JP2004507231A - Recombinant non-replicating virus expressing GM-CSF and use thereof for enhancing an immune response - Google Patents

Abstract

For use in enriching antigen-presenting cells (APCs) at the site of immunization, to enhance the immunological response to the antigen or immunological epitope by functioning as a biological adjuvant; Disclosed is a replication-defective recombinant poxvirus encoding granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) for preventing or treating cytopenia and for treating myelodysplastic syndrome. To improve an antigen-specific immunological response, particularly to enhance a tumor antigen response for anti-tumor therapy, a replication-defective recombinant virus encoding GM-CSF, alone or encoding an antigen. And optionally a combination comprising a recombinant virus encoding an immunostimulatory molecule. Disclosed are methods for enriching APCs at the immunization site and for improving an immunological response to an antigen or immunological epitope using a replication-defective recombinant poxvirus encoding GM-CSF. . Describes the superiority of using a replication-defective recombinant avian poxvirus encoding GM-CSF over using recombinant GM-CSF.

Description

【００４０】
標的抗原は、ＨＩＶ（Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ １９７７）、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウィルス（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７１９，０５４）、Ｂ型肝炎（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７８０，０３６）、Ｃ型肝炎（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７０９，９９５）、ＥＢＶ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）などを含むウィルスなどの、病原性微生物に関連するもの、病原性微生物に由来するもの、または病原性微生物から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４１】
標的抗原は、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，８６９，６０８）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メニンゴコッカス（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、グループＡストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９５５，５９６）などの、病原性細菌に関連するもの、病原性細菌に由来するもの、または病原性細菌から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４２】
標的抗原は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、侵入性カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，６４５，９９２）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ヒストプラズモーシス（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、クリプトスポリジア（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）などを含む、病原性酵母に関連するもの、病原性酵母に由来するもの、または病原性酵母から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４３】
標的抗原は、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ， ５，９６５，２４２）、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，５８９，３４３）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉを含むが、これらのものには限定されない、病原性原虫および病原性寄生虫に関連するもの、病原性原虫および病原性寄生虫に由来するもの、または病原性原虫および病原性寄生虫から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４４】
本明細書中で使用する場合の免疫促進性分子には、共刺激分子：Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌなど、並びにＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、Ｆ１ｔ−３Ｌ（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，５５４，５１２；５，８４３，４２３）などを含むがこれらには限定されないサイトカインおよびケモカインが含まれるが、これらには限定されない。
【００４５】
マウスＢ７．１の遺伝子配列は、Ｆｒｅｅｍａｎら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２７１４−２７２２，１９８９）に開示され、そしてＧＥＮＢＡＮＫにアクセッションＮｏ． Ｘ６０９５８として開示されている。マウスＢ７．２の遺伝子配列は、Ａｚｕｍａら（Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７６−７９， １９９３）に開示され、そしてＧＥＮＢＡＮＫにアクセッションＮｏ． Ｌ２５６０６およびＭＵＳＢ７２Ｘとして開示されている。
【００４６】
マウスＢ７共刺激分子のヒトホモログには、ＣＤ８０、マウスＢ７．１のホモログ、およびＣＤ８６、Ｂ７．２のホモログが含まれる。ヒトＢ７．１（ＣＤ８０）の遺伝子配列は、ＧＥＮＢＡＮＫにアクセッションＮｏ． Ｍ．２７５３３として開示され、ヒトＢ７．２（ＣＤ８６）の遺伝子配列は、アクセッションＮｏ． Ｕ０４３４３およびＡＦ０９９１０５として開示されている。
【００４７】
マウスＩＣＡＭ−１についての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｘ５２２６４として開示され、そしてヒトＩＣＡＭ−１ホモログ（ＣＤ５４）についての遺伝子はアクセッションＮｏ． Ｊ０３１３２として開示される。
【００４８】
マウスＬＦＡ−３についての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｘ５３５２６として開示され、そしてヒトホモログについての遺伝子はアクセッションＮｏ． Ｙ００６３６として開示される。
【００４９】
マウス４−１ＢＢＬについての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｕ０２５６７として開示される。ヒトホモログ、ｈｕ４−１ＢＢＬ についての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｕ０３３９７として開示される。
【００５０】
免疫促進性分子は、免疫促進性分子をコードする組換えベクター単独により、または標的抗原をコードする核酸配列との組み合わせにより、提供することができる。別の態様において、組成物は、標的抗原をコードしそして複数の共刺激分子、Ｂ７／ＩＣＡＭ−Ｉ／ＬＦＡ−３（ＴＲＩＣＯＭ）をコードする組換えベクターを、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて提供する。
【００５１】
本明細書中で使用する場合の従来からのアジュバントには、ミョウバン、Ｒｉｂｉ ＤＥＴＯＸ^ＴＭ、フロイントのアジュバント、フロイントの完全アジュバント、ＱＳ２１などが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００５２】
疾患は、本発明を使用することにより治療または予防することができ、そして疾患にはウィルス、細菌、酵母、寄生虫、原虫、ガン細胞などにより引き起こされる疾患が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、汎発性免疫エンハンサーとして使用することができ、そしてそれ自体、未知の病因の疾患を治療する際に有用性を有する。
【００５３】
本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して治療しまたは予防することができる前新生物状態または過形成状態には、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳腺病巣などの前新生物状態または過形成状態が含まれるが、これらのものに限定されない。
【００５４】
本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して治療することができる癌には、原発性または転移性メラノーマ、アデノカルシノーマ、扁平細胞癌腫、腺扁平細胞癌腫、胸腺腫、リンパ腫、サルコーマ、肺癌、肝臓癌、非−ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ＮＰＣ、膀胱癌、子宮頚癌などが含まれるが、これらのものに限定されない。
【００５５】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスのいくつかの用途が、表２に概説される。
【００５６】
【表２】

【００５７】
本発明は、注入部位中に抗原提示細胞を補充するための、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して免疫応答を向上させる方法を提供する。さらに、本方法は、抗原提示細胞による局所リンパ節の強化を提供する。
【００５８】
本発明の方法は、標的抗原またはそのエピトープに対する免疫応答の向上を提供する。
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独でまたは抗原源とともに使用して、病原性微生物または癌により引き起こされる疾患を治療または予防する方法もまた包含する。
【００５９】
治療方法において、本発明の組換えベクターの投与は、“予防”または“治療”目的のいずれかの目的でありうる。予防的に提供された場合、本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、いずれかの症候に先だって、単独で提供されるか、または同時的なまたは先立つ抗原源の投与の前に、提供される。組換えベクターの予防的投与は、いずれかの引き続く感染または疾患を予防しまたは改善するために機能する。治療的に提供される場合、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、感染または疾患の症候の開始と同時にまたはその後に提供される。このように、本発明は、疾患−誘引物質または疾患状態への予測される曝露の前に、または感染または疾患の開始の後に、提供することができる。
【００６０】
接種材料に関連する場合の用語“単位用量”は、哺乳動物に対してユニタリーの用量として適切な物理的に別個の単位のことをいい、それぞれの単位は、所望のアジュバントまたは免疫原性効果を産生するように計算されたあらかじめ決められた量の組換えベクターを、必要とされる希釈剤とともに含有する。本発明の接種材料の新規な単位用量に関する詳細は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスおよび具体的なアジュバントの独特な特性および達成すべき免疫原性効果により指示され、そしてそれに依存する。
【００６１】
接種材料は、塩類溶液、リン酸−緩衝塩類溶液またはその他の生理学的に許容できる希釈剤などの許容できる（許容可能な）希釈剤中の溶液として典型的には調製され、水性医薬組成物を形成する。
【００６２】
接種の経路は、乱刺法（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、腫瘍内、局所、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）、鼻腔内、動脈内、膀胱内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）などであってもよく、それにより注入部位および局所リンパ節内部へのＡＰＣの遊走および疾患誘引物質に対する免疫応答を向上させるためのＡＰＣ機能の亢進を引き起こす。用量は、少なくとも一度投与される。引き続く用量を、示したように投与することができる。
【００６３】
一例において、宿主をＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを用いて少なくとも一度免疫化し、最適濃度のＡＰＣを標的部位で発生させる。引き続く免疫化は、１またはそれより多い抗原またはエピトープ源により提供される。別の例において、宿主は、タンパク質、ペプチド、多糖類、脂質、リポタンパク質、リポ多糖類、抗体、抗−イディオタイプ抗体、細胞、細胞フラグメント、細胞抽出物、アポトーシス小体、減弱ウィルスまたは不活化ウィルスなどの抗原源により初めに免疫化され、続いてＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを投与される。本発明の別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを抗原源またはエピトープ源と同時に投与する。従来からのアジュバントを場合により提供することができる。
【００６４】
別の態様において、宿主を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスにより初回用量として少なくとも１回免疫化する。ブースト用量は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするいずれかの組換えベクター、好ましくはＧＭ−ＣＳＦをコードする組換えウィルスを含むことができる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする第二の組換えベクターは、複製能を有するかまたは複製−欠損のいずれかであってもよい。一例において、初回抗原用量を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損組換えアビポックスウィルスにより提供し、その後ブースト用量のＧＭ−ＣＳＦをコードする複製能を有する組換えワクシニアウィルスを提供する。このような異種初回−ブースト計画により、組換えワクシニアベクターの複数回に分けた注入により当該技術分野において知られているような宿主抗−ベクター免疫応答を最小化しまたは減少させる。初回−ブースト方法におけるバリエーションは、本発明の範囲内に包含される。たとえば、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製能を有するベクターを初回用量として提供し、その後ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスの１またはそれより多い注入を行うことができる。ベクターは、１またはそれより多い免疫促進性分子をコードする遺伝子とともにまたは伴わずに、１またはそれより多い抗原をコードする遺伝子を提供することもできる。
【００６５】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、ジフテリア−破傷風−百日咳（ＤＰＴ）破傷風−百日咳（Ｔｄ）、ＤｔａＰ、ｂ型インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（Ｈｉｂ）ワクチン、ＤＴａＰ−Ｈｉｂワクチン、ＤＴａＰ−ＩＰＶ−Ｈｉｂワクチン、おたふく風邪−はしか−風疹（ＭＭＲ）ワクチンおよびＡ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ライム病ワクチン、インフルエンザワクチン、髄膜炎菌多糖（四価Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ）、肺炎球菌多糖ワクチン（２３価）、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ペストワクチン、黄熱ワクチン、カルメット−ゲラン杆菌ワクチンなどのワクチンなどの標準的な小児用ワクチンを含む（これらには限定されない）ワクチンと組み合わせて提供することができる。
【００６６】
哺乳動物に、好ましくはヒトに、本発明の組換えベクターを提供する際に、投与された組換えベクターの剤形は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、以前の医学的履歴、疾患の進行、腫瘍負担などの因子に依存して変化するであろう。一般的には、より低い容量またはより高い容量で投与することができるものの、哺乳動物、好ましくはヒト当たり、約１０^５〜約１０^１０のプラーク形成単位の範囲で、レシピエントにＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスの剤形を与えることが好ましい。
【００６７】
腫瘍−関連抗原および腫瘍−特異的抗原の遺伝的定義により、癌治療についての標的化抗原−特異的ワクチンの開発を可能にする。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原をコードする組換えベクターを組み合わせると、癌の発生のリスクが増加した個体における予防における予防に関して特異的な免疫応答を引き起し（予防的免疫化）、外科的処置の前に腫瘍を縮小させ、初回外科的処置の後の疾患再発を予防し（抗−転移ワクチン接種）、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の数を増大させ、それにより拡散する腫瘍の根治におけるそれらの有効性を向上させる（定着した疾患の治療）、強力なシステムである。 自己由来リンパ球（ＣＤ８^＋）、細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞またはＮＫ細胞のいずれかを、特定の腫瘍抗原に対してｅｘ ｖｉｖｏで作製して、そして腫瘍抗原源とともにＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて腫瘍を保持する患者に対して移植しなおす（養子免疫療法）ことができる。
【００６８】
癌治療において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、癌のいずれかの証拠の前に哺乳動物中に導入するか、または癌に悩まされている哺乳動物における疾患の軽減を提供するために導入することができる。
【００６９】
治療すべき疾患または症状および治療方法に依存して、標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする核酸配列を含む組換えベクターなどの抗原源は、１または複数の共刺激分子、好ましくはＢ７またはＢ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３をコードする遺伝子をさらに含むことができる。標的抗原またはその免疫学的なエピトープを、組換えベクターにより感染させた宿主細胞によりまたは腫瘍関連抗原またはそのエピトープを内在的に発現する腫瘍細胞により提供することができる。腫瘍関連抗原が宿主細胞中に存在しないか、発現されていないか、または低レベルで発現されている場合、外来性腫瘍関連抗原をコードする外来性遺伝子を提供することができる。さらに、いくつかの異なる腫瘍関連抗原をコードする遺伝子を提供することができる。
【００７０】
投与すべきＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせた、１またはそれより多い腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードし、場合により複数の共刺激分子をコードする組換えベクターの量は、ウィルス粒子の力価に基づく。投与すべき免疫源の好ましい範囲は、哺乳動物、好ましくはヒト当たり、１０^５〜１０^１０ウィルス粒子である。もし免疫化すべき哺乳動物が癌または転移性癌にすでに悩まされているならば、ワクチンをその他の治療的処置と組み合わせて投与することができる。さらに組換え複製−欠損ウィルスそれ自体は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするとともに１またはそれより多いＴＡＡをコードすることができる。
【００７１】
治療の一方法において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、癌を有する患者に対してｉｎ ｖｉｖｏで投与し、そして自己由来細胞傷害性リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球を、血液、リンパ節、腫瘍などから得ることができる。リンパ球は培養中で増殖され、標的抗原−特異的リンパ球は、特異的標的抗原および抗原提示細胞または標的抗原のいずれかでパルスしたＡＰＣの存在下、培養することにより増殖させる。標的抗原−特異的リンパ球をその後、患者体内に再び注入し戻す。
【００７２】
免疫化の後、ワクチンの有効性を、特異的溶解活性または特異的サイトカイン産生により、または腫瘍退行により評価されるように、抗原を認識する抗体または免疫細胞の産生により評価することができる。当業者は、上述したパラメータを評価するための従来法を知ることができる。
【００７３】
抗原−特異的Ｔ−細胞応答を向上させる本方法の一態様において、哺乳動物、好ましくはヒトをｒＦ−またはｒＶ−ＨＩＶ−１エピトープ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３構築物と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスにより免疫化する。処置の有効性を、標的抗原−特異的リンパ球増殖、標的抗原−特異的細胞溶解反応、サイトカイン産生、臨床的反応などを測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでモニターすることができる。
【００７４】
抗原−特異的Ｔ細胞応答を向上させる方法を、いずれかの標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対して使用することができる。特に興味深いのは、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原および感染性物質の抗原である。
【００７５】
患者に対してＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを投与することに加えて、その他の外来性免疫モジュレーターまたは免疫促進性分子、化学療法薬、抗生物質、抗真菌薬、抗ウィルス薬などを、単独でまたはそれらを組み合わせて、治療すべき症状に依存して投与することができる。その他の外来性に添加される物質の例には、外来性ＩＬ−２、ＩＬ−６、α−、β−またはγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、Ｆｌｔ−３Ｌ、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビル、アンホテリシンＢ、５フルオロウラシル、ロイコボリン、ＣＰＴ−１１など、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えトリポックスウィルス（アビポックス）を、生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦをｉｎ ｖｉｖｏで産生するその能力について調べた。ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え鶏痘ウィルス（Ｆ）およびカナリアポックスウィルス（ＡＬＶＡＣ）を、単回皮下（ｓ．ｃ）注射として投与し、そして局所リンパ節排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）注入部位を異なる時間点での細胞変化、表現形変化および機能的変化について調べた。局所リンパ節における変化を、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの４種の日用量の投与と比較した。結果から、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかの単回注入により、排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節内部で、（ｉ）リンパ節症（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）および（ｉｉ）クラスＩＩ−発現およびプロフェッショナルＡＰＣの全数の増加（ＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋が引き起こされたことが示された。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを注入したマウス由来のリンパ節をｉｎ ｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養中で使用した場合、より高いレベルのＴ−細胞初回抗原刺激およびより強力なアロ特異的溶解が結果として生じ、そのことはそれらの節内のより多い数の機能的ＡＰＣの存在を示している。時間−経過研究により、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを注入したマウスの局所節内で生じている細胞性変化／表現形変化および機能的変化が２１〜２８日間持続したことが示された。さらに、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ組換えウィルスの繰り返し注入（３×）に際して、クラスＩＩ−発現リンパ節細胞の全数は、マウス血清中の抗−アビポックス抗体力価の存在に関わらず、それぞれの注入後に増加した。
【００７７】
本発明はまた、組換えアビポックスウィルス中でまたは組換えタンパク質として投与したＧＭ−ＣＳＦが、自己の腫瘍抗原に対する宿主免疫を生成するように設計したワクチンプロトコルにおいて生物学的なアジュバントとして機能しうるかどうかについて調べた。自己の腫瘍抗原は、ＣＥＡ、Ｍ_ｒ １８０，０００〜２００，０００の糖タンパク質、であり、大きなパーセントのヒト腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）（結腸、膵臓、乳房、肺）上でのそれらの過剰発現により、免疫療法のための魅力的な標的となってきた（２６、２７）。ゲッ歯動物においては、ＣＥＡホモログが同定されていないため、ヒトＣＥＡをトランスジーンとして発現するマウス（２８〜３０）は、異なるワクチン戦略を研究するために使用されている（３１）。本発明において、アビポックス−ＣＥＡ免疫化ＣＥＡ．Ｔｇマウスは、組換えアビポックスウィルスまたは組換えタンパク質のいずれかとしてＧＭ−ＣＳＦを添加することにより向上することができるＣＥＡ−特異的細胞性免疫を発生した。ＣＥＡ．ＴｇにおけるＣＥＡ−特異的細胞性応答の相対強度に基づいて、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスの単回注入は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの複数回の毎日の注入よりも強力な生物学的アジュバントであった。免疫療法プロトコルにおいて、アビポックス−ＣＥＡをアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせて免疫化した後に、ＣＥＡ−陽性腫瘍の完全な退行が、ＣＥＡ．Ｔｇマウスの３０〜４０％において観察された。さらに、それらの腫瘍を持たないマウスは、それに引き続く腫瘍チャレンジから保護された。この知見は、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスにより、免疫部位に対して持続レベルのＧＭ−ＣＳＦを送達することができ、そしてそれを相対的に弱い自己抗原を発現する組換えアビポックスウィルスと組み合わせて使用して、宿主免疫を増強しそして抗腫瘍免疫の向上を生成することができることをはじめて示している。
【００７８】
本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、体液性応答の向上を刺激する方法において有用である。このような体液性応答の向上は、その本質においてモノクローナルであってもまたはポリクローナルであってもよい。体液性応答の向上は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞による活性の増大、増殖の増加および／またはサイトカイン分泌の増加、Ｂ細胞による増殖の増加または抗体産生の増加、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、補体−媒介性溶解の増加などにより、調べることができる。本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して引き起こされた抗体は、標準的方法により引き起こされる抗体よりも、より高い親和性および／または結合活性およびより高い力価を有することが期待される。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用する方法により引き起こされた抗体は、免疫ドミナント（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）標的エピトープまたは非ドミナント標的エピトープを認識することができる。
【００７９】
本発明はさらに、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを本発明の抗原源と組み合わせて免疫化することにより引き起こされた１または複数の抗体を含む。抗体は、目的とした標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対して特異的を有し、そしてそれと反応しまたは結合する。本発明のこの態様において、抗体はもともと、モノクローナルであるかまたはポリクローナルである。
【００８０】
例示的な抗体分子は、無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、または当該技術分野においてＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ｖ）として知られる免疫グロブリン分子の部分を含む抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の部分である。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の方法により作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ” ｉｎ Ｂｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９８５） ”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｖｏｌｕｍｅ １３， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。抗体または抗原結合性フラグメントもまた、遺伝子工学により産生することができる。重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をＥ． ｃｏｌｉ中で発現させるための技術は、ＰＣＴ特許出願：公開番号ＷＯ ９０１４４３、ＷＯ ９０１４４３およびＷＯ ９０１４４２４、およびＨｕｓｅら（（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１）の主題である。
【００８１】
一態様において、本発明の抗体を免疫アッセイにおいて使用して、生物学的サンプル中の目的とする新規抗原を検出する。
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、ＴＡＡを発現し、そしてＢ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現する組換えウィルスと組み合わせて免疫化することにより産生させた本発明の抗体を使用して、ＴＡＡを発現する癌に悩まされる哺乳動物の組織バイオプシー由来のＴＡＡの存在を、免疫細胞化学を使用して評価する。疾患組織におけるＴＡＡ抗原の描写のそのような評価を使用して、疾患に悩まされる哺乳動物における疾患の進行または免疫療法の有効性を予測することができる。この態様において、ＴＡＡの例には、ＣＥＡ、ＰＳＡ、およびＭＵＣ−１が含まれるが、これらには限定されない。免疫組織化学についての従来法は、以下の刊行物に記載される（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ） （１９８８） Ｉｎ ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） （１９８７）． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））。
【００８２】
別の態様において、本発明の抗体を、免疫療法のために使用する。本発明の抗体を、受動免疫療法において使用することができる。
患者にレシピエント哺乳動物、好ましくはヒトに対する抗体または抗原結合性フラグメントを提供する際に、投与された抗体または抗原結合性フラグメントの剤形は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、過去の医学的状態などの因子に依存して変化しうる。
【００８３】
本発明の抗体または抗原−結合性フラグメントは、疾患または感染の重症度、程度または持続期間を、妨げ、減少させ、または減弱させるために十分な量で、レシピエント被検体に対して投与することを企図される。
【００８４】
抗−イディオタイプ抗体は、通常は免疫応答の経過の間に生じ、抗−イディオタイプ抗体の部分は、最初の免疫応答を誘導したエピトープに似ている。本発明において、結合部位が疾患状態の標的抗原を反映する抗体の免疫グロブリン遺伝子またはその部分は、ウィルスゲノムのゲノムまたはその部分中に、単独でまたは複数の免疫促進性分子の遺伝子またはその部分と組み合わせて組み込まれる。得られた組換えウィルスは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて使用した抗原に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答の向上を引き起こすことができる。
【００８５】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦをコードし、周囲の環境（ｍｉｌｅａｕ）中でＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え複製−欠損ウィルスで感染させた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、１またはそれより多い内在性標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現することもでき、または第二の組換えベクターにより提供することができる１またはそれより多い外来性の外来標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現するように操作することもできる。１またはそれより多い標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えベクターは、１またはそれより多い共刺激分子 および／またはサイトカインをコードする外来性核酸配列を有していてもよい。
【００８６】
本発明の宿主細胞には、腫瘍細胞、ＰＢＭＣ、樹状細胞などの抗原提示細胞、皮膚または筋肉の細胞などが含まれるが、これらのものには限定されない。抗原提示細胞には、単球、マクロファージ、樹状細胞、前駆樹状細胞、ランゲルハンス細胞、脾細胞、Ｂ−細胞、腫瘍細胞、筋肉細胞、上皮細胞などが含まれるが、これらのものに限定されない。
【００８７】
一態様において、宿主細胞は腫瘍細胞であり、ここで腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスにｉｎ ｓｉｔｕでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露され、腫瘍細胞によるＧＭ−ＣＳＦの発現および分泌が引き起こされる。腫瘍細胞は、内在性標的抗原を発現することができるか、または腫瘍細胞は、組換えベクターを使用してさらに遺伝子的に操作して、ＴＡＡまたはその免疫学的なエピトープなどの標的抗原を発現し、そして場合により１またはそれより多い免疫促進性分子を発現することができる。組換え複製−欠損ウィルスにより提供されるＧＭ−ＣＳＦを内在性または外来性に提供されるＴＡＡとともに発現し、そして場合により複数の免疫促進性分子のうちの一つを発現する、腫瘍細胞を、癌に悩まされる哺乳動物において腫瘍減少または排除を引き起こすために有効な量で、哺乳動物に対して投与する。
【００８８】
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、腫瘍内部にｉｎ ｓｉｔｕで、例えばメラノーマ中または転移性乳癌皮膚病変中に、直接注入する。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスはまた、結腸直腸癌および膵臓癌などの癌のための外科処置の間にｉｎ ｓｉｔｕで投与することもできる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを提供することに加えて、１またはそれより多い免疫促進性分子をコードするベクターを、抗−腫瘍応答を向上させるために提供することができる。一態様において、ベクターは、Ｂ７．１をコードする組換えアビポックスまたはＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えアビポックスである。別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、ＩＬ−１２などのサイトカインまたはＩＬ−１２をコードするベクターと組み合わせて投与する。
【００８９】
別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、リンパ節−内注入により提供される。リンパ節部位は、腫瘍部位から離れていてもまたは腫瘍部位に排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）していてもよい。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独でまたは標的抗原またはその免疫学的なエピトープまたは標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えベクターと組み合わせて提供することができる。標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えベクターは、１またはそれより多い免疫促進性分子をさらにコードすることができる。一態様において、組み合わせ療法には、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスおよび標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードし、そして共刺激分子Ｂ７．１をさらにコードする組換えベクターが含まれる。別の態様において、標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードし、そしてＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をさらにコードする組換えベクターを、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）で提供する。
【００９０】
腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独で、またはワクチンとして使用するための少なくとも１またはそれより多い免疫促進性分子をコードする組換えベクターと組み合わせて使用して、ｅｘ ｖｉｖｏで感染させることもできる。一例において、組換えベクターはＢ７．１をコードする組換えアビポックスである。別の態様において、組換えベクターは、Ｂ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする。別の例において、組換えベクターはγまたはαインターフェロンなどのサイトカインをコードする。腫瘍細胞は、同一の患者由来のものであっても（自己由来）または異なる患者由来の（１または複数の）細胞株由来であっても（同種異系）よい。本発明の腫瘍細胞の投与により、個体に対して抗−腫瘍免疫応答を提供する。腫瘍細胞を、皮下的に、皮内的に、静脈内などに与えることができる。
【００９１】
本発明はまた、前駆樹状細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ＤＣ部分母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、およびＧＭ−ＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列を有する組換え複製−欠損ウィルスにより外来的に提供されるＧＭ−ＣＳＦを発現するこれらの誘導体を提供する。前駆樹状細胞および樹状細胞などのＡＰＣはまた、１またはそれより多い内在性標的抗原またはそれらの免疫学的なエピトープを発現することができ、または外来性標的抗原は、組換えベクターにより提供することができる。組換えベクターはさらに、１またはそれより多い共刺激分子をコードしてもよい。一態様において、樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスおよび少なくとも１つの標的抗原をコードする組換えベクターにより感染させる。別の態様において、樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスによりそして少なくとも１つの標的抗原をコードしそしてＢ７．１をコードする組換えアビポックスにより感染させる。さらに別の態様において、樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスおよび標的抗原をコードしそしてＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えアビポックスにより感染させる。本発明はさらに、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化する際に、１またはそれより多い標的細胞、標的抗原およびそれらの免疫学的なエピトープに対するワクチン接種および免疫療法的応答のためにＡＰＣを使用する方法を提供する。
【００９２】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを単独でまたはＢ７またはＢ７／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えベクターと組み合わせて感染させた源から単離した、前駆樹状細胞、樹状細胞、ＤＣ部分母集団、およびそれらの誘導体などのＡＰＣを、少なくとも１つのペプチド、タンパク質、抗体、標的細胞、標的細胞溶解物、細胞抽出物、標的細胞膜、アポトーシス小体、標的抗原、またはその免疫学的なエピトープにより、または少なくとも１つの標的細胞のＲＮＡまたはＤＮＡにより、パルス化しまたはインキュベートし、そして関連したＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで活性化させるために十分な量で、種に対して、投与することができる。 別の態様において、抗原提示前駆樹状細胞および樹状細胞はさらに、少なくとも１つの外来性標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現する。
【００９３】
宿主細胞は、１０^３〜１０^９細胞の範囲で提供することができる。使用することができる投与経路には、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、経口、経膀胱点滴注入、経乱刺（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが含まれる。
【００９４】
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦ発現抗原提示前駆樹状細胞または樹状細胞を、標的細胞、標的細胞溶解物、標的細胞膜、標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対して曝露するか、または少なくとも１つの標的細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡによりｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露し、そして初回免疫したＴ細胞または初回免疫していないＴ細胞とともにインキュベートして、対応するＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化する。ついで、活性化Ｔ細胞単独、またはこれと前駆ＤＣまたはＤＣとの組み合わせを、標的細胞、標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対するワクチン接種または免疫療法のために、ヒトなどの種に対して投与する。一使用方法において、前駆樹状細胞または樹状細胞を好都合にも使用して、癌細胞に対する免疫療法的成長阻害応答を引き起こす。
【００９５】
別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦ発現抗原−提示細胞、好ましくは前駆ＤＣまたはＤＣを、対応標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現する標的細胞と融合させ、既知の方法により、ＡＰＣと標的細胞との異核接合体（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ）を形成する（Ｇｏｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６２７９−６２８３， １９９８）。このような融合細胞またはキメラＡＰＣ／標的抗原細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよび標的抗原またはそれらの免疫学的なエピトープの両方ともを発現する。ＡＰＣはまた、少なくとも１つの共刺激分子をコードする、好ましくはＢ７．１またはＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えベクターで感染することができる。好ましい態様において、標的細胞は、過形成性細胞、前悪性細胞または悪性細胞である。キメラＡＰＣ／標的抗原細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で使用して、ＴおよびＢリンパ球の免疫応答を向上させることができる。
【００９６】
前駆樹状細胞は、患者由来の骨髄、末梢血、リンパ節から入手される。患者は、以前にワクチン接種されていても、あるいはＦｌｔ−３Ｌなどの化合物を用いて治療して抗原−提示細胞の数を向上させていてもよい。樹状細胞は、皮膚の表皮（ランゲルハンス細胞）などのいずれかの組織および脾臓、骨髄、リンパ節、および胸腺中、並びに血液およびリンパを含む循環システムに見いだされるものなどのリンパ様組織（ベールをかけた（ｖｅｉｌｅｄ）細胞）から入手される。臍帯血は、樹状細胞の別の供給源である。
【００９７】
樹状細胞は、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７８８，９６３に記載される方法などの当該技術分野において既知の方法を使用して、本発明中で使用するために増強させるかまたは単離することができる。いったん前駆樹状細胞、樹状細胞およびそれらの誘導体が得られれば、それらを適切な培養条件下で培養して、細胞集団を増殖させ、および／または組換えベクターによる最適な感染、トランスフェクション、または形質導入のための状態、そして最適な標的抗原取込み、処理、提示のための状態に、細胞を維持する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中での樹状細胞の成熟の適切な状態の維持に特に有利なことは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ−４）の両方が存在することである。樹状細胞の部分母集団を、接着および／または細胞表面マーカーに基づく成熟度に基づいて、単離することができる。前駆ＤＣ、ＤＣおよびそれらの部分母集団の表現型は、ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ（Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２， １９９８）中に開示される。
【００９８】
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、約６日間の期間、約５００単位／ｍｌの濃度でそれぞれ提供される。別の態様において、ＴＮＦαおよび／またはＣＤ４０を使用して、前駆ＤＣまたはＤＣを成熟させる。
【００９９】
前駆樹状細胞または樹状細胞は、処置すべき個体から入手することができ、そしてそれ自体、対応するＨＬＡ抗原に関しては自己由来であり、または細胞は、対応するＨＬＡ抗原（クラスＩおよびＩＩの両方、例えばＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤＲ）が処置すべき個体に適合する様な個体から入手することができる。あるいは、前駆樹状細胞を操作して、処置を受ける個体の適切で関連したＨＬＡ抗原を発現する。
【０１００】
前駆樹状細胞および樹状細胞を、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７８８，９６３に開示されたようなＥＢＶ−形質転換などの方法により、さらに遺伝子的に修飾して、それらの寿命を延長することができる。
【０１０１】
樹状細胞およびそれらの前駆細胞を、生理学的に許容可能な媒体中で医薬組成物の形状で提供することができる。組成物にはさらに、標的細胞、標的細胞溶解物、標的細胞膜、標的抗原またはその免疫学的なエピトープをさらに含むことができる。組成物は、免疫応答をさらに相乗的に向上させるために、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインおよび／またはケモカインを、さらに含むことができる。
【０１０２】
本発明の別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、好中球減少症の予防または治療のために使用することである。好中球減少症は、循環血液中において好中球が異常に少数である場合についての医学的用語である。好中球減少症には多くの潜在的な原因があり、それらには：あるタイプの白血病、リンパ腫または転移性癌由来の骨髄損傷；利尿剤または抗−うつ薬などの薬剤療法に対する有害反応；放射線治療または化学療法に対する反応；留置静脈内（Ｉ．Ｖ．）カテーテルの存在；感染性単核細胞症またはＨＩＶ感染などのウィルス感染；結核などの細菌感染、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫疾患、先天性異常；好中球、単球およびマクロファージの食作用、抗微生物作用、および殺腫瘍性作用の低下；栄養障害；二次感染により併発した、呼吸器管、消化管、または尿路の新生物性閉塞；が含まれる。好中球減少症を有する個体は、容易にそしてしばしば感染を受ける。感染のほとんどは、肺、口、および咽頭（粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｏｓｉｓ））、洞および皮膚において生じる。痛みを伴う口腔潰瘍、歯肉（ｇｕｍ）感染、耳感染、そして歯小嚢周囲（ｐｅｒｉｄｏｎｔａｌ）疾患が一般的である。重度の生命を脅かす感染は、病因収容および静脈内抗生物質の必要性を生じる可能性がある。
【０１０３】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、好中球減少症を予防しまたは治療する方法において有用である。ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスは、迅速で持続的な濃度のＧＭ−ＣＳＦを提供し、天然に由来するかまたは組換え的に産生されたＧＭ−ＣＳＦの投与よりも優れている（Ｍａｎｇｉ， Ｍ．Ｈ． ａｎｄ Ｎｅｗｌａｎｄ， Ａ．Ｃ． １９９９， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖｏｌ． ３５； Ｓｕｐｐｌ． ３， ｐｐ． Ｓ４−Ｓ７）。
【０１０４】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、好中球減少症の発生の前に（予防的に）または後に提供することができる。用量を好中球の数を増加させるために有効な量で、好ましくは正常範囲内にまで好中球数を増加させるために有効な量で、投与する。用量は、１回またはそれより多い回数で提供することができる。
【０１０５】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、単独でまたは抗生物質、抗真菌薬、抗ウィルス薬などの感染の治療のための別の療法と組み合わせて提供することができる。組成物中にＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスとともに包含されうる１またはそれより多い抗生物質には、セフタジジム、セフェピム（ｃｅｆｅｐｉｍｅ）、イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）、アミノグリコシド、バンコマイシン、抗シュードモナスβ−ラクタムなどが含まれるが、これらには限定されない。組成物中にＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスとともに包含されうる１またはそれより多い抗真菌薬には、アンホテリシンＢ、ダプソン、フルコナゾール（ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、フルシトシン、グリセオフルビン、イントラコナゾール（ｉｎｔｒａｃｏｎａｚｏｌｅ）、ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、ミコナゾール、クロトリマゾール、ナイスタチン、それらの組み合わせなどが含まれるが、それらには限定されない。組成物中にＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスとともに１またはそれより多い抗ウィルス剤が含まれていてもよく、そして抗ウィルス剤としては、２’−β−フルオロ−２’，３’−ジデオキシアデノシン、インディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、それらの組み合わせなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１０６】
好中球減少症を引き起こす場合がある放射線治療、化学療法またはコルチコステロイド療法の場合において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、放射線照射、化学療法またはコルチコステロイド療法の開始の前に、療法と同時に提供することができ、または、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを放射線照射処置、化学療法的処置、またはコルチコステロイド処置の後に提供することができる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスの用量は、血中の好中球の正常な数を維持するための量で、または好中球の数を増大させて好中球減少症およびその続発症を予防しまたは阻害するための量で、提供される。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え−複製欠損ウィルスを含む組成物もまた、化学療法剤、コルチコステロイド、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０１０７】
本発明の別の観点は、骨髄形成異常症候群および骨髄形成異常症候群に関連する血球減少症を治療するために、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、エリスロポエチン（ＥＰＯ）または好ましくは組換えエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）と組み合わせて使用することである。脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）は、末梢血中の１またはそれより多い造血性細胞系列内部での量的異常並びに質的異常を有する、異常骨髄分化および成熟により特徴づけられるクローン性幹細胞障害の一群である。これらの個体の標準的な治療は、血液産生物、抗生物質、および選択されたより若年の個体における同種異系骨髄移植を伴う、支持的患者管理である。Ｓｔａｓｉ， Ｒらは、ＭＤＳを有する患者において血球減少症を治療するために、組換えＧＭ−ＣＳＦ（ｒｅｃ ＧＭ−ＣＳＦ）をエリスロポエチンと組み合わせて使用することを報告した（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， １９９９， １０５， １４１−１４８）。しかしながら、ｒｈＧＭ−ＣＳＦは、顕著な副作用を伴う。本発明において、ＭＤＳに関連する血球減少症を治療するために、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、ｒｅｃ ＧＭ−ＣＳＦの代わりに、ＥＰＯと組み合わせて使用する。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、約１０^５〜約１０^１０ ｐｆｕの範囲の用量で投与し、そして１回または複数回に分けて提供する。ＥＰＯは、約１５０〜３００ ｕ／ｋｇ体重の範囲の用量で投与し、そして複数回に分けて提供する。組み合わせ用量は、好中球減少症を予防しまたは治療する際に有効であり、ヘモグロビンレベルを増加させおよび／またはＭＤＳを有する個体の輸血の必要性を減少させる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスを毎週注入するかまたは毎月注入する使用は、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を毎日投与する必要性を緩和する。
【０１０８】
ＧＭ−ＣＳＦは、癌患者において二重特異性抗体による免疫療法のためのアジュバントとして有用であることも示された（Ｅｌｓａｓｓｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌ． ３５， Ｓｕｐｐｌ． ３， ｐｐ． Ｓ２５−Ｓ２８， １９９９）。本発明において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、優れたアジュバント効果について、組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質を毎日投与する必要性を緩和する二重特異性抗体と組み合わせた場合に、ＧＭ−ＣＳＦの代わりになる。二重特異性抗体は、腫瘍細胞抗原／エピトープに対する特異性を免疫エフェクター細胞上で見いだされる細胞傷害性トリガー分子に対する反応性と組み合わせる、化学的にまたは遺伝子的に−構築された分子である。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、約１０^５〜約１０^１０ ｐｆｕの用量範囲で、複数回に分けて提供される。二重特異性抗体は、約０．２〜２００ ｍｇ／ｍ^２の用量で、複数回に分けて、例えば毎週、毎月などで提供する。免疫療法的反応の向上についての分類には、特異的溶解活性、特異的サイトカイン産生、抗体−依存性細胞性細胞傷害、腫瘍退行、腫瘍からの保護が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて使用することができる二重特異性抗体には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ−γＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦ−受容体、ＣＤ１５抗原またはＥｐＣＡＭ分子に対する腫瘍−指向的特異性を有する抗−ＣＤ３−指向性二重特異性抗体が含まれるが、これらには限定されない（ＭｃＣａｌｌ， Ａ．Ｍ．， Ａｄａｍｓ， Ｇ．Ｐ．， Ａｍｏｒｏｓｏ， Ａ．Ｒ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｕ．Ｂ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｈｏｒａｋ， Ｅ．， Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｈ．， Ｓｃｈｌｅｒ， Ｒ．， Ｍａｒｋｓ， Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｗｅｉｎｄｅｒ， Ｌ．Ｍ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ１６ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ａｎｔｉ−ＣＤ １６ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃＦｖ ｔｈａｔ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ＣＤ１６−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６：４３３−４４５， １９９９）。
【０１０９】
具体的態様の記載は、本発明の一般的性質を十分記載しているため、その他の者は、包括的な概念から離れることなく、様々な目的のためにそのような具体的な態様を容易に修飾しおよび／または適用することができるだろうし、そしてその結果そのような適用および修飾は、 開示された態様の意味およびその均等な範囲内に包含されることを意図している。
【０１１０】
参照されたすべての参考文献および特許は、参考文献として本明細書中に援用される。
【０１１１】
【実施例】
実施例１
組換えウィルスの作製
組換えポックスウィルスの作製は、ポックスウィルスゲノムＤＮＡおよび挿入すべき異種配列を保有するプラスミドベクターとの間でｉｎ ｖｉｖｏで相同組換えすることを介して達成される。ポックスウィルス中への外来性配列の挿入のためのプラスミドベクターは、組換えＤＮＡ技術の標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９）により構築される。プラスミドベクターは、１またはそれより多いキメラ遺伝子を含有し、そのそれぞれはタンパク質コード配列に連結し、ポックスウィルスゲノムの非−本質的領域由来のウィルス配列に隣接する、ポックスウィルスプロモーターを含む。プラスミドは、親ポックスウィルスで感染させた細胞中にトランスフェクトし、そしてプラスミド上のポックスウィルス配列とウィルスゲノム中の対応ＤＮＡ との間での組換えにより、結果としてウィルスゲノム中へのプラスミド上のキメラ遺伝子の挿入が引き起こされる。組換えウィルスは、様々な選択システムまたはスクリーニングシステム（Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ， １９９３；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ， １９９１；Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９４、これらのうちのいくつかを以下に記載する）のいずれかを使用して選択されそして精製される。ワクシニアゲノム中への外来性遺伝子の挿入は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析により確認する。外来性遺伝子の発現は、ウェスタン解析により示される。
【０１１２】
鶏痘親ウィルスの起源
組換え体を作製するために使用された親鶏痘ウィルスは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されＵＳＤＡからライセンスされた家禽ワクチン、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ、のバイアルからプラーク精製された。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣの産生のための開始物質は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈにより得られたＶｉｎｅｌａｎｄ研究所のニワトリ胚（ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ）起源鶏痘ワクチンのバイアルである。ウィルスをニワトリ卵の漿尿膜上で２回継代し、マスターの種子ウィルスを産生した。マスター種子ウィルスをさらに２７回、ニワトリ胚線維芽細胞中で継代し、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣマスター種子を調製した。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ産生物ロットの作製のためのウィルスストックを調製するため、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣマスター種子をニワトリ胚線維芽細胞上で２回継代した。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣの一つのバイアル、シリアル＃９６１２５、を初代ニワトリ胚皮膚細胞上で３回プラーク精製した。
【０１１３】
ワクシニア親ウィルスの起源
ウィルスは、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ系統であり、そしてＷｙｅｔｈによりＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから入手し、そして仔ウシ体内にて継代し、天然痘ワクシニア種（Ｓｍａｌｌｐｏｘ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｅｅｄ）を作製した。Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、 天然痘ワクシニア種（Ｓｍａｌｌｐｏｘ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｅｅｄ、Ｌｏｔ ３１９７、２８継代の凍結乾燥バイアルを、Ｄｒ． ＣｈａｎｏｃｋおよびＤｒ． Ｍｏｓｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から受領した。この種ウィルスをエーテル処理し、そして３回プラーク精製した。
【０１１４】
修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）親ウィルスの起源
ＭＶＡは、アンカラワクシニア株ＣＶＡに由来した（Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ， １９７５）。ウィルス減弱化を、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦｓ）における終末（ｔｅｒｍｉｎａｌ）希釈により行った。３６０回の継代後、ウィルスを３回プラーク精製し、その後ＣＥＦｓ中にさらに継代した。５１６回の継代後、減弱化ＣＶＡ ウィルスをＭＶＡと名付けなおした。５７０回の継代後、ウィルスを再びプラーク精製し、さらに継代した。種ウィルス、５７５回継代、をＤｒ． Ａｎｔｏｎ Ｍａｙｒから入手し、そして初代ニワトリ胚皮膚細胞上で２回プラーク精製した。
【０１１５】
組換えポックスウィルスの作製
ｒＦ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦの作製について、ｐＴ５０９１と名付けられたプラスミドベクター（図１）を構築し、外来性配列の鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域中への挿入を行った。マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーター（Ｇｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９０）の制御下である。さらに、鶏痘ウィルスＣ１プロモーター（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ， １９９１）の制御下にあるＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子が、組換え子孫についてのスクリーニングとして含まれる。これらの外来性配列は、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域に由来するＤＮＡ 配列により隣接される。鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ株からプラーク精製された単離物をこの組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換え鶏痘ウィルスの作製は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列とｐＴ５０９１をトランスフェクトした鶏痘ウイルス−感染初代ニワトリ胚皮膚細胞中でのｐＴ５０９１中の対応する配列のあいだでの、相同組換えを介して達成された。組換えウィルスを、以前に記載されたように（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ， １９８５）、ハロゲン化インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）の存在下でｌａｃＺ遺伝子産物の発現を検出する、ウィルスプラーク上でｉｎ ｓｉｔｕで行い、発色アッセイを用いて同定した。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明なバックグラウンドに対して青色を示す。ｖＴ２７７（図４Ａ）と名付けた陽性プラークを細胞単層から取り出し、それらの子孫を再びプレートに播いた。プラーク単離およびＢｌｕｏ−Ｇａｌ存在下での再プレート化を４ラウンド行うと、結果として所望の組換え体の精製が生じた。
【０１１６】
ｒＦ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製について、ｐＴ５０５２と名付けられた（図２）プラスミドベクターを構築し、外来性配列の鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域中への挿入を方向付けた。プラスミドベクターｐＴ５０５２ を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０）に、ブダペスト条約の条件のもと、２０００年６月１５日にアクセッションＮｏ． ＰＴＡ−２０９９として寄託した。ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの制御下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子はＣ１プロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域由来のＤＮＡ配列により隣接される。鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）株由来のプラーク精製された単離物をこの組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換えワクシニアウィルスの作製を、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列とｐＴ５０５２でトランスフェクトした鶏痘ウイルス−感染初代ニワトリ胚皮膚細胞中のｐＴ５０５２中の対応する配列とのあいだで相同組換えを介して行った。組換えウィルスを、上述したｌａｃＺ遺伝子産物について発色アッセイを使用して同定した。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明なバックグラウンドに対して青色を示す。ｖＴ２１５（図４Ｂ）と名付けた陽性プラークを細胞単層から取り出し、それらの子孫を再びプレート化した。プラーク単離およびＢｌｕｏ−Ｇａｌの存在下での再プレート化を５ラウンド繰り返すと、結果として所望の組換え体の精製を引き起こした。
【０１１７】
腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）およびＧＭ−ＣＳＦとを共発現する、ｒＦ−ＴＡＡ／ＧＭ−ＣＳＦと名付けられた組換え鶏痘ウィルスの作製のために、プラスミドベクターを構築して、鶏痘ウィルスゲノム中への外来性配列の挿入を行った。ＴＡＡ遺伝子およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、複数のプロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、外来性配列が挿入されるべき鶏痘ウィルスゲノム由来のＤＮＡ 配列により隣接される。組換え鶏痘ウィルスの作製は、鶏痘ウィルスゲノム中の鶏痘ウィルス配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトされた鶏痘ウィルス−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成される。組換えプラークを上述したように選択条件下細胞単層から取り出し、そしてそれらの子孫をさらに増殖させる。プラーク単離および再プレート化のラウンドを繰り返すと、結果として所望の組換えウィルス（図５Ａ）の精製を引き起こす。
【０１１８】
ｒＶ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦの作製のために、プラスミドベクターを構築し、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ領域中に位置するＭ２Ｌ（３０Ｋ）遺伝子中への外来性配列の挿入を方向付けた。マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの転写制御下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子はＣ１プロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ領域に由来するＤＮＡ配列により隣接される。ワクシニアのＷｙｅｔｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）株からのプラーク精製単離物を、この組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換えワクシニアウィルスの作製は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトしたワクシニア−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成された。組換えウィルスを前述したｌａｃＺ遺伝子産物についての発色アッセイを使用して同定した。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明のバックグラウンドに対して青色を示した。プラーク単離および再プレート化を数ラウンド行うことにより、結果として所望の組換えの精製を引き起こす（図４Ｃ）。
【０１１９】
ｒＶ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製のため、ｐＴ５０５１（図３）と名付けられたプラスミドベクターを構築して、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｊ領域中に位置するチミジンキナーゼ（Ｍ）遺伝子中への外来性配列の挿入を方向付けた。マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの転写制御下にあり、そしてＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は鶏痘ウィルスＣ１プロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｊ領域由来のＤＮＡ 配列により隣接される。ワクシニアのＷｙｅｔｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）株からのプラーク精製単離物を、この組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換えワクシニアウィルスの作製は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列とｐＴ５０５１によりトランスフェクトしたワクシニア−感染細胞中のｐＴ５０５１中の対応する配列とのあいだの相同組換えを介して達成される。組換えウィルスを、上述したｌａｃＺ遺伝子産物についての発色アッセイを使用して同定する。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明なバックグラウンドに対して青色を示す。組換えプラークを選択条件下、細胞単層から取り出し、そしてそれらの子孫をさらに増殖させる。プラーク単離と再プレート化のラウンドをさらに行うことにより、結果として所望の組換えウィルスの精製を引き起こす（図４Ｄ）。
【０１２０】
腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）およびＧＭ−ＣＳＦを共発現する、ｒＶ−ＴＡＡ／ＧＭ−ＣＳＦと名付けられた組換えワクシニアウィルスの作製のため、プラスミドベクターを構築して、ワクシニアゲノム中への外来性配列の挿入を行う。ＴＡＡ遺伝子およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ポックスウィルスプロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、外来性配列を挿入すべきワクシニアゲノム由来のＤＮＡ 配列により隣接される。組換えワクシニアウィルスの作製は、ワクシニアゲノム中のワクシニア配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトされたワクシニア−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成される。組換えプラークを、上述したように、選択条件下、細胞単層から取り出し、そしてそれらの子孫をさらに増殖させる。プラーク単離と再プレート化のラウンドをさらに行うことにより、結果として所望の組換えウィルスの精製を引き起こす（図５Ｂ）。
【０１２１】
ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えＭＶＡの作製のため、プラスミドベクターを構築して、ＭＶＡ ゲノム中への外来性配列の挿入を行う。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ポックスウィルスプロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、外来性配列を挿入すべきＭＶＡゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば欠失ＩＩＩ（Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９４）により隣接される。組換えＭＶＡの作製は、ＭＶＡゲノム中のＭＶＡ配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトされたＭＶＡ−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成される。組換えプラークを、選択条件下、細胞単層から取り出し、そしてその子孫をさらに増殖させる。プラーク単離と再プレート化のラウンドをさらに行うことにより、結果として所望の組換えウィルスの精製を引き起こす（図４Ｅ）。ＧＭ−ＣＳＦを腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）とともに共発現する組換えＭＶＡのゲノム構造を、図５Ｃに示す。
【０１２２】
実施例２
材料と方法
動物、細胞株、および試薬
ＣＥＡ．Ｔｇマウス（Ｈ−２^ｂ）（系統２６８２）は、Ｄｒ． Ｊｏｈｎ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から提供された（２４）。ヒトＣＥＡ遺伝子の完全コード領域を含有し、３．３ ｋｂの５’−隣接領域および５ ｋｂの３’−隣接領域が含まれるコスミドクローンを使用して、ＣＥＡ． Ｔｇマウスを作製した（３０）。ＣＥＡタンパク質発現は、胃腸管において優勢に見出され、一方でその他の部位、例えば気管、食道、小腸、および肺などにおいてもＣＥＡは発現した。マウスを、マイクロアイソレーターケージ中で、特定病原体フリー条件下にて、飼育し、維持した。系統は、創始動物から、野生型のメスＢ６マウスとの連続的な戻し交配により確立した。ＣＥＡ−陽性子孫を、固相、二重−決定因子抗−ＣＥＡ ＥＬＩＳＡキット（ＡＭＤＬ， Ｉｎｃ． Ｔｕｓｔｉｎ， ＣＡ）を使用して検出した、糞便ＣＥＡの存在により同定した。
【０１２３】
ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２（Ｈ−２^ｂ）と命名されたＣＥＡ−発現ＭＣ−３８細胞は、レトロウィルス発現ベクターｐＢＮＣを用いてヒトＣＥＡ遺伝子を形質導入することにより産生された（３２）。株をクローン化し、そしてＣＯＬ−１（３３）反応性により測定するように、安定的ＣＥＡ発現についてフローサイトメトリーにより日常的に調べた。親ＭＣ−３８およびＭＣ−３８−ＣＥＡ−２細胞株の両方を高グルコースおよび１０％加熱不活化ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。ＦＤＣＰ−１細胞は、親切にもＤｒ． Ｊｉｍ Ｉｈｌｅ（Ｓｔ． Ｊｕｄｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｍｅｍｐｈｉｓ， ＴＮ）から提供され、そして２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１０％加熱不活化ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ ＷＥＨＩ細胞培養上清を添加したＲＰＭＩ １６４０中で増殖させた。凍結乾燥組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）から入手し、そして−８０℃にて使用するまで保存した。使用する前、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを１％マウス血清を含有する塩類溶液により適切な濃度となるように再構成した。再構成したｒｅｃＧＭ−ＣＳＦはまた、−２０℃にて保存し、そしてその生物学的活性をＧＭ−ＣＳＦ−依存性ＦＤＣＰ−１指標細胞を使用して３〜６ヶ月ごとにチェックした（３４）。
【０１２４】
組換えトリポックスウィルス
本研究で使用した組換えトリポックスウィルスは、鶏痘およびカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）ウィルス−ベースのベクターであった。話の内容を簡単にするため、組換えアビポックスウィルスについて集合的に言及する。それぞれの表および図に示されるデータを生成するために使用した個々の組換えアビポックスウィルスは、鶏痘およびカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）ベクターのそれぞれについてアビポックス（Ｆ）−およびアビポックス（Ａ）として同定する。
【０１２５】
アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ
ｒＦ−ＧＭ−ＣＳＦの生成のために使用した親ウィルス（すなわち、アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ）は、鶏痘ウィルスの組織−培養適合ワクチン系統からプラーク生成された。アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦを、親鶏痘ＤＮＡとマウスＧＭ−ＣＳＦ 遺伝子を含有するプラスミドベクターとのあいだで、ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えを介して構築した。ついで、Ｔｈｅｒｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）にて作製された組換えウィルスを使用して種ストックを生成し、これはゲノム解析およびタンパク質発現解析により特性決定された。
【０１２６】
アビポックス（Ａ）−組換え体
アビポックス（Ａ）は、生産的複製のためトリの種に限定される、カナリアポックスウィルス−ベースのベクターである（３５）。カナリアポックス系統は、感染させたカナリアのポックス病変から単離し、そしてニワトリ胚線維芽細胞中で２００回、連続継代することにより減弱化し、そして４回連続のラウンドのアガロースでのプラーク精製に供した。すべての増幅およびプラーク力価測定は、初代ニワトリ胚線維芽細胞上で行った。アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（ｖＣＰ３１９）、アビポックス（Ａ）−狂犬病糖タンパク質Ｇ（アビポックス（Ａ）−ＲＧと命名、ｖＣＰ６５）およびアビポックス（Ａ）−ＣＥＡ（ｖＣＰ２４８）は、Ｖｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ（Ｔｒｏｙ， ＮＹ）から親切にも供給された。ＧＭ−ＣＳＦ発現は、バイオアッセイ（以下を参照）により確認し、そしてＣＥＡ発現は、マウスモノクローナル抗体ＣＯＬ−１を使用したウェスタンブロット解析により確認した（３２）。
【０１２７】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＧＭ−ＣＳＦ産生
ＭＣ−３８細胞をトリプシン処理し、そして血清−不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中で２回洗浄した。４×１０^６細胞を１５ ｍｌのコニカルポリプロピレンチューブ中に静置し、そして遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で再懸濁し、これに対して１０μｌのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスまたは適切な対照ウィルスのいずれかを所定のｐｆｕで添加した。感染細胞を３７℃にて１時間インキュベートし、そして１０〜１５分ごとに攪拌した。インキュベーションの後、細胞を、１０％ＦＢＳを添加した１０ ｍｌの増殖培地中で２回洗浄した。生存細胞をトリパンブルー排除法を使用してカウントし、そして６−ウェルプレートのウェルごとに３×１０^５個の細胞を添加した。上清を２４、４８および７２時間後に回収し、そして生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦレベルを上述したように測定した。
【０１２８】
局所リンパ節解析
メスＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス（Ｈ−２^ｂ）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｉｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）から入手した。６〜８−週齢のマウスを病原体−フリーの条件下で、マイクロアイソレーターケージ中に収容しそして維持した。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルス、適切な対照ウィルス（すなわち、Ｆ−ＷＴ、アビポックス−ＲＧ）および組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質を、尾根部に皮下注射により投与した。腸骨下部リンパ節、大動脈周囲リンパ節および仙骨リンパ節を外科的に単離し、細胞を機械的に分散させそして５０ ｍｌのコニカルチューブに移した。それらを１０分間氷上に立て、その後上清を回収した。細胞を遠心分離（５００×ｇ）によりペレット化し、そして氷冷Ｃａ^２＋−Ｍｇ^２＋−不含ＤＰＢＳ中で２回洗浄した。２回目の洗浄の後、細胞を、０．５〜１．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＣａ^２＋−Ｍｇ^２＋不含ＤＰＢＳ中に再懸濁した。それらを分けて、そしておよそ１０^６細胞を、１μｇのＦｉＴｃ−標識抗−Ｉ−Ａ^ｂ（ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＩｇＧ２ａ，−ｋ）または適切な対照抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）とともに、４℃にて１時間、インキュベートした。サンプルには、Ｆｃ受容体をブロックするため、１μｇの非標識２．２Ｇ２抗体（ＣＤ１６）も含有した。インキュベーションの後、細胞を２回洗浄し、そして４８８ ｎｍで１５ ｍＷの励起を有する青色レーザーを装着したＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを使用してすぐに解析した。データは、ライブゲートを使用して１０，０００細胞から集め、保存し、そして解析のために使用した。
【０１２９】
ＣＤ１１ｃ^＋細胞の単離
非処置マウス群および処置マウス群から、腸骨下部リンパ節、大動脈周囲リンパ節および仙骨リンパ節からなる局所リンパ節を外科的に採取し、プールし、そして１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）および１０％加熱不活化ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中に静置した。細胞を７０−μｍ細胞ステイナー（ｓｔａｉｎｅｒ）を通して機械的に分散させ、５０ ｍｌのコニカルチューブに移し、そして氷上に静置した。細胞懸濁液を氷冷ＤＰＢＳ中で遠心分離（５００×ｇ）により２回洗浄し、そして４℃にて１時間、１．５ ｍｌ／１０^８細胞のビオチン−抗−ＣＤ１１ｃ（クローンＢ−ｌｙ６、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含有する氷冷ＤＰＢＳ中でインキュベートした。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳ中で２回洗浄し、そして１００μｌのストレプトアビジン結合−ＭＡＣＳコロイド状超−常磁性マイクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｉｎｃ．， Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中に再懸濁し、そして４℃にて１５分間インキュベートした。細胞を氷冷ＤＰＢＳを用いて洗浄し、１０分間遠心分離（２００×ｇ）することによりペレット化し、そして５００μｌのＤＰＢＳ中で再懸濁する。ＭＡＣＳ ＬＳ^＋分離カラムをＭＩＤＩ ＭＡＣＳ磁気セパレーター中に静置し、そして製造者の指示にしたがって調製した。細胞懸濁液をカラム上にすぐにアプライし、そして非−磁性細胞を通過させた。カラムを３ ｍｌのバッファーを用いて３回すすぎ、そして磁気セパレーターから取り出し、そしてＭＡＣＳ^＋細胞画分をカラムから溶出した。ＭＡＣＳ^＋細胞画分をカラムに対する別のアプリケーションを用いて濃縮し、そしてＭＡＣＳ^＋画分中の細胞数を血球計算機を使用してそしてＦＡＣＳによりカウントした。ビオチン−ＰＥ結合体および抗−Ａ^ｂ−ＦｉＴｃ抗体（クローンＭ５／１１４．１５．２、ＩｇＧ２ｂ）からなる二重染色を使用したフローサイトメトリー解析により、ＭＡＣＳ＋細胞画分の＞８０％がＣＤ１１ ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋、ＣＤ１９⁻およびＣＤ３⁻であることが示された。
【０１３０】
混合リンパ球培養
混合−リンパ球反応のため、精製脾臓ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）Ｔ細胞を、放射線照射Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^６）リンパ節細胞の存在下（１：１比）、１０％加熱−不活化ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培養液中で増殖させた。３７℃にて５日間、Ｔ−２５フラスコ中でインキュベーションした後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上での密度遠心分離により培養物から生存Ｔ細胞を回収し、そしてＭＣ−３８（Ｈ−２^ｂ）およびＰ８１５（Ｈ−２^ｄ）を標的として機能させる一方向性ＣＴＬアッセイにおいて使用した。
【０１３１】
免疫化
ＣＥＡ．Ｔｇマウスを、尾根部近くに１００μｌのアビポックス−ＣＥＡまたはアビポックス−ＲＧを皮下注入することにより免疫化した。示した場合には、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを注入前にアビポックス−ＣＥＡと混合した。組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質をその後、３〜４日間連続して毎日、免疫化部位に投与した。
【０１３２】
血清抗体応答
血清サンプルを野生型Ｂ６およびＣＥＡ．Ｔｇから回収し、そして適切な標的抗原に対する抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより解析した。マイクロタイタープレートを、４℃にて一晩、１００ ｎｇ／ウェルのＣＥＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｆａｌｌｂｒｏｏｋ， ＣＡ）、ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、マウスｒｅｃＧＭ−ＣＳＦまたは５×１０^５ ｐｆｕ／ウェルのＡＬＶＡＣにより感作した。ウェルを５％のＢＳＡを含有するＰＢＳによりブロッキングし、その後、希釈化マウス血清（１：１０〜１：３１，２５０）と１時間インキュベーションした。インキュベーション後、過剰な液体を吸引し、そしてプレートをバッファー（１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）にて３〜５回洗浄した。ウェルに結合した抗体をＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ．， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）またはＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を用いて検出した。１時間のインキュベーションの後、反応性のレベルをクロモゲンであるｏ−フェニレンジアミンを１０分間添加することにより検出し、そしてＥＬＩＳＡマイクロプレートオートリーダーＥＬ３１０（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｎｏｏｓｋｉ， ＶＴ）を使用してＡ_{４９０ ｎｍ}を読み取った。陽性対照、陰性対照、および血清サンプルのトリプリケートを、すべてのアッセイについて実行した。ＣＥＡについておよびＡＬＶＡＣについての陽性対照は、それぞれマウスＩｇＧ２ａ抗−ＣＥＡ ＭＡｂ、ＣＯＬ−１（３５）、そしてポリクローナルウサギ抗−ＡＬＶＡＣ ＩｇＧであったが、これらは研究室で開発したものであった。商業的に入手可能なラット抗−マウスＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（クローンＭＰ１−２２Ｅ９、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を、抗−ＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡアッセイにおける陰性対照として使用した。抗体力価は、０．５のＡ_{４９０ ｎｍ}を結果として引き起こす血清希釈の逆数として決定した。
【０１３３】
Ｔ−細胞増殖アッセイ
マウス脾細胞は磁気マウス汎Ｂ（Ｂ２２０）ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ａ．Ｓ．， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）によりＴ細胞のために濃縮され、そしてＦＡＣＳ解析により、得られた細胞集団は＞９５％ ＣＤ３^＋であったことが示された。単離されたＴリンパ球を１５ ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１０％加熱−不活化ＦＢＳ、２ ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ ｍＭの非−必須アミノ酸、１ ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０ ｕ／ｍｌのゲンタマイシン、および５０μＭのβ−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ １６４０中にて再懸濁した。アッセイは、平底９６−ウェルプレートのそれぞれにおいて、５０μｇ／ｍｌのＣＥＡ（Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ， ＣＯ）、５０μｇ／ｍｌのＯＶＡまたは培養液のいずれかの存在下にて、免疫化していない同系Ｂ６マウス由来の５×１０^５個の放射線照射した脾細胞（ＡＰＣとして機能）および１．５×１０精製脾臓Ｔリンパ球とを同時培養することからなる。培養５日後に、細胞を［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル； Ａｍｅｒｓｈａｍ． Ｃｏｒｐ．， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）によりパルス化し、そして２４時間後に回収し、そして取り込まれた放射活性を液体シンチレーション分光器（Ｗａｌｌａｃ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）により測定した。
【０１３４】
ＣＴＬ株および細胞傷害性アッセイ
アビポックス−ＣＥＡ／ＲＧ±アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦにより二回目の免疫化をした４週間後に、２〜３匹のマウス／群から得た脾臓をプールし、そして単一細胞懸濁液を作製した。脾細胞を１５ ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ ｍＭの非必須アミノ酸、１ ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０％加熱−不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）および５０μＭの２−ＭＥを添加したＲＰＭＩ １６４０中に懸濁した。１Ｏ ｍｌ中で２５×１０^６個の脾細胞を、Ｔ−２５フラスコに１０μｇ／ｍｌのＣＥＡ_{５２６−５３３}（ＥＡＱＮＴＴＹＬ）とともに添加した。Ｔ細胞培養物をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上でＴ細胞を回収して死細胞および赤血球を取り除き、２×１０^５Ｔ−細胞を５×１０^６の放射線照射した同系脾細胞、１０μｇのＣＥＡ_{５２６−５３３}／ｍｌおよび１０ Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ， Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．， ＥｍｅｒｙｖｉｌＩｅ， ＣＡ）の存在下にてインキュベートすることにより、１週間おきに２回刺激した。細胞傷害活性を、２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に、ＣＥＡ_{５２６−５３３}またはＦｌｕ ＮＰ ３６６−３７４のいずれかによりパルス化したマウスリンパ腫細胞株、ＥＬ−４を使用して評価した。
【０１３５】
ＣＴＬ活性は、以前に記載された方法（３６）を修飾することにより評価した。オーバーナイトのインジウム−１１１（^１１１Ｉｎ）放出アッセイを行った。簡単に述べれば、４×１０^６のＥＬ−４標的細胞は、（^１１１Ｉｎ）−オキシキノリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）中、３７℃にて３０分間、５０μＣｉで放射標識された。ペプチド−パルス化標的細胞を標識した後に、１μｇペプチド／ｍｌでインキュベートした。標的細胞およびエフェクター細胞を適切な比率で混合し、そして３７℃にて１８時間インキュベートした。放出された^１１１Ｉｎの量は、ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ Ａｕｔｏｇａｍｍａ， Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ）で測定し、そして特異的溶解のパーセントを以下のようにして計算した：
％特異的溶解＝［（実験的ｃｐｍ − 自発的ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ − 自発的ｃｐｍ）］×１００。溶解ユニット（ＬＵ_３０）は、１０，０００ペプチド−パルス化ＥＬ−４細胞の３０％溶解を得るために必要とされるエフェクター細胞の数を示す。
【０１３６】
サイトカイン産生アッセイ
Ｔ細胞株を、２×１０^４細胞／ウェルの細胞密度にて、５×１０^５放射線照射（２０００ ｒａｄ）同系ＣＥＡ．Ｔｇマウス脾細胞／ウェルおよび様々な濃度のＣＥＡ_{５２６−５３３}ペプチドとともに、平底９６−ウェルプレート中で、インキュベートした。上清を４８時間後に回収し、そしてＩＦＮ−γおよびＩＬ−４レベルを、適切なＥＬＩＳＡアッセイ（Ｅｎｄｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を使用して測定した。
【０１３７】
腫瘍療法の研究
６−〜８−週齢のオスおよびメスＣＥＡ．Ｔｇマウスに、はじめ、２ ｍｇのシクロホスファミドを１回腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により与えた。４日後、３×１０^５細胞のＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞（１００μｌ中）を右側脇腹に皮下で注入した。注入細胞のＦＡＣＳ解析により、＞８５％の細胞上でＣＥＡ発現（ＣＯＬ−１結合）、強力なＭＨＣクラスＩ発現、およびＮＭＣクラスＩＩ発現の不存在が示された。４〜５日後、腫瘍体積が３０〜５０ ｍｍ^３であったとき、マウスに、２００μｌ中、１０^８ ｐｆｕのアビポックス−ＣＥＡ／ＲＧを単独で、または１０^８ ｐｆｕのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたは２０μｇのｒｅｃＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて、初回免疫を与え、１００μｌずつに分けて尾のそれぞれの側に皮下注入した。ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを、４日間連続して毎日免疫化部位に投与した。免疫化を、同一部位に２週間後にブーストした。腫瘍を、２〜３回／週測定し、そして体積を以下のようにして計算した：［（ｍｍ、短軸）^２×（ｍｍ、長軸）］／２。＞２ ｃｍ^３の腫瘍を保持するマウスを人道的理由のために犠死させ、そして死亡日を記録した。腫瘍体積が減少したマウスにおいて、それはおそらく免疫化によるものであると思われるが、データを２つのカテゴリーに分けた：（ｉ）腫瘍退行および（ｉｉ）腫瘍根絶；これらはそれぞれ、測定された腫瘍体積の減少および腫瘍の完全な消滅として定義された。腫瘍が完全に根絶したマウスは、３×１０^５細胞のＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞（１００μｌ中）をもう一方の脇腹に、２回目の皮下注入によりチャレンジした。
【０１３８】
統計的解析
Ｔ−細胞増殖／溶解データの統計学的有意性は、スチューデントの両側ｔテストに基づく。それぞれの処置群についての腫瘍体積の変化により測定したＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍の増殖速度の変化を、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵテストを用いて比較した。表３において、個々のＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける腫瘍増殖を、２つのカテゴリーに分類した：（ｉ）測定された腫瘍体積の減少により定義される腫瘍退行、および（ｉｉ）注入部位での腫瘍を測定できないかまたは触診できないことにより定義される腫瘍根絶。報告されたすべてのｐ値は両側性であり、そしてデータに対して実行された様々な評価のためには調整されなかった。＜０．０５のｐ値を有意とみなした。
【０１３９】
実施例３
組換えアビポックスウィルスによるＧＭ−ＣＳＦ産生
マウスＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスを作製し、そしてＧＭ−ＣＳＦをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するそれらの能力を、ＭＣ−３８腫瘍細胞の感染後に評価した（図６）。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスは、ＧＭ−ＣＳＦ−依存性細胞株を用いたバイオアッセイにおいて測定した場合、ほぼ等量のＧＭ−ＣＳＦ（すなわち、２２５〜２５０ ｎｇ／１０^６細胞／日）を産生した。同一の細胞を同一のＭＯＩの対照ウィルスにより感染した場合、検出できるＧＭ−ＣＳＦは産生されなかった。
【０１４０】
実施例４
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ投与の後の局所リンパ節中の細胞的変化／機能的変化
排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）局所リンパ節でのクラスＩＩ−発現細胞の濃縮は、マウスモデルにおけるＧＭ−ＣＳＦ生物活性に関するｉｎ ｖｉｖｏ読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）であった（１５、２２）。実際、局所リンパ節症（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）が、Ｂ６マウスにおいて、１０^７または１０^８ ｐｆｕの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを投与して７日後に観察され、より低い程度であるが適切な対照ウィルスにより観察された（表３）。
【０１４１】
【表３】

【０１４２】
^ａ　Ｂ６マウス（６〜１０マウス／群）に、材料と方法において概説したように、示された組換えアビポックスウィルスまたはｒＧＭ−ＣＳＦを注入した。対照マウスにはＨＢＳＳを与えた。リンパ節をアビポックス−処置マウスから７日目および２１日目に回収し、そして最終注入の２４時間後にｒＧＭ−ＣＳＦ−処置マウスから回収した。リンパ節細胞の全数およびクラスＩＩ発現レベルを決定した。データは、２つの別個の実験の平均±ＳＥＭである。ＭＦＩ値は、４〜６回の定量の範囲として表している。
^ｂ　ｐ＜０．０５〔ｖｓ．対照（ＨＢＳＳ−処置）マウス〕
^ｃ　ｐ＜０．０５〔ｖｓ．同ｐｆｕの適切な対照アビポックスウィルス（すなわち、１０^７アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ ｖｓ． １０^７アビポックス（Ｆ）−ＷＴ）〕
^ｄ　ｐ＜０．０５〔ｖｓ．ｒＧＭ−ＣＳＦの１回注入〕。
【０１４３】
細胞／節の全数における最も顕著な増加が、１０^８ ｐｆｕのＧＭ−ＣＳＦ−発現組換えウィルスのいずれかを注入したマウスにおいて生じた。リンパ節細胞性における増加とともに、対照ウィルスと比較して、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスで処置したマウスにおけるクラスＩＩ−発現細胞のパーセントの選択的な増加が見られた（表３）。通常、非処置マウスまたはアビポックス−ＷＴまたはアビポックス−ＲＧのいずれかを注入したマウスから得た２５〜２９％のリンパ節細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する。（１０^７または１０^８ ｐｆｕの）組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかを注入すると、それらのＭＦＩの付随する３−倍のブーストとともに、７日目までに４３〜５１％までそのパーセントが増加した（表３）。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ−処置マウス由来の局所リンパ節を、注入の２１日後に解析した場合、クラスＩＩ^＋リンパ節細胞のパーセントの持続的な増加が見いだされた。ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの複数回注入が、リンパ節細胞性およびＭＨＣクラスＩＩ発現を向上させるために必要とされた（表３）。ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ処置を終了する際、リンパ節細胞性およびクラスＩＩ発現の変化は、表３にも示したように、２１日目までに迅速に処置前レベルに戻った。
【０１４４】
アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦを単回注入したマウスにおけるクラスＩＩ−発現リンパ節細胞の増加の時間経過をより徹底的に調査した。図７にまとめたように、マウスに１０^７または１０^８ ｐｆｕの組換えアビポックスウィルスまたは適切な対照ウィルスのいずれかを注入し、そして局所リンパ節におけるクラスＩＩ−発現細胞の全数を１週間おきに決定した。クラスＩＩ^＋細胞／リンパ節の全数レベルの増加が、１０^７または１０^８ ｐｆｕのいずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを注入したマウスにおいて、７日目までに観察された（図７）。１０^８ ｐｆｕのいずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスで処置したマウスにおけるクラスＩＩ発現細胞の絶対数は、２１〜２８日間増加したままであった。ｒｅｅＧＭ−ＣＳＦにより４日間処置したマウスにおけるクラスＩＩ−発現リンパ節細胞の全数の変化についての比較の時間経過を示している（図７Ａ、断続線）。
【０１４５】
局所リンパ節におけるクラスＩＩ発現レベルの増加は、Ｂ細胞でのより高いクラスＩＩレベルおよびＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋細胞の流入を含むことが報告された（２１）。ＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋細胞はまた、ＡＰＣ、特にマクロファージおよび樹状細胞の細胞−表面表現型プロファイルと一致する細胞−表面表現型プロファイルである、ＣＤ３⁻、ＣＤ１９⁻、Ｔｅｒ１１９⁻、ＮＫ１．１⁻、ＣＤ１１ ｂ^＋、ＤＥＣ２０５^＋、ＣＤ８０^＋およびＣＤ８６^＋であった（３７）。図８は、１０^８ ｐｆｕのいずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスまたは適切な対照ウィルスで処置したマウスから単離された局所リンパ節中の、ＡＰＣ集団における一時的変化をまとめている。非処置マウス由来のおよそ１〜２％のリンパ節細胞が、それらの抗原表現型により定義される場合、ＡＰＣであった。１０^８ ｐｆｕのいずれかのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの注入の７日後には、そのパーセントは、ほぼ３倍に増加した（データは示していない）。いずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスの注入後７日目の節内でのＣＤ１１ｃ^＋／クラスＩＩ^＋細胞の絶対数は、１２−倍に増加した（図８）。さらに、ＡＰＣ／節の数の増加についての時間経過は、クラスＩＩ−発現細胞の全数についての時間経過と実質的に同一であった。アビポックス−ＷＴおよび−ＲＧ処置マウス由来のリンパ節は、より多い数のＡＰＣを含有しなかった（図８）。それらの節は、有意により多い数のＢおよびＴ細胞を含有しなかった。
【０１４６】
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたは対照ウィルスを注入したＢ６マウス由来の局所的節を７日後および２１日後に単離し、そして混合リンパ球培養物からアロ反応性ＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するために使用した（図９）。アロ特異的溶解活性について調べた際、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ−処置マウスから７日目（図９Ａ）および２１日目（図９Ｂ）に単離されたリンパ節細胞は、非処理マウスまたは対照アビポックスウィルスで処置したマウスのいずれかから得たリンパ節細胞よりも、有意に（ｐ＜０．０５）強力であった。
【０１４７】
実施例５
複数アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ注入の効果
マウスにアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを３回、毎月注入し、そして局所リンパ節をそれぞれの注入後の全クラスＩＩ−発現細胞の変化について調べた研究を行った。血清サンプルを、抗−アビポックスおよび抗−ＧＭ−ＣＳＦ抗体力価の発生についても解析した。初回アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ注入の後７日後に、クラスＩＩ細胞の絶対数は０．５から４．９×１０^６／リンパ節へとおよそ１０−倍に増加した（図１ＯＡ）。２８日までに、その数は１．７×１０^６まで落ち込み、しかし２８日目にアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの２回目の注入後、３５日目までに４．８×１０^６まで増加した。５６日目にアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの３回目の注入を行ったところ、再びクラスＩＩ^＋細胞／節の数が２．８から５．７×１０^６と増加した（図１ＯＡ）。アビポックス（Ａ）−ＲＧの注入の結果、クラスＩＩ^＋リンパ節細胞の数の変化は観察されなかった。
【０１４８】
血清サンプルを、７日目、２８日目、３５日目、５６日目、６３日目、および８４日目に採取し、抗−アビポックスおよび−ＧＭ−ＣＳＦ ＩｇＧ力価の存在について解析した。測定可能な抗−アビポックス抗体力価は、７日目および２８日目に観察された（図１ＯＢ）。２８日目に投与したアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの２回目の注入の後、血清抗−アビポックスＩｇＧ力価は、＞１００，０００にブーストされた。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの３回目の注入の結果、さらに血清抗−アビポックスＩｇＧ力価が＞２００，０００までさらに増加した。検出可能な血清抗−ＧＭ−ＣＳＦ ＩｇＧ力価は、いずれの時間点でも見いだされなかった（図１ＯＢ）。
【０１４９】
実施例 ６
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの抗原−特異的免疫に対するアジュバント効果
ＣＥＡ．Ｔｇ マウスにおける抗 −ＣＥＡ 抗体応答
ＣＥＡ．Ｔｇマウスに、アビポックス−ＣＥＡを単独で１ヶ月おきに２回、またはアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの単回注入または４日間連続して投与したｒｅｅＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせて２回、ワクチン接種した。マウスの６０％において抗−ＣＥＡ ＩｇＧ血清力価の存在した場合、アビポックス−ＣＥＡ単独でワクチン接種するかまたはアビポックス−ＣＥＡをｒｅｃＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてワクチン接種した（図１１ Ｂおよび１１ Ｃ）。アビポックス−ＣＥＡおよびアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦをワクチン接種した１０匹のＣＥＡ．Ｔｇマウスすべてが（図１１、パネルＤ）、抗−ＣＥＡ ＩｇＧ応答を引き起こした。ＣＥＡ抗体力価は、ナイーブマウスまたは対照ウィルス（アビポックス−ＲＧ）をワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスの血清中には検出されなかった（図１１、パネルＡ）。
【０１５０】
ＣＥＡ に対する Ｔ− 細胞増殖性応答
初代ＣＥＡ−特異的脾臓Ｔ−細胞増殖応答を使用して、組換えアビポックスウィルス中のＧＭ−ＣＳＦを送達する効率を、複数のＧＭ−ＣＳＦ注入を使用する場合と比較して評価した（表２）。ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞増殖は、ワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから単離した脾臓Ｔ細胞を５日間インキュベーションした後、〔^３Ｈ〕チミジン取込みにより測定した。ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞増殖は、（ｉ）ＯＶＡがＴ細胞増殖を刺激できないこと、そして（ｉｉ）対照アビポックスウィルスにより免疫化したマウスから単離した脾臓Ｔ細胞が、可溶性ＣＥＡの存在下で増殖できないこと、により示された（表２）。アビポックス−ＣＥＡを、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｅＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて投与した場合、得られた可溶性ＣＥＡに対する脾臓Ｔ細胞増殖応答をブーストした（Ｐ＜０．０５）。ＣＥＡ−特異的リンパ球増殖は、アビポックス−ＲＧ−ワクチン接種ＣＥＡ．Ｔｇマウスから単離した脾臓Ｔ細胞を使用しては見いだされなかった（表４）。
【０１５１】
【表４】

【０１５２】
^ａ　ＣＥＡ．Ｔｇマウス（２〜３匹／群）に、１０^８ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＣＥＡまたはアビポックス（Ａ）−ＲＧを、皮下に（１００μｌ）２回、１ヶ月おきに投与した。ＧＭ−ＣＳＦを組換えタンパク質として、または材料と方法に記載した組換えアビポックス（Ａ）ウィルスと組み合わせて投与した。２回目の免疫化の４〜６週後に、マウスを犠死させ、脾臓Ｔ細胞を単離し、処置群にしたがってプールした。可溶性ＣＥＡ、ＯＶＡ、およびＣｏｎＡに対するＴ細胞増殖応答を、^３Ｈ−チミジン取込みにより測定した。
^ｂ　データは、代表的な実験から得たΔｃｐｍ〔Ｔ細胞、ＡＰＣを含有するウェル、および抗原なしのウェルにおけるマイナスｃｐｍ（２６２１−７９７３）〕±ＳＥＭとして示す。Ｃｏｎ−Ａ刺激ウェルについて、平均ｃｐｍが示される（ＳＥＭ＜１０％）。３回の別個の実験を行い、同様の結果を得た。ｎｅｇ＝ｃｐｍ＜培地対照。
^ｃ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ−免疫マウス）
^ｄ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．アビポックス（Ａ）ＣＥＡ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ−処置マウス）。
【０１５３】
ＣＥＡ ペプチド − 特異的 Ｔ− 細胞溶解
ワクチン化ＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける検出された主要なペプチド−特異的ＣＴＬ応答に対する繰り返した試みが失敗したため（データは示していない）、脾臓Ｔ細胞を、免疫化ＣＥＡ．Ｔｇマウスから単離し、そしてその後ＣＥＡアミノ酸５２６−５３３をスパンする８−ｍｅｒのペプチドおよびＩＬ−２の存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。ＣＥＡ_{５２６−５３３}、ＩＬ−２および放射線照射ＡＰＣに対するＴ細胞増殖応答が、アビポックス−ＣＥＡを単独でまたはアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｅＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて免疫化したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて観察された。２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、３種の細胞集団からの単離Ｔ細胞の＞９０％が、ＣＤ８^＋であった。さらに、それらのＴ細胞は、ＣＥＡ_{５２６−５３３}ペプチドによりパルスした同系（ＥＬ−４）標的を殺すことができた（図１２Ａ）。ＣＥＡペプチド−特異的ＥＬ−４溶解は、溶解ユニットにより測定した場合、アビポックス−ＣＥＡをアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてワクチン接種したＣＲＡ．Ｔｇマウスから得たＴ細胞株について、最高であった（ｐ＜０．０５ ｖｓ． アビポックス−ＣＥＡまたはアビポックス−ＣＥＡ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ−免疫化マウスのいずれか）（図１２Ａ）。ＥＬ−４標的細胞を無関係なペプチド（すなわち、Ｆｌｕ ＮＰ）によりパルスした場合、バックグラウンドレベルの細胞溶解が観察された（図１２Ａ）。アビポックス−またはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせたアビポックス−ＣＥＡによりワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから生成されたＴ細胞株はまた、アビポックス−ＣＥＡを単独でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから生成されたＴ細胞株よりも、高いレベルのγ−インターフェロンを産生した（図１２Ｂ）。ＩＬ−４は、それらの培養物のいずれにも見いだされなかった。
【０１５４】
実施例７
抗腫瘍免疫
ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍を保有するＣＥＡ．Ｔｇマウスを、アビポックス−ＣＥＡ単独でまたはアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて、並びに対照ウィルス、アビポックス−ＲＧを単独でまたはＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて、ワクチン接種した。ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍は、ナイーブＣＥＡ．Ｔｇマウス中でおよびアビポックス−ＲＧを単独でまたはＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてワクチン接種したマウス中で、徐々に増殖し、そしてそれらのマウスを腫瘍接種後６〜７週で犠死させた（表３）。アビポックス−ＣＥＡワクチン接種の結果、数匹のＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて腫瘍増殖の一過性な速度低下が引き起こされた；しかしながら、生存は長くなった（図１３Ｃ）。
