JP2004508340A - HLA binding peptides and methods of use - Google Patents

Abstract

The present invention provides peptide compositions that can specifically bind to a selected MHC allele and induce T cell activation in T cells restricted by the MHC allele. The present peptides are useful for eliciting an immune response against a desired antigen.

Description

Ｂ． ＤｕＰｏｎｔ、「ＨＬＡの免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＬＡ）」、１巻、組織適合性試験（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ） １９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク１９８９から列挙した表。
＊Ｎ−黒人種、Ａ＝アジア人種、Ｃ＝白人種。括弧内の数字は分析の対象とした個体数を示す。
【００２８】
ペプチド化合物を記載するために使用する命名法は、従来の方法に従い、アミノ基を各アミノ酸残基の左側（Ｎ末端）に、カルボキシル基を右側（Ｃ末端）に示す。本発明の選択された具体的な態様を示す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、具体的には示していないが、特に明記しない限り、生理的なｐＨ値において取ると思われる形態で存在する。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に、標準的な３文字表記または１文字表記で表される。Ｌ型のアミノ酸残基は大文字１文字または３文字記号の最初の大文字で表され、Ｄ型のそのようなアミノ酸は小文字１文字または小文字３文字記号で表される。グリシンは非対称炭素原子がなく、単純に「Ｇｌｙ」またはＧと呼ばれる。
【００２９】
本発明のペプチドを同定するために使用される手法は、一般に、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ， ３５１：２９０（１９９１）に開示されている方法に準拠し、これは参照として本明細書に組み入れられる。簡単に説明すると、この方法は、適当な細胞または細胞系統から、典型的には、免疫沈降または親和性クロマトグラフィーによってＭＨＣクラスＩ分子を大規模単離することを含む。当業者に同じく既知の所望のＭＨＣ分子を単離するための他の方法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速リガンドクロマトグラフィーおよび上記技術全ての組み合わせが挙げられる。
【００３０】
規定のＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子を有する細胞は数多く知られており、容易に入手可能である。例えば、ヒトＥＢＶ−形質転換したＢ細胞系統は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子の分取的単離の優れた供給源であることが示されている。十分に特徴付けられた細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「細胞系統およびハイブリドーマのカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」、第６版（１９８８） メリーランド州ロックビル、米国）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９０／１９９１ 細胞系統のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）（ＮＩＧＭＳ） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ニュージャージー州カンデン；およびＡＳＨＩ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， Ｂｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ７５ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｔｒｅｅｔ Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ ０２１１５などの個人的および市販の供給元から入手可能である。表２は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の供給源として使用するのに好適なＢ細胞系統をいくつか列挙する。これらの細胞系統は全て大規模バッチで増殖させることができるので、ＭＨＣ分子の大規模産生に有用である。当業者は、これらは単に例示的にすぎない細胞系統であること、および多数の他の細胞起源を使用することができることを認識している。ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの同型接合体である同様のＥＢＶ Ｂ細胞系統は、それぞれＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子起源として働くと思われる。
【００３１】
【表２】ヒト細胞系統（ＬＩＬＡ−Ａ起源）

【００３２】
典型的な場合には、所望の対立遺伝子を単離するために免疫沈降を使用する。使用する抗体の特異性に依存して、数多くのプロトコールを使用することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ分子を親和性精製するために、対立遺伝子特異的ｍＡｂ試薬を使用することができる。ＨＬＡ−Ａ分子を単離するためのｍＡｂ試薬はいくつか入手可能である（表３）。従って、標的とするＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の各々について、ＨＬＡ−Ａ分子を直接単離するために使用することができる試薬が入手可能である。標準的な技術を使用してこれらのｍＡｂを用いて調製される親和性カラムをうまく使用して、それぞれのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精製する。
【００３３】
以下の実施例のセクションに記載されているように、対立遺伝子−特異的なｍＡｂ以外に、Ｗ６／３２およびＢ９．１２．１などの反応性の広い抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ ｍＡｂ並びに１つの抗ＨＬＡ−Ｂ、Ｃ ｍＡｂ、Ｂ１．２３．２を別の親和性精製プロトコールに使用してもよい。
【００３４】
【表３】抗体試薬

【００３５】
単離されたＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したペプチドは、典型的には、酸処理を使用して溶出される。ペプチドはまた、加熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピック剤、またはそれらの組み合わせなどの種々の標準的な変性手段によってクラスＩ分子から解離させることができる。
【００３６】
ペプチド分画は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＭＨＣ分子からさらに分離され、配列が決定される。ろ過、限外ろ過、電気泳動、サイズクロマトグラフィー、特異的な抗体による沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画電気泳動法等を含む、当業者に既知の他の種々の標準的な手段によってペプチドを分離することができる。
【００３７】
単離したペプチドの配列決定は、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ， Ｍ． Ｗ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９１， ３９９ （１９８３））などの標準的な技術により実施することができる。配列決定するのに好適な他の方法には、以前に記載されている個々のペプチドの質量分析法による配列決定が挙げられる（参照として本明細書に組み入れられている、Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２５： １２６１ （１９９２））。異なるクラスＩ分子からバルク状の不均質なペプチドのアミノ酸配列決定すると（例えば、プールされたＨＰＬＣ分画）、典型的には、各クラスＩ対立遺伝子の特徴的な配列モチーフが明らかにされる。
【００３８】
異なるクラスＩ対立遺伝子に特異的なモチーフが規定されると、そのアミノ酸配列が既知である抗原タンパク質からペプチドエピトープの可能性を有するものを単離することができる。典型的には、ペプチドエピトープの可能性を有するものの同定は、最初に、モチーフの存在について所望の抗原のアミノ酸配列をスキャンするためのコンピュータを使用して実施される。次いで、エピトープ配列を合成する。ＭＨＣクラス分子に結合する能力を種々の異なる方法で測定する。１つの手段は、例えば、上記の関連する用途に記載されているクラスＩ分子結合アッセイ法である。文献に記載されている別法には、抗原提示の阻害（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４１： ３８９３ （１９９１））、インビトロアセンブリーアッセイ法（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ， ６２： ２８５ （１９９０））およびＲＭＡ．Ｓなどの変異細胞を使用するＦＡＣＳに基づいたアッセイ法（Ｍｅｌｉｅｆら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１： ２９６３ （１９９１））が挙げられる。
【００３９】
次に、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示すペプチドを、インビトロにおいて特異的なＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力についてアッセイする。例えば、ペプチドと共にインキュベーションされた抗原提示細胞を、応答細胞集団におけるＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイすることができる。抗原提示細胞は末梢血液単核細胞または樹状細胞などの正常な細胞であってもよい（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６６： １８２（１９８７）、Ｂｏｏｇ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １８： ２１９ （１９８８））。
【００４０】
または、インビトロにおける一次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力を試験するために、ペプチドを添加する場合には、マウス細胞系統ＲＭＡ−Ｓ（Ｋａｒｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１９： ６７５ （１９８６）；Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１： ２９６３−２９７０ （１９９１））およびヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｔ−２（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ， ３４５： ４４９−４５２（１９９０））などの、内部的に処理されたペプチドを有するクラスＩ分子を負荷する能力が欠損し、適当なヒトクラスＩ遺伝子がトランスフェクトされている突然変異哺乳類細胞系統が便利に使用される。使用可能な他の真核細胞系統には、蚊の幼虫（ＡＴＣＣ 細胞系統 １２５， １２６， １６６０， １５９１， ６５８５， ６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨトウムシ（ａｒｍｙｗｏｒｍ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）およびシュナイダー細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈｏｌ．， ２７： ３５３−３６５［１９２７］）などのショウジョウバエ細胞系統などの種々の昆虫細胞系統が挙げられる。それは、適当なヒトクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子をコードする遺伝子およびヒトＢ２マイクログロブリン遺伝子でトランスフェクトされている。
【００４１】
末梢血リンパ球は、便利なことに、正常なドナーまたは患者の単純な静脈穿刺または白血球分離により単離され、ＣＴＬ前駆体の応答細胞起源として使用される。一態様において、適当な抗原提示細胞を、適当な培養条件下において無血清培地で１０〜１００μＭのペプチドと共に４時間インキュベーションする。次いで、ペプチド負荷した抗原提示細胞を、最適な培養条件下において応答細胞集団と共にインビトロにおいて７〜１０日間インキュベーションする。放射性標識した標的細胞を死滅させるＣＴＬの存在、特異的なペプチド−パルス標識した（ｐｕｌｓｅｄ）標的並びにペプチド配列を誘導する関連ウィルスまたは腫瘍抗原の内因的に処理された形態を発現する標的細胞について、培養物をアッセイすることによって陽性のＣＴＬ活性化を測定することができる。
【００４２】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ制限性は、適当または不適当なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対して試験することによって測定される。ＭＨＣ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示し、特異的なＣＴＬ応答を生じるペプチドは本明細書において免疫原性ペプチドと呼ぶ。
【００４３】
免疫原性ペプチドは合成もしくは組換えＤＮＡ技術によって作製することも、またはウィルス全体または腫瘍などの天然起源から単離することもできる。ペプチドは、好ましくは、他の天然型宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様では、ペプチドを未変性の断片または粒子に合成により結合させることもある。ポリペプチドまたはペプチドは種々の鎖長であっても、中性（非荷電）の形態または塩である形態であってもよく、グリコシル化、側鎖の酸化もしくはリン酸化などの改変を含有しなくても、または本明細書に記載するように改変がポリペプチドの生物学的活性を破壊しない状態を条件としてこれらの改変を含有してもよい。
【００４４】
望ましくは、大型のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持する限りは、ペプチドは可能な限り小型であると考えられる。可能な場合には、本発明のペプチドを鎖長９または１０のアミノ酸残基、ＣＣＬ １２５、１２６、１６６０、１５９１、６５８５， ６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨトウムシ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）およびシュナイダー細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈｏｌ．， ２７： ３５３−３６５ （１９２７）参照）などのショウジョウバエ細胞系統に最適化することが望ましいことがある。それは、適当なヒトクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子をコードする遺伝子およびヒトＢ２マイクログロブリン遺伝子でトランスフェクトされている。
【００４５】
末梢血リンパ球は、便利なことに、正常なドナーまたは患者の単純な静脈穿刺または白血球分離により単離され、ＣＴＬ前駆体の応答細胞起源として使用される。一態様において、適当な抗原提示細胞を、適当な培養条件下において無血清培地で１０〜１００μＭのペプチドと共に４時間インキュベーションする。次いで、ペプチド負荷した抗原提示細胞を、最適な培養条件下において応答細胞集団と共にインビトロにおいて７〜１０日間インキュベーションする。放射性標識した標的細胞を死滅させるＣＴＬの存在、特異的なペプチド−パルス標識した（ｐｕｌｓｅｄ）標的並びにペプチド配列を誘導する関連ウィルスまたは腫瘍抗原の内因的に処理された形態を発現する標的細胞について、培養物をアッセイすることによって陽性のＣＴＬ活性化を測定することができる。
【００４６】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ制限性は、適当または不適当なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対して試験することによって測定される。ＭＨＣ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示し、特異的なＣＴＬ応答を生じるペプチドは本明細書において免疫原性ペプチドと呼ぶ。
【００４７】
免疫原性ペプチドは合成もしくは組換えＤＮＡ技術によって作製することも、またはウィルス全体または腫瘍などの天然起源から単離することもできる。ペプチドは、好ましくは、他の天然型宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様では、ペプチドを未変性の断片または粒子に合成により結合させることもある。ポリペプチドまたはペプチドは種々の鎖長であっても、中性（非荷電）の形態または塩である形態であってもよく、グリコシル化、側鎖の酸化もしくはリン酸化などの改変を含有しなくても、または本明細書に記載するように改変がポリペプチドの生物学的活性を破壊しない状態を条件としてこれらの改変を含有してもよい。
【００４８】
望ましくは、大型のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持する限りは、ペプチドは可能な限り小型であると考えられる。可能な場合には、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子に結合する内因的に処理されたウィルスペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが同じである、鎖長９または１０のアミノ酸残基に本発明のペプチドを最適化することが望ましいことがある。
【００４９】
所望の活性を有するペプチドは、適宜、改変して、ある種の所望の特性を提供することができる、例えば、薬理学的な特性が改善されるが、所望のＭＨＣ分子に結合し、適当なＴ細胞を活性化する未改変ペプチドの生物学的活性の実質的に全てを増加または少なくとも維持する。例えば、ペプチドに保存的はまた非保存的置換などの種々の変化を実施することができ、この場合には、このような変化は、ＭＨＣ結合の改善などの使用時の利点を提供すると思われる。保存的置換は、アミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似した別のアミノ酸残基と置換する、例えば、疎水性残基を別の疎水性残基と置換し、または極性残基を別の極性残基と置換することを意味する。置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせが挙げられる。１つのアミノ酸置換の影響はまた、Ｄ−アミノ酸を使用して探索することができる。このような改変は、例えば、参照として本明細書に組み入れられているＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３２： ３４１−３４７（１９８６）、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， 「ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」， ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編（Ｎ．Ｙ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． １−２８４（１９７９）；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ， 「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．， Ｐｉｅｒｃｅ）， 第２版（１９８４）に記載されているように、既知のペプチド合成手法を使用して実施することができる。
【００５０】
ペプチドは、例えば、アミノ酸の付加または欠損によって、化合物のアミノ酸配列を伸長または減少することによっても改変することができる。本発明のペプチドまたは類似物はある種の残基の順序または組成を変更することによっても改変することができ、例えば、重要な接触部位におけるものまたは保存された残基のような、生物学的活性に必須なある種のアミノ酸残基は、生物学的活性に有害な影響を与えない限り、一般に変更しなくてもよいことは容易に理解される。重要でないアミノ酸はＬ−α−アミノ酸またはそれらのＤ−異性体などのタンパク質に天然に生ずるものに限られる必要はなく、β−γ−δ−アミノ酸およびＬ−α−アミノ酸の多数の誘導体などの非天然型アミノ酸を同様に含んでもよい。
【００５１】
典型的には、１つのアミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用して、結合に対する静電荷、疎水性等の影響を求める。例えば、一連の正電荷（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負電荷（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換はペプチド鎖に実施され、種々のＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体に対する感受性の異なるパターンを明らかにする。また、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏまたは同様の残基などの小型で比較的中性の部分を使用する多重置換を使用することができる。置換はホモ−オリゴマーまたはヘテロ−オリゴマーであってもよい。置換または付加される残基の数および種類は、必須の接触点の間に必要な空間および検討されるある種の機能的特質（例えば、疎水性および親水性）に依存する。親ペプチドの親和性と比較したとき、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する高い結合親和性もこのような置換によって達成することができる。任意の事象において、このような置換は、結合を妨害する可能性のある、例えば、立体障害および荷電障害を回避するために選択されるアミノ酸残基または他の分子断片を使用するべきである。
【００５２】
アミノ酸置換は典型的には、１残基である。置換、欠損、挿入または任意のそれらの組み合わせを組み合わせて、最終的なペプチドに到達することができる。置換種は、ペプチドの少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入されるものである。ペプチドの特徴を微妙に調節することが望ましい場合には、このような置換は、一般に、以下の表４により実施される。
【００５３】
【表４】

