JP2004509343A - キャピラリー電気泳動のための高速高分解能組成物、方法、およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物、キャピラリー電気泳動要素、および方法に関する。キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットもまた提供される。
【0002】
(発明の背景)
キャピラリー電気泳動は、以下のいくつかの技術的利点に起因して、分析技術として広く適用されてきた:(i)キャピラリーが、高い表面対容量比を有し、これが、より効率的な熱損失を可能にし、次いで、このことが、より迅速な分離のために高い電場が使用されるのを可能にする;(ii)この技術は、最小限のサンプル容量を必要とする;(iii)大部分の分析物の優勢な分解が達成可能である;(iv)この技術は、自動化に受け入れやすい(例えば、Camilleri編、Capillary Electrophoresis:Theory and Practice(CRC Press、Boca Raton、1993);およびGrossmanら編、Capillary Electrophoresis(Academic Press、San Diego、1992)を参照のこと)。これらの利点に起因して、生体分子(特に、核酸)の分離へのキャピラリー電気泳動の適用に、大きな関心が持たれてきた。核酸(特に、デオキシリボ核酸(DNA))の迅速かつ正確な分離に対する必要性が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物の分析およびDNA配列決定において存在している(例えば、Williams、Methods:A Companion to Methods in Enzymology、4:227−232(1992);Drossmanら、Anal.Chem.、62:900−903(1990);Huangら、Anal.Chem.、64:2149−2154(1992);およびSwerdlowら、Nucleic Acids Research、18:1415−1419(1990)を参照のこと)。
【0003】
電荷対摩擦抵抗比が、自由溶液中の異なるサイズのポリヌクレオチドについて同じであるので、ポリヌクレオチドの電気泳動分離は、代表的には、シービング(sieving)媒体を含む。初期の選り抜きのシービング媒体は、代表的には、架橋化ゲルであったが、いくつかの例では、安定性および生産性の問題が、非ゲル液体ポリマーシービング媒体(例えば、直鎖ポリアクリルアミド、ヒドロキシアルキルセルロース、アガロース、およびセルロースアセテートなど)の試験を導いてきた(例えば、Bode、Anal.Biochem.、83:204−210(1977);Bode、Anal.Biochem.、83:364−371(1977);Bode、Anal.Biochem.、92:99−110(1979);Hjertenら、J.Liquid Chromatography、12:2471−2477(1989);Grossman、米国特許第5,126,021号;Zhuら、米国特許第5,089,111号;Tietzら、Electrophoresis、13:614−616(1992))。
【0004】
キャピラリー電気泳動による分離を複雑にし得る別の因子は、電気浸透(electroendoosmosis)の現象である。この現象は、時折、電気浸透(electroosmosis)または電気浸透流(EOF)とも呼ばれ、これは、電場によって誘導されるキャピラリー中の流体の流れである。この現象は、高分解能分離が代表的に要求される状況(例えば、DNA配列決定フラグメントの分析において)に対するキャピラリー電気泳動の適用を妨害する。この現象は、キャピラリー電気泳動において、そのキャピラリーの内壁が固定された電荷を含む場合に生じ得る。このような電荷は、対イオンの移動層の形成を生じ得、次いで、これが、電場の存在下で移動して、液体のバルクフローを生じる。不幸にも、EOFの程度は、多くの因子(電荷の分布における変動、分析物および/または分離媒体の成分の選択的吸着、分離媒体のpHなどを含む)に依存して変化し得る。この可変性は、接近して離れている分析物のバンドを分解する能力を減少し得るので、多くの試みが、このような流れを直接的または間接的に制御するためになされてきた。これらの試みには、荷電基を抑制するためのキャピラリーの内壁の共有結合性のコーティングまたは改変、高粘性ポリマーの使用、緩衝液のpHおよび/または濃度の調整、キャピラリー壁を共有結合的にコーティングするためのゲル分離媒体の使用、ならびにキャピラリーの軸に対して半径方向の電場の適用が含まれた。
【0005】
現在、核酸フラグメントのキャピラリー電気泳動は、しばしば、プレコーティングされたキャピラリーを使用して行われる。プレコーティングされたキャピラリー管は、一般に、作製するのに高価であり、限定された寿命を有し、そして再現性の問題にさらされ得る。これらの問題は、平行な複数のキャピラリー泳動を使用する、大規模のキャピラリー電気泳動に特に重要である。
【0006】
(発明の要旨)
本発明は、サンプル中の分析物を分離(例えば、DNA配列決定フラグメントまたは他のポリヌクレオチドフラグメントの一塩基分解)するための組成物を提供する。シービング成分、および必要に応じて、表面相互作用成分を含む、組成物が提供され、シービング成分は、少なくとも1つの低粘性の高分子量非架橋化アクリルアミドポリマーを含み、そして表面相互作用成分は、少なくとも1つの非架橋化ポリマーを含む。好ましい実施形態において、これらの組成物は、架橋化ポリマーゲルを含まない。
【0007】
別の局面において、本発明は、キャピラリー電気泳動要素を含む。キャピラリー電気泳動要素は、分析物を分離するための組成物が挿入される、コーティングされていないキャピラリーを含む。このキャピラリー内に配置される組成物は、シービング成分および表面相互作用成分を含む。
【0008】
別の局面において、本発明の組成物を、キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するために使用する、方法を提供する。特定の実施形態において、本発明の方法は、複数のコーティングされていないキャピラリー、または本明細書中に開示される新規組成物を含むキャピラリー電気泳動要素を使用して、平行して行われる。
【0009】
別の局面において、本発明は、とりわけ、プレコーティングされたキャピラリーと共に使用するための、表面相互作用成分を含まない、低粘性の高分子量非架橋化アクリルアミドポリマーシービング成分を含む組成物を提供する。プレコーティングされたキャピラリーは、例えば、BioRad Life Sciencesから市販されている(例えば、Biocap XLキャピラリー、カタログ番号148−3081)。キャピラリーはまた、当該分野で周知の方法を使用してプレコーティングされ得る。このような手順は、例えば、Cobbら、Anal.Chem.62:2478(1990)およびGrossman、米国特許第5,347,527号に記載される。
【0010】
キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットもまた、提供される。特定の実施形態において、これらのキットは、本明細書中に提供される組成物のうちの1つを備える。1以上のこれらの組成物または方法と共に使用するための、コーティングされていないキャピラリーを備えるキットもまた、提供される。
【0011】
(定義)
「アクリルアミド」および「アクリルアミドモノマー」とは、式H2C=CR−C(=O)NR1R2を有する構造であって、Rが−Hまたは−CH3であり得、そしてR1およびR2が、独立して、−H、−CH3、−(CH2)xOH、−CH2CH(OH)(CH2)yOR3、−CH(CH2OH)CH(OH)CH3、−CH2CH2(OCH2CH2)p−OR3、−CH2CONH2、