【０１５５】
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせたアビポックス−ＣＥＡによるワクチン接種は、１６匹のＣＥＡ．Ｔｇマウスのうち６匹で腫瘍体積の測定可能な減少を引き起こした（図１３Ａ）。３５日目までに、アビポックス−ＣＥＡ＋アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ処置群の平均的腫瘍体積は、非処置群、アビポックス−ＲＧ＋アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ群またはアビポックス−ＣＥＡ−ワクチン接種群ＣＥＡ．Ｔｇマウスよりも、有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）。実際、アビポックス−ＣＥＡおよびアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦによりワクチン接種した５匹の腫瘍−保持ＣＥＡ．Ｔｇマウスは、２８日目までに腫瘍フリーになり（表３、図１３Ａ）、そしてその状態が１４週間そのままであった（図１３Ｃ）。その時点で、５匹の腫瘍−フリーＣＥＡ．Ｔｇマウスを、ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２ 腫瘍細胞によりチャレンジし、そしてすべてがプロテクトされた（図１３Ｄ）。アビポックス−ＣＥＡおよびｒＧＭ−ＣＳＦをワクチン接種した１４匹のＣＥＡＴｇマウスのうちの４匹もまた、腫瘍フリーになり（表３；図１３Ｂ）、そしてそれらの４匹のマウスのうちの３匹はチャレンジした腫瘍を再び注入した（図１３Ｄ）。
【０１５６】
【表５】

【０１５７】
^ａ　ＣＥＡ．Ｔｇマウスを、材料と方法に記載されたように、近似するアビポックス組換え体±アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦのいずれか、により２週間間隔で免疫化した。データは、単一の実験に由来するデータを示すアビポックス（Ａ）−ＲＧ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ群を除き２種の別個の実験から集めた。
^ｂ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．対照ＣＥＡ．Ｔｇマウス）
^ｃ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ−ワクチン接種ＣＥＡ．Ｔｇマウス）。
【０１５８】
実施例８
ｒＦ−ＧＭ−ＣＳＦは、Ｉｎ ｖｉｖｏでＣＥＡワクチンに対するＣＥＡ−特異的Ｔ−細胞応答を向上させる
方法
本明細書中およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：５８００−５８０７， １９９９に開示されたとおり、メスＣ５７ＢＬ／６マウスを、１×１０^８ ｐｆｕ／マウスのアビポックス（Ｆ）−ＷＴ、ｒＦ−ＣＥＡ、またはｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭにより、１回ワクチン接種した。それぞれの群の半数には、１×１０^７ ｐｆｕ／マウスのアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦをアジュバントとして与え、ＧＭ−ＣＳＦがＴ−細胞応答を向上させるかどうかを調べ、一方で残りのマウスにはアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦを与えなかった（ｎ＝３マウス／群）。１４日後、ワクチン接種群から得た脾細胞を細胞性免疫応答の解析のために回収した。Ｔ−細胞応答を定量するため、いくつかの濃度のＣＥＡタンパク質の存在下、５日間、ワクチン接種マウス由来のＴ細胞を放射線照射脾細胞とともにインキュベートした。Ｔ細胞をまた、陽性増殖対照および陰性増殖対照のために、Ｃｏｎ Ａまたはオボアルブミンとともにインキュベートした。インキュベーションの最後の１８時間のあいだ、^３Ｈ−チミジンを添加し、Ｔ−細胞増殖を測定した。
【０１５９】
これらの実験は、ｒＦ−ＣＥＡ、またはｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭと組み合わせて投与した場合、アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦが、これらのベクターのＣＥＡ−特異的Ｔ−細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで活性化する能力を向上させることを示す（図１４Ａ〜１４Ｃ）。
【０１６０】
実施例９
β−ガラクトシダーゼに対するＣＤ４応答：鶏痘ウイルス−ＧＭ−ＣＳＦの免疫アジュバント効果
方法
Ｆｐ−ｍｕ−ＧＭ−ＣＳＦとともにまたは伴わずに、不完全フロイントアジュバントと組み合わせたβ−ｇａｌにより免疫化したマウスから単離した脾細胞によるβ−ｇａｌに対するリンパ球増殖性応答を測定した。マウスを、まず不完全フロイントアジュバントと組み合わせた１００μｇのβ−ｇａｌでワクチン接種し（三角）（体積比率あたり１：１に混合）またはアジュバントのみで接種した（丸）。選択した群において、Ｆｐ−ｍｕ−ＧＭ−ＣＳＦ（１０^７ ｐｆｕ）（菱形）またはＦｐ−ＷＴ（１０^７ ｐｆｕ）（四角）のいずれかを免疫源とともに添加し、そして皮下に注入した。ワクチン接種の３０日後、脾臓を回収し、そしてＴ−細胞を単離し、そしてリンパ球増殖性アッセイにおいて使用し、そこには、β−ｇａｌタンパク質（１００〜６．２５ ｕｇ／ｍｌ）およびナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した５×１０^５放射線照射抗原−提示細胞が含まれた。^３Ｈ−チミジンをｉｎ ｖｉｔｒｏ培養５日後に添加し、そして取り込まれた量を２４時間後に測定した。
【０１６１】
結果
データは、全タンパク質（β−ガラクトシダーゼ）を免疫源として使用した場合に、マウスＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルス（鶏痘ウイルス）が、実質的に宿主細胞性（すなわちＣＤ４）免疫応答を増大させることを示した（図１５）。
【０１６２】
実施例１０
膀胱癌を有する患者に対するアビポックス−Ｆ−ＧＭ−ＣＳＦの膀胱内投与
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、膀胱癌を有する患者に対して、膀胱内で投与した。患者には、１０^６〜１０^１１ ｐｆｕのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦをカテーテルを介して投与し、膀胱癌腫細胞に感染させた。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、１〜１０回、１日おき、１週間おき、または１ヶ月おきに投与する。治療の有効性は、臨床的に評価する。
【０１６３】
実施例１１
頭部および頸部癌腫を有する患者における、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの直接腫瘍内注入
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、頭部および頸部などの腫瘍、皮膚のメラノーマおよび乳癌転移に直接的に注入する。１０^５〜１０^９ ｐｆｕのあいだのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、１〜１０回、 １日おき、１週間おき、または１ヶ月おきに投与する。
【０１６４】
実施例１２
ＣＥＡ−発現癌腫を有する患者のワクチン化
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭワクチンと組み合わせて使用して、いずれかのＣＥＡ発現腫瘍を治療する。アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭは、鶏痘組換え体が腫瘍抗原ＣＥＡおよび３種の異なる共刺激分子：Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現するワクチンである。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦは、１０^６〜１０^１０ ｐｆｕ／注入の用量で与える。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭの投与の前（１日〜１週間）、同時、または後（１日〜１週間）のいずれかに投与する。アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭは、１０^６〜１０^１０ ｐｆｕ／感染の濃度で与える。
【０１６５】
実施例１３
Ｒｈｅｓｕｓ ＭａｅａｑｕｅｓでのＳＩＶおよびＳＨＩＶチャレンジモデルにおける、ＨＩＶ抗原およびＳＩＶ抗原を発現する組換えポックスウィルスと組み合わせたアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、１０^６〜１０^１０ ｐｆｕ／注入の用量で皮下に与える。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＨＩＶ抗原−ＴＲＩＣＯＭ、アビポックス−ＳＩＶ抗原−ＴＲＩＣＯＭ、アビポックス−ＨＩＶ抗原−Ｂ７、またはアビポックス−ＳＩＶ抗原−Ｂ７の投与の前（１日〜１週間）、同時、または後（１日〜１週間）のいずれかに、皮下に１０^６〜１０^１０ ｐｆｕ／注入で投与する。
【０１６６】
検討
ＧＭ−ＣＳＦは、プロフェッショナルＡＰＣを局所注入部位に引き寄せ、その後局所リンパ節中に遊走して宿主免疫応答を媒介する能力により、ワクチンに対する強力な生物学的アジュバントとして作用すると考えられる（１５、２１、２２）。組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質を４〜５日間連続して注入した以前の研究（１５）は、局所リンパ節でクラスＩＩ−発現ＡＰＣが増殖し、その次に宿主免疫におけるブーストと相関関係を有したことを報告した。異なるビヒクルを使用して、ＧＭ−ＣＳＦを免疫化部位に対して送達した。それらのアプローチのいくつかには、腫瘍細胞ワクチン中にレトロウィルスベクターを介してＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入すること（１９、２０）、融合タンパク質（１８）および複製−欠失（２５）組換えポックスウィルスが含まれる。本研究において、ＧＭ−ＣＳＦを発現する複製−欠損組換えアビポックス〔鶏痘ウイルス、カナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）〕ウィルスを、一回、皮下に注入してＢ６マウスに与えた。局所排出性リンパ節内部のリンパ節細胞の絶対数（表３）、パーセント（表３）、ＭＦＩ（表３）、およびクラスＩＩ−発現細胞の絶対数（図７Ａ〜７Ｄ）およびＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋細胞の数（図８）の結果としての増加は、すべて、組換えアビポックスウィルスによる生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦの合成と一致した。ＧＭ−ＣＳＦを発現する２種の異なる組換え体アビポックスウィルス、鶏痘およびカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）を比較し、そして一見した相違は観察されなかった。
【０１６７】
ＧＭ−ＣＳＦを免疫化部位に対して送達するための組換えアビポックスウィルスの使用は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを使用することよりもいくつかの利点を有する可能性がある。局所リンパ節中でのＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋細胞の絶対数の増加の程度は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの場合よりもアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを注入したマウスにおいて、ずっと大きかった。例えば、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ処置の４〜５日後、ＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋リンパ節細胞の数は、非処置マウスと比較した場合、およそ６−倍に増加した（０．７１ ｖｓ． ０．１２×１０^６／節、図３）。１０^８ ｐｆｕの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかの一回注入により、ＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋リンパ節細胞の絶対数をほぼ７０−倍にまでブーストした（１．４４ ｖｓ． ０．１２×１０^６／節、図３）。ＧＭ−ＣＳＦを送達するために組換えアビポックスウィルスを使用することの第二の利点は、局所リンパ節内でのＡＰＣの濃縮と関連する一時的な変化である可能性がある。図８に示すように、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦは、局所リンパ節内でのＡＰＣ濃度を増加させるためには、４〜５日間投与することを必要とする。 ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ処置の中止に際して、注入部位内部での変化は、迅速に消滅する（およそ４〜５日）。一方で、クラスＩＩ^＋およびＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋リンパ節細胞の絶対数の増加は、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかを、２１〜２８日間注入したマウスの局所リンパ節中で持続した（図８）。実際、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ注入の２１日後に単離されたリンパ節細胞は、より強力なアロ特異的なＣＴＬ応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、そのことからそれらの機能的完全性が示される（図９Ｂ）。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスが注入後にＧＭ−ＣＳＦの貯蔵所を作製し、そして局所的節において見いだされる長期的な変化は、サイトカインの遅速放出を示しているだろう、と議論する者もいるかもしれない。ＧＭ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、２〜３日間のオーダーであるため、そのような意見はありそうもない。理論により縛られるものではないが、よりもっともらしい説明は、複製−欠失アビポックスウィルスが注入部位に居続け、そして持続的にＧＭ−ＣＳＦを産生し、これが続いて局所リンパ節においてみられる持続的な変化を媒介する、というものである。
【０１６８】
これらの組換えアビポックスウィルスがワクチン接種部位に対して生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦを送達するために使用すべきであるならば、それらは特定の抗癌ワクチンと融和性でなければならない。そのような仮説を試験するため、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスならびにｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＣＥＡを腫瘍ワクチンとして使用する場合に、それらがＣＥＡ−特異的宿主免疫をＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて増強する能力について評価した。アビポックス−ＣＥＡにより、または以前に報告されたとおり組換えワクシニア−ＣＥＡ ウィルスにより（２９）、ＣＥＡ．Ｔｇマウスにワクチン接種すると、ＣＥＡ−特異的体液性−および細胞性−媒介性免疫を誘導する。しかしながら、組換えポックスウィルス−ＣＥＡワクチンによりワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて生成されたＣＥＡ−特異的免疫は、比較的弱かった。実際、本発明において、アビポックス−ＣＥＡワクチン接種により、ＣＥＡ．ＴｇマウスにおけるＣＥＡ−発現皮下腫瘍の一過性増殖阻害が誘導された（図１３Ｂ）。ＧＭ−ＣＳＦを、組換えアビポックスウィルスとしてまたは組換えタンパク質として組み込むことにより、アビポックス−ＣＥＡ−ワクチン接種ＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて、ＣＥＡ−特異的ＣＤ４^＋−増殖性応答（表４）およびＣＤ８^＋−媒介性溶解応答（図１２Ａ）が増大した。実際、抗−ＣＥＡ−特異的細胞性免疫応答は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦではなく、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦが生物学的ワクチンアジュバントであるＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて有意により強力であった。したがって、腫瘍抗原およびＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスは融和性であり、そして同時に注入することができる様である。さらに、組換えアビポックス−ＣＥＡ ウィルスがＣＥＡを２１〜２８日間連続的に産生するならば、増大した局所的ＧＭ−ＣＳＦレベルとともに抗原が同時的に存在することは、結果として樹状細胞に腫瘍抗原を持続的に負荷していることになるだろう。
【０１６９】
それは、ＣＥＡに対する細胞応答の改善を説明しうるが、それらの変化が、アビポックス−ＣＥＡおよびアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦでワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおけるより強力な抗腫瘍応答を媒介しなかった理由は、解明されないままである。１つの可能性のある説明は、細胞−媒介性免疫が自己抗原に対して生成される実験的モデルを使用することにより、抗腫瘍応答を埋め合わせうる宿主／腫瘍因子を導入することができる、というものである。
【０１７０】
感染しそして遺伝子産物を発現する能力、および臨床試験において証明されたそれらの安全性のため（３８〜４２）、組換えアビポックスウィルスは、癌ワクチンとして魅力的な候補である。ワクシニアに対して先に曝露すると、組換えアビポックスウィルスに対する免疫応答を変化させず（４３）、そして多様な初回−ブーストプロトコルにおいて、２種のウィルスが、マウスモデルにおいて抗腫瘍免疫を誘導する（３６）。この知見は、組換えアビポックスウィルスを使用することを、免疫化部位でＡＰＣを濃縮するためにＧＭ−ＣＳＦを送達し、それにより抗原−特異的抗腫瘍免疫の生成を増大させることを含むことまで拡張される。別の知見は、繰り返し注入の後のアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦが局所リンパ節でのＡＰＣを濃縮する能力であった。これらの研究およびその他の研究（２４、４４）において観察された抗−アビポックス血清抗体力価の存在にかかわらず、そのことは起こった。事実、最近の臨床試験において、進行したＣＥＡ−陽性腫瘍を伴う患者に対して投与されたアビポックス−ＣＥＡの複数回注入により、ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞前駆細胞頻度の進行性の増加が引き起こされた。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを使用することの３つ目の利点は、それをアビポックス−ＣＥＡなどの免疫源と容易に混合することができること、そしてｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの４〜５回の毎日の注入と比較して、ワクチンを一回注入として投与することができることの容易性である。そのことにより、ワクチンデザインが簡単にすることができ、治療コストを下げることができ、その一方でおそらくは、ＧＭ−ＣＳＦのアジュバント効果を最大にすることができる。
【０１７１】
【表６】

【図面の簡単な説明】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴および多くの付随する利点は、本発明の詳細な説明を読むことにより、本明細書中に添付する図面とともに考慮した場合に、よりよく理解されるだろう：
【図１】図１は、ｒＦ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦの作製のためのプラスミドベクターｐＴ５０９１を示す。
【図２】図２は、ｒＦ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製のためのプラスミドベクターｐＴ５０５２を示す。
【図３】図３は、ｒＶ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製のためのプラスミドベクターｐＴ５０５１を示す。
【図４】図４Ａ−４Ｅは、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えポックスウィルスのゲノム構造を示す。ＢａｍＨＩ Ｊは、鶏痘ゲノム中の外来性遺伝子の挿入部位である。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＪまたはＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍは、ワクシニアウィルスゲノム中の挿入部位である。欠失ＩＩＩは、ＭＶＡゲノム中の挿入部位である。４０Ｋ、Ｃ１、Ｐ１およびＰ２は、ポックスウィルスプロモーターである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦを腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）とともに発現する組換えポックスウィルスのゲノム構造を示す。ＢａｍＨＩ Ｊは、鶏痘ゲノム中の外来性遺伝子の挿入部位である。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｊは、ワクシニアウィルスゲノム中の挿入部位である。欠失ＩＩＩは、ＭＶＡゲノム中の挿入部位である。Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、ポックスウィルスプロモーターである。
【図６】図６は、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスによるマウスＧＭ−ＣＳＦの産生を示す。ＭＣ−３８細胞を、材料と方法において概説したように、５ ＭＯＩのアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ、５ ＭＯＩのアビポックス（Ｆ）−ＷＴ、５ ＭＯＩのアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたは５ ＭＯＩのアビポックス（Ａ）−ＲＧのいずれかにより感染させた。対照細胞には、ウィルスを与えなかった。細胞を３日間増殖させ、そして２４時間ごとに上清を回収した。マウスＧＭ−ＣＳＦレベルを、ＧＭ−ＣＳＦ−依存性ＦＤＣＰ−１指標細胞株を使用して測定し、そしてｎｇ ＧＭ−ＣＳＦ産生／１０^６細胞／２４ｈとして示した。データは、同様の結果が繰り返し得られた代表的な実験に由来するトリプリケートウェルからの平均±ＳＥである。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスを用いて処置したマウスの局所リンパ節内のＭＨＣクラスＩＩ−発現細胞を示す。図７Ａおよび７Ｂにおいて、Ｂ６マウス群（２０〜３０マウス）には、１０^７ ｐｆｕ（２Ａ）または１０^８ ｐｆｕ（２Ｂ）のアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）またはアビポックス（Ｆ）−ＷＴ（白丸）のいずれかを１回ｓ．ｃ．注射（ｄａｙ １、矢印）した。図７Ｃおよび７Ｄにおいて、Ｂ６マウスにはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）またはアビポックス（Ａ）−ＲＧ（白丸）をそれぞれ１０^７ ｐｆｕおよび１０^８ ｐｆｕで与えた。その他のＢ６マウス（ｎ＝２０）には、２０μｇのｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ（図７Ａ、断続線、黒三角）を４日間（黒水平線）、毎日注射した。対照マウス（白三角、すべてのパネル）には、１００μｌのＨＢＳＳを与えた。マウス（４〜６／群）をそれぞれの時点で犠死させ、鼠蹊部リンパ節を回収し、一緒にし、そして全リンパ節細胞を血球計算板を使用して計数した。クラスＩＩ−発現細胞のパーセントを、フローサイトメトリーを使用してＩ−Ａｂ^＋細胞により決定し、そしてクラスＩＩ−発現細胞の全数を以下の様にして計算した：全リンパ節細胞×％クラスＩＩ^＋細胞＝全クラスＩＩ^＋細胞。データは、それぞれの時点が、２〜３の異なる測定法の平均である、３〜４実験から得た結果を示す（ＳＤ≦１５％）。
【図８】図８は、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦにより処置したマウスにおける局所リンパ節あたりのＡＰＣの全数を示す。Ｂ６マウス（８〜１２／群）に対して、図７Ａ〜７Ｄに概説したように、１０^８ ｐｆｕ（矢印で示す）のアビポックス（Ｆ）−ＣＭ−ＣＳＦ（黒三角）、アビポックス（Ｆ）−ＷＴ（白三角）、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒四角）またはアビポックス（Ａ）−狂犬病糖タンパク質（ＲＧ）（白四角）を投与した。組換えＧＭ−ＣＳＦ（２０μｇ、黒丸）を、マウスのコホート（ｎ＝１５）に対して、４日間連続して与えた（黒水平線）。対照マウス（破断線）には、ＨＢＳＳを与えた。局所リンパ節を示した時点で回収し、そしてＣＤ１１ｃ^＋／Ｉ−Ａｂ^＋細胞の全数を、材料と方法において概説したように測定した。データは、それぞれの時間点について２〜３回試験した３〜４回の別個の実験に由来する知見の合成の平均±ＳＥを示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、アビポックス（図１０Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦのアロ反応性ＣＴＬの生成に対する効果を示す。ナイーブのＢ６マウスを、１０^８ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒三角）、１０^８ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＲＧ（黒四角）のいずれかにより前述したように処置した。対照マウスには、ＨＢＳＳ（黒丸）を与えた。７日後（図９Ａ）および２１日後（図９Ｂ）に、マウス（３〜４）を犠死させ、局所リンパ節を回収し、そして単一細胞懸濁物を調製した。それらのリンパ節細胞に放射線照射し（５０００ ｒａｄ）そしてＡＰＣとして使用した。一方向性のＭＬＣを設定するため、１：１の比率のレスポンダー（ＢＡＬＢ／Ｃ脾細胞）およびスティミュレーター（照射されたＢ６リンパ節細胞）を、Ｔ−２５フラスコ中の１０ ｍｌの培養液中で、３７℃にて５日間インキュベートした。細胞を回収し、材料と方法において記載したように細胞傷害性を測定した。細胞溶解は、同種異系Ｈ−２ｂ標的細胞（ＭＣ−３８）について示されたが、同系Ｈ−２ｄ細胞（Ｐ８１５）に対する細胞溶解は、すべての群について＜８％であった。データは、同一の結果を繰り返し示した単一の実験に由来する４重の決定値に由来する平均±ＳＥを示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、（Ａ）アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはアビポックス（Ａ）−ＲＧの複数回に分けた注入の後のリンパ節クラスＩＩ−発現細胞の変化を示す。Ｂ６マウス（１５／群）には、１０^７ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）、１０^７ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＲＧ（白丸）またはＨＢＳＳ（黒三角）のいずれかを注入した。それぞれの時点において、２〜５匹のマウス／群を犠死させ、両側性鼠径部リンパ節を単離し、そして図７Ａ〜７Ｄについて概説したように全クラスＩＩ発現細胞を決定した。データは、単一の実験に由来する結果を示す（図１０Ｂ）。マウス由来の血清サンプルを、抗−アビポックス（Ａ）（斜線付き棒）または抗−ＧＭ−ＣＳＦ ＩｇＧ（黒棒）抗体力価の存在について解析した（材料と方法を参照）。血清抗−アビポックス（Ａ）および抗−ＧＭ−ＣＳＦ抗体力価は、それぞれの時点で解析した、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦおよび非処理群からの２匹の別個のマウスから得た平均である（ＳＥ＜１０％）。
【図１１】図１１は、ＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける抗−ＣＥＡ ＩｇＧ血清力価の生成を示す。ＣＥＡ．Ｔｇマウスを、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ単独（１０^８ ｐｆｕ、パネルＢ）により、またはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ（２０μｇ、パネルＣ）またはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（１０^８ ｐｆｕ、パネルＤ）とともに、材料と方法に概説されたようにワクチン接種した（２×）。その他のマウスは、アビポックス（Ａ）−ＲＧ（１０^８ ｐｆｕ）またはＨＢＳＳ（パネルＡ）のいずれかを２回注入した。最終処理の２週間後、マウスから採血し、そして血清を前述したように抗−ＣＥＡ ＩｇＧ抗体の存在について試験した。データは、個々のマウスの血清抗体力価を示す。＜１００の力価は陰性とみなした。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡをアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦとともにワクチン接種したＣＥＡ．ＴｇマウスにおけるＣＥＡ−_{５２６−４３３}特異的ＣＴＬ 応答の生成を示す。ＣＥＡ．Ｔｇマウスを材料と方法に概説されるようにワクチン接種した。精製脾臓Ｔ細胞を、１０ユニットのＩＬ−２および１μｇのＣＥＡペプチド／ｍｌの存在下にて、３ラウンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に供した。Ｔ細胞株は、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ単独（○、●）、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ＋アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒四角、□）およびアビポックス（Ａ）−ＣＥＡ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ（▲、△）でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから増殖させた。細胞溶解活性は、０．２μｇのＣＥＡ_{５２６−５２２}（黒色）（図１２Ａ）または対照ペプチド（すなわち、Ｆｌｕ ＮＰ_{３６６−３７４}）（白色）の存在下でインキュベートされたＥＬ４標的細胞に対して試験した。それらの同一のＴ細胞株を、新たに単離し放射線照射したＡＰＣおよび０．０１〜１μｇのＣＥＡペプチドとともに４８時間インキュベートし、上清を回収した。ＩＦＮ−γ産生を、ＥＬＩＳＡにより決定した（図１２Ｂ）。データは、同様の結果が繰り返し得られた代表的な実験における３個の別個のウェルに由来する平均±ＳＥＭであった。検出可能なＩＬ−４レベルは見出されなかった。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（１３Ａ）またはｒＧＭ−ＣＳＦ（１３Ｂ）のいずれかと組み合わせたアビポックス（Ａ）−ＣＥＡでワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける、抗腫瘍免疫を示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（１３Ａ、矢印）またはｒＧＭ−ＣＳＦ（１３Ｂ、矢印、黒水平線）のいずれかと組み合わせたアビポックス−ＣＥＡでワクチン接種したＣＥＡ．ＴｇマウスにおけるＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍の増殖を示す。Ｎは、第５６日において腫瘍を有さないマウスの数を示す。データは、２回の別個の実験を組み合わせている。図１３Ａおよび１３Ｂにおける黒線は、腫瘍退行が観察されたマウスを示す。図１３Ｃは、アビポックス（Ａ）でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウス、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ単独（●）、またはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせ（黒四角）またはｒＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせ（▲）でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスの生存を示す。非処置ＣＥＡ．Ｔｇマウス（破断線）には、ＨＢＳＳを与えた。アビポックス（Ａ）−ＲＧ単独またはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒＧＭ−ＣＳＦのいずれかとの組み合わせでワクチン接種しても、全体の生存は変化しなかった（データは示さない）。図１３Ｄは、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡおよびアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝５、▲）またはアビポックス（Ａ）−ＣＥＡ＋ｒＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝４、●）でワクチン接種した後にＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍を拒絶したＣＥＡ．Ｔｇマウスを、３×１０^５のＭＣ３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞でチャレンジした。断続線は、同一の腫瘍用量を投与した１０匹のナイーブなＣＥＡ．Ｔｇマウスの生存を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦがＣＥＡワクチンに対するＣＥＡ−特異的Ｔ−細胞応答を向上させることを示す。図１４Ａ：バッファー（黒ボックス）、アビポックス（Ｆ）−ＷＴ（黒ダイヤ）、またはアビポックス（Ｆ）−ＷＴ＋アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）でワクチン接種したマウス由来のＴ−細胞応答。図１４Ｂ：アビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ（黒ダイヤ）、またはアビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ＋アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）でワクチン接種したマウス由来のＴ−細胞応答。図１４Ｃ：アビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ（すなわち、ＣＥＡ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３を発現するアビポックス；黒ダイヤ）、またはアビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ＋アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）でワクチン接種したマウス由来のＴ−細胞応答。それぞれのパネル中の挿入は、Ｃｏｎ Ａ（陽性対照）およびオボアルブミン（陰性対照）に対するＴ−細胞応答が、すべての群について同一であったことを示す。
【図１５】図１５は、不完全フロイントアジュバント（鶏痘マウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｆｐ−ｍｕ ＧＭ−ＣＳＦ）を含むかまたは含まないＩＦＡ）と組み合わせたβ−ｇａｌにより免疫化したマウスから単離した脾細胞による、全タンパク質、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）に対するリンパ球増殖応答を示す（●＝非処置；▲＝β−ｇａｌ＋ＩＦＡ；◆＝β−ｇａｌ＋ＩＦＡ＋Ｆｐ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦ １０^７ ｐｆｕ；黒四角＝β−ｇａｌ＋Ｆｐ−ＷＴ）。[0001]
Field of the Invention
The present invention expresses a cytokine, granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF), for use in enhancing the immune response and for treating neutropenia and myelodysplastic syndrome Recombinant replication-defective virus. More specifically, the invention is for use as a biological adjuvant to enhance immune responses, especially anti-tumor responses, and to treat neutropenia and myelodysplastic syndrome. GM-CSF-expressing recombinant replication-deficient avian poxvirus and a composition comprising the same.
[0002]
Background of the Invention
Due to its action as a major stimulatory cytokine for Langerhans cells and dendritic cells (1-3), GM-CSF⁵Is thought to function as a biological vaccine adjuvant. Experimental and clinical studies suggest that recombinant GM-CSF protein can boost host immunity directed against various immunogens (4-14). In most of these studies, recombinant GM-CSF protein (recGM-CSF) was administered for 4-5 consecutive days, starting with injection with antigen (15). Other approaches deliver GM-CSF in DNA plasmids (16, 17), fusion proteins (18), retroviral vectors (19, 20) and replication-competent vaccinia vectors (45), all of which are , For most of them, increased host immunity. The use of vaccinia-GM-CSF recombinant virus is problematic because repeated injections can be problematic for host anti-vector immune responses (23). A replication-deficient avian poxvirus is constructed to express a cytokine gene product (24, 25) and has been shown herein to be more suitable than prior art methods for delivering GM-CSF to the site of immunization. Shown in
[0003]
Summary of the Invention
