JP2004508065A - CD11b発現細胞に対する分子送達用ベクター - Google Patents
CD11b発現細胞に対する分子送達用ベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004508065A JP2004508065A JP2002526418A JP2002526418A JP2004508065A JP 2004508065 A JP2004508065 A JP 2004508065A JP 2002526418 A JP2002526418 A JP 2002526418A JP 2002526418 A JP2002526418 A JP 2002526418A JP 2004508065 A JP2004508065 A JP 2004508065A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adenyl cyclase
- cd11b
- cells
- molecule
- cyaa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 title claims abstract description 154
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 title claims abstract description 154
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 64
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 claims abstract description 150
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 claims abstract description 150
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 80
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 80
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 claims abstract description 38
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 240
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 75
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 72
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 70
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 70
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 55
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 51
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 26
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 25
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 claims description 25
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 23
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 14
- 241001135529 Bordetella sp. Species 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 5
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 4
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 73
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 46
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 34
- 230000004044 response Effects 0.000 description 28
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 23
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 22
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 19
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 18
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 17
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 17
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 17
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 13
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 11
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 8
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 8
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 6
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 6
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 5
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 5
- 230000001593 cAMP accumulation Effects 0.000 description 5
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 101150101102 cyaA gene Proteins 0.000 description 5
- 101150096136 cyaC gene Proteins 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 4
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 4
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 4
- 230000037453 T cell priming Effects 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PTHLSIBOMNYSIS-UHFFFAOYSA-N 5-(4-aminophenyl)-8-chloro-3-methyl-1,2,4,5-tetrahydro-3-benzazepin-7-ol Chemical compound C1N(C)CCC2=CC(Cl)=C(O)C=C2C1C1=CC=C(N)C=C1 PTHLSIBOMNYSIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010083528 Adenylate Cyclase Toxin Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- 101100276209 Rhizobium meliloti (strain 1021) cya1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 101150084863 cya gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000013227 macrophage apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QLPHBNRMJLFRGO-YDHSSHFGSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-[6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexyl]pentanamide Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 QLPHBNRMJLFRGO-YDHSSHFGSA-N 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 2
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 101100462972 Mus musculus Pcdh8 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 2
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 2
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003133 propidium iodide exclusion Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- SOGTULYCPNFAGT-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-amino-3-[(3-nitropyridin-2-yl)disulfanyl]propanoic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CSSC1=NC=CC=C1[N+]([O-])=O SOGTULYCPNFAGT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UYYRDZGZGNYVBA-VPXCCNNISA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[2-chloro-4-[3-(3-chloro-4-hydroxyphenyl)-1,1-dioxo-2,1$l^{6}-benzoxathiol-3-yl]phenoxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(Cl)C(O)=CC=2)C=C1Cl UYYRDZGZGNYVBA-VPXCCNNISA-N 0.000 description 1
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000776564 Acetobacter cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100034534 Adenomatous polyposis coli protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000190564 Capnocytophaga haemolytica Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037355 Chromosome alignment-maintaining phosphoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000006460 Cyana Species 0.000 description 1
- FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane-1,2-diaminetetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1CCCCC1N(CC(O)=O)CC(O)=O FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N Gly-Thr-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000924579 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000741320 Homo sapiens Cathelicidin antimicrobial peptide Proteins 0.000 description 1
- 101000880066 Homo sapiens Chromosome alignment-maintaining phosphoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100341519 Homo sapiens ITGAX gene Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100019396 Mus musculus Itgax gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010077960 Neurocalcin Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- XFLVBMBRLSCJAI-ZKWXMUAHSA-N biotin amide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)N)SC[C@@H]21 XFLVBMBRLSCJAI-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- XFLVBMBRLSCJAI-UHFFFAOYSA-N biotin amide Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)N)SCC21 XFLVBMBRLSCJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 101150031985 cyaB gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 101150079947 hlyB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150104052 hlyD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006450 immune cell response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N leucyl-glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000011815 naïve C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000031972 neutrophil apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000051 skin sensitiser Toxicity 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004861 thermometry Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 108010055094 transporter associated with antigen processing (TAP) Proteins 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/099—Bordetella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y406/00—Phosphorus-oxygen lyases (4.6)
- C12Y406/01—Phosphorus-oxygen lyases (4.6.1)
- C12Y406/01001—Aodenylate cyclase (4.6.1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
発明の背景
本発明は、CD11b発現細胞に対し特異的に問題の分子をin vivoでターゲティングするためのベクターの製造におけるBordetellaアデニルシクラーゼ毒素の新規使用に関する。本発明は同様に、免疫応答をプライミングする免疫原性組成物、CD11b発現細胞への分子送達のための薬学組成物及び新しいベクターに関する。
【0002】
百日咳の原因物質であるBordetella pertussisは、周知のpertussis毒素(PT)及びアデニル酸シクラーゼ毒素(CyaA)又同様にアデニルシクラーゼをも含めた複数の毒素を分泌する。CyaAは、肺のコロニー化の早期段階に必要とされるマウスの呼吸器モデルにおけるB.pertussisのきわめて重要な毒性因子である。実際、この毒素の遺伝学的欠失は、B.pertussis感染の病理的効果を劇的に減少させ、肺から回収される細菌数を減少させ、感染後に見られる炎症性細胞動員及び肺病巣をほぼ一掃する[Weiss et al., 1984;Weiss et al., 1989;Gross et al., 1992;Khelef et al., 1992;Khelef et al., 1994;Gueirard et al., 1998].その上、CyaAは、マウスの呼吸器モデルにおけるB.pertussis感染に対し保護する抗原である[Guiso et al., 1989;Guiso et al., 1991].
当初B.pertussis培養上清中でHewlett et alにより発見された[Hewlett et al., 1976]アデニルシクラーゼは、後に真核性カルモジュリンにより活性化されることが発見された[Wolff et al., 1980]。この特筆すべき特長はまもなく、アデニルシクラーゼが真核細胞内に入りそこでカルモジュリンにより活性化された時に標的細胞内でcAMPの大幅な増加をひき起こすことができるということがConfer及びEatonによって示された時点で1つの理論的根拠を見い出した[Confer et al., 1982]。
【0003】
アデニルシクラーゼは、CyaA遺伝子によりコードされ、その発現は、B. pertussisのその他の毒性遺伝子の発現と同様、環境シグナルにより協調的に調節される。CyaA 遺伝子は、同じくCyaAの分泌に必要とされる遺伝子cyaB、D及びEをも含むオペロンの一部である[Ladant et al., 1999]。
【0004】
CyaA毒素は、400個のアミノ酸のN末端触媒ドメイン及び、標的細胞に対する毒素の結合及びその後の細胞の細胞質ゾル内への触媒半分の送達を担当する1306個の残基のC末端部分から成る1706個の残基の2機能性タンパク質である[Sakamoto et al., 1992][Ladant et al., 1999]。この部分は同様に、生体膜内でカチオン選択的チャンネルを形成するその能力に起因して弱い溶血活性を示す[Benz et al., 1994][Gray et al., 1998]。この領域は、Escherichia coliヘモリシン及び細菌毒素のRTX(Toxin中の反復)のその他の成員と相同性をもつ。特に、それは、カルシウム結合に関与する一連のグリシン及びアスパラギン酸塩富有ノナペプチド反復を含有する[Rose et al., 1995][Coote et al., 1992]。
【0005】
CyaAポリペプチドは、2つの内部リシン(リシン856及び963)の翻訳後パルミトイル化により活性毒素に変換される不活性プロトキシンとして合成される。この修飾には、B. pertussis染色体上のCyaAの近くにあるアクセサリー遺伝子 cyaCの産物が必要である。
【0006】
CyaAは、哺乳動物の赤血球のような膜輸送が欠如した細胞を含めたさまざまな細胞型に結合し、これに侵入することが示されてきた[Rogel etl al., 1992]。このことは、CyaAの触媒ドメインが、標的細胞の原形質膜を横切って直接転座させられることを示唆していた。細胞の細胞質ゾル内への触媒ドメインの内在化は、カルシウム及び温度に依存し、原形質膜の電位によって左右される[Rogel et al., 1992][Karimova et al., 1998][Otero et al., 1995]。しかしながら、毒素が膜を横断してそのN末端触媒ドメインを輸送する分子メカニズムは、大部分が今日までなお未知のままである。その上、CyaA結合については、いかなる特異的レセプタも報告されていない。
【0007】
