JP2004511495A - 造血幹細胞遺伝子療法 - Google Patents
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Abstract
Description
技術分野
本願開示内容は、遺伝子療法の分野のものである。特に、本発明は、造血幹細胞(HSC)または骨髄の遺伝子療法と併用して胸腺を刺激することで患者の免疫系を調節する分野のものである。
【0002】
発明の背景
免疫系
免疫系の主な機能は、「外来」抗原を「自己」と区別し、これに応じて応答して生体を感染から保護することである。通常の免疫応答における一連のイベントでは、特定の抗原提示細胞(APC)によって外来抗原が小さなペプチド断片へと貪食分解され、APC表面の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の溝に提示される。MHC分子には、すべての有核細胞上に発現するクラスI分子(細胞障害性T細胞(Tc)によって認識される)と、主に免疫系の細胞によって発現されるクラスII分子(ヘルパーT細胞(Th)によって認識される)とがある。Th細胞はAPC上のMHC II/ペプチド複合体を認識し、応答する。続いて、これらの細胞によって放出される因子が両方のTc細胞または特定の抗原に特異な抗体産生B細胞活性化のいずれかを促進する。事実上すべての免疫応答においてTh細胞がいかに重要かを最もよく示しているのがHIV/AIDSである。この疾患ではTh細胞がウイルスに破壊されることで死滅して重篤な免疫不全が起こり、最終的には死につながる。Th(ならびに程度は低いがTc)が不適切な形で発達すると、アレルギーや癌、自己免疫疾患などのさまざまな他の疾患につながる可能性がある。
【0003】
抗原を認識する能力はTリンパ球およびBリンパ球の細胞膜レセプターにある。これらのレセプターは、個々のT細胞またはB細胞が各々独特な抗原レセプターを持つような形で、可能性のある多くの遺伝子が複雑な再配列を繰り返して無作為に生成される。実際に起こり得る多様性がこのように桁外れに多いことはすなわち、生体が遭遇するかもしれないあらゆる抗原に対して複数のリンパ球がさまざまな結合強度(親和性)でこれを認識し、さまざまな度合いで応答できるようになることを意味する。抗原レセプターの特異性は偶然に生じるものであるため、自己の抗原と反応するリンパ球によって生体が「自滅」しないのは何故なのかという問題が生じる。幸いにも、T細胞およびB細胞がそうするのを防ぐ機序がいくつかある。これらの細胞が集まると、免疫系が自己に対して寛容となる状況が生じるのである。
【0004】
自己寛容の最も効率的な形態は、これらの細胞が生成される部位(T細胞であれば胸腺、B細胞であれば骨髄)において反応する可能性のあるリンパ球をすべて物理的に除去する(殺す)ことである。これは中枢寛容(central tolerance)と呼ばれている。もうひとつの重要な寛容方法として、直接的またはさらに高い可能性としてサイトカインによって自己反応性細胞を阻害する調節Th細胞によるものがある。事実上すべての免疫応答でTヘルパー細胞による開始および調節が必要だとすれば、あらゆる寛容導入療法の主な目的はこれらの細胞を標的することであろう。同様に、Tcは極めて重要な効果器細胞であるため、これらの細胞を生成することが抗癌療法や抗ウイルス療法などの方策の主な目的のひとつにある。
【0005】
胸腺
胸腺はTリンパ球産生の中心となる部位であるため、免疫系における重要な臓器だと言えるだろう。胸腺の役割として、骨髄由来の適当な前駆細胞を血液中から取り込み、この前駆細胞をT細胞抗原受容体(TCR)の産生に必要な遺伝子再配列などのT細胞系譜に関与させることがあげられる。これに関連しているのが、T細胞数を増すことであらゆる外来抗原を認識して排除できる機会を増やす、驚くべき細胞分裂である。しかしながら、T細胞による抗原認識の奇妙な特徴のひとつに、B細胞とは異なり、TCRはMHC分子に物理的に結合したペプチド断片しか認識しない点がある。通常、これは自己MHCであり、この機能は胸腺で選択される。この過程は正の選択と呼ばれ、皮質上皮細胞だけにみられる特徴である。TCRが自己MHC/ペプチド複合体との結合に失敗すると、T細胞は「無視」されて死滅する。T細胞が成熟していくためには、TCRによるシグナル伝達が多少なりとも必要なのである。
【0006】
胸腺は、内部のT細胞のうち〜1%を毎日血流中に放出する、機能的免疫系には欠かせないものであるが、哺乳動物だけが持つ明らかな特異点のひとつに、性ステロイドが産生されると胸腺に重篤な萎縮が起こることがあげられる。これは幼い子どもにも起こり得るものであるが、思春期頃からが深刻である。健常な個体であれば、新たなT細胞が産生・放出されなくなっても常に臨床的な結果が出てくるとは限らない(ただし、免疫による障害は年齢を重ねるにつれて出現率と重篤度が高くなる)。AIDSおよびこれに伴う化学療法や放射線療法などでT細胞が大量に失われると、患者は免疫抑制された状態になるため、極めて疾患にかかりやすくなる。
【0007】
しかしながら、多くのT細胞は発達して自己MHC/ペプチド複合体を高い親和性で偶然に認識することができる。したがって、このようなT細胞は潜在的には自己反応性であり、多発性硬化症、関節炎、糖尿病、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス(SLE)などの重篤な自己免疫疾患の原因となりかねない。幸いなことに、胸腺では自己MHC/ペプチド複合体に対するTCRの親和性が高くなりすぎると、発達中の胸腺細胞の自殺的な活性化が惹起され、胸腺細胞がアポトーシスで死滅する負の選択と呼ばれるプロセスが発生する。これは中枢寛容と呼ばれている。このようなT細胞は胸腺ではまだ未成熟であるため、応答することなく死滅する。胸腺でこうした負の選択を引き起こし得る可能性が最も高いインデューサに、樹状細胞(DC)と呼ばれるAPCがある。APCの状態では、細胞は最も強いシグナルをT細胞に送達する。胸腺では、これによってT細胞がさらに成熟する末梢のリンパ系器官で欠失が生じ、DCが活性化を引き起こす。
【0008】
胸腺の萎縮
胸腺は神経内分泌系(Kendall、1988)との間における双方向の情報伝達に大きく影響される。胸腺の機能にとって特に重要なのが、栄養効果(甲状腺刺激ホルモンすなわちTSH、成長ホルモンすなわちGH)と萎縮効果(黄体形成ホルモンすなわちLH、卵胞刺激ホルモンすなわちFSHの両方ならびに副腎皮質刺激ホルモンすなわちACTH)(Kendall、1988;Homo−Delarche、1991)を含む、脳下垂体、副腎、性腺の相互関係である。特に、胸腺生理学の特性のひとつに、思春期前後に体内を循環する性ステロイドの産生量が増えるのに比例して構造と機能とが徐々に衰えることがあげられる(HirokawaおよびMakinodan、1975;Tosiら、1982;Hirokawaら、1994)。ホルモンの正確な標的とホルモンが胸腺の萎縮を誘導する機序については、今のところ明らかになっていない。胸腺は末梢T細胞プールを産生して維持する中心となる部位であるため、免疫による障害の出現率が高齢者で増加している主な原因が上記の萎縮にあるのではないかと考えられてきた。特に、T細胞の細胞溶解活性や細胞分裂応答などのT細胞依存性免疫機能が低下することで明らかになる免疫系の欠如が認められると、これが以後の生涯で免疫不全や自己免疫疾患、腫瘍荷重の出現率が増える形で表れてくる(Hirokawa、1998)。
【0009】
胸腺の萎縮による影響は末梢においてもT細胞プールへの胸腺からの入力の減少という形で表れ、結果としてT細胞受容体(TCR)レパートリーが少なくなる。また、サイトカインプロファイルの変動(Hobbsら、1993;Kurashimaら、1995)、CD4+サブセットおよびCD8+サブセットの変化、ナイーブT細胞ではなく記憶細胞への偏り(Mackallら、1995)も認められる。さらに、加齢に伴って、T細胞の枯渇後に免疫系が正常なT細胞数まで再生する能力が最終的に失われてしまうほど胸腺形成(thymopoiesis)の効率が悪くなる(Mackallら、1995)。しかしながら、Douekら(1998)による近年の研究で、胸腺の出力はヒトではおそらく老齢期でも起こるであろうことが明らかになった。すなわち、TCR遺伝子再構成の摘出(excisional)DNA産物を用いて、高齢患者でHIV感染後に新たに生成されて循環しているナイーブT細胞を示したのである。化学療法の経験のある患者では、思春期前の患者に比べて思春期後の患者で、T細胞プール、特にCD4+T細胞の再生速度が大幅に減少することから、上記出力の速度と以後の末梢T細胞プールの再生についてはさらに検討する必要がある(Mackallら、1995)。これは、TimmおよびThomanによる近年の研究(1999)でさらに実証されている。彼らは、骨髄移植(BMT)後の老齢マウスではCD4+T細胞の再生が認められるが、胸腺でのナイーブT細胞の産生量が減ることと相まって、末梢の微小環境が老化することで記憶細胞に偏るのではないかということを示した。
【0010】
胸腺は基本的に、さまざまな支質細胞(主に上皮細胞サブセット)の間に点在する発達中の胸腺細胞からなるものであり、この支質細胞によって微小環境が構成され、T細胞が最適な状態で発達するのに必要な成長因子と細胞間相互作用とが得られる。胸腺細胞と上皮サブセットとの間にその分化および成熟を左右する共生発達の関係(Boydら、1993)があるということは、他方の状態に影響するかもしれない何らかの細胞型のレベルで性ステロイドの阻害が起こり得ることを意味する。放射線キメラを利用した過去の研究で、骨髄(BM)幹細胞は年齢に影響されず(Hirokawa、1998;MackallおよびGress、1997)、若いBM細胞と同程度に胸腺再増殖の可能性があることが明らかになっているため、胸腺細胞自体の内部に固有の問題があるということは考えにくい。さらに、高齢動物の胸腺細胞にも少なくとも若干は分化能力が残っている(MackallおよびGress、1997;GeorgeおよびRitter、1996;Hirokawaら、1994)。しかしながら、Aspinallによる近年の研究(1997)で、TCRγ鎖の遺伝子再構成の段階で起こった前駆CD3−CD4−CD8−トリプルネガティブ(TN)集団に欠陥があることが明らかになった。
【0011】
発明の開示
本願開示内容は、遺伝子組換えHSC、リンパ球前駆細胞または骨髄前駆細胞、上皮幹細胞またはこれらの組み合わせ(本願明細書では、グループと各メンバを「GM細胞」と呼ぶ)を再活性化している胸腺に送達して利用する、遺伝子療法の方法に関するものである。好ましい実施形態では、年齢の高い(思春期後)患者の萎縮胸腺を再活性化させる。この再活性化された胸腺は(好ましくは遺伝的に改変されたおよび/または外来性の)HSCおよび骨髄細胞を血液から取り込み、胸腺でこれを新たなT細胞とDCの両方に変換できるようになる。
【0012】
一態様では、本願開示内容は、患者の胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を破壊し、この患者に骨髄またはHSCを移植することを含む、患者のT細胞障害を治療するための方法を提供するものである。
【0013】
一実施形態では、T細胞障害が、定義された遺伝的な根拠を持つものである。
【0014】
好ましい実施形態では、T細胞障害が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)などによるウイルス感染と、T細胞機能障害と、T細胞が直接的または間接的に数字上で減少するまたは機能的に弱くなる他の疾患または健康状態からなる群から選択される。
【0015】
好ましい実施形態では、HSCを遺伝的に改変し、胸腺の再活性化時とその後で形成されるT細胞でHIVに対する耐性を生む。たとえば、HSCを改変し、その産物が、HIVの感染、機能および/または複製にT細胞で干渉する遺伝子を含むようにする。
【0016】
別の態様では、本願開示内容は、HIVなどの感染因子による感染を防止するための方法を提供するものである。感染因子の感染、活性、複製などやこれらの組み合わせに対して耐えるまたはこれを防ぐように遺伝的に改変されたGMを、胸腺の再活性化と同時に患者に注射する。
【0017】
別の態様では、本願開示内容は、性ステロイドによるシグナル伝達を破壊することによって胸腺を再活性化させるものである。一実施形態では、性腺摘除を用いて性ステロイドによるシグナル伝達を破壊する。好ましい実施形態では化学的な性腺摘除を用いる。別の実施形態では外科的な性腺摘除を用いる。性腺摘除によって、胸腺の状態が逆行して思春期前での状態に戻るため、胸腺が活性化されることになる。
【0018】
特定の実施形態では、LHRHのアゴニストまたはアンタゴニスト、抗エストロゲン抗体、抗アンドロゲン抗体を投与すること、あるいは受動(抗体)または能動(抗原)抗LHRHワクチン接種またはこれらの組み合わせ(「ブロッカー」)によって、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を遮断する。
【0019】
好ましい実施形態では、徐放性ペプチド放出製剤によってブロッカー(単数または複数)を投与する。徐放性ペプチド放出製剤については一例がWO98/08533号に開示されており、その内容を本願明細書に援用する。
【0020】
本発明では、好ましい実施形態では、胸腺の再活性化の直前、胸腺の再活性化時または胸腺の再活性化の直後に、遺伝子組換えHSCを患者に移植し、遺伝子組換えT細胞の新たな集団を作り出す。
【0021】
発明の詳細な説明
本願開示内容は、遺伝的に改変した造血幹細胞、リンパ球前駆細胞、骨髄前駆細胞、上皮幹細胞またはこれらの組み合わせ(GM細胞)を用いる、遺伝子療法のための方法を含む。遺伝子療法としてこのような細胞を送達するために過去に第三者が行ったいくつかの試みは、無視できるレベルで改変細胞が得られただけで失敗に終わっている。本願開示内容は、細胞の取り込みと所望のT細胞への分化とを促進する、上記の細胞を送達するための新たな方法を提供するものである。本発明の方法によって胸腺が再活性化中の患者に改変細胞を注射する。改変された幹細胞および前駆細胞が胸腺に取り込まれて変換され、T細胞や樹状細胞、胸腺で生成される他の細胞になる。これらの新しい細胞は各々親の幹細胞/前駆細胞の遺伝的改変体を含んでいる。
【0022】
レシピエントの胸腺を再活性化するには、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を破壊すればよい。この破壊によって、レシピエントのホルモンの状態が逆行する。破壊を達成するための好ましい方法のひとつが性腺摘除によるものである。性腺摘除方法としては、化学的な性腺摘除と外科的な性腺摘除とがあげられるが、これに限定されるものではない。性腺摘除ステップの間または後でGM細胞を患者に移植する。これらの細胞は胸腺によって患者に属するものとして受容され、胸腺が産生する新たなT細胞およびDCの一部となる。このようにして得られるT細胞集団には、幹細胞/前駆細胞に挿入された遺伝的改変体が含まれることになる。
【0023】
胸腺を再活性化するための好ましい方法のひとつに、脳下垂体に対するLHRHの直接的および/または間接的な刺激作用を遮断することがあげられる。これはゴナドトロフィンFSHおよびLHの喪失につながる。これらのゴナドトロフィンは通常、性腺に作用して性ホルモンを放出させ、特に女性の場合はエストロゲンを、男性の場合はテストステロンを放出させる。FSHおよびLHの喪失によって上記の放出が遮断されるのである。これによって生じる直接的な作用に性ステロイドの血漿濃度の瞬時降下があり、結果として胸腺に阻害信号が放出され続けることになる。そこで、(理想的には自家の)CD34+造血細胞を注射することで胸腺再成長の度合いを高め、動態を強めることができる。