An aspect of the present invention is a composition comprising a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, alone or in combination with a source of antigen or epitope.
[0004]
A further aspect of the invention is a composition comprising a recombinant replication-defective virus encoding both GM-CSF and an antigen or an immunological epitope thereof, especially one or more tumor-associated antigens.
[0005]
Another aspect of the invention is a composition comprising a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, alone or with at least one immunostimulatory molecule, in combination with a vector expressing the antigen.
[0006]
A further aspect of the present invention is to provide a recombinant replication-defective poxvirus encoding GM-CSF, alone or with or without a gene encoding at least one immunostimulatory molecule, at least one antigen or immunological thereof. And a vector expressing a novel epitope.
[0007]
Another aspect of the present invention is to provide a recombinant avipoxvirus encoding GM-CSF, alone or with or without a gene encoding at least one immunostimulatory molecule, at least one tumor-associated antigen or its immunity. A composition comprising a vector expressing a biological epitope.
[0008]
One aspect of the present invention is to express a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, with or without a gene encoding at least one immunostimulatory molecule, to express at least one antigen or immunological epitope thereof. And a recombinant replication-defective virus.
[0009]
Another aspect of the invention is a composition comprising a recombinant replication-defective avianpoxvirus encoding GM-CSF together with a recombinant replication-defective avianpoxvirus expressing at least one antigen or immunological epitope thereof. It is.
[0010]
Another aspect of the invention is a composition comprising a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF together with an antibiotic, antifungal, anti-parasitic, anti-viral, or a combination thereof.
[0011]
Yet another aspect of the present invention is a composition comprising a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF together with erythropoietin.
The invention further provides a composition comprising a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF together with a bispecific antibody.
[0012]
The present invention provides a host cell infected with a first vector of a recombinant replication-defective virus encoding a GM-CSF molecule that causes expression of GM-CSF in the host cell. The second vector further provides to the host cell an exogenous gene encoding at least one target antigen or an immunological epitope thereof and / or an exogenous gene encoding one or more costimulatory molecules. can do.
[0013]
The present invention provides an antigen-presenting cell (APC) or a tumor cell infected with a first vector of a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF that causes expression of GM-CSF. The second vector further provides to the host cell an exogenous gene encoding at least one target antigen or an immunological epitope thereof and / or a gene encoding one or more costimulatory molecules. Can be.
[0014]
The invention further provides a host cell infected with a recombinant avipoxvirus that causes the expression of GM-CSF. The host cell can also be infected with a recombinant vector encoding at least one target antigen or immunological epitope thereof and / or a recombinant vector encoding at least one immunostimulatory molecule.
[0015]
Another aspect of the invention is dendritic cells (DCs) and their precursor cells infected by a replication-defective virus encoding GM-CSF. The DC and its progenitor cells are further engineered to express a foreign gene encoding at least one target antigen or immunological epitope thereof, and / or to express at least one immunostimulatory molecule. can do.
[0016]
Yet another aspect of the invention are DCs and their progenitors that have been genetically engineered to co-express GM-CSF and at least three exogenous costimulatory molecules. DCs and their progenitors can be further engineered to express a foreign gene encoding at least one target antigen or immunological epitope thereof.
[0017]
The invention further provides DCs and their progenitors that have been genetically engineered to co-express GM-CSF, at least one B7 molecule, ICAM-1 and LFA-3. DCs and their progenitors can be further engineered to express a foreign gene encoding at least one target antigen or immunological epitope thereof.
[0018]
The invention further provides host cells infected with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF as a source for commercial production of GM-CSF.
It is an object of the present invention to provide an immune response against an antigen or an epitope thereof comprising administering a recombinant replication-defective virus expressing GM-CSF in an amount sufficient to enhance the immune response to the antigen or an epitope thereof. It is to provide a way to improve.
[0019]
It is another object of the present invention to provide a recombinant replication-defective poxvirus expressing GM-CSF, alone or in an amount sufficient to enhance an immune response to the antigen or an epitope thereof, or an immunological It is an object of the present invention to provide a method for improving an immune response to an antigen or an epitope thereof, which comprises administering together with a source of an epitope.
[0020]
Another object of the invention is a method for improving the immune response to at least one antigen or an immunological epitope thereof, comprising administering a first recombinant vector encoding GM-CSF, Administering a second recombinant vector encoding the present invention, wherein at least one recombinant vector is a replication-defective virus.
[0021]
It is a further object of the present invention to provide a method for enhancing local lymph nodes with antigen presenting cells (APCs) using a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF.
[0022]
The present invention relates to the administration of a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, alone or together with a recombinant virus encoding at least one tumor antigen source, preferably at least one tumor antigen or an immunological epitope thereof. There is further provided a method of generating anti-tumor immunity, comprising:
[0023]
In another method for improving an immunological response, APCs or tumor cells infected with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF are used to enhance an immunological response to a mammal. Serve in effective amounts. The APC or tumor cell further expresses a foreign gene encoding at least one target antigen or an immunological epitope thereof, alone or together with a gene encoding at least one costimulatory molecule to enhance an immune response. can do. The target antigen or its immunological epitope can be administered to the mammal before, simultaneously with, or subsequent to the administration of the APC or tumor cell. Additionally or alternatively, the APCs or tumor cells may be pulsed with at least one target antigen or immunological epitope thereof prior to administration to the mammal.
[0024]
Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating neutropenia using a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF.
It is a further object of the present invention to provide a method for treating myelodysplastic syndrome using a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF with erythropoietin.
[0025]
Another aspect of the invention is a plasmid encoding GM-CSF for use in generating a replication-defective virus encoding GM-CSF.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF for use in enhancing an immunological response to an antigen or immunological epitope thereof. Recombinant replication-defective viruses for use in the present invention include replication-defective poxvirus, herpes virus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV) and others that cannot replicate in mammalian cells, especially human cells. But not limited to these vectors. In particular, the present invention relates to fowlpox virus, canarypox virus and modified vaccinia ankara strains (MVA) encoding GM-CSF for use as a biological adjuvant in enhancing an immunological response to an antigen. And a recombinant replication-deficient avian poxvirus.
[0026]
The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF of the present invention improves the immunological response to cells of the immune system, including antigen-presenting cells (APC), T lymphocytes, B lymphocytes, NK cells, etc. It has utility in providing An immunological response can be a generalized immunopotentiating or upregulating effect, as indicated by increased cytokine release, increased proliferation by immune cells, increased mitogen responsiveness, and the like. Of particular interest is the migration and increase of APCs at immunological sites caused by administration of a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF. The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is a biological adjuvant in that it functions to increase APC at the site of injection. The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF can be used in combination with an antigen source to improve antigen-specific immunological responses. Such responses can include cellular and / or humoral responses to the specific antigen or its epitope.
[0027]
Recombinant-replication deficient virus encoding GM-CSF provides enhanced immunological response and native GM-CSF protein, recombinant GM-CSF protein, GM-CSF-DNA plasmid, GM-CSF-fusion protein, It provides advantages that go beyond those of retroviral vectors encoding GM-CSF and vaccinia vectors encoding GM-CSF. The enhancement provided by the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is evident in both the extent and duration of the immune response.
[0028]
Of particular interest are recombinant replication-defective fowlpox viruses and recombinant replication-deficient canarypox viruses for delivering genes encoding GM-CSF to host cells.
[0029]
The structure of a recombinant replication-defective fowlpox virus encoding GM-CSF is disclosed herein. The structure of a recombinant canarypox virus encoding GM-CSF is disclosed in Human Gene therapy 1998 Nov: 9 (17): 2481-92.
[0030]
The recombinant replication-defective virus of the present invention comprises a gene encoding full-length human GM-CSF (GenBank No. M10663) or a mammalian gene encoding GM-CSF.
The present invention is a composition, preferably a pharmaceutically acceptable composition, comprising at least one recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, alone or in combination with an antigen source or an epitope source thereof. The composition may include a conventional adjuvant. Sources of antigens or immunological epitopes thereof include peptides, lipids, lipoproteins, carbohydrates, polysaccharides, lipopolysaccharides, cells, cell fragments, cell extracts, antibodies, anti-idiotype antibodies, apoptotic bodies, etc. But not limited to these. The source of the antigen or epitope may be isolated from a naturally occurring source, chemically synthesized, or genetically produced. Sources of the genetically produced antigen or its epitope include vectors encoding at least one antigen or its epitope, and the like. Cell sources of antigens or immunological epitopes thereof include bacteria, fungi, yeasts, protozoa, viruses, tumor cells, APCs, dendritic cells (DCs), DC-tumor cell fusions, etc., as well as at least one Includes, but is not limited to, cells transfected with or transduced with a gene encoding an antigen or an epitope thereof.
[0031]
In one specific embodiment, the antigen source is one or more incorporated into a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF to co-express one or more antigens with GM-CSF. Provided by one or more genes encoding more antigens or immunological epitopes thereof. Of particular interest are genes encoding tumor antigens or tumor-associated antigens.
[0032]
In another embodiment, a composition comprises a recombinant replication-defective avipoxvirus encoding GM-CSF and a source of antigen, alone or with a conventional adjuvant.
[0033]
The present invention relates to a method for producing at least one recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, alone or at least one vector encoding an antigen or an epitope thereof and / or encoding one or more immunostimulatory molecules. And a composition, preferably a pharmaceutically acceptable composition, comprising in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
[0034]
In another embodiment, the composition comprises a recombinant replication-defective avipoxvirus encoding GM-CSF in combination with a vector encoding at least one antigen or immunological epitope thereof. Vectors for use in providing the gene (s) encoding an antigen having utility or immunological epitopes thereof in the present invention include, in mammalian host cells, preferably human cells, Included are any vectors that can cause functional expression of one or more gene products. Vectors useful in providing the gene encoding the antigen include, but are not limited to, viral vectors, nucleic acid-based vectors, and the like, including poxviruses, herpesviruses, adenoviruses, alphaviruses, retroviruses , Picornavirus, iridovirus, and the like, but are not limited thereto. Poxviruses that have utility in providing a gene encoding an antigen and / or a gene encoding an immunostimulatory molecule include replicating and non-replicating vectors.
[0035]
In one aspect, the composition comprises a recombinant replication-defective fowlpox encoding GM-CSF in combination with a recombinant fowlpox encoding at least one antigen or epitope thereof, alone or in combination with one or more. Includes in combination with the gene encoding the molecule. In another embodiment, the composition comprises a recombinant replication-defective avipox encoding GM-CSF in combination with a recombinant replication-defective avipox encoding at least one antigen and encoding a B7 molecule. In another embodiment, the recombinant replication-defective avipoxvirus encoding at least one antigen also encodes a plurality of costimulatory molecules, for example, B7 / LFA-3 / ICAM-1. The extent of the immune response to the antigen, epitope, or cell expressing the antigen, which is caused by the administration of the composition of the invention, is achieved by using recGM-CSF in combination with the recombinant virus encoding the antigen. Much larger than the response.
[0036]
As used herein, a target antigen refers to an antigen or an immunological on an antigen that is essential in immune recognition and ultimate elimination or control in a disease-causing agent or disease-state mammal. Is an epitope. Immune recognition can be cellular and / or humoral. In the case of an intracellular pathogen or cancer, the immune recognition is preferably a T lymphocyte response.
[0037]
Target antigens include antigens associated with a pre-neoplastic or hyperplastic condition. The target antigen may be associated with or cause cancer. Such target antigens may be tumor cells, tumor-specific antigens, tumor-associated antigens (TAAs) or tissue-specific antigens, their epitopes, and their epitope agonists. Such target antigens include carcinoembryonic antigen (CEA) such as CAP-1, CAP-1-6D (46) (GenBank Accession No. M29540) and its epitopes, MART-1 (Kawakami et al, J Exp. Med. 180: 347-352, 1994), MAGE-1 (U.S. Patent No. 5,750,395), MAGE-3, GAGE (U.S. Patent No. 5,648,226). Natl'l Acad. Sci. USA 91: 6458-6462, 1992), MUC-1, MUC-2, point-mutated ras oncogene, normal p53 and point-mutated p53 oncogene)), GP-100 (Kawakami et al. (Hollstein et al Nucleic Acids Res 22: 3551-3555, 1994), PSMA (Israeli et al Cancer Res. 53: 227-230, 1993), tyrosinase (Kwon et al PNAS 84: 7473-7777, 1987), TRP-1 (gp75) (Cohen). et al Nucleic Acid Res. 18: 2807-2808, 1990; U.S. Patent No. 5,840,839), NY-ESO-1 (Chen et al PNAS 94: 1914-1918, 1997), TRP-2. (Jackson et al EMBO J. 11: 527-535, 1992), TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2 / neulc-erb / B2 (U.S. Patent No. 5,550,214), BRC-I, B C-II, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, TAA modifications and tissue specific antigen, splice variants of TAA, epitope agonists, and the like, but is not limited to such. Other TAAs are described in US Pat. S. Patent No. No. 4,514,506 can be identified, isolated and cloned by methods known in the art. Target antigens also include one or more growth factors and their respective splice variants.
[0038]
Potential human tumor and tissue-specific antigens and their immunological epitopes for targeting using the present invention include those exemplified in Table 1, including Is not limited.
[0039]
[Table 1]

[0040]
Target antigens include HIV (Korber et al, eds HIV Molecular Immunology Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico 1977), influenza, Herpes simplex virus, human herpes virus, simple herpes virus, U.S. Pat. , Hepatitis B (US Patent No. 5,780,036), hepatitis C (US Patent No. 5,709,995), viruses including EBV, cytomegalovirus (CMV), etc. May be associated with, derived from, or isolated from a pathogenic microorganism.
[0041]
Target antigens include Chlamydia (U.S. Pat. No. 5,869,608), Mycobacteria, Legionella, Meningiococus, Group A Streptococcus, and Streptococcus (Streptomyces). , Listeria, Hemophilus influenzae (U.S. Patent No. 5,955,596), related to, derived from, or isolated from pathogenic bacteria. It may be any of those.
[0042]
Target antigens include Aspergillus, invasive Candida (U.S. Patent No. 5,645,992), Nocardia, Histoplasmosis, Cryptosporadia, and the like. And any of those related to, derived from, or isolated from pathogenic yeast.
[0043]
Target antigens include Pneumocystis carinii, Trypanosoma, Leishmania (U.S. Patent No. 5,965,242), Plasmodium (U.S. Patent No. 5,589, 343) and Toxoplasma gondii, including, but not limited to, those associated with, derived from, or derived from, pathogenic protozoa and pathogenic parasites It may be any of those isolated from parasites.
[0044]
Immunostimulatory molecules as used herein include costimulatory molecules: B7, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, VCAM-1, OX-40L, and the like, and Including, but not limited to, IL-2, TNFα, IFNγ, IL-12, RANTES, MIP-1α, F1t-3L (U.S. Patent No. 5,554,512; 5,843,423). Including but not limited to cytokines and chemokines.
[0045]
The gene sequence of mouse B7.1 is disclosed in Freeman et al. (J. Immunol. 143: 2714-2722, 1989), and accession no. X60958. The gene sequence of mouse B7.2 is disclosed in Azuma et al. (Nature 366: 76-79, 1993) and is described in GENBANK under accession no. L25606 and MUSB72X.
[0046]
Human homologs of mouse B7 costimulatory molecules include CD80, homologs of mouse B7.1, and homologs of CD86, B7.2. The gene sequence of human B7.1 (CD80) was obtained from Genbank at Accession No. M. No. 27533, and the gene sequence of human B7.2 (CD86) has the accession no. U04343 and AF099105.