【0012】
【化1】
であり得、そしてR3が、独立して、−H、−CH3、または−CH2CH3であり得る、構造をいう。xおよびyの値は、1〜3の範囲であり、そしてpの値は、1〜200の範囲である。
【0013】
「平均分子量」とは、種々の分子量を有するポリマー種から構成されたサンプル集団の、重量平均分子量(Mw)をいう。この量は、以下の式:
【0014】
【化2】
により規定され、ここで、niは、種iの分子数を示し、そしてMiは、i番目の種の分子量である。本明細書中で使用される場合、用語「分子量」とは、他のように特定されない限り、重量平均分子量をいう。
【0015】
用語「キャピラリー」とは、本明細書中で使用される場合、一定体積の分離媒体(例えば、本明細書中に開示されるような、分析物を分離するための組成物)を支持可能である、電気泳動を実行するための管もしくはチャネルまたは他の構造をいう。キャピラリーの幾何学的構造は、広範に変動し得、そしてその幾何学的構造としては、円形断面を備えた管、矩形断面を備えた管、または四角形断面を備えた管、チャネル、溝、プレートなどが挙げられるが、これらに限定されず、そしてこの幾何学的構造は、広範な技術により製造され得る。本発明の特定の実施形態とともに使用するためのキャピラリーの重要な特徴は、分離媒体の体積と接触した表面の表面−体積比である。この比が高い値であることは、代表的には、電気泳動の間にその分離媒体からのより良好な熱転移を可能にする。好ましくは、特定の実施形態において、約0.8〜0.02μm−1の範囲にある値が、使用される。これらは、約5μm〜約200μmの範囲内の内径を有する、円形断面を備えた管状キャピラリーの表面−体積比に対応する。用語「コーティングされていないキャピラリー」とは、そのキャプラリーが、本発明の組成物の導入前にコーティングされていないこと、すなわち、使用前に共有結合によりコーティングされていないことを、意味する。特定の実施形態において、本発明とともに使用するためのキャピラリーは、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス(例えば、ホウケイ酸ガラス、リン酸塩ガラス、アルミナ含有ガラスなど)または他のシリカ様材料から作製される。特定の実施形態において、プラスチック物質中に形成されたキャピラリーが、使用される。プラスチック物質は、例えば、例えば、ポリアクリレートおよびポリオレフィン(例えば、LUCRYL(登録商標)(BASF、ドイツ)、TPX(商標)(Matsui Plastics,Inc.、White Plains、NY)、TOPAS(登録商標)(Hoechst Celanese Corp.、Summit,NJ)、およびZEONOR(登録商標)(Zeon Chemicals、Louisville,KY))を包含し得る。チャネルキャピラリーのためのプラスチック物質の記載は、とりわけ、米国特許第5,750,015号に見出され得る。
【0016】
本明細書中で使用される場合、用語「分析物を分離するための組成物」は、低粘性で高分子量のシービング成分と、必要に応じて、表面相互作用成分とを、含む。このような組成物は、キャピラリー電気泳動を使用して、ポリヌクレオチド、または異なるサイズを有するが遊離溶液中で類似するかもしくは同じ電荷−摩擦抵抗比を有する他の生体分子を分離するために、特に有用である。当業者は、電荷保有成分、または電解質が、代表的には、このような組成物に含まれることを、認識する。この電荷保有成分は、通常は、一定pHにて分離媒体を維持するための緩衝系の一部である。分析物を分離するための組成物は、1つ以上の非架橋アクリルアミドポリマーを含む。
【0017】
用語「DNA配列決定フラグメント」とは、選択されたDNA標的配列に関する配列情報を得るために生成された、DNAポリヌクレオチドをいう。このようなフラグメントは、例えば、サンガージデオキシ法によって酵素的にか、または例えばマクサム−ギルバート法によって化学的に、生成され得る。このフラグメントは、1つの配列決定反応(例えば、ジデオキシシチジン三リン酸の存在下で実施されるジデオキシ配列決定反応)において生じ得るか、または1つを超える配列決定反応から(例えば、各フラグメントの3’末端塩基を同定するために適切に標識された5’−プライマーを含む、4つの異なるジデオキシ配列決定反応から)生じ得る。
【0018】
「ポリマー」は、その伝統的意味にて使用され、一緒に共有結合されて鎖を形成する、より小さいモノマーサブユニットまたはオリゴマーサブユニットから構成された、大きな分子を指す。「ホモポリマー」は、1つのモノマー反復単位のみから構成された、ポリマーである。「コポリマー」とは、2種以上のモノマー反復単位から構成された、ポリマーを指す。線状ポリマーは、連続して一本の状態で一緒に連結されてポリマー分子を形成する、モノマー反復単位から構成される。分枝型ポリマーは、線状ポリマーと類似するが、主ポリマーに沿って種々の分枝点から突出した側鎖を有する。星型ポリマーは、1つの分枝部位から複数の側枝が放射状に延びて、星型の外見または車輪およびスポーク状の外見を生じること以外は分枝型ポリマーと類似する。
【0019】
架橋されたポリマーは、例えば、末端以外の点で互いに共有結合したポリマー分子を含む。架橋は、架橋剤の存在下で重合反応の間に生じ得る。ある程度の架橋(ゲル化点として公知)で、ゲル化が生じる。このゲル化点で、明らかなゲルまたは不溶性ポリマーが形成し、そしてこの系は流動性を失う。架橋されて巨視的な分子を形成するポリマー分子の網目構造の形成に対応する、この架橋されたポリマーゲルは、全ての溶媒中で、上昇した温度でさえ不溶性である。アクリルアミドポリマーおよびポリマーゲルの考察は、当該分野で公知の参考文献(例えば、Odian、Priciples of Polymerization、第三版(Wiley Interscience、1991)に見出され得る。
【0020】
本明細書中で使用される場合、「非架橋アクリルアミドポリマー」とは、アクリルアミドモノマーを含有する、分枝を有しているかまたは有していないポリマーをいうが、一緒に架橋されるポリマー分子を除外する。従って、非架橋ポリマーは、末端以外の点で連結したポリマー分子を含まず、そして重合の間にゲル化をしない。
【0021】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合、天然ヌクレオシドモノマーまたは修飾ヌクレオシドモノマーの線状ポリマーをいい、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形態などを含む。代表的に、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結されてポリヌクレオチドを形成するが、ペプチド核酸もまた意図される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、数モノマー単位(例えば、20)〜数千モノマー単位の範囲の大きさである。ポリヌクレオチドが、文字列(例えば、「ATGCCTG」)によって示されるときにはいつでも、他に示されない限り、ヌクレオチドは、左から右へ5’→3’の順であり、そして「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」は、デオキシシチジンを示し、「G」は、デオキシグアニンを示し、そして「T」は、デオキシチミジンを示すことが、理解される。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、ホスホセレネート(phosphoselenate)、ホスホジセレネート、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホロアニリデート(phosphoranilidate)、ホスホロアミダイトなどが挙げられる。
【0022】