【００５４】
機能の実質的な変化（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する親和性）は、表４のものより保存性の低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス立体配座のような、置換領域のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさばりを維持することに対する影響がより大きく異なる残基を選択することによって実施される。ペプチドの特性の最も大きな変化を生ずることが期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルから（または、によって）置換される、（ｂ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニルもしくはヒスチジルが負電荷残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルから（または、によって）置換される、または（ｃ）かさの高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖のないもの、例えば、グリシンから（または、によって）置換されるものである。
【００５５】
ペプチドは、免疫原性ペプチド中に２つまたはそれ以上の残基の同配体を含んでもよい。本明細書において規定する同配体は、第１の配列の立体配座は第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列と置換することができる２つまたはそれ以上の残基の配列である。この用語は、具体的には、当業者に既知のペプチド骨格改変を含む。このような改変は、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニルの改変、アミド結合の完全な置換、伸長、欠損または骨格架橋を含む。一般に、Ｓｐａｔｏｌａ， 「アミノ酸、ペプチド、およびタンパク質の化学および生化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」 ＶＩＩ巻（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、１９８３）参照のこと。
【００５６】
種々のアミノ酸模倣物または非天然型アミノ酸によるペプチドの改変は、インビトロにおけるペプチドの安定性を増加する上で特に有用である。安定性は、多数の方法によりアッセイされる。例えば、ペプチダーゼ並びにヒト血漿および血清などの種々の生物学的媒体は安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ， １１： ２９１−３０２ （１９８６）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は、便利なことに、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイ法を使用して決定される。プロトコールは、一般に、以下のようである。ヒトプール血清（ＡＢ型、非加熱不活性化）を使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清をＲＰＭＩ組織培養培地で希釈して、ペプチドの安定性を試験するために使用する。所与の時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％のトリクロロ酢酸またはエタノールに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却し（４℃）、次いで遠心して、沈降した血清タンパク質をペレット化する。次いで、安定性−特異性クロマトグラフィー条件を使用して、ペプチドの存在を逆相ＨＰＬＣによって測定する。
【００５７】
ＣＴＬ刺激活性を有する本発明のペプチドまたはそれらの類似物を改変して、血清半減期の改善以外の所望の特質を提供することができる。例えば、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列に結合することによって、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を増強することができる。特に好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー複合体にはスペーサー分子が結合している。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下において実質的に非荷電であるアミノ酸またはアミノ酸模倣物などの比較的小型で中性の分子を含む。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙまたは非極性アミノ酸もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。必要に応じて存在するスペーサーは同一の残基を含む必要がなく、従ってヘテロ−またはホモ−オリゴマーであってもよいことが理解される。存在する場合には、スペーサーは、通常は、少なくとも１残基または２残基であり、さらに通常は、３〜６残基である。または、ＣＴＬペプチドは、スペーサーなしで、Ｔヘルパーペプチドに結合してもよい。
【００５８】
免疫原性ペプチドは、直接またはＣＴＬペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のスペーサーを介してＴヘルパーペプチドに結合することができる。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのアミノ末端はアシル化されてもよい。
【００５９】
ある態様では、ＣＴＬを抗原刺激する際に助力となる少なくとも１つの成分を本発明の薬学的組成物中に含むことが望ましいことがある。脂質は、ウィルス抗原に対するインビトロにおけるＣＴＬの抗原刺激を助力することができる物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基のαおよびεアミノ基に結合することができ、次いでＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等などの１つ以上の結合残基を介して免疫原性ペプチドに結合される。次いで、脂質を結合したペプチドをミセル形態で直接注射しても、リポソームに導入しても、例えば、フロイントの不完全アジュバントのようなアジュバントの形態に乳化してもよい。好ましい態様において、特に有効な免疫原は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に、Ｓｅｒ−Ｓｅｒのような結合を介して結合している、Ｌｙｓのαおよびεアミノ基に結合したパルミチン酸を含む。
【００６０】
ＣＴＬ応答の脂質抗原刺激の別の例として、適当なペプチドに共有結合している場合には、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（_ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）リポタンパク質を使用して、ウィルス特異的ＣＴＬを抗原刺激することができる。参照として本明細書に組み入れられているＤｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ， ３４２： ５６１−５６４ （１９８９）を参照のこと。本発明のペプチドを例えば、_ｐ３ＣＳＳに結合し、リポペプチドを個体に投与して、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に抗原刺激することができる。さらに、中和抗体の誘導も、適当なエピトープを示すペプチドに結合した_ｐ３ＣＳＳで抗原刺激することができるので、２つの組成物を組み合わせて、感染に対する液性および細胞性応答をさらに効果的に誘導することができる。
【００６１】
また、追加のアミノ酸をペプチドの末端に付加して、担体の支持体に結合するために、ペプチドの互いの結合を容易にするか、またはペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的特性を改良するためにより長いペプチドとの結合を容易にする等が可能である。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸等などのアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入することができる。いくつかの場合には、Ｃ末端の改変がペプチドの結合特性を変更することがある。また、末端−ＮＨ_２アシル化、例えば、アルカノイル（Ｃ_１〜Ｃ_２０）またはチオグリコリルアセチル化、末端−カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミン等によって改変されることによって、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は天然の配列と異なることがある。いくつかの場合において、これらの改変は、支持体または他の分子に結合する部位を提供することができる。
【００６２】
本発明のペプチドは多種多様の方法で作製することができる。ペプチドは、サイズが比較的短いので、従来の技術により溶液中または固相支持体上で合成することができる。種々の自動合成装置を購入可能であり、既知のプロトコールにより使用することができる。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． （１９８４）、上記参照。
【００６３】
または、関心対象の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現に好適な条件下において培養する組換えＤＮＡ技術を使用することができる。参照として本明細書に組み入れられているＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に一般に記載されているように、これらの手法は一般に当技術分野において既知である。従って、本発明の１つまたは複数のペプチド配列を含む融合タンパク質を使用して、適当なＴ細胞エピトープを発現することができる。
【００６４】
本明細書において考慮される鎖長のペプチドのコード配列は、化学的技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０３： ３１８５（１９８１）のホスホトリエステル方法によって合成することができるので、適当な塩基を、未変性のペプチド配列をコードするものと置換することによって改変を簡単に実施することができる。次いで、コード配列に適当なリンカーを提供し、当技術分野において通常入手可能な発現ベクターにライゲーションし、そのベクターを使用して、所望の融合タンパク質を作製するために好適な宿主を形質転換することができる。現在、このようなベクターおよび好適な宿主系は数多く入手可能である。融合タンパク質を発現させるためには、機能的に結合した開始コドンおよび停止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、並びに通常複製系をコード配列に提供して、望ましい細胞宿主中で発現させるための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列を、所望のコード配列を挿入するための便利な制限酵素切断部位を含有するプラスミドに提供する。得られた発現ベクターを好適な細菌宿主に形質転換する。当然のことながら、好適なベクターおよび制御配列を使用して、酵母または哺乳類細胞宿主を使用することもできる。
【００６５】
本発明のペプチド、並びにそれらの薬学的組成物およびワクチン組成物は、ウィルス感染症および癌を治療および／または予防するために、哺乳類、特にヒトに投与するのに有用である。本発明の免疫原性ペプチドを使用して治療することができる疾患の例には、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、腎臓癌、子宮頸癌、リンパ腫、ＣＭＶ、および尖圭コンジロームが挙げられる。
【００６６】
薬学的組成物については、本発明の免疫原性ペプチドを、すでに癌に罹患している個体または関心対象のウィルスに感染している個体に投与する。潜伏期の個体または感染の急性期の個体は、適宜、別個にまたは他の治療法と併用して免疫原性ペプチドで治療することができる。治療的用途では、ウィルスまたは腫瘍抗原に対する効果的なＣＴＬ応答を誘導し、症状および／または合併症を治癒または少なくとも一部阻止するのに十分な量の組成物を患者に投与する。これを実施するのに十分な量は、「治療的に有効な用量」として規定される。このように使用するのに有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与方法、被治療疾患の病期および重症度、患者の体重および全身の健康状態、並びに処方する医師の判断に依存するが、一般に初回免疫では（すなわち、治療的または予防的投与のため）、７０ｋｇの患者に対して約１．０μｇ〜約５０００μｇのペプチドを投与し、次に患者の血液中の特異的なＣＴＬ活性を測定することによって、患者の応答および状態に応じて、数週間〜数ヶ月にわたって追加免疫投与療法に従って、約１．０μｇ〜約１０００μｇのペプチドを追加免疫投与する。本発明のペプチドおよび組成物は、一般に、重篤な疾患状態、すなわち、生命を脅かすか、または生命を脅かす可能性のある状況に使用することができることを留意するべきである。このような症例では、外来物質が最小であることおよびペプチドが比較的低毒性であることを考慮すると、実質的に過剰量のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、望ましいと治療医が考えることがある。
【００６７】
治療的用途では、ウィルス感染症の最初の徴候が出現した時、または腫瘍検出時もしくは外科的切除時、急性感染症の症例では診断直後に投与を開始するべきである。この次に、少なくとも症状が実質的に軽減するまで、およびその後の期間にわたって追加免疫投与する。慢性感染症では、初回負荷投与、次に追加免疫投与が必要になることがある。
【００６８】
本発明の組成物による感染個体の治療は、急性感染個体では感染症の消炎を早めることができる。慢性感染症を発症しやすい（または、発症する素因のある）個体では、本発明の組成物は、急性から慢性感染症への移行を予防する方法において特に有用である。例えば、本明細書に記載されているように、罹患しやすい個体が感染前または感染時に同定される場合には、本発明の組成物をそのような個体に標的化することができ、大集団に投与する必要性を小さくすることができる。
【００６９】
本発明のペプチド組成物は、慢性感染症を治療するため、および免疫系を刺激して保菌者のウィルス感染細胞を排除するためにも使用することができる。細胞障害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分な量の免疫賦活ペプチドを製剤および投与様式に提供することは重要である。従って、慢性感染症を治療するためには、代表的な用量は、７０ｋｇの患者の投与あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇ、好ましくは約５μｇ〜１０００μｇの範囲である。個体を効果的に免疫化するためには、免疫投与の次におそらく長期間にわたって一定の期間、例えば、１〜４週間追加免疫投与が必要になることがある。慢性感染症の症例では、少なくとも臨床症状または臨床試験が、ウィルス感染が排除されたか、または実質的に軽減されたことを示すまで、およびその後の期間も投与を継続するべきである。
【００７０】
治療的治療のための薬学的組成物は、非経口、局所、経口、または局部的投与が意図されている。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与される。従って、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁させた免疫原性ペプチド溶液を含む非経口投与用組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝液、０．９％食塩液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は、従来の既知の滅菌技術で滅菌されても、またはろ過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままの使用または凍結乾燥して使用するように包装してもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液と組み合わせる。本発明の組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等などの適当な生理的条件に必要な薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
【００７１】
薬学的製剤中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は大きく、すなわち、約０．１重量パーセント未満から、通常約２重量パーセントまたは少なくとも約２重量パーセント、２０重量パーセント〜５０重量パーセント以上まで異なってもよく、選択した特定の投与様式により体液の容量、粘性等によって主に選択される。
【００７２】
本発明のペプチドはまた、リンパ組織などの特定の細胞組織にペプチドを標的化する、リポソームにより投与することもできる。リポソームはまた、ペプチドの半減期を延長する上でも有用である。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、層状の層等が挙げられる。これらの製剤において、送達されるペプチドは、単独で、または例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などのリンパ系細胞に多く見られる受容体に結合する分子または他の治療的組成物もしくは免疫原性組成物と併用して、リポソームの一部として組み入れられる。従って、本発明の所望のペプチドを充填したリポソームをリンパ系細胞部位に誘導することができ、リポソームは選択された治療的／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明に使用するためのリポソームは、一般に、中性および負荷電のリン脂質並びにコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般に、血流中の例えば、リポソームシュー（ｓｕｅ）、酸不安定性、およびリポソームの安定性を考慮することによって誘導される。参照として本明細書に組み入れられている、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９： ４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、リポソームを作製するために種々の方法を利用可能である。
【００７３】
免疫細胞を標的化するためには、リポソームに組み入れるリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体またはその断片を含んでもよい。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、特に投与方法、送達されるペプチド、および被治療疾患の病期により様々な用量で、静脈内、局部的に、局所的等で投与することができる。
【００７４】
固形組成物では、例えば、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウム等を含む従来の無毒性固形担体を使用することができる。経口投与では、以前に掲載したような担体などの通常使用される賦形剤のいずれかを、一般に作用成分、すなわち、本発明の１つまたは複数のペプチドの１０％〜９５％、さらに好ましくは２５％〜７５％の濃度で組み入れることによって、薬学的に許容される無毒性の組成物が形成される。
【００７５】
エアゾール投与では、免疫原性ペプチドは、好ましくは、細粒化された形態で、界面活性剤および噴射剤と共に供給される。ペプチドの典型的な割合は０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。界面活性剤は、当然のことながら、無毒性でなければならず、好ましくは噴射剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有するカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸（ｓｔｅａｍｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸、リノレン酸、オレステリック−アシッド（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸などの炭素原子数６〜２２個の脂肪酸のエステルまたは部分的なエステルである。混合または天然グリセリドなどの混合エステルを使用することができる。界面活性剤は組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５％〜５％を構成してもよい。組成物の平衡は通常推進的である。例えば、鼻腔内送達のためのレシチンの場合と同様に、望ましい場合には、担体を含めることができる。
【００７６】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載する免疫原性ペプチドの免疫学的に有効な量を作用成分として含有する。ペプチドは、それ自身の担体に結合して、または活性なペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主に導入することができる。このようなポリマーは、免疫学的反応が高いという利点を有し、また、異なるペプチドを使用してポリマーを作製する場合には、ウィルスまたは腫瘍細胞の異なる抗原決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導する追加の能力という利点を有する。有用な担体は当技術分野において既知であり、例えば、サイログロブリン、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウィルス組換えワクチン等を含む。ワクチンはまた、水、リン酸緩衝食塩液、または食塩液などの生理学的に耐えられる（許容される）希釈剤を含有してもよく、典型的には、アジュバントをさらに含んでもよい。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンなどのアジュバントは当技術分野に既知の物質である。また、上記のように、本発明のペプチドをＰ_３ＣＳＳなどの脂質に結合することによってＣＴＬ応答を刺激することができる。本明細書に記載したようにペプチド組成物で、注射、エアゾール、経口、経皮、または他の経路により免疫化すると、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答し、宿主は後の感染に対して少なくとも部分的に免疫を有するか、または慢性感染症を発症しない。
【００７７】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、抗原に対する免疫応答を誘発し、患者自身の免疫応答能力を増強するために、ウィルス感染または癌に罹患しやすい患者またはそのリスクのある患者に投与される。このような量は、「免疫学的に有効な用量」と規定される。このように使用する際にも、正確な量は患者の健康状態および体重、投与様式、製剤の性質等に依存するが、一般に７０キログラムの患者あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇの範囲であり、さらに通常は体重７０ｋｇあたり約１０μｇ〜約５００μｇ ｍｇの範囲である。