CyaAにより細胞中毒の生理学的帰結は、in vitroで食作用において特徴づけされた。Confer及びEatonは、B. pertussisから抽出されたCyaAが好中球又はマクロファージ内の細胞内cAMPレベルを増大させ、化学定性及びスーパーオキサイド生成及び食作用能力といったような殺菌機能の阻害を導くことを初めて示した[Confer et al., 1982]。これらの活性はその後、精製された毒素又はCyaAを遺伝学的に欠失させた細菌突然変異体について確認された[Pearson et al., 1987;Friedman et al., 1987][Njamkepo et al., 2000]。反対に、そのcAMP含有量の有意な変化にも関わらず、非造血性由来の細胞系統の生存度は、CyaA中毒による影響を受けないように思われた[Bassinet et al., 2000]。その上、本発明人は、B. pertussisCyaAがin vitro[Khelef et al., 1993;Khelef et al., 1995]及びin vivo[Gueirard et al., 1998]でマクロファージアポプトーシスを引き起こし得るということを以前に実証した。これらのモデルでは、CyaAの遺伝学的欠失が、マクロファージアポプトーシスを一掃したものの好中球の死は一掃せず、このことは、CyaAがi)主としてマクロファージアポプトーシスの原因であり、ii)好中球のアポプトーシスの原因である可能性もあるものの、もう1つの因子も同様にその原因でありうるということを示唆している。
【0008】
そのほかに、B.bronchiseptica感染(そのCyaAが密接に関係するB. pertussisの動物相同体)のマウスモデルで実施されたin vivo研究は、B.bronchisepticaCyaA毒性の主要な標的が早期感染段階を制御するGM−CSF依存性でかつシクロホスファミド感応性の個体群であることを実証した[Harvill et al., 1999]。これらの基準は、好中球そして場合によってはマクロファージ又は樹状細胞を含めたその他の細胞を同定したが、CD11bレセプタがCyaAによるターゲティングに関与しているというデータは全く開示又は示唆されていない。CyaAについての標的細胞のこれらの個体群は、早期感染段階を制限しかつ後期感染段階を制御する適応性免疫応答の発達に有利に作用するものと同じである[Harvill et al., 1999]。
【0009】
その他の毒素とは異なり、CyaAは、長い間、いかなるレセプタ結合とも無関係であるとみなされてきた。これは、i)CyaAが由来の異なる多様なモデル細胞系統を中毒させることができる[Ladant et al., 1999];ii)CyaAは飽和不能な形でジャーカット細胞及びヒツジ赤血球に結合する[Gray et al., 1999]、という観察事実に基づいている。しかしながら、CyaAによる感染を受けた細胞に関し、幾分かの特異性がみられた。実際、in vivo研究は、Bordetella種でのマウス呼吸器感染の間に、CyaAが、上皮細胞に劇的に損傷を加えることなく白血球(特にマクロファージ)を特異的に破壊するということを示した[Gueirard et al., 1998;Harvill et al., 1999]。
【0010】
特許出願WO93/21324においては、CD4+T細胞又はCD8+T細胞応答を誘発するために組換え型Bordetellaアデニルシクラーゼを使用することが提案された。しかしながら、Bordetellaアデニルシクラーゼについての特異的レセプタは全く同定されなかったことから、non−professional(外来の)提示細胞による摂取とそれに続く樹状細胞による交叉プライミング及び提示に抗原提示が関係しているか否か、又は抗原がprofessional(本来の)抗原提示細胞(pAPC)にターゲティングされるか否かはわからなかった。
【0011】
その表面表現型と一致して、樹状細胞(MHCI及びII、同時刺激及び粘着分子)は、ナイーブT細胞のプライミングについて数多くのin vitro検定において最も潜在能の高いAPCを表わす[Bell et al., 1999;Viola et al., 1999]。例えば、その他のAPC様の休止ナイーブB細胞は、休止雄B細胞を雌の宿主に注入すると雄特異的CD8+T細胞の特異的寛容化が導かれることから、寛容原性でさえあり得る[Fuchs et al., 1992]。in vitroで、ナイーブB細胞は、Fab依存性メカニズムを介して、ナイーブCD8+T細胞を欠失し得る[Bennett et al.,1998]。その上、CDによるAg提示は、in vivoでT細胞応答の誘発と相関関係をもつ。このことは、MHCII制限されたAg提示について立証されてきた。静脈内(iv)経路を介してのアジュバントを含まないAgの注射は、通常T細胞のプライミングを誘発せず[Kyburz et al.,1993;Aichele et al.,1994;Aichele et al.,1995]、非特異的B細胞[Guery et al.,1997][Zhong et al.,1997;Reis e Sousa et al.,1999]そして場合によっては樹状細胞[Crowley et al.,1990][Zhong et al.,1997;Reis e Sousa et al.,1999]によるAgの提示を導く。
【0012】
これとは対照的に、アジュバントの存在下での皮下(sc)免疫化のような局所的免疫化戦略は、通常、T細胞のプライミング及び、皮ふから免疫化部位にドレンするLNまで移動するランゲルハンス細胞によるターゲティングされたAgの提示を誘発する。この場合、B細胞及びマクロファージは関与しない[Guery et al.,1996]。MHCII及びMHCIペプチド複合体についてのSC又は皮内(id)DNA免疫化の後にも、類似の結果が得られた: 樹状細胞は、局所的注入部位で直接トランスフェクトされ得、その後、輸入リンパ管を介して輸入LNまで移動することができる[Condon et al.,1996;Casares et al.,1997;Porgador et al., 1998]。輸入リンパ管の機械的分断は、皮ふの感作物質又は皮ふ移植片に対するT細胞応答を排除することから、移動は免疫性の主要な事象として知られている[Zinkemagel et al.,1997]。
【0013】
従って、樹状細胞に対するターゲティングは、CD4+及びCD8+T細胞の刺激にとって不可欠である。大部分の抗体応答が、CD4+T細胞ヘルプに依存していることから、樹状細胞に対し抗原をターゲティングすることは、ワクチン接種の主要な最終目的である。
【0014】
出願人らは、T細胞によるBordetella種のアデニルシクラーゼの提示を研究することに興味をもち、CyaAと相互作用し問題の分子のためのタンパク様ベクターとしてのCyaAの使用についての新たな可能性を開く、特異的細胞上に存在する特異的レセプタ分子を同定した。
【0015】
遺伝学的に解毒された細胞毒素は、真核細胞に侵入するその能力に起因して、特にTエピトープについてのワクチンベクターとしての候補である(Ladant et al., 1999)。しかしながら、in vivoでのCTL応答をプライミングすることが示されたタンパク様ベクターはほとんどない(Ballard et al., 1996、Cabonette et al., 1999)。その上、数多くのin vitroでの将来有望な研究にもかかわらず、pAPC、特に樹状細胞、そしてより特定的には骨髄性樹状細胞に対し排他的にターゲティングされるものとして示されたベクターは全くない。
【0016】
発明人らは、その他の細胞、特に好中球が本発明のベクターによりターゲティングされ得るということを示した。
【0017】
本発明は、少なくとも部分的にこれらのニーズを満たすことのできる手段を提供し、例えば免疫応答の刺激を可能にするべくpAPCの規定の集団に対し分子を特異的にターゲティングするような新規のベクターを提案している。
【0018】
その上、pAPC及びその特異的白血球にターゲティングされた分子は、これらの細胞の近位環境に生物学的に活性な分子を送達するのに有用な新しいベクターの製造を可能にすることになる。これらの分子は、例えば、ターゲティングされた細胞又は免疫応答又は炎症性応答に関与する細胞の機能的特性を変調させることができる。
【0019】
実際、発明人らは、Bordetella pertussisアデニルシクラーゼ毒素が細胞レセプタが指定した(CD11b/CD18)αM/β2レセプタと特異的に結合すること、そしてこの相互作用が、細胞の細胞質ゾルに対するアデニルシクラーゼドメインの細胞内送達のため、そしてその後細胞死のために必要とされることを発見した。αM/β2(CD11b/CD18)インテグリンは、β2インテグリン系統群の2量体であり、これらのインテグリンの発現は、白血球に制限されている。CD11b/CD18αM/βは、好中球/顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、NK細胞及びB及びTCD8+リンパ球のサブセットに制限されているマウス及びヒトにおける発現パターンを表示する(Jeyaseelan et al., 2000、Amaout et al., 1990)。
【0020】
従って、このレセプタは、特にTエピトープ免疫化のために設計された新しいベクターのための理想的な標的を表わすものとなるだろう。
【0021】
出願人らは、本発明においてCD11b発現細胞に特異的にin vivoで分子をターゲティングするためにBordetellaアデニルシクラーゼを使用することができるということを示した。
【0022】
特に、出願人らは本発明において、Bordetella pertussisアデニルシクラーゼ毒素の中に含まれるペプチド抗原が、効率良く、樹状細胞の表面に特異的にターゲティングされ、前記樹状細胞の細胞質ゾル内に転座され、CTL応答プライミングすることができる、ということを示した。
【0023】
特定の実施形態においては、前記応答は、アジュバント必要条件及びCD4+T−細胞ヘルプを迂回して得られる。
【0024】
同様に、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼを問題のペプチドに化学的にカップリングさせて、このペプチドをCD11b発現細胞、特に樹状細胞の細胞質ゾルにターゲティングすることができるということも示された。
【0025】
本発明はかくして、新しく効率の良い免疫原性組成物ならびに、CD11b発現細胞に対する新しい薬物送達ベクターを提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、CD11b発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするためのタンパク様ベクターの製造におけるBordetellaアデニルシクラーゼの使用に関する。
【0026】
本発明は同様に、CD11b発現細胞に対し特異的に問題のペプチド又は分子をターゲティングするための組成物の調製を目的とした、抗原で組換えされ特に該ペプチドの挿入により修飾されるか又は該分子の挿入によって修飾されているBordetellaアデニルシクラーゼの使用にも関する。
【0027】
「特異的」という語は、本発明では、アデニルシクラーゼが問題の分子のためのベクターとして使用される場合、好ましくはCD11b発現細胞に向けられ、かくして、前記細胞の表面又は前記細胞の内部で、その他の細胞との関係において選択的に問題の分子をターゲティングするための手段を提供することを意味している。
【0028】
発明の一実施形態においては、問題の分子は、基本的にCD11b発現細胞に向けられている。
【0029】
本書で使用されているように、CD11b発現細胞という語は、その表面上でCD11b/CD18 αmβ2レセプタを発現する細胞に関する。特に、これらの細胞は、顆粒球/好中球、マクロファージ、NK細胞、TCD8+及びB細胞及び骨髄性樹状細胞である。
【0030】
CD11b発現細胞そしてより特定的には骨髄性樹状細胞、好中球及びマクロファージは免疫及び生得的防御系の基本的機能、特に炎症性及び特異的免疫応答に関与することから、本発明は、これらのCD11b発現細胞特に骨髄性樹状細胞、好中球又はマクロファージに対し問題の分子又はペプチドをターゲティングする能力をもつタンパク様ベクター又は組成物の製造に関する。
【0031】
特に、1つの実施形態においては、前記分子又はペプチドのターゲティングはin vivoで有効である。
【0032】
かくして、本発明は、或る種の白血球特に骨髄性樹状細胞、好中球又はマクロファージのターゲティングを必要とする動物又はヒト宿主に対する投与にとって適当な組成物の設計のために適切な手段を提供する。
【0033】
Bordetellaアデニルシクラーゼは、Bordetella種の中で分泌されるカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼ又はそのフラグメントであり、該フラグメントは、肺の中の細菌コロニー化の初期段階にとって必須の主要毒性因子であるアデニルシクラーゼの機能特性を保持する。アデニルシクラーゼは、1706個のアミノ酸のポリペプチドの形で合成され分泌される。カルモジュリン依存性触媒活性は、最初の400個のアミノ酸中に局在化されている。活性であるために、前記アデニルシクラーゼ毒素には、CyaC遺伝子産物の同時発現によって翻訳後修飾された時点で侵襲性かつ溶血性が付与される。Bordetellaアデニルシクラーゼ毒素の以下の特異的特長は、この毒素が、問題の分子をin vivoでCD11b発現細胞にターゲティングするためのタンパク様ベクターの製造に使用できるものであることを表わしている:
a)このアデニルシクラーゼは、CD11b発現細胞に特異的に結合する:
b)N末端触媒ドメインは、これらのCD11b発現細胞の細胞質ゾル内に転座させられる。
【0034】
c)C末端ドメインは、CD11b発現細胞の膜に結合し、環内経路によって内在化され得る。
【0035】
d)遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼに化学的に結合されたエピトープが、in vivo特異的CTL応答を惹起することができる。
【0036】
「アデニルシクラーゼ」という表現は、本発明の中では、結果として得られる産物が問題の分子をCD11b発現細胞に特異的にターゲティングすることができるということを条件として、遺伝学的に又は化学的に修飾されたアデニルシクラーゼを含めた天然の又は修飾されたアデニルシクラーゼを包含する。
【0037】
かくして、本発明は、上述の通りのBordetellaアデニルシクラーゼの使用、そしてより特定的には、CD11b発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするための修飾された又は組換え型アデニルシクラーゼの使用に関する。
【0038】
より特定的には、組換え型アデニルシクラーゼには、触媒ドメイン内に挿入されたペプチド配列又はシステイン残基を伴うアデニルシクラーゼか又はその触媒ドメインの全て又は一部分が欠如した切形アデニルシクラーゼのいずれかを提供するように遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが含まれる。
【0039】
Bordetellaアデニルシクラーゼ毒素とCD11b/CD18αmβ2レセプタの間の特異的相互作用に起因して、問題の分子は、少なくともCD11b発現細胞の表面に特異的にターゲティングされる。本発明の特定の1実施形態においては、Bordetellaアデニルシクラーゼ毒素は、CD11b発現細胞の細胞質ゾル内、CD11b発現細胞の表面、又はCD11b発現細胞の環内経路内へのいずれかに問題の分子を送達するためのタンパク様ベクターの製造において使用される。
【0040】
組換え型Bordetellaアデニルシクラーゼの調製のための発現ベクターは、特許出願WO93/21324(Institut Pasteur)の中で記述されている。問題の分子の化学的カップリングのために適切な遺伝学的に修飾されたBordetellaアデニルシクラーゼの調製のための新規の発現ベクターも同様に、以下の実験の部で記述されている。より特定的には、CyaA遺伝子及びCyaC遺伝子の両方の発現を導く発現ベクターを構築することができる(Sebo et al., 1991)。これと並行して、例えばMeckman et al., 1985の中で記述されているようなhlyB及びhlyDといったE. coli内の細胞毒性アデニルシクラーゼの分泌に必要な遺伝子を担持する二次的プラスミドを構築することが可能である。特に、WO93/21324において記述されている発現プラスミドを使用することができる。このプラスミドを使用すると、アデニルシクラーゼをE. coli内で発現させ、場合によってはこの細菌内で大量に分泌させることができる。又、それは、例えば、CaM Affi−Gel樹脂上の親和性クロマトグラフィを用いて、又はDE AE−セファロース及びフェニル−セファロースを用いたもののようなその他の公表された手順によって、容易に精製される(Guermonprez et al., 2000)。
【0041】
本発明の一実施形態においては、アデニルシクラーゼは、組換え型の遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである。特に、CD11b発現細胞に結合するためそして任意には細胞質ゾル内の転座のために必要なドメインがなお機能的であることを条件として、通常の部位特異的又は無作為突然変異誘発技術を用いて、点突然変異、欠失又は挿入といったような突然変異を得ることができる。CD11b発現細胞に対する組換え型毒素及びそのフラグメントの特異的結合そして任意にはその後の触媒ドメインの転座を評価するための検定については、以下の実験の部で記述されている。
【0042】
本発明のもう1つの実施形態においては、組換え型Bordetella種アデニルシクラーゼは、未変性、修飾済み又は組換え型Bordetella種アデニルシクラーゼ毒素のフラグメントであり、ここでこのフラグメントは、CD11bレセプタを結合する能力をもつ。特に、本発明では、残基373〜1706(CyaA373−1706)を包含するフラグメントがCD11b/CD18レセプタとの相互作用のために基本的に必要とされる構造を含有することが発見された。かくしてBordetella種アデニルシクラーゼ毒素の好ましいフラグメントは、N末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如したBordetellaアデニルシクラーゼ毒素、そしてより特定的には、残基1−373の全て又は一部分が欠如したBordetella pertussisアデニルシクラーゼである。
【0043】
CD11bに対する特異的結合は、例中に例示されているように抗−CD11bモノクローナル抗体でin vitroで査定できる。
【0044】
タンパク様ベクターの製造又は組成物の調製において使用されるためには、アデニルシクラーゼは好ましくは非毒性である。アデニルシクラーゼ毒素の非毒性突然変異体は、当該技術分野において充分記述されている(Betsou et al., 1993:Betsou et al., 1995。
【0045】
本発明の好ましい実施形態においては、アデニルシクラーゼは、Bordetella pertussisから分離される。
【0046】
特定の実施形態においては、問題の分子は、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中で選択される。
【0047】
特定的実施形態においては、問題の分子は、異種抗原である。本書に使用されている「異種」という語は、ベクター自体の中で使用されるアデニルシクラーゼ以外の抗原を意味する。
【0048】
本発明の好ましい実施形態において、タンパク様ベクターの製造は異種分子特にペプチドを許容部位にてアデニルシクラーゼの触媒ドメイン内に挿入する段階を含んで成る。
【0049】
本書で使用されている、「許容部位」という語は、異種分子特にペプチドが、アデニルシクラーゼ毒素の望ましい機能的特性に実質的な影響を及ぼすことなくすなわちCD11b/CD18レセプタに対する特異的結合に必要なドメインに影響を及ぼすことなくそして有利には、触媒ドメインの転座のプロセスに影響を及ぼすことなく挿入され得る1つの部位に関係する。好ましい実施形態においては、ターゲティングされた細胞内でcAMPの合成を促進するためのCyaA毒素の能力はさらに維持されている。
【0050】
許容部位のための選択方法は、例えば、WO93/21324内及びLandant et al., 1992内に紹介されている。特に、2重選択(抗生物質に対する耐性及びα−相補による皿上の測熱試験)を用いた方法により、毒素のN末端触媒ドメインについてコードする遺伝子の部分における(読取り枠を保存する)オリゴヌクレオチド挿入を直ちに同定することが可能となる。毒素の触媒活性に対するこれらの突然変異の機能的帰結は、遺伝学的(E. coli cya−菌株の機能的相補)及び生化学的(修飾されたアデニルシクラーゼの安全性、その酵素活性、caMとのその相互作用などの特徴づけ)の両方の形で容易に分析可能である。この方法論により、抗原決定因子の挿入にとって潜在的に有利な部位を同定するために多数の突然変異をスクリーニングすることが可能になった。
【0051】
本発明の特定の実施形態においては、許容部位が、Bordetella pertussisアデニルシクラーゼの残基137〜138、残基224〜225、残基228〜229、残基235〜236、残基317〜318そして残基335〜336から成るグループの中から選択されている。
【0052】
しかしながら、本発明においては、例えば、上述の方法論を使用することによって同定され得るその他の許容部位、特に残基400〜1700の間の部位を同定することができる。
【0053】
タンパク様ベクターの製造には同様に、そのN末端触媒ドメインの全部又は一部分が欠如したBordetellaアデニルシクラーゼ、より好ましくは残基1〜373が欠如したBordetella pertussisアデニルシクラーゼのN末端において例えば異種ペプチドといった問題の分子を融合する段階を含まれる可能性もある。
【0054】
発明の好ましい1実施形態においては、上述の定義の1つに従ったアデニルシクラーゼは、タンパク様ベクターの製造又はCD8+細胞毒性T−細胞応答(CTL応答)をプライミングするために特異的に設計された組成物の調製において使用され、ここでその応答は、CD11b発現細胞に対する問題の分子で修飾(特に組換え又は接合)されたアデニルシクラーゼのターゲティングとその後の問題の分子の前記CD11b発現細胞の細胞質ゾル特に骨髄性樹状細胞に対する転座に追従している。この状況下で、問題の分子は、好ましくはエピトープ又は抗原であるか又はこれを含んで成る。
【0055】
本書で使用する「エピトープ」という語は、免疫応答を誘発できる異種分子そして特に異種ペプチドを意味する。
【0056】
特定の実施形態においては、抗原は、細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原から成るグループの中から選択される。
