純骨折を処置するためにキャスト固定術を実施した。被験者に、骨折治癒時の不使用および制限使用による患部の腕と肩の骨格筋萎縮を防止する処置を実施する。具体的には、キャスト固定の日から開始して、週に1度、抗VPAC1受容体を含むpH6.0を13mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【0112】
【表4】
【0113】
処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない場合の被験者の予想される状態および追跡治療に比べ、腕と肩の患部の筋量、強度、および可動性の測定可能な維持、ならびに物理治療課程の短縮を示す。
【0114】
実施例11 VPAC 2 受容体の作動薬である、Ro25−1553を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
昏睡状態の体重50kgのヒト女性被験者を、病院に収容する。被験者に、昏睡状態の間の不使用による全身の骨格筋萎縮を防止するための処置を実施する。具体的には、昏睡状態の間、月に1度、筋肉注射を介して、以下を含むpH6.0の水溶液3mlを被験者に投与する。
【0115】
【表5】
【0116】
処置の結果、被験者は、薬物療法なしの被験者の予想される状態に比べ、昏睡時および意識回復後の、骨格筋量の測定可能な維持、ならびに物理療法の必要性の低下を示す。
本発明は、単に発明の個々の態様を示すことを意図して述べた特定の実施形態の範囲に制限されるものではなく、機能的に等価の方法および成分は、本発明の範囲内にある。これらには、試験動物の種類、VPAC作動薬の性質およびタイプ、動物の性別、萎縮モデル、遺伝的方法を含むVPAC活性化方法などが含まれるが、これに限るものではない。本明細書で示し記載するものに加え、上記の説明および添付の図面を読めば、当技術の習熟者には本発明の様々な修正形態が明らかであろう。このような修正形態は、添付の特許請求の範囲内に入るものとする。
本明細書のすべての参照を、参考として本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
図1〜5で使用される省略形:
【表6】 図1Aおよび1Bは、マウス神経除去萎縮モデルにおけるVPAC1およびVPAC2受容体作動薬(1日2回、皮下に投与)の抗萎縮効果を示す。図1Aは、神経除去した前脛骨筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。図1Bは、神経除去した内側腓腹筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水、B:VPAC1R作動薬(0.1mg/kg)+T、C:VPAC1R作動薬(0.3mg/kg)+T、D:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+T、E:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+T、F:PACAP−38(0.1mg/kg)+T、G:PACAP−38(0.3mg/kg)+T。
図2Aおよび2Bは、マウス神経除去萎縮モデルにおけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬(浸透性ミニポンプによって連続的投与)の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図2Aは、神経除去および正常な前脛骨筋におけるVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図2Bは、正常な内側腓腹筋におけるVPAC2受容体選択的作動薬の肥大誘発効果を示す。X軸に関する説明:A:注入した水、B:VPAC1R作動薬(0.3mg/kg)、C:VPAC1R作動薬(1mg/kg)、D:VPAC1R作動薬(3mg/kg)、E:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)、F:VPAC2R作動薬(1mg/kg)、G:VPAC2R作動薬(3mg/kg)、H:PACAP−38(0.3mg/kg)、I:PACAP−38(1mg/kg)、PACAP−38(3mg/kg)。
図3Aおよび3Bは、マウスの糖質コルチコイド(デキサメタゾン)誘発萎縮モデルにおけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬(1日2回、皮下投与)の抗萎縮効果を示す。図3Aは、糖質コルチコイド誘発萎縮を起こした前脛骨筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。図3Bは、糖質コルチコイド誘発萎縮を起こした内側腓腹筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水+デキサメタゾン(1.2mg/kg/日を飲用水に含める),B:PACAP−38(0.1mg/kg)+デキサメタゾン+T、C:PACAP−38(0.3mg/kg)+デキサメタゾン+T、D:VPAC1R作動薬(0.1mg/kg)+デキサメタゾン+T、E:VPAC1R作動薬(0.3mg/kg)+デキサメタゾン+T、F:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+デキサメタゾン+T、G:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+デキサメタゾン+T。
図4Aおよび4Bは、マウスの不使用(キャスト固定)萎縮モデルにおけるVPAC2受容体選択的作動薬(1日2回、皮下投与)の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図4Aは、キャスト固定誘発萎縮を起こした前脛骨筋における、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553の抗萎縮効果を示す。図4Bは、正常な内側腓腹筋における、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553の肥大誘発効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水、B:VPAC2R作動薬(0.03mg/kg)+T、C:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+T、D:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+T。
図5Aおよび5Bは、ラット神経除去萎縮モデルにおけるVPAC2受容体選択的作動薬(1日2回、皮下投与)の抗萎縮効果を示す。図5Aは、神経除去誘発萎縮を起こした前脛骨筋における、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553の抗萎縮効果を示す。図5Bは、神経除去誘発萎縮を起こした足の長指伸筋(EDL)における、VPAC2R作動薬であるRo25−1553の抗萎縮効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水、B:VPAC2R作動薬(0.03mg/kg)+T、C:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+T、D:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+T。
(技術分野)
本発明は、骨格筋の量若しくは機能を調節する候補化合物、血管活性腸管ペプチド受容体(VPAC)の活性若しくは発現を調節する候補化合物、または血管活性腸管ペプチド(VIP)若しくはVIP類縁体の発現を調節する候補化合物を同定するための方法に関する。本発明はまた、介入のための標的としてVPAC受容体を使用する、骨格筋萎縮を処置するための方法、または骨格筋肥大を誘発するための方法に関する。
【0002】
(配列表の説明)
配列表に含まれる各VPAC受容体タンパク質配列を、対応するジェンバンク受入番号およびクローン元の動物種と併せて表Iに示す。
【0003】
【表1】
【0004】
(背景)
VPACおよびリガンド
血管活性腸管ペプチド(VIP)並びにその機能的および構造的関連類縁体(VIP類縁体)は、平滑筋弛緩(気管支拡張、腸管運動)、微小血管トーン(血管抑制)および透過性の調整、粘液分泌の調整、様々な免疫機能(抗炎症、免疫細胞防護)の変調、神経影響(記憶増進、催眠、食事摂取、概日リズム制御、性的行動)、唾液腺機能の維持、発育成長の調節、およびホルモン分泌(プロラクチン、成長ホルモン、インスリン)の刺激を含め、多くの生理的機能を有することで知られている。VIPおよびVIP類縁体は、ニューロン経路(推定の神経伝達物質として)および神経内分泌経路を介して、その効果を血管活性腸管ペプチド受容体を通じて媒介する。今日までに2つのVPAC受容体が特定されている(VPAC1およびVPAC2)。VPAC1受容体は、ヒト、マウス(ハツカネズミ(Mus musculus))、ラット(ドブネズミ(Rattus norvegicus)およびクマネズミ(Rattus sp.))、ブタ(イノシシ(Sus scrofa))、カエル(ワライガエル(Rana ridibunda))、キンギョ(Carassius auratus)、およびシチメンチョウ(Meleagris gallopavo)をクローン元としてきた。VPAC2受容体は、ヒト、マウス(ハツカネズミ(Mus musculus))、およびラット(ドブネズミ(Rattus norvegicus))をクローン元としてきた。
【0005】
VPAC1およびVPAC2受容体は、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド(PACAP)ファミリーの他のメンバに対する配列相同性に基づいて、PACAP受容体ファミリーに分類される。PACAPファミリーの受容体は、さらにリガンド親和性に基づいて、2つのサブクラスに細分される。PACAPタイプI受容体は、VIPよりもPACAPにはるかに強い親和性を有し、一方PACAPタイプII受容体は、PACAPとVIPにほぼ等しい親和性を有する。VPAC1およびVPAC2受容体は、PACAPとVIPに同様の親和性を有するので、PACAPタイプII受容体として分類される。選択的作動薬および拮抗薬は、PACAPタイプI受容体同様に、分子的かつ薬理的にVPAC1およびVPAC2受容体を区別することができる。これらの作動薬および拮抗薬は、生物活性を特定のVPAC受容体サブクラスに合致させるのに有用であった。
【0006】
VPAC1およびVPAC2受容体は、共にGタンパク質結合受容体(GPCR)クラスに属する。VPAC1およびVPAC2受容体の、特定のGタンパク質への結合の特異性は、検査する組織によって異なるように思われる。筋肉などの組織では、VPAC1またはVPAC2受容体の作動薬活性化が、アデニル酸シクラーゼのGαs活性化をまねく。アデニル酸シクラーゼは、cAMPの形成に触媒作用を及ぼし、それが次には、タンパク質キナーゼAの活性化、細胞内カルシウム放出、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPキナーゼ)活性化を含む、多数の効果を有する。他の研究では、VPAC受容体の作動薬活性後の細胞内イノシトール3リン酸合成の強化が、GαiまたはGαqに結合するVPAC受容体を示唆する。
【0007】
VPAC1およびVPAC2受容体の発現は組織特異性であり、各受容体の発現パターンには差異がある。ヒトでは、VPAC1受容体は、脳、脂肪、肝臓、および心臓で発現され、VPAC2受容体は、肺、膵臓、脳、腎臓、骨格筋、胃、心臓、および胎盤で発現することがわかっている。ラットでは、VPAC1受容体の発現は、松果腺、小腸、肝臓、脾臓、膵臓、肺、大動脈、輸精管、および脳で見られ、VPAC2受容体の発現は、胃、腸、骨格筋、脾臓、膵臓、胸腺、副腎、心臓、肺、大動脈、脳、下垂体、および嗅球で見られる。
【0008】
骨格筋萎縮および肥大
骨格筋は、仕事のための生理的要求または代謝的需要の変化に容易に適合する塑性組織である。肥大は、骨格筋量の増加を指し、骨格筋萎縮は、骨格筋量の減少を指す。急性の骨格筋萎縮は、手術、ベッド休養、または骨折による不使用;脊髄損傷、自己免疫疾患、または感染病による神経除去/神経損傷;無関係条件に対する糖質コルチコイド使用;感染または他の原因による敗血症;病気または飢餓による栄養制限;および宇宙旅行を含めて、様々な原因を追跡可能であるが、これに限るものではない。骨格筋萎縮は、正常な生物学的プロセスを通じて起こるが、ある医療状況では、この正常な生物学的プロセスが衰弱レベルの筋萎縮を引き起こす。例えば、急性の骨格筋萎縮は、整形外科的処置に付随するものを含め、患者の運動抑制状態からのリハビリテーションにおける顕著な制限を与えるが、これに限るものではない。このような場合、骨格筋萎縮を改善するのに必要なリハビリテーション期間は、しばしば、本来の損傷を修復するのに要する期間よりもはるかに長くなる。このような急性の不使用萎縮は、永久的な障害および早死にをまねくことがあるので、既に筋機能および筋量にかなりの加齢性欠損を患っている可能性のある高齢者では特に問題となる。
【0009】
骨格筋萎縮はまた、癌性悪液質、慢性炎症、AIDS性悪液質、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、うっ血性心不全、遺伝病(例えば筋ジストロフィー)、神経変性病、筋肉減少症(年齢に関係する筋肉の喪失)など、慢性的な状態にも起因することがある。これらの慢性状態では、骨格筋萎縮が運動能力の早期喪失をまねき、その結果、疾病関連発症率を増加させる可能性がある。
【0010】
骨格筋の萎縮または肥大を制御する分子的プロセスについては、ほとんど知られていない。骨格筋萎縮を開始させる引き金となるものは、様々な萎縮開始事象に関して異なるが、患部の骨格筋線維では、タンパク質合成の減少およびタンパク質分解の増加、ならびに遅線維(きわめて酸化的な代謝/遅い収縮性タンパク質イソ型)から速線維(きわめて解糖的な代謝/速い収縮性タンパク質イソ型)への転換の収縮性および代謝性酵素タンパク質アイソザイム特徴における変化を含め、いくつかの共通する生化学的変化が生じる。発生する骨格筋での他の変化には、脈管構造の喪失および細胞外マトリックスの再構築が含まれる。速攣縮筋および遅攣縮筋は、相対的な筋肉喪失が特定の萎縮刺激または条件に依存する適切な条件下で、萎縮を実証する。重要なことは、これらの変化すべてが調和して調節され、生理的および代謝的需要の変化に応じて始動または停止することである。
【0011】
萎縮および肥大が生じるプロセスは、哺乳類種にわたって維持されている。多数の研究により、萎縮時に、げっ歯類とヒトで同一の基本的な分子的、細胞的、および生理的プロセスが起こることが実証されている。従って、骨格筋萎縮のげっ歯類モデルをうまく利用して、ヒトの萎縮反応が理解および予測されてきた。例えば、げっ歯類とヒトの両方で様々な手段によって誘発される萎縮は、筋肉の解剖学的構造、断面積、機能、線維タイプ転換、収縮性タンパク質の発現、および組織学的に同様の変化をもたらす。加えて、いくつかの薬剤が、げっ歯類とヒトの両方で骨格筋萎縮を調節することが実証されている。これらの薬剤としては、タンパク質同化ステロイド、成長ホルモン、インスリン様成長因子I、およびβアドレナリン作動薬が挙げられる。総合して、これらのデータは、骨格筋萎縮がげっ歯類とヒトで共通の機構に起因することを実証している。
【0012】
いくつかの薬剤が骨格筋萎縮を調節することがわかり、この徴候に関するヒトでの使用を承認されているが、これらの薬剤は、心筋肥大、腫瘍形成、多毛症、女性の男性化、疾病率および死亡率の増加、肝臓障害、低血糖症、筋骨格系疼痛、組織膨張の増加、頻脈、浮腫など、望ましくない副作用を有する(医師用卓上参考書(Physicians Desk Reference)第54版、2000年)。現在、急性または慢性の骨格筋萎縮のための、きわめて有効かつ選択的な処置が存在しない。従って、骨格筋萎縮を調節する他の治療用薬剤の同定が必要とされている。
骨格筋萎縮の処置で使用する化合物の同定に関する問題の1つは、そのような化合物を同定するための優れたスクリーニング方法がないことであった。本出願人らは、VPAC1およびVPAC2受容体が、骨格筋の量または機能の調節に関与し、VPAC1およびVPAC2受容体の作動薬が、骨格筋萎縮を阻止、かつ/または骨格筋の肥大を誘発することを見出した。
【0013】
(発明の概要)
本発明は、骨格筋萎縮の処置で潜在的に有用、および/または骨格筋肥大の誘発に有用な候補化合物を同定するための、VPAC受容体の使用に関する。特に、本発明は、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するための生体外の方法を提供する。本発明の一実施形態では、この方法は、VPAC受容体に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体に結合するかどうかを決定する工程とを含み、VPAC受容体に結合する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する。本発明の他の実施形態では、この方法は、VPAC受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体を活性化するかどうかを決定する工程とを含み、VPAC受容体を活性化する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する。本発明のさらに他の実施形態では、この方法は、さらに候補化合物のリストを作成する工程を含む。
【0014】
他の態様では、本発明は、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物を同定するための、VPAC受容体の使用に関する。特に、本発明は、VPAC受容体に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体に結合するかどうかを決定する工程と、前の工程でVPAC受容体に結合すると決定された試験化合物またはVPAC受容体に結合することが予めわかっている化合物を非ヒト動物に投与する工程と、試験化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含む方法を提供する。骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。本発明の他の実施形態では、この方法は、VPAC受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がVPAC受容体を活性化するかどうかを決定する工程と、前の工程でVPAC受容体を活性化すると決定された試験化合物またはVPAC受容体を活性化することが予めわかっている化合物を非ヒト動物に投与する工程と、試験化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含む。生体内で骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0015】
本発明は、さらに、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するための方法を提供する。これらの方法は、(i)機能的VPAC受容体を発現する細胞を、受容体を脱感作するのに十分な作動薬の濃度および作動薬−受容体暴露期間で、VPAC受容体作動薬に接触させる工程と、(ii)試験化合物に細胞を接触させる工程と、(iii)VPAC受容体の活性化レベルを決定する工程とを含む。本発明の前述の実施形態では、工程(ii)は、工程(i)の前または後に実施することができる。特定の一実施形態では、本発明は、VPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる候補化合物を、単独でまたはVPAC受容体作動薬と組み合わせて非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するために使用できるかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0016】