【００７８】
いくつかの例において、本発明のペプチドワクチンを、関心対象のウィルス、特にウィルスの外被抗原に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。
【００７９】
治療的目的または免疫目的のためには、本発明のペプチドの１つまたは複数をコードする核酸を患者に投与することもできる。患者に核酸を送達するために、数多くの方法が便利なことに使用される。例えば、核酸を「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。この方法は、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １４６５−１４６８ （１９９０）、並びに米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号に記載されている。例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているように、弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して、核酸を投与することもできる。ＤＮＡのみを含む粒子を投与してもよい。または、ＤＮＡを金粒子などの粒子に接着してもよい。核酸はまた、陽イオン脂質などの陽イオン化合物と複合体を形成して送達することもできる。脂質を介する遺伝子送達方法は、例えば、国際公開公報第９６／１８３７２号、国際公開公報第９３／２４６４０号、ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｒｅｒｉｔｅ （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９１、Ｒｏｓｅの米国特許第５，２７９，８３３号、国際公開公報第９１／０６３０９号、およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−７４１４に記載されている。本発明のペプチドはまた、ワクシニアまたは鶏痘などの弱毒化ウィルス宿主によっても発現させることができる。本発明の方法は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてワクシニアウィルスを使用することを含む。急性もしくは慢性感染宿主または非感染宿主に導入すると、組換えワクシニアウィルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主ＣＴＬ応答を誘導する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、参照として本明細書に組み入れられている米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌：Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、参照として本明細書に組み入れられている、Ｓｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３５１： ４５６−４６０ （１９９１））に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター等は本明細書の説明から当業者に明らかになると思われる。
【００８０】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段では、本発明の多重エピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞において発現させるために選択されたＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。ヒトコドン利用表を使用して、各アミノ酸のコドン選択をガイドする。これらのエピトープ−コードＤＮＡ配列を直接隣接させて、連続ポリペプチド配列を作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、追加の要素をミニ遺伝子デザインに組み入れてもよい。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めてもよいアミノ酸配列の例には、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体保持シグナルが挙げられる。また、ＣＴＬエピトープに隣接する合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然型隣接配列を含めることによって、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ発現を改善することができる。
【００８１】
ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを集成することによって、ミニ遺伝子配列をＤＮＡに変換する。既知の技術を使用して、適当な条件下において、重複オリゴヌクレオチド（鎖長３０〜１００塩基）を合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、オリゴヌクレオチドの末端が接続される。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで所望の発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８２】
当業者に既知の標準的な調節配列をベクターに挿入して、標的細胞において確実に発現させる。いくつかのベクター要素が必要とされる：ミニ遺伝子挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター、効率的な転写停止のためのポリアデニル化シグナル、大腸菌複製開始点、および大腸菌選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。例えば、ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）プロモーターのような数多くのプロモーターを本発明の目的のために使用することができる。他の好適なプロモーター配列は、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【００８３】
ミニ遺伝子発現および免疫原性を最適化するために、追加のベクター改変が望ましいことがある。いくつかの場合において、イントロンは効率的な遺伝子発現のために必要とされ、１つまたは複数の合成または天然型イントロンがミニ遺伝子の転写領域に組み込まれてもよい。ミニ遺伝子発現を増加するためにｍＲＮＡ安定化配列の挿入を考慮することもできる。免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性に役割を果たしていることが最近提案されている。これらの配列は、免疫原性を増強することが判明している場合には、ベクターのミニ遺伝子コード配列の外側に挿入されてもよい。
【００８４】
いくつかの態様において、ミニ遺伝子がコードするエピトープの産生を可能にするためのバイシストロン性発現ベクターおよび免疫原性を増強または低下させるために挿入される第２のタンパク質を使用することができる。同時発現される場合に、免疫応答を有用に増強すると思われるタンパク質またはポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、または共刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルに結合して、ＣＴＬエピトープとは別個に発現してもよい。こうすることにより、ＨＴＬエピトープを、ＣＴＬエピトープとは別の細胞コンパートメントに誘導することができる。必要な場合には、これにより、ＨＴＬエピトープがＭＨＣクラスＩＩ経路にさらに効率的に流入しやすくなり、それによってＣＴＬ誘導を改善すると思われる。ＣＴＬ誘導とは異なり、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に低下させることは、ある種の疾患に恩典を有することがある。
【００８５】
発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子が、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドを適当な大腸菌株に形質転換し、標準的な技術を使用してＤＮＡを作製する。制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して、ミニ遺伝子の配向およびＤＮＡ配列、並びにベクターに含まれる他の全ての要素を確認する。適切なプラスミドを保有する細菌細胞を、マスター細胞バンクおよび検討用細胞バンクとして保管することができる。
【００８６】
治療量のプラスミドＤＮＡは、大腸菌における発酵、それに続く精製によって作製される。検討用の細胞バンクのアリコートを使用して、（テリフィック培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）などの）発酵培地に接種し、既知の技術により振とうフラスコまたはバイオリアクターで飽和するまで増殖する。キアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって供給される固相陰イオン交換樹脂などの標準的な生物分離技術を使用して、プラスミドＤＮＡを精製することができる。必要な場合には、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、超コイルＤＮＡを開環状体および直鎖状体から単離することができる。
【００８７】
種々の製剤を使用して、精製プラスミドＤＮＡを注射用に製剤化することができる。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で凍結乾燥したＤＮＡを溶解することである。種々の方法が記載されており、新規な技術が利用可能になることもある。上記のように、核酸は、便利なことに、陽イオン脂質を用いて製剤化される。また、糖脂質、フソゲンリポソーム、ペプチドおよび集合的に保護的、対話的、非凝縮（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ， ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ， ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）（ＰＩＮＣ）と呼ばれる化合物を精製プラスミドＤＮＡと複合体化し、安定性、筋肉内分散または特異的な器官もしくは細胞種との相互作用（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）などの変数に影響を与えてもよい。
【００８８】
標的細胞感受性を、ミニ遺伝子がコードするＣＴＬエピトープの発現およびＭＨＣクラスＩ発現の機能的アッセイ法として使用することができる。標準的なＣＴＬクロム放出アッセイ法の標的として好適である哺乳類細胞系統にプラスミドＤＮＡを導入する。使用するトランスフェクション方法は、最終的な製剤に依存する。エレクトロポレーションは「裸の」ＤＮＡに使用することができるが、陽イオン脂質はインビトロにおけるトランスフェクションに向けることができる。緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトした細胞を濃縮することができる。次いで、これらの細胞をクロム−５１標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ系統の標的細胞として使用される。５１Ｃｒ放出で検出するとき、細胞溶解は、ミニ遺伝子がコードするＣＴＬエピトープのＭＨＣ発現が生じたことを示す。
【００８９】
インビトロにおける免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能的試験の第２の方法である。適当なヒトＭＨＣ分子を発現する遺伝子組換えマウスをＤＮＡ産物で免疫化する。用量および投与経路は製剤依存的である（例えば、ＤＮＡのＰＢＳ溶液は筋肉内注射であり、脂質−複合体ＤＮＡは腹腔内注射である）。免疫から２１日後、脾臓を採取し、試験対象の各エピトープをコードするペプチドの存在下において１週間再度刺激する。標準的な技術を使用して、ペプチド負荷したクロム−５１標識標的細胞の細胞溶解についてこれらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）をアッセイする。ミニ遺伝子がコードするエピトープに相当するペプチドのＭＨＣ負荷によって感作される標的細胞の溶解は、ＣＴＬをインビトロにおいて誘導するためのＤＮＡワクチン機能を証明している。
【００９０】
同様に、抗原性ペプチドを使用して、エクスビボでＣＴＬを誘導することができる。得られたＣＴＬを使用して、従来の他の形態の治療に応答しない、またはペプチドワクチン治療方法に応答しない患者の慢性感染症（ウィルスまたは細菌）または腫瘍を治療することができる。特定の病因（感染性物質または腫瘍抗原）に対するエクスビボのＣＴＬ応答は、組織培養において、患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）および適当な免疫原性ペプチドと共にインキュベーションすることによって誘導される。ＣＴＬｐが活性化されて成熟し、エフェクターＣＴＬに増殖する適当なインキュベーション期間（典型的には、１〜４週）後、細胞を患者に注入し、患者の生体内で、細胞は特異的な標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊する。特異的な細胞障害性Ｔ細胞を作製するためのインビトロにおける条件を最適化するために、刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）培養物を適当な無血清培地で維持する。
【００９１】
刺激細胞を被活性細胞、例えば、前駆ＣＤ８＋細胞と共にインキュベーションする前に、刺激細胞表面上で発現されるヒトクラスＩ分子に負荷されるのに十分な量の抗原性ペプチドを刺激細胞培養物に添加する。本発明では、十分な量のペプチドは、約２００、好ましくは２００以上のヒトクラスＩ ＭＨＣ分子に、刺激細胞のそれぞれの表面上で発現されるペプチドを負荷できる量である。好ましくは、刺激細胞は＞２０μｇ／ｍｌのペプチドと共にインキュベーションされる。
【００９２】
次いで、静止または前駆ＣＤ８＋細胞を、ＣＤＳ＋細胞を活性化するのに十分な期間、適当な刺激細胞と共にインキュベーションする。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は抗原特異的に活性化される。刺激細胞に対する静止または前駆ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の比は、個体によって異なってもよく、個体のリンパ球の培養条件への適応性並びに本明細書に記載する治療方法を使用する疾患状態または他の状態の性質および重症度などの可変要因にさらに依存することがある。しかしながら、好ましくはリンパ球：刺激細胞比は約３０：１〜３００：１の範囲である。エフェクター／刺激物質培養物は、治療的に使用可能または有効な数のＣＤ８＋細胞を刺激する必要がある期間だけ維持することができる。
【００９３】
インビトロにおけるＣＴＬの誘導には、ＡＰＣ上の対立遺伝子特異的なＭＨＣクラスＩ分子に結合させたペプチドの特異的な認識が必要である。ＡＰＣあたりの特異的なＭＬＩＣ／ペプチド複合体の数は、特に一次免疫応答ではＣＴＬの刺激にとって重要である。細胞あたりのペプチド／ＭＨＣ複合体の量が少量で細胞をＣＴＬによる溶解に感受性にするのに十分であっても、または二次的なＣＴＬ応答を刺激するのに十分であっても、一次応答中のＣＴＬ前駆体（ｐＣＴＬ）の活性化を成功させるためには、有意に多量のＭＨＣ／ペプチド複合体が必要である。細胞の空の（ｅｍｐｔｙ）主要組織適合性抗原複合体分子のペプチド負荷により、一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。細胞の空の主要組織適合性抗原複合体分子のペプチド負荷により、一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。
【００９４】
突然変異細胞系統は全てのヒトＭＨＣ対立遺伝子について存在しないので、ＡＰＣの表面から内因性ＭＨＣ結合ペプチドを除去し、次に得られた空のＭＨＣ分子に関心対象の免疫原性ペプチドを負荷する技術を使用することは有利である。非形質転換（非腫瘍形成）、非感染細胞、好ましくは患者の自己由来の細胞をＡＰＣとして使用することは、エクスビボのＣＴＬ治療の開発をめざすＣＴＬ誘導プロトコールの設計に望ましい。本出願は、ＡＰＣ表面から内因性ＭＨＣ結合ペプチドを除去し、次に所望のペプチドを負荷する方法を開示している。
【００９５】
安定なＭＨＣクラスＩ分子は、以下の要素から形成されるトリマー複合体である：１）通常８〜１０残基のペプチド、２）α１およびα２ドメインにペプチド結合部位を保有する膜貫通重鎖多型タンパク質、および３）共有結合以外で結合した非多型軽鎖、β_２マイクログロブリン。複合体からの結合ペプチドの除去および／またはβ_２マイクログロブリンの解離によりＭＨＣクラスＩ分子は機能せず、不安定になり、その結果迅速な分解を生じる。ＰＢＭＣから単離される全てのＭＨＣクラスＩ分子には、内因性ペプチドが結合している。従って、第１の段階は、外因性ペプチドを添加する前に、分解を生じることなく、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子に結合した全ての内因性ペプチドを除去することである。
【００９６】
結合ペプチドからＭＨＣクラスＩ分子を遊離する２つの可能な方法は、培養温度を３７℃から２６℃に低下させて一晩培養し、β_２マイクログロブリンを不安定化することと、弱酸処理を使用して、細胞から内因性ペプチドを除去することとを含む。この方法は、以前に結合したペプチドを細胞外環境に放出し、新たな外因性ペプチドを空のクラスＩ分子に結合させる。低温インキュベーション方法により、外因性ペプチドはＭＨＣ複合体に効率的に結合できるが、細胞の代謝速度を遅くしうる２６℃における一晩のインキュベーションを必要とする。活発にＭＨＣ分子を合成していない細胞（例えば、静止ＰＢＭＣ）は、低温手法により空の表面ＭＬＩＣ分子を大量に産生しないと思われる。
【００９７】
強酸による除去には、トリフルオロ酢酸、ｐＨ ２によるペプチドの抽出または免疫親和性精製したクラスＩ−ペプチド複合体の酸変性が含まれる。これらの方法は、内因性ペプチドを除去するが、抗原提示に不可欠であるＡＰＣの生存性および最適な代謝速度を保存することが重要なため、ＣＴＬ誘導には適さない。グリシンまたはクエン酸−リン酸緩衝液などのｐＨ３の弱酸溶液が、内因性ペプチドを同定し、腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを同定するために使用されている。ＭＨＣクラスＩ分子だけが不安定化される（および結合しているペプチドは放出される）が、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含む他の表面抗原は無傷のままであるという点において、この処理は特に効果的である。最も重要なことには、弱酸溶液による細胞の処理は細胞の生存性および代謝状態に影響しない。弱酸処理は迅速である。その理由は、内因性ペプチドの除去は４℃では２分で生じ、ＡＰＣは、適当なペプチドが負荷されると、容易にその機能を発揮するからである。一次抗原特異的ＣＴＬを作製するためのペプチド特異的ＡＰＣを作製するためにの技術が本明細書において使用される。得られたＡＰＣは、ペプチド特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬを誘導するのに効率的である。
【００９８】
活性化されたＣＤ８＋細胞は、種々の既知の方法の１つを使用して刺激細胞から効果的に分離することができる。例えば、刺激細胞、刺激細胞に負荷されたペプチドまたはＣＤ８＋細胞に特異的なモノクローナル抗体（またはその断片）を、適当な相補的なリガンドに結合するために使用することができる。次いで、例えば、既知の免疫沈降または免疫アッセイ法のような適当な手段によって、刺激物質−エフェクター細胞混合物から抗体標識した分子を抽出することができる。
【００９９】
効果的な、細胞障害性のある活性化されたＣＤ８＋細胞の量はインビトロ用途およびインビトロ用途で異なることがあり、また、これらのキラー細胞の最終的な標的である細胞の量および種類によって異なることがある。この量はまた、患者の状態によっても変わり、適当な要因全てを担当医が考慮することによって決定されるべきである。しかしながら、マウスに使用される約５×１０^６〜５×１０^８細胞と比較して、好ましくは、約１×１０^６〜約１×１０^１２、さらに好ましくは約１×１０^８〜約１×１０^１１、よりさらに好ましくは約１×１０^〜〜１×１０^１０の活性化ＣＤ８＋が成人に使用される。
【０１００】
好ましくは、上記に考察するように、被治療個体にＣＤ８＋細胞を投与する前に、活性化ＣＤ８＋を細胞培養物から採取する。しかしながら、現在の提案されている他の治療方法とは異なり、本発明の方法は腫瘍形成性でない細胞培養系を使用することに注目することは重要である。従って、刺激細胞および活性化ＣＤ８＋細胞の完全な分離が実施されない場合、小数の刺激細胞の投与に関連することが既知の本質的な危険がないが、哺乳類の腫瘍−促進細胞の投与は極めて危険になることがある。
【０１０１】
細胞成分を再導入する方法は当技術分野において既知であり、Ｈｏｎｓｉｋらに付与された米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４，６９０，９１５号に例示されているものなどの手法を含む。例えば、静脈内注入による活性化ＣＤ８＋の投与が適当である。
【０１０２】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、モノクローナル抗体を作製するためにも使用することができる。このような抗体は、診断薬または治療薬の可能性のあるものとして有用となりうる。
【０１０３】
ペプチドはさらに診断試薬としての用途を見出すことができる。例えば、本発明のペプチドを使用して、本発明のペプチドまたは関連ペプチドを使用する治療方法に対する特定の個体の感受性を判定することができ、従って既存の治療プロトコールを改良する際または罹患個体の予後を判定する際に有用となりうる。また、ペプチドは、どの個体が慢性感染症を発症する実質的な危険状態にあるかを予測するためにも使用することができる。
【０１０４】
本発明のペプチドを同定するためには、クラスＩ抗原単離並びに天然に処理されたペプチドの単離および配列決定を関連する出願に記載されているように実施した。次いで、これらのペプチドを使用して、以下の対立遺伝子Ａ３．２、Ａ１、Ａ１１およびＡ２４．１の各々に特異的な結合モチーフを規定した。これらのモチーフは３頁（前頁）に記載されている。以下の表５〜８に記載するモチーフは、関連する用途に記載されている天然に処理されたペプチドの配列決定プールデータから規定される。
【０１０５】
【表５】ＨＬＡ−Ａ３．２対立遺伝子特異的モチーフの要約