用語「一塩基分解」(R一塩基)とは、大きさが1ヌクレオチド異なる2つのポリヌクレオチドフラグメントから生じる、2つのピークの間の分解の測定をいう。一塩基分解は、以下の式:
【0023】
【化3】
を使用して数学的に決定され得、ここで、tnは、nヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントの移動時間であり;tn+1は、n+1ヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントの移動時間であり;Wnは、nヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントからのピークの基底での全幅であり;そしてWn+1は、n+1ヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントからのピークの基底での全幅である。「移動時間」は、ポリヌクレオチドフラグメントが、キャピラリーまたは微小チャネルの長さ(すなわち、注入点から検出器まで)を移動するのにかかる時間である。
【0024】
用語「一塩基分解限界」とは、一塩基分解値が特定の系において0.58未満に落ちる、ポリヌクレオチドフラグメントの大きさをいう。
【0025】
(例示的実施形態の詳細な説明)
本明細書中で使用されるこの節の見出しは、組織的目的のみのためであり、記載される主題を限定するとは解釈されるべきでない。本出願において引用される全ての参考文献は、各参考文献が具体的かつ個々に参考として援用されたのと同程度に、任意の目的のための参考として明示的に援用される。
【0026】
特定の実施形態において、本発明は、低粘度、高分子量の非架橋アクリルアミドポリマーシービング成分を含有する組成物を提供する。他の実施形態において、組成物は、表面相互作用成分(例えば、ポリジメチルアクリルアミド(pDMA))をさらに含有する。さらに、本発明の組成物は、架橋されたポリマーゲルを含まない。分析物(特に、ポリヌクレオチド配列)の高速、高分解能のキャピラリー電気泳動のための方法が提供され、この方法は、この新規の組成物を使用することによる。これらの方法を使用するキットもまた提供される。
【0027】
本発明の組成物の1つの利点は、1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーが、開示された方法および電気泳動要素において使用された場合に、公知の電気泳動組成物と比較して、予測できない利点を提供することである。約1,000,000Da未満の分子量を有する線状アクリルアミドポリマーは、本発明の組成物よりも乏しい分解能を提供する。約3,000,000Daより大きい分子量を有する線状アクリルアミドポリマーは、粘度の問題を示し、そして操作(例えば、キャピラリーに挿入し、そしてキャピラリーから除去する)のが困難である。従って、本発明の組成物は、25℃で10,000センチポイズ未満、好ましくは5,000センチポイズ未満、より好ましくは1,000センチポイズ未満、そして最も好ましくは600センチポイズ未満の粘度を有する。非架橋アクリルアミドポリマーとしては、例えば、線状ポリマー(例えば、ポリアクリルアミド(LPA))、分枝ポリマーおよび星型ポリマーが挙げられ得る。
【0028】
シービング成分は、ポリアクリルアミド以外の親水性N置換アクリルアミドポリマー(すなわち、この置換基は、アクリルアミド窒素に結合している)を含み得る。例示的な親水性N置換アクリルアミドポリマーとしては、以下のホモポリマーおよびそれらのコポリマーが挙げられる:
【0029】
【化4】
ここで、R3は、−Hまたは−CH3であり得、そしてR4およびR5は、独立して、−H、−CH3、−(CH2)xOH、−CH2CH(OH)(CH2)yOR6、−CH(CH2OH)CH(OH)CH3、−CH2CH(OCH2CH2)pOR6、−CH2CONH2、
【0030】
【化5】
であり得、そしてR6は、独立して、−H、−CH3、または−(CH2CH3)であり得る。xおよびyの値は1〜3の範囲であり、pの値は1〜200の範囲であり、そしてqはポリマーの分子量に正比例し、かつ数百〜数十万の範囲である。平均分子量は、100,000Da〜25,000,000Da、好ましくは、1,000,000Da〜3,000,000Daの範囲である。
【0031】
開示された組成物中のシービング成分としての使用に適切な、1つの例示的な親水性N置換アクリルアミドコポリマーは、以下:
【0032】
【化6】
であり、ここで、R3、R4、R5およびコポリマーの分子量は、上記の通りであり、そしてm:nの比は、約100:1〜約1:100の範囲である。
【0033】
特定の実施形態において、このシービング成分は、約1,000,000Daと約3,000,000Daとの間の平均分子量を有する、非架橋ポリアクリルアミドポリマーを含む。1,000,000Da以上の平均分子量の非架橋ポリアクリルアミドポリマーは、改善された分解能を提供する。3,000,000Da以下の平均分子量の非架橋ポリアクリルアミドポリマーは、改善された流動性を提供し、このようなポリマーの取り扱いおよびコーティングされていないキャピラリーへの充填を容易にする。
【0034】
特定の実施形態において、本発明の組成物の表面相互作用成分は、1つ以上の非架橋ポリマーを含む。このような成分は、種々の化学分類(例えば、以下の参考文献において記載される化学分類)に属し得る:Molyneux,Water−Soluble Synthetic Polymers:Properties and Behavior,第1巻および第2巻(CRC Press,Boca Raton,1982);Davidson,Editor,Handbook of Water−Soluble Gums and Resins(McGraw−Hill,New York,1980);Franks,editor,Water:A Comprehensive Treatise(Plenum Press,New York,1973)など。
【0035】
表面相互作用成分として適切であり得る例示的な非架橋ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、N,N−二置換ポリアクリルアミド、N−単置換ポリアクリルアミドなどが挙げられる。特定の実施形態において、この表面相互作用成分は、0.05〜0.5%、好ましくは0.1〜0.4%、そして最も好ましくは0.2%の範囲で、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)(pDMA)を含む。
【0036】
N置換ポリアクリルアミドの例示的なN置換基としては、C1〜C12アルキル;ハロ置換C1〜C12アルキル;メトキシ置換C1〜C12アルキル;ヒドロキシル置換C1〜C12アルキルなどが挙げられる。好ましくは、ハロ置換基は、フルオロであり、そしてヒドロキシル置換C1〜C12アルキルは、単置換である。上記モノマー置換基が代表的に選択され、その結果、得られたポリマーは、水溶性であることが理解される。例えば、C12アルキル含有モノマーは、しばしば、コポリマーの小画分成分としてのみ存在する。より好ましくは、例示的な置換基は、C1〜C3アルキル;ハロ置換C1〜C3アルキル;メトキシ置換C1〜C3アルキル;およびヒドロキシル置換C1〜C3アルキルからなる群より選択される。このようなポリマーは、例えば、Odian,Principles of Polymerization、第3版(John Wiley,New York,1991)、Glass,editor,Water−Soluble Polymers;Beauty and Performance(Adv.Chem.Ser.,#213、American Chemical Society,Washington,D.C.,1986)、およびMolyneux,Water−Soluble Polymers:Properties and Behavior,第I巻および第II巻(CRC Press,Boca Raton,FL,1982)において開示されるような、従来の技術によって合成される。