本発明は、さらに、VPAC受容体遺伝子調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に試験化合物を接触させる工程と、レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含む、VPAC受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するための方法を提供する。レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、VPAC受容体の発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の一実施形態では、本発明は、VPAC受容体の発現を増加させる候補化合物を非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するために使用できるかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0017】
その他の実施形態では、本発明は、VPAC受容体に特異的な抗体を提供する。特に、本発明は、VPAC受容体に特異的なキメラ抗体またはヒト抗体を提供する。
【0018】
本発明は、さらに、VIPまたはVIP類縁体遺伝子調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に試験化合物を接触させる工程と、レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含む、VIPまたはVIP類縁体の発現を増加させる化合物を同定するための方法を提供する。レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、VIPまたはVIP類縁体の発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の一実施形態では、本発明は、VIPまたはVIP類縁体の発現を増加させる候補化合物を非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【0019】
本発明はまた、骨格筋の量または機能を増加させるための治療用標的としてのVPAC受容体の使用に関する。この使用には、骨格筋の量または機能を増加、および/または骨格筋萎縮を処置するための、VPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化合物、またはVIP類縁体の発現を増加させる化合物の使用が含まれる。特に、本発明は、骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体で骨格筋の量または機能を増加させるための方法であって、骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体を特定する工程と、その被験体に、安全かつ有効な量の、VPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化号物、またはVIP類縁体の発現を増加させる化合物を投与する工程とを含む方法を提供する。その他の実施形態では、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で骨格筋萎縮を処置する方法であって、その被験体に、有効な量のVPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化合物、またはVIP類縁体の発現を増加させる化合物を投与する工程を含む方法を提供する。
【0020】
本発明はまた、骨格筋の量または機能を増加、および/または骨格筋萎縮を処置するための、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物の使用に関する。特に、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で、骨格筋萎縮を処置する方法であって、安全かつ有効な量の、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物を、単独でまたはVPAC受容体作動薬と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。
【0021】
(詳細な説明)
I.用語および定義
以下は、本明細書で使用する用語に関する定義の一覧である。
「作動薬」とは、受容体を活性化するいかなる化合物をも意味する。
「対立形質の変異型」とは、所与の遺伝子または遺伝子生成物の変異形態を意味する。多数の遺伝子が個体群中に2つまたはそれ以上の対立形態で存在し、多数の対立遺伝子を有する遺伝子もあることが、当技術の習熟者には認識されている。
【0022】
「抗体」とは、その文法的な様々な形において、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を意味する。「精製抗体」とは、それが生来付随するタンパク質および自然発生有機分子から、部分的または完全に分離された抗体を意味する。好ましくは、乾燥重量で少なくとも60%抗体、より好ましくは少なくとも75%抗体、さらに好ましくは少なくとも90%抗体、最も好ましくは少なくとも99%抗体を調製する。
「結合親和性」とは、リガンドが受容体と相互作用する傾向を意味し、特異的なVIPリガンド−VPAC相互作用に関する解離定数に反比例する。解離定数は、標準的な飽和、競合、若しくは動的結合技術を介して直接的に、または機能的アッセイおよびエンドポイントに関する薬理学的技術を介して間接的に測定することができる。
【0023】
「キメラ抗体」とは、2つまたはそれ以上の異なる抗体分子由来、すなわち異なる動物種由来の構造要素を含有する抗体を意味する。キメラ抗体には、「ヒト化抗体」として知られる抗体が含まれるが、これに限るものではなく、これには相補的決定領域移植として知られる技術によって生成されるキメラ抗体が含まれるが、これに限るものではない。
「融合」とは、1つのハイブリッドタンパク質をコード化するように、作用可能に結合する2つまたはそれ以上のDNAコード配列を意味する。従って、「融合タンパク質」とは、そのようなハイブリッドタンパク質を指す。
「阻害」とは、特定のプロセスまたは活性を部分的または完全に阻止することを意味する。例えば、完全または部分的に筋萎縮を妨げる場合、その化合物は、骨格筋萎縮を阻害する。
【0024】
本明細書で使用する時、2つのDNA配列は、その間の連鎖の性質が、(1)フレームシフト変異の移入を引き起こさず、(2)プロモーター領域がコード配列の転写を方向づける能力に干渉せず、または(3)対応するRNA転写産物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合に、「作用可能に結合する」と言われる。例えば、コード配列および調節配列は、コード配列の転写を調節配列の影響下または制御下におくようにそれらが共有結合する時に、作用可能に結合する。従って、プロモーター領域は、得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳できるように、そのDNA配列の転写をもたらすことができる時には、コード配列と作用可能に結合する。
「PACAP」とは、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドを意味する。
【0025】
「パーセント同一性」とは、以下のように計算される、2つの配列が共通に有するヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率を意味する。特異的配列(クエリー)のパーセント同一性を計算するには、ジェネティクスコンピュータグループ社(Genetics Computer Group, Inc.)から入手可能なベストフィット(BestFit)比較コンピュータプログラムである、ウィスコンシンパッケージ(Wisconsin Package)、バージョン10.1を用いて、クエリー配列の関連部分をリファレンス配列と比較する。このプログラムは、スミス(Smith)およびウォーターマン(Waterman)の、応用数学の進歩(Advances in Applied Mathematics)、第2号:482〜489(1981年)のアルゴリズムを使用する。パーセント同一性は、ベストフィットプログラムに関する以下の初期設定パラメータで計算する:スコアリングマトリックス(scoring matrix)がblosum62.cmp、ギャップクリエーションペナルティ(gap creation penalty)が8、ギャップエクステンションペナルティ(Gap extension penalty)が2。配列をリファレンス配列と比較する時には、クエリー配列の関連部分は、VPAC配列由来のものになる。例えば、クエリーがVPAC/精製タグ融合タンパク質の場合、パーセント同一性スコアを計算するために、配列のVPACポリペプチド部分だけを整合させる。
【0026】
「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾(例えば、リン酸化反応またはグリコシル化)に関わらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。
「プロモーター」とは、転写の開始、および遺伝子またはコード領域からの転写速度を制御するDNA配列を意味する。
「予防的処置」とは、現時点では骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体の、骨格筋萎縮の発生を完全にまたは部分的に阻止するための防止的な処置を意味する。本明細書の背景の項で説明したように、骨格筋萎縮の恐れのある人がいることが当技術の習熟者には認識されよう。さらに、骨格筋萎縮をまねく生化学的変化を適切に調節すれば、その危険のある個人での萎縮の発生が防止または低減されることが、当技術の習熟者には認識されよう。
「調節」とは、文法的なすべての形において、増加、減少、または維持することを意味し、例えば骨格筋の量または機能を調節するとは、骨格筋の量または機能のレベルを増加、減少、または維持することを意味する。
【0027】
「骨格筋の量または機能の調節」には、骨格筋量の調節、骨格筋機能の調節、またはその両方が含まれる。
「調節要素」とは、作用可能に結合するDNA配列からの転写のレベルを制御できるDNA配列を意味する。調節要素のこの定義には、プロモーターおよびエンハンサーが含まれる。例えば、VPAC受容体遺伝子調節要素とは、VPAC受容体遺伝子からの転写レベルを制御できるDNA配列である。
「レポーター遺伝子」とは、その生成物を好ましくは定量的に検出できるコード配列を意味し、レポーター遺伝子は、測定すべき信号に応答性のある異種プロモーターまたはエンハンサー要素と作用可能に結合する。この状況でのプロモーターまたはエンハンサー要素は、本明細書では「応答要素」と呼ぶ。
【0028】
「選択的作動薬」とは、作動薬が、ある受容体(類)に、他の受容体に比べて顕著に大きい活性を有することを意味するもので、それが他の受容体に関して完全に不活性であることではない。
「骨格筋肥大」とは、骨格筋量の増加、骨格筋機能の増加、またはその両方を意味する。
「骨格筋萎縮」とは、「筋消耗」と同一で、骨格筋量の減少、骨格筋機能の低下、またはその両方を意味する。
「スプライス変異型」とは、代替的なエクソン使用の結果得られるmRNAまたはタンパク質を意味する。細胞のタイプに応じて、または単一の細胞タイプ内でさえ、mRNAがわずかに異なる形態でスプライス変異型として発現されることがあり、従って発現されるmRNAに応じて、翻訳されるタンパク質が異なることが当技術の習熟者には認識されている。
【0029】
物質の「治療的に有効な量」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳類における許容可能な利益対危険比で、処置を受ける被験体で医学的に望ましい結果、例えば骨格筋萎縮の軽減、骨格筋量または骨格筋機能の増加を実現することのできる量である。
「治療的処置」とは、筋量または筋機能の増加が望まれる被験体の処置を意味する。例えば、既に発生した骨格筋萎縮を部分的または完全に改善、またはさらなる骨格筋萎縮の発生を完全または部分的に阻止するための、現在骨格筋萎縮の徴候を示す被験体の処置が、その被験体の治療的処置である。「治療的処置」という用語は、また、例えば、骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体に骨格筋肥大を誘発させる処置、例えば筋量を増加させるための家畜動物の処置を含む。
【0030】
「処置」という用語は、予防的または治療的処置を意味する。
「VIP」は、血管活性腸管ペプチドを意味する。
「VIP類縁体」は、VPAC受容体のリガンドとして作用するポリペプチドを意味する。好ましいVIP類縁体は、PACAP−27、PACAP−38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド(PHI)、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド(PHV)、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15、Arg21)VIP、[(Arg15、20、21Leu17)−VIP−Gly−Lys−Arg−NH2]、[K15、R16、L27、VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25−1553、Ro25−1392、またはPACAP(6−38)である。より好ましいVIP類縁体は、VIP、PACAP−27、PACAP−38、PHI、PHV、Ro25−1553、Ro25−1392、および[K15、R16、L27、VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]である。
【0031】
「VPAC受容体作動薬」とは、VPAC1若しくはVPAC2受容体、またはその両方を活性化することのできる化合物または分子を意味する。VPAC受容体の活性化は、本明細書で以下に説明するように測定することができる。
本明細書で用いるVPAC受容体に関する専門用語は、ハーマー(Harmar)らの薬理学総説(Pharmacological Reviews)(1998年)50(2):265〜270で提案された規約に従う。
「VPAC受容体」とは、VPAC1受容体またはVPAC2受容体を意味する。
【0032】
「VPAC1受容体」とは、任意の動物種由来のVPAC1受容体を意味する。VPAC1受容体は、これまでに、「VIP受容体」、「VIP1受容体」(ラッツ(Lutz)ら、FEBS Lett(1993年)334:3−8)、「VIP/PACAPタイプII受容体」(チッカレリ(Ciccarelli)ら、Regul Pept(1994年)54:397−407)、「HIVR」または「ヒト腸VIP受容体」(A・クービノー(Couvineau)ら、生化学・生物理学研究通信(Biochem. Biophys. Res. Commun.)(1994年)200(2)、769−776)、および「PVR2」(ローリングス(Rawlings)ら、内分泌学(Endocrinology)(1995年)136:2088−2098)と呼ばれてきた。
【0033】
VPAC1受容体の定義には、それに関するcDNAまたは受容体をコード化するゲノム配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これに限るものではない。これらの配列には、受入番号L13288、X75299、M86835、NM_011703、U49434、AF100644、I28734、U31991(部分的cDNA配列)、U56391、E05551、および806702が含まれる。これらのVPAC1受容体のタンパク質配列は、これらのDNA配列のコード領域を翻訳することによって得られ、一般にデータベース登録の一部分として利用可能である。
「VPAC2受容体」とは、任意の動物種由来のVPAC2受容体を意味する。VPAC2受容体はまた、「VIP2」(ラッツ(Lutz)ら、1993年)、「PACAPR−3」(イナガキ(Inagaki)ら、Proc Natl Academy Sci USA(1994年)91:2679−2683)、および「PVR3」(ローリングス(Rawlings)ら、内分泌学(Endocrinology)(1995年)136:2088−2098)とも呼ばれてきた。
【0034】
VPAC2受容体の定義には、それに関する受容体をコード化するDNA配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これに限るものではない。これらの配列には、受入番号X95097、L40764、L36566、Y18423、U18810、D28132、Z25885、U09631、およびA43808が含まれる。これらのVPAC2受容体のタンパク質配列は、これらのDNA配列のコード領域を翻訳することによって得られ、一般にデータベース登録の一部分として利用可能である。
【0035】
「VPAC受容体」という用語には、欠損型および/または変異型タンパク質が含まれ、リガンド結合または信号伝達に必要のない受容体分子の領域は、削除または修飾されてきた。例えば、主要なアミノ酸配列に1つまたはそれ以上の同類変化を有するVPAC受容体が本発明で有用であることが、当技術の習熟者には認識されよう。特定のアミノ酸の、同様の構造または特性を有する異なるアミノ酸による置換(同類置換)が、静止変化(silent change)、すなわち、機能を顕著に変えない変化を引き起こす可能性があることが、当該技術分野で公知である。同類置換は、当該技術分野では周知である。例えば、GPCRは、膜貫通型αヘリックス中のアミノ酸残基の置換を許容でき、これは他の疎水性アミノ酸と共に脂肪の方を向き、機能性を残すものである。欠損および/または同類アミノ酸置換などの変異により自然発生する配列とは異なるVPAC1受容体は、VPAC1受容体の定義に含まれる。欠損および/または同類アミノ酸置換などの変異により自然発生する配列とは異なるVPAC2受容体は、VPAC2受容体の定義に含まれる。
【0036】
当技術の習熟者には、また、上述した以外の種、特に哺乳類種由来のVPAC受容体が本発明で有用であることも認識されよう。当技術の習熟者には、さらに、公知のVPAC種の配列からのプローブを使用することによって、cDNAまたは公知の配列に相同なゲノム配列が、公知のクローニング方法によって同じまたは代替的な種から得られることがあることも認識されよう。このようなVPAC1受容体は、VPAC1の定義に含まれ、このようなVPAC2受容体は、VPAC2の定義に含まれる。
加えて、当技術の習熟者には、VPAC受容体の対立形質変異型またはスプライス変異型が特定の種に存在する可能性があり、これらの変異型が本発明で有用であることが認識されよう。このようなVPAC1受容体の変異型は、VPAC1の定義に含まれ、このようなVPAC2受容体の変異型は、VPAC2の定義に含まれる。
【0037】
VPAC1若しくはVPAC2受容体ポリペプチド、またはVPAC1若しくはVPAC2受容体ポリペプチド断片の、非VPACポリペプチドとの融合体は、VPAC受容体融合タンパク質と呼ばれる。公知の方法を用いて、当技術の習熟者には、VPAC1受容体またはVPAC2受容体の融合タンパク質を製造することができ、これは、天然のVPAC1およびVPAC2受容体とは異なるが、本発明での有用性を残している。VPAC1受容体融合タンパク質は、VPAC1受容体の定義の範囲に含まれ、VPAC2受容体融合タンパク質は、VPAC2受容体の定義の範囲に含まれる。
「機能的VPAC受容体」とは、生体内または生体外で、VIPまたはVIP類縁体に結合するVPAC受容体を指し、リガンド結合の結果として活性化する。
【0038】
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、タンパク質化学、薬理学、または分子生物学の技術者に一般に理解されているのと同一の意味を有する。本明細書で述べる、方法、材料、および実施例は、制限的なものではない。本明細書に記載のものと同様または等価の、他の方法および材料は、本発明の実施または試験で使用することができる。
【0039】
II.骨格筋量の調節におけるVPAC受容体の役割