【０１０６】
【表６】ＨＬＡ−Ａ１対立遺伝子特異的モチーフの要約

【０１０７】
【表７】ＨＬＡ−Ａ１１対立遺伝子特異的モチーフの要約

【０１０８】
【表８】ＨＬＡ−Ａ２４．１対立遺伝子特異的モチーフの要約

【０１０９】
実施例 １
免疫原性ペプチドの同定
種々のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子について上記に同定したモチーフを使用して、種々の病原菌および腫瘍−関連タンパク質由来のアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。スクリーニングは関連する用途に記載するように実施した。表９〜１０は抗原の検索結果を提供する。
【０１１０】
【表９】

【０１１１】
表１０に掲載するペプチドは上記のように同定し、それらが由来する病原菌または抗原により分類される。
【０１１２】
【表１０】

【０１１３】
上記の説明は本発明を例示するために提供されているが、本発明の範囲を限定するために提供されるものではない。本発明の他の形態は当業者に容易に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書に引用されている刊行物、特許、および特許出願は全て参照として本明細書に組み入れられる。[0001]
This application is a continuation-in-part of U.S. patent application Ser. No. 08 / 589,107, which is hereby incorporated by reference. U.S. patent application Ser. No. 60 / 013,833, U.S. patent application Ser. No. 08 / 027,746, which is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 08 / 027,746. No. 08 / 159,339, which is a continuation-in-part of US Pat. This application is also related to US patent application Ser. No. 08 / 186,266, US patent application Ser. No. 08 / 821,739, and US patent application Ser. No. 08 / 758,409. All of the above applications are incorporated herein by reference.
[0002]
Background of the Invention
The present invention relates to compositions and methods for the prevention, treatment or diagnosis of many pathological conditions such as viral diseases and cancer. In particular, the present invention provides novel peptides that can bind selective major histocompatibility complex (MHC) molecules and induce an immune response.
[0003]
MHC molecules are classified as either class I or class II molecules. Class II MHC molecules are mainly expressed on cells involved in the initiation and persistence of an immune response, such as T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, and the like. Class II MEC molecules are recognized by helper T lymphocytes and induce proliferation of helper T lymphocytes and amplification of the immune response to the particular immunogenic peptide shown. Class I MHC molecules are expressed on almost all nucleated cells, are recognized by cytotoxic T lymphocytes (CTLs), and subsequently destroy cells bearing antigen. CTL is especially important in fighting tumor rejection and viral infection. CTL recognizes antigens in the form of peptide fragments that bind to MHC class I molecules rather than the intact foreign antigen itself. Antigens usually need to be synthesized endogenously by cells, and some protein antigens are broken down into small peptide fragments in the cytoplasm. Some of these small peptides translocate to the pre-Golgi compartment and interact with the class I heavy chain to promote correct folding and association with subunit J32 microglobulin. The peptide-MHC class I complex is then delivered to the cell surface for expression and potential recognition by specific CTL.
[0004]
Studies of the crystal structure of HLA-A2.1, a human MHC class I molecule, have shown that the peptide binding groove is formed by the folding of the a1 and a2 domains of the class I heavy chain (Bjorkman et al., Nature). 329: 506 (1987)). However, these studies did not identify peptides that bind to the groove.
[0005]
Booth et al., Science, 242: 1065 (1988) first described a method for acid elution of binding peptides derived from MHC. Subsequently, Rammensee and his co-workers (Falk et al., Nature, 351: 290 (1991)) developed an approach to characterize naturally processed peptides that bind to class I molecules. Other investigators eluted from class I molecules of type B (Jardetsky et al., Nature, 353: 326 (1991)) and A2.1 (Hunt et al., Science, 225: 1261 (1991)) by mass spectrometry. Conventional automated sequencing of the resulting peptides resulted in successful direct amino acid sequencing of the larger amounts of peptides in the various HPLC fractions. A review of the characterization of naturally processed peptides in MHC class I was published by Rotzschke and Falk (Rotzschke and Falk, Immunol. Today, 12: 447 (1991)).
[0006]
Sette et al., Proc. Natl. Acad. USA, 86: 3296 (1989) showed that MHC allele-specific motifs can also be used to predict MHC binding capacity. Shaeffer et al., Proc. Natl. Acad. USA, 86: 4649 (1989), has shown that MHC binding is associated with immunogenicity. Several authors (De Bruijin et al., Eur. I. Immunol., 21: 2963-2970 (1991)); Palmer et al., 991 Nature, 353: 852-955 (1991)) have described class I binding motifs in animal models. Provided preliminary evidence that it could be applied to the identification of potential immunogenic peptides. Class I motifs specific to many human alleles of a given class I isoform must now be accounted for. It is desirable that the frequency of combination of these various alleles be high enough to cover most or perhaps most of the human outbred population.
[0007]
Despite advances in the art, the prior art has not yet provided vaccines or therapeutics with useful human peptides based on this work. The present invention provides these and other advantages.
[0008]
Summary of the Invention
The present invention provides a composition comprising an immunogenic peptide having a binding motif for an MHC class I molecule. Immunogenic peptides are typically from about 8 to about 11 residues and contain conserved residues involved in binding the protein encoded by the appropriate MHC allele. Many allele-specific motifs have been identified.
[0009]
For example, for HLA-A3.2, the motif comprises the first conserved residue of L, M, I, V, S, A, T and F in the second position from the N-terminus to the C-terminus; Includes a second conserved residue of R or Y at the C-terminus. Other first conserved residues are C, G or D, or E. Another second conserved residue is H or F. The first and second conserved residues are preferably separated by 6-7 residues.
[0010]
The motif for HLA-A1 contains from the N-terminus to the C-terminus the first conserved residue of T, S or M, the second conserved residue of D or E, and the third conserved residue of Y. Other second conserved residues are A, S or T. The first and second conserved residues are contiguous and are preferably separated from the third conserved residue by 6-7 residues. The second motif includes the first conserved residue of E or D and the second conserved residue of Y when the first and second conserved residues are separated by 5-6 residues.
[0011]
The motif for HLA-A11 is the first conserved residue of T, V, M, L, I, S, A, G, N, C, D or F in the second position from the N-terminus to the C-terminus. And contains a conserved C-terminal residue of K, R, Y or H. The first and second conserved residues are preferably separated by 6-7 residues.
[0012]
The motif for HLA-A24.1 contains, from the N-terminus to the C-terminus, the first conserved residue of Y, F or W in the second position and the C-terminal conservation of F, I, W, M or L Including residues. The first and second conserved residues are preferably separated by 6-7 residues.
[0013]
Many potential target protein epitopes can be identified in this way. Examples of suitable antigens include prostate-specific antigen (PSA), hepatitis B core and hepatitis B surface antigens (HBVc, HBVs), hepatitis C antigen, malignant melanoma antigen (MAGE-1), Epstein. Includes bar virus antigen, human immunodeficiency virus type 1 (HIV 1), papilloma virus antigen, Lassa fever virus, Mycobacterium tuberculosis (MT), p53, CEA, and Her2 / neu. Accordingly, the peptides are useful in pharmaceutical compositions for both in vitro and ex vivo therapeutic and diagnostic uses.
[0014]
Definition
The term “peptide” is used interchangeably herein with “oligopeptide” and typically substitutes one residue for another by a peptide bond between the α-amino and carbonyl groups of adjacent amino acids. Shows a series of linked residues, typically L-amino acids. The oligopeptides of the invention are less than about 15 residues in length and usually consist of about 8 to about 11 residues, preferably 9 or 10 residues.
[0015]
An "immunogenic peptide" is a peptide that contains an allele-specific motif such that the peptide can bind an MHC allele and induce a CTL response. Thus, the immunogenic peptide can bind to the appropriate class I MHC molecule and induce a cytotoxic T cell response to the antigen from which the immunogenic peptide is derived.
[0016]
"Conserved residues" are amino acids that occur at a particular position in a peptide motif at a significantly higher frequency than would be expected by a random distribution. Typically, conserved residues are those amino acids that the immunogenic peptide can provide a point of contact with the MHC molecule. At least 1 to 3 or more, preferably 2 conserved residues within a peptide of defined length determine the motif for the immunogenic peptide. These residues are typically in close contact with the peptide binding groove, ie, with their side chains embedded in specific pockets in the groove itself. Typically, an immunogenic peptide will contain up to three conserved residues, more usually two conserved residues.
[0017]
As used herein, a “negative binding residue” is a peptide that, when present at a particular position, is a non-binding or insufficient binding agent, such that the appropriate An amino acid that cannot induce a CTL response despite the presence of conserved residues.
[0018]
The term "motif" refers to a pattern of residues in a peptide of defined length, usually about 8 to about 11 amino acids, that is recognized by a particular MHC allele. The peptide motif for each human MHC allele is typically different, differing in the pattern of highly conserved residues.
[0019]
Binding motifs for alleles can be defined with high precision. In some cases, all conserved residues are in the proper position in the peptide and there are no negative binding residues.
[0020]
The expression "isolated" or "biologically pure" means a substance that is substantially or essentially free of components that normally accompany it when found in its natural state. Thus, the peptides of the present invention do not include substances normally associated with the in situ environment, such as MHC I molecules of antigen presenting cells. Even when proteins are isolated to homogenous or predominant bands, there is a range of 5-10% non-denatured protein trace contaminants that are co-purified with the desired protein. The isolated peptides of the present invention do not include such endogenous co-purified proteins.
[0021]
The term "residue" refers to an amino acid or amino acid mimetic that is incorporated into an oligopeptide by an amide bond or amide bond mimetic.
[0022]
Description of specific aspects
The present invention relates to the determination of allele-specific peptide motifs of the human class I MHC (sometimes referred to as HLA) allele subtype. These motifs can then be used to convert T from an antigen associated with a human viral disease, cancer or autoimmune disease whose amino acid sequence is known for any desired antigen, particularly those with potential antigen or autoantigen targets. Define the cellular epitope.
[0023]
For those with a large number of potential target proteins, epitopes can be identified in this way. Examples of suitable antigens include prostate specific antigen (PSA), hepatitis B core and surface antigens (HBVc, HBVs), hepatitis C antigen, Epstein-Barr virus antigen, melanoma antigen (eg, MAGE-1) , Human immunodeficiency virus (HIV) antigen and human papilloma virus (HPV) antigen, Lassa fever virus, Mycobacterium tuberculosis (MT), p53, CEA and Her2 / neu.
[0024]
Peptides containing epitopes of these antigens are synthesized and then used, for example, in assays using purified class I molecules and radioiodinated peptides and / or cells expressing empty class I molecules, for example, immunologically. The ability to bind to appropriate MHC molecules is tested by fluorescent staining and flow microfluorimetry, peptide-dependent class I assembly assays and inhibition of CTL recognition by peptide competition. Such peptides that bind to class I molecules are further evaluated for their ability to act as targets for CTL from infected or immunized individuals and are capable of reacting with virus-infected target cells or tumor cells. The foxes' ability to elicit a primary CTL response in vitro or in vitro capable of producing a population is evaluated as a potential therapeutic.
[0025]
MHC class I antigens are encoded by the HLA-A, B and C loci. HLA-A and B antigens are expressed at approximately equal density on the cell surface, but HLA-C expression is significantly lower (about 10-fold lower). Each of these loci has a number of alleles. The peptide binding motifs of the present invention are relatively specific for each allele subtype.
[0026]
For peptide-based vaccines, the peptides of the invention preferably contain a motif recognized by MHC I molecules that are widely distributed in the human population. Since the frequency of occurrence of MHC alleles varies by ethnicity and race, selection of target MHC alleles can depend on the target population. Table 1 shows various allele frequencies in HLA-A locus products between different races. For example, the majority of the Caucasian population can be covered with peptides that bind to four HLA-A allele subtypes, specifically HLA-A2.1, A1, A3.2 and A24.1. Similarly, the majority of the Asian population contains the addition of a peptide that binds to the fifth allele, HLA-A11.2.
[0027]
[Table 1]

B. Tables from DuPont, "Immunobiology of HLA", Volume 1, Histocompatibility Testing 1987, Springer-Verlag, New York 1989.
* N-Black, A = Asian, C = White. The numbers in parentheses indicate the number of individuals analyzed.
[0028]
The nomenclature used to describe peptide compounds follows conventional methods, with the amino group shown on the left (N-terminal) and the carboxyl group on the right (C-terminal) of each amino acid residue. In the formulas showing selected specific embodiments of the present invention, the amino and carboxyl end groups are not specifically indicated, but unless otherwise specified, in a form which would be taken at physiological pH values. Exists. In amino acid structural formulas, each residue is generally represented by the standard three letter or one letter code. L-form amino acid residues are represented by a single capital letter or the first capital letter of the three letter symbol, and such amino acids of the D form are represented by a single lower case letter or three lower case letter symbol. Glycine has no asymmetric carbon atom and is simply referred to as "Gly" or G.
[0029]
The technique used to identify the peptides of the invention is generally based on the method disclosed in Falk et al., Nature, 351: 290 (1991), which is incorporated herein by reference. Briefly, the method involves large-scale isolation of MHC class I molecules from appropriate cells or cell lines, typically by immunoprecipitation or affinity chromatography. Examples of other methods for isolating the desired MHC molecule, also known to those skilled in the art, include ion exchange chromatography, lectin chromatography, size exclusion chromatography, fast ligand chromatography and combinations of all of the above techniques. Can be
[0030]
Many cells with defined MHC molecules, particularly MHC class I molecules, are known and readily available. For example, human EBV-transformed B cell lines have been shown to be an excellent source of preparative isolation of Class I and Class II MHC molecules. Well-characterized cell lines are described in the American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", 6th edition (1988) Maryland, Maryland). Rockville, U.S.A., National Institute of General Medical Sciences 1990/1991 Cell Lines Catalog (NIGMS) Human Genetic Mutant, Washington, New Jersey, USA. pital, 75 Francis Street Boston, available from private and commercial sources, such as MA 02115. Table 2 lists some suitable B cell lines for use as sources of the HLA-A allele. All of these cell lines can be grown in large batches and are therefore useful for large scale production of MHC molecules. Those skilled in the art will recognize that these are merely exemplary cell lines and that many other cellular sources can be used. Similar EBV B cell lines that are homozygotes for HLA-B and HLA-C appear to serve as HLA-B and HLA-C allele sources, respectively.
[0031]
TABLE 2 Human cell line (LILA-A origin)

[0032]
Typically, immunoprecipitation is used to isolate the desired allele. Numerous protocols can be used, depending on the specificity of the antibody used. For example, allele-specific mAb reagents can be used to affinity purify HLA-A, HLA-B and HLA-C molecules. Several mAb reagents for isolating HLA-A molecules are available (Table 3). Thus, for each of the targeted HLA-A alleles, reagents are available that can be used to directly isolate the HLA-A molecule. Affinity columns prepared with these mAbs using standard techniques are successfully used to purify each HLA-A allele product.
[0033]
As described in the Examples section below, in addition to allele-specific mAbs, broadly reactive anti-HLA-A, B, C mAbs such as W6 / 32 and B9.12.1 and 1 One anti-HLA-B, C mAb, B1.23.2 may be used in another affinity purification protocol.
[0034]
[Table 3] Antibody reagent