【0057】
本発明の好ましい実施形態においては、上述の定義づけの1つに従ったアデニルシクラーゼ、すなわち天然、修飾済み又は組換え型アデニルシクラーゼは、タンパク様ベクターの製造又はCD4+細胞の応答をプライミングするために特異的に設計された組成物の調製において使用され、ここでこの応答は、特に骨髄性樹状細胞におけるCD11b発現細胞に対する問題の分子で修飾(特に組換え又は接合)されたアデニルシクラーゼのターゲティングに追従している。この状況下で、問題の分子は、好ましくはエピトープ又は抗原であるか又はこれを含んで成る。
【0058】
問題の分子は、特に、ポリオウイルス抗原、HIVウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルスエピトープ、腫瘍抗原から成るグループの中から選択された抗原であり得る。
【0059】
CD11b発現細胞の機能的特性は、これらの特異的細胞をターゲティングする薬物のためのタンパク様ベクターの製造におけるBordetellaアデニルシクラーゼ毒素の新規使用を画定する。この状況下で、本発明の1つの特定的実施形態においては、いわゆる問題の分子は薬物である。前記薬物は、アデニルシクラーゼに対し化学的又は遺伝学的にカップリングされ得る。ポリペプチドに対する薬物のカップリング方法は、当該技術分野において周知であり、例えばN−ピリジルスルフォニル活性化スルフヒドリルを用いることによるジスルフィドリンケージを含む。
【0060】
有利には、問題の分子は、アデニルシクラーゼ毒素にカップリングされた時点で、好中球といったような炎症性応答に関与する細胞の表面に対し特異的にターゲティングされる抗炎症薬である。
【0061】
特に、「実験の部」では、CD11b+抗原提示細胞特にCD11B+抗原提示細胞の細胞質ゾルにin vivo ターゲティングするため化学的リンケージ又は遺伝学的挿入によりCyaAに分子を移植できるということが初めて示されている。実際、ジスルフィド結合又は遺伝学的挿入のいずれかを用いて、解毒済みCyaAの触媒ドメインに対し一定の与えられたCD8+T−細胞エピトープに対する分子をカップリングする場合、工学処理された分子は、in vivo特異的CTL応答を惹起できかくして、前記CD8+T細胞エピトープがCD11b発現細胞の細胞質ゾル内に転座させられていることを示す、ということがわかった。
【0062】
より特定的には、選択的なCD8+細胞毒性細胞プライミングのための抗原提示は、主として骨髄性樹状細胞によって実施される。
【0063】
従って、特定の実施形態においては、タンパク様ベクターの製造のために用いられる組換え型アデニルシクラーゼは、前記アデニルシクラーゼの触媒ドメイン内にある遺伝学的に挿入されたシステイン残基に対するジスルフィド結合を用いて化学的に結合された単数又は複数の分子を含有する遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである。
【0064】
実際、触媒ドメイン内のさまざまな許容部位にある異なるシステイン残基に対するジスルフィド結合を用いて多数の分子をアデニルシクラーゼに化学的に結合させることができる。
【0065】
出願人らは同様に、ベクター化された抗原に特異的なCTLを、特に異種アジュバントを提供する必要なく、組換え型毒素の一回だけの静脈内注射の後に in vivoでプライミングすることができる、ということをも示した。実験の部で示したこれらの結果そして特に骨髄性樹状細胞に対するエピトープの特異的ターゲティングにより、アジュバント及びCD4+T細胞ヘルプを迂回する新たな免疫化戦略が可能となる。
【0066】
従って、本発明は同様に、異種アジュバントを含まない、静脈内投与のために処方されin vivoでのCD8+T細胞免疫応答を可能にする組成物の調製のための、問題の分子特にペプチドで組換えられたBordetellaアデニルシクラーゼ毒素の使用に関する。本発明は同様に、かかる状態のままのこの組成物にも関する。
【0067】
本発明は特に、同様に、触媒ドメイン内に挿入された抗原を含む組換え型Bordetellaアデニルシクラーゼを含むことを特徴とする、動物又はヒトの宿主において特に静脈内投与により投与するように処方された新しい免疫原性組成物にも関する。
【0068】
本発明はさらに、問題の分子がBordetella種アデニルシクラーゼにカップリングされていることを特徴とする、CD11b発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするように処方されたヒト又は動物における投与のための薬学組成物にも関する。
【0069】
1つの好ましい実施形態においては、問題の分子は、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される。
【0070】
もう1つの好ましい実施形態においては、問題の分子は抗原である。
【0071】
もう1つの特定的な実施形態においては、薬学又は免疫原性組成物は、問題の分子にカップリングされた組換え型Bordetella種アデニルシクラーゼを含む組換え型Bordetella種アデニルシクラーゼをコードする核酸構成を含んで成る。
【0072】
特定の実施形態においては、アデニルシクラーゼは、Bordetella pertussis毒素由来のものである。
【0073】
その他の特定的実施形態においては、アデニルシクラーゼ毒素は、遺伝学的に修飾された毒素である。1つの好ましい実施形態においては、アデニルシクラーゼは、非毒性アデニルシクラーゼ、特に解毒されたアデニルシクラーゼである。
【0074】
1つの好ましい実施形態においては、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、CD11b発現細胞の細胞質ゾル内に特異的に問題の分子を転座させることができる。
【0075】
特に、前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、その触媒N末端ドメインの全て又は一部が欠如したBordetellaアデニルシクラーゼ、そしてより特定的には、残基1〜373が欠如したBordetella pertussisアデニルシクラーゼである。
【0076】
有利には、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、許容部位において触媒ドメイン内に挿入された単数又は複数のシステイン残基を含んで成る。かかる遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、挿入されたシステイン残基にてジスルフィド結合(単複)を用いて単数又は複数の問題の分子にカップリングされ得る。
【0077】
好ましい一実施形態においては、分子特に抗原は、Bordetella pertussisアデニルシクラーゼの残基137〜138、残基224〜225、残基228〜229、残基235〜236及び残基317〜318及び残基335〜336から成るグループの中から選択された許容部位の中に挿入されるか、そうでなければ分子は、そのN末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如したBordetellaアデニルシクラーゼのN末端部分、そしてより特定的には、残基1〜373が欠如したBordetella pertussisアデニルシクラーゼのN末端部分に融合される。
【0078】
特定的1実施形態においては、分子は、細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原である抗原である。
【0079】
好ましい実施形態においては、問題の分子は、ポリオウイルスエピトープ、HIVウイルス、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルス抗原、腫瘍抗原から成るグループの中から選択された抗原である。
【0080】
もう1つの実施形態においては、遺伝学的に修飾された毒素は、CD11b発現細胞の表面内で又は環内経路内に、特異的に問題の分子を送達することができる。
【0081】
出願人は、アジュバント無しで本発明において定義づけされたような動物又はヒト宿主内に免疫原性組成物をin vivo静脈内投与するだけで、該動物又はヒト宿主内の免疫応答を効率よく促進するのに充分であるということを示した。
【0082】
特に、本発明の免疫原性組成物は、特異的に樹状細胞が関与する免疫細胞応答をin vivo又はin vitroで誘発又は刺激する能力をもつ。
【0083】
その結果として、特定の1実施形態においては、免疫原性又は薬学組成物には、有利にも、水酸化アルミニウムといったような当該技術分野において一般に使用されるプライミングアジュバントが全く無い。
【0084】
1つの特定的実施形態においては、問題の分子は薬物、好ましくは抗炎症薬である。
【0085】
さらに、本発明は同様に、動物又はヒト宿主に対する投与のためのワクチン又は免疫療法用組成物の調製のための前述の通りの免疫原性組成物の使用にも関する。
【0086】
本書で使用されている「免疫療法用組成物」という語は、免疫学的応答を導きかつ、ガン、ウイルス感染、寄生虫感染又は細菌感染に対する治療といったような治療的処置に結びつけられる組成物に関係する。
【0087】
本発明はさらに、
a)上述のとおりの免疫原性組成物を提供する段階;
b)免疫応答を促進するために前記宿主に対し、好ましくは静脈内経路を介して前記免疫原性組成物を投与する段階、
を含む、動物又はヒト宿主を免疫化するための方法に関する。
【0088】
本発明は、最後に、CD11b発現細胞に特異的に問題の分子を送達するためのタンパク様ベクターにおいて、前記問題の分子にカップリングされたBordetella種アデニルシクラーゼ、そしてより好ましくは組換え型又は修正されたBordetella種アデニルシクラーゼを含んで成ることを特徴とするタンパク様ベクターに関する。
【0089】
タンパク様ベクターは、特定の細胞の表面に存在するCD11b/CD18αmβ2とBordetellaアデニルシクラーゼの特異的結合を介してCD11b発現細胞に対して問題の分子をターゲティングすることができる。1つの特定の実施形態においては、該ベクターは同様に、CD11b発現細胞の細胞質ゾル内で特異的に問題の分子を送達することもできる。
【0090】
特定の実施形態においては、タンパク様ベクターは、樹状細胞特に骨髄性樹状細胞又は好中球に対して問題の分子をターゲティングすることができる。
【0091】
問題の分子は、アデニルシクラーゼ、より好ましくは組換え型アデニルシクラーゼ毒素に対し化学的又は遺伝学的にカップリングされる。1つの分子をポリペプチドにカップリングする方法は、当該技術分野において周知である。一例としては、発明人は、ビオチン誘導体、ビオチンHDPDが触媒ドメイン内に遺伝学的に挿入された唯一のシステイン残基上に選択的にカップリングされ得ることを示した。システイン含有アデニルシクラーゼ毒素又は、未変性システイン残基が欠けているものの唯一の遺伝学的に挿入されたシステインを含有する遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼに対し、合成ペプチドが同様にカップリングされてきた。
【0092】
もう1つの特定の実施形態においては、アデニルシクラーゼにカップリングされた問題の分子は、未変性システイン残基が欠けているもののその触媒ドメイン内で許容部位(単複)に遺伝学的に挿入されたシステイン残基(単複)を含有する遺伝学的に挿入されたアデニルシクラーゼに化学的にカップリングされたエピトープである。
【0093】
特定の1実施形態においては、タンパク様ベクターは、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼを含んで成る。1つの好ましい実施形態においては、アデニルシクラーゼは、Bordetella pertussis由来の組換え型非毒性アデニルシクラーゼである。
【0094】
本発明は、より特定的には、N末端触媒ドメインの全部又は一部分が欠如した組換え型Bordetellaアデニルシクラーゼ、より好ましくは残基1〜373が欠如したBordetella pertussisから成るタンパク様ベクターに関する。
【0095】
本発明のもう1つの好ましいタンパク様ベクターは、未変性システイン残基が欠けているものの、触媒ドメイン内で許容部位に遺伝学的挿入されたシステイン残基(単複)を含有する遺伝学的に修飾されたBordetellaアデニルシクラーゼである。
【0096】
有利には、本発明の1つの特定の実施形態において、送達されるべき薬物は、アデニルシクラーゼ毒素にカップリングされた時点で、好中球といったような炎症性反応に関与する細胞の細胞質ゾル又は表面にターゲティングされる抗炎症薬である。
【0097】
以下の例は、請求されている発明の範囲を制限することなく、本発明を例示するものである。より特定的には、A部では、CD11b/CD18レセプタに対するアデニルシクラーゼ毒素の特異的結合、特にin vitroでのCD11b発現細胞に対するアデニルシクラーゼ毒素の特異的結合を顕示する実験データが示されている。B部では、実験結果は、遺伝学的にカップリングされた分子、より特定的には抗原をin vitro及びin vivoでCD11b発現細胞特に骨髄性樹状細胞の細胞質ゾル特に特異的にターゲティングする可能性を示している。その上、結果は、ターゲティングがCD11bレセプタにより媒介されること及び、CTLプライミングがアジュバントの不在下での全身的免疫化の後に観察されることを示している。C部では、CyaAフラグメント上のジスルフィド結合を用いたエピトープペプチドの特異的カップリングを実施して新しいタンパク様ベクターを得ることができるということが示されている。D部では、CD11bレセプタとの相互作用のためにはCyaAのC末端部分のみで必要かつ充分であることが示されている。
【0098】
最後に、結果は、交叉プライミング抗原に対して発生させられたもののようなその他の数多くのCTL反応とは異なり、CD4+T細胞ヘルプが、CTL応答のプライミングにとって不可欠でなかったということを示している。
実施例
A.Bordetellaアデニル酸シクラーゼ毒素は、αMβ2インテグリン(CD11b/CD18)と特異的に相互作用する。
【0099】
A.1 材料及び方法
A.1.1 組換え型毒素及び抗体
CyaA産生のためのプロトコルは、すでに他の文献で記述されてきた〔Karimova, et al., 1998〕。CyaA毒素は、プロトキシンの活性化に必要とされるCyaCアクセサリー遺伝子及びlacUV5プロモータの下でcyaA構造遺伝子CyaAを担持する発現プラスミドを内包するE. coli菌株の中で産生された。8Mの尿素、Hepes−Na20mM、pH7.5の中での可溶化の後、CyaAを、逐次的DEAE−セファロース及びフェニル−セファロースにより95%(SDSゲル分析によって判断されるもの、図示せず)を超える均質性に至るまで精製した。遺伝学的に不活性化された触媒ドメイン内に挿入された唯一のシステインを内包する解毒された組換え型CyaA毒素CACTE5−Cys−Ovaを、pCACT−Ova−E5のBsiwl及びKpnl部位の間に適切な2本鎖オリゴヌクレオチドを挿入することによって構築した〔Guermonprez et al., 2000〕。結果としてもたらされたタンパク質CACTE5−Cys−Ovaの中で、CyaAの残基224及び225の間にアミノ酸配列ASCGSIINFEKLGTを挿入する。組換え型毒素を、以前に記述された通りに発現させ精製した。精製されたタンパク質を、メーカーの指示に従がい、特異性の高いスルフヒドリル試薬N−(6−(ビオチンアミド)ヘキシル)−3′−(2′−ピリジルチオ)プロピオンアミド(ビオチン−HPDP、PIERCE)を用いてその唯一のCys上で標識づけした。ビオチニル化されたCyaAをDEAE−セファロース上で再度精製して、未反応のビオチン−HPDP試薬を除去した。毒素濃度は、142M−1×cm−1の分子消散係数(結合研究)を用いて、又はBioradタンパク質検定システム(cAMPの蓄積及び細胞死の研究)を用いて、280nmでの吸着から分光光度計により決定した。
【0100】
マウスCD11(2D7、ラットIgG2a κ)、マウス及びヒトCD11b(M1/70、ラットIgG2b、κ)、マウスCD11c(HL3、ハムスタ1、λ)、マウスCD18(C71/16、ラットIgG2a、κ)、対照(A95−1、又は抗−CD16/32、2.4G2、ラットIgG2a k)に特異的な精製済みmAbは、Pharmingen(San Diego, USA)から入手した。抗ヒトCD11b(44、マウスIgG2a、κ)、及び抗ヒトCD18(TS/18、マウスIgGl、κ)ハイブリドーマからの上清は、寄贈されたものであり、遮断実験においてこれを1/2希釈で使用した。抗マウスCD11b(5C6、ラットIgG2b、κ)から上清は、G. Milon (Pasteur Institute, Paris)から寄贈されたものであり、結合阻害検定において1/2の最終希釈で使用された。精製済みCyaAで皮下で免疫化したウサギから抗−CyaAポリクローナル抗体を得た。硫酸アンモニウム(33%)により免疫血清から血清を沈殿させた。遠心分離後に、ペレット化されたタンパク質を、20mMのHepes−Na、150mMのNaCl、pH7.5(緩衝液C)内で再度懸濁させ、同じ緩衝液に対し広範に透析した。その後、抗体を、室温で130分間、ビオテン−アミドカプロン酸塩N−ヒドロキシスクシニミドエステル(SIGMA、ジメチルスルホキシド中に溶解)とのインキュベーションによりビオチニル化した。その後、100mMのエタノールアミン、pH9.0を添加し、30分間さらにインキュベートした後、混合物を4℃で緩衝液Cに対して広範に透析させた。ビオチニル化した抗体を−20℃で保存した。
【0101】
A.1.2 細胞及び培地
米国菌培養収集機関(ATCC)から、EL4、J774A.1、LB27.4、THP−1を入手し、5×10−5Mの2−メルカプトエタノールを伴うか又は伴なわず、10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンで補足したRPMI1640(完全培地)の中で培養した。完全培地中でFSDC(Grolomoni et al., 1995)を培養した。ヒトCD11b/CD18又はCD11c/CD18についてトランスフェクションを受けた又はベクターのみでトランスフェクションを受けたCHO細胞を、D. Golen bock(Boston, USA)から入手し、以前に記述された通りに〔Ingalls et al, 1998〕ネオマイシンの存在下で培養した。ヒト好中球を前述の通りに精製した〔Rieu et al.,1992〕。
【0102】
A.1.3 C ya A結合検定
96ウェルの培養平板(Costar)中で血清無しで全ての結合検定をDMEM4.5mg/mlグルコース(Life Technologies)中で実施した。2×105個/ウェルの細胞を20分間(実験に応じて4℃又は37℃で)200μlの最終体積中でインキュベートした。一部の実験においては、100μlの最終体積中で遮断用mAbの存在下で4℃で20分間、細胞を予備インキュベートした。4℃で200μlの合計体積でmAbの連続的存在下でウェルに対し、毒素溶液を添加した。その後、平板を5分間1500rpmで遠心分離し、上清を除去した。飽和剤としての対照(非免疫又は免疫前)ウサギ血清の存在下で(1/50)、ビオチニル化された抗−CyaAウサギポリクローナル抗体(DMEM中1/400、50μl/ウェル)と共に25分間4℃で、細胞をインキュベートした。
【0103】
遠心分離及び上清除去の後、1/300の希釈度(50μl/ウェル)で、ストレプトアビジン−フィコエリスリン(PE)(Pharmingen)で細胞を染色した。洗浄後、細胞を、5μg/mlのヨウ化プロピジウムの存在下で、FACStar(Becton−Dickinson, Mountain View, USA)上でのフローサイトメトリーにより細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム排除により細胞凝集物及び死枯細胞を排除するため、ゲートを行なった。プリズムソフトウェアを用いて、Bmax=最大結合%で、双曲線モデル△MFI=Bmax*〔CyaA〕/Kd+〔CyaA〕)に、実験点を適合させた。
【0104】
A.1.4 cAMP検定
4.5mg/mlのグルコース及び20U/mlのヘキソキナーゼを含有するものの血清は含まないDMEMでインキュベーション培地が構成されている抗原競合免疫検定〔Karimova et al., 1998〕により、cAMP蓄積を測定した。グルコースのATP依存性リン酸化反応の触媒として作用するヘキソキナーゼを添加して、ATPのあらゆる痕跡について細胞外培地を涸渇させ、かくしてcAMPの細胞外合成を防止した。従って、測定されたcAMPの量は、厳密に細胞内のcAMPの蓄積を表わしている。4℃で1時間、10μl/mlの特異的mAbを伴う又は伴わない100μl/ウェルの中で、96ウェル付き平板内で5×105個の細胞を予備インキュベートし、次に20分間37℃で0.05、0.5又は5g/mlのCyaAと共に、又予備インキュベーションの間に存在する場合には10μg/mlの特異的mAbと共に、インキュベートした。CyaAの用量応答効果のためには、細胞を37℃で20分間毒素と共に直接インキュベートした。中毒の後、5分間2500rpmで細胞を遠心分離した。100μlのHCl 0.1Nで、標本を溶解させ、120℃で5分間煮沸し、100μlのトリス0.125M、NaCl 0.2Mで中和した。Na2CO3 0.1M pH9.5中1/4、000で希釈した。AMP−BSA接合体でマイクロタイタープレートをコーティングした。これらのプレートをPBS−Tween 0.1%中で2回洗浄し、PBS−BSA2%中で1時間飽和し、PBS−Tween0.1%で5回洗浄した。cAMP−BSA接合体をコーティングした平板に直接、標本及びcAMP標本(Sigma)を添加し、HCl 0.1N及びトリス0.125M−NaCl 0.2Mの1/1混合物で階段希釈した。PBS−BSA2%中に1/2、500で抗−cAMPウサギ抗体を添加し、3時間37℃でインキュベートした。PBS−Tween 0.1%で5回平板を洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Amersham)にカップリングした抗ウサギ抗体を、PBS−BSA2%中に1/2500で添加し、1時間37℃でインキュベートし、従来のペルオキシダーゼ反応を用いて顕示させた。プリズムソフトウェアを用いて、S字状モデルに対し標準曲線の実験点を適合させた。