本発明を利用すると、従来技術における情報が得られ、以下のことが教示されることが、当技術の習熟者には認識されよう。本明細書の結果は、VPAC受容体の作動薬が、骨格筋肥大を誘発、並びに/または神経除去、不使用、および副腎皮質ホルモンによって誘発される骨格筋萎縮を阻害することを示しており、従って骨格筋萎縮プロセスにおけるVPAC受容体の調節的役割または機能が実証される。理論に縛られることを意図しないが、VPAC受容体作動薬が骨格筋萎縮および肥大に及ぼす効果は、筋肉細胞への直接的な効果によるものと考えられている。ただし、この効果を、全体または一部分で、作動薬の非筋肉組織への分泌促進効果を通じて媒介することも可能である。
【0040】
生体内でのVPAC受容体の固有の役割を、PACAP受容体、VPAC1受容体、またはVPAC2受容体のいずれかに対して選択的な作動薬である薬理学的薬剤を用いて、以下に説明される骨格筋萎縮の様々なモデルで調査した。使用した選択的作動薬には、PACAP−38(VPAC1/VPAC2/PAC1受容体には非選択的)(バッケムバイオサイエンス社(Bachem Biosciences Inc.)(ペンシルベニア州キングオブプルシア);グーレット(Gourlet)、バートンゲン(Vertongen)らの、ペプチド(Peptides)18(1997年)403〜408の方法に従って合成された[K15、R16、L27、VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](PACAP38と同様の効力を有するVPAC1受容体選択的作動薬);およびシンペップ社(Synpep Inc.)(カリフォルニア州ダブリン)から購入したRo25−1553(PACAP38と同様の効力を有するVPAC2受容体選択的作動薬)が含まれる。使用前に、薬剤を、HPLCによって純度に関して、質量分析法によって組成物に関して調べた。これらの薬剤は、科学文献(グーレット(Gourlet)、ヴァンダーミアズ(Vandermeers)らの、ペプチド(Peptides)18(1997年)1539〜1545;グーレット(Gourlet)、バートンゲン(Vertongen)らの、ペプチド(Peptides)18(1997年)403〜408;ゴーゼス(Gozes)らの、現代医療化学(Curr. Med. Chem.)6(1999年)1019〜1034)で十分に特徴付けられ、記載されてきた。
【0041】
図1〜5は、VPAC1またはVPAC2受容体のための作動薬の投与が、統計的に有意に、骨格筋萎縮の阻害、または肥大の誘発を引き起こすことを実証する、実験の結果を示す。VPAC1またはVPAC2受容体作動薬を、1日に2回、テオフィリンと組み合わせて投与すると、骨格筋萎縮の動物モデルで骨格筋萎縮が阻害された。テオフィリンは、VPAC1およびVPAC2受容体作動薬の作用の期間および大きさを増強するために添加され、従ってこれらの化合物の有効性が高められる。これらの萎縮モデルにテオフィリンを単独で投与しても効果はなく、VPAC1およびVPAC2受容体作動薬をテオフィリンと組み合わせた抗萎縮効果が、VPAC受容体作動薬の効果によるものであることが実証された。さらに、浸透性ミニポンプを介して、テオフィリンを含まずに、VPAC1およびVPAC2受容体作動薬を連続投与すると、やはり骨格筋萎縮が阻害、および/または骨格筋肥大が引き起こされた。
【0042】
具体的には、図1は、VPAC1受容体選択的作動薬である、[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](VPAC1R作動薬)、VPAC2受容体選択的作動薬である、Ro25−1553(VPAC2R作動薬)、またはVPAC1/VPAC2受容体非選択的作動薬である、PACAP−38を利用したマウス神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、1日に2回、図1Aおよび1Bに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。これらの作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した(VPAC受容体作動薬によって誘発されたcAMP信号の作用の大きさおよび期間を増加させるために含める)。9日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、非特異的VPAC受容体作動薬であるPACAP−38が、神経除去した前脛骨筋(図1A)および内側腓腹筋(図1B)の萎縮を阻害することが実証された。VPAC1受容体選択的作動薬である[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]は、神経除去した内側腓腹筋(図1B)の萎縮を阻害した。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、神経除去した前脛骨筋(図1A)および内側腓腹筋(図1B)の萎縮を阻害した。この結果の統計的有意性は、ANCOVA(ダグラス・C・モンゴメリ(Douglas C. Montgomery)の、実験の設計と分析(Design and Analysis of Experiments)、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley and Sons)(ニューヨーク)(第2版、1984年))を用いて決定した。
【0043】
図2は、VPAC1受容体選択的作動薬である、[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](VPAC1R作動薬)、VPAC2受容体選択的作動薬である、Ro25−1553(VPAC2R作動薬)、またはVPAC1/VPAC2受容体非選択的作動薬である、PACAP−38を利用したマウス神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスに、実験期間の終わりまで、ALZeT浸透性ミニポンプを用いた5μl/時間の連続注入によって、上述の薬剤または対照ビヒクル(生理食塩水)を投薬した。薬剤の1日の供給量は、図2Aおよび2Bに示す通りである。ミニポンプの埋め込みは、坐骨神経摘出と同時に実施した。9日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、神経除去した前脛骨筋(図2A)の萎縮を阻害した。加えて、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、神経除去していない(対照)前脛骨筋(図2A)および内側腓腹筋(図2B)の肥大を誘発した。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0044】
図3は、VPAC1受容体選択的作動薬である、[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2](VPAC1R作動薬)、VPAC2受容体選択的作動薬である、Ro25−1553(VPAC2R作動薬)、またはVPAC1/VPAC2受容体非選択的作動薬である、PACAP−38を利用したマウスの糖質コルチコイド誘発性萎縮研究の結果を示す。糖質コルチコイドであるデキサメタゾンを飲用水に添加後(1.2mg/kg/日)に、オスのマウスの肩甲骨間領域に、1日に2回、図3Aおよび3Bに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。これらの作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した。VPAC受容体作動薬およびデキサメタゾンの投与開始から9日で、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、非特異的VPAC受容体作動薬であるPACAP−38が、糖質コルチコイド投与によって誘発される内側腓腹筋の萎縮を阻害することが実証される(図3B)。VPAC1受容体選択的作動薬である[K15、R16、L27VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]は、糖質コルチコイド投与によって誘発された前脛骨筋の筋萎縮を阻害した(図3A)。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、糖質コルチコイド投与によって誘発された前脛骨筋(図3A)および内側腓腹筋(図3B)の筋萎縮を阻害した。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0045】
図4は、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553(VPAC2R作動薬)を利用した、マウスの不使用(キャスト固定)萎縮研究の結果を示す。右後肢のキャスト固定後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、1日に2回、図4Aおよび4Bに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。VPAC2R作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した。9日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553は、前脛骨筋(図4A)の不使用誘発性萎縮を阻害した。加えて、Ro251553は、内側腓腹筋の肥大を誘発した。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0046】
図5は、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553(VPAC2R受容体)を利用した、ラットの神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのラットの肩甲骨間領域に、1日に2回、図5Aおよび5Bに記載の用量でVPAC2R受容体作動薬のいずれかまたは対照ビヒクル(生理食塩水)を9日間皮下注射した。VPAC2R受容体作動薬は、1日に2回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン(T−30mg/kg)の腹腔内投与と併せて共投与した。9日目に、前脛骨筋および足の長指伸筋(EDL)を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553が、神経除去した前脛骨筋(図5A)およびEDL筋(図5B)の萎縮を阻害することが実証された。結果の統計的有意性は、ANCOVAを用いて決定した。
【0047】
III.VPAC受容体、VIPまたはVIP類縁体、あるいはVPAC受容体を発現する細胞株の調製
VPAC1受容体、VPAC2受容体、VIPおよびVIP類縁体は、抗体の生成、本発明のスクリーニングアッセイでの試薬としての使用、および骨格筋萎縮の処置のための医薬品試薬としての使用を含めて、様々な使用に関して調製することができるが、これに限るものではない。本発明の特定の実施形態には、精製ポリペプチドが最も有用であり、他の実施形態には、ポリペプチドを発現する細胞株が最も有用であることが、当技術の習熟者には明白である。例えば、VPAC受容体の構造的及び機能的特徴を保持することが重要な状況、例えばVPAC受容体を活性化する候補化合物を同定するスクリーニング方法では、機能的VPAC受容体を発現する細胞を使用することが望ましい。
【0048】
VIPおよびVIP類縁体が短鎖ポリペプチドであるので、これらのポリペプチドが、組換え手段によってではなく、当該技術分野で周知の技術を用いて直接合成によって最も好都合に得られることが当技術の習熟者には認識されよう。加えて、これらの分子の多くが市販されている。
VPAC受容体源がポリペプチドを発現する細胞株である場合、細胞は、例えば内生的にVPAC受容体を発現させることができ、内生VPAC受容体の発現を増加させるように刺激され、またはVPAC受容体を発現するように遺伝子操作されてきた。細胞株が対象のポリペプチドを発現するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、適切な抗体によるポリペプチドの検出、タンパク質をコード化するmRNAを検出するためのDNAプローブの使用(例えば、ノーザンブロットまたはPCR技術)、または対象のポリペプチドに選択的な薬剤の結合の測定(例えば、放射性同位体標識した選択的作動薬)がある。
【0049】
VPAC1、VPAC2、またはこれらのポリペプチドを発現する細胞株の調製で組換えDNA技術を用いることが、特に企図されている。このような組換え方法は、当該技術分野では周知である。組換えVPAC1またはVPAC2受容体を発現するには、1つまたはそれ以上の調節要素の制御下で対象のポリペプチドをコード化する核酸を含む発現ベクターを調製する。いくつかの種由来のVPAC1およびVPAC2受容体をコード化するゲノムまたはcDNA配列は、ジェンバンク(GenBank)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で入手可能)に記載されており、そこから容易に入手可能である。VPAC1受容体配列に関する受入番号としては、L13288(ヒト);ヒトVPAC1受容体に関する完全な遺伝子配列を併せて構築する(収集リストは806702にある)、U11079、U11080、U11081、U11082、U11083、U11084、U11085、U11086、U11087;X75299(ヒト);M86835(ドブネズミ(Rattus norvegicus));NM_011703(ハツカネズミ(Mus musculus))、U49434(イノシシ(Sus scrofa))、AF100644(ワライガエル(Rana ridibunda))、I28734(ブタ(Porcine))、E05551(クマネズミ(Rattus sp.))、およびU56391(キンギョ(Carassius auratus))が挙げられる。VPAC2受容体配列に関する受入番号としては、X95097(ヒト)、L40764(ヒト)、L36566(ヒト)、Y18423(ヒト)、U18810(ヒト)、D28132(ハツカネズミ(Mus musculus))、Z25885(ドブネズミ(Rattus norvegicus))、U09631(ドブネズミ(Rattus norvegicus))、およびA43808(ラット)が挙げられる。この公的に利用可能な配列情報を用いて、VPAC1またはVPAC2受容体をコード化する核酸分子を単離する手段の1つは、天然のDNAプローブ、または当該技術分野で周知の方法、例えば適切なライブラリからの配列のPCR増幅によって人工的に合成したDNAプローブによる、ゲノムDNAまたはcDNAライブラリのスクリーニングである。その他の方法は、対象の受容体に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、特定の組織(骨格筋など)から単離されたmRNAから、直接的にcDNAをPCR増幅することである。このように単離されたmRNAは、市販されている。当技術の習熟者には、さらに、公知のVPAC受容体配列の一部分に対応する核酸プローブを使用することによって、相同なcDNAまたは他の種からのゲノム配列を、公知の方法を用いて得ることができることも認識されよう。本発明の方法に特に有用であるのは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル、チンパンジー、マーモセット、イヌ、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、ニワトリ、およびシチメンチョウを含めた種由来のVPAC受容体であるが、これに限るものではない。次いで、当該技術分野で周知の方法によって、対象のVPAC受容体をコード化する単離核酸分子を、適切な発現ベクターに連結させる。このようにして調製される発現ベクターが宿主細胞中で発現し、受容体を発現する宿主細胞は、スクリーニングアッセイで直接的に使用されるか、または、受容体を発現する宿主細胞から受容体を単離し、単離された受容体をスクリーニングアッセイで使用する。
【0050】
本発明の目的で使用できる宿主発現ベクター系としては、VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換させた細菌(例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B.subtilis))などの微生物;VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換え酵母発現ベクターによって形質転換させた酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピヒア(Pichia));VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス(baculovirus))で感染させた昆虫細胞系;VPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス)で感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)によって形質転換させた植物細胞系;または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)若しくは哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、レトロウイルスLTR)を含有し、さらにVPAC受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換え発現構造を有する哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、HEK293、NIH3T3)が挙げられるが、これに限るものではない。
【0051】
宿主細胞を用いて、対象のポリペプチドを産生する。VPAC受容体は膜結合分子であるので、宿主細胞膜から精製、またはVPAC受容体を細胞膜中に固定して使用、すなわち、細胞全体または細胞の膜断片を使用する。このような発現系からのVPAC受容体の精製または濃縮は、当技術の習熟者に周知の方法によって、適切な界面活性剤または脂質ミセルを用いて達成される。
細菌系では、多数の発現ベクターが、発現する遺伝子生成物に意図される用途に応じて有利に選択される。例えば、VPAC受容体に対する抗体の生成のためにこのようなタンパク質を大量に産生する時には、高レベルのタンパク質生成物の発現を導くベクターが望ましい。当技術の習熟者は、このようなベクター構成を生成し、融合タンパク質選択的カラムや抗体カラムなどの選択的な精製技術、および非選択的精製技術を含めた様々な方法によって、タンパク質を精製することができる。
【0052】
昆虫タンパク質発現系では、バキュロウイルスA.カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcNPV)は、ヨトウガ(S.frugiperda)細胞で異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。この場合、VPAC受容体ヌクレオチド配列は、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、AcNPVプロモーターの管理下に置かれる。次いで、組換えウイルスを使用して、挿入した遺伝子を発現させる細胞を感染させ、当技術の習熟者に公知の多くの技術のうちの1つによってタンパク質を精製する。
【0053】
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を使用することができる。これらの発現系の使用には、しばしば、挿入したヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために、ベクター中で特定の開始信号を形成する必要がある。これは、内生的な開始信号を含まないVPAC受容体遺伝子の一部分を使用する場合に、特に重要である。挿入したヌクレオチド配列のコード領域の枠内でのこの開始信号の配置、ならびに転写および翻訳促進要素の添加、および組換えタンパク質の精製は、当技術の習熟者に公知の多くの方法の1つによって達成される。哺乳類宿主細胞では、組換えタンパク質の必須な翻訳後修飾ができる適切な細胞タイプを選択することも重要である。このような修飾、例えば、開裂、リン酸化反応、グリコシル化などには、修飾酵素を含有する適切な宿主細胞の選択が必要である。このような宿主細胞としては、CHO、HEK293、NIH3T3、COSなどが挙げられるが、これに限るものではなく、当技術の習熟者には公知である。