【0024】
本発明は、性ステロイドによって成熟して免疫系を持つ動物であればどのような種の動物にも(ヒトを含む)使用できるものであり、たとえば哺乳動物や有袋動物など、好ましくは大型の哺乳動物、最も好ましくはヒトがあげられる。
【0025】
「再生」「再活性化」「再構築」という用語ならびにその派生語は、本願明細書では同義に用いられるものであり、萎縮した胸腺が活性状態に回復することを意味する。
【0026】
本願明細書において使用する「性腺摘除」とは、生体での性ステロイドの産生と運搬を顕著に低減または排除することを意味する。これによって患者は胸腺が十分に機能している思春期前の状態に効率よく戻る。外科的な性腺摘除では患者の性腺を摘出する。
【0027】
外科的な方法ほどの永続性はない性腺摘除方法のひとつに、一定期間のあいだ化学薬品を投与する方法があり、本願明細書ではこれを「化学的な性腺摘除」と呼ぶ。さまざまな化学薬品をこのように機能させることができる。化学薬品の送達時ならびにその後の一定期間のあいだ、患者のホルモン産生が停止する。好ましくは、化学薬品の送達終了時に性腺摘除を無効にする。
【0028】
好ましい実施形態では、患者はHIVに感染している。この患者を治療するための好ましい方法は以下のステップを含む。各ステップの詳細については後述する。
1)多剤併用療法(HAART)での処置によってウイルス力価を小さくし、この処置を、新しいT細胞の感染を防止または少なくする方法の最初から最後まで継続する。
2)T細胞のアブレーション(免疫抑制)を行う。
3)好ましくはLHRH類縁体を投与することにより胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を遮断する。
4)胸腺が再活性化を開始した時点で、HIVの感染を防止する、HIVの複製を防止する、HIVウイルスを機能しなくする、あるいは、HIVによるT細胞の感染を止める他の作用を持つタンパク質を発現する遺伝子を含むように改変したGM細胞を投与する。
5)GM細胞が自己細胞ではない場合、胸腺再活性化の時点でドナー細胞を投与することで、免疫系を準備刺激してドナー細胞を自己であると認識させる。
6)胸腺のキメラ(thymic chimera)が構築されて胸腺に成熟T細胞の新たなコホートが現れ始めたら、免疫抑制を縮小し、最終的には中止する。
【0029】
胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達の破壊
容易に理解できるように、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を当業者間で周知のいろいろな方法で破壊することができるため、そのうちいくつかを本願明細書で説明する。たとえば、胸腺での性ステロイド産生を阻害するか、あるいは1種またはそれ以上の性ステロイド受容体を遮断することで、性ステロイドアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは能動(抗原)または受動(抗体)抗性ステロイドワクチン接種を施す場合のように所望の破壊が達成される。性ステロイドの産生については、1種またはそれ以上の性ステロイド類縁体を投与して阻害することも可能である。臨床例の中には、物理的な性腺摘除によって性腺を永久的に除去する方がよいこともある。
【0030】
好ましい実施形態では、性ステロイド類縁体、好ましくは黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)の類縁体を投与することによって、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を破壊する。性ステロイド類縁体とこれを治療や化学的な性腺摘除に利用することについては周知である。このような類縁体としては、ブセレリン(ヘキスト)、シストレリン(ヘキスト)、デカペプチル(商品名デビオファーム;ボーフール・イプセン)、デスロレリン(バランスファーマシューティカルズ)、ゴナドレリン(エアスト)、ゴセレリン(商品名ゾラデックス;ゼネカ)、ヒストレリン(オルト)、リュープロライド(商品名ルプロン;アボット/TAP)、リュープロレリン(Ploskerら)、ルトレリン(ワイエス)、メテレリン(WO9118016)、ナファレリン(シンテックス)、トリプトレリン(米国特許第4,010,125号)などのLHRH受容体(LHRH−R)アゴニストがあげられるが、これに限定されるものではない。また、LHRH類縁体としては、アバレリックス(Abarelix)(商品名プレナクシス;プラエシス)およびセトロレリックス(商品名;ゼンタリス)などのLHRH−Rアンタゴニストもあげられるが、これに限定されるものではない。アゴニストの組み合わせ、アンタゴニストの組み合わせ、アゴニストとアンタゴニストとの組み合わせも含まれる。なお、上述した各参考文献の開示内容を本願明細書に援用する。現時点では上記類縁体がデスロレリン(米国特許第44,218,439号に記載)であると好ましい。さらに包括的な一覧については、Vickeryら、1984を参照のこと。
【0031】
好ましい実施形態では、LHRHレセプター(LHRH−R)アンタゴニストを患者に送達した後、LHRH−Rアゴニストを送達する。このプロトコールを用いると、性ステロイドの産生を抑える前に、アゴニストを投与することで発生し得る性ステロイド産生のスパイクが排除または制限されることになる。別の実施形態では、LHRH−Rアンタゴニストを事前に投与するかまたは投与せずに、性ステロイド産生のスパイクをほとんど発生させないか全く発生させないLHRH−Rアゴニストを使用する。
【0032】
胸腺の再活性化を刺激することについては、基本的には性ステロイドの作用および/またはLHRH類縁体の直接的な作用を阻害して行うものであるが、相互に作用して胸腺の作用を高めることのできる別の物質を含むと有用な場合もある。このような化合物としては、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、上皮成長因子ファミリおよび線維芽細胞成長因子ファミリのメンバ、幹細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、ケラチノサイト成長因子(KGF)があげられるが、これに限定されるものではない。これらの別の化合物(単数または複数)についてはLHRH類縁体を最初に適用するときに1回だけ与えることを前提にしている。しかしながら、これらの物質1種類または2種類以上の組み合わせからなる投与量をさらに適当な時期に与え、胸腺をさらに刺激するようにしてもよい。また、胸腺特異性になるように標的してもよいステロイド受容体ベースのモジュレータを開発して使用してもよい。
【0033】
製薬組成物
本発明において用いる化合物は、薬学的に許容される何らかの担体に含有させて供給してもよいし、担体なしで供給してもよいものである。一例として、生理的に適合するコーティング、溶剤、希釈剤があげられる。非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与では、カプセル化などによって組成物を保護してもよい。あるいは、活性成分の徐放を可能にしつつこれらの活性成分(単数または複数)を保護する担体と一緒に組成物を供給してもよい。さまざまなバージョンの乳酸/グリコール酸コポリマーなどの持続放出薬剤を調製するための多数のポリマーおよびコポリマーが従来技術において周知である。たとえば、ポリエチレングリコール(PEG)の変性ポリマーを生分解性コーティングとして用いる米国特許第5,410,016号を参照のこと。
【0034】
経口送達を意図した製剤であれば、液体、カプセル、錠剤などとして調製することが可能である。これらの組成物には、活性成分が分解されないように保護する、賦形剤、希釈剤および/または被膜などを含むことが可能である。これらの製剤は周知である。
【0035】
どのような製剤であっても、LHRH類縁体の活性に悪影響をおよぼすことのない他の化合物を含むようにしてもよい。一例として、本願明細書にて説明するさまざまな成長因子および他のサイトカインがあげられる。
【0036】
用量
このLHRH類縁体は、一定の期間持続する単回用量で投与することが可能なものである。好ましくは製剤の薬効が1〜2ヶ月間である。標準用量は使用する類縁体のタイプによって決まる。通常、この用量は約0.01μg/kgから約10mg/kgであり、好ましくは約0.01mg/kgから約5mg/kgである。用量は使用するLHRH類縁体またはワクチンによって変わる。好ましい実施形態では、周期的な流行が続いている間は維持される用量にする。たとえば、通常は冬季が「インフルエンザシーズン」になる。本願明細書に記載のようにしてLHRH類縁体の製剤を製造および送達し、インフルエンザシーズンの最初から2ヶ月以上患者を保護することができる。この場合、感染の危険性が小さくなるかなくなるまで2ヶ月に1回程度かそれ以上の期間をあけて追加投与するようにする。
【0037】
免疫系を強化するための製剤を製造することが可能である。あるいは、免疫系を強化する一方でインフルエンザウイルスによる感染を特異的に防止するための製剤を調製することが可能である。後者の製剤には、インフルエンザウイルスに対する耐性を生むべく作られてきたGM細胞が含まれるであろう(下記参照)。GM細胞については、LHRH類縁体製剤との併用で投与することもできるし、あるいは空間的および/または時間的に別々に投与することもできる。非GM細胞の場合と同様に、長期にわたって複数回用量を患者に投与し、インフルエンザシーズンの最初から最後までインフルエンザウイルスによる感染から患者を保護し、感染を妨害することができる。
【0038】
化学的な性腺摘除用薬剤の送達
本発明による化合物の送達は、当業者間で周知の多くの方法で達成可能なものである。化学的なインヒビターを投与して胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を阻害する標準的なやり方のひとつに、3ヶ月間有効なLHRHアゴニストを単回用量で用いる方法がある。この方法では、3ヶ月が経過するずっと前にアゴニストが患者の体から排泄されてしまうため、単純に1回のi.v.(静脈内)またはi.m.(筋肉内)注射を行うだけでは不十分なことがある。代わりにデポ注射またはインプラントを利用してもよいし、あるいは、インヒビターの徐放が可能な他のインヒビター送達手段。同様に、ここで必要な機能を保ちつつ、たとえば化学薬品を変性させるなどの方法で体内におけるインヒビターの半減期を延ばすための方法を利用してもよい。
【0039】
さらに有用な送達機序の一例として、皮膚にレーザを照射する方法や皮膚表面で高圧神経衝撃トランジェント(high pressure impulse transient)(応力波または神経衝撃トランジェントとも呼ばれる)を発生させる方法があげられるが、これに限定されるものではない。いずれの方法でも、同じ場所に担体を併用または併用せずに、化合物(単数または複数)を接触させる処理を同時にまたは後から行う。好ましい接触方法のひとつに、処置を行っている間は皮膚の上にパッチを載せたままにしておく方法がある。
【0040】
ひとつの送達手段では、適切な波長が維持され、厳密に焦点の合ったレーザ光線を利用して、患者の皮膚に小さなパーフォレーションを作るか、皮膚を変質させる。米国特許第4,775,361号、米国特許第5,643,252号、米国特許第5,839,446号、米国特許第6,056,738号を参照のこと(いずれも本願明細書に援用する)。好ましい実施形態では、レーザ光線の波長は0.2から10ミクロンである。より好ましくは、波長は約1.5から3.0ミクロンである。最も好ましくは、波長は約2.94ミクロンである。一実施形態では、レンズを用いてレーザ光線の焦点を合わせ、皮膚の表皮をとおして皮膚表面に照射スポットを形成する。別の実施形態では、レーザ光線の焦点を合わせ、皮膚の表皮細胞のみをとおして照射スポットを形成する。
【0041】
本願明細書において使用する「アブレーション」および「パーフォレーション」とは、皮膚に形成された穴を意味する。このような穴については深さを変えることが可能である。たとえば表皮細胞のみを貫通するようにしてもよいし、皮膚の毛細管層まで全体を貫通するようにしてもよく、あるいはその間のいずれかの場所で終端してもよい。本願明細書において使用する「変質」とは、穴を形成することなく皮膚の透過性を高める、皮膚構造の変化を意味する。パーフォレーションと同様に、皮膚をどのような深さで変質させてもよい。
【0042】
レーザ光線を規定するにあたって、波長、エネルギフルエンス、パルス時間幅および照射スポットサイズをはじめとする、いくつかの要素が考慮されることがある。好ましい実施形態では、エネルギフルエンスは0.03〜100,000J/cm2の範囲である。より好ましくは、エネルギフルエンスは、0.03〜9.6J/cm2の範囲である。光線の波長は、Er:YAGなどのレーザ材料にある程度は左右される。パルス時間幅は、コンデンサ群、フラッシュランプ、レーザロッドの材料などによって生成されるパルス幅から必然的に得られる。パルス幅は1fs(フェムト秒)から1,000μsの間であると最適である。
【0043】
この方法によれば、レーザで形成するパーフォレーションまたは変質を必ずしも1回のレーザパルスで形成しなくてもよい。好ましい実施形態では、表皮細胞をとおしてのパーフォレーションまたは変質を、各々が標的組織厚の一部のみを貫通または変化させる複数のレーザパルスを用いて形成する。
【0044】
この目的を達成するために、パルス1回分のエネルギを求めて所望のパルス数で割ることで、複数のパルスで表皮細胞を貫通または変化させるのに必要なエネルギをおおざっぱに見積もることができる。たとえば、あるサイズのスポットで表皮細胞全体をとおしてパーフォレーションまたは変質を形成するのに1Jのエネルギが必要な場合、各々がそのエネルギの1/10である10のパルスを用いて定性的に同様のパーフォレーションまたは変質を形成することができる。放射線照射の間は患者が標的組織を動かさず、各パルスの間に生成される熱が有意に拡散しないことが望ましい(ヒトの反応時間は100ms程度)ため、好ましい実施形態では、レーザからのパルスの繰り返し数を100ms未満の時間で完全なパーフォレーションを形成できるような数にしなければならない。あるいは、標的組織とレーザの向きを機械的に固定し、これよりも長い放射線照射時間のあいだ標的位置の変化が起こらないようにすることも可能である。
【0045】
血流をほとんど発生させないか全く発生させない形で皮膚を貫通するには、表皮細胞層などの外側の表面を介するが毛細管層ほど深部ではない位置で皮膚を穿孔または変質すればよい。このとき、皮膚での光線直径が約0.5ミクロン〜5.0cmの範囲になるようにレーザ光線の焦点を皮膚に正確に合わせる。任意に、スポットを幅約0.05〜0.5mmで長さ最大2.5mmのスリット形にしてもよい。幅はどのようなサイズであってもよく、除去対象となる流体または適用対象となる医薬品の所望の透過率と照射部分の組織構造とによって制御される。焦点レンズの焦点距離はどのような長さであってもよいが、一実施形態では30mmである。
【0046】