【0105】
A.1.5 毒性検定
以前に記述された通りに〔Khelef et al.,1993;Khelef et al.,1995〕、細胞死を評価した。簡単に言うと、安全培地中で96ウェルの平板内で24時間105個の細胞をインキュベートし、血清を含まない培地で一回洗浄した。全ての細胞培養をさらに血清無しの培地で実施した。4時間37℃でCHO細胞にさまざまな濃度のCyaAを直接適用することにより、用量応答効果を評価した。細胞毒性阻害については、10μg/mlの特異的mAbを伴って又は伴わずに、1時間4℃で細胞を予備インキュベートし、その後、J774A.1A.1細胞については2時間0.5μg/mlで、CHO細胞については4時間5μg/mlでそして、予備インキュベーション中に存在する場合には10μg/mlの特異的mAbで、37℃でインキュベートした。死にかかっている細胞により培地内に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の量を定量化するCytotox96TM検定(Promega)を用いて、細胞溶解を評価した。
【0106】
A.2.結果
A.2.1 C ya Aの可飽和結合は、標的細胞の表面でのCD11bの存在と相関関係をもつ。
【0107】
白血球の集団に向かってのCyaA細胞特異性を特徴づけするため、我々は、β2インテグリンのさまざまな組合せを発現する3つの代表的なマウス細胞系統、すなわち、腫瘍マクロファージであるJ774A.1;T細胞胸腺腫であるEL4;及びB細胞リンパ腫であるLB27.4を選択した。37℃でCyaAで20分間インキュベートした後、ビオチニル化された抗−CyaA抗体及びストレプトアビジン−PEを用いてフローサイトメトリーにより、これらの細胞の細胞表面に対するCyaAの結合を監視した。これらの条件下で、我々は、J774A.1細胞系統上でのCyaAの効率の良い用量依存性の可飽和結合を観察した。見かけのKdはそれぞれ9.2±4.5nM及び3.2±1.9nMであったため、J774A.1細胞に対するCyaAの親和力は高いものであった。EL4及びLB27.4細胞に対するCyaAの低い結合が観察されたが、これはテストされた濃度では飽和可能でなかった。
【0108】
J774細胞系統に対するCyaAの結合が、β2インテグリン系統群の成員の1つの発現と相関関係をもつか否かを見極めるため、我々は、充分に特徴づけされたβ2インテグリン(CD11a、Cd11b及びCD11c)の3つのα鎖及び共通のβ鎖(CD18)について特異的なモノクローナル抗体(mAb)を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞の表現型分析を実施した(図1b、c、d、e)。J774A.1細胞はほとんどCD11b及びCD18を発現したが、CD11aについても陽性であった。EL4細胞及びLB27.4細胞は、ほとんどCD11a及びCD18を発現した。合わせて考慮すると、これらのデータは、J774A.1に対するCyaAの効率の良い不飽和結合が、インテグリンCD11b/CD18の存在と相関関係をもっていたということを示している。
【0109】
A.2.2 C ya A可飽和結合は、抗−CD11bmAbにより特異的に遮断される
我々は次に、CD11b/CD18が、このインテグリンを発現する細胞に対するCyaAの結合に直接関与できるか否かを見極めた。我々は、CyaAの固定された又は変動する濃度でmAbの不在下で平均蛍光値の百分率を計算することにより、抗CD11bM1/70mAbで得られた阻害の定量分析を行なった(図2)。M1/70抗−CD11bmAbで得られたCyaA結合の阻害は、テストされた大部分のCyaA濃度でほぼ完全であった(図2a、b)。この阻害は、抗−CD11a、CD11c、CD18又は対照mAbがCyaA結合を阻害しなかったことから、特異的であった。第2の抗−CD11bmAb(クローン5c6)も同様に、CyaAを阻害した(図2c、d)。CD11bを発現する未成熟樹状細胞であるFSDC(図2a、c)及びマクロファージ細胞系統J774A.1(図2b、d)でも類似の結果が得られた。
【0110】
CyaAがヒトCD11bとも類似の要領で相互作用できるか否かを検査するため、その高いCD11b発現が充分に立証されているヒト好中球について、CyaA結合研究を実施した。抗−CyaAウサギ抗体を用いたヒト骨髄性細胞のインキュベーションの後に高いバックグラウンド蛍光が得られたことから(データ示さず)、我々は、交互結合検査をセットアップした。その触媒ドメイン内に遺伝学的に導入された唯一のシステイン残基上で、CyaAの解毒された形態を特異的にビオチニル化した。このシステムを用いて、我々は好中球に対するCyaA結合を検出することができた(図3)。44又はM1/70 抗−CD11b mAbを用いた好中球の予備インキュベーションは、CyaAの結合のそれぞれ完全な又は部分的な阻害を導いた(図3a及びb)。マウス細胞に対するCyaA結合を遮断しなかった抗マウスCD18mAbであるC71/16とは異なり、ヒト抗−CD18TS/18mAbでの予備インキュベーションは、ヒト好中球に対するCyaA結合の完全な阻害を導いた(図3b)。ヒト単球THP−1細胞系統でも類似の結果が得られた(データ示さず)。
【0111】
結論としては、マウス及びヒトの両方に由来する3つの骨髄性細胞系統(J774A.1、FSDC、THP−1)ならびに精製されたばかりのヒト好中球の表面に対するCyaA結合は、主としてCD11b/CD18インテグリンを通して媒介されると思われる。
A.2.3 C ya Aを媒介とするcAMPの増加及び毒性は、抗CD11b mAbにより特異的に遮断される。
【0112】
CD11b/CD18−依存性CyaA結合の生理学的関連性を評価するため、我々は、CyaAの細胞毒性に対する遮断mAbの効果を研究した。我々は、まず最初に、さまざまなmAbの存在下でCyaAに露呈されたJ774A.1細胞内で産生されたcAMPの量を測定した。図4aに示されているように、CyaAにより誘発された細胞内cAMP含有量の増大は、細胞をM1/70抗−CD11bmAbと共に予備インキュベートした場合、完全に廃止された。CyaA細胞結合を遮断しなかったC17/16抗マウスCD18mAb(図2)は、CyaAで処理された細胞の細胞内cAMP含有量に対し全く効果を与えなかった。かくして、これらのデータは、CyaAによって誘発された細胞内cAMPの増大が、CD11bと毒素の相互作用に依存するものであることを強く示唆している。CyaAの毒性についてのこの分子の必要条件をさらに分析するため、我々は、CyaAで媒介された細胞死に対するβ2インテグリン系統群の異なる鎖に特異的mAbの効果を評価した。図4bは、抗−CD11b mAb J774A.1がCyaAによって誘発される細胞死を劇的に低減させたということを示している(88%の阻害)。CyaAにより誘発される細胞死は、J774A.1が細胞に対する毒素の結合を遮断しなかったmAb(抗CD11a、CD11c又はCD18又は対照mAb)で予備インキュベートされた場合に、影響を受けなかった。
【0113】
合わせて考慮した場合、これらのデータは、CD11bを通したCyaA結合がJ774A.1細胞内でのCyaAで媒介された毒性にとって厳密に必要なものである、ということを示している。
A.2.4 CD11b/CD18でのCHO細胞のトランスフェクションは、C ya Aに対する感受性を付与する
CyaA結合におけるCD11bの役割を確認するため、我々は、ヒトインテグリンCD11b/CD18又はCD11c/CD18によるトランスフェクションを受けた又はモックトランスフェクション(ベクター単独)を受けたCHO細胞を使用した。図5aに示されているように、CyaAは、37℃でこれらの細胞系統に結合できた。しかしながら、CyaA結合は、CD11b/CD18を発現するCHO細胞内では効率が良くかつ可飽和であったが、CD11c/CD18又はモックトランスフェクションを受けた細胞においてはそうでなかった。CD11b/CD18でのトランスフェクションを受けた細胞についてのCyaAの親和力は、nM範囲(Kd=0.7±0.09nM)内にあった。4℃で、CyaA結合の効率は、37℃での結合に比べ低減した(図5b)。この温度では、CD11b/CD18でのトランスフェクションを受けた細胞とその他の2つの細胞系統の間の差はより顕著であった。
【0114】
我々は、J774A.1におけるCyaA媒介毒性にとってCD11bが必要であることを発見したことから、このとき、CD11b発現が、CHOでのトランスフェクションを受けた細胞に対してCyaA感受性表現型を付与するのに充分なものであるか否かを見極めた。さまざまな報告〔Gordon et al., 1988〕と一致して、CyaAは、CD11c/CD18でのトランスフェクションを受けたCHO 細胞内又は対照のモックトランスフェクションを受けた細胞中で注目に値する量の細胞内cAMPを、ただし高い毒素濃度でのみ(5μg/ml、図5C)誘発した。これとは対照的に、CyaAは、研究された最低の濃度(0.05μg/ml)でさえ、CD11b/CD18でのトランスフェクションを受けたCHO細胞内のCAMPの細胞内レベルを増大させた。その上、5μg/mlのCyaAに応答したcAMPの産生は、CD11c/CD18又はモックトランスフェクションを受けた細胞に比較して、CD11b/CD18でのトランスフェクションを受けた細胞においては4〜5倍高いものであった。
【0115】
我々は同様に、CyaAで媒介された細胞死内のCD11b/CD18の役割も評価した。図5dに示されているように、CD11b/CD18でのトランスフェクションを受けたCHOの50%以上が、5μg/mlのCyaAでの4時間のインキュベーションの後に死滅し、一方CD11b/CD18でのトランスフェクション又はモックトランスフェクションを受けた細胞は、この処理により影響を受けなかった。
【0116】
要するに、これらの結果はかくしてヒトCD11b/CD18インテグリンの発現がCHO 細胞内のCyaAについての高親和力レセプタを作り出すのに充分なものであることを明確に立証した。
A.3 論述: C ya Aのためのレセプタ
その他の毒素とは異なり、CyaAは、長い間、あらゆるレセプタ結合から独立したものと考えられてきた。これは、i)CyaAがさまざまな由来の多様なモデル細胞系統をin vitroで中毒させることができること〔Ladant et al., 1999〕、ii)CyaAがジャーカット細胞及びヒツジ赤血球に、非可飽和的に結合すること〔Gray et al., 1999〕という観察事実に基づいている。実際、これらの観察事実は、脂質膜へのCyaAの非特異的吸着が、細胞質ゾル内への触媒ドメインの幾分かの転座を導くということを立証した。しかしながら、これらの観察事実は、特異的レセプタの存在を度外視したわけではない。我々は、骨髄性細胞系統についてのこの研究において、CyaAの結合及び毒性特性が、インテグリンCD11b/CD18とのその相互作用に依存していることを示した。効率が良くかつ可飽和の結合は、CD11bの発現と相関関係をもち、抗CD11b mAbにより完全かつ特異的に遮断される。その上、CHO細胞内でのCD11b/CD18の発現は、CyaAの結合を劇的に増強させ、その結果、この毒素による中毒に対する感受性を増大させる。我々の結果は、白血球の上で特異的に発現される細胞表面分子とCyaAの相互作用を裏づける最初の証拠である。抗−CD11b mAbによるCyaA結合のほぼ完全な遮断は、CD11bがテストされた細胞系統内のCyaAのための主要レセプタであることを示唆している。CD11c/CD18トランスフェクタント、又はEL4又はLB27.4といったようなCD11a/CD18発現細胞に対する効率の良い結合の欠如は、CD11b/CD18が、標的細胞に対するCyaAの結合に関与するβ2系統群の唯一のインテグリンであることを示唆している。
【0117】
以前の研究と一致して、我々は、テスト対象の全ての細胞系統に対するCyaAの検出可能な結合を観察した。さらに、CyaAは高濃度で、細胞死に結びつけられない、モックトランスフェクションを受けたCHO細胞内のわずかではあるものの検出可能なcAMP増加を誘発した。かくして、高い濃度では、CyaAは、多様な細胞系統を結合させそこまで転座することができるが、効率が良くかつ可飽和の結合、転座及び死滅は、CD11b発現細胞の顕著な特徴である。
【0118】
β2インテグリン系統群の成員に対するCyaAの結合は、これらの分子と相互作用することが近年発見されたその他のRTX毒素の挙動を連想させるものである〔Lally et al, 1997:Li et al, 1999;Ambagala et al., 1999;Jeyaseelan et al.,2000〕。CyaAと強い相同性を共有するE. coli HlyAは、血漿膜でカチオン孔を形成する。HlyAは、低濃度においてのみであるが、白血球に対する特異性を示す[Welch et al., 1991]。この相対的特異性は、インテグリンCD11a/CD18とのその相互作用によって媒介されることが示された[Lally et al., 1997]。同様にして、それぞれヒト及びウシの白血球に特異的な比較的混交度の低いRTX毒素であるA.actinomycetemcomitans及びP. haemolytica白血球毒素(それぞれLtxA及びLktA)も又、CD11a/CD18と相互作用する〔Lally et al., 1997;Li et al., 1999;Ambagala et al.,1999; Jeyaseelan et al, 2000〕。HlyAと強い相同性をもつにも関わらず、CyaAは、その細胞分布が異なるもう1つのβ2インテグリン(CD11b/CD18)を認識する。実際、CD11bは、たいていはマクロファージ、好中球及び樹状細胞上で発現されるが、T及びB細胞の大部分の上で発現されず、一方、CD11aは、T及びBリンパ球を含むすべての白血球上で発現される。
【0119】
CD11b発現細胞に対するCyaAのこの特異的ターゲティングは、本発明において、この特定の細胞サブセットを特異的にターゲティングするために活用されている。侵襲性であり続けているCyaAの解毒された突然変異体を、その他の細胞型に顕著な影響を及ぼすことなく、CD11b陽性細胞に対する薬理学的に活性な分子の送達のために使用することが可能であろう。
B.骨髄性樹状細胞の細胞質ゾルに至るターゲティング対象抗原の送達及び選択的CTLプライミング
B.1 材料及び方法
B.1.1 組換え型アデニル酸シクラーゼ毒素及びペプチド
pOVA合成ペプチド(SIINFEKL)はNEOSYSTEMに由来し、これをPBS中で1mg/mlで希釈させた。
B.1.2 細胞毒性T細胞の検出のための免疫化及び検定
6〜8週の週令のIffa Credo(L’arbresle, France)からの雌C57BL/6(H−2b)を使用した。C57BL/6バックグラウンド上で育種されたTAP1−/−(Van Kaer et al., 1992),CD4−/−(Killeen et al., 1993),CD40−/−(Kawabe et al., 1994)及びB細胞欠損μ突然変異(Kitamura et al.,1991)は、CDTA施設(CNRS、Orleans, France)に由来し、Institut Pasteurの施設内で育種された。動物を、PBS中のAgで静脈内免疫化した。注射から7日後に、動物を屠殺し、脾臓を除去した。脾細胞の単一細胞懸濁液(2.5×107個の細胞)を、10mlのCM(以下参照)中で照射済み脾細胞(2.5×107個)で5日間、1μg/mlのpOVAの存在下で再度刺激した。正に前述の通りに、細胞毒性検定を実施した(Fayolle et al., 1999)。
B.1.3 細胞系統
H−2Kbの状況下でOVA257−264ペプチド(SIINFEKL)について特異的なCD8+T細胞ハイブリドーマであるB3Z(Karttunen et al., 1992)は、N. Shastri博士(USA,バークレイ、カリファルニア大学)から寄贈されたものであった。
B.1.4 抗原提示検定
全ての抗原提示検定は、10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、及び5×10−5Mの2−メルカプトエタノール(完全培地、CM)で補足されたRPMI1640中で、96ウェルの培養マイクロプレート(0.2mlの最終体積)内でのB3ZとAPCの同時培養によって実施された。B3Z細胞(105細胞/ウェル)の刺激を、APCの存在下での18〜24時間の培養の上清中でのIL−2放出によって監視した。以前に記述された通り(Guermonprez et al.,1999),CTLL検定中でIL−2を測定した。一部の実験(図の説明参照)では、NF−ATlacZリポータ検定を用いて、B3Zの刺激を査定した。細胞リゼイト中のLacZ活性を、以前に記述された通りに(Karttunen et al., 1992)CPRG基板で査定した。次のような2つの抗原提示検定を実施した。すなわち、i)in vitro検定: ナイーブマウスに由来するAPCをさまざまな濃度のAgの存在下でB3Zと同時培養(105/ウェル)した。一部の実験では、APCを、4℃で40分間10μg/mlのmAbを伴って又は伴わずに予備インキュベートし、その後、mAbの連続的存在下で100μlの最終体積内で細胞に対しAgを添加した。4時間のパルスの後、APCを2回洗浄し、B3Zとの同時培養に付した。使用した精製済みmAbは、CD11b(M1/70 ratigG2b,K)又はイソ型整合した対照に対するものであり、Pharmingen(SanDiego, USA)に由来していた。ii)Ex vivo検定:APCは、1ウェルあたりのさまざまなAPC数で0.2mlの最終体験でB3Zとの培養に付した。
B.1.5 抗原提示細胞及び選別
Vremec et alにより修正されたSteinmanのプロトコル(Vremee et al.,1992)に従って、合計脾細胞(TSC)、低密度(LDF)及び高密度(HDF)画分を調製した。簡単に言うと、37℃で40分間、コラゲナーゼで脾臓を消化し、その後切裂し、EDTA 5mMの連続的存在下で前処理した。細胞を、高密度のBSA溶液上で遠心分離した。上清及びペレット細胞を別個に収集し、低密度画分及び高密度画分と呼称した。フィコエリスリン(PE)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)にカップリングされているか又はビオチニル化されたハムスタのHL3 mAbと共に2mMのEDTA(PBS−FACS)及び5%のウシ胎児血清で補足されたPBS中で4℃でCD11c染色を実施し、その後、ストレプトアビジン−PEにより顕示させた。PEにカップリングされた53−6.7mAbで、CD8α染色を実施した。PE又はFITCにカップリングされたM1/70mAbを用いて、CD11b染色を行なった。PEにカップリングされるか又はビオチニル化されたB220mAbで、CD54染色を実施し、ストレプトアビジン−PEにより顕示させた。全てのmAbはPharmingenに由来するものであった。2回の洗浄後、FAC Star(Beckton Dickinson, Mountain View, USA)を用いて細胞を選別した。CM中で細胞を、無菌状態で回収した。選択された細胞の純度を、FACS Can装置(Beckton Dickinson, Mountain View, USA)上で分析された選別済み細胞のアリコート上で検査した。選別済み細胞の純度は、標準的に80〜98%の間であった。その他の実施形態においては(図の説明に記載の通り)、供給業者のプロトコル(MACS、Miltenyi Biotec, Bergish Gladback, Germany)に従って、CD11c Micro Beads及びMagnetic Cell Sorting技術を用いて、脾臓コラゲナーゼ消化物から直接、CD11c+細胞を選別した。この技術では、選別済み細胞の純度は80%前後の範囲内であった。
B.2 結果
B.2.1 アジュバント不在下でのC ya AOVAによる全身的免疫化の後の、CD4及びCD40とは独立したCTLプライミング
実験モデルエピトープとして、ニワトリオバルブミン、H−2Kb制限、SIINFEKLエピトープを使用した。これを、解毒されたなおも侵襲性の突然変異体CyaAの触媒ドメインの中に遺伝学的に挿入した。C57BL/6(H−2b)マウスを、50μgの組換え型毒素又は対照食塩水溶液で1回ivで免疫化した。免疫化から7日後に、pOVAに特異的なCTL活性をCyaAOVAで免疫化したC57BL/6マウスの脾細胞内で検出したが、食塩水又は対照CyaAの注射を受けたマウスの体内ではこれは検出されなかった(図6a)。CD4又はCD40欠損マウスでも類似の結果が得られ、これは、他の数多くのCTL応答と異なり(交叉プライミング用Agに対し発生させたものなど(Bennett et al., 1997;1998;Shoenberger et al.,1998,Ridge et al.,1998)),CyaAOVAによるCTL応答のプライミングのために、CD4+T細胞ヘルプが不可欠でなかったことを示している(図6b,C)。その上、B細胞欠損マウスの中でもCTL応答が得られたことから、B細胞は必要とされなかった(IgM−/−,図6d)。場合によってアジュバントとして作用する汚染物質LPSは、C57BL 10ScSn及びLPS−低応答性マウスC57BL10ScCrがCyaAOVA注射(図示せず)の後に類似のOVA特異的CTL応答を示したことから、CTL応答CyaAOVAの刺激に関与しない。
B.2.2 CD11b−発現細胞に対するC ya AOVA提示の in vitro 及び in vivo ターゲティング
CyaAOVAの免疫原性をより良く理解するため、我々は、CD8+T細胞に対するその提示に関与するAPCを決定しようとした。刺激の読み出しとしてIL−2分泌を用いて、我々は、H−2Kb 制限された抗OVA CD8+T細胞ハイブリドーマであるB3Zを、CyaAOVAの存在下、ただしCyaALCMVの不在下で、バルク脾細胞によりin vitroで刺激する(図7a)。我々は、3つの明確な脾臓APCすなわちDC(CD11c+),B細胞(CD45R+)及びマクロファージ/顆粒球(CD11bhigh+CD11c−)のAPC能力を分析することを意図していた。合計脾細胞内のCD11c+の百分率が低いもの(<1%)であったため、我々は密度分画を実施し、フローサイトメトリーによりDC富有(4〜10%)低密度集団からCD11c+を選別した。高密度画分は、微量のCD11c+細胞しか含有していなかった。これとは対照的に、両方の画分内のCD45R+及びCD11bhigh+CD11c−(顆粒球/マクロファージから成る)細胞の分布により、これらのマーカーについての全集団に関する選別が可能となった。図7Cに示されているように、CyaAOVAは、DCにより最も効率良く提示され、CD11bhigh+CD11c−及びB細胞による効率はこれより低いものであった。このことは、脾細胞の低密度画分内での抗原提示能力のほぼ排他的な分画と相関関係をもつ(図7a)。これとは好対照に、高及び低画分の両方共が、pOVAに応答してB3Zを刺激することができた(図示せず)。