【0054】
長期的で組換えタンパク質の高い発現には、安定な発現が好ましい。例えば、安定してVPAC受容体を発現する細胞株が作りだされてもよい。当技術の習熟者は、電気穿孔法、リン酸カルシウムトランスフェクション、またはリポソーム媒介トランスフェクションなどの公知の方法に従って、安定してVPAC受容体を発現する細胞株を生成することができる。これは、通常、適切な発現制御要素(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写終止端配列、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位など)を含む、発現ベクター、選択マーカ、および対象の遺伝子を用いて、細胞をトランスフェクションすることによって達成される。選択マーカは、対象の遺伝子として同じベクター内に含有されるか、またはVPAC配列含有ベクターと共にトランスフェクションする別個のベクター上に含有されることができる。発現ベクター中の選択マーカは、選択に対する耐性を与えることができ、細胞がベクターを安定的にその染色体に組み入れるようにし、細胞を成長させて、次にクローニングされ細胞株に拡張することができる増殖巣を形成させる。あるいは、発現ベクターにより、マーカの物理的特質を用いて選択可能マーカを発現する細胞を選択することができ、すなわち、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現により、蛍光活性細胞分類(FACS)分析を用いてマーカを発現する細胞を選択することができる。
【0055】
当技術の習熟者は、対象の遺伝子がうまく組み入れられた細胞を選択できるようにするために、トランスフェクションに適した細胞タイプを選択することができる。例えば、選択マーカが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの場合、適した細胞のタイプは、それぞれ、tk−、hgprt−、またはaprt−細胞になる。または、選択マーカが、メトトレキサート、ミコフェノリン酸、G−418、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える、それぞれdhfr、gpt、neo、またはhygroの場合、野生型細胞を使用することができる。このような組換え型細胞株は、VPAC受容体の活性に影響を及ぼす候補化合物の同定に有用である。
【0056】
IV.VPAC受容体抗体の調製
VPAC受容体の1つまたはそれ以上のエピトープを選択的に認識する抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab発現ライブラリを用いて産生される分子、トランスジェニックマウスで産生されるヒト抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)、および上述のいずれかの断片に結合するエピトープが挙げられる。治療的な使用の場合、キメラ抗体またはヒト抗体が好ましく、ヒト抗体が最も好ましい。
【0057】
抗体は、試験化合物の評価、例えばVPAC受容体ポリペプチドの不動化に関して、本明細書で説明する化合物スクリーニングスキームと組み合わせて使用でき、または、このような抗体を、遺伝子治療技術と組み合わせて使用し、細胞内で、またはこれらの遺伝子を導入する患者の組織内で直接、例えばVPAC受容体の発現を評価することができる。加えて、本発明の抗体は、骨格筋萎縮の処置で有用である。VPAC受容体に選択的な抗体は、VPAC受容体作動薬である抗体の部分集合を同定するために、本発明の方法によってスクリーニングすることができる。加えて、VIPまたはVIP類縁体に特異的な抗体に対して生成される抗イディオタイプ抗体は、VPAC受容体作動薬として有用な可能性があり、抗VPAC抗体と同様に、本発明の方法によってVPAC受容体を活性化する能力に関してスクリーニングすることができる。
【0058】
抗体の産生では、当該技術分野で周知の方法によって、VPAC、VIP若しくはVIP類縁体、抗VIP抗体、抗VIP類縁体抗体、またはこれらの免疫原性断片で注射することにより、様々な宿主動物を免疫化することができる。抗イディオタイプ抗体の調製では、免疫原は、抗VIP抗体または抗VIP類縁体抗体である。抗イディオタイプ抗体の産生については、例えば米国特許第4,699,880号に記載されており、これを参考として本明細書に組み込む。適切な宿主動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、およびウマが挙げられるが、これに限るものではない。免疫化技術は、当該技術分野で周知である。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から精製することができ、またはモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法によって生成することができる。これらの技術には、クーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)の周知のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術が含まれるが、これに限るものではない。モノクローナル抗体は、κまたはλ軽鎖を含有する、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgDを含めて、いかなる免疫グロブリンのクラスのものでもよい。
【0059】
ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性のため、ヒトの患者の治療的処置に使用する時には、非ヒト抗体に対してはキメラ抗体が好ましい。キメラ抗体を産生および使用する技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、バズワニ(Vaswani)らのアレルギー喘息免疫学年報(Ann. Allergy Asthma Immunol.)(1998年)81:105〜119、ファラー(Farah)らの真核生物遺伝子発現総評(Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression)(1998年)8(3−4):321−56、米国特許第5,807,715号、同第4,816,397号、同第4,816,567号、および同第5,824,307号に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。
【0060】
完全ヒト抗体は、非ヒト抗体よりも免疫原性が低いので、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。このような抗体を、内生免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は実質的に発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現できる、トランスジェニックマウスを用いて産生することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばVPACのすべてまたは一部分によって通常の様式で免疫化される。抗原に反する指向性のあるモノクローナル抗体は、これらの免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて得られる。この技術は、米国特許第5,874,299号、同第5,877,397号、同第5,569,825号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、および同第6,075,181号に詳細に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。ヒト免疫グロブリンをハイブリドーマ細胞の培養によって直接得る代替案として、ハイブリドーマ細胞を、その後の発現または遺伝子操作のための再配列重鎖および軽鎖部位源として使用することができる。高レベルの適切なmRNAが利用可能であるので、このような抗体産生細胞からの遺伝子の単離は、容易である。再生し、再配置した部位は、所望通りに操作することができる。例えば、一定領域をなくすか、若しくは異なるイソタイプのもので置き換えることができ、または単鎖Fv領域をコード化するために様々な領域を連結させることができる。このような技術については、PCT国際公開特許WO96/33735およびWO96/34096に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。
【0061】
V.試験化合物の選択
本発明のアッセイに従ってスクリーニングできる化合物としては、植物や動物抽出物などの天然生成物、合成化学物質、ならびにタンパク質、ランダムペプチドライブラリのメンバおよびD−またはL−型アミノ酸から成る順列組み合わせ的化学由来の分子ライブラリを含むがこれには限定されない可溶性ペプチド、ホスホペプチド(ランダムまたは部分的に変性した、指向性ホスホペプチドライブラリのメンバを含むが、これには限定されない)などのペプチド、抗体(ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、抗イディオタイプ、または単鎖抗体、ならびにFab、F(ab’)2及びFab発現ライブラリ断片、ならびにこれらのエピトープ結合断片を含むが、これには限定されない)、有機及び無機分子を含めた生物学的活性材料を含めて公知の化合物ライブラリが挙げられるが、これに限るものではない。
【0062】
試験化合物のより伝統的な供給源に加え、コンピュータモデルおよびサーチ技術により、VPACのリガンド結合部位から、または既に同定したVPAC受容体の作動薬からの構造的な情報を用いることによって、試験化合物の理論的選択が可能になる。試験化合物のこのような理論的選択により、治療用候補化合物を同定するためにスクリーニングしなければならない試験化合物の数を減らすことができる。VPAC受容体はGPCRであり、従ってVPACタンパク質配列の知識が、潜在的リガンドのスクリーニングのために使用できる結合部位のモデル生成を可能にする。このプロセスは、いくつかの様式で達成することができる。最も確固たる手法とは、テンプレート(バクテリオロドプシンまたはロドプシン結晶構造または他のGPCRモデルから得られる)へのVPAC受容体配列の配列整合の生成、アミノ酸構造の変換、および分子力学および視覚的検査によるモデルのリファイニングを伴うものである。強い配列整合を得られない場合、疎水性ヘリックスのモデル構築によって、モデルを生成することもできる。次いで、既知のロドプシン構造の一般的なレイアウトから開始する他のものに対して相対的に各ヘリックスを回転させ翻訳することによって、これらを組み合わせる。残基と残基の接触を示す変異型データも使用することができ、これらの接触が達成されるように、ヘリックスを互いに対して相対的に位置決めすることができる。このプロセス中、既知のリガンドの、ヘリックス内の結合部位空洞内へのドッキングを用いて、リガンドの結合を安定化させる相互作用を発生させることによって、ヘリックスの位置決めに役立たせることもできる。モデルは、分子力学を用いた精製、ならびに標準的な相同性モデリング技術を用いた細胞内および細胞外ループのループ構築によって完成させることができる。GPCR構造およびモデリングに関する一般的な情報は、T・シェーンベルグ(Schoneberg)らの分子および細胞内分泌学(Molecular and Cellular Endocrinology)、151(1999年)、181〜193、D・フラワー(Flower)の生物化学および生物理学公報(Biochimica et Biophysica Acta)、1422(1999年)、207〜234、およびP・M・セクストン(Sexton)の薬物の発見と開発における最新の見解(Current Opinion in Drug Discovery and Development)、2(5)(1999年)、440〜448に見ることができ、これらを参考として本明細書に組み込む。
【0063】
モデルを完成させた後は、いくつかの既存のコンピュータプログラムの1つを用いることによって、例えば潜在的リガンドのスクリーニングに使用することができる。これらの最も一般的なものは、DOCKプログラム(UCSF分子設計インスティテュート(UCSF Molecular Design Institute)(カリフォルニア州サンフランシスコ私書箱0446、パルナサスアヴェニュー533、U−64、94143−0446)である。その変異型のいくつかのものにおいては、立体的適合および結合部位への大まかな静電相補性のために、市販および/または専売化合物のデータベースをスクリーニングすることができる。しばしば、DOCKで優れた得点の分子が、リガンドになる高い可能性を有することがわかっている。使用できるその他のプログラムは、FLEXX(トライポス社(Tripos Inc.)、ミズーリ州セントルイス、サウスハンリーロード(South Hanley Rd.)1699、63144−2913 www.tripos.com)である。このプログラムはかなり遅いので、化合物のより小規模のデータベースを通す検索に通常制限されている。FLEXX内のスコアリングスキームは、より詳細にわたっており、通常、DOCKよりも結合能力の優れた推測が得られる。FLEXXは、DOCKの提案を確認するために、または既知のリガンド若しくはテンプレートから組み合わせて生成される化合物のライブラリを調査するために最もよく使用される。
【0064】
VI.骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
VPAC受容体が骨格筋萎縮を調節する役割を果たすことがわかったことで、骨格筋萎縮の予防的または治療的処置に最終的に使用することができる候補化合物を同定するための、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする様々な方法が可能になる。本発明は、VPAC受容体に結合し、VPAC受容体を活性化し、VPAC受容体若しくはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続若しくは増大させ、VPAC受容体遺伝子の発現を増加させ、またはVIP若しくはVIP類縁体遺伝子の発現を増加させる能力に関して、試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【0065】
ヒトにおいて、VPAC1受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、初期の生体外スクリーニングを、60%より多くがヒトVPAC1受容体(受入番号L13288(配列ID番号:1))の配列と同一のアミノ酸配列を有するVPAC1受容体を用いて実施することが好ましい。より好ましくは、VPAC1受容体の配列が、配列ID番号:1に70%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:1に80%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:1に90%より多くが同一である。試験化合物を、ヒトVPAC1受容体に対してスクリーニングすることが最も好ましい。非ヒト種において、VPAC1を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のVPAC1受容体を使用することが好ましい。
【0066】
ヒトにおいて、VPAC2受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、初期の生体外スクリーニングを、60%より多くがヒトVPAC2受容体(受入番号X95097(配列ID番号:10))の配列と同一のアミノ酸配列を有するVPAC2受容体を用いて実施することが好ましい。より好ましくは、VPAC2受容体の配列が、配列ID番号:10に70%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:10に80%より多くが同一であり、より好ましくは、配列ID番号:10に90%より多くが同一である。試験化合物を、ヒトVPAC2受容体に対してスクリーニングすることが最も好ましい。非ヒト種において、VPAC2受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のVPAC2受容体を使用することが好ましい。
【0067】
本発明の方法は、大量処理用途を実施するが、この方法でわずか1つの試験化合物を使用することは、スクリーニングという用語に包含される。VPAC受容体を活性化し、VPAC受容体若しくはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続若しくは増大させ、VPAC受容体遺伝子の発現を増加させ、またはVIP若しくはVIP類縁体遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、本発明の方法によって決定されるように、本明細書では「候補化合物」と呼ぶ。このような候補化合物を使用して、骨格筋の量または機能を調節することができる。ただし、より典型的には、生体外スクリーニングのこの第1レベルは、追加的なレベルのスクリーニングでさらに調査するに値する化合物、すなわち候補化合物を、より狭い範囲で選択するための手段を提供するものである。本発明の使用が、1つまたはそれ以上の試験化合物の群から、さらなる調査に値する化合物の部分集合を同定するためのものであることが、当事者には認識されよう。また、本発明のアッセイが、他の候補化合物に対して相対的に、特定の候補化合物の予想される有用性をランク付けするのに有用であることも、当技術の習熟者には認識されよう。例えば、10nMでVPACを活性化する候補化合物は、1000nMでVPACを活性化する(しかし10nMでは活性化しない)ものより関心が高い。このような情報を用いて、当技術の習熟者は、さらなる調査に関してスクリーニングの第1レベルで同定された候補化合物の部分集合を選択することができる。ほんの一例であるが、200nM未満の濃度でVPACを活性化する化合物には骨格筋萎縮の動物モデルでさらに試験を実施し、閾値より高いものにはそれ以上の試験を実施しない。また、試験化合物群の選択方法、および陽性のものの選択方法に応じて、試験化合物のある割合だけが候補化合物として同定され、この割合が非常に小さいものであることも、当事者には認識されよう。
【0068】
以下で説明するアッセイシステムは、VPAC受容体、またはVPAC受容体を発現する細胞を含むキットに形成してもよく、それは様々な容器、例えばバイアル瓶、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなどに詰めることができる。その他の試薬は、別個の容器に入れて、キット、例えば陽性対照試料、陰性対照試料、緩衝液、および細胞培養媒質と合わせて提供することができる。
【0069】
一実施形態では、本発明は、VPAC受容体に結合する候補化合物を同定するために、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。化合物の受容体への結合を決定する方法は、当該技術分野では周知である。通常、このアッセイには、試験化合物を含むまたは含まない環境で受容体に結合することがわかっている標識化合物と共に、VPAC受容体源をインキュベートする工程と、結合した標識化合物の量を決定する工程とを含む。本明細書に記載されるように、VPAC受容体源は、VPAC受容体を発現する細胞、またはある形態の単離VPAC受容体であることができる。標識化合物は、好ましくは定量的に測定できるように、VIPまたはいかなるVIP類縁体標識(例えば、125I標識、ユーロピウム標識、フルオレセイン標識、GFP標識、35S−メチオニン標識)でもあることができる。このような標識技術は、当該技術分野では周知である。VPAC受容体に結合する試験化合物は、受容体に結合する標識リガンドの量を低減させるので、対照試料(試験化合物を含まない)からのものに比べて信号レベルが低下する。この技術の変形形態が記載されており、これは、Gタンパク質非連結剤を含むまたは含まない環境で結合する受容体(例えば、グアニンヌクレオチド類縁体、すなわちGpppNHpを含むまたは含まない環境で結合)が、作動薬と拮抗薬を区別できるものである。M・キーン(Keen)の受容体シグナルトランスダクションプロトコルにおける膜調製および完全な状態の細胞のための放射性リガンド結合方法(Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact cells in Receptor Signal Transduction Protocols)、R.A.J.チャリス(Challis)(編集)、ヒュマナプレス社(Humana Press Inc.)、ニュージャージー州トトウェイ(1997年)を参照されたい。