[0035]
Peptides bound to the peptide binding groove of the isolated MHC molecule are typically eluted using acid treatment. Peptides can also be dissociated from Class I molecules by a variety of standard denaturing means such as heating, pH, detergents, salts, chaotropic agents, or combinations thereof.
[0036]
The peptide fraction is further separated from MHC molecules by reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) and sequenced. Various other standard means known to those skilled in the art, including filtration, ultrafiltration, electrophoresis, size chromatography, precipitation with specific antibodies, ion exchange chromatography, isoelectric focusing, etc. Can separate the peptides.
[0037]
Sequencing of the isolated peptides can be performed by standard techniques such as Edman degradation (Hunkapiller, MW, et al., Methods Enzymol. 91, 399 (1983)). Other suitable methods for sequencing include mass spectrometry sequencing of individual peptides as previously described (Hunt et al., Science, 225, incorporated herein by reference). : 1261 (1992)). Amino acid sequencing of bulky heterogeneous peptides from different Class I molecules (eg, pooled HPLC fractions) typically reveals characteristic sequence motifs for each Class I allele.
[0038]
Given the specific motifs for the different class I alleles, those with potential peptide epitopes can be isolated from antigenic proteins whose amino acid sequence is known. Typically, the identification of potential peptide epitopes is first performed using a computer to scan the amino acid sequence of the desired antigen for the presence of the motif. Next, the epitope sequence is synthesized. The ability to bind to MHC class molecules is measured in a variety of different ways. One means is, for example, the class I molecule binding assay described in the relevant application above. Alternatives described in the literature include inhibition of antigen presentation (Sette et al., J. Immunol., 141: 3893 (1991)), in vitro assembly assays (Townsend et al., Cell, 62: 285 (1990)). And RMA. FACS-based assays using mutant cells such as S (Melief et al., Eur. J. Immunol., 21: 2963 (1991)).
[0039]
Next, peptides that test positive in the MHC class I binding assay are assayed for the ability of the peptide to induce a specific CTL response in vitro. For example, antigen presenting cells incubated with the peptide can be assayed for the ability to induce a CTL response in a responding cell population. The antigen presenting cells may be normal cells such as peripheral blood mononuclear cells or dendritic cells (Inaba et al., J. Exp. Med., 166: 182 (1987); Boog, Eur. J. Immunol., 18: 219 (1988)).
[0040]
Alternatively, to test the ability of the peptide to induce a primary CTL response in vitro, the mouse cell line RMA-S (Karre et al., Nature, 319: 675 (1986); Ljunggren et al., Eur) when the peptide is added. J. Immunol., 21: 2963--2970 (1991)) and human somatic T cell hybridoma, T-2 (Cerundolo et al., Nature, 345: 449-452 (1990)). Mutant mammalian cell lines lacking the ability to load class I molecules with peptides and transfected with the appropriate human class I gene are conveniently used. Other eukaryotic cell lines that can be used include mosquito larvae (ATCC cell lines 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), silkworms (ATTC CRL 8851), armyworms (ATCC CRL 1711), (ATCC CCL 80) and various insect cell lines such as the Drosophila cell line, such as the Schneider cell line (Schneider J. Embryol. Exp. Morphor., 27: 353-365 [1927]). It has been transfected with the gene encoding the appropriate human class I MHC allele and the human B2 microglobulin gene.
[0041]
Peripheral blood lymphocytes are conveniently isolated by simple venipuncture or leukocyte separation of normal donors or patients and used as a responder cell source for CTL precursors. In one embodiment, appropriate antigen presenting cells are incubated with 10-100 μM peptide for 4 hours in serum-free medium under appropriate culture conditions. The peptide-loaded antigen presenting cells are then incubated in vitro with the responder cell population under optimal culture conditions for 7-10 days. For the presence of CTL that kills radiolabeled target cells, specific peptide-pulsed targets, as well as target cells expressing endogenously processed forms of related viruses or tumor antigens that induce peptide sequences, Positive CTL activation can be measured by assaying the culture.
[0042]
CTL specificity and MHC restriction are determined by testing against different peptide target cells expressing appropriate or inappropriate human MHC class I. Peptides that show a positive test result in the MHC binding assay and produce a specific CTL response are referred to herein as immunogenic peptides.
[0043]
The immunogenic peptides can be made by synthetic or recombinant DNA techniques, or can be isolated from natural sources such as whole viruses or tumors. The peptide is preferably substantially free of other native host cell proteins and fragments thereof, but in some embodiments, the peptide may be synthetically linked to the native fragment or particle. The polypeptide or peptide may be of various chain lengths, in neutral (uncharged) or salt form, and contain no alterations such as glycosylation, side chain oxidation or phosphorylation. Or may contain these modifications, provided that the modifications do not destroy the biological activity of the polypeptide as described herein.
[0044]
Desirably, the peptide will be as small as possible, as long as it retains substantially all of the biological activity of the large peptide. Where possible, peptides of the present invention may be combined with 9 or 10 amino acid residues in chain length, CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), silkworm (ATTC CRL 8851), silkworm (ATCC CRL 1711), It may be desirable to optimize for Drosophila cell lines such as (ATCC CCL 80) and the Schneider cell line (see Schneider J. Embryol. Exp. Morphor., 27: 353-365 (1927)). It has been transfected with the gene encoding the appropriate human class I MHC allele and the human B2 microglobulin gene.
[0045]
Peripheral blood lymphocytes are conveniently isolated by simple venipuncture or leukocyte separation of normal donors or patients and used as a responder cell source for CTL precursors. In one embodiment, appropriate antigen presenting cells are incubated with 10-100 μM peptide for 4 hours in serum-free medium under appropriate culture conditions. The peptide-loaded antigen presenting cells are then incubated in vitro with the responder cell population under optimal culture conditions for 7-10 days. For the presence of CTL that kills radiolabeled target cells, specific peptide-pulsed targets, as well as target cells expressing endogenously processed forms of related viruses or tumor antigens that induce peptide sequences, Positive CTL activation can be measured by assaying the culture.
[0046]
CTL specificity and MHC restriction are determined by testing against different peptide target cells expressing appropriate or inappropriate human MHC class I. Peptides that show a positive test result in the MHC binding assay and produce a specific CTL response are referred to herein as immunogenic peptides.
[0047]
The immunogenic peptides can be made by synthetic or recombinant DNA techniques, or can be isolated from natural sources such as whole viruses or tumors. The peptide is preferably substantially free of other native host cell proteins and fragments thereof, but in some embodiments, the peptide may be synthetically linked to the native fragment or particle. The polypeptide or peptide may be of various chain lengths, in neutral (uncharged) or salt form, and contain no alterations such as glycosylation, side chain oxidation or phosphorylation. Or may contain these modifications, provided that the modifications do not destroy the biological activity of the polypeptide as described herein.
[0048]
Desirably, the peptide will be as small as possible, as long as it retains substantially all of the biological activity of the large peptide. Where possible, peptides of the present invention may be attached to 9 or 10 amino acid residues in chain length that are the same size as endogenously processed viral or tumor cell peptides that bind to cell surface MHC class I molecules. It may be desirable to optimize.
[0049]
Peptides having the desired activity can be modified as appropriate to provide certain desired properties, for example, improved pharmacological properties, but which bind to the desired MHC molecule and have the appropriate Increase or at least maintain substantially all of the biological activity of the unmodified peptide that activates T cells. For example, various changes can be made to the peptide, such as conservative or non-conservative substitutions, in which case such changes would provide advantages during use, such as improved MHC binding. . Conservative substitutions involve replacing an amino acid residue with another biologically and / or chemically similar amino acid residue, eg, replacing a hydrophobic residue with another hydrophobic residue, or replacing a polar residue. It means replacing the group with another polar residue. Substitutions include Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; and combinations such as Phe, Tyr. The effect of a single amino acid substitution can also be explored using D-amino acids. Such modifications are described, for example, in Merrifield, Science, 232: 341-347 (1986), Barany and Merrifield, "Peptides (The Peptides)," Gross and Meienhofer, eds. Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); and Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", (Rockford, Ill., Pierce), Second Edition (1984), as known. It can be performed using peptide synthesis techniques.
[0050]
Peptides can also be modified by extending or reducing the amino acid sequence of the compound, for example, by the addition or deletion of amino acids. The peptides or analogs of the present invention can also be modified by altering the order or composition of certain residues, for example, biologically, such as at critical contact sites or conserved residues. It is readily understood that certain amino acid residues that are essential for activity generally do not need to be changed without adversely affecting the biological activity. The non-essential amino acids need not be limited to those naturally occurring in proteins, such as L-α-amino acids or their D-isomers, but include β-γ-δ-amino acids and numerous derivatives of L-α-amino acids. Unnatural amino acids may be included as well.
[0051]
Typically, a series of peptides with one amino acid substitution is used to determine the effects of electrostatic charge, hydrophobicity, etc. on binding. For example, a series of positively charged (eg, Lys or Arg) or negatively charged (eg, Glu) amino acid substitutions can be made in a peptide chain to reveal different patterns of sensitivity to various MHC molecules and T cell receptors. Also, multiple substitutions using small, relatively neutral moieties such as Ala, Gly, Pro or similar residues can be used. Substitutions may be homo-oligomers or hetero-oligomers. The number and type of residues substituted or added will depend on the space required between the required contact points and certain functional attributes considered (eg, hydrophobic and hydrophilic). Higher binding affinities for MHC molecules or T cell receptors when compared to the affinity of the parent peptide can also be achieved by such substitutions. In any event, such substitutions should use amino acid residues or other molecular fragments selected to avoid binding, eg, steric hindrance and charge hindrance.
[0052]
Amino acid substitutions are typically of one residue. Substitutions, deletions, insertions or any combination thereof can be combined to arrive at the final peptide. A replacement species is one in which at least one residue of the peptide has been removed and a different residue inserted at that position. If it is desired to fine-tune the characteristics of the peptide, such substitutions are generally made according to Table 4 below.
[0053]
[Table 4]