【0120】
免疫化の後in vivoで形成されたKb−OVA複合体を検出するために、50μgのCyaAOVAで8〜15時間前にivで免疫化されたマウスから調製されたAPCを、Agの添加無しでin vitroでB3Zと同時培養した(ex vivo検定)。In vitro検定については、CyaAOVA提示を担当するAPCは、DC富化された低密度の脾細胞画分の中のみに排他的に存在した(図7b)。検定の特異性は、B3Zを刺激しなかったCyaALCMV免疫化されたマウスからのAPCを用いて検査した(図7b)。CyaAOVA提示に関与する低密度APCをさらに特徴づけするために、我々は、細胞選別を実施した。図7dに示された結果は、DC(CD11C+)画分が、より効率の良いAPCであったことを示している。同じ画分から選別マクロファージ/顆粒球(CD11bhigh+CD11c−)及びB細胞(CD45R+)は、B3Zの刺激についてきわめて効率の低いものであった。
【0121】
CyaAOVAに関与するAPCをさらに特徴づけするため、我々は、CD11c+CD8α−骨髄性サブセット及びCD11c+CD8α+リンパ球サブセット内の脾臓の低密度CD11c+DCの亜分画を実施した。In vitro及びex vivo検定(それぞれ図7e及びf)は、CyaAOVAについての抗原提示能力が、低レベルしかCD11b+を発現しないリンパ球系サブセットとは異なり、このインテグリンをも発現する骨髄性サブセットにより保持されるということを示した(Pulendran et al.,1997;Vremec et al.,1997)。CD11c+CD8α+リンパ球系サブセットがCyaAOVAを提示できないのは、CD11c+CD8α+及びCD11c+CD8α−がB3Zに対しpOVA合成ペプチドを同等に良く提示することから、CyaAOVAに特異的なことであった。
【0122】
対照(C57BL/6)又はB細胞欠損マウス(IgM−/−)からの脾細胞で実施したin vitro及びex vivo検定は、in vitro及びin vivoでのCyaAOVAの提示に対するB細胞の貢献の低さを確認した(図7g及びh)。これらの結果と一致して、CyaAOVAによって誘発されたCTL応答は、対照マウスに比べてB細胞欠損マウスでは有意な影響を受けなかった(図5d)。
B.2.3 樹状細胞によるC ya AOVAのMHCI制限された提示は、 in vitro 及び in vivo の両方における組換え型毒素の細胞質ゾル送達に左右される。
【0123】
CyaAOVA提示が、OVAエピトープの細胞質ゾル送達又は細胞外投入に左右されるか否かを見極めるために、我々は、ナイーブ動物(in vitro,図8a)又はCyaAOVAでiv免疫化された動物(ex vivo,図8b)から精製された対照の脾臓TAP+/+又はTAP−/−由来のCD11c+DC又は全脾細胞を用いて、Ag提示検定を実施した。結果は、樹状細胞によるCyaAOVA提示が、in vitro又はin vivoのいずれかでTAPに完全に依存していることを示している。pOVA提示はTAPに依存しない現象であることから、我々は、pOVAペプチド(図示せず)でin vitroで投入したこれらの細胞でB3Kを刺激することによって、CyaAOVAで免疫化されたマウスから選別されたTAP−/−DCの機能性を検査した。これらの結果は、CyaAOVAのin vivo提示がその細胞質ゾル送達により左右されることを示している。
B.2.4 CD11bでのC ya Aの相互作用は、MHCIによる抗原提示のための細胞質ゾル経路に対する挿入された抗原の送達及び細胞結合に必要とされる。
【0124】
我々は、A部で、CD11+細胞に対するCyaAWTの可飽和かつ効率の良い結合が、抗−CD11bmAbにより特異的に遮断され得ることを示した。さらに、CD11bトランスフェクションは特異的に、そうでなければCyaA WTに対する耐性をもつCD11b−細胞である細胞に対して可飽和結合及びCyaAWTに対する感受性を付与した。抗CD11bmAbによる細胞結合の遮断は、その後の触媒アデニル酸シクラーゼドメインの細胞内送達、cAMP上昇及びCyaAWTにより誘発される細胞死を阻害した。この結果は細胞系統について得られたものであるため、CyaAが脾細胞に結合するか否かを決定することが残されていた。我々は、フィコエリスリンにカップリングされたストレプトアビジンでの全脾細胞懸濁液に対するOVAペプチドを担持するビオチニル化され、解毒された形態のCyaA(CyaAOVAビオチン)の固定を検出するためにフローサイトメトリーをセットアップした。この検定を用いて、我々は、CyaAOVAが、全脾細胞懸濁液(5〜7%)内の白血球のサブセットに結合することを視察した。抗−CD11bM1/70mAbでの予備インキュベーションがこの結合を排除したが、対照mAbではそうならなかった(図9a)。その上、CD11bの発現と低密度細胞へのCyaAOVAの結合の間には相関関係がある:CyaAOVAは、高レベルのCD11bを発現するCD11c+CD8α−に対し効率良く結合し、低レベルのCD11bしか発現しないCD11c+CD8α+に対してはその効率は比較的低く、CD11bを発現しないCD11c−CD8α+T細胞に対しては非常にわずかしか結合しない(図9b)。このCD11c−集団内へのCD11bhigh+の存在と相関して、CyaOVAが低い百分率のCD11c−CD8α−細胞と効率良く結合することは、注目に値する。かくしてCyaOVAビオチンの結合は、CD11bにより媒介され(CyaA WTの場合と同様)、CyaOVAを提示する一定の与えられた細胞型の能力を予測させる。
【0125】
In vitroで、我々は、抗体CD11bm AbM1/70がB3Zに対するTSC細胞によるCyaAOVAの提示を遮断することを示した(図10a)。この遮断は、i)その他のβ2インテグリン系統群の成員(抗CD11a,CD11c)に特異的な対照mAb(単複)がほとんど又は全く効果をもたなかったこと(図10a,データは示さず);ii)pOVAの提示が抗−CD11b又はこれらのmAbのうちのいずれかによっても影響されなかったこと(図10b,データは示さず);から特異的である。このことは、CD11bが少なくとも脾臓の中でCyaAOVAについての主たるレセプタであることそしてCyaAOVA−CD11bの相互作用が挿入されたエピトープの提示によって不可欠であることを確認している。
【0126】
最後に、CyaAOVA提示におけるCD11b発現細胞の役割を確認するために、我々は、CyaAOVA又はpOVAで免疫化したマウスからの全脾細胞についての選別実験を行なった。CD11b+及びCD11b−画分の中で全脾細胞を選別した。pOVAのiv免疫化の後に2つの亜集団がB3Zを刺激した一方で(図10d),CD11b+亜集団のみが、CyaAOVAのiv免疫化の後にB3Zを刺激した(図10c)。
【0127】
これらの結果を考え合わせると、CyaOVAからのOVAペプチドの提示が、細胞結合ひいてはCD11bとの相互作用により左右されるということが明らかに立証されている。
B.3 論述
本研究においては、エピトープ送達ベクターとしてBordetella pertussisの解毒されたアデニル酸シクラーゼを用いて、我々は、アジュバント必要条件に対するニーズを迂回しながら、唯一回の注入後にCTL応答をプライミングする免疫化のための戦略を確立した。我々は、ベクターとしての解毒されたCyaAの高い効率に寄与するメカニズムを識別した。
B.3.1 C ya Aは、CD11bインテグリンとの相互作用を通して骨髄性樹状細胞をターゲティングする
In vitro又はIn vivoで投入されたAPCを用いた特異的CD8+T細胞ハイブリドーマに対する抗原提示検定(それぞれin vitro及びex vivo検定)は、CyaAOVAのための最も効率の良いAPCがCD11c+CD11bhight+DCであることを立証した。実際、CyaAOVAについてのAg提示能力は全て、DCを保持する脾細胞の低密度画分に属していた。規定の細胞型の細胞選別は、CD11c+CD11bhight+DC細胞がCD11c−CD11bhight+細胞に比べてCyaAOVAを提示する上ではるかに効率が良いということを顕示した。B細胞(CD45R+)について観察されたわずかな貢献は、CyaAOVAの効率の良い提示(in vitro及びex vivo)及びB細胞欠損マウス内のCTL応答によって確認された。
B.3.2 C ya Aは、 in vivo でのMHCクラスI提示のための細胞質ゾル経路に対しAgを送達する
ここで、我々は、in vitroでの全脾細胞に対するCyaAOVAの提示の依存性を示している。驚くべきことに、我々は同様にCyaAOVAのin vivo提示が、TAP依存性経路に従っても起こるということをも示している。こうして、in vivoでのCyaAOVA提示が、事実上、場合によって起こる細胞外劣化からではなく細胞質ゾル送達の結果としてもたらされるという結論が導かれた。
B.3.3 CTLプライミングはCD4 + T細胞ヘルプを迂回し、CD40シグナリングには依存しない
未成熟段階から成熟段階に向かっての成熟は、i)Ag捕捉能力の低下;ii)T細胞プライミング能力の増加;iii)Ag標本採取部位(脾臓内の周辺帯)から、それらがAg特異的T細胞と出会う確率を最大にしているT細胞部域(脾臓内の細動脈周囲シーツ)までの移動によって特徴づけられる(De smedt et al., 1996)。DCによるAg提示に加えて、成熟期は現在、T細胞プライミングのための前提条件として広く仮定されている。In vitro研究が、特にCD40L−CD40の相互作用を介しての、樹状細胞成熟のシグナリングにおけるCD4+T細胞の役割を強調した(Bell et al.,1999)。細胞Agの交叉プライミングの後のCD8+T細胞プライミングの場合、CD4+T細胞は、CD40−依存性メカニズムにおいてCD8+T細胞に対するそのヘルプを免除する(Schuurhuis et al., 2000;Bennett et al.,1998;Schoenberger et al.,1998;Ridge et al.,1998)。CyaAOVAはCD4及びCD40と独立した形でCTLをプライミングすることから、解毒されたCyaAには固有のアジュバント活性が付与されている可能性があると推測したくなる。
B.3.4 結論
当該研究は、ベクター化されたAgのprofessional(本来の)APC細胞質、ゾル送達に対するターゲティング及びアジュバント無しのCTLプライミングの両方に適合するタンパク質ワクチンベクターの我々の知るかぎりにおいて初めての特徴づけを表わしている。さらに、我々は、Ag提示が、CyaAとそのレセプタであるCD11bの間の相互作用に依存していることを実証することによって細胞ターゲティングのメカニズムを解明した。従って、CyaAの細胞特異性は、思いがけないことにAg送達目的に適合されている。最後に、CyaA又はその他の細菌毒素の細胞特異性は、その効果を制限された1組の細胞にターゲティングすべきである広範な1組の薬学的に関連性ある分子の細胞質ゾル送達に役立つ可能性がある。
C.in vivoで樹状細胞に対し化学的にカップリングされた抗原を送達するためのアデニルシクラーゼの使用
C.1 C ya A由来のベクターに対する問題の分子のカップリング方法
ジスルフィド結合を用いてCyaAに問題の分子を移植することによる組換え型CyaA毒素を作り出すための一般的方法論がここで記述されている。
【0128】
一つの例示として、オバルブミンからのCD8+T細胞エピトープに対応する12個のアミノ酸長さをもつ合成ペプチドを、235の位置でCyaA触媒ドメイン内に遺伝学的に導入されたシステイン残基に対するジスルフィド結合を通して化学的に架橋させた(野生型CyaAはシステイン残基を全く有していない)。この新規のアーキテクチャの期待される利点は、以下の通りである:
(i) 汎用性: 単一のCyaA担体を、所望のあらゆる合成ペプチドに容易にカップリングできる。
(ii) 免疫原性: APC細胞質ゾル内への送達の時点で、CyaAに化学的にカップリングされたエピトープは、(細胞内還元条件に起因して)ベクターから放出され、MHCクラスI提示経路内に直接導入されるはずであり、かくして、プロテアソームによるタンパク質分解処理の潜在的に制限ある段階を迂回させる。
【0129】
ジスルフィド結合によりCyaAに合成ペプチドをカップリングする一般的手順は、図11の中に概略的に示されている。
【0130】
第1段階では、一般にCyaAの触媒ドメイン内に遺伝学的に挿入された単一のシステイン残基を含有する組換え型CyaA毒素(野生型CyaAはシステイン残基を全く有していない)が産生される。
【0131】
組換え型CyaA毒素、ACTM235は、以前に特徴づけされた(Heveker及びLadant, 1997)。特に、ACTM235は、アミノ酸235と236の間に挿入されたCys−Serジペプチドを内包し、完全に細胞毒性である。この毒素は、A.1.1.で前述した通り、均質性に至るまで発現、精製された。
【0132】
第2段階では、オバルブミンからのCD8+T細胞エピトープに対応する合成ペプチドが設計された。精確なエピトープ配列であるSIINFEKL(アミノ酸のための1文字コード)配列に加えて、化学合成中にペプチドのN末端で、活性化されたニトロ−ピリジン−スルフォニルチオール基(Cys−NPys)を伴うシステイン残基が付加された。活性化されたNpysシステインは、APC内でのペプチドのさらなるタンパク質分解処理を容易にするため、可とう性GGAモチーフによりSIINFEKL配列から分離された。ペプチド(Cys−Npys−OVA、分子量:1405da)は、Neosystem(Strasbourg, France)によって合成された。
【0133】
第3段階でCys−Npys−OVAペプチドは以下の手順を用いてACTM235にカップリングされた。
【0134】
10mMのジチオトレイトール(DTT)の存在下で12時間インキュベートすることによって、8Mの尿素、20mMのHepes−Na,pH7.5中の精製されたACTM235が10mg還元された。還元効率は、非還元性条件下でのSDS−Page分析によって検査された。基本的に全てのACTM235タンパク質が、二量体種(約400kDaの分子量)の証拠が全く無い状態で、単量体種に対応する200kDaの単一バンドとして移動した。還元されたタンパク質をその後、8Mの尿素、20mMのHepes−Na,pH7.5中で平衡化されたDEAE−セファロース(Amersham Pharmacia Biotech)カラム(5mlの樹脂パック)上に投入した。ACTM235タンパク質をDEAE−セファロース樹脂上に充分保持し、その後この樹脂を、微量のDTTをことごとく除去するべく8Mの尿素、20mMのHepes−Na,pH7.5,0.1M,NaCl(>100ml)で広範に洗浄した(残留DTTの不在は、5,5′−ジチオ−ビス−(2−ニトロ安息香酸)、DTNBを用いて検査された)。その後、還元されたACTM235タンパク質を次に、7mlの8M尿素、20mMのHepes−Na,pH7.5,0.5MのNaClの中でDEAE−セファロース樹脂から溶出させた。次に、還元したACTM235タンパク質(8mg,約45nmol)に対して3mg(約2μmol)のCys−Npys−OVAペプチドを添加し、混合物を室温で16時間インキュベートした。その後、25mlの20mM Hepes−Na,pH7.5及び8mlの5M NaClを添加し、この希釈混合物を次に、20mMのHepes−Na,pH7.5,1MのNaCl内で平衡化されたフェニルセファロース(Amersham Pharmacia Biotech)カラム(10mlの樹脂パック)上に投入した。フェニル−セファロース樹脂を、50mlの20mM Hepes−Na,pH7.5,1MのNaClで洗浄し、その後50mlの20mM Hepes−Na,pH7.5で洗浄した。その後、誘導体化したACTM235タンパク質を、8Mの尿素、20mMのHepes−Na,pH7.5中で溶出させた。142,000M−1.cm−1という分子消散係数を用いて、280nmでの吸収から分光光度法により毒素濃度を決定した。
【0135】
Cys−Npys−OVAペプチドを、同じ手順を用いて、解毒された変異体である第2の組換え型CyaA毒素、CyaAE5−LCMVap(すなわち残基188と189の間の2つのアミノ酸LQの遺伝学的挿入の結果として酵素活性が欠如している)に対し、カップリングさせた。この毒素は同様に、CyaAの残基224と225の間に挿入され単一のCys残基を含有する15個のアミノ酸という長さのポリペプチド配列(PASAKAVYNFATCGT)も含有している。この組換え型毒素をコードするプラスミドは、PASAKAVYNFATCGT配列をコードする適切な合成2本鎖オリゴヌクレオチドのStuI及びKpnI制限部位の間での挿入によって修飾されたpCACT−ova−E5の誘導体である(Guermonprez et al.,2000)。Cya AE5−LCMVgpタンパク質は、A.1.1で前述したとおりに、発現され精製された。
【0136】
表1に示されているペプチドは、同様に、触媒部位内の同じLQジペプチド挿入及びCyaAの残基224と225の間に挿入された14個のアミノ酸の配列を含有するもう1つの解毒された組換え型CyaA毒素CyaAE5−CysOVAに、類似の形でカップリングされた。このインサートは、図12に示されているようなOVAエピトープに隣接するCys残基を含有している。この組換え型毒素をコードするプラスミドは、ASCGSIINFEKLGT配列をコードする適切な合成2本鎖オリゴヌクレオチドをBsiWI及びKpnI制限部位の間に挿入することにより修飾されたpCACT−ova−E5の誘導体である。CyaAE5−CysOVAタンパク質は、A.1.1に記述された通りに発現され精製された。
【0137】
CyaAE5−CysOVAは、ジスルフィド架橋によるCTLエピトープの化学的カップリングのための一般的な解毒済みベクターとみなすことができる。CyaAE5−CysOVA内部のOVAエピトープの存在は、B.1.4において前述した通り、特異的T細胞ハイブリドーマに対するOVAエピトープの提示を測定することによる、エピトープ送達における機能性についての容易なin vitro検定を可能にする。
【0138】
【表1】
【0139】
代替的には、組換え型CyaA毒素のチオール基を、2,2′−ジチオジピリジン(Sigma)で活性化し、還元されたシステインを含むペプチドで誘導体化することができる(合成ペプチド内のCysを還元するための手順はメーカーにより提供される)。これは、所望のペプチドが内部システイン残基を含有する場合に特に適していると思われる。
C.2 C ya Aに化学的にカップリングされたOVAエピトープの in vitro 及び in vivo 免疫原性の分析
化学的(CyaA−gp−S−S−OVA E5)又は遺伝学的カップリング(CyaA−OVA E5)の後のCyaAによるMHCクラス1分子に対するOVAエピトープのin vitro送達をまず最初に、脾細胞による抗OVA B3Z CD8+T細胞ハイブリドーマに対するこれらの分子の提示を研究することによって分析した。さまざまな濃度の組換え型CyaAの存在下で105個のB3Z細胞と18時間、C57BL/6マウスからの3・105個の脾細胞を同時培養した。B3ZによるIL−2放出を、CTLL増殖検定において測定した。
【0140】
図13に示されているように、B3ZがCyaA−gp−S−S−OVA E5又はCyaA−OVA E5のいずれかで刺激された時点で、高いIL−2分泌が観察され、かくして、CyaAに対し化学的にリンクされたOVAエピトープが、遺伝学的カップリングの後と同じ位効率良く抗原提示細胞の細胞質ゾル経路に対して送達されたことが実証された。B3Zが、OVAエピトープの欠如したCyaA分子で刺激された時点でいかなるIL−2産生も観察されず、かくしてIL−2産生の特異性が示された。
【0141】
第2段階では、次に、OVA特異的CTL応答を誘発するこれらの分子のin vivo能力が分析された。50μgのさまざまなCyaAをivで注射することによって、C57BL/6マウス(1グループにつき2匹)を免疫化した。7日後、個々のマウスの25・106個の脾細胞を5日間、照射を受けた同系の25・106個の脾臓細胞の存在下で0.1μgのOVAペプチドで再度刺激した。
【0142】
エフェクタ細胞の細胞毒性活性を、50μMのOVAペプチドでのパルス処理を受けた又は受けていない51Cr標識づけされたEL4標的細胞上で測定した。
【0143】
図14で示されているように、CyaA−gp−S−S−OVA E5又はCyaA−OVA E5のいずれかにより免疫化されたマウスの中で高いCTL反応が誘発され、かくして、OVAエピトープの化学的又は遺伝学的カップリングの比較可能な効率が実証された。OVAエピトープが欠如した対照CyaA分子で免疫化されたマウスにおいて、又はコーティングされていないEL4が標的細胞として使用された場合には、いかなるCTL応答も観察されず、観察されたCTL応答の特異性が示された。
【0144】
結論としては、これらの結果は明らかに、CyaA由来のタンパク様ベクターに化学的にリンクされたCD8+T細胞エピトープが、MHCクラスI提示のための細胞質ゾル経路に対し非常に効率良く送達され、in vivoで強いCTL応答を誘発するということを実証している。
D.CD11b/CD18に結合し効率の良い分子送達ベクターとして使用されうるC ya A由来のフラグメントの同定
CyaAとCD11b/CD18レセプタの間の相互作用に関与する領域をマッピングしようという1つの試みとして、CyaAのさまざまなサブフラグメントが構築され、段落Aにおいて前述した方法を用いて、トランスフェクションを受けたCHO細胞の表面上でCD11b/CD18に結合するためビオチニル化CyaA毒素と競合するそれらの能力についてテストされた。
D.1 C ya A373−1706の発現