波長、パルス長、エネルギフルエンス(レーザエネルギ出力(ジュール)および焦点での光線サイズ(cm2)の関数)、照射スポットサイズを調節することで、表皮細胞への影響をアブレーション(パーフォレーション)と非焼灼性の変性(変質)との間で変えることが可能である。表皮細胞のアブレーションと非焼灼性の変質はいずれもその後に適用される製剤の透過性を高めるものである。
【0047】
たとえば、パルスエネルギ以外の変数を一定に維持したままパルスエネルギを小さくすると、組織への作用を焼灼性と非焼灼性との間で変化させることができる。パルス長約300μsのEr:YAGレーザを用いて、パルスまたは輻射エネルギ1回分で2mmのスポットを皮膚に照射する場合、パルスエネルギが約100mJを超えると部分的または完全なアブレーションが形成され、パルスエネルギが約100mJ未満であると部分的なアブレーションまたは非焼灼性の変質が表皮細胞に形成される。任意に、複数のパルスを利用して、体液の透過性を高めるのに必要または医薬品送達用の閾値パルスエネルギをパルス数にほぼ等しい分だけ減少させてもよい。
【0048】
あるいは、スポットサイズ以外の変数を一定に維持したままスポットサイズを小さくしても、組織への作用を焼灼性と非焼灼性との間で変化させることができる。たとえば、スポット面積を半分にすることで同じ効果を得るのに必要なエネルギも半分になる。レーザの輻射出力を顕微鏡対物レンズ(microscope objective)の対物レンズ(たとえばニューヨーク州メルビルのニコン社から入手可能なものなど)に結合することで、0.5ミクロンまで抑えて照射を行うことができる。このような場合、おおよそ顕微鏡の解像限界までのスポットに光線の焦点を合わせることができるが、これはおそらく約0.5ミクロン程度である。実際、光線のプロファイルがガウスであれば、対象となる照射部分のサイズを実測光線サイズよりも小さくすることができ、顕微鏡の画像解像度を超えることが可能なのである。この場合、組織を非焼灼的に変質させるには、エネルギフルエンスを3.2J/cm2にすると良いであろうと思われるが、この場合に二分の一ミクロンのスポットサイズであれば必要なパルスエネルギは約5nJになる。このように低いパルスエネルギはダイオードレーザで容易に得ることができ、ガラスなどの吸収用フィルタを用いて光線を減衰させれば、Er:YAGレーザなどでも得ることができるものである。
【0049】
任意に、輻射エネルギの波長以外の変数を一定に維持したまま輻射エネルギの波長を変えることで、組織への作用を焼灼性と非焼灼性との間で変化させるようにしてもよい。たとえば、Er:YAG(エルビウム:YAG;2.94ミクロン)レーザの代わりにHo:YAG(ホルミウム:YAG;2.127ミクロン)を使用すると組織によるエネルギの吸収量が小さくなり、少な目のパーフォレーションまたは変質が形成される。
【0050】
レーザによって生成されるピコ秒およびフェムト秒のパルスを利用し、皮膚に変質またはアブレーションを形成するようにしてもよい。これは、時間幅1フェムト秒から1msの範囲で1回のパルスを送達する調節済みのダイオードまたは関連のマイクロチップレーザで達成可能なものである(パルス長を1フェムト秒まで抑えて用いることについて開示した、本願明細書に援用するD.Sternらの「Corneal Ablation by Nanosecond,Picosecond, and Femtosecond Lasers at 532 and 625 nm」、Corneal Laser Ablation、第107巻、第587〜592頁(1989)を参照のこと)。
【0051】
もうひとつの送達方法では、皮膚での高圧神経衝撃トランジェントを利用して透過性を得る。本願明細書に援用する米国特許第5,614,502号および米国特許第5,658,892号を参照のこと。立ち上がり時間と最大応力(または圧力)とを定めた応力波(たとえばレーザで生成する場合はレーザ応力波(LSW))などの高圧神経衝撃トランジェントを用いて、表皮細胞や粘膜などの上皮組織の層をとおして本願開示内容にあるものなどの化合物を安全かつ効率的に移動させることができる。これらの方法を利用すれば、正味電荷とは関係なく広範囲にわたるサイズの化合物を送達することができる。また、本方法で用いる神経衝撃トランジェントでは組織の損傷が回避される。
【0052】
神経衝撃トランジェントに曝露する前は、表皮細胞などの上皮組織層は外来化合物を通さないことが多い。このため、上皮層よりも下にある細胞に化合物を拡散させることができない。上皮層を神経衝撃トランジェントに曝露すると、上皮層をとおして化合物を拡散させることができる。拡散速度は通常、神経衝撃トランジェントの性質と送達対象となる化合物のサイズとによって決まる。
【0053】
皮膚の表皮細胞などの特定の上皮組織層をとおしての貫通速度も、pH、皮膚支持体組織の代謝、表皮細胞外の領域と表皮細胞内の領域との圧差ならびに皮膚の解剖組織上の部位および生理状態をはじめとする、ほかのいくつかの要因に左右される。さらに、皮膚の生理状態は、健康状態、年齢、性別、人種、スキンケア、病歴に左右される。たとえば、事前に有機溶剤または界面活性剤に触れると皮膚の生理状態に影響する。
【0054】
また、上皮組織層をとおして送達される化合物の量も上皮層が透過性である時間と透過性にされる上皮層の表面積の大きさとに左右されることになる。
【0055】
神経衝撃トランジェントの特性と特徴を、神経衝撃トランジェントを生成するエネルギ源によって制御する。本願明細書に援用するWO98/23325号を参照のこと。しかしながら、この特徴は、神経衝撃トランジェントが伝播する接触媒質の線形特性と非線形特性とによって変わってくる。接触媒質によって生じる線形の減衰は主に神経衝撃トランジェントの高周波成分を減衰する。これによって帯域幅が小さくなり、これに伴って神経衝撃トランジェントの立ち上がり時間が長くなる。一方、接触媒質の非線形特性は立ち上がり時間を短くする。立ち上がり時間が短くなるのは、音と粒子の速度が応力(圧力)に依存するためである。応力が大きくなると、音と粒子の速度も上昇する。これによって神経衝撃トランジェントの立ち上がりが急勾配になる。立ち上がり時間の急勾配の増加を実質的なものとするのに波をどのくらいの時間伝搬させることになるかは、線形の減衰、非線形係数、最大応力の相対強度によって決まる。
【0056】
神経衝撃トランジェントの立ち上がり時間、規模、持続時間については、一時的に上皮組織層の透過性を高める非破壊的な(すなわち非衝撃波)神経衝撃トランジェントが得られるように選択する。通常、立ち上がり時間は少なくとも1nsであり、より好ましくは約10nsである。
【0057】
神経衝撃トランジェントの最大応力または圧力は上皮組織または細胞層によって異なる。たとえば、表皮細胞をとおして化合物を移動させる場合、神経衝撃トランジェントの最大応力または圧力を少なくとも400バール、より好ましくは少なくとも1,000バールに設定しなければならないが、約2,000バールを超えないようにする。上皮粘膜層では最大圧力を300バールから800バール、好ましくは300バールから600バールの間に設定するものとする。神経衝撃トランジェントは、持続時間が数十ns前後で上皮組織と互いに影響しあうのが短時間しかないと好ましい。神経衝撃トランジェントとの相互作用後、上皮組織が永久的に損傷されることはなく、最大約3分間透過性を維持するだけである。
【0058】
また、これらの方法では、高振幅の別個のパルスを数回患者に印加するだけである。患者に施される神経衝撃トランジェントの数は一般に100未満であり、より好ましくは50未満、最も好ましくは10未満である。複数の光学パルスを用いて神経衝撃トランジェントを生成する場合、連続したパルス間の時間は10から120秒であるが、これは上皮組織の永久的な損傷を防ぐには十分な長さである。
【0059】
神経衝撃トランジェントの特性については、従来技術において標準の方法を用いて測定することが可能である。たとえば、Doukasら、Ultrasound Med.Biol.、21:961(1995)に記載されているようなポリフッ化ビニリデン(PVDF)トランスデューサ法を用いて、最大応力または圧力、立ち上がり時間を測定することができる。
【0060】
神経衝撃トランジェントは、さまざまなエネルギ源によって生成可能なものである。神経衝撃トランジェントの発射を担う物理現象は、通常、(1)熱弾性生成、(2)光破壊または(3)アブレーションという3通りの機序から選択される。
【0061】
たとえば、高エネルギのレーザ源を適用して標的材料を焼灼することで神経衝撃トランジェントを開始することができ、その後この神経衝撃トランジェントを接触媒質によって上皮組織または細胞層に結合する。接触媒質は、たとえば、非線形である限りは液体またはゲルである。よって、水、ひまし油などの油、ホスフェート緩衝生理食塩水(PBS)などの等張媒質またはコラーゲンゲルなどのゲルを接触媒質として用いることができる。
【0062】
また、たとえば神経衝撃トランジェントの生成後に化合物に対して表皮細胞が透過性である時間を引き延ばすことによって移動性を高める界面活性剤を接触媒質に含むようにしてもよい。界面活性剤には、たとえばイオン性洗剤または非イオン性洗剤が考えられ、よって、たとえばラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキシドを含むことができる。
【0063】
吸収する標的材料は光学的に誘発されるトランスデューサとして作用する。光を吸収すると標的材料には急激な熱膨張が起こって焼灼され、神経衝撃トランジェントが起こる。一般に、金属およびポリマーのフィルムは可視スペクトル領域および紫外スペクトル領域での吸収係数が大きい。
【0064】
使用するレーザの波長で光を完全に吸収する限り、多くのタイプの材料をレーザ光線と併用の標的材料として用いることができる。標的材料については、アルミニウムまたは銅などの金属、黒いポリスチレンなどのポリスチレンなどのプラスチック、セラミック、高濃縮染料溶液で構成することが可能である。標的材料は印加するレーザエネルギの断面積よりも寸法の大きなものでなければならない。また、光が皮膚表面に衝突しないように、標的材料は光学的貫通深さよりも厚くなければならない。さらに、標的材料は機械的に支持できるだけの十分な厚さのものでなければならない。標的材料が金属製の場合、一般的な厚さは1/32から1/16インチである。プラスチックの標的材料では、厚さは1/16から1/8インチである。
【0065】
また、限られた狭い範囲の(confined)アブレーションによって神経衝撃トランジェントを強めることもできる。限られた狭い範囲のアブレーションでは、石英の光学ウィンドウなどのレーザ光線透過材料を標的材料と密着させて配置する。この透明材料を用いて標的材料を焼灼してプラズマを限局すると、結合係数が桁違いに大きくなる(Fabroら、J.Appl.Phys.、68:775、1990)。透明材料には、石英、ガラスまたは透明プラスチックを用いることが可能である。
【0066】
標的材料と限局用の透明材料との間に空間ができるとプラズマが膨張する余裕ができ、標的に加わる運動量が小さくなってしまうため、炭素含有エポキシなどの最初は液体状である接着剤を用いて透明材料を標的材料に接着し、このような空間をなくすようにすると好ましい。
【0067】
たとえば電気光学的装置または音響光学的装置を用いてQスイッチレーザまたはモード同期レーザを利用するなどの従来技術において周知の標準的な光学的変調技法によってレーザ光線を生成することができる。赤外スペクトル、可視スペクトルおよび/または赤外スペクトルにおいてパルスモードで動作できる標準的な市販レーザとしては、Nd:YAG、Nd:YLF、CO2、エキシマ、染料、Ti:サファイア、ダイオード、ホルミウム(および他の希土材料)、金属蒸気レーザがあげられる。これらの光源はパルス幅が調節可能であり、数十ピコ秒(ps)から数百マイクロ秒まで可変である。本願開示内容で使用する光学パルス幅は100psから約200nsで可変であり、好ましくは約500psから40nsの間である。
【0068】
また、体外砕石機によって神経衝撃トランジェントを生成することも可能である(一例が、Colemanら、Ultrasound Med.Biol.、15:213〜227、1989に記載されている)。これらの神経衝撃トランジェントは立ち上がり時間が30から450nsであり、レーザで生成する神経衝撃トランジェントの場合よりも長い。この新たな方法用に体外砕石機を用いて適切な立ち上がり時間の神経衝撃トランジェントを形成するために、上記の式(1)によって求められる距離だけ非線形の接触媒質(水など)中で神経衝撃トランジェントを伝播させる。たとえば、立ち上がり時間100nsでピーク圧力が500バールの神経衝撃トランジェントを生成する砕石機を用いる場合、上皮細胞層と接触する前に神経衝撃トランジェントが接触媒質を介して移動しなければならない距離は約5mmである。
【0069】
砕石機によって生成される神経衝撃トランジェントを加工する方法のもうひとつの利点として、波の引張成分(tensile component)が広がり、非線形の接触媒質中を伝播することで減衰される点があげられる。この伝播距離を調整し、圧力が波の圧縮成分の最大圧力のわずか約5から10%の引張成分を持つ神経衝撃トランジェントを生成する必要がある。したがって、加工された(shaped)神経衝撃トランジェントが組織を損傷することはない。
【0070】
使用する砕石機のタイプは重要ではない。電気水力学式砕石機、電磁式砕石機または圧電式砕石機のいずれかを用いることができる。
【0071】
また、圧電トランスデューサなどのトランスデューサを用いて神経衝撃トランジェントを生成することも可能である。好ましくは、トランスデューサが接触媒質と直接接触し、光学的、熱的または電気的に場を印加して神経衝撃トランジェントを生成した後に急激に変位する。たとえば、絶縁破壊を利用することができ、この絶縁破壊は一般に高電圧スパークまたは圧電トランスデューサによって誘導される(特定の体外砕石機で用いられているものと同様である。Colemanら、Ultrasound Med.Biol.、15:213〜227、1989)。圧電トランスデューサの場合、電界を印加した後にトランスデューサが急激に膨張して接触媒質の急激な変位を発生させる。
【0072】
また、光ファイバを用いて神経衝撃トランジェントを生成することも可能である。光ファイバ送達系は特に扱いやすく、上皮組織層に隣接して位置する標的材料に光線を照射し、到達しにくい場所で神経衝撃トランジェントを生成するのに利用できるものである。これらのタイプの送達系は、カテーテルおよび関連の可撓性装置に統合し、人体のほとんどの器官への照射に利用できるため、レーザと光学的に結合させる場合に好ましいものである。また、所望の立ち上がり時間と最大応力の神経衝撃トランジェントを得るには、これに光学源(optical source)の波長を合わせて特定の標的材料で適切な吸収を生成する方法が簡単である。
【0073】
あるいは、爆発的に生じる神経衝撃に応答して強力な(energetic)材料で神経衝撃トランジェントを生成することもできる。放電またはスパークを発生させることで、この強力な材料を起爆装置で爆発させる。
【0074】
神経衝撃トランジェントと併せて静水圧を利用し、上皮組織層を介しての化合物の移動性を高めることができる。神経衝撃トランジェントによって誘発される作用は数分間持続するため、神経衝撃トランジェントの印加後に皮膚の表皮細胞などの上皮組織層の表面に静水圧を加えることで、濃度勾配に沿って上皮細胞層を介して受動的に拡散していく薬剤の移動速度を増すことができる。
【0075】
幹細胞または前駆細胞の遺伝的改変体
遺伝子