[0047]
The gene for mouse ICAM-1 is available from GenBank under Accession No. X52264, and the gene for the human ICAM-1 homolog (CD54) has accession no. It is disclosed as J03132.
[0048]
The gene for mouse LFA-3 is available from GenBank under Accession No. X53526, and the gene for the human homolog is described in Accession No. It is disclosed as Y00636.
[0049]
The gene for mouse 4-1BBL is available from GenBank under Accession No. It is disclosed as U02567. The gene for the human homolog, hu4-1BBL, is available from GenBank under Accession No. U03397.
[0050]
The immunostimulatory molecule can be provided by a recombinant vector encoding the immunostimulatory molecule alone, or in combination with a nucleic acid sequence encoding the target antigen. In another embodiment, the composition comprises a recombinant vector encoding a target antigen and encoding a plurality of costimulatory molecules, B7 / ICAM-I / LFA-3 (TRICOM), and a recombinant replication encoding GM-CSF. -Provided in combination with a defective virus.
[0051]
Conventional adjuvants as used herein include alum, Ribi DETOX^TM, Freund's adjuvant, Freund's complete adjuvant, QS21, etc., but are not limited thereto.
[0052]
Diseases can be treated or prevented by using the present invention, and include diseases caused by viruses, bacteria, yeast, parasites, protozoa, cancer cells, and the like. Recombinant replication-defective viruses encoding GM-CSF can be used as pan-immune enhancers and as such have utility in treating diseases of unknown etiology.
[0053]
Proneoplastic or hyperplastic conditions that can be treated or prevented using the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF of the present invention include colon polyps, Crohn's disease, ulcerative colitis, mammary gland Includes, but is not limited to, preneoplastic or hyperplastic conditions such as lesions.
[0054]
Cancers that can be treated using the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF of the present invention include primary or metastatic melanoma, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, thymoma , Lymphoma, sarcoma, lung cancer, liver cancer, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, leukemia, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colon cancer, multiple myeloma, neuroblastoma, NPC, bladder Cancer, cervical cancer, and the like, but are not limited to these.
[0055]
Some uses of the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF are outlined in Table 2.
[0056]
[Table 2]

[0057]
The present invention provides a method for enhancing an immune response using a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF to recruit antigen presenting cells into an injection site. Further, the method provides for the enhancement of regional lymph nodes by antigen presenting cells.
[0058]
The method of the invention provides for an enhanced immune response to the target antigen or its epitope.
The invention also encompasses a method of treating or preventing a disease caused by a pathogenic microorganism or cancer using a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, alone or with an antigen source.
[0059]
In a method of treatment, administration of the recombinant vector of the present invention may be for either a "prophylactic" or "therapeutic" purpose. When provided prophylactically, the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF of the present invention may be provided alone or prior to any symptoms, or may be administered simultaneously or prior to administration of the antigen source. Before offered. Prophylactic administration of the recombinant vector functions to prevent or ameliorate any subsequent infection or disease. When provided therapeutically, the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is provided at or after the onset of infection or disease symptoms. Thus, the invention can be provided prior to predicted exposure to a disease-attractant or disease state, or after the onset of an infection or disease.
[0060]
The term “unit dose” when referring to an inoculum refers to physically discrete units suitable as unitary doses for mammals, each unit providing the desired adjuvant or immunogenic effect. A predetermined amount of the recombinant vector, calculated to produce, is included with the required diluent. Details regarding the novel unit dose of the inoculum of the invention are dictated by and dependent on the unique properties of the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF and the specific adjuvant and the immunogenic effects to be achieved. I do.
[0061]
The inoculum is typically prepared as a solution in an acceptable (acceptable) diluent, such as a saline solution, phosphate-buffered saline solution or other physiologically acceptable diluent, and is used to prepare the aqueous pharmaceutical composition. Form.
[0062]
The routes of inoculation include scarification, intravenous (IV), intramuscular (IM), subcutaneous (SC), intradermal (ID), intraperitoneal ( IP), intratumoral, local, intranodal, intranasal, intraarterial, intravesical, etc., whereby APC migration into the injection site and local lymph nodes and Causes enhanced APC function to improve the immune response to disease inducers. The dose is administered at least once. Subsequent doses can be administered as indicated.
[0063]
In one example, the host is immunized at least once with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF to generate an optimal concentration of APC at the target site. Subsequent immunizations are provided by one or more antigens or epitope sources. In another example, the host is a protein, peptide, polysaccharide, lipid, lipoprotein, lipopolysaccharide, antibody, anti-idiotype antibody, cell, cell fragment, cell extract, apoptotic body, attenuated virus or inactivated. It is first immunized with a source of antigen, such as a virus, followed by administration of a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF. In another embodiment of the present invention, a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is administered simultaneously with the antigen or epitope source. Conventional adjuvants can optionally be provided.
[0064]
In another embodiment, the host is immunized at least once as a first dose with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF. The boost dose can include any recombinant vector encoding GM-CSF, preferably a recombinant virus encoding GM-CSF. The second recombinant vector encoding GM-CSF may be either replication-competent or replication-deficient. In one example, the initial antigen dose is provided by a replication-defective recombinant avipoxvirus encoding GM-CSF, followed by a boost dose of replication-competent recombinant vaccinia virus encoding GM-CSF. Such a heterologous prime-boost scheme minimizes or reduces the host anti-vector immune response as known in the art by multiple injections of the recombinant vaccinia vector. Variations on the first-boost method are included within the scope of the present invention. For example, a replication competent vector encoding GM-CSF can be provided as an initial dose, followed by one or more injections of a replication-defective virus encoding GM-CSF. The vector can also provide a gene encoding one or more antigens, with or without a gene encoding one or more immunostimulatory molecules.
[0065]
Recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF was used for diphtheria-tetanus-pertussis (DPT) tetanus-pertussis (Td), DtaP, Haemophilus influenza (Hib) vaccine, DTaP-Hib vaccine, DTaP-. IPV-Hib vaccine, mumps-measles-rubella (MMR) vaccine and hepatitis A vaccine, hepatitis B vaccine, Lyme disease vaccine, influenza vaccine, meningococcal polysaccharide (tetravalent A, C, W135 and Y) Vaccines, including, but not limited to, standard pediatric vaccines such as pneumococcal polysaccharide vaccine (23 valency), anthrax vaccine, cholera vaccine, plague vaccine, yellow fever vaccine, Bacillus Calmette-Guerin vaccine, etc. Provide in combination Can be.
[0066]
When providing the recombinant vector of the present invention to a mammal, preferably to a human, the dosage form of the administered recombinant vector depends on the age, weight, height, sex, general medical condition of the mammal, It will vary depending on factors such as previous medical history, disease progression, and tumor burden. In general, it can be administered in lower or higher volumes, but will not exceed about 10 per mammal, preferably human.⁵~ About 10¹⁰It is preferred to give the recipient a dosage form of a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF within the range of plaque forming units.
[0067]
The genetic definition of tumor-associated and tumor-specific antigens allows the development of targeted antigen-specific vaccines for cancer treatment. Combining a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF with a recombinant vector encoding a tumor-associated antigen or a tumor-specific antigen, a specific immune response for prophylaxis in prevention in individuals at increased risk of developing cancer (Prophylactic immunization) to shrink tumors prior to surgical treatment, prevent disease recurrence after primary surgical treatment (anti-metastatic vaccination), or cytotoxic lymphocytes in vivo. It is a powerful system that increases the number of spheres (CTLs), thereby improving their effectiveness in the eradication of spread tumors (treatment of established diseases). Autologous lymphocytes (CD8⁺), Cytotoxic T lymphocytes and / or CD4⁺Patients who generate either helper T cells or NK cells ex vivo against a specific tumor antigen and retain the tumor in combination with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF together with the tumor antigen source Can be transplanted again (adoptive immunotherapy).
[0068]
In cancer treatment, a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is introduced into a mammal prior to any evidence of cancer, or provides for a reduction in disease in a mammal afflicted with cancer. Can be introduced to
[0069]
Depending on the disease or condition to be treated and the method of treatment, the source of the antigen, such as a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding the target antigen or its immunological epitope, may comprise one or more costimulatory molecules, preferably B7 Alternatively, it may further include a gene encoding B7 / ICAM-1 / LFA-3. The target antigen or its immunological epitope can be provided by a host cell infected with the recombinant vector or by a tumor cell that expresses the tumor-associated antigen or its epitope endogenously. An exogenous gene encoding an exogenous tumor-associated antigen can be provided if the tumor-associated antigen is not present, is not expressed, or is expressed at low levels in the host cell. In addition, genes encoding several different tumor-associated antigens can be provided.
[0070]
The amount of recombinant vector encoding one or more tumor-associated antigens (TAAs), optionally encoding multiple costimulatory molecules, in combination with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF to be administered is , Based on the titer of the virus particles. The preferred range of immunogen to be administered is 10 per mammal, preferably human.⁵-10¹⁰Virus particles. If the mammal to be immunized already suffers from a cancer or metastatic cancer, the vaccine can be administered in combination with other therapeutic treatments. In addition, the recombinant replication-defective virus itself can encode one or more TAAs as well as GM-CSF.
[0071]
In one method of treatment, a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is administered to a patient with cancer in vivo, and autologous cytotoxic or tumor-infiltrating lymphocytes are treated with blood. , Lymph nodes, tumors and the like. Lymphocytes are expanded in culture and target antigen-specific lymphocytes are expanded by culturing in the presence of specific target antigens and APCs pulsed with either antigen presenting cells or target antigens. The target antigen-specific lymphocytes are then reinjected back into the patient.
[0072]
After immunization, the efficacy of the vaccine can be assessed by the production of antibodies or immune cells that recognize the antigen, as assessed by specific lytic activity or specific cytokine production, or by tumor regression. Those skilled in the art will be aware of conventional methods for evaluating the parameters described above.
[0073]
In one aspect of this method of improving antigen-specific T-cell responses, a mammal, preferably a human, is combined with the rF- or rV-HIV-1 epitope / B7-1 / ICAM-1 / LFA-3 construct. Immunization with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF. The efficacy of the treatment can be monitored in vitro and / or in vivo by measuring target antigen-specific lymphocyte proliferation, target antigen-specific cytolytic response, cytokine production, clinical response, etc. .
[0074]
Methods for improving antigen-specific T cell responses can be used for any target antigen or immunological epitope thereof. Of particular interest are tumor associated antigens, tissue specific antigens and antigens of infectious agents.
[0075]
In addition to administering to the patient the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, other foreign immune modulators or immunostimulatory molecules, chemotherapeutic agents, antibiotics, antifungals, antivirals And the like, alone or in combination, can be administered depending on the condition to be treated. Examples of other exogenously added substances include exogenous IL-2, IL-6, α-, β- or γ-interferon, tumor necrosis factor, Flt-3L, cyclophosphamide, cisplatin, ganciclovir. , Amphotericin B, 5 fluorouracil, leucovorin, CPT-11, and the like, and combinations thereof.
[0076]
Recombinant avian poxvirus expressing GM-CSF (Avipox) was examined for its ability to produce biologically active GM-CSF in vivo. Recombinant fowlpox virus (F) and canarypox virus (ALVAC) expressing GM-CSF were administered as a single subcutaneous (sc) injection and the local lymph node draining injection site was injected at different times Cellular, phenotypic and functional changes at points were examined. Changes in local lymph nodes were compared to the administration of four daily doses of recGM-CSF. The results show that with a single injection of any of the recombinant Avipox-GM-CSF viruses, within the draining lymph nodes, (i) lymphadenopathy and (ii) class II-expression and professional APC (CD11c)⁺/ I-Ab⁺Was shown to have been caused. When lymph nodes from mice injected with avipox-GM-CSF were used in in vitro mixed lymphocyte cultures, higher levels of T-cell priming and more potent allospecific lysis resulted. This indicates the presence of a higher number of functional APCs in those sections. Time-course studies showed that the cellular / phenotypic and functional changes occurring in the local nodes of mice injected with the recombinant Avipox-GM-CSF virus persisted for 21-28 days. Furthermore, upon repeated injection (3 ×) of avipox-GM-CSF recombinant virus, the total number of class II-expressing lymph node cells was increased after each injection, regardless of the presence of anti-avipox antibody titers in mouse serum. Increased.
[0077]
The present invention also provides that GM-CSF administered in a recombinant avipoxvirus or as a recombinant protein can function as a biological adjuvant in a vaccine protocol designed to generate host immunity to its own tumor antigens I checked it. Autologous tumor antigens are CEA, M_r 180,000-200,000 glycoproteins, an attractive target for immunotherapy due to their overexpression on a large percentage of human adenocarcinomas (colon, pancreas, breast, lung) (26, 27). Since no CEA homolog has been identified in rodents, mice expressing human CEA as a transgene (28-30) have been used to study different vaccine strategies (31). In the present invention, avipox-CEA immunized CEA. Tg mice developed CEA-specific cellular immunity that could be improved by adding GM-CSF as either a recombinant avipoxvirus or a recombinant protein. CEA. Based on the relative strength of the CEA-specific cellular response in Tg, a single injection of avipox-GM-CSF virus was a more potent biological adjuvant than multiple daily injections of recGM-CSF. In an immunotherapy protocol, complete regression of CEA-positive tumors following immunization of Avipox-CEA in combination with either Avipox-GM-CSF or recGM-CSF resulted in CEA. Observed in 30-40% of Tg mice. In addition, those tumor-free mice were protected from subsequent tumor challenge. This finding suggests that recombinant avipoxviruses expressing GM-CSF can deliver sustained levels of GM-CSF to the site of immunity, and that it can be used to express recombinant avipox virus expressing relatively weak autoantigens. It has been shown for the first time that it can be used in combination with poxviruses to enhance host immunity and produce enhanced anti-tumor immunity.
[0078]
The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF of the present invention is useful in methods of stimulating enhanced humoral responses both in vivo and in vitro. Such an improvement in humoral response may be monoclonal or polyclonal in nature. Improvement of humoral response is due to CD4⁺ Increased activity by T cells, increased proliferation and / or increased cytokine secretion, increased proliferation or increased antibody production by B cells, increased antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), increased complement-mediated lysis, etc. Can be checked. Antibodies raised using the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF of the present invention have higher affinity and / or avidity and higher titer than antibodies raised by standard methods. Expected to have. Antibodies raised by the method using a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF can recognize an immunodominant or non-dominant target epitope.
[0079]
The present invention further includes one or more antibodies raised by immunizing a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF in combination with the antigen source of the present invention. An antibody has specificity for, and reacts with or binds to a target antigen of interest or its immunological epitope. In this aspect of the invention, the antibodies are naturally monoclonal or polyclonal.
[0080]
Exemplary antibody molecules are intact immunoglobulin molecules, substantially intact immunoglobulin molecules, or F (ab), F (ab '), F (ab') in the art.₂And a portion of an immunoglobulin molecule that contains an antigen binding site that includes a portion of the immunoglobulin molecule known as F (v). Polyclonal or monoclonal antibodies can be made by methods known in the art (Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 495-497; Campbell "Monoclonal Antibody Radiation Technology Promotion, the Promotion of Pharmaceutical Technology, Therapeutics Promotion Technology). in Burdon et al. (eds.) (1985) "Laboratory Technologies in Biochemistry and Molecular Biology," Volume 13, Elsevier Science Publishers, Publishers. Antibodies or antigen-binding fragments can also be produced by genetic engineering. Both the heavy and light chain genes were E. coli. Techniques for expression in E. coli are the subject of PCT patent applications: Publication Nos. WO 901443, WO 901443 and WO 9014424, and Huse et al. ((1989) Science 246: 1275-1281).
[0081]
In one embodiment, the antibodies of the invention are used in an immunoassay to detect a novel antigen of interest in a biological sample.
In one embodiment, a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is produced by immunizing in combination with a recombinant virus expressing TAA and expressing B7-1, ICAM-1 and LFA-3. Using the antibodies of the present invention, the presence of TAA from a tissue biopsy of a mammal afflicted with a TAA-expressing cancer is assessed using immunocytochemistry. Such assessment of the delineation of TAA antigens in diseased tissue can be used to predict disease progression or the effectiveness of immunotherapy in a mammal afflicted with the disease. In this aspect, examples of TAAs include, but are not limited to, CEA, PSA, and MUC-1. Conventional methods for immunohistochemistry are described in the following publications (Harrow and Lane (eds) (1988) In "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; New York, NY). (Eds) (1987) In Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons (New York, New York).
[0082]
In another embodiment, the antibodies of the invention are used for immunotherapy. The antibodies of the present invention can be used in passive immunotherapy.
In providing a patient with an antibody or antigen-binding fragment for a recipient mammal, preferably a human, the dosage form of the administered antibody or antigen-binding fragment depends on the mammal's age, weight, height, sex, general It may vary depending on factors such as medical condition, past medical condition, etc.
[0083]
The antibody or antigen-binding fragment of the invention is administered to the recipient subject in an amount sufficient to prevent, reduce or attenuate the severity, extent or duration of the disease or infection. Is contemplated.
[0084]
Anti-idiotypic antibodies usually arise during the course of an immune response, with portions of the anti-idiotypic antibody resembling the epitope that induced the initial immune response. In the present invention, the immunoglobulin gene or a part thereof of an antibody whose binding site reflects a target antigen in a disease state is contained in the genome of the virus genome or a part thereof, alone or in combination with a gene of a plurality of immunostimulatory molecules or a part thereof. Incorporated in combination. The resulting recombinant virus can elicit an enhanced cellular and humoral immune response to the antigen used in combination with the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF.
[0085]
The present invention provides host cells infected with a recombinant replication-defective virus that encodes GM-CSF and expresses GM-CSF in the surrounding environment (mileau). The host cell can also express one or more endogenous target antigens or immunological epitopes thereof, or can be provided by a second recombinant vector, one or more exogenous foreign targets. It can also be engineered to express the antigen or its immunological epitope. Recombinant vectors encoding one or more target antigens or immunological epitopes thereof may have exogenous nucleic acid sequences encoding one or more costimulatory molecules and / or cytokines.
[0086]
The host cells of the present invention include, but are not limited to, tumor cells, PBMCs, antigen presenting cells such as dendritic cells, skin or muscle cells, and the like. Antigen presenting cells include, but are not limited to, monocytes, macrophages, dendritic cells, progenitor dendritic cells, Langerhans cells, splenocytes, B-cells, tumor cells, muscle cells, epithelial cells, etc. .
[0087]
In one embodiment, the host cell is a tumor cell, wherein the tumor cell is exposed to a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF in situ or in vitro to express GM-CSF by the tumor cell and Secretion is triggered. The tumor cells can express an endogenous target antigen, or the tumor cells can be further genetically engineered using a recombinant vector to express a target antigen, such as TAA or its immunological epitope. And can optionally express one or more immunostimulatory molecules. Tumor cells expressing GM-CSF provided by the recombinant replication-defective virus together with endogenously or exogenously provided TAA, and optionally expressing one of a plurality of immunostimulatory molecules, It is administered to a mammal afflicted with cancer in an amount effective to cause tumor reduction or elimination in the mammal.
[0088]
In one embodiment, the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is injected directly inside the tumor in situ, for example, into melanoma or into metastatic breast cancer skin lesions. The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF can also be administered in situ during surgical procedures for cancer, such as colorectal and pancreatic cancer. In addition to providing a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, a vector encoding one or more immunostimulatory molecules can be provided to enhance an anti-tumor response. In one embodiment, the vector is a recombinant avipox encoding B7.1 or a recombinant avipox encoding B7.1 / LFA-3 / ICAM-1. In another embodiment, the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is administered in combination with a cytokine such as IL-12 or a vector encoding IL-12.
[0089]
In another embodiment, the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is provided by intralymph node-injection. The lymph node site may be remote from or draining from the tumor site. The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF can be provided alone or in combination with a target antigen or an immunological epitope thereof or a recombinant vector encoding a target antigen or an immunological epitope thereof. . The recombinant vector encoding the target antigen or its immunological epitope can further encode one or more immunostimulatory molecules. In one embodiment, the combination therapy comprises a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF and a recombinant vector encoding a target antigen or immunological epitope thereof, and further encoding a costimulatory molecule B7.1. included. In another embodiment, the recombinant vector encoding the target antigen or immunological epitope thereof and further encoding B7.1 / LFA-3 / ICAM-1 is a recombinant replication-deficient encoding GM-CSF Provided intranodally in combination with the virus.
[0090]
Tumor cells can be produced using a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, alone or in combination with a recombinant vector encoding at least one or more immunostimulatory molecules for use as a vaccine. , Ex vivo. In one example, the recombinant vector is a recombinant avipox encoding B7.1. In another aspect, the recombinant vector encodes B7.1 / LFA-3 / ICAM-1. In another example, the recombinant vector encodes a cytokine such as gamma or alpha interferon. The tumor cells can be from the same patient (autologous) or from a cell line (one or more) from a different patient (allogeneic). Administration of the tumor cells of the present invention provides an anti-tumor immune response to the individual. Tumor cells can be given subcutaneously, intradermally, intravenously, and the like.
[0091]
The present invention also provides for exogenous replication of dendritic cells, dendritic cells (DCs), DC subpopulations, and recombinant replication-defective viruses in which GM-CSF has a nucleic acid sequence encoding GM-CSF. Provided are those derivatives that express the provided GM-CSF. APCs, such as progenitor dendritic cells and dendritic cells, can also express one or more endogenous target antigens or their immunological epitopes, or exogenous target antigens can be provided by recombinant vectors. can do. The recombinant vector may further encode one or more costimulatory molecules. In one embodiment, dendritic cells are infected with a replication-defective virus encoding GM-CSF and a recombinant vector encoding at least one target antigen. In another embodiment, dendritic cells are infected with a replication-defective virus encoding GM-CSF and with a recombinant avipox encoding at least one target antigen and encoding B7.1. In yet another embodiment, dendritic cells are infected with a replication-defective virus encoding GM-CSF and a recombinant avipox encoding a target antigen and encoding B7.1 / LFA-3 / ICAM-1. The present invention further provides for vaccination and immunotherapeutic responses to one or more target cells, target antigens and their immunological epitopes in activating T cells in vivo or in vitro. A method for using APC is provided.
[0092]
Progenitor dendritic cells isolated from a source infected with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF alone or in combination with a recombinant vector encoding B7 or B7 / LFA-3 / ICAM-1; An APC, such as a dendritic cell, a DC subpopulation, and derivatives thereof, is prepared by converting at least one peptide, protein, antibody, target cell, target cell lysate, cell extract, target cell membrane, apoptotic body, target antigen, or The species is pulsed or incubated with its immunological epitope or with the RNA or DNA of at least one target cell and in an amount sufficient to activate an associated T cell response in vivo. Can be administered. In another embodiment, the antigen-presenting progenitor dendritic cells and dendritic cells further express at least one foreign target antigen or an immunological epitope thereof.
[0093]
The host cell is 10³-10⁹It can be provided in a range of cells. Routes of administration that can be used include intravenous, subcutaneous, intralymphatic, intratumoral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, rectal, vaginal, intranasal, oral, transvesical instillation, and the like.
[0094]
In one embodiment, the GM-CSF expressing antigen presenting progenitor dendritic cells or dendritic cells are exposed to a target cell, a target cell lysate, a target cell membrane, a target antigen or an immunological epitope thereof, or at least one. Exposed in vitro with DNA or RNA from two target cells and incubated with primed or nonprimed T cells to activate the corresponding T cell response in vitro. The activated T cells alone or in combination with the precursor DCs or DCs are then administered to a species such as a human for vaccination or immunotherapy against target cells, target antigens or immunological epitopes thereof. I do. In one method of use, precursor dendritic cells or dendritic cells are advantageously used to elicit an immunotherapeutic growth inhibitory response to cancer cells.
[0095]
In another embodiment, a GM-CSF expressing antigen-presenting cell, preferably a precursor DC or DC, is fused with a target cell expressing a corresponding target antigen or an immunological epitope thereof, and the APC and the target cell are isolated by known methods. Heterokaryon (Gong, J. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6279-6283, 1998). Such fusion cells or chimeric APC / target antigen cells express both GM-CSF and the target antigen or their immunological epitopes. APCs can also be infected with a recombinant vector encoding at least one costimulatory molecule, preferably encoding B7.1 or B7.1 / LFA-3 / ICAM-1. In a preferred embodiment, the target cells are hyperplastic, pre-malignant or malignant cells. Chimeric APC / target antigen cells can be used both in vivo and in vitro to enhance the immune response of T and B lymphocytes.
[0096]
Precursor dendritic cells are obtained from bone marrow, peripheral blood, and lymph nodes from the patient. The patient may have been previously vaccinated or may have been treated with a compound such as Flt-3L to increase the number of antigen-presenting cells. Dendritic cells are found in any tissue, such as the epidermis of the skin (Langerhans cells), and in lymphoid tissues, such as those found in the spleen, bone marrow, lymph nodes, and thymus, and in the circulatory system, including blood and lymph. (Veiled cells). Cord blood is another source of dendritic cells.
[0097]
Dendritic cells are derived from U.S.A. S. Patent No. Methods known in the art, such as those described in US Pat. No. 5,788,963, can be augmented or isolated for use in the present invention. Once the progenitor dendritic cells, dendritic cells and their derivatives are obtained, they can be cultured under appropriate culture conditions to expand the cell population and / or optimize infection, transfection, Alternatively, cells are maintained in a condition for transduction and optimal target antigen uptake, processing, and presentation. Particularly advantageous for maintaining the proper state of maturation of dendritic cells in in vitro culture is that both granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) are present. That is. A subpopulation of dendritic cells can be isolated based on maturity based on adhesion and / or cell surface markers. The phenotypes of precursor DCs, DCs and their subpopulations are disclosed in Banchereau and Steinman (Nature 392: 245-252, 1998).
[0098]
In one aspect, GM-CSF and IL-4 are each provided at a concentration of about 500 units / ml for a period of about 6 days. In another embodiment, TNFα and / or CD40 is used to mature the precursor DC or DC.