【0070】
VPAC1またはVPAC2に特異的に結合する(すなわち、1つのタイプの受容体には結合するが他のタイプには結合しない)化合物を区別することが望まれる時には、上述のアッセイは、VPAC受容体の一方だけ発現する細胞若しくは細胞由来の膜を使用して実施、またはアッセイを特定の受容体の組換え源によって実施すべきである。2つ以上の形態のVPACを発現する細胞は、対象外のVPAC受容体遺伝子を不活性または無効にするために、相同組換えを用いて修飾することができる。あるいは、VPAC源が2つ以上のVPAC受容体タイプを含有する場合、アッセイで得られる信号から、対象外の受容体によって産生されたバックグラウンド信号を差し引かなければならない。バックグラウンド反応は、アンチセンス、抗体、または選択的拮抗薬を使用することによって、対象外のVPAC受容体からの信号を排除することを含めて、多数の方法によって決定することができる。
【0071】
その他の実施形態では、本発明は、VPAC受容体を活性化する候補化合物を同定するために、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。通常、このアッセイは、細胞ベースのものであるが、上述のように作動薬と拮抗薬を区別できる細胞不使用アッセイも知られている。細胞ベースのアッセイは、VPAC1またはVPAC2受容体を発現する細胞を試験化合物または対照に接触させる工程と、VPAC受容体シグナルトランスダクション経路の化合物の発現または活性を測定することによってVPAC受容体の活性化を測定する工程とを含む。
【0072】
上述の背景の項で述べたように、VPAC受容体は、細胞のタイプに応じて、Gα s、Gα q、またはGα iを含む、いくつかの異なる経路を通じて連結するように思われる。必要な経路成分が特定の細胞タイプに存在すれば、VPACの作動薬活性化により、受容体がこれらの経路のいずれかを介して信号を発することができると考えられる。従って、VPAC活性化に関してスクリーニングするために、処置に関係のある細胞タイプが生体内で異なる経路を介してVPACを骨格筋萎縮に連結させる場合でも、アッセイでは、読出しとして、いずれのシグナルトランスダクション経路も使用することができる。スクリーニングアッセイが、受容体活性化を測定する経路とは関係なく、有用なVPAC作動薬を同定するのに有効であることが、当技術の習熟者には認識されよう。これらの信号伝達経路の活性化を測定するためのアッセイは、当該技術分野では公知である。
【0073】
例えば、試験化合物に接触させた後で、cAMP誘発のために細胞の溶解物を調製し分析することができる。cAMPは、Gα s活性化に応答して誘発される。Gα sがVPAC以外の受容体によって活性化され、試験化合物がVPAC受容体を通してまたは他の機構によってその効果を与えるので、2つの対照比較物は、試験化合物がVPAC受容体の活性化によってcAMPのレベルを増加させるかどうかを決定するのに関係する。一方の対照は、試験化合物に接触させた細胞のcAMPレベルと、対照化合物(すなわち、試験化合物を溶解させたビヒクル)に接触させた細胞のcAMPレベルとを比較するものである。試験化合物が対照化合物に対して相対的にcAMPレベルを増加させる場合、これは、試験化合物がいくつかの機構によってcAMPを増加させることを示す。もう一方の対照は、VPACを発現する細胞株のcAMPレベルと、VPAC受容体を発現しないことを除いて本質的に同一の細胞株のcAMPレベルとを、両方の細胞株を試験化合物で処置して、比較するものである。試験化合物が、VPAC受容体を発現しない細胞株に対して相対的に、VPAC受容体を発現する細胞株におけるcAMPレベルを高める場合、これは、試験化合物がVPAC受容体の活性化によってcAMPを高めることを示す。
【0074】
本発明の特定の実施形態では、様々なレポーター遺伝子のいずれかに連結されたcAMP応答要素を含有する構成を、VPAC受容体を発現する細胞に導入することができる。このようなレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、グルクロニドシンセターゼ、成長ホルモン、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質)、またはアルカリ性ホスファターゼが挙げられるが、これに限るものではない。細胞を試験化合物に暴露した後、レポーター遺伝子発現のレベルを計量して、試験化合物がVPAC受容体を活性化する能力を決定することができる。
【0075】
このアッセイで有用な細胞は、上述のVPAC受容体結合アッセイに関するものと同一であるが、活性化アッセイで使用される細胞が、好ましくはVIPまたは1つ若しくはそれ以上のVIP類縁体に統計的に有意に応答する機能的受容体を発現する点で異なる。完全長のVPAC受容体を発現する細胞の使用に加えて、レポーター要素に連結された、またはレポーター要素を含むように若しくは信号伝達タンパク質と相互作用するように物理的に修飾された、受容体のリガンド結合領域を含むVPAC受容体を発現する細胞は操作されることができる。例えば、野生型VPACまたはVPAC断片をGタンパク質に融合させて、融合タンパク質のVPAC部分に結合する作動薬で融合させたGタンパク質の活性化を引き起こすことができる。R・シーフェルト(Siefert)らの薬理科学の風潮(Trends Pharmacol.Sci.)(1999年)、20:383〜389。この細胞はまた、例えばCREレポーター遺伝子の強い誘発を検出するためのVIPまたはVIP類縁体による誘導応答を最大限にするために、読出しに応じて、好ましくは多数の特徴を有するべきであり、(a)低い天然レベルのcAMP、(b)VPAC受容体と相互作用できるGタンパク質、(c)高レベルのアデニリルシクラーゼ、(d)高レベルのタンパク質キナーゼA、(e)低レベルのホスホジエステラーゼ、および(f)高レベルのcAMP応答要素結合タンパク質が有利である。VIPまたはVIP類縁体に対する応答を高めるために、宿主細胞を操作して、望ましい因子の発現量をより多くし、または望ましくない因子の発現量をより少なくすることができる。加えて、CREレポーターの誘発のための代替的な経路を排除して、基礎レベルを低下させることができる。
【0076】
場合によっては、作動薬への長期暴露後に、Gタンパク質連結受容体反応が弱まり、または感度が低下する。本発明の他の実施形態は、VPAC受容体作動薬に応答して、VPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる化合物を同定するための方法を提供する。このような化合物は、骨格筋萎縮を処置するために、例えば単独でまたはVPAC受容体作動薬と組み合わせて使用することができる。通常、この方法は、(i)機能的VPAC受容体を発現する細胞を、受容体を脱感作するのに十分な作動薬の濃度および作動薬−受容体暴露の期間で、VPAC受容体作動薬によって処置する工程と、(ii)細胞を試験化合物に接触させる工程と、(iii)VPAC受容体の活性化レベルを決定する工程とを含む、細胞ベースのアッセイを使用する。いくつかの機構は、これに限るものではないが、受容体リン酸化反応、受容体内在化または分解、およびVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の下方調節を含む、受容体脱感作に寄与することが、当技術の習熟者には認識されよう。当技術の習熟者は、脱感作のどの機構を標的にするかに応じて、細胞を試験化合物に接触させる適切な時間(すなわち、作動薬処置前、処置時、または処置後)を決定することができる。例えば、作動薬処置後に細胞を試験化合物に接触させると、受容体のリン酸化反応の結果として起こる受容体脱感作を阻止する試験化合物を検出することができる。
【0077】
その他の実施形態では、本発明は、VPAC遺伝子の転写またはVPAC受容体発現を調節する候補化合物を同定するために、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。VPAC遺伝子の転写活性を調節する候補化合物は、VPAC受容体調節領域(レポーター遺伝子構成)に作用可能に結合するレポーター遺伝子を用いて同定することができる。このような方法は、当該技術分野では公知である。このような方法の1つでは、細胞因子源が存在する環境でレポーター遺伝子構造を試験化合物に接触させ、レポーター遺伝子発現のレベルを決定する。対照試料に比べて発現レベルの増加を引き起こす試験化合物は、VPAC遺伝子の転写を増加させる候補化合物の指標である。生体外または生体内転写に必要な細胞因子を提供するには、通常VPAC受容体を発現する任意の細胞タイプから、適切な細胞または細胞抽出物を調製する。
【0078】
VPAC受容体発現を調節する候補化合物は、また、細胞を試験化合物に接触させてVPACの発現を決定する方法で同定することもできる。試験化合物を含む環境でのVPAC受容体の発現レベルを、試験化合物を含まない環境での発現レベルと比較する。VPACの発現を増加させる試験化合物を、筋量または筋機能を増加させる候補化合物として同定する。このような方法は、VPAC受容体の転写若しくは翻訳を増加させ、またはmRNA若しくはVPAC受容体の安定性を増加させる候補化合物を検出する。
その他の実施形態では、本発明は、VIPまたはVIP類縁体の発現を調節する候補化合物を同定するために、1つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。このようなアッセイは、後の修飾によってVPAC受容体の発現を調節する候補化合物を同定するためのアッセイに関して本質的に上述したように実施される。VIP遺伝子またはVIP類縁体遺伝子からの転写を調節する候補化合物を同定するには、レポーター遺伝子は、対象のVIP遺伝子またはVIP類縁体遺伝子の調節領域に作用可能に結合し、細胞因子源は、対象の遺伝子を発現する細胞タイプ由来であるべきである。
【0079】
VII.骨格筋萎縮モデルを用いる候補化合物のスクリーニング
上述のように、生体外アッセイによって、1つまたはそれ以上の試験化合物から選択される候補化合物は、骨格筋萎縮および/または肥大モデル系で骨格筋の量または機能を調節する能力に関してさらに試験を実施することができる。このような骨格筋萎縮または肥大モデルには、骨格筋萎縮の生体外細胞培養モデルと生体内動物モデルの両方が含まれる。このようなスクリーニングの追加的なレベルは、追加的な調査、例えば治験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用である。
【0080】
筋肉萎縮の細胞培養モデル
骨格筋萎縮の生体外モデルは、当該技術分野では公知である。このようなモデルについては、例えば、H・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)の生体外(In Vitro)(1988年)24:609−619、H・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)らの生体力学雑誌(J of Biomechanics)(1991年)24Suppl1:91−9、H・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)らの生体外細胞発生生物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.)(1988年)24(3):166−74、J・A・クロミアック(Chromiak)らの生体外細胞発生生物学・動物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)(1998年)34(9):694−703、J・シャンスキー(Shansky)らの生体外細胞発生生物学・動物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)(1997年)33(9):659−61、C・E・ペロン(Perrone)らの生化学雑誌(J.Biol.Chem.)(1995年)270(5):2099−106、J・A・クロミアック(Chromiac)およびH・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)の細胞生理学雑誌(J.Cell.Physiol.)(1994年)159(3):407−14、およびH・H・バンデンブルフ(Vandenburgh)およびP・カーリッシュ(Karlisch)の生体外細胞発生生物学(In Vitro Cell.Dev.Biol.)(1989年)25(7):607−16に記載されている。このようなモデルは、前述の生体外スクリーニングに従って動物モデルでの試験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用であるが、必要ではない。細胞培養モデルを候補化合物によって処置し、処置に対するモデルの応答を、筋肉タンパク質合成または分解、骨格筋量または収縮機能における変化など、筋肉マーカの変化を評価することによって測定する。筋肉マーカで有意な変化を誘発する化合物には、通常、骨格筋萎縮の動物モデルでさらにスクリーニングを実施する。
【0081】
骨格筋萎縮の動物モデル
候補化合物を非ヒト動物に投与し、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉または筋線維断面積、収縮タンパク質含量、非収縮タンパク質含量、または骨格筋の量若しくは機能変化と相関のある生化学または遺伝子マーカなど、萎縮または肥大のマーカの変化を評価することによって、動物の応答を監視する。骨格筋肥大を誘発し、または骨格筋萎縮のいかなる側面も防止する候補化合物は、ヒトの骨格筋萎縮を処置するための見込みの治療用候補と考えるべきであり、本明細書では治療用候補化合物と呼ぶ。候補化合物が骨格筋萎縮を調節する能力の評価に加えて、毒性などの望ましくない副作用も、このようなスクリーニングで検出することができる。許容不可能な高レベルの副作用がないことを、治療用候補化合物の選択のためのさらなる基準として使用することができる。
【0082】
骨格筋萎縮に関する様々な動物モデルが当該技術分野で知られており、G・J・ハービソン(Herbison)ら(1979年)の物理療法医学リハビリ文書(Arch.Phys.Med.Rehabil.)60:401〜404、H−J・アッペル(Appell)(1990年)のスポーツ医学(Sports Medicine)10:42〜58、P−O・ハッセルグレン(Hasselgren)およびJ・E・フィッシャー(Fischer)(1998年)の世界外科雑誌(World J.Surg.)22:203〜208、E・T・アグベニーガ(Agbenyega)およびA・C・ウェアハム(Wareham)(1992年)の計算生化学・生理学(Comp.Biochem.Physiol.)102A:141〜145、D・B・トマソン(Thomason)およびF・W・ブース(Booth)(1990年)の応用生理学雑誌(J.Appl.Physiol.)68:1〜12、R・H・フィッツ(Fitts)ら(1986年)の応用生理学雑誌(J.Appl.Physiol.)60:1946−1953、P・ブラマンティ(Bramanti)ら(1998年)の国際解剖発生学雑誌(Int.J.Anat.Embryol.)103:45〜64、G・D・カーティー(Cartee)(1995年)のアメリカ老年学会生物科学医用科学雑誌(J.Gerontol.A Biol.Sci.Med.Sci.)50:137〜141、L・C・コーク(Cork)ら(1987年)の発展臨床生物学研究(Prog.Clin.Biol.Res.)229:241〜269、F・W・ブース(Booth)およびP・D・ゴールニック(Gollnick)(1983年)の医用科学スポーツ運動学(Med.Sci.Sports Exerc.)15:415〜420、S・A・ブルームフィールド(Bloomfield)(1997年)の医用科学スポーツ運動学(Med.Sci.Sports Exerc.)29:197〜206などに記載されている。これらのモデルに好ましい動物は、マウスおよびラットである。これらのモデルには、例えば、肢のキャスト固定または不動化、後肢懸架、動物の完全不動化、および低重力状況などの不使用誘発萎縮モデルが含まれる。神経損傷誘発萎縮モデルには、例えば、神経圧挫、特定の筋肉を刺激する神経部分の除去、神経への毒素適用、およびウイルス性、細菌性、または真核生物感染性剤による神経感染が含まれる。糖質コルチコイド誘発萎縮モデルには、動物への外因性糖質コルチコイドの萎縮誘発用量の適用、および、例えば、視床下−下垂体−副腎(HPA)軸を活性化するホルモンの適用による外因性副腎皮質ホルモン産生の刺激が含まれる。敗血症誘発萎縮モデルには、例えば、細菌などの敗血症誘発有機体の接種、細菌細胞壁抽出物または内毒素などの免疫活性化化合物による動物の処置、および腸壁の穿刺が含まれる。悪液質誘発萎縮モデルには、例えば、悪液質形成の可能性を有する腫瘍形成細胞による動物の接種、悪液質をまねく感染性剤(AIDSを引き起こすウイルスなど)による動物の感染、悪液質を誘発するホルモンまたはCNTF、TNF、IL−6、IL−1などのサイトカインによる動物の処置が含まれる。心機能不全誘発萎縮モデルには、心機能不全が骨格筋萎縮を付随して発生するような動物の操作が含まれる。神経変性病誘発萎縮モデルには、ニューロンの構成要素による動物の免疫化で得られるものなど、自己免疫動物モデルが含まれる。筋ジストロフィー誘発萎縮モデルには、自然または人工の遺伝的誘発筋ジストロフィーモデル、例えばMdxマウスで発生するジストロフィン遺伝子の変異などが含まれる。
【0083】
骨格筋肥大の動物モデルには、例えば、対向肢の不活性化による肢筋肉高使用モデル、不使用萎縮誘発事象後の再測定モデル、一時的神経損傷のために萎縮した筋肉の再使用モデル、協力筋の不活性化による選択的な筋肉高使用(例えば相補的肥大)モデル、筋肉に置かれた高荷重による筋肉高使用モデル、および糖質コルチコイド誘発萎縮後の糖質コルチコイド除去によって誘発される肥大モデルが含まれる。好ましい動物萎縮モデルには、坐骨神経除去萎縮モデル、糖質コルチコイド誘発萎縮モデル、および足キャスト固定不使用萎縮モデルが含まれ、これらは以下で詳細に説明する。
【0084】
坐骨神経除去萎縮モデルは、動物への麻酔、およびその後の右または左坐骨神経の小断片の外科的除去を伴うものであり、例えばマウスにおける坐骨神経は、大腿に沿ったほぼ中間点で単離し、3〜5mmの断片を摘出する。これにより、下位後肢筋肉組織の神経が除去され、これらの筋肉の萎縮を生じさせる。通常、実質的に正常歩行のために膝の満足な動きを提供するように、大腿二頭筋に対する神経支配は完全な状態で残される。通常、未処置動物では、神経除去10日後に、神経除去した筋肉の筋量が30〜50%減少する。神経除去後、神経除去誘発骨格筋萎縮に対する効果を決定するために、試験化合物を、例えば注射によって、または例えば浸透性ミニポンプ(例えば、カリフォルニア州パロアルトのアルザ(Alza))の埋め込みを介した連続注入によって投与する。神経除去後の様々な時点で、動物を安楽死させ、神経除去した足と神経除去していない足の両方から下肢筋肉を迅速に解剖して、腱と結合組織を取り除いた筋肉の重量を測定する。例えば、筋量、筋肉断面積、筋線維断面積、または収縮タンパク質含量を測定することによって、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
【0085】