本発明に有用な遺伝子および遺伝子断片(ポリヌクレオチド)としては、T細胞の遺伝子ベースの疾患および健康状態に影響をおよぼすものがあげられる。このような疾患および健康状態としては、HIV感染/AIDS、T細胞白血病ウイルス感染、他のリンパ増殖疾患を含むが、これに限定されるものではない。HIV/AIDSについて言えば、nef転写因子と、tatおよびrevなどのHIV遺伝子を特異的に切断するリボザイムをコードする遺伝子(Bauer G.ら(1997)と、HIVの複製を阻害することが明らかになっている(Bonyhadiら 1997)HIV−1のrev遺伝子のトランスドミナント変異体形態であるRevM10と、HIV−1のrev−応答配列(RRE)の過発現コンストラクト(Kohnら、1999)と、発現が細胞のHIV感染または複製に対して阻害性であるRNAまたはタンパク質をコードする遺伝子と、これらの断片および組み合わせとを含むが、これに限定されるものではない、多数の遺伝子および遺伝子断片を利用することができる。
【0076】
これらの遺伝子または遺伝子断片は安定して発現可能な形態で用いられる。本願明細書で使用する「安定して発現可能な形態」という表現は、遺伝子または遺伝子断片を宿主細胞に導入した後で宿主細胞にて、さらには分割および/または分化後にその細胞の子孫で、少なくとも半永久的に遺伝子または遺伝子断片(「機能的断片)の産物(RNAおよび/またはタンパク質)が発現され得ることを意味する。このためには、上記の遺伝子または遺伝子断片が、ベクターに含まれるか否かを問わず、DNAをRNAに転写するための適切なシグナル配列を持つものでなければならない。さらに、この遺伝子または遺伝子断片によってコードされるタンパク質が患者の健康状態に影響する活性分子である場合、DNAも翻訳シグナルをコードする。
【0077】
ほとんどの場合、遺伝子または遺伝子断片はベクターに含まれることになる。当業者であれば、所望のRNAまたはタンパク質を発現させるのに使用できる発現ベクターを知っている。発現ベクターとは、そこに含まれるDNA配列の転写と、これによって得られるRNAの翻訳とを指示することができるベクターである。発現ベクターは、遺伝的改変の対象となる細胞で複製でき、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、ミニ染色体を含む。あるいは、遺伝子または遺伝子断片が細胞の染色体DNAの不可欠な部分になることもある。組換えベクターならびに方法論についてはおおむね周知である。
【0078】
本願開示内容のタンパク質を発現させるのに有用な発現ベクターは複製起点を含む。適切に作出された発現ベクターは、細胞での自律複製の複製起点を含むか、あるいは宿主細胞の染色体と結合することができる。このようなベクターには、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、強い高コピー数プロモーターも含まれることがある。プロモーターとは、DNAと結合してRNAの合成を開始するようRNAポリメラーゼに指令するDNA配列である。強いプロモーターはこのような開始を高い頻度で引き起こす。本願開示内容の発現ベクターは、本発明で使用されるRNAまたはタンパク質をコードするDNAと作動的に結合されている。すなわち、このベクターは、結合されたDNA分子の複製とこのDNA分子にコードされるRNAまたはタンパク質の発現の両方を指令することができる。したがって、タンパク質について言えば、発現ベクターは、制御配列による制御下でのDNA分子の発現とこのDNA分子にコードされる所望のタンパク質の産生とを可能にする正しいリーディングフレームを維持しつつ、結合されたDNA分子の上流に適切な転写開始シグナルを持つものでなければならない。発現ベクターは、クローニングベクター、修飾(modified)クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを含むがこれに限定されるものではない。好ましくは、挿入された遺伝子またはポリヌクレオチドの発現の量とタイミングとを制御できるように誘導性プロモーターを使用する。
【0079】
細胞
遺伝的改変体に好ましい細胞に造血幹細胞がある。これらの細胞は、骨髄、末梢血または臍帯から得られるものであってもよいし、あるいは他のHSC源に由来するものであってもよく、自己由来であっても非自己由来であってもよい。また、自己由来であっても非自己由来であってもよい、リンパ球細胞、骨髄前駆細胞、上皮幹細胞も有用である。
【0080】
非自己由来の(ドナー)細胞を用いる場合、胸腺再活性化のステップの間にこれらの細胞に対する寛容を作り出す。胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達の遮断開始時または開始後に、遺伝的に改変された関連のドナー細胞をレシピエントに移植する。これらの細胞は胸腺によってレシピエントに属するものとして受容され、胸腺が産生する新たなT細胞およびDCの一部となる。このようにして得られるT細胞集団はレシピエントとドナーの両方を自己として認識するため、ドナーからの移植片に対する寛容が作られる。本願明細書に援用する、係属中の米国特許出願第09/号を参照のこと。
【0081】
遺伝的改変の方法
遺伝子療法に用いる細胞に、標準的な組換え方法を用いて遺伝的改変体を導入することができる。たとえば、培養したHSCのレトロウイルスベクターによる形質導入が、功を奏する方法のひとつである(BelmontおよびJurecic、1997、Bahnson,A.B.ら、1997)。付加的なベクターとしては、アデノウイルス由来のベクターまたはレンチウイルス由来のベクター、モロニーマウス白血病ウイルス由来のベクターがあげられるが、これに限定されるものではない。
【0082】
また、遺伝子銃を用いるなどの粒子による遺伝子導入(YangおよびZiegelhoffer、1994)、リポソームによる遺伝子導入(Nabelら、1992)、遺伝子組換えベクターとリン酸カルシウムとの共沈(GrahamおよびVan Der Eb、1973)、電気穿孔(Potterら、1984)、マイクロインジェクション(Capecchi、1980)ならびに、遺伝子が少なくともその時間の一部(at least part of the time)に発現されるように好ましくはベクターの遺伝子またはオリゴヌクレオチドをHSCに安定して導入できる他の方法も有用である。
【0083】
遺伝子療法
本願開示内容は、患者の胸腺の再活性化による遺伝子療法の方法を提供するものである。これは、GM細胞をレシピエントに投与することによって達成される。遺伝子組換え細胞としては、HSC、上皮幹細胞、骨髄細胞またはリンパ球前駆細胞がありうる。好ましくは、遺伝子組換え細胞は、CD34+ HSC、リンパ球前駆細胞または骨髄前駆細胞である。最も好ましくは、遺伝子組換え細胞はCD34+ HSCである。遺伝子組換え細胞を患者に投与し、末梢血系を介して胸腺まで移行させる。このような造血前駆細胞の胸腺への取り込みは、性ステロイドの非存在下で実質的に増大する。これらの細胞は胸腺に受け入れられ、変化した細胞から遺伝的改変体を持つ樹状細胞およびT細胞を産生する。結果として、レシピエントの末梢血中を循環する所望の遺伝子変化のあるT細胞集団が得られ、これに伴って、患者の胸腺の再活性化によって生じる細胞、組織、臓器の集団が大きくなる。
【0084】
小動物での研究
材料および方法
動物
モナッシュ大学のCentral Animal ServicesからオスのCBA/CAHマウスおよびC57B16/Jマウスを入手し、従来の条件下で飼育した。週齢は4〜6週間から26ヶ月までの範囲であり、関連がある場合はこれを明記する。
【0085】
性腺摘除
キシラジン(ロンプン;オーストラリアのニューサウスウェールズ州ボタニーのバイエルオーストラリアリミテッド)0.3mgと塩酸ケタミン(ケタラール;オーストラリアのニューサウスウェールズ州Caringbahのパークデービス)1.5mgとを生理食塩水に入れた溶液0.3mlを腹腔内注射し、動物を麻酔した。陰嚢を切開して精巣を露出させ、縫合糸で結紮した後、周囲の脂肪組織と一緒に摘出して外科的な性腺摘除を行った。
【0086】
ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取り込み
BrdU(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルコーポレーション)(PBS100μl中100mg/体重kg)を4時間の間隔でマウスに2回腹腔内注射した。対照のマウスにはビヒクル単独の注射を行った。2回目の注射の1時間後、胸腺を切断解剖し、FACS解析用に細胞浮遊液を生成するか、あるいはすみやかにTissue Tek(インディアナ州O.C.T.compound,Miles INC)に埋め込み、液体窒素中でスナップ凍結させ(snap−frozen)、使用するまで−70℃で保管した。
【0087】
フローサイトメトリーによる分析
マウスをCO2窒息で屠殺し、胸腺、脾臓、腸間膜リンパ節を摘出した。器官を冷たいPBS/1%FCS/0.02%アジド中にて200μmの篩で静かに押しつぶし、遠心分離(650g、5分、4℃)し、PBS/FCS/Azのいずれか一方に再懸濁させた。赤血球溶解液(8.9g/リットル塩化アンモニウム)中にて10分間4℃で脾臓細胞をインキュベートし、洗浄し、PBS/FCS/Azに再懸濁させた。血球計算盤と臭化エチジウム/アクリジンオレンジとを用いて細胞濃度および生存度を2回重複して求め、蛍光顕微鏡(Axioskop;ドイツのオーバーコッヘンのカールツアイス)下で観察した。
【0088】
3色免疫蛍光法では、抗αβTCR−FITCまたは抗γδTCR−FITC、抗−CD4−PEおよび抗−CD8−APC(いずれもカリフォルニア州サンディエゴのファーミンジェンから入手)を用いて常法に従って胸腺細胞を標識し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。αβTCR−FITC/CD4−PE/CD8−APCまたはB220−B(シグマ)とCD4−PEおよびCD8−APCとのいずれかで脾臓およびリンパ節の懸濁液を標識した。カリフォルニア州バーリンゲームのカルタグラボラトリーズインコーポレイテッドから購入したストレプトアビジンTri−color複合体でB220−Bを発色させた。
【0089】
BrdU検出では、CD4−PEおよびCD8−APCで細胞を表面標識し、続いて、従来すでに説明されている(CarayonおよびBord、1989)ようにして固定および膜透過処理を行った。簡単に説明すると、染色した細胞を1%PFA/0.01%Tween−20中にて4℃でO/Nに固定した。洗浄後の細胞を、DNase(100Kunitz単位、西ドイツのベーリンガー・マンハイム)500μl中にて30分間37℃でインキュベートし、DNAを変性させた。最後に、抗BrdU FITC(ベクトン・ディッキンソン)を用いて細胞をインキュベートした。
【0090】
4色免疫蛍光法では、抗ラットIg−Cy5(英国、アマシャム)によって共通に検出される、CD3、CD4、CD8、B220およびMac−1で胸腺細胞を標識し、ネガティブ細胞(TN)を解析用に選び出した。これをさらにCD25−PE(ファーミンジェン)およびCD44−B(ファーミンジェン)で染色し、続いて、従来すでに説明されている(GodfreyおよびZlotnik、1993)ようにしてストレプトアビジンTri−colour(カリフォルニア州、カルタグ)での染色を行った。次に、上述したようにしてBrdU検出を行った。
【0091】
FacsCalibur(ベクトン・ディッキンソン)にて試料を分析した。0°および90°の光散乱プロファイルに基づいて生存可能なリンパ球を選び出し、Cell questソフトウェア(ベクトン・ディッキンソン)を用いてデータを分析した。
【0092】
免疫組織学
凍結保存した胸腺切片(4μm)を、クライオスタット(レイカ)を用いて切断し、100%アセトン中にてすみやかに固定した。
【0093】
2色免疫蛍光法では、この実験室で生成したモノクローナル抗体のパネルである、MTS 6、10、12、15、16、20、24、32、33、35および44(Godfreyら、1990、表1)で切片を二重標識し、多価ウサギ抗サイトケラチンAb(カリフォルニア州カーピンテリアのダコ)を用いて上皮細胞決定基の同時発現を評価した。結合したmAbをFITC標識ヒツジ抗ラットIg(Silenus Laboratories)と反応させ、抗サイトケラチンをTRITC標識ヤギ抗ウサギIg(Silenus Laboratories)と反応させた。
【0094】
BrdU検出では、切片を抗サイトケラチンに続いて抗ウサギTRITCで染色するか、あるいは特定のmAbで染色し、これを抗ラットIg−Cγ3(アマシャム)と反応させた。続いて、従来すでに説明されている(Penitら、1996)ようにしてBrdU検出を行った。簡単に説明すると、70%エタノール中にて30分間切片を固定した。半乾燥させた切片を4MのHCl中にてインキュベートし、ホウ酸緩衝液(シグマ)中で洗浄して中和し、続いてPBS中で2回洗浄した。抗BrdU−FITC(ベクトン・ディッキンソン)を用いてBrdUを検出した。
【0095】
3色免疫蛍光法では、抗サイトケラチンと一緒に特定のMTS mAbで切片を標識した。次に、上述したようにしてBrdU検出を実施した。
【0096】
レイカの蛍光顕微鏡とニコンの共焦点顕微鏡とを用いて切片を分析した。
【0097】
移行についての検討
キシラジン(ロンプン;オーストラリアのニューサウスウェールズ州ボタニーのバイエルオーストラリアリミテッド)0.3mgと塩酸ケタミン(ケタラール;オーストラリアのニューサウスウェールズ州Caringbahのパークデービス)1.5mgとを生理食塩水に入れた溶液0.3mlを腹腔内注射し、動物を麻酔した。
【0098】
胸腺細胞手法のFITC標識の詳細は他の資料に記載されているものと同様である(Scollayら、1980;Berzinsら、1998)。簡単に説明すると、胸腺の葉を露出させ、各葉に350μg/mlFITC(PBS中)約10μmを注射した。創傷を外科用ステープルで縫合し、完全に麻酔からさめるまでマウスを温めた。注射の約24時間後にCO2窒息によってマウスを屠殺し、リンパ系器官を分析用に摘出した。
【0099】
細胞数を計数した後、抗CD4−PEおよび抗CD8−APCで試料を染色し、続いてフローサイトメトリーで分析した。(自己蛍光細胞および重複物(doublets)を排除するために)移行細胞をCD4またはCD8のいずれかを発現しているlive−gated FITC+細胞として同定した。FITC+ CD4細胞およびCD8細胞のパーセンテージを加え、リンパ節と脾臓のそれぞれについて総移行率を求めた。また、Berzinsら(1998)に説明されているようにして1日あたりの輸出速度を算出した。
【0100】
対応のないスチューデントのt検定またはノンパラメトリックなMann−Whitney検定を用いて分析したデータを利用し、少なくとも3回重複して行った実験について対照と試験結果との間の統計的有意性を判定した。対照値とは有意に異なっている実験値を、*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001として示す。
【0101】
結果
胸腺細胞個体群に対して年月がおよぼす影響
(i)胸腺の重量および胸腺細胞数