新しい発現ベクターpTRAC−373−1706(図16)を使用することにより、E.coliの中でCyaA373−1706タンパク質を産生させた。これは、(CyaAのLys860及び983の翻訳後パルミトイル化による活性毒素へのproCyaAの変換に関与するCyaCをコードする)CyaC遺伝子及びCyaAのC末端ドメイン−コドン373から1706をコードするCyaA遺伝子の3′部分によってプラスミドpDL1312のニューロカルシン遺伝子を置換することで構築されたプラスミドpDL1312(Ladant 1995)の誘導体である(図16参照)。cyaC及び ’cyaAの両方の遺伝子共、λファージPrプロモータの制御下で同じ転写単位内に置かれる。cyaC遺伝子の3′末端は、その停止コドンの前に、下流側の ’cyaA遺伝子の翻訳開始を増強するためにリボソーム結合部位を導入するように修正された(図16)。結果としてのCyaCポリペプチドの修飾(CyaCのN末端における最後の3つのアミノ酸Gly−Thr−Alaは、Asn−Arg−Glu−Glu配列によって置換された)は、CyaAをアシル化するその能力に対しいかなる効果ももたらさなかった。(cyaAの唯一のBasBI部位の上流側の)毒素の触媒ドメインについてコードする)CyaA遺伝子の5′末端は、欠失させられ、MGCGN配列をコードする適切な合成2本鎖オリゴヌクレオチドで置換された(図16)。
【0145】
pTRAC−373−1706は同様に、32℃未満の温度でλPrプロモータにおける遺伝子転写を強く抑制する感熱性λリプレッサCI857、colE1の複製起点及びアンビシリン耐性を付与するベーターラクタマーゼ遺伝子をコードする。
【0146】
CyaA373−1706タンパク質の発現は、E. coli菌株BLR内で行なわれた。pTRAC−373−1706で形質転換された細胞を、中間対数期まで150mg/Lのアンピシリンを含有するLB培地内で30℃で成長させ、次に、42℃まで成長温度を上昇させることによってCyaC及び切形CyaA合成を誘発した。42℃でさらに3〜4時間成長させた後、細菌を収獲した。その後、野生型CyaAについて記述された通りに(Guermonprez et al.2000),CyaA373−1706タンパク質を精製した。CyaA373−1706にはcAMP合成活性が欠如し、これはヒツジ赤血球の溶血活性を示し、又そのMGCGNN末端配列内に唯一のシステイン残基をも含有している。
D.2 C ya A−E5及びC ya Aフラグメント:1〜383(触媒ドメイン)及び373−1706(疎水性及び反復ドメイン)によるCD11bに対するC ya A−E5結合の阻害
図15に示されているように、トランスフェクションを受けたCHO細胞をCyaA−E5と共にインキュベートした後に、ビオチニル化されたCyaA−E5結合の強い阻害が達成された。フラグメントCyaA−373−1706と共にこれらの細胞をインキュベートした後に類似の阻害が得られたが、一方、CyaA1−383は、ビオチニル化されたCyaA−E5の結合に対し著しい効果を全くもたなかった。
【0147】
かくして、これらの結果は明らかに、残基373〜1706を包含するCyaAのフラグメント,CyaA373〜1706が、CD11b/CD18レセプタとの相互作用に基本的に必要とされる構造を含有しているということを実証している。
E.結論
MHCクラスI分子は通常、内因的に合成されたタンパク質から誘発されたペプチドを提示することから、CTL応答を惹起するためには抗原提示細胞の細胞質ゾルに対しエピトープが送達されなくてはならない。組換え型ACTタンパク質のCTLプライミング活性が、抗原提示細胞(APC)の細胞質ゾル内にCD8+T細胞エピトープを送達するその能力に少なくとも1部分依存しているということは、以前に実証されてきた。1つのアプローチでは、野生型毒素についてはポリペプチドのその部分が、その毒性効果を及ぼす標的細胞の細胞質ゾルに到達すること(すなわちcAMP合成)がわかっているという理由で、CyaAの触媒ドメイン内にエピトープが遺伝学的に挿入された。細胞に入った後、エピトープインサートを包含するCyaA 触媒ドメインは、成熟したCD+T細胞エピトープを放出するためタンパク質分解によって処理されなくてはならず、このエピトープは次に小胞体に転座してMHCクラスI分子と会合することになる。
【0148】
プロテアソームによって実施されたこのタンパク質分解処理は、数多くのケースにおいて制限的な段階であり得(Pamer and Cresswell, 1988;Cascio et al., 2001),成熟エピトープの全体的収率の有意な減少を導く。ジスルフィド結合を用いてCyaAの触媒ドメインにエピトープをリンクさせることから成るここで記述されている代替的アプローチは、この設計では、(N末端トリミングのみを必要とする)成熟エピトープがAPCの細胞質ゾルの内部でCyaAから適量で放出されることになるという点において、著しい利点を提供する。さらに、単一のCyaA担体タンパク質は、所望のあらゆる合成ペプチドに対し容易にかつ急速にカップリングされうることから、これは非常に汎用的なシステムであるはずである。その上、同じCyaA分子上に多数のペプチドをカップリングできるように、組換え型の解毒されたCyaA毒素の触媒ドメイン内(例えば以前にマッピングされた許容部位内WO93/21324(INSTITUT PASTEUR)に複数のシステイン残基を遺伝子工学によって導入することも容易になる。これは、全体的なエピトープ送達及び組換え型タンパク質の免疫原性を増大させるはずである。
【0149】
欠失マッピングは、毒素とそのCD11b/CD18レセプタの相互作用に関与する領域としてCyaAのC末端部分(aa373−1706)を同定することを可能にした。従って、in vivoでCD11b+細胞をターゲティングするためのタンパク質モジュールとして切形タンパク質CyaA373−1706を使用することができる。特に、特異的免疫応答を惹起するために樹状細胞まで送達されるべきCyaA373−1706に、問題の抗原に対応するポリペプチド又はタンパク質を遺伝学的に融合させることができる。そのN末端として同じく唯一のシステインを含む組換え型CyaA373−1706タンパク質上で、類似のカップリングを実施することも可能である。
【0150】
【表2】
【0151】
【表3】
【0152】
【表4】
【0153】
【表5】
【0154】
【表6】
【0155】
【表7】
【0156】
【表8】
【0157】
【表9】
【0158】
【表10】
【0159】
【表11】
【0160】
【表12】
【図面の簡単な説明】
【図1A】
図1: CyaAの飽和可能結合は、CD11bの発現と相関関係をもつ。
a; マクロファージ(J774A.1)、B細胞(LB27.4)及びT細胞(EL4)の表面におけるCyaA結合を20分間37℃で実施した。表面結合したCyaAを、材料及び方法の節で記述されているように、ビオチニル化した抗−CyaAポリクローナル抗体で検出し、ストレプトアビジン−PEで顕示させ、生きた細胞上のフローサイトメトリにより検出した。結合は、△MFI=(CyaAでインキュベートされた細胞の平均蛍光強度値)−(CyaA無しの細胞の平均蛍光強度)として表現されている。
【図1B】
図1Aの続き。
b.c.d.e : J774A.1、LB27.4及びEL4細胞上のβ2インテグリンの表面発現。PEにカップリングされた特異的mAbを用いてフローサイトメトリによりCD11a(b)、CD11b(c)、CD11c(d)及びCD18(e)発現を決定した。インテグリン発現は、△MFI=(特異的mAbで染色された細胞の平均蛍光強度値)−(イソ型対照mAbで染色された細胞の平均蛍光強度)、として表現される。
【図2】
図2: マウス細胞系統に対するCyaA結合は抗CD11bmAbによって遮断される。
20μg/mlの特異的mAbと共に又はこれを伴わずに15分間4℃で細胞を予備インキュベートし、次に5μg/mlのCyaAそして予備インキュベーションの間に存在した場合には10μg/mlの特異的mAbと共に20分間4℃でインキュベートした。表面結合したCyaAを、材料及び方法の節で記述されているように、ビオチニル化された抗CyaAポリクローナルで検出し、ストレプトアビジン−PEにより顕示させ、生きた細胞上のフローサイトメトリにより検出した。
a.b.: さまざまな用量のCyaAの結合に対するM1/70抗CD11bmAbの効果。FS樹状細胞樹状細胞(a)又はJ774A.1マクロファージ(b)を、培地単独(○)で又はM1/70抗CD11bmAbと共に(●)予備インキュベートし、次にM1/70抗−CD11bmAbを伴って又は伴わずにインキュベートした。mAb無しで行なわれた実験から得た実験点を△MFI=Bmax*(〔CyaA〕/Kd+〔CyaA〕)に適合させることによってBmaxを決定した。
c.d.: 定用量のCyaA結合に対する特異的mAbの効果。FSDC(c)又はJ774A.1−(d)細胞を特異的mAb(抗CD11a、2D7、抗CD11b、M1/70及び5C6、抗−CD11c、HL3、抗−CD18、C17/16、対照A95−1)を伴って又は伴わずに予備インキュベートし、5μg/mlの定濃度でCyaAと共にインキュベートした。mAb無しのCyaA結合について得られた△MFI値として、特異的mAb、特異的mAbで処理した細胞上のCyaA結合について得た△MFIの値を正規化した。
【図3A】
図3: ヒト好中球に結合するCyaAは、抗CD11b及び抗−CD18mAbによって遮断される。
a.b.c.: 精製されたばかりの好中球の蛍光ヒストグラムを、培地単独(a)、44抗−CD−11b mAb(b)又はイソ型−整合した対照マウスmAb(c)で予備インキュベートし、その後、ビオチニル化CyaAを伴って(灰色)又は伴わずに(白抜き)インキュベートし、ストレプトアビジン−PEにより顕示させた。
【図3B】
図3Aの続き。
d: 好中球へのCyaA結合に対する特異的mAbの効果(抗CD11b、44、M1/70、抗−CD18、TS/18、対照マウスIgG2a、対照ラットIgG2b、A95−1)。
精製したばかりの好中球を、特異的mAbを伴って又は伴わずに予備インキュベートし、CyaAと共にインキュベートした。mAb無しのCyaA結合について得た△MFI値のa%として、特異的mAbで処理した細胞に対するCyaA結合について得た△MFIの値を正規化した。
【図4A】
図4: CyaAにより媒介される細胞内cAMPの増大及び細胞死は、J774A.1細胞内の抗−CD11bmAbにより特異的に遮断される。
a.: 細胞内cAMP蓄積に対する特異的mAbの効果。J774A.1細胞を1時間4℃で、10μg/mlの特異的mAb(抗−CD11b、M1/70、抗CD−18、C17/16)を伴って又は伴わずに予備インキュベートし、その後20分間37℃で、5μg/mlのCyaAを、予備インキュベーション中に存在した場合には10μg/mlのmAbを伴ってインキュベートした。細胞内cAMP含有量を、材料及び方法の節で記述されている通りに決定した。
【図4B】
図4Aの続き。
b: CyaAが媒介した細胞死に対する特異的mAbの効果。J774A.1 細胞を1時間4℃で培地単独で又は10μg/mlの特異的mAb(抗−CD11a、2D7抗−CD11b、M1/70、抗−CD11C、HL3、抗−CD18、C71/16、対照、2.4G2)と共に予備インキュベートした。その後、これらを0.5μg/mlのCyaAそして予備インキュベーション中存在している場合には10μg/mlの特異的mAbと共に2時間37℃でインキュベーションした。Cytotox96TM検定を用いてLDH放出により細胞溶解を決定した。
【図5A】
図5: CHO細胞は、CD11cではなくCD11bでのトランスフェクションを受けた時点でCyaAを結合させCyaAに対する感応性をもつ状態となる。
a.b.: CHOトランスフェクタントの表面で結合するCyaA、CD11b/CD18(●)、ヒトCD11c/CD18(○)でのトランスフェクションを受けたCHO細胞又はモックトランスフェクションを受けたCHO細胞(黒丸半円)を20分間37℃(a)又は4℃(b)で20分間、さまざまな用量のCyaAでインキュベートした。材料及び方法の節で記述される通りに、表面結合したCyaAをビオチニル化された抗CyaAポリクローナル抗体で検出し、ストレプトアビジン−PEで顕示させ、生きた細胞上でのフローサイトメトリーにより検出した。結合は、△MFI=(CyaAと共にインキュベートした細胞の平均蛍光強度値)−(CyaA無しの細胞の平均蛍光強度)として表現されている。
【図5B】
図5Aの続き。
c: CHOトランスフェクタント内での細胞内cAMPの蓄積。ヒトCD11b/CD18(●)、ヒトCD11c/CD18(○)でのトランスフェクションを受けたCHO細胞又はモックトランスフェクションを受けたCHO細胞(黒丸半円)を20分間37℃でCyaAと共に又はCyaAを伴わずにインキュベートした。材料及び方法の節で記述される通りに、細胞内cAMP含有量を決定した。
d: CHOトランスフェクタント内での細胞溶解。ヒトCD11b/CD18、ヒトCD11c/CD18でのトランスフェクションを受けたCHO細胞又はモックトランスフェクションを受けたCHO細胞を37℃で4時間5μg/mlのCyaAでインキュベートした。Cytotox96TM検定を用いてLDH放出により細胞溶解を決定した。
【図6A】
図6: Cya AOVAでの静脈内免疫化が、B細胞、CD4及びCD40に依存しない形で抗OVACTL応答をプライミングする。
C57BL/6 WT+/+(a)、CD4−/−(b)、CD40−/−(c)又はIgM−/−(d)マウスを、OVAからのH−2Kb制限されたSIINFEKLエピトープを担持するCyaAの遺伝学的に解毒された形態であるCyaAOVA50μgを用いて、(●、○)又はOVAエピトープ無しの対照の解毒された毒素であるCyaAE5を用いて(黒三角、△)、静脈内で免疫化した。7日後、動物を屠殺し、脾細胞を、照射を受けたC57BL/6脾細胞の存在下で10μg/mlのpOVA合成ペプチドを用いて5日間、in vitroで再刺激した。10μg/mlでpOVAを用い予めパルス処理した(●、黒三角)又はしない(○、△)H−2K2bEL4細胞に対する4時間のクロム51放出検定内で、CTL活性を査定した。
【図6B】
図6Aの続き。
【図7A】
図7: 静脈内免疫化の後の、in vitro又はin situでのCyaAOVA提示に関与する脾細胞抗原提示細胞の同定。
脾細胞の低密度画分は、特異的抗−OVACD8+T細胞ハイブリドーマ(a、b)に対しCyaAOVAを提示する:
In vitro検定(a):ナイーブマウス(TSC、黒四角、□)由来の低(LDF、●)及び高密度(HDF、黒三角)画分又は未分画合計脾細胞を、H−2Kbの状況下で、pOVAペプチドに対し特異的なCD8+T細胞ハイブリドーマであるB3Zで培養した。OVAペプチド(CyaAOVA、●、黒三角、黒四角)又は対照ペプチド(CyaALCMV、□)をさまざまな濃度で担持する組換え型解毒済みCyaAの存在下での18時間の同時培養の後、上清中で放出されたIL−2をCTLL増殖検定において測定した。結果は、△cpm単位で表現され、検定中のCyaA濃度に対してプロットされている(△cpm=[cpm+CyaA]−[cpm−CyaA])。
Ex vivo検定(b): 前もって50μgのCyaAOVA(●、黒三角、黒四角)又はCyaALCMV(○)で静脈内(iv)で免疫化した(6〜12時間)マウスから脾細胞を得、LDF及びHDFにおいて分画した。TSC(黒四角)、LDF(●、○)、又はHDF(黒三角)から回収したさまざまな数の細胞又は未分画脾細胞(黒四角)を、組換え型CyaAを添加すること無く直接B3Zでの培養に付した。前述のように18時間培養した後IL−2の放出を査定した。cpm単位で表わした結果は、各ウェル内に存在するAPCの数に対しプロットされている。
樹状細胞(CD11c+)はCD11bhigh+CD11c−細胞又はB細胞(CD45R+)(c、d)よりもさらに効率の良いAPCである:
In vitro検定(c): LDFからのCD11c+(●)選別細胞、TSCからのCD11bhigh+CD11c−(○)及びCD45R+(黒四角)選別細胞を、さまざまな濃度のCyaAOVAの存在下で18時間B3Zと共に培養に付した。IL−2を上述のように査定した。
Ex vivo検定(d): 50μgのCyaAOVAで予め(6〜12時間)免疫化されたC57BL/6マウスからフローサイトメトリーにより選別した細胞を、APCとして使用した。低密度脾細胞からのCD11c+(●)、CD11bhigh+CD11c−(○)、CD45R+(黒四角)選別細胞を、CyaAOVAの添加なくウェル1つあたりさまざまな細胞数でB3Zと共に直接18時間培養させた。上述のとおり、IL−2を査定した。
CD8α−骨髄性樹状細胞は、CD8α+リンパ樹状細胞サブセット(e、f)よりもさらにCyaAについて効率の良いAPCである:
ナイーブマウス(e)又は予め(6〜12時間)50μgのCyaAOVAでivで免疫化されたマウス(f)からのCD11c+低密度細胞を、骨髄性樹状細胞(CD11c+D8α−、●)及びリンパ樹状細胞(CD11c+D8α+、○)内でフローサイトメトリーにより分画し、B3Z刺激について、in vitro(e)及びex vivo(f)検定においてAPCとして使用した。IL−2を上述の通り査定した。
B細胞遺伝学的枯渇は、脾細胞(g、h)によるCyaAOVA提示を損なわない:
C57BL/6WTマウス(黒四角、●、黒三角)又はB細胞欠損マウス(□、○、△)からのTSC(黒四角、□)、LDF(●、○)又はHDF(黒三角、△)を、aの場合と同様に、B3Zについてのin vitro検定(g、黒四角、□)又はex vivo検定(h、黒四角、●、黒三角、□、○、△)においてAPCとして使用した。マウスは、ナイーブ(g)のもの又は予め(1.5時間)ivで50μgのCyaAOVAで免疫化されたもの(h)のいずれかに由来していた。上述の通りIL−2を査定した。
【図7B】
図7Aの続き。
【図8】
図8: 樹状細胞によるCyaAOVAの提示は、静脈内免疫化の後、in vitro及びin vivoでTAP輸送体を必要とする。
In vitro検定(a): 対照C57BL6 TAP+/+(黒三角、●)又はTAP−/−マウス(△、○)からのTSC(黒三角、△)又はCD11c+(●、○)選別細胞を、さまざまな用量のCyaAOVAの存在下又は不在下でB3Zを用いて培養した。図6aに描かれている通り、IL−2を査定した。結果は、抗原濃度に対しプロットされ、cpm単位で表わされている。
Ex vivo検定(b):対照C57BL6TAP+/+(黒三角、●)又は予めivで50μgのCyaAOVAで免疫化されたTAP−/−マウス(△、○)からのTSC(黒三角、△)又はCD11c+(●、○)選別細胞を、18時間B3Zで培養した。図6aに描かれている通り、IL−2を査定した。結果は、同時培養された細胞の数に対してプロットされ、cpm単位で表わされている。
【図9a】
図9: 細胞に対するCyaAOVA結合におけるαMβ2インテグリン(CD11b)の役割
TSCに対するCyaAOVAビオチンの結合は、抗−CD11b(a)によって遮断される: TSC懸濁液を、10μg/mlの抗CD11bM1/70mAb又はイソ型対照mAbと共に、又は全く何も無く、4℃でインキュベートした。その後、2μg/ml(左図版)又はさまざまな濃度(右図版)のCyaAOVA−ビオチンを4℃で30分間細胞に添加した。洗浄の後、30分間ストレプトアビジン−PEでCyaAOVA−ビオチンを顕示させた(Strep−PE)。その後、洗浄後、細胞を、ヨウ化プロピジウムを含有するPBS中で細胞を再懸濁させた。ヨウ化プロピジウム排除によりゲートされた生きた細胞のサイズ(FSC)を、Strep−PE蛍光に対しプロットした。染色中のCyaAOVA−ビオチン濃度に対し、CyaAOVA−ビオチンについて陽性のリンパ球の百分率をプロットした。
【図9b1】
図9aの続き。
低密度細胞に対するCyaAOVA−ビオチンの結合は、CD11b(b)の発現と相関関係を有する:LDFを、CD11c、CD8α及びCyaOVA−ビオチン(又は培地)について3重染色するか、又は別の実験においては、CD11c、CD8α及びCD11b(又は対照mAb)で染色した。洗浄後、細胞をStrep−PEで30分間染色してCyaAOVA−ビオチン、抗−CD11c−FITC及び抗−CD8α−APCを顕示した。リンパDC(CD11c+CD8α+)、骨髄性DC(CD11c+CD8α−)、CD8+T細胞(CD11c−CD8α+)及びその他の細胞(CD11c−CD8α−)についてゲートを行なった。各ゲートについて、CyaAOVA−ビオチン染色又はCD11b染色が、別々のヒストグラム内で細胞数に対しプロットされている。左側ヒストグラム:LDF懸濁液を0μg/ml(灰色で満たされたヒストグラム)、2.5μg/ml(狭く、開放したヒストグラム)又は10μg/ml(厚く、開放したヒストグラム)のCyaAOVA−ビオチンと共に30分間室温でインキュベートした。右側ヒストグラム:イソ型対照−PE(灰色で満たされたヒトスグラム)、CD11b−PE(薄く、開放したヒストグラム)。
【図9b2】
図9b1の続き。
【図10】
図10: MHCIによるCyaAOVA提示におけるαMβ2インテグリン(CD11bの役割
TSC(a、b)でのin vitro抗原提示検定:a、bの場合と同じ実験を、APCとしてナイーブC57BL/6マウスからのTSCを用いて実施した。B3Zの刺激を、CTLL増殖検定で測定された同時培養上清中のIL−2放出により査定した。CyaAOVA又はpOVA濃度に対し、cpm単位で結果がプロットされている。
TSC又はCD11b+及びCD11b−画分(c、d)でのex vivo抗原提示検定: C57BL/6マウスを、50μgのCyaAOVA(c)又は10μgのpOVA(d)で静脈内免疫化した。TSC(△)からフローサイトメトリーによってCD11b+(●)及びCD11b−(○)細胞を選別し、B3Zで1ウェルあたりさまざまな細胞数で培養に付した。18時間の同時培養の後、B3Zの刺激をIL−2放出により査定した。cpm単位で表わした結果は、各ウェル内に存在する免疫化された動物からのAPC数に対しプロットされている。
【図11】
図11: ジスルフィド結合を通した組換え型CyaAに対するエピトープの化学的カップリング方法のまとめ。
【図12】
図12: CTLエピトープの化学的カップリングのためのベクターのダイヤグラム
【図13】
図13: CTLL増殖検定において測定されたB3ZによるIL−2放出を示すグラフ。
C57BI/6マウスからの3・105個の脾細胞を、さまざまな濃度のシクラーゼの存在下で105個のB3Z細胞と18時間同時培養した。B3ZによるIL2放出をCTLL増殖検定において測定した。