糖質コルチコイド誘発萎縮モデルは、試験動物への糖質コルチコイド(例えば飲用水中でデキサメタゾン1.2mg/kg/日)の投与を伴う。通常、未処置動物では、骨格筋量は、10日間のデキサメタゾン投与後に30〜50%減少する。糖質コルチコイド投与に付随して、またはその後に、糖質コルチコイド誘発骨格筋萎縮への影響を決定するために、例えば注射または連続注入によって、試験化合物を投与する。糖質コルチコイド投与後の様々な時点で、神経除去モデルに関して上述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
足キャスト固定不使用萎縮モデルは、動物の一方の後肢の、膝から足の先までのキャスト固定を伴う。通常、10日間のキャスト固定後に、筋量が20〜40%減少する。キャスト固定後、足キャスト固定誘発骨格筋萎縮への効果を決定するために、試験化合物を、例えば注射によって、または例えば浸透性ミニポンプ(例えば、カリフォルニア州パロアルトのアルザ(Alza))の埋め込みを介した連続注入によって投与する。足キャスト固定後の様々な時点で、神経除去モデルに関して上述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
【0086】
ヒトで使用する化合物のスクリーニングでは、ヒトVPAC受容体と他の動物種由来のVPAC受容体との間に相違があるので、非ヒトVPAC受容体を用いてスクリーニングを実施した時に、偽陽性または陰性の結果がいくつか現れる可能性があるということが、当技術の習熟者には認識されよう。従って、初期の生体外スクリーニングを、ヒトVPAC受容体を用いて実施することが好ましい。ある環境では、同定した候補化合物は、ヒト受容体にだけ活性があって、非ヒト受容体には活性がないことがある。このような環境では、これらの候補化合物がスクリーニングの第2レベルで骨格筋の量または機能を調節できるかどうかを決定することが望ましい場合がある。これらの候補は、非ヒトVPACを活性化しないので、非ヒト動物による標準生体内スクリーニングは勧められない。このような環境では、これらの候補に関するスクリーニングの第2レベルは、ヒトVPAC受容体を発現するトランスジェニック動物で実施することができる。
【0087】
これに限るものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヤギ、イヌ、およびヒト以外の霊長類を含めた任意の種の動物を使用して、VPAC受容体トランスジェニック動物を生成することができる。マウスおよびラットが好ましく、マウスが最も好ましい。当該技術分野では様々な技術が知られており、それを使用して、トランスジェニック動物の創始株を産生するために、動物にヒトVPAC導入遺伝子を導入することができる。このような技術としては、前核マイクロインジェクション、レトロウイルス媒介遺伝子の生殖細胞系への転移、胚幹細胞での遺伝子標的化、胚の電気穿孔法、および精子媒介遺伝子転移が挙げられるが、これに限るものではない。
【0088】
VIII.骨格筋萎縮の処置のための遺伝子治療方法
VPAC、VIP、およびVIP類縁体の発現は、遺伝子治療手法を用いて生体内で制御することができる。VPAC、VIP、およびVIP類縁体遺伝子の発現および/または活性は、VPAC受容体、構造的活性型VPAC、VIP、またはVIP類縁体遺伝子を適切な組織内に導入することによって増加させることができる。これらの遺伝子の過剰発現は、総細胞VPAC活性を高め、従って骨格筋萎縮を調節する。遺伝子又は対象の遺伝子を、被験体での発現に適切なベクターに挿入する。これらのベクターには、DNAを細胞内に導入する他の粒子(例えば、リポソーム、金粒子など)、または対象の遺伝子を含有するDNA発現ベクターのヒト組織(例えば筋肉)への直接注射に加えて、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これに限るものではない。
【0089】
全体的なVIPまたはVIP類縁体遺伝子発現レベルを増加させるために使用できる他の方法には、患者へのVIPまたはVIP類縁体発現細胞、好ましくは自家細胞の導入が含まれる。これらの細胞は、組換え型(例えば、VIPまたはVIP類縁体を発現するように操作したもの)または非組換え型(例えば、内生的にVIPまたはVIP類縁体を発現する細胞)であることができる。細胞は、骨格筋萎縮の処置のため、体内の多数の部位(例えば筋肉)に送られることができる。細胞ベースの遺伝子治療技術は、当該技術の習熟者には公知である。
【0090】
IX.医薬品の配合および使用方法
スクリーニング方法によって同定される候補化合物または治療用候補化合物は、骨格筋萎縮を処置するために個人に投与することができる。このために、本発明は、これに限るものではないが、手術、ベッド休養、骨折による不使用;脊髄損傷による神経除去/神経損傷;自己免疫疾患;感染病;無関係状況での糖質コルチコイド使用;感染症または他の原因による敗血症;病気または飢餓による栄養制限;癌性悪液質;慢性炎症;AIDS性悪液質;COPD;うっ血性心不全;例えば、筋ジストロフィー、神経変性病などのサルコペニアおよび遺伝病によって誘発される骨格筋萎縮を含む、骨格筋萎縮を変調させるための方法および組成物を包含する。VPACの作動薬を用いて、骨格筋萎縮を阻害することができる。必ずしも、有効な化合物が、対象のVPACまたはVPAC受容体サブタイプに完全な特異性を示す必要はない。他の病変受容体の特異的拮抗薬を、有効であるが特異性のない作動薬と合わせて共投与できることが企図されている。あるいは、投薬量のみ、または投薬計画の調節によって、この特異性の欠如に対処してもよい。
【0091】
本発明のスクリーニング方法によって同定される候補化合物または治療用候補化合物は、VPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物と組み合せて投与してもよい。これらは、公知の化合物、例えばテオフィリンであってもよく、または本発明のスクリーニング方法によって、これらの化合物がVPAC受容体またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させることを同定してもよい。
【0092】
用量の決定
VPACに害を与える化合物の安全性および治療的有効性は、生体外または生体内技術を用いる標準的な手順によって決定することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましいが、副作用のレベルが許容可能であれば、治療指数の低い化合物も有用である。生体外および生体内の毒性学的および薬理学的技術から得られるデータを使用して、有用な可能性のあるヒトの用量範囲を配合することができる。好ましい用量は、化合物の循環濃度が、許容可能な安全性を備えて、治療的に最大限になる範囲内にある。化合物の循環濃度は、投薬形態、投薬後の時間、投与経路などに応じて変更することができる。副作用が許容可能であれば、この範囲から外れる用量も有用である。患者の年齢や体重などの事項を用いて、従来の様式でこのような事項を決定することができる。薬理遺伝学的手法が、臨床群における化合物の選択、用量、および投薬計画の最適化に有用な可能性がある。
【0093】
配合および使用
本発明による骨格筋萎縮の調節で使用するための医薬組成物は、製薬上許容可能な担体および賦形剤を使用し、従来の方法を用いて配合することができる。本発明の組成物は、単位剤形で提供することが好ましい。本明細書で使用する時、「単位剤形」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験者への投与に適切な、優れた医療慣習に基づく1回用量のVPAC受容体作動薬を含有する本発明の組成物である。医薬組成物は、例えば、経鼻投与、経皮投与、吸入投与、非経口投与、皮膚投与、経口投与、または直腸投与による供給のために配合することができる。経口投与の場合、医薬組成物は、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、結合剤、充填剤、潤沢剤、崩壊剤、または湿潤剤を含む添加物を含有する錠剤またはカプセル剤形であることができる。錠剤は、コーティングすることができる。経口投与のための液体製剤には、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル、防腐剤、緩衝塩、香料、着色剤、甘味剤などを含む添加物を含有する、シロップ、懸濁液、または使用前に液体で再構成される乾燥製品が含まれるが、これに限るものではない。経口投与用の医薬組成物は、口、胃、または腸管における薬理学的活性化合物の放出を制御するように配合することができる。
【0094】
吸入投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、液体、粉末、ゲル、または、事前測定または非事前測定用量の加圧または非加圧噴射剤を利用するエアロゾル噴霧の形態によって供給することができるが、これに限るものではない。薬理学的に活性な化合物は、適切な充填剤、ビヒクル、防腐剤、緩衝剤などと併せて配合することができる。非経口投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと合わせて配合でき、ボーラス注射または注入のための懸濁液、溶液、エマルション、すぐに構成可能な粉末などとして調製することができる。これらの化合物の投薬は、皮下注射針、高圧装置などを含め、様々な技術によって投与することができる。直腸投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、座薬、浣腸などとして供給するために、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと併せて配合することができる。皮膚投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、ローション、皮膚軟化剤などを含む許容可能な生理学的担体と併せて配合することができ、またはパッチタイプの手段に組み込むことができる。長期的な投与の場合、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、ポリマー、疎水性材料、樹脂などの適切な添加物は、これに限定されないが、筋肉内または皮下の位置を含む多数の部位に注射または埋め込むための持続性製剤として配合することができる。加えて、薬理学的に活性な化合物は、分配装置によって投与することができる。
【0095】
治験時の効果の監視
VPACの発現または活性に対する化合物(例えば薬物)の影響の監視は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、治験においても実施することができる。例えば、スクリーニングアッセイによってVPAC受容体活性またはVPAC受容体発現を増加させると決定した化合物の効果は、骨格筋萎縮の患者または骨格筋萎縮の危険性のある患者の治験において評価することができる。試験化合物または擬薬投与後の様々な時点で、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉破壊の生化学的マーカ、または生活水準指標の変化を観察することによって、患者に対する化合物の効果を決定することができる。ヒト被験体で骨格筋量を測定する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、肢の周囲の測定、例えばコンピュータ断層撮影法、MRI、若しくは超音波による筋肉の厚さの測定、または、形態学的および生化学的パラメータ(例えば、断面線維面積、線維直径、または酵素活性)を検査するための筋肉生検が挙げられる。さらに、骨格筋量は骨格筋機能と相関があるので、筋機能は、筋量の代用マーカとして使用でき、筋量の変化は、機能的測定、例えば、強度、協力筋群の力、または筋電図記録で見られる収縮特徴を用いて評価することができる。加えて、筋萎縮の結果生じる筋肉タンパク質喪失は、被験体の尿または血液中のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、すなわち3−メチルヒスチジンのレベルの定量化によって測定することができる。このような方法の概観については、アッペル(Appell)のスポーツ医学(Sports Med.)10:42〜58(1990年)を参照されたい。生活水準指標としては、椅子からの立ち上がりの容易さ、疲労前の歩数、または階段昇降能力が挙げられるが、これに限るものではない。
【0096】
(実施例)
実施例1 ヒトVPAC2受容体発現に関するベクターの構成
ヒトVPAC2受容体(hVPAC2R)DNA配列(受入番号X95097)を取り出し、1つが開始コドンで開始する遺伝子の5’末端(5’オリゴヌクレオチド)で、1つが停止コドンを含有する遺伝子の3’末端(3’オリゴヌクレオチド)の、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、5’オリゴヌクレオチド内に1つの固有部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、hVPAC2遺伝子には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するように設計される。加えて、3’オリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化添加信号配列を含有する。ヒト骨格筋由来の二重鎖cDNAは、ユニバーサルクイッククローンcDNAコレクション(Universal QUICK−Clone cDNA collection)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)から購入される。上述の5’および3’オリゴヌクレオチドを用いて、hVPAC2R cDNAは、アドバンタックPCRキット(AdvanTaq PCR kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いたヒト骨格筋cDNAのPCRによって増幅される。hVPAC2遺伝子PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hVPAC2遺伝子DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。
【0097】
pIRESneoベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)へのhVPAC2R PCR生成物のクローニングは、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVPAC2R PCR生成物とpIRESneoベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて、pIRESneoベクターDNAをhVPAC2R PCR生成物DNAにライゲーションする。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成(pIRESneo/hVPAC2R)を用いて、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を形質転換させる。形質転換させた細胞を、寒天を含むLB/X−gal/IPTGおよびアンピシリン上に塗布する。白色コロニー(陽性クローン)を選択し、LB培地で個々に培養する。ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、プラスミドDNAを単離する。少なくとも1つのクローンからの挿入を配列させて、確実にhVPAC2R配列が正しくなるようにする。安定統合型マーキュリーCRE−LUCプラスミド(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を含有するHEK293細胞を、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(Mammalian Transfection Kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、正しい配列挿入を有する精製pIRESneo/hVPAC2R DNAによってトランスフェクションする。pIRESneo/hVPAC2R
【0098】
DNAによって安定にトランスフェクションした細胞を、G418中で細胞を培養することによって選択する。安定にトランスフェクションした細胞(HEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R細胞)を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、および非必須アミノ酸(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)を含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。クローンは、実施例2および実施例3で説明するように、VIPへの暴露後に、VIP結合およびCRE−LUC活性化に関して特徴付ける。次いで、適切なレベルでhVPAC2受容体を発現し、CRE−LUCレポーター系に適切に連結される細胞を、さらなる分析で使用する。
【0099】
実施例2 受容体結合アッセイ
化合物の受容体結合分析は、実施例1のHEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R細胞を96ウェルポリリシンコーティングプレートで平板培養することによって細胞全体に実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、および非必須アミノ酸を含有するDMEM培地に播種し、一晩インキュベートする。培養培地を取り除き、MEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中のユーロピウム(Eu−VIP)+10%シーブロック(Seablock)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)で共有標識した適切な量のVIPを添加する。細胞をEu−VIPと共に室温で90分インキュベートし、次いでマグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で4回洗浄する。最後の洗浄の後、強化溶液(ワラック社(Wallac Inc.)、メリーランド州ゲイサーズバーグ)を添加し、バイオワークスユーロピウムプログラム(BioWorks Europium program)を用いてワラックプレートリーダ(Wallac plate reader)(ワラック社(Wallac Inc.)、メリーランド州ゲイサーズバーグ)でプレートを読み取る。飽和結合分析の場合、10(−12)〜10(−3)Mの範囲のEu−VIPの記録用量(log doses)を細胞に添加し、非特異的結合の評価のために、非標識VIPの飽和濃度を含まない環境と含む環境の両方で結合を分析する。競合的結合の場合、対象の化合物の濃度の変更に加えて、結合に対する最大値の半分であるEu−VIP濃度を添加する。
【0100】
実施例3 受容体活性化アッセイ
受容体活性化分析は、実施例1のHEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R細胞をパッカードビュープレート(Packard View Plate)−96(パッカード社(Packard Inc.)、カリフォルニア州)に播種して実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、および非必須アミノ酸を含有するDMEM培地に播種し、一晩インキュベートする。次いで、培地を取り除き、対象の化合物を含有する、0.01%ウシアルブミン断片V(シグマ(SIGMA)、ミズーリ州セントルイス)を含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で置き換える。次いで、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で4時間インキュベートし、その後培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で細胞を2回洗浄する。次いで、洗浄した細胞に溶解試薬(Lysis Reagent)(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を加え、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。次いで、細胞を−80℃に20分間置き、その後37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液およびルシフェラーゼ分析基質(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を細胞溶解物に加え、照度計を用いてルシフェラーゼ活性を定量化する。化合物暴露後の増加を、化合物暴露後の、hVPAC2受容体なしでCRE−LUC構成を含有するHEK細胞中のルシフェラーゼのレベルと比較することによって、化合物の相対的な活性を評価する。10倍超過のhVPAC2受容体拮抗薬を含む環境および含まない環境で、hVPAC2受容体/CRE−LUC HEK細胞の化合物へのルシフェラーゼ応答を評価することによって、応答の特異性についても確認する。