【0037】
好ましい表面相互作用成分は、pDMAである。特定の実施形態に従って、pDMA以外の疎水性ポリマーは、表面相互作用成分として使用され得る。これらとしては、以下のホモポリマーが挙げられるが、これに限定されない:N−アルキル−置換アクリルアミドおよびこれらのコポリマー、
【0038】
【化7】
ここで、R7は、−Hまたは−CH3であり得、R8およびR9は、独立して、−H、−CH3、−CH2CH3、−CH2CH2CH3、−CH(CH3)2または−CH2CONH2であり得、そしてzは、約2000〜50,000の範囲である。平均分子量は、200,000Da〜5,000,000Da、好ましくは300,000Da〜2,500,000Daの範囲である。アミド基はまた、
【0039】
【化8】
のような環状化合物であり得る。表面相互作用成分として使用され得るコポリマーの別の例としては、以下の構造、
【0040】
【化9】
が挙げられ、ここで、R3、R4、R5、および分子量は、以前に記載されており、そしてj:kの比は、1:9〜9:1の範囲である。
【0041】
特定の実施形態において、分離媒体の表面相互作用成分を含むポリマーは、約0.001%〜約10%重量:重量(w:w)の濃度で存在し得る。好ましくは、このようなポリマーは、約0.01%〜約1%w:wの範囲の濃度で存在する。
【0042】
特定の実施形態において、組成物は、変性剤のようなさらなる成分を含み得る。このような変性剤は、例えば、ポリヌクレオチドを含む分析物との、二重鎖または二次構造の形成を防ぐことが所望である場合に有用であり得る。例示的な変性剤としては、ホルムアミド(例えば40〜90%)、尿素(例えば6〜8M)、市販のラクタム(例えば、ピロリドン、2−ピロリジノン)などが挙げられる。特定の実施形態において、変性剤は、単独または組み合わせて、尿素、ホルムアミド、または2−ピロリジノンを含む。電気泳動における変性剤の使用の指導は、周知の分子生物学の参考文献(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989))において見出され得る。
【0043】
特定の実施形態において、組成物は、25℃で10,000センチポイズ(cp)未満の粘度を有する。他の実施形態において、組成物の粘度は、25℃で5,000cp未満、25℃で1,000cp未満、または25℃で600cp未満である。全ての粘度測定を、Brookfield Model DV−II粘度計(Brookfield Engineering Laboratories,Inc.,Middleboro,MA)を使用して行なった。4000cp未満の粘度を有する組成物について、スピンドル番号18を、小サンプルアダプターと共に使用した。スピンドル速度は、1000cp未満の粘度のサンプルについて3rpm、1000cpと2000cpとの間の粘度のサンプルについて1.5rpm、および2000cpと4000cpとの間の粘度のサンプルについて0.6rpmであった。4000cpより大きい粘度のサンプルについて、より小さいスピンドルおよび異なるアダプターが必要である。
【0044】
キャピラリー電気泳動を実施するための装置が周知である。基本的装置を記載する多数の参考文献が利用可能であり、いくつかのキャピラリー電気泳動機器(例えば、Applied Biosystems(Foster City,CA)モデル270A、モデル310、モデル3100、またはモデル3700機器)が、市販されている。キャピラリー電気泳動装置およびこれらの操作を記載する例示的な参考文献としては、Jorgenson,Methods:A Companion to Methods in Enzymology,4:179−190(1992);Colburnら、Applied Biosystems Research News,1号(1990年冬);Grossmanら(上記引用)などが挙げられる。
【0045】
特定の実施形態において、緩衝液系は、pHを制御するため、そして電荷保有成分として使用される。例示的な緩衝液としては、以下が挙げられる:有機酸(例えば、クエン酸、酢酸、ギ酸);双性イオン(例えば、TES(N−トリス[ヒドロキシメチル]−2−アミノエタンスルホン酸)、BICINE(N,N−ビス[2−ヒドロキシエチル]グリシン)、ACES(N−[2−アセトアミド]−2−アミノエタンスルホン酸)、TAPS(N−トリス[ヒドロキシメチル]メチル−3−アミノプロパンスルホン酸)、またはグリシルグリシン);無機酸(例えば、リン酸);および有機塩基(例えば、トリス(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン)緩衝液(例えば、SigmaまたはCalbiochemより入手可能))の水溶液。緩衝液の濃度は、例えば、約1mMと1Mとの間で、広範に変化し得る。特定の実施形態において、本発明のキャピラリー電気泳動法における使用のための例示的な緩衝液は、以下を含む:(i)100mM TAPS、7M尿素(pH8.0);または(ii)TTE(50mMトリス−50mM TAPS)、7M尿素(pH8.0)。
【0046】
特定の実施形態において、二本鎖ポリヌクレオチド(例えば、PCRまたはLCR増幅によるDNAフラグメント、酵素消化物など)は、標準的なプロトコルまたはメーカーの推奨するプロトコルによって分離され、ここで市販のキャピラリー電気泳動装置(例えば、モデル270−HT、310、3100または3700装置(Applied Biosystems,Foster City)が用いられる。このような標準的または推奨されるプロトコル以外で、本発明の組成物および/またはキャピラリー電気泳動要素が用いられる。特定の実施形態において、キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法は、コーティングされていないキャピラリー(第1の末端および第2の末端を有する)に、シービング成分および表面相互作用成分を含む組成物を挿入する工程を包含する。異なるサイズの分析物のサンプルを、このキャピラリーに充填し、そしてこのキャピラリーの第1の末端と第2の末端との間に、電場を印加する。このサンプル中の異なるサイズの分析物は、キャピラリー内の組成物を通って移動し、分析物が分離される。他の実施形態において、予めコーティングされたキャピラリーを使用する。特定の実施形態において、この組成物は、本明細書中で開示される組成物の1つを含む。
【0047】
本発明の特定の方法は、DNA配列決定のために用いられ得る。特定の実施液体において、このような配列決定は、DNA配列決定プロトコルによって調製された一本鎖ポリヌクレオチドを分離する工程を包含する。DNA配列決定プロトコルの詳細な説明は、とりわけ、Automated DNA Sequencing Chemistry Guide(Applied Bioxyxtems,Part No.4305080);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989);Ausbelら、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,1993,2000年8月までの補遺を含む)などに見出され得る。
【0048】