【図14A】
図14: 50μMのOVAペプチドでパルス処理された(A)又はされていない(B)51Cr標識づけされたEL4標的細胞上で測定された細胞毒性活性を示すグラフ
C57BL/6マウスをさまざまなCyaA50μgで静脈内注射した。7日後、脾細胞をOVAペプチドでin vitroで刺激した。51Crで標識づけされた標的細胞上で、細胞毒性活性を測定した。
図14は、OVA特異的CTL応答を誘発する本発明のタンパク様ベクターのin vivo能力を示す。
【図14B】
図14A続き。
【図15】
図15: CyaA−E5及びCyaAフラグメントによるCD11bに対するCyaA結合の阻害
CD11b/CD18でのトランスフェクションを受けたCHO細胞を、異なる濃度のCyaA−E5(黒色三角形)、CyaAl−383(黒色四角形)又はCyaA−373−1706(黒色菱形)と共に1時間氷上で予備インキュベートし、次に、5μg/mlのビオチニル化されたCyaA−E5で30分間氷上でインキュベートした。表面結合したシクラーゼをストレプトアビジン−PEを用いて顕示させ、生きた細胞上でフローサイトメトリーにより分析した。結果は平均蛍光強度(A)、陽性細胞百分率(B)及び阻害百分率(C)として示されている。
【図16】
図16: pTRAC−373−1706発現ベクターの概略的表示
大きい矢印は、β−ラクタマーゼ(bla)、ファージラムダの感熱性リプレッサcl857(λcl857)、CyaC遺伝子及び切形 ’CyaA遺伝子の読取り枠を表わす(矢印は、対応する遺伝子の翻訳方向を指している)。ColE1起点(Ori)、Prプロモータ(λPr)及びいくつかの関連制限部位も同様に表示されている。cyaCと切形 ’cyaA 遺伝子の間の遺伝子間領域は、下部に詳しく示されている。これは、cyaCの新しいC末端拡張(野生型CyaCのArg182の下流側)、停止コドン(下線付き)、CyaA373−1706のイニシエータMet及び第1のコドン(野生型Cya−Aの上流側)を示している。
Claims (56)
- CD11b発現細胞に対し特異的に問題の分子をターゲティングするためのタンパク様ベクターの製造におけるBordetella種アデニルシクラーゼの使用。
- CD11b発現細胞に対する問題の分子のターゲティングのための組成物の調製を目的とした、前記問題の分子の挿入により修飾されているBordetellaアデニルシクラーゼの使用。
- 前記Bordetella種アデニルシクラーゼがBordetellaアデニルシクラーゼ毒素の1フラグメントであり、前記フラグメントがCD11bレセプタに結合する能力をもつ、請求項2に記載の使用。
- CD11bレセプタに結合する能力をもつBordetellaアデニルシクラーゼ毒素の前記フラグメントは、そのN末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如したBordetellaアデニルシクラーゼ毒素である、請求項3に記載の使用。
- CD11bレセプタに結合する能力をもつBordetellaアデニルシクラーゼ毒素は、残基1〜373の全て又は一部分が欠如したBordetella pertussisアデニルシクラーゼ毒素である、請求項4に記載の使用。
- 前記問題の分子のターゲティングがin vivoで有効である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
- 問題の分子が、CD11b発現細胞の細胞質ゾルの中で特異的にターゲティングされ転座させられている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 前記CD11b発現細胞が樹状細胞、より好ましくは骨髄性樹状細胞である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用。
- 前記CD11b発現細胞が好中球である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用。
- アデニルシクラーゼが遺伝学的に修飾されたBordetella種のアデニルシクラーゼである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用。
- アデニルシクラーゼが非毒性形態である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用。
- アデニルシクラーゼがBordetella pertussis由来のものである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用。
- 問題の分子が、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用。
- 問題の分子が抗原である、請求項13に記載の使用。
- 問題の分子がエピトープを含んで成る、請求項13に記載の使用。
- 問題の分子が、そのN末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如した遺伝学的に修飾されたBordetellaアデニルシクラーゼ、より好ましくは残基1−373が欠如したBordetella pertussis アデニルシクラーゼのN末端に融合された異種ペプチドである、請求項15に記載の使用。
- 前記抗原が細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原から成るグループの中から選択されている、請求項14に記載の使用。
- 前記抗原が、ポリオウイルス抗原、HIVウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルスエピトープ、腫瘍抗原から成るグループの中から選択されている、請求項17に記載の使用。
- 問題の分子が、アデニルシクラーゼ毒素に化学的又は遺伝学的にカップリングされた薬物である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用。
- 前記薬物が、前記アデニルシクラーゼの触媒ドメイン内にある遺伝学的に挿入されたシステイン残基に対するジスルフィド結合を用いて化学的にカップリングされている、請求項19に記載の使用。
- 薬物が抗炎症性薬物である請求項19又は20のいずれか1項に記載の使用。
- 触媒ドメイン内に挿入された抗原を含むBordetellaアデニルシクラーゼを含むことを特徴とする、動物又はヒトの宿主において投与するように処方された免疫原性組成物。
- 問題の分子がBordetella種アデニルシクラーゼにカップリングされていることを特徴とする、CD11b発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするように処方されたヒト又は動物における投与のための薬学組成物。
- アデニルシクラーゼが、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである、請求項22又は23に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼがCD11b発現細胞の細胞質ゾル内で特異的に問題の分子を転座させることができる、請求項24に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、その触媒N末端ドメインの全て又は一部分の欠如したBordetellaアデニルシクラーゼである、請求項25に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、残基1〜373の欠如したBordetella pertussisアデニルシクラーゼである、請求項25に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、許容部位において触媒ドメイン内に挿入された単数又は複数のシステイン残基を含んで成る、請求項24又は25のいずれか1項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 前記CD11b発現細胞が樹状細胞、より好ましくは骨髄性樹状細胞である、請求項22〜28のいずれか1項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 前記CD11b発現細胞が、好中球である、請求項22〜28のいずれか1項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 問題の分子が、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される、請求項22〜30に記載の薬学又は免疫原性組成物。
- 問題の分子にカップリングされたBordetella種アデニル酸シクラーゼをコードする核酸構成を含んで成る、請求項22〜29に記載の薬学又は免疫原性組成物。
- 問題の分子が薬物である、請求項31に記載の薬学又は免疫原性組成物。
- 薬物が抗炎症薬である、請求項33に記載の薬学組成物。
- 問題の分子が抗原である、請求項22〜31に記載の薬学又は免疫原性組成物。
- 前記抗原が細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原から成るグループの中から選択されている、請求項35に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 抗原が、ポリオウイルス抗原、HIVウイルス、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルス抗原、腫瘍抗原から成るグループの中から選択されている、請求項36に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 前記抗原が、そのN末端触媒ドメインの欠如した遺伝学的に修飾されたBordetellaアデニルシクラーゼのN末端部分に融合されている、請求項35〜37のいずれか1項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 前記抗原が、残基1−373の欠如した遺伝学的に修飾されたBordetella1 pertussisアデニルシクラーゼに融合されている、請求項35〜38のいずれか1項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 静脈内投与ために処方され、特にプライミングアジュバンドが欠けている、請求項22〜39のいずれか1項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
- 特異的に樹状細胞が関与する免疫応答を誘発又は刺激する能力をもつ、請求項22〜40のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ワクチン又は免疫療法組成物の調製のための請求項35〜39のいずれか1項に記載の免疫原性又は薬学組成物の使用。
- CD11b発現細胞に特異的に問題の分子を送達するためのタンパク様ベクターにおいて、前記問題の分子にカップリングされた組換え型Bordetella種アデニルシクラーゼを含んで成ることを特徴とするタンパク様ベクター。
- CD11b発現細胞の細胞質ゾル内で特異的に問題の分子を送達することもできる、請求項43に記載のタンパク様ベクター。
- 前記CD11b発現細胞が樹状細胞、より好ましくは骨髄性樹状細胞である、請求項43又は44に記載のタンパク様ベクター。
- 前記CD11b発現細胞が好中球である、請求項43又は44に記載のタンパク様ベクター。
- アデニルシクラーゼが遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである、請求項43〜46のいずれか1項に記載のタンパク様ベクター。
- 前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼには未変性システイン残基が欠けているが、触媒ドメイン内の1又は複数の許容部位に遺伝学的を挿入された1又は複数のシステイン残基が含まれている、請求項47に記載のタンパク様ベクター。
- アデニルシクラーゼが非毒性アデニルシクラーゼである、請求項47又は48のいずれか1項に記載のタンパク様ベクター。
- 遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、そのN末端触媒ドメインの全て又は一部分の欠如したBordetellaアデニルシクラーゼである、請求項47〜49のいずれか1項に記載のタンパク様ベクター。
- アデニルシクラーゼがBordetella pertussis由来のものである、請求項43〜50のいずれか1項に記載のタンパク様ベクター。
- 前記組換え型アデニルシクラーゼが、残基1〜373の欠如したBordetella pertussisアデニルシクラーゼである、請求項51に記載のタンパク様ベクター。
- 問題の分子が、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される、請求項43〜52に記載のタンパク様ベクター。
- 前記問題の分子が、前記アデニルシクラーゼに化学的又は遺伝学的にカップリングされた薬物である、請求項43〜53のいずれか1項に記載のタンパク様ベクター。
- 問題の分子がエピトープである、請求項54に記載のタンパク様ベクター。
- 前記問題の分子は、未変性システイン残基が欠けているもののその触媒ドメイン内で1又は複数の許容部位に遺伝学的に挿入された1又は複数のシステイン残基を含有する遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼに化学的にカップリングされたエピトープである、請求項54又は55のいずれか1項に記載のタンパク様ベクター。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00402562A EP1188446B1 (en) | 2000-09-15 | 2000-09-15 | Proteinaceous vectors for molecule delivery to CD11b expressing cells |
PCT/EP2001/011315 WO2002022169A2 (en) | 2000-09-15 | 2001-09-14 | VECTORS FOR MOLECULE DELIVERY TO CD11b EXPRESSING CELLS |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004508065A true JP2004508065A (ja) | 2004-03-18 |
JP2004508065A5 JP2004508065A5 (ja) | 2011-12-01 |
Family
ID=8173866
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002526418A Pending JP2004508065A (ja) | 2000-09-15 | 2001-09-14 | CD11b発現細胞に対する分子送達用ベクター |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20040001867A1 (ja) |
EP (2) | EP1188446B1 (ja) |
JP (1) | JP2004508065A (ja) |
KR (2) | KR100879151B1 (ja) |
AT (2) | ATE438409T1 (ja) |
AU (2) | AU9385501A (ja) |
BR (1) | BR0113915A (ja) |
CA (1) | CA2422603A1 (ja) |
CZ (1) | CZ2003726A3 (ja) |
DE (1) | DE60042687D1 (ja) |
ES (1) | ES2331348T3 (ja) |
HK (1) | HK1057989A1 (ja) |
HU (1) | HUP0303126A3 (ja) |
PL (1) | PL208864B1 (ja) |
PT (1) | PT1188446E (ja) |
RU (1) | RU2312143C2 (ja) |
WO (1) | WO2002022169A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015524270A (ja) * | 2012-07-23 | 2015-08-24 | ゲントイセル | 異種ポリペプチドを含むCyaAベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2646776B1 (fr) | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
ES2331348T3 (es) | 2000-09-15 | 2009-12-30 | Pasteur Institut | Vectores proteinicos para el suministro de moleculas a las celulas que expresan cd11b. |
EP1489092A1 (en) | 2003-06-18 | 2004-12-22 | Institut Pasteur | Modified Bordetella adenylate cyclase comprising or lacking CD11b/CD18 interaction domain and uses thereof |
CA2542612A1 (en) * | 2003-10-14 | 2005-04-21 | Kingston Henry Gordon Mills | Adenylate cyclase in the treatment and/or prophylaxis of immune-medicated disease |
ES2337694T3 (es) * | 2003-11-21 | 2010-04-28 | Institut Pasteur | Toxina de adenilato ciclasa recombinante de bordetella que induce las respuestas de la celula t contra los antigenos tumorales. |
DK1576967T3 (da) * | 2004-03-18 | 2008-01-21 | Pasteur Institut | Rekombinant protein, der bærer epitoper fra det humane papillomvirus indsat i et adenylatcyclaseprotein eller et fragment deraf samt dets terapeutiske anvendelse |
ES2291071B1 (es) | 2005-06-13 | 2009-03-16 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Agentes y metodos basados en el uso del dominio eda de la fibronectina. |
ES2331271B1 (es) * | 2007-06-29 | 2010-10-14 | Universidad Del Pais Vasco | Metodo para la internalizacion de bacterias no invasivas en celulas eucariotas. |
SG193832A1 (en) * | 2008-05-29 | 2013-10-30 | Transgene Sa | Biomarker for selecting patients and related methods |
DK2233569T3 (da) | 2009-03-23 | 2014-10-06 | Inst Of Microbiology Of The Ascr V V L | Mutante CyaA-polypeptider og polypeptidderivater egnet til at levere immunogene molekyler i en celle |
RU2585216C2 (ru) * | 2009-03-23 | 2016-05-27 | Институт Пастор | Мутантные полипептиды суаа и производные полипептидов, подходящие для доставки иммуногенных молекул в клетку |
GB201003920D0 (en) * | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method of treatment |
EP2478915A1 (en) | 2011-01-24 | 2012-07-25 | Genticel | CyaA-carried polypeptide(s) and use to induce both therapeutic and prophylactic immune responses |
EP2689786A1 (en) | 2012-07-23 | 2014-01-29 | Genticel | HPV/CYAA-based chimeric proteins and their uses in the induction of immune responses against HPV infection and HPV-induced disorders |
EP2975120A1 (en) | 2014-07-17 | 2016-01-20 | Institut Pasteur | Monomeric and functional adenylate cyclase CyaA toxin |
EP3323426A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-23 | Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse | Immunogenic and vaccine compositions for use against bordetella bronchiseptica infection |