【0101】
実施例4 hVPAC 2 受容体またはVPAC 2 受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するためのスクリーニング
VPAC2受容体またはVPAC2受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる化合物の同定は、実施例3で説明した受容体活性化アッセイの変形形態に関与する。具体的には、このアッセイは、HEK293/CRE−LUC/pIRESneo/hVPAC2R受容体細胞をパッカードビュープレート(Packard View Plate)−96(パッカード社(Packard Inc.)、カリフォルニア州)に播種することによって実施する。細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、L−グルタミン、非必須アミノ酸、およびVIPの飽和量を含むDMEM培地に播種し、48時間インキュベートする。次いで、培地を取り除き、対象の化合物に加えて0.01%ウシアルブミン断片V(シグマ(SIGMA)、ミズーリ州セントルイス)およびVIPを含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で置き換える。次いで、細胞を、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で4時間インキュベートし、その後、培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)で細胞を2回洗浄する。次いで、洗浄した細胞に溶解試薬(Lysis Reagent)(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を加え、細胞を37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。次いで、細胞を−80℃に20分間置き、その後37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で20分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液およびルシフェラーゼ分析基質(プロメガ社(Promega Inc.)、ウィスコンシン州マジソン)を細胞溶解物に加え、照度計を用いてルシフェラーゼ活性を定量化する。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光性を刺激する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物とする。最も対象の化合物は、相対的に高レベルの蛍光性を誘発するものである。
【0102】
実施例5 hVPAC 2 受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するためのスクリーニング
適切な組織中のhVPAC2受容体遺伝子の生理的発現に必要なすべての調節要素を含有するように、転写開始部位の十分に上流で開始するhVPAC2受容体遺伝子のプロモーター領域を含有する配列を、ヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方がプロモーター領域の5’末端を含有し(5’オリゴヌクレオチド)、他方が転写開始部位を含むプロモーター領域の3’末端を含有する(3’オリゴヌクレオチド)、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、5’オリゴヌクレオチド内に1つの固有部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、hVPAC2遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。5’および3’オリゴヌクレオチドは、PCRキットである、アドバンテージ(Advantage)(登録商標)ゲノムPCRキット(Genomic PCR kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使って、ヒトDNA(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)由来のhVPAC2遺伝子調節領域のPCR増幅のために使用される。hVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hVPAC2遺伝子調節領域DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。pECFP−1ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)へのhVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物のクローニングは、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物とpECFP−1ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。pECFP−1ベクターDNAのhVPAC2遺伝子調節領域PCR生成物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成を用いて、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。細胞をLBおよびカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のために、カナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてプラスミドDNAを単離し、hVPAC2遺伝子調節領域を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、hVPAC2遺伝子調節領域を含有する、精製した構成プラスミドDNAを、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(Mammalian Transfection Kit)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使用し、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて、HEK293細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、G418を用いて選択し、単離して、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境中で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、非必須アミノ酸(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、およびG418(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)を含有するDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。G418耐性クローンは、それがhVPAC2遺伝子プロモーター配列を確実に含有するように、サザンブロット法(Southern blotting)によって特徴化し、さらに、hVPAC2遺伝子調節領域の活性化を、適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでhVPAC2遺伝子調節領域−ECFPを発現する細胞を、以下のように、hVPAC2遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、hVPAC2遺伝子調節領域−ECFP含有HEK293細胞を、適切な密度で、黒色で透明底の96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、一晩成長させることによって実施する。翌日、培地を取り除き、試験化合物を新たな成長培地に加える。細胞を、37℃で5%二酸化炭素/95%空気環境で16時間インキュベートし、その後蛍光を測定する(蛍光光度計(バイオルミン(biolumin)(商標)960、モルキュラーダイナミクス/アマーシャムファーマシアバイオテック(Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech)、ニュージャージー州ピスカタウェイ)使用、検出放射475(501)nmによる励起433(453)nm)。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光性を刺激する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物とする。最も対象の化合物は、相対的に高レベルの蛍光性を誘発するものである。
【0103】
実施例6 ヒトVIP発現を増加させる化合物を同定するためのスクリーニング
ヒトVIP(hVIP)発現を増加させる化合物を同定するための方法は、使用される調節領域がhVIP遺伝子のためのものであることを除き、本質的には、hVPAC2受容体の発現を増加させる化合物を同定するための方法と同一である。適切な組織中のhVIP遺伝子の生理学的発現に必要なすべての調節要素を含有するように、転写開始部位の十分に上流で開始するhVIP遺伝子の調節領域を含有する配列を、ヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方が調節領域の5’末端を含有し(5’オリゴヌクレオチド)、他方が転写開始部位を含む調節領域の3’末端を含有する(3’オリゴヌクレオチド)、2つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドはまた、5’オリゴヌクレオチド内に1つの固有部位を有し、3’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、hVIP遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。5’および3’オリゴヌクレオチドは、アドバンテージ(Advantage)(登録商標)ゲノムPCRキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使って、ヒトDNA(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)由来のhVIP遺伝子調節領域のPCR増幅のために使用する。hVIP遺伝子調節領域PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によってPCRアーチファクトから精製され、hVIP遺伝子調節領域DNA断片は、ヌクレオトラップ(NucleoTrap)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。pECFP−1ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)へのhVIP遺伝子調節領域PCR生成物のクローニングは、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVIP遺伝子調節領域PCR生成物とpECFP−1ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。pECFP−1ベクターDNAのhVIP遺伝子調節領域PCR生成物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成を使用して、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。細胞をLBおよびカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のために、カナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてプラスミドDNAを単離し、hVIP遺伝子調節領域を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、hVIP遺伝子調節領域を含有する、精製した構成プラスミドDNAを、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使用し、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて、HEK293細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、G418を用いて選択し、単離して、37℃の5%二酸化炭素/95%空気環境で、10%ウシ胎児血清(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、L−グルタミン(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、非必須アミノ酸(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)、およびG418(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)を含むDMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ロックビル)中で増殖させる。G418耐性クローンは、それがhVIP遺伝子調節領域配列を確実に含有するように、サザンブロット法(Southern blotting)によって特徴化し、さらに、hVIP遺伝子調節領域の活性化を、適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでhVIP遺伝子調節領域−ECFPを発現する細胞を、以下のように、hVIP遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、hVIP遺伝子調節領域構成を含有するクローンを使用することを除いて、実施例5と同様に実施する。
【0104】
実施例7 hVPAC 2 受容体を活性化するヒト抗体の製造方法
hVPAC2受容体を活性化する完全なヒトモノクローナル抗体は、以下のように最初に組換えhVPAC2受容体タンパク質を形成することによって産生する。実施例1からの手順に従い、hVPAC2PCR生成物を得る。次いで、このhVPAC2PCR生成物を、5’および3’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにhVPAC2遺伝子PCR生成物とpHAT20ベクター(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって、pHAT20ベクターにクローニングする。pHAT20ベクターDNAのhVPAC2遺伝子PCR生成物DNAへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ(AdvantAge)(商標)PCRクローニングキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)からのDNAリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクター/挿入構成を使用し、TOP10F’コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)に形質転換させる。形質転換させた細胞をLBおよびアンピシリン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにアンピシリン耐性コロニーを選択する。陽性のクローンをアンピシリン含有LB培地で培養し、ヌクレオボンドDNA精製システム(NucleoBond DNA Purification System)(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてプラスミドDNAを単離し、hVPAC2遺伝子を含有する構成をDNA配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、hVPAC2−pHAT20ベクターDNAを、HAT配列の開始部とhVPAC2−pHAT20構成には存在しない固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む5’オリゴヌクレオチド、および既に使用した3’hVPAC2オリゴヌクレオチドを使用することによって、さらなるPCRクローニングに使用する。オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、hVPAC2−pHAT20構成からのHAT−hVPAC2融合遺伝子をPCR増幅し、上述のようにPCR生成物を精製する。次いで、HAT−hVPAC2融合遺伝子生成物を、クローンテック製BacPAKバキュロウイルス発現システム(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、pBacPAK8ベクターへのクローニングに使用する。HAT−hVPAC2融合遺伝子のpBacPAK8ベクターへのライゲーションは、本質的には上述の通りである。次いで、hVPAC2/HAT−pBacPAK8構成をTOP10’Fコンピテント大腸菌(E. coli)細胞にトランスフェクションし、アンピシリン耐性細胞を選択し、プラスミドDNAを単離して上述のように構成の一体性を確認する。次いで、カルフォス(CalPhos)(商標)哺乳類トランスフェクションキット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、この構成を線形化BacPAK6DNAと共に、Sf21昆虫宿主細胞に共トランスフェクションする。次いで、昆虫細胞を2〜3日インキュベートし、その後、個々の透明なプラークからウイルスを採取する。その後、すべて製造業者(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)の推奨に従って、BacPAK昆虫細胞培地を用い、ウイルスをsf21細胞内で増幅させ、採取したウイルスを力価測定し、力価測定したウイルスをSf21細胞の大規模感染に使用する。次いで、製造業者が推奨する条件を用いて、TALON(登録商標)クローンテック製セルスルー(CellThru)精製キット(クローンテック社(Clonetech Inc.)、米国カリフォルニア州パロアルト)を使用して、組換えHAT−VPAC2融合タンパク質を精製する。簡潔には、感染の48時間後に、感染させたSf21細胞を採取し、抽出/ローディング緩衝液内で超音波分解する。次いで、細胞溶解物をTALON(登録商標)セルスルー(CellThru)カラムの中に通す。カラムを抽出/ローディング緩衝液で2回洗浄し、結合したHAT−hVPAC2タンパク質を溶出緩衝液で溶出させる。溶出したタンパク質を、製造業者(Bio−Radラボラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、カリフォルニア州ハーキュレス)の推奨に従って、Bio−Rad SDS−PAGEシステムおよびタンパク質定量化システムを用い、一体性に関してSDS−PAGEによって分析し、タンパク質濃度を定量化する。