時が経過するにつれて胸腺の重量(図1A)と胸腺細胞の総数(図1B)がいずれも極めて有意に(p≦0.0001)減少する。若い成体での相対胸腺重量(胸腺mg/体重g)は平均値で3.34であり、これが18〜24月齢で0.66まで減少する(脂肪が蓄積するため正確な計算には限度がある)。胸腺の重量が減少するのは胸腺細胞の総数が減少することによる可能性がある。1〜2月齢では胸腺の胸腺細胞数は〜6.7×107個であり、これが24月齢までに細胞数〜4.5×106個まで減少する。性腺を摘除して胸腺に対する性ステロイドの影響を排除すると、再生が起こり、性腺摘除後4週間が経過するまでに胸腺は重量と細胞充実性のいずれも若い成体の場合と等しくなる(図1Aおよび図1B)。興味深いことに、性腺摘除後2週間で胸腺細胞数は有意に(p≦0.001)増加(〜1.2×108)し、これが性腺摘除後4週間が経過するまでに正常な若い成体のレベルまで回復する(図1B)。
【0102】
胸腺で生成されるT細胞数が減少してもこれが末梢に反映されることはなく、末梢では時が経過しても脾臓細胞数は一定のままである(図2A)。時が経過して末梢に到達するT細胞数が減少しても脾臓とリンパ節でのB細胞とT細胞との比には何ら影響がない(図2B)ため、末梢に恒常性の機序が働いていることは明らかであった。しかしながら、CD4+T細胞とCD8+T細胞との比は時の経過に伴って2月齢の2:1から2年の時点での比1:1(図2C)まで有意に減少(p≦0.001)した。性腺摘除後に末梢に到達するT細胞数が増えても末梢のT細胞数には何ら変化は観察されなかった。性腺摘除後、脾臓のT細胞数は変化せず、B細胞:T細胞の比も脾臓とリンパ節のいずれにおいても変化しなかった(図2Aおよび図2B)。性腺摘除後2週間が経過した時点で末梢のCD4:CD8比の経時的な減少は依然として顕著であったが、これは性腺摘除後4週間が経過するまでに完全に反転した(図2C)。
【0103】
(ii)αβTCR、γδTCR、CD4およびCD8の発現
時の経過に伴って見られる胸腺細胞数の減少が特定の細胞個体群が枯渇した結果として生じたものであるか否かを判定するために、特徴のあるマーカーで胸腺細胞を標識して別々の部分母集団を分析できるようにした。また、これによって性腺摘除後の胸腺再増殖の動力学を分析できるようになった。主な胸腺細胞部分母集団の割合を正常な若い胸腺の割合と比較した(図3)ところ、時が経過しても均一のままであることが明らかになった。また、αβTCRおよびγδTCRの発現によって胸腺細胞がさらに分割されてもこれらの個体群の割合には経時的に何ら変化がないことが明らかになった(データ図示せず)。性腺摘除後2週間および4週間の時点で、胸腺細胞の部分母集団は同じ割合のままであり、胸腺細胞数が性腺摘除後に最大100倍まで増加するため、すべての胸腺細胞サブセットが徐々に増えるのではなく同期的に増えることが分かる。
【0104】
したがって、高齢動物の胸腺で細胞数の減少が認められるのは、T細胞個体群に有意な変化が検出されることなくあらゆる細胞表現型がバランスよく減少した結果であるように思われる。胸腺の再生は、すべてのT細胞部分母集団を逐次的ではなく同時に補充しながら同期的に行われる。
【0105】
胸腺細胞の増殖
図4に示されるように、4〜6週齢で胸腺細胞の15〜20%が増殖している。このうちの大半(〜80%)はDPであり、TNサブセットが〜6%(図5A)で二番目に大きい個体群を構成している。したがって、免疫組織学的には大半の分裂が被膜下および皮質に見られる(データ図示せず)。髄領域にも若干の分裂が見られ、FACS分析によって分裂しているSP細胞の割合(CD4T細胞9%とCD8T細胞25%)が明らかになっている(図5B)。
【0106】
老化胸腺では細胞数が有意に減少するが、胸腺細胞の増殖は一定のままであり、2年で12〜15%まで減少(図4)し、増殖中の個体群の表現型は2ヶ月の胸腺(図5A)に似ている。1歳での分裂が若い成体に見られる分裂を反映していることが免疫組織学的に明らかになったが、2年の時点では、増殖は主に外皮質で見られ、脈管系を囲んでいる(データ図示せず)。性腺摘除後2週間の時点で、胸腺細胞数は有意に増加するが、増殖している胸腺細胞の割合には変化がないことから、ここでも細胞が同期増殖していることが分かる(図4)。性腺摘除後2週間が経過するまでに、胸腺細胞増殖の局在位置と分裂している細胞が2月齢の胸腺の状況を真似る度合いとが免疫組織学的に明らかになった(データ図示せず)。増殖中の個体群を示す各部分母集団の割合を分析すると、増殖中の個体群に含まれるCD8T細胞のパーセンテージに有意な(p<0.001)増加が認められた(2月齢および2歳で1%、性腺摘除後2週間で〜6%まで増加)(図5A)。
【0107】
図5Bは、若いマウス、高齢マウス、性腺摘除を行ったマウスの各サブセットでの増殖の度合いを示している。DNサブセットでは増殖の有意な(p≦0.001)崩壊がある(2ヶ月の時点で35%であったものが2年までに4%へ)。CD8+T細胞の増殖も有意に(p≦0.001)減少し、老化胸腺の髄では分裂の痕跡が認められないという免疫組織学による所見(データ図示せず)が反映されていた。性腺摘除後4週間が経過するまでにDN増殖の減少が正常な若いレベルに戻ることはない。しかしながら、CD8+T細胞サブセットでの増殖は性腺摘除後2週間の時点で有意に(p≦0.001)増加し、性腺摘除後4週間の時点で正常な若いレベルに戻っている。
【0108】
DNサブセットでの増殖の減少について、マーカーCD44およびCD25を用いてさらに分析した。胸腺細胞の前駆細胞だけでなくDN部分母集団にもαβTCR+CD4−CD8胸腺細胞が含まれており、これがSP細胞への遷移時に両方のコレセプターを下方制御していたと思われる(GodfreyおよびZlotnik、1993)。これらの成熟細胞を選び出すことで、真のTNコンパートメント(CD3−CD4−CD8−)を分析することができ、この分析によって時の経過に伴う増殖率または性腺摘除後における増殖率に何ら違いはないことが分かった(図5C)。しかしながら、CD44およびCD25を発現している部分母集団を分析したところ、TN1サブセット(CD44+CD25−)の増殖に正常な若い頃の20%から18月齢の時点での約6%への有意な(p<0.001)減少が認められ(図5D)、これが性腺摘除後4週間が経過するまでに回復した。TN1サブセットで増殖が減少した分だけTN2部分母集団(CD44+CD25+)では増殖が有意に(p≦0.001)増えたが、これも性腺摘除後2週間が経過するまでに正常な若いレベルに戻った(図5D)。
【0109】
胸腺の微小環境に対して年月がおよぼす影響
ポリクローナル抗サイトケラチンAbで二重標識した、MTSシリーズからのMAbの包括的なパネルを用いる免疫蛍光法によって、時の経過に伴う胸腺の微小環境の変化について検討した。
【0110】
これらのMAbによって認識される抗原については、胸腺の上皮サブセット、脈管関連(vascular−associated)抗原、支質細胞と胸腺細胞の両方に存在するものという3つのグループに細分化することができる。
【0111】
(i)上皮細胞抗原
2年齢のマウス胸腺を抗ケラチン染色(pan−上皮)したところ、上皮細胞の重篤な組織破壊が認められると共にはっきりと識別できる皮髄境界領域が欠如し、通常の胸腺アーキテクチャが失われていることが明らかになった。MAb、MTS 10(髄)、MTS 44(皮質)を用いてさらに分析を行ったところ、皮質のサイズが時の経過に伴って明らかに減少し、髄上皮にはそれほど大きな減少が見られない(データ図示せず)ことが分かった。上皮細胞のない領域またはケラチンネガティブエリア(KNA、van Ewijkら、1980;Godfreyら、1990;Bruijntjesら、1993)が一層はっきりとしており、抗サイトケラチン標識で明らかなように老化胸腺のサイズが大きくなった。また、老化胸腺の見た目には胸腺上皮の「嚢胞状」構造があり、これは髄領域で特に顕著(データ図示せず)である。抗サイトケラチン染色によって、脂肪蓄積、胸腺サイズの激しい減少、皮髄境界領域の完全性の低下が疑う余地なく明らかに認められる(データ図示せず)。胸腺は性腺摘除後2週間が経過するまでに再生しはじめる。これは、胸腺の葉のサイズ、MTS 44によって明らかになる皮質上皮の増加、髄上皮の局在において明白である。髄上皮はMTS 10によって検出され、2週間の時点で皮質全体に散在したMTS 10で染色された上皮のサブポケットが依然として残っている。性腺摘除後4週間が経過するまでに、明確な髄および皮質があり、識別できる皮髄境界領域がある(データ図示せず)。
【0112】
MTS 20マーカーおよび24マーカーで原始上皮細胞を検出(Godfreyら、1990)し、老化胸腺の退化をさらに示すことができるのではないかと思われる。いずれもE14に豊富に存在し、単離された髄上皮細胞クラスターを4〜6週間で検出するが、老化胸腺の強度を再度高める(データ図示せず)。性腺摘除後、これらの抗原はいずれも若い成体の胸腺でのレベルと同じレベルで発現され(データ図示せず)、MTS 20およびMTS 24が皮髄境界領域に位置する上皮の不連続なサブポケットに逆戻りしている。
【0113】
(ii)脈管関連抗原
T細胞前駆細胞の胸腺への移行と成熟T細胞の胸腺から末梢への移出を血液胸腺障壁(blood−thymus barrier)が担っているのではないかと考えられる。
【0114】
MAb MTS 15は胸腺の血管内皮に特異的であり、粒状の拡散染色パターン(Godfreyら、1990)が得られる。老化胸腺では、MTS 15の発現量が大幅に増え、脈拍数と血管・末梢脈管系スペースのサイズの増大を反映している(データ図示せず)。
【0115】
コラーゲン、ラミニン、フィブリノゲンなどの重要な構造・細胞接着分子を含む胸腺の細胞外マトリックスをmAb MTS 16によって検出する。正常な若い胸腺全体に散在させると、MTS 16の発現の性質が老化胸腺で一層広範囲かつ相関性のあるものになる。MTS 16の発現は性腺摘除の2週間後にさらに亢進されるが、性腺摘除の4週間後には発現は2月齢の胸腺で見られる状況を表している(データ図示せず)。
【0116】
(iii)共有抗原
MAb MTS 6によって検出される、正常な若い胸腺でのMHC IIの発現は、皮質上皮で強い陽性(粒状)であり(Godfreyら、1990)、髄上皮では染色が弱い。老化胸腺ではMHC IIの発現の減少が認められ、性腺摘除後2週間の時点で発現が実質的に増加する。性腺摘除後4週間が経過するまでに発現は再度減少し、2月齢の胸腺に類似して見える(データ図示せず)。
【0117】
胸腺細胞の移出
幼齢マウスではT細胞の約1%が毎日胸腺から移行する(Scollayら、1980)。本願発明者らは、数は有意に(p≦0.0001)減少したが、14月齢、さらには2年齢ですら、正常な幼齢マウスに匹敵する比例率で移行が起こっている(図5)ことを見出した。後から胸腺を出てきた細胞のCD4:CD8比は2ヶ月の時点での〜3:1から26ヶ月の時点での〜7:1に増大した。性腺摘除後1週間が経過するまでに、末梢に移出している細胞の数は実質的に増加し、全体としての移行率は1〜1.5%のままであった。
【0118】
実施例
以下の実施例は本発明による方法の具体的な例を示すものであり、実施例の記載内容に本発明を限定するものと解釈すべきではない。便宜上、これらの実施例ではHIV感染の治療と予防のための遺伝子療法について説明する。
【0119】
実施例1
T細胞の枯渇
T細胞を枯渇させ、できるだけ多くのHIV感染細胞を取り除く。また、非自己抗原を認識するT細胞を取り除いて、非自己由来の遺伝子組換え細胞を利用できるようにする。このステップの標準的な方法のひとつに、以下のような方法がある。Atgam(外来抗T細胞グロブリン、ファルマシア・アップジョン)15mg/kgを毎日注射する形で抗T細胞抗体を10日間の期間にわたってT細胞活性化のインヒビターであるシクロスポリンA 3mg/kgと併用して3〜4週間の連続輸注でヒトの患者に与え、続いて必要に応じて毎日9mg/kgの錠剤を与えた。患者の胸腺におけるT細胞の初期発達にこの処置が影響することはなかった。これは、ヒトの胸腺のサイズと構成ではこのような影響を持つのに必要な量の抗体を送達することができないためである。この処置を約4〜6週間続け、性ステロイドをなくして胸腺を再構築できるようにした。T細胞再活性の予防とインターロイキンまたは細胞接着分子などのセカンドレベルシグナルのインヒビターとを併用し、T細胞のアブレーションを亢進してもよい。
【0120】
このように末梢T細胞を枯渇させることで、外来ドナーに対して潜在的に反応性であるものを含めてすべてのT細胞が非特異的に使い果たされるため、移植片拒絶の危険性が最小限に抑えられる。しかしながら、同時に、T細胞が不足しているため、この方法では、患者が極めて感染症にかかりやすい状態にあり、特にウイルス感染しやすい状態にあることを意味する、全身性免疫不全の状態が惹起される。適切なT細胞の助けがないと、B細胞の応答ですら正常に機能しなくなる。
【0121】
また、処置前にHAART療法を開始し、手順の最初から最後まで継続してウイルス力価を小さくする。
【0122】
実施例2
性ステロイドアブレーション療法
LHRHアゴニストを送達する形で患者に性ステロイドアブレーション療法を施した。これについては、Leucrin(デポ注射;22.5mg)またはゾラデックス(インプラント;10.8mg)のいずれかの形で、どちらも3ヶ月効果のある単回用量で与えた。この方法は、胸腺を再活性化できる程度まで性ステロイドレベルを低下させる上で有効であった。場合によっては、性ステロイドアブレーション療法を行っている間、性ステロイドの副腎での産生を抑える、Cosudex(5mg/日)などのサプレッサも1日1錠の量で送達する必要がある。副腎で産生される性ステロイドはヒトのステロイドの10〜15%前後を占めている。
【0123】
血液中の性ステロイドを最低値まで減少させるには約1〜3週間を要した。これと一致していたのは、胸腺の再活性化であった。場合によっては、さらに3ヶ月間にわたる注射/インプラントまで処置を延長する必要がある。
【0124】
実施例3
別の送達方法
LHRHアゴニストを3ヶ月間デポまたはインプラント投与する代わりに、別の方法を用いてもよい。一例として、Er:YAGレーザなどのレーザを患者の皮膚に照射し、表皮細胞の妨害作用が低減するように皮膚を焼灼または変質させることができる。
【0125】
A.レーザアブレーションまたは変質:2枚の平らな共振器ミラーと、活性媒質としてのEr:YAG結晶と、電源と、レーザ光線の焦点を合わせるための手段とで構成される固体パルスEr:YAGレーザを用いて、赤外線レーザ光パルスを形成した。レーザ光線の波長は2.94ミクロンとした。シングルパルスを用いた。
【0126】
動作パラメータについては以下のとおりとした。1パルスあたりのエネルギを40、80または120mJ、焦点での光線サイズを2mmとし、1.27、2.55または3.82J/cm2のエネルギフルエンスを得た。パルス時間幅を300μsとして、エネルギフルエンス率0.42、0.85または1.27×104W/cm2を得た。
【0127】
続いて、一定量のLHRHアゴニストを皮膚に適用し、放射線照射部位に塗り拡げた。LHRHアゴニストを放射線照射部位に保持できるようにこれを軟膏の形にしてもよい。任意に、アゴニストを閉塞パッチし、放射線照射部位上の適所にこれを保持するようにしてもよい。
【0128】
任意に、光線スプリッタを用いてレーザ光線を分岐させ、複数のアブレーションまたは変質部位を得るようにしてもよい。このようにすることで、皮膚をとおしてLHRHアゴニストを一層短時間で血流まで流動させることができる。部位数をあらかじめ決定し、所望の約30日間のあいだ患者の系内にアゴニストを維持できるようにすればよい。
【0129】