WO2018091613A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse | Immunogenic and vaccine compositions for use against bordetella bronchiseptica infection |
EP3342421A1 (en) | 2016-12-27 | 2018-07-04 | Genticel | Immunogenic composition comprising cyaa-derived polypeptide promoting a th1/th17-oriented immune response |
JP7407721B2 (ja) * | 2017-11-03 | 2024-01-04 | アセンド バイオテクノロジー インク | 腫瘍関連骨髄系細胞の調節および免疫チェックポイント遮断の増強のための方法 |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2601679B1 (fr) * | 1986-07-15 | 1990-05-25 | Sanofi Sa | Immunotoxines, procede de preparation et compositions pharmaceutiques en contenant |
US5182211A (en) | 1987-08-07 | 1993-01-26 | Institut Pasteur | Plasmid vectors encoding a protein of a picornavirus |
US5312902A (en) | 1988-06-09 | 1994-05-17 | Institut Pasteur | Dimer of the precursor of HIV-2 envelope glycoprotein |
US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
FR2638169B1 (fr) | 1988-10-25 | 1991-01-11 | Pasteur Institut | Derives d'adenyl cyclase et leurs utilisations biologiques |
EP0406857B1 (en) | 1989-07-07 | 1995-05-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Proteins and production thereof |
NO175188C (no) | 1990-06-27 | 1994-09-14 | Sjur Olsnes | Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidkonjugat med evne til å trenge inn i cellecytosol |
US5935580A (en) * | 1992-04-21 | 1999-08-10 | Institut Pasteur | Recombinant mutants for inducing specific immune responses |
DK0637335T3 (da) * | 1992-04-21 | 2007-11-26 | Pasteur Institut | Rekombinante mutanter til induktion af specifikke immunreaktioner |
DE69612093T2 (de) * | 1995-06-07 | 2001-10-31 | Joel K Swadesh | Auf antigen verarbeitende zellen zielgerichtete konjugate ein polyaminosäure rückgrat und ein nicht-steroidales antiphlogistikum enthaltend |
US5821122A (en) | 1995-06-07 | 1998-10-13 | Inserm (Institute Nat'l De La Sante Et De La Recherche . .) | Isolated nucleic acid molecules, peptides which form complexes with MHC molecule HLA-A2 and uses thereof |
AU2322097A (en) | 1996-03-27 | 1997-10-17 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Lyophilized pulmonary surfactant peptide compositions |
US6333154B1 (en) * | 1997-12-04 | 2001-12-25 | Institut Pasteur | Bacterial multi-hybrid system and applications thereof |
US6673914B1 (en) | 1998-01-22 | 2004-01-06 | John Wayne Cancer Institute | Human tumor-associated gene |
CA2374237A1 (en) * | 1999-05-06 | 2000-11-16 | Wake Forest University | Compositions and methods for identifying antigens which elicit an immune response |
CN1402782A (zh) | 1999-10-19 | 2003-03-12 | 路德维哥癌症研究院 | Mage-a12抗原肽及其应用 |
ES2331348T3 (es) | 2000-09-15 | 2009-12-30 | Pasteur Institut | Vectores proteinicos para el suministro de moleculas a las celulas que expresan cd11b. |
EP1489092A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-22 | Institut Pasteur | Modified Bordetella adenylate cyclase comprising or lacking CD11b/CD18 interaction domain and uses thereof |
CA2542612A1 (en) | 2003-10-14 | 2005-04-21 | Kingston Henry Gordon Mills | Adenylate cyclase in the treatment and/or prophylaxis of immune-medicated disease |
US20070026022A1 (en) | 2004-11-19 | 2007-02-01 | Gilles Dadaglio | Recombinant adenylate cyclase toxin of Bordetella induces T cell responses against tumoral antigens |
ES2337694T3 (es) | 2003-11-21 | 2010-04-28 | Institut Pasteur | Toxina de adenilato ciclasa recombinante de bordetella que induce las respuestas de la celula t contra los antigenos tumorales. |
DK1576967T3 (da) | 2004-03-18 | 2008-01-21 | Pasteur Institut | Rekombinant protein, der bærer epitoper fra det humane papillomvirus indsat i et adenylatcyclaseprotein eller et fragment deraf samt dets terapeutiske anvendelse |
EP1894941A1 (en) | 2006-09-01 | 2008-03-05 | Institut Pasteur | Treatment of cervical carcinoma with a recombinant adenylate cyclase carrying HPV antigens |
US8017132B2 (en) * | 2009-03-23 | 2011-09-13 | Institut Pasteur | Mutant CyaA polypeptides and polypeptide derivatives suitable for the delivery of immunogenic molecules into a cell |
-
2000
- 2000-09-15 ES ES00402562T patent/ES2331348T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-15 DE DE60042687T patent/DE60042687D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-15 AT AT00402562T patent/ATE438409T1/de active
- 2000-09-15 EP EP00402562A patent/EP1188446B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-15 PT PT00402562T patent/PT1188446E/pt unknown
-
2001
- 2001-09-14 CA CA002422603A patent/CA2422603A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-14 JP JP2002526418A patent/JP2004508065A/ja active Pending
- 2001-09-14 AU AU9385501A patent/AU9385501A/xx active Pending
- 2001-09-14 AU AU2001293855A patent/AU2001293855B2/en not_active Ceased
- 2001-09-14 CZ CZ2003726A patent/CZ2003726A3/cs unknown
- 2001-09-14 HU HU0303126A patent/HUP0303126A3/hu unknown
- 2001-09-14 PL PL365743A patent/PL208864B1/pl unknown
- 2001-09-14 KR KR1020037003818A patent/KR100879151B1/ko active IP Right Grant
- 2001-09-14 AT AT01974315T patent/ATE518880T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-09-14 WO PCT/EP2001/011315 patent/WO2002022169A2/en active IP Right Grant
- 2001-09-14 BR BR0113915-0A patent/BR0113915A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-09-14 EP EP01974315A patent/EP1317282B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-14 RU RU2003110574/13A patent/RU2312143C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-09-14 KR KR1020087015164A patent/KR100953364B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-03-14 US US10/387,486 patent/US20040001867A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-04 HK HK03108857.2A patent/HK1057989A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-05 US US11/098,404 patent/US20050238637A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-06-27 US US13/169,605 patent/US9370564B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-06-08 US US15/177,029 patent/US10004794B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015524270A (ja) * | 2012-07-23 | 2015-08-24 | ゲントイセル | 異種ポリペプチドを含むCyaAベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用 |
JP2019013229A (ja) * | 2012-07-23 | 2019-01-31 | ゲントイセル | 異種ポリペプチドを含むCyaAベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002022169A2 (en) | 2002-03-21 |
EP1317282A2 (en) | 2003-06-11 |
BR0113915A (pt) | 2003-07-01 |
HUP0303126A2 (hu) | 2003-12-29 |
PL365743A1 (en) | 2005-01-10 |
KR20030055265A (ko) | 2003-07-02 |
AU2001293855B2 (en) | 2007-04-26 |
KR100953364B1 (ko) | 2010-04-20 |
AU9385501A (en) | 2002-03-26 |
US20050238637A1 (en) | 2005-10-27 |
US10004794B2 (en) | 2018-06-26 |
PT1188446E (pt) | 2009-11-10 |
US20120214206A1 (en) | 2012-08-23 |
EP1188446A1 (en) | 2002-03-20 |
DE60042687D1 (de) | 2009-09-17 |
EP1188446B1 (en) | 2009-08-05 |
HK1057989A1 (en) | 2004-04-30 |
US20040001867A1 (en) | 2004-01-01 |
US20160375119A1 (en) | 2016-12-29 |
KR100879151B1 (ko) | 2009-01-19 |
HUP0303126A3 (en) | 2004-10-28 |
PL208864B1 (pl) | 2011-06-30 |
ATE438409T1 (de) | 2009-08-15 |
US9370564B2 (en) | 2016-06-21 |
EP1317282B1 (en) | 2011-08-03 |
RU2312143C2 (ru) | 2007-12-10 |
ES2331348T3 (es) | 2009-12-30 |
ATE518880T1 (de) | 2011-08-15 |
CZ2003726A3 (cs) | 2003-09-17 |
WO2002022169A3 (en) | 2002-11-21 |
CA2422603A1 (en) | 2002-03-21 |
KR20080059684A (ko) | 2008-06-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10004794B2 (en) | Vectors for molecule delivery to CD11b expressing cells | |
Agren et al. | Genetically engineered nontoxic vaccine adjuvant that combines B cell targeting with immunomodulation by cholera toxin A1 subunit. | |
Tao et al. | Induction of IL-4-producing CD4+ T cells by antigenic peptides altered for TCR binding. | |
US20160355593A1 (en) | Antibody vaccine conjugates and uses therefor | |
AU2001293855A1 (en) | Vectors for molecule delivery to CD11b expressing cells | |
US7807377B2 (en) | Method of isolating antigen-specific T cells employing artificial antigen presenting cells | |
HU227508B1 (en) | Soluble lymphotoxin-beta receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies, as therapeutic agents for the treatment of immunological disease | |
JP2003519668A (ja) | 熱ショックタンパク質融合タンパク質による、cd4+t細胞非依存性のインビボctl惹起による個別atp結合ドメインのマッピング | |
JPH11513025A (ja) | アレルゲン−xcd32融合タンパク質 | |
JP4024298B2 (ja) | 治療薬および自己免疫疾患 | |
Gengoux et al. | In vivo induction of CD4+ T cell responses by antigens covalently linked to synthetic microspheres does not require adjuvant | |
EP1594533B1 (en) | Antibody vaccine conjugates and uses therefor | |
ES2201078T3 (es) | Metodos de aislar antigenos presentados por cd1, vacunas que comprenden antigenos presentados por cd1, y lineas celulares para usar en dichos metodos. | |
Feldmann et al. | Macrophage-lymphocyte interactions in immune induction | |
Carayanniotis et al. | Characterization of the adjuvant-free serological response to protein antigens coupled to antibodies specific for class II MHC determinants | |
EP1390065A2 (en) | Methods for promoting antigen presentation and modulating immune responses using cholera toxin and its b subunit | |
AU2007203473B2 (en) | Vectors for Molecule Delivery to CD11b Expressing Cells | |
Delamarre et al. | and Presentation | |
Virella et al. | The induction of an immune response: antigens, lymphocytes, and accessory cells | |
ROSENTHAL | Macrophage—Lymphocyte Interactions in Immune | |
US20040265341A1 (en) | Prevention of uveitis | |
Nasser et al. | Prior exposure to the carrier regulates rat immune responses to a conjugate vaccine | |
JP2003528025A (ja) | 免疫反応調節物質アルファ2マクログロブリン複合体 | |
AU2002311499A1 (en) | Methods for promoting antigen presentation and modulating immune responses using cholera toxin and its B subunit |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080903 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110412 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110711 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110719 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20111012 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120619 |