[0054]
Substantial changes in function (eg, affinity for MHC molecules or T cell receptors) can be achieved by selecting less conservative substitutions than those in Table 4, ie, (a) for example, in sheet or helical configurations. Selecting residues that have a greater effect on the structure of the peptide backbone of the substitution region, such as loci, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) maintaining the bulk of the side chains. Implemented by Substitutions that are expected to produce the greatest change in the properties of the peptide include (a) a hydrophilic residue, eg, seryl, from a hydrophobic residue, eg, leucyl, isoleucyl, phenylalanyl, valyl or alanyl (or (B) a residue having a positively charged side chain, such as lysyl, arginyl or histidyl, is replaced (or by) a negatively charged residue such as glutamyl or aspartyl, or (c) 2.) Residues with bulky side chains, for example, those in which phenylalanine is substituted for (or by) no side chain, for example, glycine.
[0055]
The peptide may comprise an isotope of two or more residues in the immunogenic peptide. An isotope as defined herein may comprise two or more that can replace the second sequence because the conformation of the first sequence matches the binding site specific for the second sequence. Is the sequence of the residues. The term specifically includes peptide backbone modifications known to those skilled in the art. Such modifications include modifications of the amide nitrogen, α-carbon, amide carbonyl, complete substitution of the amide bond, extensions, deletions or backbone crosslinks. See generally, Spatola, "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, peptides and Proteins", Volume VII (Weinstein, 1983).
[0056]
Modification of the peptide with various amino acid mimetics or unnatural amino acids is particularly useful in increasing the stability of the peptide in vitro. Stability is assayed by a number of methods. For example, various biological media such as peptidases and human plasma and serum have been used to test stability. See, for example, Verhoef et al., Eur. J. See Drug Metab Pharmacokin, 11: 291-302 (1986). The half-life of the peptides of the invention is conveniently determined using a 25% human serum (v / v) assay. The protocol is generally as follows. The human pool serum (type AB, non-heat inactivated) is delipidated by centrifugation before use. The serum is then diluted in RPMI tissue culture medium and used to test peptide stability. At a given time interval, a small amount of the reaction solution is removed and added to 6% trichloroacetic acid or ethanol. The turbid reaction sample is cooled (4 ° C.) for 15 minutes and then centrifuged to pellet the precipitated serum proteins. The presence of the peptide is then determined by reverse-phase HPLC using stability-specific chromatography conditions.
[0057]
The peptides of the invention having CTL stimulating activity or their analogs can be modified to provide desired attributes other than improved serum half-life. For example, the ability of a peptide to induce CTL activity can be enhanced by binding to a sequence containing at least one epitope capable of inducing a T helper cell response. Particularly preferred immunogenic peptide / T helper complexes have a spacer molecule attached. Spacers typically include relatively small, neutral molecules, such as amino acids or amino acid mimetics that are substantially uncharged under physiological conditions. The spacer is typically selected from, for example, Ala, GIy or other neutral spacers of non-polar or neutral polar amino acids. It is understood that the optional spacer need not include the same residues, and thus may be a hetero- or homo-oligomer. If present, the spacer will usually be at least one or two residues, more usually three to six residues. Alternatively, the CTL peptide may bind to the T helper peptide without a spacer.
[0058]
The immunogenic peptide can be linked to the T helper peptide directly or via a spacer at the amino or carboxy terminus of the CTL peptide. The amino terminus of the immunogenic peptide or T helper peptide may be acylated.
[0059]
In certain embodiments, it may be desirable to include in the pharmaceutical composition of the invention at least one component that assists in priming CTL. Lipids have been identified as substances that can assist in vitro stimulation of CTL against viral antigens. For example, a palmitic acid residue can be linked to the α and ε amino groups of a Lys residue and then via one or more linking residues, such as Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, etc. Bound to the immunogenic peptide. The lipid-bound peptide may then be directly injected in micelle form, introduced into liposomes, or emulsified in the form of an adjuvant, such as, for example, Freund's incomplete adjuvant. In a preferred embodiment, a particularly effective immunogen comprises palmitic acid linked to the α and ε amino groups of Lys, which is linked to the amino terminus of the immunogenic peptide via a bond such as Ser-Ser.
[0060]
As another example of lipid antigen stimulation of a CTL response, tripalmitoyl-S-glycerylcysteinelyseryl-serine (when covalently linked to a suitable peptide)_p3Escherichia coli (E. coli) lipoproteins such as CSS) can be used to prime virus-specific CTL. See Deres et al., Nature, 342: 561-564 (1989), which is incorporated herein by reference. For example, the peptide of the present invention_p3It can bind to CSS and administer the lipopeptide to the individual to specifically prime the CTL response to the target antigen. In addition, the induction of neutralizing antibodies also bound to peptides displaying the appropriate epitope_p3Being able to prime with CSS, the two compositions can be combined to more effectively induce humoral and cellular responses to infection.
[0061]
Also, additional amino acids may be added to the termini of the peptide to facilitate binding of the peptides to each other or to improve the physical or chemical properties of the peptide or oligopeptide for attachment to the support of the carrier. Therefore, it is possible to facilitate the binding to a longer peptide. Amino acids such as tyrosine, cysteine, lysine, glutamic acid or aspartic acid can be introduced at the C-terminus or N-terminus of the peptide or oligopeptide. In some cases, modification of the C-terminus may alter the binding properties of the peptide. Also, terminal -NH₂Acylation, for example, alkanoyl (C₁~ C₂₀) Or thioglycolylacetylation, terminal-carboxyl amidation, eg, by modification with ammonia, methylamine, and the like, the peptide or oligopeptide sequence may differ from the native sequence. In some cases, these modifications can provide sites for binding to a support or other molecule.
[0062]
The peptides of the present invention can be made by a wide variety of methods. Because the peptides are relatively short in size, they can be synthesized in solution or on a solid support by conventional techniques. Various automatic synthesizers are commercially available and can be used according to known protocols. See, e.g., Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Second Edition, Pierce Chemical Co. (1984), see above.
[0063]
Alternatively, using recombinant DNA technology, the nucleotide sequence encoding the immunogenic peptide of interest is inserted into an expression vector, transformed or transfected into a suitable host cell, and cultured under conditions suitable for expression. Can be. See, eg, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), which is incorporated herein by reference. In addition, these techniques are generally known in the art. Thus, a fusion protein comprising one or more peptide sequences of the present invention can be used to express a suitable T cell epitope.
[0064]
Coding sequences for peptides of chain lengths contemplated herein can be obtained by chemical techniques, for example, Matteucci et al. Am. Chem. Soc. , 103: 3185 (1981), so that modifications can be easily made by replacing the appropriate base with that encoding the native peptide sequence. Then, providing a suitable linker to the coding sequence, ligating to an expression vector commonly available in the art, and using the vector to transform a suitable host to produce the desired fusion protein. Can be. Currently, many such vectors and suitable host systems are available. To express the fusion protein, an operably linked start codon and stop codon, a promoter region and a terminator region, and usually a replication system are provided in the coding sequence to provide an expression vector for expression in the desired cellular host. provide. For example, a promoter sequence compatible with the bacterial host is provided on a plasmid that contains convenient restriction enzyme cleavage sites for insertion of the desired coding sequence. The resulting expression vector is transformed into a suitable bacterial host. It will be appreciated that yeast or mammalian cell hosts may be used, using suitable vectors and control sequences.
[0065]
The peptides of the invention, and their pharmaceutical and vaccine compositions, are useful for administration to mammals, especially humans, to treat and / or prevent viral infections and cancer. Examples of diseases that can be treated using the immunogenic peptides of the invention include prostate cancer, hepatitis B, hepatitis C, AIDS, kidney cancer, cervical cancer, lymphoma, CMV, and condyloma acuminatum Is mentioned.
[0066]
For pharmaceutical compositions, the immunogenic peptides of the invention are administered to an individual already suffering from a cancer or infected with the virus of interest. Incubating individuals or individuals in the acute phase of infection can be treated with the immunogenic peptide, separately or in combination with other treatments, as appropriate. For therapeutic use, a composition is administered to a patient in an amount sufficient to induce an effective CTL response to a viral or tumor antigen and to cure or at least partially arrest the symptoms and / or complications. An amount sufficient to accomplish this is defined as "therapeutically effective dose." Effective amounts for such use will depend, for example, on the peptide composition, the mode of administration, the stage and severity of the disease being treated, the weight and general health of the patient, and the judgment of the prescribing physician. Generally, in a first immunization (ie, for therapeutic or prophylactic administration), a 70 kg patient is administered about 1.0 μg to about 5000 μg of the peptide, and then the specific CTL activity in the patient's blood is reduced. Depending on the response and condition of the patient, about 1.0 μg to about 1000 μg of the peptide is boosted according to the booster therapy over a period of weeks to months, depending on the response and condition of the patient. It should be noted that the peptides and compositions of the invention can generally be used in severe disease states, ie, life-threatening or potentially life-threatening situations. In such cases, it is possible to administer a substantially excessive amount of these peptide compositions, given the minimal amount of foreign substances and the relatively low toxicity of the peptides, which may be desirable and therapeutic. The doctor may think.
[0067]
For therapeutic use, administration should begin when the first signs of a viral infection appear, or upon tumor detection or surgical resection, or immediately after diagnosis in cases of acute infection. This is followed by a booster dose, at least until the symptoms are substantially alleviated, and for a period thereafter. Chronic infections may require an initial loading dose followed by a booster dose.
[0068]
Treatment of an infected individual with a composition of the invention can hasten inflammation of the infection in acutely infected individuals. In individuals susceptible to (or predisposed to) developing chronic infections, the compositions of the invention are particularly useful in methods of preventing the transition from acute to chronic infections. For example, if an susceptible individual is identified before or at the time of infection, as described herein, the compositions of the invention can be targeted to such individuals, Need to be administered to a patient.
[0069]
The peptide compositions of the present invention can also be used to treat chronic infections and to stimulate the immune system to eliminate the carrier's virus-infected cells. It is important to provide the formulation and the mode of administration with an immunostimulatory peptide in an amount sufficient to effectively stimulate a cytotoxic T cell response. Thus, for treating chronic infections, typical doses range from about 1.0 μg to about 5000 μg, preferably about 5 μg to 1000 μg per 70 kg patient. Effective immunization of an individual may require a booster dose following the immunization, perhaps for a period of time, perhaps for an extended period of time, eg, 1-4 weeks. In cases of chronic infection, administration should be continued at least until clinical symptoms or clinical trials indicate that the viral infection has been eliminated or substantially alleviated, and for a period thereafter.
[0070]
Pharmaceutical compositions for therapeutic treatment are intended for parenteral, topical, oral or local administration. Preferably, the pharmaceutical compositions are administered parenterally, for example, intravenously, subcutaneously, intradermally, or intramuscularly. Accordingly, the present invention provides a composition for parenteral administration comprising an immunogenic peptide solution dissolved or suspended in an acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. A variety of aqueous carriers can be used, eg, water, buffers, 0.9% saline, 0.3% glycine, hyaluronic acid, and the like. These compositions may be sterilized by conventional, known sterilization techniques, or may be sterile filtered. The resulting aqueous solutions may be packaged for use as is or lyophilized, the lyophilized formulation being combined with a sterile solution prior to administration. The composition of the present invention comprises a pH adjuster and a buffer, a tonicity adjuster, a wetting agent and the like, for example, sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate and the like. And pharmaceutically acceptable auxiliary substances necessary for appropriate physiological conditions.
[0071]
The concentration of the CTL stimulating peptide of the present invention in the pharmaceutical formulation is high, i.e., varies from less than about 0.1 weight percent to usually about 2 weight percent or at least about 2 weight percent, 20 weight percent to 50 weight percent or more. Depending on the particular mode of administration selected, it is mainly selected according to the volume, viscosity, etc. of the body fluid.
[0072]
The peptides of the invention can also be administered by liposomes, targeting the peptide to specific cellular tissues, such as lymphoid tissues. Liposomes are also useful in extending the half-life of the peptide. Liposomes include emulsions, foams, micelles, insoluble monolayers, liquid crystals, phospholipid dispersions, layered layers, and the like. In these formulations, the delivered peptide may be alone or, for example, a molecule that binds to a receptor found on lymphoid cells such as a monoclonal antibody that binds the CD45 antigen or other therapeutic composition or immunogenicity. In combination with the composition, it is incorporated as part of the liposome. Thus, liposomes loaded with the desired peptide of the present invention can be directed to lymphoid cell sites, which deliver the selected therapeutic / immunogenic peptide composition. Liposomes for use in the present invention are generally formed from standard vesicle-forming lipids, including neutral and negatively charged phospholipids and sterols such as cholesterol. Selection of lipids is generally guided by consideration of, for example, liposome shoes, acid instability, and liposome stability in the bloodstream. Szoka et al., Ann. Rev .. Biophys. Bioeng. , 9: 467 (1980); U.S. Patent Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, and 5,019,369. As such, various methods are available for making liposomes.
[0073]
To target immune cells, the ligand incorporated into the liposome may include, for example, an antibody or fragment thereof specific for the cell surface determinant of the desired immune system cells. The liposome suspension containing the peptide can be administered intravenously, locally, topically, etc., at various doses depending on, among other things, the mode of administration, the peptide to be delivered, and the stage of the disease being treated.
[0074]
For solid compositions, conventional nontoxic solid carriers can be used, including, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate, and the like. For oral administration, any of the commonly used excipients, such as the carriers listed above, will generally contain 10% to 95%, more preferably 10% to 95%, of the active ingredient, ie, one or more peptides of the present invention. By incorporating at concentrations from 25% to 75%, pharmaceutically acceptable non-toxic compositions are formed.
[0075]
For aerosol administration, the immunogenic peptides are preferably supplied in finely divided form along with a surfactant and propellant. Typical proportions of peptide are from 0.01% to 20% by weight, preferably 1% to 10% by weight. The surfactant must, of course, be non-toxic and, preferably, soluble in the propellant. Representative of such agents are caproic acid, octanoic acid, lauric acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, olesteric-acid with aliphatic polyhydric alcohol or its cyclic anhydride. olesteric acid and esters or partial esters of fatty acids having 6 to 22 carbon atoms such as oleic acid. Mixed esters such as mixed or natural glycerides can be used. Surfactants may constitute from 0.1% to 20%, preferably from 0.25% to 5%, by weight of the composition. The equilibrium of the composition is usually propulsive. For example, a carrier can be included, as desired, as with lecithin for intranasal delivery.
[0076]
In another aspect, the invention contains an immunologically effective amount of an immunogenic peptide described herein as an active ingredient. Peptides can be introduced into hosts, including humans, bound to their own carrier or as homopolymers or heteropolymers of active peptide units. Such a polymer has the advantage of a high immunological response and, if different peptides are used to make the polymer, antibodies and / or reactive with different antigenic determinants of the virus or tumor cells. It has the advantage of additional ability to induce CTL. Useful carriers are known in the art and include, for example, thyroglobulin, albumin such as bovine serum albumin, tetanus toxoid, polyamino acids such as poly (lysine: glutamic acid), hepatitis B virus core protein, hepatitis B virus recombination. Including vaccines. The vaccine may also contain a physiologically tolerable (acceptable) diluent, such as water, phosphate buffered saline, or saline, and may typically further include an adjuvant. Adjuvants such as Freund's incomplete adjuvant, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, or alum are materials known in the art. As described above, the peptide of the present invention is₃CTL responses can be stimulated by binding to lipids such as CSS. When immunized by injection, aerosol, oral, transdermal, or other route with a peptide composition as described herein, the host immune system produces large amounts of CTL specific for the desired antigen. In response to the vaccine, the host is at least partially immune to subsequent infection or does not develop a chronic infection.
[0077]