B.圧力波:一定用量のLHRHアゴニストをプラスチック製の可撓性ワッシャ(直径約1インチ、厚さ約1/16インチ)などの適当な容器に入れ、圧力波を作り出す予定の部位の皮膚にのせる。次に、この部位を厚さ約1mmの黒いポリスチレンシートなどの標的材料で被覆する。Qスイッチ式固体ルビーレーザ(パルス持続時間は20nsであり、1パルスあたり最大2ジュールを生成可能)を用いてレーザ光線を生成し、これを標的材料に衝突させて1回の神経衝撃トランジェントを発生させる。黒いポリスチレンの標的はレーザ光を完全に吸収するため、皮膚はレーザ光に曝露されずに神経衝撃トランジェントにのみ曝露されることになる。このやり方では痛みは発生しない。アゴニストの循環血液濃度を維持すべく、上記の手順を毎日繰返してもよいし、必要に応じて行うようにしてもよい。
【0130】
実施例4
HSCの遺伝的改変体
ほとんどのHIV感染患者ではHSCの力価が極めて低いため、ドナーを用いて細胞を供給するようにすると好ましい。実用的であれば、細胞を採取する前にドナーに顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を10μg/kgの量で2〜5日間注射し、ドナーの血液中のHSCレベルを増やす。ドナーの血液または骨髄から、好ましくはフローサイトメータまたは免疫磁気ビーズを用いてCD34+ドナー細胞を精製する。フローサイトメトリーでドナー由来のHSCをCD34+として同定する。任意に、これらのHSCを幹細胞成長因子でex vivoにて増やしてもよい。
【0131】
HIVの複製を阻害することが明らかになっている(Bonyhadiら 1997)HIV−1のrev遺伝子のトランスドミナント変異体形態であるRevM10を含むようにレトロウイルスベクターを作出する。このベクターでトランスフェクトしたエコトロピックプロデューサー細胞を濾過し、得られた濾過上清に感染させることでアンフォトロピックベクター含有上清を生成する。回収されたCD34+細胞を、IL−3、IL−6、SCF(それぞれ10ng/ml)を加えたLCTM培地にて事前に24時間刺激し、細胞が細胞サイクルに入るようにする。次に、ベクターを含有する上清を2〜3日間繰返し細胞に加え、ベクターを細胞に形質導入できるようにする。
【0132】
LHRHアゴニスト送達の約1〜3週間後、胸腺が再活性化を開始する直前または胸腺が再活性化を開始した時点で、最適には細胞約2〜4×106個/kgの用量で、患者に遺伝的に修飾したHSCを注射する。任意に、レシピエントにG−CSFも注射し、HSCの増加を助けるようにしてもよい。
【0133】
再活性化された胸腺は遺伝子組換えHSCを取り込み、これをドナータイプのT細胞と樹状細胞とに変換する一方で、レシピエントのHSCをレシピエントタイプのT細胞と樹状細胞とに変換する。細胞死によって欠失を誘導するか、あるいは免疫調節細胞によって寛容を誘導することによって、ドナーの樹状細胞は潜在的にレシピエントに対して反応性であるT細胞に寛容になる。
【0134】
実施例5
別のプロトコール
ドナーの遺伝子組換え細胞の移植に利用できる時間が短い場合は、実施例1〜4で用いたような時系列を部分的に修正する。T細胞のアブレーションと性ステロイドのアブレーションとを同時に開始してもよい。T細胞のアブレーションを約10日間継続し、一方、性ステロイドのアブレーションについては3ヶ月前後継続する。
【0135】
実施例6
免疫抑制の終了
胸腺のキメラが構築されて胸腺に成熟T細胞の新たなコホートが現れ始めたら、患者から血液を採取し、標準的な混合リンパ球反応で、ドナー細胞に対する応答性がT細胞に欠けているかどうかをin vitroにて確認する。応答がなければ、免疫抑制療法を徐々に縮小し、感染に対して防御できるようにする。血液中に活性化T細胞が存在することである程度は分かる拒絶の徴候が認められなければ、最終的には免疫抑制療法を完全に中止する。HSCには強い自己更新能力があるため、このように形成される造血キメラは、(健常で移植を行っていない、寛容を誘導していない人々の場合のように)理論的には患者の生涯をとおして安定することになる。
【0136】
実施例7
LHRHアゴニストを用いてヒト胸腺を再活性化
本発明による方法でヒトの胸腺を再活性化できることを示すために、前立腺癌に対する化学療法での治療を受けてきた患者でこれらの方法を用いた。性ステロイドアブレーション療法を施す前と4ヶ月後とにこの前立腺癌患者を評価した。結果を図23〜図27にまとめておく。全体的にみて、これらのデータから、多くの患者でT細胞の状態が定量的かつ定性的に改善されることがわかる。
【0137】
LHRH療法がリンパ球とそのT細胞のサブセットの総数に対しておよぼす影響 前立腺癌のLHRHアゴニスト処置を受けている患者(全体>60歳)にて末梢血リンパ球の表現型組成(phenotypic composition)を分析した(図23)。処置前とLHRHアゴニスト処置開始の4ヶ月後に患者の試料を分析した。処置前には患者全員で血液1mlあたりのリンパ球細胞の総数が対照値の下端であった。処置後、9名中6名の患者に総リンパ球数の実質的な増加が認められた(事例によっては総細胞数の倍増が観察された)。これと相関しているのが、9名中6名の患者における総T細胞数の増加であった。CD4+サブセットでは、この上昇が9名中8名の患者でさらに目立っていることから、CD4+T細胞のレベルが上昇していることが分かった。CD8+サブセットでは、全体的にCD4+T細胞の場合よりも程度が低いとはいえ、9名中4名の患者でレベルが上昇するという、それほど特徴的ではない傾向が認められた。
【0138】
LHRH療法がT細胞サブセットの割合におよぼす影響
LHRHアゴニスト処置の前後に患者の血液を分析したところ、処置後に、T細胞、CD4+T細胞またはCD8+T細胞の全体的な割合には実質的な変化が認められず、CD4+:CD8+比にはさまざまな変化があった(図24)。このことから、処置後に総T細胞数が実質的に増加するにもかかわらず、処置を行ってもT細胞サブセットの恒常性維持にはほとんど影響しないことが分かる。値はいずれも対照値に対する相対的なものとした。
【0139】
LHRH療法がB細胞および骨髄細胞の割合におよぼす影響
LHRHアゴニスト処置を受けている患者の末梢血に含まれるB細胞および骨髄細胞(NK、NKTおよびマクロファージ)の割合を分析したところ、サブセットごとにさまざまな度合いで変化することが分かった(図25)。NK、NKT、マクロファージの割合は処置後も比較的一定のままであったが、B細胞の割合は9名中4名の患者で減少した。
【0140】
LHRHアゴニスト療法がB細胞および骨髄細胞の総数におよぼす影響
処置後に末梢血に含まれるB細胞と骨髄細胞の総細胞数を分析したところ、処置後に、NK(9名中5名の患者)、NKT(9名中4名の患者)、マクロファージ(9名中3名の患者)で細胞数に明らかなレベルの上昇が認められた(図26)。B細胞数については、9名中2名の患者でレベルが上昇し、9名中4名の患者では変化なし、9名中3名の患者ではレベルが低下するといった具合で、顕著な傾向は特に認められなかった。
【0141】
LHRH療法が記憶細胞に対するナイーブ細胞のレベルにおよぼす影響
LHRHアゴニスト処置後に見られた主な変化は末梢血のT細胞個体群でのものであった。特に、CD4+T細胞サブセットでのナイーブ(CD45RA+)と記憶(CD45RO+)との比が患者9名中6名で増加する、ナイーブ(CD45RA+)CD4+細胞の割合の選択的な増加が認められた(図27)。
【0142】
結論
このように、胸腺が萎縮したヒトなどの動物にLHRHアゴニスト処置を施すことによって、胸腺の再活性化を惹起することが可能だと結論付けることができる。性ステロイドアブレーション療法を受けた前立腺癌患者では血液のTリンパ球の状態に全般的な改善が認められた。このような細胞が胸腺由来のものだけであるか否かを正確に判定するのは極めて困難であるが、主流の(CD8 αβ鎖)T細胞については他の起源が全く説明されていないため、これは極めて論理的な結論であろう。胃腸管T細胞は大部分がTCRγδまたはCD8αα鎖である。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
性腺摘除前後の胸腺細胞数の変化を示す図である。胸腺が萎縮した結果、時の経過に伴って胸腺細胞数が有意に減少する。細胞数は性腺摘除後2週間が経過するまでに若い成体のレベルまで増加した。性腺摘除後3週間が経過するまでに細胞数は若い成体の値から有意に増加し、性腺摘除後4週間が経過するまでに安定している。***=若い成体(2ヶ月)の胸腺とは有意に異なっている。p<0.001。
【図1B】
性腺摘除前後の胸腺細胞数の変化を示す図である。胸腺が萎縮した結果、時の経過に伴って胸腺細胞数が有意に減少する。細胞数は性腺摘除後2週間が経過するまでに若い成体のレベルまで増加した。性腺摘除後3週間が経過するまでに細胞数は若い成体の値から有意に増加し、性腺摘除後4週間が経過するまでに安定している。***=若い成体(2ヶ月)の胸腺とは有意に異なっている。p<0.001。
【図2A】
A,B,Cにおいて、(A)脾臓の数値は時が経過したり性腺を摘除したりしても一定のまま維持される。末梢のB:T細胞比も一定のままである(B)が、CD4:CD8比は時の経過に伴って有意に(p<0.001)小さくなり、性腺摘除後4週間が経過するまでに正常な若い成体のレベルまで回復する。
【図2B】
A,B,Cにおいて、(A)脾臓の数値は時が経過したり性腺を摘除したりしても一定のまま維持される。末梢のB:T細胞比も一定のままである(B)が、CD4:CD8比は時の経過に伴って有意に(p<0.001)小さくなり、性腺摘除後4週間が経過するまでに正常な若い成体のレベルまで回復する。
【図2C】
A,B,Cにおいて、(A)脾臓の数値は時が経過したり性腺を摘除したりしても一定のまま維持される。末梢のB:T細胞比も一定のままである(B)が、CD4:CD8比は時の経過に伴って有意に(p<0.001)小さくなり、性腺摘除後4週間が経過するまでに正常な若い成体のレベルまで回復する。
【図3】
CD4対CD8胸腺細胞個体群の蛍光標示式細胞分取器(FACS)の経時および性腺摘除後のプロファイルを示す図である。それぞれのプロットの上に各象限のパーセンテージを示してある。胸腺細胞の部分母集団は時が経過しても一定のままであり、性腺摘除後に胸腺細胞が同期的に増加する。
【図4】
BrdUパルスを取り込ませて検出した場合の胸腺細胞の増殖を示す図である。増殖中の胸腺細胞の割合は時が経過したり性腺を摘除したりしても一定のままである。
【図5A】
齢と性腺摘除とが胸腺細胞サブセットの増殖に対してどのような影響をおよぼすかを示す図である。(A)増殖中の個体群全体を構成する各サブセットの割合――増殖中の個体群のうちCD8+T細胞の割合が有意に増加している。***=極めて有意、p<0.001、**=有意、p<0.01。
【図5B】
齢と性腺摘除とが胸腺細胞サブセットの増殖に対してどのような影響をおよぼすかを示す図である。(B)増殖している各部分母集団のパーセンテージ――TNサブセットとCD8サブセットは2ヶ月目よりも2年の時点での増殖が有意に少ない。性腺摘除後2週間の時点で、TN個体群は若い頃の正常な増殖レベルに戻ったがCD8個体群では増殖の有意な増加が認められる。このレベルは性腺摘除後4週間までに若い頃の正常なレベルと等しくなる。***=極めて有意、p<0.001、**=有意、p<0.01。
【図5C】
齢と性腺摘除とが胸腺細胞サブセットの増殖に対してどのような影響をおよぼすかを示す図である。(C)TNの増殖量は時が経過したり性腺を摘除したりしても全体として一定のままである。***=極めて有意、p<0.001、**=有意、p<0.01。
【図5D】
齢と性腺摘除とが胸腺細胞サブセットの増殖に対してどのような影響をおよぼすかを示す図である。しかしながら、(D)TN1部分母集団では増殖が経時的に有意に減少し、性腺摘除後4週間が経過するまでには正常なレベルに戻らない。***=極めて有意、p<0.001、**=有意、p<0.01。
【図6】
マウスにFITCを胸腺内注射した。24時間後に末梢におけるFITC+細胞の数を算出した。できたばかりの胸腺移行物(RTE)の割合は一貫して胸腺細胞数年齢(thymus cell number age)の約1%に保たれて性腺摘除後2週間で有意に減少したが、RTE細胞数は時の経過に伴って有意に(p<0.01)減少した。性腺摘除後、これらの値は増加しているが、性腺摘除後2週間の時点で依然として若いマウスの場合よりも有意に低かった。時の経過に伴ってCD4+とCD8+RTEとの比の有意な増大が認められたが、これは性腺摘除後1週間が経過するまでに正常になった。
【図7A】
化学療法剤であるシクロホスファミドで処置した後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後1週間および2週間の時点で、非性腺摘除(シクロホスファミド単独)群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した。細胞数は4週間が経過するまでに正常になる(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図7B】
化学療法剤であるシクロホスファミドで処置した後の脾臓での細胞数の変化を示す図である。処置後1週間および2週間の時点で、非性腺摘除(シクロホスファミド単独)群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した。細胞数は4週間が経過するまでに正常になる(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図7C】
化学療法剤であるシクロホスファミドで処置した後のリンパ節での細胞数の変化を示す図である。処置後1週間および2週間の時点で、非性腺摘除(シクロホスファミド単独)群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した。細胞数は4週間が経過するまでに正常になる(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図8A】
外科的な性腺摘除後1週間で放射線照射(625ラド)した後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後1週間および2週間の時点で、非性腺摘除(放射線照射単独)群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図8B】
外科的な性腺摘除後1週間で放射線照射(625ラド)した後の脾臓での細胞数の変化を示す図である。処置後1週間および2週間の時点で、非性腺摘除(放射線照射単独)群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図8C】
外科的な性腺摘除後1週間で放射線照射(625ラド)した後のリンパ節での細胞数の変化を示す図である。処置後1週間および2週間の時点で、非性腺摘除(放射線照射単独)群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図9A】
放射線照射と性腺摘除とを同日に行った後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後2週間の時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。しかしながら、観察された差異は処置の1週間前にマウスに性腺摘除を施した場合(図7)ほど顕著ではない。(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図9B】