特定の現在利用可能なDNA配列決定プロトコルの重要な特徴は、一本鎖ポリヌクレオチドまたはDNA配列決定フラグメント(これはサイズによって分離され得る)の「ネスト化種(nested series)」または「ラダー」の生成である。DNA配列決定の鎖の終結法は、(1)オリゴヌクレオチドプライマー、およびその配列が決定されるべき標的核酸を含むテンプレート核酸を提供する工程、(2)このオリゴヌクレオチドプライマーをこのテンプレート核酸にハイブリダイズさせる工程、(3)このプライマーを、ヌクレオシド三リン酸前駆体および少なくとも1つの鎖終結ヌクレオチドを含む反応混合物中で、核酸ポリメラーゼ(例えば、T7 DNAポリメラーゼ、SequennaseTM、逆転写酵素など)を用いて伸長させて、ネスト化種のDNAフラグメント集団を形成する工程であって、この結果、全ての短いDNAフラグメントが全ての長いDNAフラグメントとのサブ配列となり、そしてその結果、同じサイズの各DNAフラグメントが、同じ鎖終結ヌクレオチドで終結する、工程、(4)このDNAフラグメント集団を、サイズに従って分離する工程、および(5)各DNAフラグメント集団に関連する鎖終結ヌクレオチドを同定する工程、を包含する。しかし、当業者は、DNA配列決定法に対する多くの変形物が利用可能であることを理解する。
【0049】
受容可能なテンプレートとしては、当該分野で議論されるテンプレート(例えば、Technical Manual for ABI Model 370A DNA Sequencer(Applied Biosystems,Foster City,CA))が挙げられる。例えば、標的配列は、適切なクローニングベクター(例えば、複製形態のM13クローニングベクター)に挿入され得、これは次いで、標的配列のコピー数を増幅するために、増殖される。一本鎖形態のM13は、テンプレートとして使用するために単離される。また、テンプレートは、当該分野で教示されるように、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって提供され得る(例えば、Innisら(上で引用される);Wilsonら、Biotechniques,第8巻、184〜189ページ(1990);Gyllensten,Biotechniques,第7巻、700〜708ページ(1989)など)。特定の実施形態において、増幅の後、このテンプレートは、液相における重合反応に使用され得るか、または固相支持体に結合され得るかのいずれかである(例えば、Stahlら、Nucleic Acids Research,第16巻、3025〜3038ページ(1988);Hultmanら、Nucleic Acids Research,第17巻、4937〜4946ページ(1989)などにより教示される)。
【0050】
一旦、ネスト化腫のDNAフラグメントが生成されると、これらは、本発明の、組成物、キャピラリー電気泳動要素または方法を使用するキャピラリー電気泳動によって、分離される。
【0051】
上で記載された本発明は、実施例を参照することによってよりよく理解され得る。以下の実施例は、例示のみの目的のためであることが意図され、いずれの様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【0052】
(実施例)
(実施例1)
(溶液重合による非架橋アクリルアミドポリマーの調製)
94.50gの蒸留水(18MΩ・cm)および32.02g(0.129mol)の28.57重量% アクリルアミド溶液(Bio−Rad,Hercules,CA)を含む溶液を、機械的撹拌用の2”Teflonブレード、パージのための排出チューブおよび温度計を取り付けた500mL3つ口丸底フラスコ中で調製した。絶え間なく機械的に撹拌しながら、150mL/分の速度で120分間、超純粋なヘリウム(99.99%)をこの溶液にバブリングし、この溶液を脱酸素した。この脱酸素した溶液に、1.0mL(13.06mmol)の2−プロパノール(イソプロパノール)および4.0mL(0.35mmol)の1.99重量% 過硫酸アンモニウム(純度99.99%、Aldrich)の溶液を、シリンジで添加した。このフラスコを、150rpmで絶え間なく機械的に撹拌し、150ml/分でヘリウムをパージしながら、50±1℃の油浴に120分間浸けた。この反応を、200mLの蒸留水を撹拌しながら添加することによってクエンチし、10分間空気でバブリングした。得られた無色透明の溶液を、50K分子量カットオフ(MWCO)Spectra/Por−7再生セルロース膜に入れ、そして3日間、4.5ガロンの蒸留水(18MΩ・cm)に対して透析した。水は、一日に二回交換した。この透析した溶液を、凍結乾燥し、そして8.41gの非架橋アクリルアミドポリマーを得た(収率92%)。
【0053】
このポリマーを、American Porimer Standards(Mentor,Ohio)によるポリアクリルアミド一次基準を使用するゲル透過クロマトグラフィー(GPC)によって特徴付けた。分離を、1ml/分の流速の0.05m NaNO3を使用する、直列の3つのクロマトグラフィーカラム(Ultrahydrogel(Waters Corp.,Milford,MA)2000 Angstromカラム、Ultrahydrogel 1000 Angstromカラム、およびガードカラム)を用いて、30℃で行った。注入容量は、100μlであり、そして検出器は、Knauer DRI 8Xであった。この非架橋アクリルアミドポリマーは、589キロダルトン(kDa)のMn、2517kDaのMw(図1〜3において2.5M)、および4.23の多分散性を有することが見出された。バッチ様式の光散乱により決定されるように、Mwは、1936kDaであった(表1の調製番号1)。当業者は、ポリマーの観察された分子量が特徴付けの方法に依存して変わり得ることを理解する。添付の特許請求の範囲に記載される分子量は、上記のGPC法に基づく。
【0054】
このポリマーを、使用前に、40℃で少なくとも4時間真空乾燥した。
【0055】
(実施例2)
(別の架橋されていないアクリルアミドの調製)
(溶液重合によるポリマー)
第2の架橋されていないアクリルアミドポリマーを、2.0mL(26.12mmol)のイソプロパノールをこの脱酸素化溶液に添加したことを除いて、実施例1に記載されるように調製した。当業者は、イソプロパノールが連鎖移動剤として役立ち、調製されるポリマーの分子量を制限することを理解する。従って、イソプロパノールの量を変化させることによって、このポリマーのモル重量が変化され得る。
【0056】
得られた無色透明な溶液を、実施例1でのように透析しそして凍結乾燥した。架橋されていないアクリルアミドポリマーの収量は、9.0g(収率98%)であった。このポリマーを、ゲル浸透クロマトグラフィーによって特徴付けし、そして310kDaのMn、1376kDaのMw(図1−3において1.4M)および4.40の多分散性を有することを見出した。バッチモードの光散乱によって決定されたMwは、975kDaであった(表1の調製番号2)。
【0057】
実施例1および2に記載される溶液重合手順に従って、さらに、異なる分子量を有する架橋されていないアクリルアミドポリマーを、イソ−プロパノールの濃度を変化させることによって調製した(表1の調製番号1−4を参照のこと)。
【0058】
(表1.架橋されていないアクリルアミドポリマー調製物)
【0059】
【表1】
(実施例3)
(逆乳化重合による架橋されていないアクリルアミドポリマーの調製)
5番目の架橋されていないアクリルアミドポリマーを、以下のように、逆乳化重合(IEP)によって調製した。1Lのポリプロピレンビーカーに、100.05gのPetrolum Special(bp 180−220℃,Fluka)、100.01gの28.57重量%のアクリルアミド溶液(Bio−Rad)、2.50gのソルビタンモノオレエート(Fluka)、および1.0109重量%の過硫酸アンモニウム溶液(1.00mL)(99.99%、Aldrich)を添加した。この混合物を、2インチのマグネチックスターラーバーを用いて、10分間、800rpmで攪拌することによって乳化した。次いで、このエマルジョンを、機械的攪拌のために2インチのTeflon(登録商標)製の攪拌ブレード、パージのためのブリーディングチューブ(bleeding tubu)および温度計を備えた1Lの3つ口丸底フラスコに移した。このエマルジョンを、300rpmで機械により一定に攪拌した状態で、120分間、150mL/分の速度で、超純粋ヘリウム(99.99%)でパージした。このエマルジョンに、マイクロシリンジを使用して、0.010mLのN,N,N,N−テトラメチルエチレンジアミン(超純粋、Armesco)を添加した。このフラスコを、300rpmで機械により一定に攪拌し、150mL/分で19時間、ヘリウムでパージした状態で、35±1℃の油浴に下げた。重合の間、エマルジョンの温度は、決して35℃を越えなかった。