A vaccine composition containing the peptide of the present invention is administered to a patient susceptible to or at risk of a viral infection or cancer to elicit an immune response to an antigen and enhance the patient's own immune response ability. You. Such an amount is defined as an "immunologically effective dose." In such use, the precise amount also depends on the condition and weight of the patient, the mode of administration, the nature of the formulation, etc., but generally ranges from about 1.0 μg to about 5000 μg per 70 kilogram patient. More usually, it is in the range of about 10 μg to about 500 μg mg per 70 kg body weight.
[0078]
In some instances, it may be desirable to combine the peptide vaccines of the invention with a vaccine that induces a neutralizing antibody response against the virus of interest, particularly the viral coat antigen.
[0079]
For therapeutic or immunization purposes, nucleic acids encoding one or more of the peptides of the invention may also be administered to a patient. Numerous methods are conveniently used to deliver nucleic acids to a patient. For example, nucleic acids can be delivered directly as "naked DNA." This method is described, for example, in Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990), and U.S. Patent Nos. 5,580,859 and 5,589,466. For example, ballistic delivery may be used to administer the nucleic acid, as described in US Pat. No. 5,204,253. Particles containing only DNA may be administered. Alternatively, DNA may be adhered to particles such as gold particles. Nucleic acids can also be complexed and delivered with cationic compounds such as cationic lipids. Methods for lipid-mediated gene delivery are described, for example, in WO 96/18372, WO 93/24640, Mannino and Gould-Forerite (1988) BioTechniques 6 (7): 682-691, and the US patent to Rose. No. 5,279,833, WO 91/06309, and Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414. The peptides of the present invention can also be expressed by attenuated viral hosts such as vaccinia or fowlpox. The method of the present invention comprises using vaccinia virus as a vector to express a nucleotide sequence encoding a peptide of the present invention. Upon introduction into an acute or chronic infected or uninfected host, the recombinant vaccinia virus expresses an immunogenic peptide, thereby inducing a host CTL response. Vaccinia vectors and methods useful for immunization protocols are described, for example, in US Pat. No. 4,722,848, which is incorporated herein by reference. Another vector is BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG vectors are described in Stover et al. (Nature 351: 456-460 (1991)), which is incorporated herein by reference. A wide variety of other vectors useful for therapeutic administration or immunization of the peptides of the present invention, such as the Salmonella typhi vector, will be apparent to those skilled in the art from the description herein.
[0080]
A preferred means of administering a nucleic acid encoding a peptide of the invention uses a minigene construct encoding a multiple epitope of the invention. To generate a DNA sequence encoding a CTL epitope (minigene) selected for expression in human cells, the amino acid sequence of the epitope is back-translated. The human codon usage table is used to guide codon selection for each amino acid. These epitope-encoding DNA sequences are immediately adjacent to create a continuous polypeptide sequence. Additional elements may be incorporated into the minigene design to optimize expression and / or immunogenicity. Examples of amino acid sequences that may be back-translated and included in the minigene sequence include helper T lymphocyte epitopes, leader (signal) sequences, and endoplasmic reticulum retention signals. Also, MHC expression of a CTL epitope can be improved by including synthetic (eg, poly-alanine) or natural flanking sequences adjacent to the CTL epitope.
[0081]
The minigene sequence is converted to DNA by assembling oligonucleotides encoding the plus and minus strands of the minigene. Using known techniques, under appropriate conditions, overlapping oligonucleotides (30-100 bases in length) are synthesized, phosphorylated, purified, and annealed. The ends of the oligonucleotide are spliced using T4 DNA ligase. This synthetic minigene encoding a CTL epitope polypeptide can then be cloned into a desired expression vector.
[0082]
Standard regulatory sequences known to those of skill in the art are inserted into the vector to ensure expression in the target cells. Several vector elements are required: a promoter with a downstream cloning site for minigene insertion, a polyadenylation signal for efficient transcription termination, an E. coli origin of replication, and an E. coli selectable marker (eg, ampicillin). Or kanamycin resistance). For example, a number of promoters can be used for the purposes of the present invention, such as the human cytomegalovirus (hCMV) promoter. See U.S. Patent Nos. 5,580,859 and 5,589,466 for other suitable promoter sequences.
[0083]
Additional vector modifications may be desirable to optimize minigene expression and immunogenicity. In some cases, introns are required for efficient gene expression, and one or more synthetic or natural introns may be incorporated into the transcribed region of the minigene. Insertion of mRNA stabilizing sequences can also be considered to increase minigene expression. It has recently been proposed that immunostimulatory sequences (ISS or CpG) play a role in the immunogenicity of DNA vaccines. These sequences may be inserted outside the minigene coding sequence of the vector, if known to enhance immunogenicity.
[0084]
In some embodiments, a bicistronic expression vector to allow production of the epitope encoded by the minigene and a second protein inserted to enhance or reduce immunogenicity can be used. Examples of proteins or polypeptides that would beneficially enhance the immune response when co-expressed include cytokines (eg, IL2, IL12, GM-CSF), cytokine-inducing molecules (eg, LeIF), or costimulation Molecules. Helper (HTL) epitopes may be linked to an intracellular target signal and expressed separately from the CTL epitope. By doing so, the HTL epitope can be induced in a different cell compartment from the CTL epitope. Where necessary, this would facilitate the more efficient entry of HTL epitopes into the MHC class II pathway, thereby improving CTL induction. Unlike CTL induction, specifically reducing the immune response by co-expression of an immunosuppressive molecule (eg, TGF-β) may have benefits for certain diseases.
[0085]
Once the expression vector has been selected, the minigene is cloned into the polylinker region downstream of the promoter. This plasmid is transformed into an appropriate E. coli strain and the DNA is made using standard techniques. Restriction enzyme mapping and DNA sequence analysis are used to confirm the orientation and DNA sequence of the minigene and all other elements contained in the vector. Bacterial cells carrying the appropriate plasmid can be stored as a master cell bank and a study cell bank.
[0086]
A therapeutic amount of plasmid DNA is produced by fermentation in E. coli followed by purification. An aliquot of the study cell bank is used to inoculate a fermentation medium (such as Terrific Broth) and grow to saturation in shake flasks or bioreactors by known techniques. Plasmid DNA can be purified using standard bioseparation techniques, such as solid phase anion exchange resins supplied by Qiagen. If necessary, supercoiled DNA can be isolated from open circular and linear forms using gel electrophoresis or other methods.
[0087]
Various formulations can be used to formulate the purified plasmid DNA for injection. The simplest of these is to dissolve the lyophilized DNA in sterile phosphate buffered saline (PBS). Various methods have been described and new technologies may become available. As noted above, nucleic acids are conveniently formulated with cationic lipids. Also, compounds called glycolipids, fusogenic liposomes, peptides and collectively protective, interactive, non-condensing (PINC) complexes with purified plasmid DNA to provide stability, muscle It may affect variables such as internal scatter or trafficking with specific organs or cell types.
[0088]
Target cell sensitivity can be used as a functional assay for expression of CTL epitopes encoded by minigenes and MHC class I expression. Plasmid DNA is introduced into a mammalian cell line that is suitable as a target for a standard CTL chromium release assay. The transfection method used will depend on the final formulation. Electroporation can be used on "naked" DNA, while cationic lipids can be directed to in vitro transfection. Plasmids expressing green fluorescent protein (GFP) can be co-transfected and the transfected cells can be enriched using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then chromium-51 labeled and used as target cells for the epitope-specific CTL lineage. Cell lysis as detected by 51Cr release indicates that MHC expression of the CTL epitope encoded by the minigene has occurred.
[0089]
In vitro immunogenicity is a second method of functional testing of minigene DNA preparations. A transgenic mouse expressing the appropriate human MHC molecule is immunized with the DNA product. The dose and route of administration are formulation dependent (e.g., a solution of DNA in PBS is an intramuscular injection, and lipid-complex DNA is an intraperitoneal injection). Twenty-one days after immunization, spleens are harvested and restimulated for one week in the presence of the peptide encoding each epitope to be tested. These effector cells (CTL) are assayed for cell lysis of peptide-loaded chromium-51 labeled target cells using standard techniques. Lysis of target cells sensitized by MHC loading with a peptide corresponding to the minigene-encoded epitope demonstrates DNA vaccine function to induce CTL in vitro.
[0090]
Similarly, antigenic peptides can be used to induce CTL ex vivo. The resulting CTL can be used to treat chronic infections (viruses or bacteria) or tumors in patients who do not respond to other conventional forms of treatment or respond to peptide vaccine treatment methods. Ex vivo CTL responses to specific etiologies (infectious agents or tumor antigens) are induced by incubating patient CTL precursor cells (CTLp) with antigen presenting cells (APC) and appropriate immunogenic peptides in tissue culture. Is done. After an appropriate incubation period (typically 1 to 4 weeks) when CTLp is activated and matures and proliferates to effector CTL, the cells are injected into the patient and, within the patient's body, the cells are targeted to a specific target. Destroy cells (infected cells or tumor cells). To optimize the in vitro conditions for producing specific cytotoxic T cells, the stimulator cell culture is maintained in a suitable serum-free medium.
[0091]
Prior to incubating the stimulator cells with the activated cells, eg, progenitor CD8 + cells, an amount of the antigenic peptide sufficient to load human class I molecules expressed on the stimulator cell surface is added to the stimulator cell culture. I do. In the present invention, a sufficient amount of peptide is such that about 200, preferably 200 or more human class I MHC molecules can be loaded with the peptide expressed on each surface of the stimulator cells. Preferably, the stimulator cells are incubated with> 20 μg / ml peptide.
[0092]
The quiescent or progenitor CD8 + cells are then incubated with the appropriate stimulator cells for a period of time sufficient to activate the CDS + cells. Preferably, the CD8 + cells are antigen-specifically activated. The ratio of quiescent or progenitor CD8 + (effector) cells to stimulator cells may vary from individual to individual, adaptability of the individual to the culture conditions of lymphocytes as well as disease states or other disease states using the therapeutic methods described herein. It may further depend on variables such as the nature and severity of the condition. However, preferably, the lymphocyte: stimulator cell ratio ranges from about 30: 1 to 300: 1. The effector / stimulant culture can be maintained for as long as necessary to stimulate a therapeutically usable or effective number of CD8 + cells.
[0093]
Induction of CTL in vitro requires specific recognition of the peptide bound to the allele-specific MHC class I molecule on the APC. The number of specific MLIC / peptide complexes per APC is important for CTL stimulation, especially in the primary immune response. Whether the amount of peptide / MHC complex per cell is small enough to make the cells susceptible to lysis by CTL, or sufficient to stimulate a secondary CTL response, the primary response Successful activation of the CTL precursor in the cell (pCTL) requires significantly higher amounts of the MHC / peptide complex. Primary cytotoxic T lymphocyte responses can be induced by peptide loading of empty major histocompatibility complex molecules of cells. Primary cytotoxic T lymphocyte responses can be induced by peptide loading of empty major histocompatibility complex molecules of cells.
[0094]
Since mutant cell lines are not present for all human MHC alleles, techniques for removing endogenous MHC binding peptides from the surface of APCs and then loading the resulting empty MHC molecules with the immunogenic peptide of interest It is advantageous to use The use of non-transformed (non-tumorigenic), non-infected cells, preferably autologous cells of the patient, as APCs is desirable in designing CTL induction protocols aimed at developing ex vivo CTL treatments. The present application discloses a method of removing endogenous MHC binding peptides from APC surfaces and then loading the desired peptides.
[0095]
A stable MHC class I molecule is a trimeric complex formed from the following elements: 1) a peptide, usually 8 to 10 residues, 2) a transmembrane heavy chain that carries peptide binding sites in the α1 and α2 domains. Type protein, and 3) non-polymorphic light chain, β₂Microglobulin. Removal of the binding peptide from the complex and / or β₂The dissociation of microglobulin renders MHC class I molecules non-functional and unstable, resulting in rapid degradation. All MHC class I molecules isolated from PBMC have endogenous peptides attached. Thus, the first step is to remove all endogenous peptides bound to MHC class I molecules on the APC without adding degradation before adding the exogenous peptides.
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Two possible ways to release the MHC class I molecules from the binding peptide are to reduce the culture temperature from 37 ° C to 26 ° C and grow overnight,₂It involves destabilizing microglobulin and removing the endogenous peptides from the cells using weak acid treatment. This method releases previously bound peptides into the extracellular environment and binds new exogenous peptides to empty class I molecules. The low temperature incubation method allows the exogenous peptide to bind efficiently to the MHC complex, but requires an overnight incubation at 26 ° C., which can slow down the metabolic rate of the cells. Cells that are not actively synthesizing MHC molecules (eg, quiescent PBMCs) do not appear to produce large amounts of empty surface MLIC molecules by the cryogenic approach.
[0097]
Removal with a strong acid includes extraction of the peptide with trifluoroacetic acid, pH 2, or acid denaturation of the immunoaffinity purified class I-peptide complex. These methods remove endogenous peptides but are not suitable for CTL induction because it is important to preserve APC viability and optimal metabolic rate, which are essential for antigen presentation. A weak acid solution at pH 3, such as glycine or citrate-phosphate buffer, has been used to identify endogenous peptides and tumor associated T cell epitopes. This treatment is particularly effective in that only MHC class I molecules are destabilized (and the bound peptides are released) while other surface antigens, including MHC class II molecules, remain intact. It is a target. Most importantly, treatment of cells with a weak acid solution does not affect cell viability and metabolic status. Weak acid treatment is rapid. This is because endogenous peptide removal occurs in 2 minutes at 4 ° C., and APCs readily perform their function when loaded with the appropriate peptide. Techniques for making peptide-specific APCs for making primary antigen-specific CTL are used herein. The resulting APC is efficient in inducing peptide-specific CD8 + CTL.
[0098]
Activated CD8 + cells can be effectively separated from stimulator cells using one of a variety of known methods. For example, a stimulator cell, a peptide loaded on the stimulator cell, or a monoclonal antibody (or fragment thereof) specific for CD8 + cells can be used to bind to a suitable complementary ligand. The antibody-labeled molecule can then be extracted from the stimulator-effector cell mixture by any suitable means, such as, for example, known immunoprecipitations or immunoassays.
[0099]
The amount of effective, cytotoxic, activated CD8 + cells may vary for in vitro and in vitro applications, and will depend on the amount and type of cells that are ultimate targets for these killer cells. There is. This amount will also depend on the condition of the patient, and should be determined by the attending physician in considering all appropriate factors. However, about 5 × 10⁶~ 5 × 10⁸Compared to cells, preferably about 1 × 10⁶~ About 1 × 10¹²And more preferably about 1 × 10⁸~ About 1 × 10¹¹And even more preferably about 1 × 10^~~ 1 × 10¹⁰Activated CD8 + is used in adults.
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Preferably, as discussed above, the activated CD8 + is harvested from the cell culture prior to administering the CD8 + cells to the treated individual. However, it is important to note that, unlike other currently proposed treatment methods, the method of the present invention uses a non-tumorigenic cell culture system. Thus, without complete isolation of stimulator cells and activated CD8 + cells, there is no inherent risk known to be associated with the administration of a small number of stimulator cells, but the administration of mammalian tumor-promoting cells is extremely dangerous It may be.
[0101]
Methods for reintroducing cellular components are known in the art and are exemplified in U.S. Patent No. 4,844,893 to Honsik et al. And U.S. Patent No. 4,690,915 to Rosenberg. Including methods such as For example, administration of activated CD8 + by intravenous infusion is appropriate.
[0102]
The immunogenic peptides of the invention can also be used to generate monoclonal antibodies. Such antibodies may be useful as potential diagnostic or therapeutic agents.
[0103]
Peptides can also find use as diagnostic reagents. For example, the peptides of the invention can be used to determine the susceptibility of a particular individual to a method of treatment using a peptide of the invention or a related peptide, and therefore, in improving existing treatment protocols or in prognosis of affected individuals. May be useful in determining The peptides can also be used to predict which individuals are at substantial risk of developing a chronic infection.
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To identify the peptides of the present invention, Class I antigen isolation and isolation and sequencing of naturally processed peptides were performed as described in the related application. These peptides were then used to define binding motifs specific for each of the following alleles A3.2, A1, A11 and A24.1. These motifs are described on page 3 (previous page). The motifs listed in Tables 5-8 below are defined from sequencing pool data of naturally processed peptides described in the relevant applications.
[0105]
Table 5 Summary of HLA-A3.2 allele-specific motifs