放射線照射と性腺摘除とを同日に行った後の脾臓での細胞数の変化を示す図である。処置後2週間の時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。しかしながら、観察された差異は処置の1週間前にマウスに性腺摘除を施した場合(図7)ほど顕著ではない。(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図9C】
放射線照射と性腺摘除とを同日に行った後のリンパ節での細胞数の変化を示す図である。処置後2週間の時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。しかしながら、観察された差異は処置の1週間前にマウスに性腺摘除を施した場合(図7)ほど顕著ではない。(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。
【図10】
化学療法剤であるシクロホスファミドと外科的な性腺摘除または化学的な性腺摘除とを同日に行う処置後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後1週間および2週間の時点で、非性腺摘除(シクロホスファミド単独)群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した。(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。化学的な性腺摘除は、シクロホスファミド処置後の免疫系の再生という点では外科的な性腺摘除に匹敵する。
【図11】
単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)でのフットパッド免疫付与後のリンパ節の細胞充実性を示す図である。高齢の非性腺摘除群よりも高齢の性腺摘除後の方が細胞充実性が高くなった点に注意されたい。一番下のグラフは、CD25対CD8細胞についてFACSで選び出した活性化細胞の総数を示している。
【図12A】
HSV−1接種後に活性化されたLN(リンパ節)のCTL(細胞障害性T細胞)におけるVβ10の発現について示す図である。高齢マウスでクローン反応が減少し、予想した応答が性腺摘除後に元通りになる点に注意されたい。
【図12B】
HSV−1接種後に活性化されたLN(リンパ節)のCTL(細胞障害性T細胞)におけるVβ10の発現について示す図である。高齢マウスでクローン反応が減少し、予想した応答が性腺摘除後に元通りになる点に注意されたい。
【図12C】
HSV−1接種後に活性化されたLN(リンパ節)のCTL(細胞障害性T細胞)におけるVβ10の発現について示す図である。高齢マウスでクローン反応が減少し、予想した応答が性腺摘除後に元通りになる点に注意されたい。
【図13A】
性腺摘除によってHSV−1免疫付与に対する応答性が回復する。(a)高齢マウスでは、若いマウスおよび性腺摘除後のマウスと比較して感染後にリンパ節の細胞充実性全体の有意な減少が認められた。結果については8〜12体のマウスの平均±1SDで示す。**=若い(2月齢)マウスに対してp≦0.01、^=高齢(非性腺摘除)マウスに対してp≦0.01。
【図13B】
性腺摘除によってHSV−1免疫付与に対する応答性が回復する。(b)HSV−1感染マウスのLNにおける活性化(CD8+CD25+)細胞の代表的なFACSプロファイルである。時が経過するにつれ、あるいは性腺摘除によって、活性化CTLの割合には何ら差異は認められなかった。結果については8〜12体のマウスの平均±1SDで示す。**=若い(2月齢)マウスに対してp≦0.01、^=高齢(非性腺摘除)マウスに対してp≦0.01。
【図13C】
性腺摘除によってHSV−1免疫付与に対する応答性が回復する。(c)高齢マウスのリンパ節での細胞充実性低下が活性化CTL数の有意な減少という形で表れてきた。高齢マウスでは性腺摘除によってHSV−1に対する免疫応答が回復し、CTL数は若いマウスの場合に匹敵していた。結果については8〜12体のマウスの平均±1SDで示す。**=若い(2月齢)マウスに対してp≦0.01、^=高齢(非性腺摘除)マウスに対してp≦0.01。
【図14】
HSV−1で免疫付与したマウスから膝窩リンパ節を取り出し、3日間培養した。バックグラウンドレベルの溶解(51Cr放出量で判定)について免疫付与していないマウスを対照として用いてCTLアッセイを実施した。結果を8体のマウスの平均として±1SDで3組(in tripricate)示す。高齢マウスではE:T比10:1および3:1のどちらでもCTL活性の有意な(p≦0.01,*)低減が認められたことから、リンパ節内に存在する特定のCTLのパーセンテージが減少したことが分かる。高齢マウスでは、性腺摘除によってCTL応答が若い成体のレベルまで回復した。
【図15A】
HSV−1感染に対するCD4+T細胞の助けとVβTCR応答とについての分析内容を示す図である。HSV−1感染後にD5で膝窩リンパ節を取り出し、(a)CD25、CD8および特定のTCRVβマーカーおよび(b)CD4/CD8T細胞の発現をex−vivoにて分析した。(a)Vβ10またはVβ8.1を発現している活性化(CD25+)CD8+T細胞のパーセンテージを1群あたり8体のマウスの平均±1SDとして示す。時が経過するにつれ、あるいは性腺摘除によって、何ら差異は認められなかった。結果を1群あたり8体のマウスの平均±1SDとして示す。***=若いマウスおよび性腺摘除マウスに対してp≦0.001。
【図15B】
HSV−1感染に対するCD4+T細胞の助けとVβTCR応答とについての分析内容を示す図である。HSV−1感染後にD5で膝窩リンパ節を取り出し、(a)CD25、CD8および特定のTCRVβマーカーおよび(b)CD4/CD8T細胞の発現をex−vivoにて分析した。(b)休眠状態のLN個体群では時が経過するにつれてCD4/CD8比の減少が認められた。これは性腺摘除後に回復した。結果を1群あたり8体のマウスの平均±1SDとして示す。***=若いマウスおよび性腺摘除マウスに対してp≦0.001。
【図16A】
Ly5近交系マウスの骨髄移植後の胸腺での細胞数の変化を示す図である。処置後のすべての時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の方が脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。性腺摘除を行ったマウスでは、非性腺摘除動物の場合(データ図示せず)よりも近交系の(Ly5.2)細胞が有意に増加した。
【図16B】
Ly5近交系マウスの骨髄移植後の脾臓での細胞数の変化を示す図である。処置後のすべての時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の方が脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。性腺摘除を行ったマウスでは、非性腺摘除動物の場合(データ図示せず)よりも近交系の(Ly5.2)細胞が有意に増加した。
【図16C】
Ly5近交系マウスの骨髄移植後のリンパ節での細胞数の変化を示す図である。処置後のすべての時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の方が脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。性腺摘除を行ったマウスでは、非性腺摘除動物の場合(データ図示せず)よりも近交系の(Ly5.2)細胞が有意に増加した。
【図16D】
Ly5近交系マウスの骨髄移植後の骨髄での細胞数の変化を示す図である。処置後のすべての時点で、非性腺摘除群と比較して性腺摘除を行った動物の方が胸腺で急激な増加が認められる点に注意されたい。また、シクロホスファミド単独の群よりも摘除群の方が脾臓およびリンパ節での数値がかなり増加した(処置群ごとにそれぞれの時点でn=3〜4)。性腺摘除を行ったマウスでは、非性腺摘除動物の場合(データ図示せず)よりも近交系の(Ly5.2)細胞が有意に増加した。
【図17A】
胎仔肝臓再構築後に性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胸腺細胞数の変化を示す図である。(各被験群についてn=3〜4)。(A)2週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスの胸腺細胞数は正常なレベルであり、性腺摘除を行っていないマウスの場合よりも有意に(*p≦0.05)高かった。4週間後に性腺摘除を行ったマウスで胸腺の肥大が観察された。性腺摘除を行っていない方の細胞数は対照レベル未満のままである。
【図17B】
胎仔肝臓再構築後に性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胸腺細胞数の変化を示す図である。(各被験群についてn=3〜4)。(B)CD45.2+細胞――CD45.2+はドナー由来を示すマーカーである。再構築の2週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの両方にドナー由来の細胞が存在した。処置の4週間後、性腺摘除を行った方の胸腺細胞の約85%がドナー由来であった。性腺摘除を行っていない方の胸腺にはドナー由来の細胞がなかった。
【図18】
致死量放射線照射および胎仔肝臓再構築後に外科的な性腺摘除を行った後のCD4対CD8ドナー由来の胸腺細胞個体群のFACSプロファイルを示す図である。それぞれのプロットの右側に各象限のパーセンテージを示してある。同年齢の対照プロファイルは8月齢のLy5.1近交系マウス胸腺のものである。性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスのプロファイルをCD45.2+細胞について選び出し、ドナー由来の細胞のみを示す。再構築の2週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで胸腺細胞の部分母集団に違いはない。
【図19A】
致死量放射線照射、胎仔肝臓再構築および性腺摘除後の骨髄およびリンパ球の樹状細胞(DC)数を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下の(following)グラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおける樹状細胞の正常数を表している。(A)ドナー由来の骨髄樹状細胞――再構築の2週間後、性腺摘除を行っていないマウスでDCが正常なレベルで存在した。同じ時点でDCは性腺摘除を行ったマウスの方が有意に(*p≦0.05)多かった。4週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスではDC数が対照レベルより高いままだった。
【図19B】
致死量放射線照射、胎仔肝臓再構築および性腺摘除後の骨髄およびリンパ球の樹状細胞(DC)数を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下の(following)グラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおける樹状細胞の正常数を表している。(B)ドナー由来のリンパ球樹状細胞――再構築の2週間後、性腺摘除を行ったマウスのDC数が性腺摘除を行っていないマウスの2倍であった。処置の4週間後、DC数は対照レベルより高いままだった。
【図20A】
性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとについて、胎仔肝臓再構築後の骨髄での総細胞数と骨髄のCD45.2+細胞数の変化を示す図である。各被験群についてn=3〜4体のマウス。(A)総細胞数――再構築の2週間後、骨髄細胞の数が正常になり、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで細胞数に有意な差は認められなかった。再構築の4週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで細胞数に有意な(*p≦0.05)差が認められた。
【図20B】
性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとについて、胎仔肝臓再構築後の骨髄での総細胞数と骨髄のCD45.2+細胞数の変化を示す図である。各被験群についてn=3〜4体のマウス。(B)CD45.2+細胞数。再構築の2週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで骨髄中のCD45.2+細胞数に有意な差は認められなかった。性腺摘除を行ったマウスでは、4週間の時点でCD45.2+細胞数が多いままであった。同じ時点で性腺摘除を行っていないマウスにドナー由来の細胞はなかった。
【図21A】
性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における骨髄中のT細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下のグラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞と樹状細胞の正常な数を表している。(A)T細胞数――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の2週間後および4週間後に数値が減少した。
【図21B】
性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における骨髄中のT細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下のグラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞と樹状細胞の正常な数を表している。(B)ドナー由来の骨髄樹状細胞――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の2週間後にDC細胞数は正常であった。この時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差は認められなかった。
【図21C】
性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における骨髄中のT細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下のグラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞と樹状細胞の正常な数を表している。(C)ドナー由来のリンパ球樹状細胞――再構築の2週間後および4週間後に数値は正常なレベルであった。2週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差は認められなかった。
【図22A】
性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における脾臓での総細胞数と脾臓のドナー(CD45.2+)細胞数の変化を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。(A)総細胞数――再構築の2週間後、細胞数は減少したが、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで細胞数に有意な差は認められなかった。再構築の4週間後、細胞数は性腺摘除を行ったマウスで正常なレベルに近づいていた。