[0099]
Precursor dendritic cells or dendritic cells can be obtained from the individual to be treated and are themselves autologous with respect to the corresponding HLA antigen, or the cells may be derived from the corresponding HLA antigen (class I and II Both, for example, HLA-A, B, C and DR) can be obtained from an individual as appropriate for the individual to be treated. Alternatively, the progenitor dendritic cells are engineered to express the appropriate and relevant HLA antigens of the treated individual.
[0100]
Precursor dendritic cells and dendritic cells were purchased from U.S.A. S. Patent No. Methods such as EBV-transformation as disclosed in US Pat. No. 5,788,963 can be further genetically modified to extend their lifespan.
[0101]
Dendritic cells and their precursor cells can be provided in the form of a pharmaceutical composition in a physiologically acceptable medium. The composition can further comprise a target cell, a target cell lysate, a target cell membrane, a target antigen or an immunological epitope thereof. The composition can further include cytokines and / or chemokines such as IL-4 and GM-CSF to further synergistically enhance the immune response.
[0102]
Another aspect of the invention is the use of a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF for the prevention or treatment of neutropenia. Neutropenia is a medical term for the abnormally low number of neutrophils in the circulating blood. Neutropenia has many potential causes, including: bone marrow damage from certain types of leukemia, lymphoma or metastatic cancer; adverse reactions to drug therapies such as diuretics or antidepressants; Response to radiation therapy or chemotherapy; presence of an indwelling intravenous (IV) catheter; viral infection such as infectious mononucleosis or HIV infection; bacterial infection such as tuberculosis; autoimmunity such as systemic lupus erythematosus. Disease, congenital abnormalities; reduced phagocytosis, antimicrobial and tumoricidal effects of neutrophils, monocytes and macrophages; nutritional disorders; respiratory, gastrointestinal, or urinary tract complicated by secondary infection Neoplastic occlusion; Individuals with neutropenia are easily and often infected. Most infections occur in the lungs, mouth and pharynx (mucositosis), sinuses and skin. Painful oral ulcers, gum infections, ear infections, and peridontal disease are common. Severe life-threatening infections can result in etiological containment and the need for intravenous antibiotics.
[0103]
The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is useful in a method for preventing or treating neutropenia. The replication-deficient virus encoding GM-CSF provides a rapid and sustained concentration of GM-CSF, which is superior to the administration of naturally occurring or recombinantly produced GM-CSF ( Mangi, MH and Newland, AC 1999, European J. of Cancer Vol. 35; Suppl. 3, pp. S4-S7).
[0104]
A recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF can be provided before (prophylactically) or after the onset of neutropenia. The dose is administered in an amount effective to increase the number of neutrophils, preferably in an amount effective to increase the number of neutrophils to within the normal range. The dose can be provided one or more times.
[0105]
The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF can be provided alone or in combination with another therapy for the treatment of infection, such as antibiotics, antifungals, antivirals, and the like. One or more antibiotics that may be included with the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF in the composition include ceftazidime, cefepime, imipenem, aminoglycoside, vancomycin, anti-pseudomonas β-. Lactams and the like, but are not limited to these. One or more antifungal agents that may be included with the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF in the composition include amphotericin B, dapsone, fluconazole, flucytosine, griseofulvin, intraconazole. ), Ketoconazole, miconazole, clotrimazole, nystatin, combinations thereof, and the like, but are not limited thereto. One or more antiviral agents may be included in the composition along with the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, and the antiviral agent may include 2'-β-fluoro-2 ', Examples include, but are not limited to, 3'-dideoxyadenosine, indinavir, nelfinavir, ritonavir, nevirapine, AZT, ddI, ddC, combinations thereof, and the like.
[0106]
In the case of radiation therapy, chemotherapy or corticosteroid therapy which can cause neutropenia, recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is replaced with radiation, chemotherapy or corticosteroid therapy Can be provided concurrently with the therapy, or the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF can be provided after irradiation, chemotherapeutic, or corticosteroid treatment. The dose of the recombinant replication-deficient virus encoding GM-CSF may be in an amount to maintain a normal number of neutrophils in the blood, or to increase the number of neutrophils, resulting in neutropenia and It is provided in an amount to prevent or inhibit its sequelae. Compositions comprising a recombinant-replication deficient virus encoding GM-CSF may also include a chemotherapeutic agent, a corticosteroid, or a combination thereof.
[0107]
Another aspect of the present invention relates to a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF, for treating myelodysplastic syndrome and cytopenia associated with myelodysplastic syndrome, comprising erythropoietin (EPO) or preferably It is to be used in combination with recombinant erythropoietin (rhEPO). Myelodysplastic syndrome (MDS) is a group of clonal stem cell disorders characterized by abnormal bone marrow differentiation and maturation with quantitative and qualitative abnormalities within one or more hematopoietic cell lines in peripheral blood It is. The standard treatment for these individuals is supportive patient management with allogeneic bone marrow transplantation in blood products, antibiotics, and selected younger individuals. Stasi, R. et al. Reported the use of recombinant GM-CSF (rec GM-CSF) in combination with erythropoietin to treat cytopenia in patients with MDS (British J. Haematology, 1999, 105, 141-148). However, rhGM-CSF is associated with significant side effects. In the present invention, a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is used in combination with EPO instead of rec GM-CSF to treat cytopenia associated with MDS. The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is⁵~ About 10¹⁰ It is administered at a dose in the range of pfu and is provided in one or more divided doses. EPO is administered at a dose in the range of about 150-300 u / kg body weight and is provided in multiple doses. The combined doses are effective in preventing or treating neutropenia, increasing hemoglobin levels and / or reducing the need for transfusion in individuals with MDS. The use of weekly or monthly infusions of replication-defective virus encoding GM-CSF alleviates the need to administer the GM-CSF protein daily.
[0108]
GM-CSF has also been shown to be useful as an adjuvant for immunotherapy with bispecific antibodies in cancer patients (Elsasser, D. et al European J. Cancer, Vol. 35, Suppl. 3, pp. S25-S28, 1999). In the present invention, the recombinant replication-deficient virus encoding GM-CSF has an excellent adjuvant effect when combined with a bispecific antibody that alleviates the need to administer the recombinant GM-CSF protein daily. Substitute for GM-CSF. Bispecific antibodies are chemically or genetically-constructed molecules that combine the specificity for a tumor cell antigen / epitope with the reactivity to a cytotoxic trigger molecule found on immune effector cells. The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is approximately 10⁵~ About 10¹⁰ It is provided in multiple doses in the pfu dose range. The bispecific antibody is about 0.2-200 mg / m²And is provided in multiple doses, for example, weekly, monthly, etc. Classifications for improving immunotherapeutic response include specific lytic activity, specific cytokine production, antibody-dependent cellular cytotoxicity, tumor regression, and protection from tumors. Bispecific antibodies that can be used in combination with the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF include FcγRI (CD64), Fc-γRII (CD32), FcγRIII (CD16), HER-2 / neu , EGF-receptors, CD15 antigens or anti-CD3-directed bispecific antibodies with tumor-directed specificity to EpCAM molecules, including but not limited to (McCall, AM, Adams). , GP, Amoroso, AR, Nielsen, UB, Zhang, L., Horak, E., Simmons, H., Schler, R., Marks, JD and Weinder, L. M. Isolation and characterisation of an ant -CD16 single-chain Fv fragment and construction of an anti-HER2 / neu / anti-CD 16 bispecific scFv that triggers CD16-dependent tumor cytolysis Mol Immunol 36:... 433-445, 1999).
[0109]
The description of the specific embodiments fully describes the general nature of the invention, and others will readily appreciate such specific embodiments for various purposes without departing from the general concept. Could be modified and / or applied to, and consequently, such applications and modifications are intended to be included within the meaning of the disclosed embodiments and their equivalents.
[0110]
All references and patents referred to are incorporated herein by reference.
[0111]
【Example】
Example 1
Production of recombinant virus
The production of a recombinant poxvirus is achieved through in vivo homologous recombination between a poxvirus genomic DNA and a plasmid vector carrying a heterologous sequence to be inserted. Plasmid vectors for insertion of foreign sequences into poxviruses are constructed by standard methods of recombinant DNA technology (Sambrook et al. 1989). Plasmid vectors contain one or more chimeric genes, each of which contains a poxvirus promoter linked to the protein coding sequence and flanked by viral sequences from non-essential regions of the poxvirus genome. The plasmid is transfected into cells infected with the parental poxvirus and recombination between the poxvirus sequence on the plasmid and the corresponding DNA in the viral genome results in the plasmid being transferred into the viral genome. Insertion of the chimeric gene is caused. Recombinant viruses can be generated using any of a variety of selection or screening systems (Mazzara et al, 1993; Jenkins et al, 1991; Sutter et al, 1994, some of which are described below). Selected and purified. Insertion of the foreign gene into the vaccinia genome is confirmed by polymerase chain reaction (PCR) analysis. Expression of the foreign gene is shown by Western analysis.
[0112]
Origin of fowlpox parental virus
The parent fowlpox virus used to make the recombinant was plaque purified from a vial of a poultry vaccine, POXVAC-TC, manufactured by Schering-Plough Corporation and licensed from the USDA. The starting material for the production of POXVAC-TC is a vial of chicken embryo-derived fowlpox vaccine from the Vineland Institute obtained by Schering-Plough. The virus was passaged twice on the chorioallantoic membrane of chicken eggs to produce the master seed virus. The master seed virus was passaged a further 27 times in chicken embryo fibroblasts to prepare POXVAC-TC master seeds. POXVAC-TC master seeds were passaged twice on chick embryo fibroblasts to prepare virus stocks for production of POXVAC-TC product lots. One vial of POXVAC-TC, serial # 96125, was plaque purified three times on primary chicken embryo skin cells.
[0113]
Origin of vaccinia parental virus
The virus was of the strain New York City Board of Health and was obtained from New York City Board of Health by Wyeth, and was passaged in calves to produce smallpox vaccinia species (Smallpox Vaccine Seed). Flow Laboratories received lyophilized vials of smallpox vaccinia seed (Smallpox Vaccine Seed, Lot 3197, passage 28) from Dr. Chanock and Dr. Moss (National Institutes of Health), which received ether from the virus. Then, plaque purification was performed three times.
[0114]
Origin of the modified vaccinia virus Ankara (MVA) parent virus
MVA was derived from the Ankara vaccinia strain CVA (Mayr et al, 1975). Virus attenuation was performed by terminal dilution in chicken embryo fibroblasts (CEFs). After 360 passages, the virus was plaque purified three times and then further passaged into CEFs. After 516 passages, the attenuated CVA virus was renamed MVA. After 570 passages, the virus was again plaque purified and further passaged. Seed virus, passage 575 times, Obtained from Anton Mayr and plaque purified twice on primary chicken embryo skin cells.
[0115]
Production of recombinant poxvirus
For the preparation of rF-muGM-CSF, a plasmid vector named pT5091 (FIG. 1) was constructed, and the exogenous sequence was inserted into the BamHIJ region of the fowlpox genome. The mouse GM-CSF gene is under the control of the vaccinia 40K promoter (Gritz et al, 1990). In addition, E. coli under the control of the fowlpox virus C1 promoter (Jenkins et al, 1991). The E. coli lacZ gene is included as a screen for recombinant progeny. These exogenous sequences are flanked by DNA sequences derived from the BamHIJ region of the fowlpox genome. A plaque purified isolate from the fowlpox POXVAC-TC strain was used as the parental virus for this recombinant vaccine. Generation of recombinant fowlpox virus involves homologous recombination between the fowlpox sequence in the fowlpox genome and the corresponding sequence in pT5091 in fowlpox virus-infected primary chicken embryonic skin cells transfected with pT5091. Was achieved through. Recombinant virus was isolated on a viral plaque, detecting expression of the lacZ gene product in the presence of halogenated indolyl-β-D-galactoside (Bluo-gal), as described previously (Chakrabarti et al, 1985). Performed in situ and identified using a chromogenic assay. Viral plaques expressing lacZ show blue against a transparent background. Positive plaques, designated vT277 (FIG. 4A), were removed from the cell monolayer and their progeny were replated. Four rounds of plaque isolation and replating in the presence of Blue-Gal resulted in purification of the desired recombinant.
[0116]
For the production of rF-huGM-CSF, a plasmid vector named pT5052 (FIG. 2) was constructed to direct the insertion of foreign sequences into the BamHI J region of the fowlpox genome. The plasmid vector pT5052 was transferred to the American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110) on June 15, 2000 under the conditions of the Budapest Treaty. Deposited as PTA-2099. The human GM-CSF gene is under the control of the vaccinia 40K promoter and the lacZ gene is under the control of the C1 promoter. These exogenous sequences are flanked by DNA sequences from the BamHI J region of the fowlpox genome. A plaque purified isolate from the fowlpox POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation) strain was used as the parental virus for this recombinant vaccine. The generation of the recombinant vaccinia virus is via homologous recombination between the fowlpox sequence in the fowlpox genome and the corresponding sequence in pT5052 in fowlpox virus-infected primary chicken embryonic skin cells transfected with pT5052. went. Recombinant virus was identified using a chromogenic assay for the lacZ gene product described above. Viral plaques expressing lacZ show blue against a transparent background. Positive plaques, designated vT215 (FIG. 4B), were removed from the cell monolayer and their progeny were replated. Five rounds of plaque isolation and replating in the presence of Blue-Gal resulted in purification of the desired recombinant.
[0117]
For the generation of a recombinant fowlpox virus named rF-TAA / GM-CSF, which co-expresses tumor-associated antigen (TAA) and GM-CSF, a plasmid vector was constructed to construct the fowlpox virus genome An exogenous sequence was inserted into it. The TAA gene and the GM-CSF gene are under the control of multiple promoters. These foreign sequences are flanked by DNA sequences from the fowlpox virus genome into which the foreign sequences are to be inserted. Generation of recombinant fowlpox virus involves homologous recombination between fowlpox virus sequences in the fowlpox virus genome and the corresponding sequences in the plasmid vector in fowlpox virus-infected cells transfected by the plasmid vector. Is achieved via Recombinant plaques are removed from the cell monolayer under selective conditions as described above, and their progeny are further propagated. Repeated plaque isolation and replating rounds result in purification of the desired recombinant virus (FIG. 5A).
[0118]
For the production of rV-muGM-CSF, a plasmid vector was constructed to direct the insertion of the foreign sequence into the M2L (30K) gene located in the HindIII M region of the vaccinia genome. The mouse GM-CSF gene is under the transcriptional control of the vaccinia 40K promoter, and the lacZ gene is under the control of the C1 promoter. These exogenous sequences are flanked by DNA sequences derived from the Hind III M region of the vaccinia genome. A plaque purified isolate from vaccinia strain Wyeth (New York City Board of Health) was used as the parental virus for this recombinant vaccine. The generation of recombinant vaccinia virus was achieved via homologous recombination between vaccinia sequences in the Wyeth vaccinia genome and the corresponding sequences in the plasmid vector in vaccinia-infected cells transfected with the plasmid vector. Recombinant virus was identified using a chromogenic assay for the lacZ gene product described above. Viral plaques expressing lacZ showed blue against a transparent background. Performing several rounds of plaque isolation and replating results in purification of the desired recombination (FIG. 4C).
[0119]
For the production of rV-huGM-CSF, a plasmid vector named pT5051 (FIG. 3) was constructed to incorporate the exogenous sequence into the thymidine kinase (M) gene located in the Hind III J region of the vaccinia genome. Oriented insertion. The mouse GM-CSF gene is under the transcriptional control of the vaccinia 40K promoter and The E. coli lacZ gene is under the control of the fowlpox virus C1 promoter. These exogenous sequences are flanked by DNA sequences from the Hind III J region of the vaccinia genome. A plaque purified isolate from vaccinia strain Wyeth (New York City Board of Health) was used as the parental virus for this recombinant vaccine. The generation of a recombinant vaccinia virus is achieved via homologous recombination between vaccinia sequences in the Wyeth vaccinia genome and the corresponding sequences in pT5051 in vaccinia-infected cells transfected with pT5051. Recombinant virus is identified using a chromogenic assay for the lacZ gene product described above. Viral plaques expressing lacZ show blue against a transparent background. Recombinant plaques are removed from the cell monolayer under selective conditions, and their progeny are further propagated. Further rounds of plaque isolation and replating result in purification of the desired recombinant virus (FIG. 4D).
[0120]
For the generation of a recombinant vaccinia virus, named rV-TAA / GM-CSF, which co-expresses tumor-associated antigen (TAA) and GM-CSF, a plasmid vector was constructed to construct an exogenous vaccinia genome. Insert a sequence. The TAA gene and the GM-CSF gene are under the control of a poxvirus promoter. These foreign sequences are flanked by DNA sequences from the vaccinia genome into which the foreign sequences are to be inserted. The generation of recombinant vaccinia virus is achieved via homologous recombination between vaccinia sequences in the vaccinia genome and the corresponding sequences in the plasmid vector in vaccinia-infected cells transfected with the plasmid vector. Recombinant plaques are removed from the cell monolayer under selective conditions, as described above, and their progeny are further propagated. Further rounds of plaque isolation and replating result in purification of the desired recombinant virus (FIG. 5B).
[0121]
To create a recombinant MVA that expresses GM-CSF, a plasmid vector is constructed to insert an exogenous sequence into the MVA genome. The GM-CSF gene is under the control of a poxvirus promoter. These exogenous sequences are flanked by DNA sequences from the MVA genome into which the exogenous sequence is to be inserted, such as deletion III (Sutter et al, 1994). The generation of recombinant MVA is achieved via homologous recombination between MVA sequences in the MVA genome and the corresponding sequences in the plasmid vector in MVA-infected cells transfected with the plasmid vector. Recombinant plaques are removed from the cell monolayer under selective conditions and their progeny are further propagated. Further rounds of plaque isolation and replating result in purification of the desired recombinant virus (FIG. 4E). The genomic structure of recombinant MVA co-expressing GM-CSF with tumor-associated antigen (TAA) is shown in FIG. 5C.
[0122]
Example 2
Materials and methods
Animals, cell lines, and reagents
CEA. Tg mouse (H-2^b) (System 2682) is Dr. John Thompson (Institute of Immunobiology, University of Freiburg, Freiburg, Germany) (24). Using a cosmid clone containing the complete coding region of the human CEA gene and including a 3.3 kb 5'-flanking region and a 5 kb 3'-flanking region, CEA. Tg mice were generated (30). CEA protein expression was found predominantly in the gastrointestinal tract, while CEA was also expressed in other sites, such as the trachea, esophagus, small intestine, and lungs. Mice were housed and maintained in microisolator cages under specific pathogen-free conditions. Strains were established from founders by continuous backcrossing with wild-type female B6 mice. CEA-positive progeny were identified by the presence of fecal CEA, detected using a solid phase, dual-determinant anti-CEA ELISA kit (AMDL, Inc. Tustin, CA).
[0123]
MC-38-CEA-2 (H-2^bCEA-expressing MC-38 cells, designated), were produced by transducing the human CEA gene with the retroviral expression vector pBNC (32). Strains were cloned and routinely checked for stable CEA expression by flow cytometry as measured by COL-1 (33) reactivity. Both parental MC-38 and MC-38-CEA-2 cell lines were grown in DMEM containing high glucose and 10% heat inactivated FBS. FDCP-1 cells were kindly provided by Dr. Provided by Jim Ihle (St. Jude's Hospital, Memphis, TN) and 2 mM L-glutamine, 50 μM 2-mercaptoethanol, 10% heat-inactivated FBS, 50 μg / ml gentamicin and 10% WEHI cell culture supernatant Were grown in RPMI 1640 supplemented with Lyophilized recombinant mouse GM-CSF is available from PeproTech, Inc. (Rock Hill, NJ) and stored at -80 ° C until use. Before use, recGM-CSF was reconstituted to an appropriate concentration with saline containing 1% mouse serum. Reconstituted recGM-CSF was also stored at −20 ° C. and its biological activity was checked every 3-6 months using GM-CSF-dependent FDCP-1 indicator cells (34). .
[0124]
Recombinant avian poxvirus
The recombinant avian poxvirus used in this study was a fowlpox and canarypox (ALVAC) virus-based vector. For simplicity, we will refer collectively to recombinant avipoxviruses. The individual recombinant avipox viruses used to generate the data shown in each table and figure are identified as avipox (F)-and avipox (A) for fowlpox and canarypox (ALVAC) vectors, respectively. .
[0125]
Avipox (F) -GM-CSF
The parent virus used for production of rF-GM-CSF (ie, Avipox (F) -GM-CSF) was plaque-produced from a fowlpox virus tissue-culture compatible vaccine strain. Avipox (F) -GM-CSF was constructed between parent fowlpox DNA and a plasmid vector containing the mouse GM-CSF gene via in vivo homologous recombination. Then, Therion Biologics Corp. A seed stock was generated using a recombinant virus made at (Cambridge, MA), which was characterized by genomic and protein expression analysis.
[0126]
Avipox (A)-recombinant
Avipox (A) is a canarypoxvirus-based vector that is restricted to avian species for productive replication (35). The canarypox line was isolated from infected canary pox lesions and attenuated by 200 consecutive passages in chicken embryo fibroblasts and subjected to four consecutive rounds of plaque purification on agarose. did. All amplification and plaque titrations were performed on primary chicken embryo fibroblasts. Avipox (A) -GM-CSF (vCP319), Avipox (A) -Rabies glycoprotein G (named Avipox (A) -RG, vCP65) and Avipox (A) -CEA (vCP248) are available from Virogenetics Corp (Troy, NY). GM-CSF expression was confirmed by bioassay (see below), and CEA expression was confirmed by Western blot analysis using mouse monoclonal antibody COL-1 (32).
[0127]
In vitro GM-CSF production
MC-38 cells were trypsinized and washed twice in serum-free Opti-MEM (Life Technologies Co., Gaithersburg, MD). 4 × 10⁶The cells were placed in a 15 ml conical polypropylene tube and pelleted by centrifugation. The cell pellet was resuspended in 300 μl Opti-MEM, to which 10 μl of either Avipox-GM-CSF virus or an appropriate control virus was added at the given pfu. Infected cells were incubated at 37 ° C for 1 hour and agitated every 10-15 minutes. After the incubation, the cells were washed twice in 10 ml of growth medium with 10% FBS. Viable cells were counted using the trypan blue exclusion method and 3 × 10 6 per well of a 6-well plate⁵Cells were added. Supernatants were collected after 24, 48 and 72 hours and biologically active GM-CSF levels were measured as described above.
[0128]
Regional lymph node analysis
Female C57BL / 6 (B6) mouse (H-2^b) Was obtained from the National Cancer Institute, Frederick Cancer Research and Development Facility (Frederick, MD). Six to eight-week old mice were housed and maintained in microisolator cages under pathogen-free conditions. Recombinant Avipox-GM-CSF virus, the appropriate control virus (ie, F-WT, Avipox-RG) and recombinant GM-CSF protein were administered by subcutaneous injection at the ridge. Hypoiliac, para-aortic and sacral lymph nodes were surgically isolated, cells were mechanically dispersed and transferred to 50 ml conical tubes. They were allowed to stand on ice for 10 minutes, after which the supernatant was collected. Cells are pelleted by centrifugation (500 × g) and ice cold Ca²⁺-Mg²⁺-Washed twice in DPBS free. After the second wash, cells were removed from 0.5-1.0 × 10⁶Ca at a concentration of cells / ml²⁺-Mg²⁺Resuspended in DPBS free. Split them and about 10⁶Cells were treated with 1 μg of FiTc-labeled anti-IA.^b(BALB / c mice, IgG2a, -k) or an appropriate control antibody (PharMingen, Inc., San Diego, CA) for 1 hour at 4 ° C. The sample also contained 1 μg of unlabeled 2.2G2 antibody (CD16) to block the Fc receptor. After incubation, cells were washed twice and analyzed immediately using a Becton-Dickinson FACScan equipped with a blue laser with 15 mW excitation at 488 nm. Data was collected from 10,000 cells using a live gate, stored, and used for analysis.
[0129]
CD11c⁺Cell isolation
From the untreated and treated groups of mice, regional lymph nodes consisting of lower iliac, periaortic and sacral lymph nodes were surgically harvested, pooled, and treated with 15 mM HEPES (pH 7.4) and 10 mM. Placed in RPMI-1640 containing% heat inactivated FBS. Cells were mechanically dispersed through a 70-μm cell stainer, transferred to a 50 ml conical tube, and placed on ice. The cell suspension is washed twice by centrifugation (500 × g) in ice-cold DPBS and 1.5 ml / 10 min at 4 ° C.⁸Cells were incubated in ice-cold DPBS containing biotin-anti-CD11c (clone B-ly6, PharMingen, Inc., San Diego, Calif.). The cells are centrifuged, washed twice in DPBS, and resuspended in 100 μl of streptavidin-conjugated-MACS colloidal super-paramagnetic microbeads (MicroBeads) (Miltenyi Biotec, Inc., Gladbach, Germany), Then, the mixture was incubated at 4 ° C. for 15 minutes. The cells are washed with ice-cold DPBS, pelleted by centrifugation (200 × g) for 10 minutes, and resuspended in 500 μl DPBS. MACS LS⁺The separation column was placed in a MIDI MACS magnetic separator and prepared according to the manufacturer's instructions. The cell suspension was immediately applied onto the column and passed through non-magnetic cells. The column was rinsed three times with 3 ml of buffer and removed from the magnetic separator and MACS⁺The cell fraction was eluted from the column. MACS⁺The cell fraction is concentrated using another application for the column and the MACS⁺The number of cells in the fractions was counted using a hemocytometer and by FACS. Biotin-PE conjugate and anti-A^bFlow cytometry analysis using double staining consisting of -FiTc antibody (clone M5 / 114.15.2, IgG2b) showed> 80% of the MACS + cell fraction to be CD11 c⁺/ I-Ab⁺, CD19⁻And CD3⁻It was shown to be.