その後、精製したHAT−hVPAC2融合タンパク質を、以下のようにヒトモノクローナル抗体産生のために異種マウス(XenoMouse)動物の免疫化に使用する。10μgの精製した組換えHAT−hVPAC2融合タンパク質を、25μgの補助剤モノホスホリル脂質A(シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス)と組み合わせて使用して、8週間にわたり、何度も10匹の異種マウス(XenoMouse)動物に接種する。接種した動物から血清を取得し、HAT−hVPAC2融合タンパク質でポリスチレンELISAプレート(コーニンググラスワークス(Corning Glass Works)、ニューヨーク州コーニング)を塗布することによってHAT−hVPAC2タンパク質に対する抗体を検出するために、精製したHAT−hVPAC2融合タンパク質を用いる抗原回収ELISAで使用して、PBS−1%BSAでブロッキングし、洗浄して、血清試料の1:50希釈液と共に37℃で1時間インキュベートする。PBSで5回洗浄後、プレートはヒト免疫グロブリンGに対するアルカリ性ホスファターゼ抱合ヤギ抗体と合わせて、37℃で1時間インキュベートする。次いで、プレートをPBSで5回洗浄し、緩衝液中のp−ニトロフェニルホスフェート基質(シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス)によって抗体を検出する。プレートリーダを使用して405nmでの光学密度を測定し、信号を定量化した。高い抗体産生が実証されたマウスを、ハイブリドーマ形成のために使用する。ハイブリドーマは、異種マウス(XenoMouse)動物からの脾臓細胞と非分泌骨髄腫細胞株NSA−bcl2を、30%ポリエチレングリコールPEG450の存在下で、比率4:1の脾臓細胞とNSA−bcl2細胞を用いて融合させることによって生成される。融合細胞を、96ウェルプレートへの希釈を制限することによりクローニングし、10%ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、L−グルタミン、100u/mlペニシリン−ストレプトマイシン、およびヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(すべてライフテクノロジーズ(Life Technologies)(メリーランド州ロックビル)から入手)を含有するRPMI−1640培地内で培養する。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン選択ハイブリドーマからの上清を、前述のようにELISAによってヒト抗体産生に関してスクリーニングした。HAT−hVPAC2融合タンパク質に対するヒト抗体を産生するハイブリドーマは、大規模な抗体産生のため選択される。モノクローナル抗体を、タンパク質G−セファロース(Sepharose)クロマトグラフィーによって精製する。簡潔には、培養したハイブリドーマクローンからの上清を、ローディング緩衝液中でタンパク質G−セファロースカラム(シグマ(SIGMA)、ミズーリ州セントルイス)上に置き、3回洗浄し、IgGを溶出緩衝液で溶出させる。次いで、これらの抗体を、hVPAC2活性化(作動性)潜在性を評価するためのスクリーニングで使用する。これは、実施例3で概略した方法を用いて実施する。hVPAC2受容体に対する作動薬活性を示すそれらのヒトモノクローナル抗体は、指定の候補化合物である。
【0105】
実施例8 VPAC 2 受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の治 療的処置
体重50kgで、長期のベッド休養による腕および足の重度筋萎縮を患うヒト男性被験者に、骨格筋萎縮を改善させるための処置を行う。3ヶ月間、週に1度、抗VPAC2受容体を含むpH6の水溶液15mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【0106】
【表2】
【0107】
処置期間の終わりに、被験者は、腕と足の筋量、強度、および可動性の測定可能な増加を示す。
【0108】
実施例9 VPAC 2 受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
体重55kgのヒト女性被験者に、1ヶ月以内に臀部関節置換手術を計画する。術後回復時の筋肉不使用による骨格筋萎縮のレベルを最終的に低減させるために、手術の前と後で、被験者に骨格筋量を増加させるための処置をする。具体的には、手術前の1か月間および手術後の2ヶ月間、週に1度、抗VPAC2受容体を含むpH6.0の水溶液18mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【0109】
【表3】
【0110】
処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない場合の被験者の予想される状態に比べて、腕と足の筋量、強度、可動性の測定可能な維持を示す。
【0111】
実施例10 VPAC 1 受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
体重45kgのヒト女性被験者に、落下後の上腕の単純骨折を処置するためにキャスト固定術を実施した。被験者に、骨折治癒時の不使用および制限使用による患部の腕と肩の骨格筋萎縮を防止する処置を実施する。具体的には、キャスト固定の日から開始して、週に1度、抗VPAC1受容体を含むpH6.0を13mlを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【0112】
【表4】
【0113】
処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない場合の被験者の予想される状態および追跡治療に比べ、腕と肩の患部の筋量、強度、および可動性の測定可能な維持、ならびに物理治療課程の短縮を示す。
【0114】
実施例11 VPAC 2 受容体の作動薬である、Ro25−1553を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
昏睡状態の体重50kgのヒト女性被験者を、病院に収容する。被験者に、昏睡状態の間の不使用による全身の骨格筋萎縮を防止するための処置を実施する。具体的には、昏睡状態の間、月に1度、筋肉注射を介して、以下を含むpH6.0の水溶液3mlを被験者に投与する。
【0115】
【表5】
【0116】
処置の結果、被験者は、薬物療法なしの被験者の予想される状態に比べ、昏睡時および意識回復後の、骨格筋量の測定可能な維持、ならびに物理療法の必要性の低下を示す。
本発明は、単に発明の個々の態様を示すことを意図して述べた特定の実施形態の範囲に制限されるものではなく、機能的に等価の方法および成分は、本発明の範囲内にある。これらには、試験動物の種類、VPAC作動薬の性質およびタイプ、動物の性別、萎縮モデル、遺伝的方法を含むVPAC活性化方法などが含まれるが、これに限るものではない。本明細書で示し記載するものに加え、上記の説明および添付の図面を読めば、当技術の習熟者には本発明の様々な修正形態が明らかであろう。このような修正形態は、添付の特許請求の範囲内に入るものとする。
本明細書のすべての参照を、参考として本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
図1〜5で使用される省略形:
【表6】 図1Aおよび1Bは、マウス神経除去萎縮モデルにおけるVPAC1およびVPAC2受容体作動薬(1日2回、皮下に投与)の抗萎縮効果を示す。図1Aは、神経除去した前脛骨筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。図1Bは、神経除去した内側腓腹筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水、B:VPAC1R作動薬(0.1mg/kg)+T、C:VPAC1R作動薬(0.3mg/kg)+T、D:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+T、E:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+T、F:PACAP−38(0.1mg/kg)+T、G:PACAP−38(0.3mg/kg)+T。
図2Aおよび2Bは、マウス神経除去萎縮モデルにおけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬(浸透性ミニポンプによって連続的投与)の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図2Aは、神経除去および正常な前脛骨筋におけるVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図2Bは、正常な内側腓腹筋におけるVPAC2受容体選択的作動薬の肥大誘発効果を示す。X軸に関する説明:A:注入した水、B:VPAC1R作動薬(0.3mg/kg)、C:VPAC1R作動薬(1mg/kg)、D:VPAC1R作動薬(3mg/kg)、E:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)、F:VPAC2R作動薬(1mg/kg)、G:VPAC2R作動薬(3mg/kg)、H:PACAP−38(0.3mg/kg)、I:PACAP−38(1mg/kg)、PACAP−38(3mg/kg)。
図3Aおよび3Bは、マウスの糖質コルチコイド(デキサメタゾン)誘発萎縮モデルにおけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬(1日2回、皮下投与)の抗萎縮効果を示す。図3Aは、糖質コルチコイド誘発萎縮を起こした前脛骨筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。図3Bは、糖質コルチコイド誘発萎縮を起こした内側腓腹筋におけるVPAC1およびVPAC2受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水+デキサメタゾン(1.2mg/kg/日を飲用水に含める),B:PACAP−38(0.1mg/kg)+デキサメタゾン+T、C:PACAP−38(0.3mg/kg)+デキサメタゾン+T、D:VPAC1R作動薬(0.1mg/kg)+デキサメタゾン+T、E:VPAC1R作動薬(0.3mg/kg)+デキサメタゾン+T、F:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+デキサメタゾン+T、G:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+デキサメタゾン+T。
図4Aおよび4Bは、マウスの不使用(キャスト固定)萎縮モデルにおけるVPAC2受容体選択的作動薬(1日2回、皮下投与)の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図4Aは、キャスト固定誘発萎縮を起こした前脛骨筋における、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553の抗萎縮効果を示す。図4Bは、正常な内側腓腹筋における、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553の肥大誘発効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水、B:VPAC2R作動薬(0.03mg/kg)+T、C:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+T、D:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+T。
図5Aおよび5Bは、ラット神経除去萎縮モデルにおけるVPAC2受容体選択的作動薬(1日2回、皮下投与)の抗萎縮効果を示す。図5Aは、神経除去誘発萎縮を起こした前脛骨筋における、VPAC2受容体選択的作動薬であるRo25−1553の抗萎縮効果を示す。図5Bは、神経除去誘発萎縮を起こした足の長指伸筋(EDL)における、VPAC2R作動薬であるRo25−1553の抗萎縮効果を示す。X軸に関する説明:A:食塩水、B:VPAC2R作動薬(0.03mg/kg)+T、C:VPAC2R作動薬(0.1mg/kg)+T、D:VPAC2R作動薬(0.3mg/kg)+T。
Claims (14)
- 骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
(a)VPAC受容体に試験化合物を接触させる工程と、
(b)前記試験化合物が前記VPAC受容体に結合するかどうかを決定する工程とを含み、該VPAC受容体に結合する該試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定し、好ましくは、工程(b)で該VPAC受容体に結合すると決定された該試験化合物を非ヒト動物に投与し、該試験化合物が動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定し、動物内で骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する方法。 - 骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
(a)VPAC受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程であって、好ましくは前記VPAC受容体が真核細胞上で発現され、機能的VPAC1受容体またはVPAC2受容体である工程と、
(b)前記試験化合物がVPAC受容体を活性化するかどうかを決定する工程とを含み、該VPAC受容体を活性化する試験化合物を骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する方法。 - 前記細胞が細胞性cAMPレベルを有し、前記試験化合物が前記VPAC受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、前記細胞性cAMPレベルを測定する工程を包含する、請求項2に記載の候補化合物を同定するための方法。
- 前記細胞がcAMP応答要素に施術により結合されたレポーター遺伝子をさらに含み、前記細胞性cAMPレベルを測定する工程がレポーター遺伝子発現を測定する工程を包含し、好ましくはレポーター遺伝子が、アルカリ性ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、グルクロニドシンセターゼ、成長ホルモン、胎盤アルカリ性ホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質である、請求項3に記載の候補化合物を同定するための方法。
- 骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物を同定するための方法であって、
(a)機能的VPAC受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、
(b)前記試験化合物が前記VPAC受容体を活性化するかどうかを決定する工程と、
(c)工程(b)で前記VPAC受容体を活性化すると決定された試験化合物を非ヒト動物に投与し、該試験化合物が動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含み、動物内で骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する方法。 - VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するための方法であって、
(a)機能的VPAC受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、
(b)対照細胞で前記VPAC受容体の脱感作を引き起こすのに十分な時間かつ十分な濃度で作動薬によって前記細胞を処理する工程であって、好ましくは工程(b)が工程(a)の前または工程(a)と同時に実施される工程と、
(c)前記VPAC受容体の活性化レベルを決定する工程とを含み、VPAC受容体またはVPAC受容体のシグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する方法。 - VPAC受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するための方法であって、
(a)VPAC受容体調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に、試験化合物を接触させる工程と、
(b)前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含み、該レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する方法。 - VIPまたはVIP類縁体の発現を増加させる候補化合物を同定するための方法であって、
(a)VIP類縁体調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に、試験化合物を接触させる工程と、
(b)前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含み、該レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する化合物として同定する方法。 - 医薬組成物であって、
(a)安全かつ有効な量のVPAC受容体作動薬と、
(b)薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。 - 骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体で骨格筋の量または機能を増加させるための方法であって、
(a)筋量または筋機能の増加が望まれる被験体を特定する工程と、
(b)その被験体に、VPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化合物、およびVIP類縁体の発現を増加させる化合物から成る群から選択される、安全かつ有効な量の化合物を投与する工程とを含む方法。 - 骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で骨格筋萎縮を処置するための方法であって、
(a)骨格筋萎縮を処置する必要がある被験体を特定する工程と、
(b)その被験体に、VPAC受容体作動薬、VPAC受容体の活性化またはVPAC受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的VPAC受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型VPAC受容体をコード化する発現ベクター、VPAC受容体の発現を増加させる化合物、VIPの発現を増加させる化号物、およびVIP類縁体の発現を増加させる化合物とから成る群から選択され、好ましくは該化合物がVPAC受容体作動薬である、安全かつ有効な量の化合物を投与する工程とを含む方法。 - 前記VPAC受容体作動薬が、VIP、PACAP−27、PACAP−38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15、Arg21)VIP、[Arg15、20、21Leu17]−VIP−Gly−Lys−Arg−NH2、[K15、R16、L27、VIP(1−7)、GRF(8−27)−NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25−1553、Ro25−1392またはPACAP(6−38)である、請求項10または11に記載の方法。
- VPAC受容体に特異的な精製抗体であって、該抗体がキメラ抗体またはヒト抗体、好ましくはヒト抗体である抗体。
- 前記抗体がVPAC受容体の作動薬である、請求項13に記載の抗体。
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