【0060】
19時間後、400mLのアセトンを添加し、そしてこのエマルジョンを300rpmで2時間攪拌した。このポリマー粉末を沈殿させ、そして上清の層をデカンテーションした。この沈殿したポリマーに、300mLのアセトンを添加し、このメカニカルスターラーを、1.5インチの卵型マグネチックスターラーバーと交換し、そして800rpmで3時間攪拌した。この沈殿したポリマーは、以上に微細な粉末となった。この粉末を静置させ、そして有機層をデカンテーションした。このポリマー粉末を300mLのアセトンで粉砕し、そして800rpmでさらに3時間攪拌した。このポリマーを吸引濾過し、そして大量のアセトンでリンスした。約5.4グラムの湿潤ポリマー粉末を、450mLの蒸留水に添加し、そしてこの溶液を、1インチのマグネットスターラーバーを用いて2日間75rpmで攪拌した。得られた混合物を、5つの50mL Falcon管に分け、そして2日間振り続け(tumble)、非常に粘性の溶液を得た。この溶液を、50K MWCO Spectra/Por−7再生セルロース膜に入れ、そして3日間、4.5ガロンの蒸留水(18M Ω・cm)に対して透析した。水を、1日に2回交換した。透析した溶液を凍結乾燥し、4.50gの架橋していないアクリルアミドポリマーを得た。バッチモードの光散乱によって決定される場合のMwは、12500kDaであり、そしてゲル浸透クロマトグラフィーによって決定される場合のMwは、6377kDaであった(表1の調製5;6.4M(図1〜3))。
【0061】
(実施例4)
(例示的な成分の調製)
本発明の組成物における使用のために、例示的な篩成分を、以下のように調製した。表1に示される架橋されていないアクリルアミドポリマーのいずれか(100mg)を、2.44gの水、0.075gの12.3% pDMA溶液、および0.5gの1M Na−TAPS/10mM EDTA緩衝液(pH 8.0)に添加した。この混合物を、一晩、ローターホイール上での回転によって溶解させた。この手順に続いて、5つの異なる篩成分(それぞれ、表1に示される架橋されていない異なるアクリルアミドポリマーを含む)を調製した。
【0062】
(実施例5)
(キャピラリー電気泳動による分析物の分離)
分析物を分離するための5つの例示的な組成物は、実施例4からの5つの篩成分のうちの1つを0.2% pDMAと合わせることによって調製した。これらの5つの組成物を分析して、47cmのコーティングされていないキャピラリー(注入口から検出器まで36cm)を備えたABI 310キャピラリー電気泳動装置(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用してポリヌクレオチド分析物を分離するそれらの能力を評価した。キャピラリー電気泳動エレメントを、各分析の前に、400秒間コーティングされていないキャピラリーを通して5つの組成物のうちの1つをポンピングすることによって調製した。
【0063】
蛍光標識したDNA配列のフラグメントおよび蛍光色素TETで標識された一本鎖DNA配列決定ラダー(sequencing ladder)(公知の大きさの18DNAフラグメントを含む)を含む検体を、ホルムアルデヒド中に溶解した。この分析物溶液を、1.5kVで10秒間かけて、このキャピラリー電気泳動エレメント中に注入した。分離を、200V/cmの電界を使用して、50℃、60℃、または70℃の使用温度で実施した。
【0064】
このピーク幅(Gaussianピークの標準偏差の4倍として定義される)ならびにDNA配列決定ラダーおよびフラグメント由来のピークの移動時間を測定した。これらの値を、一塩基分解値(single base resolution value)を計算するために使用した。この一塩基分解値および各々の使用温度で実施される3または4つの反復ラン(run)についての移動時間を、図1、2、および3に示した。
【0065】
5つの組成物および3つの使用温度に関する一塩基分解の制限を、図4に示す。使用温度に関係なく、この一塩基分解は、ポリマーの分子量が増加するにつれて約3,000,000Daまで増加する(図4を参照のこと)。しかし、この3つの分解温度の曲線のそれぞれは、このポリマーの分子量が約3,000,000Daを超えて増加する場合、プラトーに達する。従って、約3,000,000Daを越えるポリマーの分子量の増加は、一塩基分解を顕著に増加させない。しかし、約3,000,000Daを越えるポリマーの分子量の増加は、ポリマー溶液の粘度を急激に増加させる。例えば、本実施例で使用される2,500,000Daポリマーの粘度は、約500センチポイズであり、一方6,400,000Daポリマーの粘度は、50,000センチポイズより大きかった。従って、1,000,000〜3,000,000Daの分子量を有する篩組成物は、効率的な一塩基分解を提供するが、キャピラリーに充填するために十分低い粘度のままである。
【0066】
本発明は、種々の適用、方法、および組成物に関して記載されるが、本発明から逸脱することなく、種々の変化および改変がなされ得ることが理解される。上記の実施例は、本発明をよりよく例示するために提供されるのであって、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、標識ポリヌクレオチド分子量ラダーのキャピラリー電気泳動により収集された、一塩基分解データを示し、このキャピラリー電気泳動は、泳動温度50℃と、平均分子量約744,000ダルトン(Da)(0.75M);1,376,000Da(1.4M);2,015,000Da(2.0M);2,517,000Da(2.5M);または6,377,000Da(6.4M)非架橋アクリルアミドポリマーのシービング成分を含む組成物とを使用する。図1A(上段)は、一塩基分解 対 フラグメントサイズ(ヌクレオチド塩基で測定)のグラフを示す。図1Bは、フラグメント移動時間(分) 対 フラグメントサイズ(ヌクレオチド塩基で測定)のグラフを示す。
【図2】
図2は、標識ポリヌクレオチド分子量ラダーのキャピラリー電気泳動により収集された、一塩基分解データを示し、このキャピラリー電気泳動は、図1に記載された同じ5つの組成物を、泳動温度60℃にて使用する。図2A(上段)は、一塩基分解 対 フラグメントサイズ(ヌクレオチド塩基で測定)のグラフを示す。図2Bは、フラグメント移動時間(分) 対 フラグメントサイズ(ヌクレオチド塩基で測定)のグラフを示す。
【図3】
図3は、標識ポリヌクレオチド分子量ラダーのキャピラリー電気泳動により収集された、一塩基分解データを示し、このキャピラリー電気泳動は、図1に記載された同じ5つの組成物を、泳動温度70℃にて使用する。図3A(上段)は、一塩基分解 対 フラグメントサイズ(ヌクレオチド塩基で測定)のグラフを示す。図3Bは、フラグメント移動時間(分) 対 フラグメントサイズ(ヌクレオチド塩基で測定)のグラフを示す。
【図4】
図4は、図1に記載された5つのシービング成分を含む組成物を、泳動温度50℃、60℃、または70℃にて使用して観察された、一塩基分解限界を示す。この一塩基分解限界は、図1、図2、および図3に示された一塩基分解データの視覚的点検により評価した。
Claims (56)
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物であって、該組成物は、以下:
約1,000,000ダルトン(Da)と3,000,000Daとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分;ならびに、
N,N−二置換ポリアクリルアミドおよびN−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される1種以上の非架橋ポリマーを含有する表面相互作用成分であり、ここで、該N−置換基が、C1〜C3アルキル、ハロ置換のC1〜C3アルキル、メトキシ置換のC1〜C3アルキル、およびヒドロキシル置換のC1〜C3アルキルからなる群より選択される、表面相互作用成分;
を含有し、該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり;
該組成物は、架橋ポリマーゲルを含まない、組成物。 - 前記組成物が、25℃にて10,000センチポイズ未満の粘度を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、25℃にて5,000センチポイズ未満の粘度を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、25℃にて1000センチポイズ未満の粘度を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、25℃にて600センチポイズ未満の粘度を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記1種以上の非架橋ポリマーが、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含有する、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも1種の変性剤をさらに含有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記少なくとも1種の変性剤が、少なくとも1種のホルムアミド、尿素、および2−ピロリジノンからなる群より選択される、請求項7に記載の組成物。
- 前記少なくとも1種の変性剤が尿素を含む、請求項8に記載の組成物。
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物であって、該組成物は、以下:
約1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有し、かつ25℃にて10,000センチポイズ未満の粘度を有する、非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分;
ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含有する、表面相互作用成分;ならびに、
尿素を含む変性剤;
を含有し、架橋ポリマーゲルを含まない、組成物。 - 前記粘度が、25℃にて5,000センチポイズ未満である、請求項10に記載の組成物。
- 前記粘度が、25℃にて1,000センチポイズ未満である、請求項10に記載の組成物。
- 前記粘度が、25℃にて600センチポイズ未満である、請求項10に記載の組成物。
- キャピラリー電気泳動要素であって、以下:
コーティングされていないキャピラリー;
該コーティングされていないキャピラリー内に配置された分析物を分離するための組成物であって、以下:約1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有し、かつ25℃にて10,000センチポイズ未満の粘度を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分;ならびに表面相互作用成分、を含有する、組成物;
を備え、
ここで、該表面相互作用成分が、1種以上の非架橋ポリマーの溶液を含有し;
そして、該キャピラリー電気泳動要素は、架橋ポリマーゲルを含まない、キャピラリー電気泳動要素。 - 前記組成物が、25℃にて5000センチポイズ未満の粘度を有する、請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記組成物が、25℃にて1000センチポイズ未満の粘度を有する、請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記組成物が、25℃にて600センチポイズ未満の粘度を有する、請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素であって、ここで、前記1種以上の表面相互作用成分の非架橋ポリマーが、N,N−二置換ポリアクリルアミドおよびN−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択され、ここで、該N−置換基が、C1〜C3アルキル、ハロ置換のC1〜C3アルキル、メトキシ置換のC1〜C3アルキル、およびヒドロキシル置換のC1〜C3アルキルからなる群より選択される、キャピラリー電気泳動要素。
- 前記表面相互作用成分の非架橋ポリマーが、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)である、請求項18に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記組成物が、少なくとも1種の変性剤をさらに含有する、請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記少なくとも1種の変性剤が、少なくとも1種のホルムアミド、尿素、および2−ピロリジノンからなる群より選択される、請求項20に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記少なくとも1種の変性剤が尿素を含有する、請求項21に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素であって、前記組成物が、以下:
約1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有し、かつ25℃にて600センチポイズ未満の粘度を有する直鎖アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分;
ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含有する、表面相互作用成分;ならびに、
尿素を含有する、変性剤;
を含有し、該組成物が架橋ポリマーゲルを含有しない、キャピラリー電気泳動要素。 - 前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス(例えば、ホウケイ酸ガラス)、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項25に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- 前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項25に記載のキャピラリー電気泳動要素。
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、該方法は、組成物におけるキャピラリー電気泳動によって該分析物を分離する工程を包含し、該組成物が、以下:
約1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分;ならびに、
N,N−二置換ポリアクリルアミドおよびN−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される1種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分であり、ここで、該N−置換基が、C1〜C3アルキル、ハロ置換のC1〜C3アルキル、メトキシ置換のC1〜C3アルキル、およびヒドロキシル置換のC1〜C3アルキルからなる群より選択される、表面相互作用成分;