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Table 6: Summary of HLA-A1 allele-specific motifs

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Table 7: Summary of HLA-A11 allele-specific motifs

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Table 8: Summary of HLA-A24.1 allele specific motifs

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Example 1
Identification of immunogenic peptides
Using the motifs identified above for various MHC class I alleles, amino acid sequences from various pathogens and tumor-associated proteins were analyzed for the presence of these motifs. Screening was performed as described in the relevant application. Tables 9-10 provide antigen search results.
[0110]
[Table 9]

[0111]
The peptides listed in Table 10 were identified as described above and are classified by the pathogen or antigen from which they were derived.
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[Table 10]

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The above description has been provided to illustrate the invention, but not to limit the scope of the invention. Other forms of the invention will be readily apparent to those skilled in the art and are within the scope of the appended claims. All publications, patents, and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference.

Claims (11)

A composition comprising an immunogenic peptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-42. The composition of claim 1, wherein the immunogenic peptide has a sequence derived from hepatitis B virus and is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20-24. The composition of claim 1, wherein the immunogenic peptide has a sequence derived from hepatitis C virus and is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25-27. 2. The composition of claim 1, wherein the immunogenic peptide has a sequence from a human immunodeficiency virus and is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28-35. The composition of claim 1, wherein the immunogenic peptide has a sequence derived from CEA and is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 36-42. 2. The composition of claim 1, further comprising a pharmaceutically acceptable excipient. The composition of claim 1, wherein the peptide is mixed or conjugated to the second molecule. The composition of claim 1, further comprising a liposome. 2. The composition of claim 1, wherein the peptide forms a complex with an HLA molecule present on the antigen presenting cell. A recombinant nucleic acid sequence encoding an immunogenic peptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-42. A method for inducing a cytotoxic T cell response to a preselected antigen in a patient expressing a selected HLA molecule, wherein the patient-derived cytotoxic T cell is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-42. Contacting with a composition comprising the immunogenic peptide to be prepared.