【図22B】
性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における脾臓での総細胞数と脾臓のドナー(CD45.2+)細胞数の変化を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。(B)CD45.2+細胞数――再構築の2週間後、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで脾臓のCD45.2+細胞数に関して有意な差は認められなかった。性腺摘除を行ったマウスでは、4週間の時点でCD45.2+細胞数が多いままであった。同じ時点で性腺摘除を行っていないマウスにドナー由来の細胞はなかった。
【図23A】
胎仔肝臓再構築後における脾臓のT細胞、骨髄由来の樹状細胞およびリンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下のグラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞と樹状細胞の正常な数を表している。(A)T細胞数――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の2週間後および4週間後に数値が減少した。
【図23B】
胎仔肝臓再構築後における脾臓のT細胞、骨髄由来の樹状細胞およびリンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下のグラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞と樹状細胞の正常な数を表している。(B)ドナー由来の(CD45.2+)骨髄樹状細胞――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の2週間後および4週間後にDC細胞数は正常であった。2週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。
【図23C】
胎仔肝臓再構築後における脾臓のT細胞、骨髄由来の樹状細胞およびリンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。以下のグラフにおける対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞と樹状細胞の正常な数を表している。(C)ドナー由来の(CD45.2+)リンパ球樹状細胞――再構築の2週間後および4週間後に数値は正常なレベルであった。2週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。
【図24A】
性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後におけるリンパ節での総細胞数とリンパ節のドナー(CD45.2+)細胞数の変化を示す図である。(各被験群についてn=3〜4)。(A)総細胞数――再構築の2週間後、細胞数は正常なレベルであり、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な差はなかった。再構築の4週間後、性腺摘除を行ったマウスでは細胞数が正常なレベルであった。
【図24B】
性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後におけるリンパ節での総細胞数とリンパ節のドナー(CD45.2+)細胞数の変化を示す図である。(各被験群についてn=3〜4)。(B)CD45.2+細胞数――性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで再構築の2週間後にリンパ節のドナーCD45.2+細胞数に有意な差はなかった。性腺摘除を行ったマウスでは、4週間の時点でCD45.2細胞数が多いままであった。同じ時点で性腺摘除を行っていないマウスにドナー由来の細胞はなかった。
【図25A】
性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における腸間膜リンパ節のT細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞数と樹状細胞数である。(A)性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれも再構築の2週間後および4週間後にT細胞数が減少した。
【図25B】
性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における腸間膜リンパ節のT細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞数と樹状細胞数である。(B)性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスのいずれもドナー由来の骨髄樹状細胞は正常であった。4週間の時点でこれらの細胞が減少した。2週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。
【図25C】
性腺摘除を行ったマウスおよび性腺摘除を行っていないマウスの胎仔肝臓再構築後における腸間膜リンパ節のT細胞、骨髄由来の樹状細胞、リンパ球由来の樹状細胞(DC)を示す図である。(各被験群についてn=3〜4体のマウス)。対照の(斜線)バーは同年齢の未処置マウスにおけるT細胞数と樹状細胞数である。(C)ドナー由来のリンパ球樹状細胞――再構築の2週間後および4週間後に数値は正常なレベルであった。2週間の時点で、性腺摘除を行ったマウスと性腺摘除を行っていないマウスとで有意な数値差はなかった。
【図26】
前立腺癌のLHRHアゴニスト処置を受けているヒトの患者(全体>60歳)にて末梢血リンパ球の表現型組成を分析した。処置前とLHRHアゴニスト処置開始の4ヶ月後に患者の試料を分析した。処置前には患者全員で血液1mlあたりのリンパ球細胞の総数が対照値の下端であった。処置後、9名中6名の患者に総リンパ球数の実質的な増加が認められた(事例によっては総細胞数の倍増が観察された)。これと相関しているのが、9名中6名の患者における総T細胞数の増加であった。CD4+サブセットでは、この上昇が9名中8名の患者でさらに目立っていることから、CD4T細胞のレベルが上昇していることが分かった。CD8+サブセットでは、全体的にCD4+T細胞の場合よりも程度が低いとはいえ、9名中4名の患者でレベルが上昇するという、それほど特徴的ではない傾向が認められた。
【図27】
LHRHアゴニスト処置の前後にヒトの患者の血液を分析したところ、処置後に、T細胞、CD4T細胞またはCD8T細胞の全体的な割合には実質的な変化が認められず、CD4:CD8比にはさまざまな変化があった。このことから、処置後に総T細胞数が実質的に増加するにもかかわらず、処置を行ってもT細胞サブセットの恒常性維持に対しては最小限の影響しかおよばないことが分かる。値はいずれも対照値に対する相対的なものとした。
【図28】
LHRHアゴニスト処置を受けているヒトの患者の末梢血に含まれるB細胞および骨髄細胞(NK、NKTおよびマクロファージ)の割合を分析したところ、サブセットごとにさまざまな度合いで変化することが分かった。NK、NKT、マクロファージの割合は処置後も比較的一定のままであったが、B細胞の割合は9名中4名の患者で減少した。
【図29】
処置後にヒトの患者の末梢血に含まれるB細胞と骨髄細胞の総細胞数を分析したところ、処置後に、NK(9名中5名の患者)、NKT(9名中4名の患者)、マクロファージ(9名中3名の患者)で細胞数に明らかなレベルの上昇が認められた。B細胞数については、9名中2名の患者でレベルが上昇し、9名中4名の患者では変化なし、9名中3名の患者ではレベルが低下するといった具合で、顕著な傾向は特に認められなかった。
【図30A】
LHRHアゴニスト処置後に見られた主な変化は末梢血のT細胞個体群でのものであった。特に、CD4+T細胞サブセットでのナイーブ(CD45RA+)と記憶(CD45RO+)との比がヒトの患者9名中6名で増加する、ナイーブ(CD45RA+)CD4+細胞の割合の選択的な増加が認められた。
【図30B】
LHRHアゴニスト処置後に見られた主な変化は末梢血のT細胞個体群でのものであった。特に、CD4+T細胞サブセットでのナイーブ(CD45RA+)と記憶(CD45RO+)との比がヒトの患者9名中6名で増加する、ナイーブ(CD45RA+)CD4+細胞の割合の選択的な増加が認められた。
【図31】
さまざまなレーザパルスエネルギを用いた場合における皮膚のインピーダンスの低下について示す図である。フィット曲線を用いてデータを補間すると、10mJという低いエネルギを照射した皮膚で皮膚インピーダンスが低下する。
【図32】
皮膚の医薬品透過について示す図である。インスリンを試料医薬品として用いた場合の皮膚の透過性は放射線照射によって大幅に亢進された。
【図33】
皮膚に5−アミノレブリン酸(ALA)を加え、1回の神経衝撃トランジェント後の皮膚の経時蛍光変化を示す図である。強度のピークは約640nmに見られ、処置後210分経過すると(点線)高くなる。
【図34】
神経衝撃トランジェントなしで5−アミノレブリン酸(ALA)を加えた後の皮膚の経時蛍光変化を示す図である。どの時点をみても強度がわずかに変化するだけである。
【図35】
5−アミノレブリン酸(ALA)を加え、さまざまなピーク応力下での神経衝撃トランジェント後の皮膚の蛍光変化を比較した図である。表皮細胞の膜透過は最大応力に左右される。
Claims (26)
- 細胞を遺伝的に改変するステップと、患者の胸腺が再活性化している間に前記細胞を患者に送達するステップと、を含み、前記細胞が、HSCと、リンパ球前駆細胞と、骨髄前駆細胞と、上皮幹細胞と、これらの組み合わせとから選択される、被検体を遺伝子操作する方法。
- 細胞の投与前にT細胞のアブレーションを行うステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記患者の胸腺が、少なくとも部分的に不活性化されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記患者が思春期後である、請求項3に記載の方法。
- 前記患者が、該患者の胸腺を少なくとも部分的に不活性化させる疾患を持っているまたは持っていた、あるいはこのような疾患の処置を受けているまたは受けていた、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が前記患者から得られたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が前記患者から得られたものではない、請求項1に記載の方法。
- 前記患者がT細胞障害を持っている、請求項1に記載の方法。
- 前記T細胞障害が、T細胞機能障害と、HIV感染と、T細胞白血病ウイルス感染と、からなる群から選択される健康状態によって引き起こされるものである、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞を遺伝的に改変し、細胞のウイルス感染を阻害する、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞を遺伝的に改変し、T細胞内でのウイルスの複製を阻害する、請求項9に記載の方法。
- 前記T細胞障害がHIV感染によって引き起こされるものである、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞を遺伝的に改変し、nef転写因子遺伝子と、HIVのtat遺伝子および/またはrev遺伝子を切断するリボザイムをコードする遺伝子と、HIV−1のrev遺伝子のトランスドミナント変異体形態(R定しevM10)と、HIV−1のrev−応答配列(RRE)の過発現コンストラクトと、その機能断片(function fragment)と、からなる群から選択される、安て発現可能なポリヌクレオチドを含むようにする、請求項12に記載の方法。
- 前記HSCがCD34+である、請求項1に記載の方法。
- 胸腺が再活性化を開始する頃またはその少し後で前記遺伝子組換え細胞を前記患者に与える、請求項1に記載の方法。
- 前記胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を破壊する方法が、1種またはそれ以上の製薬の投与によるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記製薬が、LHRHアゴニストと、LHRHアンタゴニストと、抗LHRHワクチンと、これらの組み合わせと、からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記LHRHアゴニストが、ユーレキシン(Eulexin)と、ゴセレリンと、リュープロライドと、ジオキサラン(Dioxalan)誘導体と、トリプトレリンと、メテレリンと、ブセレリンと、ヒストレリンと、ナファレリンと、ルトレリンと、リュープロレリンと、デスロレリンと、からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- T細胞のアブレーションを行うステップと、胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を破壊するステップと、遺伝子組換え細胞を投与するステップと、を含み、前記遺伝子組換え細胞が、遺伝子組換えHSCと、リンパ球前駆細胞と、骨髄前駆細胞と、これらの組み合わせと、から選択される、患者のHIV感染を防止するための方法。
- 前記遺伝子組換え細胞が、T細胞のHIVによる感染を防止する安定して発現可能なポリヌクレオチドを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記安定して発現可能なポリヌクレオチドが、nef転写因子遺伝子と、HIVのtat遺伝子および/またはrev遺伝子を切断するリボザイムをコードする遺伝子と、HIV−1のrev遺伝子のトランスドミナント変異体形態(RevM10)と、HIV−1のrev−応答配列(RRE)の過発現コンストラクトと、その機能的断片と、からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 前記HSCがCD34+である、請求項19に記載の方法。
- 前記胸腺が再活性化を開始する頃またはその少し後で前記遺伝子組換え細胞を前記患者に与える、請求項19に記載の方法。
- 前記胸腺への性ステロイドによるシグナル伝達を破壊する方法が、1種またはそれ以上の製薬の投与によるものである、請求項19に記載の方法。
- 前記製薬が、LHRHアゴニストと、LHRHアンタゴニストと、抗LHRHワクチンと、これらの組み合わせと、からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記LHRHアゴニストが、ユーレキシンと、ゴセレリンと、リュープロライドと、ジオキサラン誘導体と、トリプトレリンと、メテレリンと、ブセレリンと、ヒストレリンと、ナファレリンと、ルトレリンと、リュープロレリンと、デスロレリンと、からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
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