を含有し、ここで該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり;そしてここで、該組成物が架橋ポリマーゲルを含まない、方法。 - 複数のコーティングされていないキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項28に記載の方法。
- 前記非架橋アクリルアミドポリマーが、25℃にて1000センチポイズ未満の粘度を有する、請求項28に記載の方法。
- 前記非架橋アクリルアミドポリマーが、25℃にて500センチポイズ未満の粘度を有する、請求項28に記載の方法。
- 前記組成物が少なくとも1種の変性剤をさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の変性剤が、少なくとも1種のホルムアミド、尿素、および2−ピロリジノンからなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の変性剤が尿素を含む、請求項33に記載の方法。
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、請求項14に記載のキャピラリー電気泳動要素を用いたキャピラリー電気泳動によって、該分析物を分離する工程を包含する、方法。
- 複数のコーティングされていないキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項35に記載の方法。
- 前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項36に記載の方法。
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、請求項25に記載のキャピラリー電気泳動要素を用いたキャピラリー電気泳動によって、該分析物を分離する工程を包含する、方法。
- 複数のキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項39に記載の方法。
- 前記キャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記キャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項40に記載の方法。
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための方法であって、該方法は、以下:
第一端部および第二端部を有するコーティングされていないキャピラリーに、組成物を挿入する工程であり、該組成物は、約1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分、ならびに、N,N−二置換ポリアクリルアミドおよびN−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される1種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分を含有し、ここで、該N−置換基は、C1〜C3アルキル、ハロ置換のC1〜C3アルキル、メトキシ置換のC1〜C3アルキル、およびヒドロキシル置換のC1〜C3アルキルからなる群より選択され;ここで、該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり;ここで、該組成物が架橋ポリマーゲルを含まない、工程;
異なるサイズの分析物のサンプルを該キャピラリーに充填する工程;ならびに、
該サンプル中の該異なるサイズの分析物が該キャピラリーを通って移動するように、該キャピラリーの該第一端部と該第二端部との間に電場を印加し、それによって該分析物を分離する、工程、
を包含する、方法。 - 前記組成物が、少なくとも1種の変性剤をさらに含有する、請求項43に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の変性剤が尿素である、請求項44に記載の方法。
- 前記表面相互作用の非架橋ポリマーが、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)である、請求項43に記載の方法。
- 複数のコーティングされていないキャピラリーを用いて並列に行われる、請求項43に記載の方法。
- 前記コーティングされていないキャピラリーが、シリカ、縮合シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス、リン酸塩ガラス、またはアルミナ含有ガラスを含む、請求項47に記載の方法。
- 前記コーティングされていないキャピラリーがプラスチック基板を含む、請求項47に記載の方法。
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットであって、該キットは、組成物を備え、該組成物は、以下:
約1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有し、かつ1000センチポイズ未満の粘度を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分;ならびに、
N,N−二置換ポリアクリルアミドおよびN−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される1種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分であって、ここで、該N−置換基が、C1〜C3アルキル、ハロ置換のC1〜C3アルキル、メトキシ置換のC1〜C3アルキル、およびヒドロキシル置換のC1〜C3アルキルからなる群より選択される、表面相互作用成分;
を含有し、ここで、該シービング成分および該表面相互作用成分が同じかまたは異なり;ここで、該組成物が架橋剤を含まない、キット。 - キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するためのキットであって、該キットは、組成物を備え、該組成物は、約1,000,000Daと3,000,000Daとの間の分子量を有し、かつ25℃にて1000センチポイズ未満の粘度を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分を含有し、ここで、該組成物が架橋ポリマーゲルを含有しない、キット。
- 請求項51に記載のキットであって、N,N−二置換ポリアクリルアミドおよびN−置換ポリアクリルアミドからなる群より選択される1種以上の非架橋ポリマーを含有する、表面相互作用成分をさらに備え、ここで、該N−置換基が、C1〜C3アルキル、ハロ置換のC1〜C3アルキル、メトキシ置換のC1〜C3アルキル、およびヒドロキシル置換のC1〜C3アルキルからなる群より選択される、キット。
- 前記表面相互作用成分が、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)である、請求項52に記載のキット。
- 少なくとも1種のホルムアミド、尿素、および2−ピロリジノンからなる群より選択される少なくとも1種の変性剤をさらに備える、請求項53に記載のキット。
- 前記少なくとも1種の変性剤が尿素である、請求項54に記載のキット。
- キャピラリー電気泳動によって分析物を分離するための組成物であって、約1,000,000ダルトン(Da)と3,000,000Daとの間の分子量を有する非架橋アクリルアミドポリマーを含有する、シービング成分を含有し、該組成物は、架橋ポリマーゲルを含有しない、組成物。
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