[0130]
Mixed lymphocyte culture
Purified spleen BALB / c (H-2) for mixed-lymphocyte reaction^d) T cells were irradiated with C57BL / 6 (H-2)⁶)) Proliferated in RPMI-1640 medium containing 10% heat-inactivated FBS in the presence of lymph node cells (1: 1 ratio). After incubation in T-25 flasks at 37 ° C. for 5 days, viable T cells were recovered from the culture by density centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient and MC-38 (H-2^b) And P815 (H-2^d) Was used in a one-way CTL assay to function as a target.
[0131]
Immunization
CEA. Tg mice were immunized by subcutaneous injection of 100 μl avipox-CEA or avipox-RG near the ridge. Where indicated, recombinant avipox-GM-CSF virus or recGM-CSF was mixed with avipox-CEA prior to injection. The recombinant GM-CSF protein was then administered to the site of immunization daily for 3-4 consecutive days.
[0132]
Serum antibody response
Serum samples were collected from wild-type B6 and CEA. Recovered from Tg and analyzed by ELISA for the presence of antibodies to the appropriate target antigen. Microtiter plates were incubated overnight at 4 ° C. with 100 ng / well of CEA (International Enzymes, Fallbrook, Calif.), OVA (Sigma Chemicals), mouse recGM-CSF or 5 × 10 5⁵ Sensitized with pfu / well ALVAC. Wells were blocked with PBS containing 5% BSA and then incubated for 1 hour with diluted mouse serum (1:10 to 1: 31,250). After incubation, excess liquid was aspirated and the plate was washed 3-5 times with buffer (PBS containing 1% BSA). Antibodies bound to the wells were detected using HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Kirkegaard & Perry Labs., Inc., Gaithersburg, MD) or IgM (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). After a 1 hour incubation, the level of reactivity was detected by adding the chromogen o-phenylenediamine for 10 minutes, and the ELISA microplate autoreader EL310 (Bio-Tek Instruments, Inc., Winoski, VT) was detected. Use A_{490 nm}Was read. Positive controls, negative controls, and triplicates of serum samples were performed for all assays. Positive controls for CEA and ALVAC were mouse IgG2a anti-CEA MAb, COL-1 (35), and polyclonal rabbit anti-ALVAC IgG, respectively, which were developed in the laboratory. A commercially available rat anti-mouse GM-CSF monoclonal antibody (clone MP1-22E9, PharMingen, Inc., San Diego, CA) was used as a negative control in the anti-GM-CSF ELISA assay. The antibody titer is 0.5 A_{490 nm}Was determined as the reciprocal of the resulting serum dilution.
[0133]
T-cell proliferation assay
Mouse splenocytes were enriched for T cells by magnetic mouse pan-B (B220) Dynabeads (Dynal, AS, Oslo, Norway), and by FACS analysis, the resulting cell population was> 95% CD3⁺It was shown that it was. The isolated T lymphocytes were subjected to 15 mM HEPES (pH 7.4), 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate Gentamicin, 50 u / ml, and 50 μM β-mercaptoethanol in RPMI 1640. Assays were performed in each flat-bottomed 96-well plate in a non-immunized syngeneic B6 mouse in the presence of 50 μg / ml CEA (Vitro Diagnostics, Littleton, CO), 50 μg / ml OVA or culture medium. 5 × 10 of origin⁵Consisted of co-culture of irradiated splenocytes (functioning as APC) and 1.5 × 10 purified spleen T lymphocytes. After 5 days in culture, cells were pulsed with [3H] -thymidine (1 μCi / well; Amersham. Corp., Arlington Heights, Ill.) And harvested after 24 hours, and the incorporated radioactivity was determined by liquid scintillation spectroscopy ( Wallac, Inc., Gaithersburg, MD).
[0134]
CTL lines and cytotoxicity assays
Four weeks after the second immunization with avipox-CEA / RG ± avipox-GM-CSF or recGM-CSF, spleens from 2-3 mice / group were pooled and single cell suspension Was prepared. Splenocytes were subjected to 15 mM HEPES (pH 7.4), 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 10 mg / ml gentamicin, 10% heat-inactivated. Suspended in RPMI 1640 supplemented with FBS (Hyclone Laboratories, Logan, UT) and 50 μM 2-ME. 25 × 10 in 10 ml⁶Spleen cells were placed in a T-25 flask at 10 μg / ml CEA._526-533(EAQNTTYL). T cell cultures were harvested on a Ficoll-Hypaque gradient to remove T cells to remove dead cells and erythrocytes, 2 x 10⁵5 × 10 T-cells⁶Irradiated syngeneic splenocytes, 10 μg of CEA_526-533Stimulation was performed twice weekly by incubating in the presence of 1 / ml and 10 U / ml of recombinant human IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA). Cytotoxic activity was determined by CEA after two in vitro stimulations._526-533Or a mouse lymphoma cell line, EL-4, pulsed with either Flu NP 366-374.
[0135]
CTL activity was assessed by modifying the previously described method (36). Overnight indium-111 (¹¹¹In) Release assays were performed. Briefly, 4 × 10⁶The EL-4 target cells of (¹¹¹In) -oxyquinoline (Amersham, Chicago, IL) was radiolabeled with 50 μCi at 37 ° C. for 30 minutes. After labeling the peptide-pulsed target cells, they were incubated with 1 μg peptide / ml. Target cells and effector cells were mixed in the appropriate ratios and incubated at 37 ° C. for 18 hours. Released¹¹¹The amount of In was measured with a gamma counter (Cobra Autogamma, Packard Instruments, Downers Grove, Ill.), And the percent specific lysis was calculated as follows:
% Specific lysis = [(experimental cpm-spontaneous cpm) / (maximum cpm-spontaneous cpm)] x 100. Dissolution unit (LU₃₀) Indicates the number of effector cells required to obtain 30% lysis of 10,000 peptide-pulsed EL-4 cells.
[0136]
Cytokine production assay
T cell lines were⁴At a cell density of cells / well, 5 × 10⁵Irradiation (2000 rad) Syngeneic CEA. Tg mouse splenocytes / well and various concentrations of CEA_526-533Incubated with the peptide in flat bottom 96-well plates. Supernatants were collected after 48 hours and IFN-γ and IL-4 levels were measured using an appropriate ELISA assay (Endogen, Inc., Cambridge, MA).
[0137]
Research on tumor therapy
6- to 8-week-old male and female CEA. Tg mice initially received 2 mg of cyclophosphamide by a single intraperitoneal (ip) injection. 4 days later, 3 × 10⁵Cellular MC-38-CEA-2 tumor cells (in 100 μl) were injected subcutaneously in the right flank. FACS analysis of the injected cells showed CEA expression (COL-1 binding), strong MHC class I expression, and the absence of NMC class II expression on> 85% of the cells. After 4-5 days, the tumor volume is 30-50 mm³When the mouse was⁸ pfu avipox-CEA / RG alone or 10⁸ Primal immunizations were given in combination with pfu avipox-GM-CSF or 20 μg recGM-CSF and injected subcutaneously in 100 μl aliquots on each side of the tail. recGM-CSF was administered to the immunization site daily for four consecutive days. Immunization was boosted at the same site two weeks later. Tumors were measured 2-3 times / week and volumes were calculated as follows: [(mm, short axis)²× (mm, major axis)] / 2. > 2 cm³The mice bearing the tumor were sacrificed for humane reasons and the day of death recorded. In mice with reduced tumor volume, probably due to immunization, the data were divided into two categories: (i) tumor regression and (ii) tumor eradication; Defined as volume loss and complete disappearance of the tumor. Mice with completely eradicated tumors were 3 × 10⁵The cells MC-38-CEA-2 tumor cells (in 100 μl) were challenged into the other flank by a second subcutaneous injection.
[0138]
Statistical analysis
Statistical significance of T-cell proliferation / lysis data is based on two-tailed Student's t-test. Changes in the growth rate of MC-38-CEA-2 tumors as measured by changes in tumor volume for each treatment group were compared using the Mann-Whitney U test. In Table 3, the individual CEA. Tumor growth in Tg mice was divided into two categories: (i) tumor regression defined by a decrease in measured tumor volume, and (ii) failure to measure or palpate the tumor at the injection site. Tumor eradication. All p-values reported were bilateral and were not adjusted for the various evaluations performed on the data. A p-value of <0.05 was considered significant.
[0139]
Example 3
GM-CSF production by recombinant avipoxvirus
Recombinant avipox viruses expressing mouse GM-CSF were generated and their ability to produce GM-CSF in vitro was evaluated after infection of MC-38 tumor cells (FIG. 6). Recombinant Avipox-GM-CSF virus was found to have approximately equal amounts of GM-CSF (i.e., 225-250 ng / lO) as measured in a bioassay using a GM-CSF-dependent cell line.⁶Cells / day). When the same cells were infected with the same MOI control virus, no detectable GM-CSF was produced.
[0140]
Example 4
Cellular / functional changes in regional lymph nodes after administration of avipox-GM-CSF or recGM-CSF
Enrichment of class II-expressing cells in draining regional lymph nodes was an in vivo readout for GM-CSF bioactivity in a mouse model (15,22). Indeed, local lymphadenopathy (lymphadenopathy) was observed in B6 mice in 10⁷Or 10⁸ Observed 7 days after administration of pfu recombinant avipox-GM-CSF virus, but to a lesser extent with the appropriate control virus (Table 3).
[0141]
[Table 3]

[0142]
^aB6 mice (6-10 mice / group) were injected with the indicated recombinant avipoxvirus or rGM-CSF as outlined in Materials and Methods. Control mice received HBSS. Lymph nodes were harvested from avipox-treated mice on days 7 and 21, and from rGM-CSF-treated mice 24 hours after the last injection. Total number of lymph node cells and class II expression levels were determined. Data are means ± SEM of two independent experiments. MFI values are expressed as a range of 4-6 quantifications.
^bP <0.05 [vs. Control (HBSS-treated) mice]
^cP <0.05 [vs. A suitable control avipoxvirus of the same pfu (ie, 10⁷Avipox (F) -GM-CSF vs. 10⁷Avipox (F) -WT)]
^dP <0.05 [vs. One injection of rGM-CSF].
[0143]
The most significant increase in the total number of cells / nodes was 10⁸ This occurred in mice injected with any of the pfu GM-CSF-expressing recombinant viruses. A selective increase in the percentage of class II-expressing cells in mice treated with the recombinant avipox virus expressing GM-CSF, as compared to the control virus, was seen with an increase in lymphadenopathy (Table 3). ). Typically, 25-29% of lymph node cells from untreated mice or mice injected with either avipox-WT or avipox-RG express MHC class II antigen. (10⁷Or 10⁸ Injection of any of the recombinant avipox-GM-CSF viruses (of pfu) increased their percentage to 43-51% by day 7 with an associated 3-fold boost of their MFI (Table 3). . Local lymph nodes from avipox-GM-CSF-treated mice were analyzed for class II when analyzed 21 days after injection.⁺A sustained increase in the percentage of lymph node cells was found. Multiple injections of recGM-CSF were required to improve lymph node cellularity and MHC class II expression (Table 3). Upon ending recGM-CSF treatment, changes in lymph node cellularity and class II expression quickly returned to pre-treatment levels by day 21, as also shown in Table 3.
[0144]
The time course of the increase in class II-expressing lymph node cells in mice injected once with avipox (F) -GM-CSF or avipox (A) -GM-CSF was investigated more thoroughly. As summarized in FIG.⁷Or 10⁸ Either the pfu recombinant avipox virus or the appropriate control virus was injected, and the total number of class II-expressing cells in regional lymph nodes was determined every other week. Class II⁺The increase in the total number of cells / lymph nodes is 10⁷Or 10⁸ This was observed by day 7 in mice injected with any of the recombinant avipox-GM-CSF viruses of pfu (FIG. 7). 10⁸ The absolute number of class II expressing cells in mice treated with any recombinant avipox-GM-CSF virus of pfu remained increased for 21-28 days. FIG. 7B shows a time course of comparison for changes in the total number of class II-expressing lymph node cells in mice treated with freeGM-CSF for 4 days (FIG. 7A, dashed line).
[0145]
Increased level of class II expression in regional lymph nodes is due to higher class II levels in B cells and CD11c⁺/ I-Ab⁺It was reported to contain an influx of cells (21). CD11c⁺/ I-Ab⁺The cells are also CD3, a cell-surface phenotype profile that is consistent with the cell-surface phenotype profile of APCs, especially macrophages and dendritic cells.⁻, CD19⁻, Ter119⁻, NK1.1⁻, CD11 b⁺, DEC205⁺, CD80⁺And CD86⁺(37). FIG.⁸ FIG. 9 summarizes the temporal changes in the APC population in regional lymph nodes isolated from mice treated with either recombinant avipox-GM-CSF virus of pfu or the appropriate control virus. Approximately 1-2% of lymph node cells from untreated mice were APCs as defined by their antigenic phenotype. 10⁸ Seven days after injection of any Avipox-GM-CSF of pfu, the percentage increased almost 3-fold (data not shown). CD11c within the node 7 days after injection of any recombinant Avipox-GM-CSF virus⁺/ Class II⁺The absolute number of cells increased 12-fold (FIG. 8). Furthermore, the time course for increasing number of APCs / nodes was substantially identical to the time course for the total number of class II-expressing cells. Lymph nodes from avipox-WT and -RG treated mice did not contain higher numbers of APCs (FIG. 8). Those nodes did not contain significantly higher numbers of B and T cells.
[0146]
Local nodes from B6 mice injected with avipox-GM-CSF or control virus were isolated after 7 and 21 days and used to generate alloreactive CTL from mixed lymphocyte cultures in vitro ( (FIG. 9). When examined for allospecific lytic activity, lymph node cells isolated on day 7 (FIG. 9A) and day 21 (FIG. 9B) from avipox-GM-CSF-treated mice were compared to untreated mouse or control Significantly (p <0.05) more potent than lymph node cells from any of the mice treated with poxvirus.
[0147]
Example 5
Effect of multiple Avipox-GM-CSF injection
Mice were injected three times monthly with Avipox-GM-CSF and a study was performed in which regional lymph nodes were examined for changes in all class II-expressing cells after each injection. Serum samples were also analyzed for the development of anti-avipox and anti-GM-CSF antibody titers. Seven days after the first avipox-GM-CSF injection, the absolute number of class II cells was 0.5 to 4.9 x 10⁶To the lymph nodes / approximately 10-fold (FIG. 10A). By 28 days, the number would be 1.7 x 10⁶, But after a second injection of Avipox-GM-CSF on day 28, 4.8 × 10 3 by day 35.⁶Increased. A third injection of avipox-GM-CSF on day 56 resulted in class II again.⁺2.8 to 5.7 x 10 cells / node⁶(FIG. 10A). Injection of Avipox (A) -RG resulted in Class II⁺No change in the number of lymph node cells was observed.
[0148]
Serum samples were collected on days 7, 28, 35, 56, 63, and 84 and analyzed for the presence of anti-avipox and -GM-CSF IgG titers. Measurable anti-avipox antibody titers were observed on days 7 and 28 (FIG. 1OB). After a second injection of avipox-GM-CSF administered on day 28, serum anti-avipox IgG titers were boosted to> 100,000. A third injection of avipox-GM-CSF resulted in a further increase in serum anti-avipox IgG titers to> 200,000. No detectable serum anti-GM-CSF IgG titers were found at any of the time points (FIG. 1OB).
[0149]
Example 6
Adjuvant effect of Avipox-GM-CSF on antigen-specific immunity
CEA. Tg Anti in mice -CEA Antibody response
CEA. Tg mice were vaccinated twice daily with avipox-CEA alone or twice in combination with either a single infusion of avipox-GM-CSF or reeGM-CSF given for 4 consecutive days. In the presence of anti-CEA IgG serum titers in 60% of the mice, avipox-CEA alone was vaccinated or avipox-CEA was vaccinated in combination with recGM-CSF (FIGS. 11B and 11C). Ten CEA.Vaccines vaccinated with Avipox-CEA and Avipox-GM-CSF. All Tg mice (FIG. 11, panel D) elicited an anti-CEA IgG response. CEA antibody titers were determined for naＡve mice or control virus (AVIPOX-RG) vaccinated CEA. It was not detected in the serum of Tg mice (FIG. 11, panel A).
[0150]
CEA Against T- Cell proliferative response
Using the primary CEA-specific spleen T-cell proliferative response, the efficiency of delivering GM-CSF in recombinant avipoxvirus was evaluated as compared to using multiple GM-CSF injections (Table 1). 2). CEA-specific T cell expansion was performed with vaccinated CEA. After incubating spleen T cells isolated from Tg mice for 5 days, [³H] was measured by thymidine incorporation. CEA-specific T cell proliferation was due to (i) the inability of OVA to stimulate T cell proliferation and (ii) spleen T cells isolated from mice immunized with control avipoxvirus in the presence of soluble CEA. Inability to grow was indicated (Table 2). When Avipox-CEA was administered in combination with Avipox-GM-CSF or reeGM-CSF, it boosted the spleen T cell proliferative response to the resulting soluble CEA (P <0.05). CEA-specific lymphocyte proliferation was determined by avipox-RG-vaccinated CEA. It was not found using spleen T cells isolated from Tg mice (Table 4).
[0151]
[Table 4]

[0152]
^a{CEA. Tg mice (2-3 mice / group)⁸ pfu avipox (A) -CEA or avipox (A) -RG was administered subcutaneously (100 μl) twice, every other month. GM-CSF was administered as a recombinant protein or in combination with the recombinant avipox (A) virus described in Materials and Methods. Four to six weeks after the second immunization, mice were sacrificed and spleen T cells were isolated and pooled according to treatment group. T cell proliferative responses to soluble CEA, OVA, and ConA³Measured by H-thymidine incorporation.
^bData are shown as Δcpm [−cpm (2621-7973) in T cells, wells containing APC, and wells without antigen] ± SEM from a representative experiment. Mean cpm is shown for Con-A stimulation wells (SEM <10%). Three separate experiments were performed with similar results. neg = cpm <medium control.
^cP <0.05 (vs. Avipox (A) -CEA-immunized mouse)
^dP <0.05 (vs. Avipox (A) CEA + recGM-CSF-treated mice).
[0153]
CEA peptide − Specific T- Cell lysis
Vaccinated CEA. Because repeated attempts at detecting major peptide-specific CTL responses in Tg mice failed (data not shown), spleen T cells were isolated from immunized CEA. It was isolated from Tg mice and subsequently stimulated in vitro in the presence of an 8-mer peptide spanning CEA amino acids 526-533 and IL-2. CEA_526-533T cell proliferative response to IL-2 and irradiated APC was determined by immunization of avipox-CEA alone or in combination with avipox-GM-CSF or reeGM-CSF. Observed in Tg mice. After two rounds of in vitro stimulation,> 90% of the isolated T cells from the three cell populations had CD8⁺Met. In addition, those T cells have CEA_526-533Syngeneic (EL-4) targets pulsed with peptide could be killed (FIG. 12A). CEA peptide-specific EL-4 lysis, as measured by the lysis unit, was determined for CRA. Vaccinated with avipox-CEA in combination with avipox-GM-CSF. The highest for T cell lines obtained from Tg mice (p <0.05 vs. either Avipox-CEA or Avipox-CEA + recGM-CSF-immunized mice) (FIG. 12A). When EL-4 target cells were pulsed with an irrelevant peptide (ie, Flu NP), a background level of cell lysis was observed (FIG. 12A). CEA vaccinated with avipox-CEA in combination with either avipox- or recGM-CSF. T cell lines generated from Tg mice were also vaccinated with Avipox-CEA alone. It produced higher levels of γ-interferon than T cell lines generated from Tg mice (FIG. 12B). IL-4 was not found in any of those cultures.
[0154]
Example 7
Anti-tumor immunity
CEA. Carrying MC-38-CEA-2 tumors. Tg mice were vaccinated with avipox-CEA alone or in combination with avipox-GM-CSF or rGM-CSF, and the control virus, avipox-RG alone or in combination with GM-CSF. MC-38-CEA-2 tumors are na ー ブ ve CEA. Grow slowly in Tg mice and in mice vaccinated with Avipox-RG alone or in combination with GM-CSF, and the mice were sacrificed 6-7 weeks after tumor inoculation (Table 3). ). Avipox-CEA vaccination results in several CEA. A transient decrease in tumor growth was induced in Tg mice; however, survival was prolonged (FIG. 13C).
[0155]
Vaccination with Avipox-CEA in combination with Avipox-GM-CSF resulted in 16 CEA. Six of the Tg mice caused a measurable decrease in tumor volume (FIG. 13A). By day 35, the average tumor volume of the avipox-CEA + avipox-GM-CSF treated group was the untreated group, avipox-RG + avipox (A) -GM-CSF group or avipox-CEA-vaccinated group CEA. It was significantly smaller than Tg mice (P <0.05). In fact, five tumor-bearing CEA.Vaccines vaccinated with Avipox-CEA and Avipox-GM-CSF. Tg mice became tumor free by day 28 (Table 3, FIG. 13A) and remained so for 14 weeks (FIG. 13C). At that time, 5 tumor-free CEA. Tg mice were challenged with MC-38-CEA-2 tumor cells and all were protected (FIG. 13D). Four of the fourteen CEATg mice vaccinated with avipox-CEA and rGM-CSF also became tumor-free (Table 3; FIG. 13B), and three of the four mice were challenged. The tumor was injected again (FIG. 13D).
[0156]
[Table 5]

[0157]
^a{CEA. Tg mice were immunized at two-week intervals with the approximate avipox recombinant ± either avipox-GM-CSF or recGM-CSF as described in Materials and Methods. Data was collected from two separate experiments except for the Avipox (A) -RG + recGM-CSF group, which shows data from a single experiment.
^bP <0.05 (vs. control CEA. Tg mouse)
^cP <0.05 (vs. Avipox (A) -CEA-vaccinated CEA.Tg mice).
[0158]
Example 8
rF-GM-CSF enhances CEA-specific T-cell responses to CEA vaccine in vivo
Method
As disclosed herein and in Cancer Research 59: 5800-5807, 1999, female C57BL / 6 mice were treated with 1 × 10⁸ pfu / mouse was vaccinated once with Avipox (F) -WT, rF-CEA, or rF-CEA / TRICOM. Half of each group contains 1 × 10⁷ pfu / mouse avipox (F) -GM-CSF was given as adjuvant to determine if GM-CSF enhances the T-cell response, while the remaining mice received avipox (F) -GM-CSF. None (n = 3 mice / group). Fourteen days later, spleen cells from the vaccinated group were collected for analysis of the cellular immune response. To quantify T-cell responses, T cells from vaccinated mice were incubated with irradiated splenocytes for 5 days in the presence of several concentrations of CEA protein. T cells were also incubated with Con A or ovalbumin for positive and negative growth controls. During the last 18 hours of incubation,³H-thymidine was added and T-cell proliferation was measured.
[0159]
These experiments show that when administered in combination with rF-CEA, or rF-CEA / TRICOM, Avipox (F) -GM-CSF activates the CEA-specific T-cell response of these vectors in vivo. 14A to 14C.
[0160]
Example 9
CD4 Response to β-Galactosidase: Immunoadjuvant Effect of Fowlpox Virus-GM-CSF
Method
The lymphoproliferative response to β-gal by splenocytes isolated from mice immunized with β-gal in combination with incomplete Freund's adjuvant with or without Fp-mu-GM-CSF was measured. Mice were first vaccinated with 100 μg β-gal in combination with incomplete Freund's adjuvant (triangles) (mixed 1: 1 per volume ratio) or with adjuvant alone (circles). In the selected group, Fp-mu-GM-CSF (10⁷ pfu) (diamond) or Fp-WT (10⁷ pfu) (squares) was added along with the immunogen and injected subcutaneously. Thirty days after vaccination, spleens are harvested and T-cells are isolated and used in lymphoproliferative assays, including β-gal protein (100-6.25 ug / ml) and na ー ブ ve C57BL. 5 × 10 6 isolated from / 6 mice⁵Irradiated antigen-presenting cells were included.³H-thymidine was added 5 days after in vitro culture and the amount incorporated was measured after 24 hours.
[0161]
result
The data show that recombinant avipoxvirus expressing mouse GM-CSF (fowlpox virus), when using the whole protein (β-galactosidase) as the immunogen, was substantially host-cell (ie, CD4) immune response. (Fig. 15).
[0162]
Example 10
Intravesical administration of Avipox-F-GM-CSF for patients with bladder cancer
Avipox-GM-CSF was administered intravesically to patients with bladder cancer. 10 for patients⁶-10¹¹ pfu avipox-GM-CSF was administered via catheter to infect bladder carcinoma cells. Avipox-GM-CSF is administered 1-10 times, every other day, every week, or every month. The effectiveness of the treatment will be evaluated clinically.
[0163]
Example 11
Direct intratumoral injection of avipox-GM-CSF in patients with head and neck carcinoma
Avipox-GM-CSF is injected directly into tumors such as the head and neck, melanoma of the skin and breast cancer metastases. 10⁵-10⁹ Avipox-GM-CSF during pfu is administered 1-10 times, every other day, every week, or every month.
[0164]
Example 12
Vaccination of patients with CEA-expressing carcinoma
Avipox-GM-CSF is used in combination with Avipox-CEA-TRICOM vaccine to treat any CEA expressing tumor. Avipox-CEA-TRICOM is a vaccine in which fowlpox recombinants express the tumor antigen CEA and three different costimulatory molecules: B7-1, ICAM-1 and LFA-3. Avipox-GM-CSF is 10⁶-10¹⁰ Give at a dose of pfu / infusion. Avipox-GM-CSF is administered either before (1 day to 1 week), concurrently, or after (1 day to 1 week) administration of Avipox-CEA-TRICOM. Avipox-CEA-TRICOM is 10⁶-10¹⁰ Give at a concentration of pfu / infection.
[0165]
Example 13
Avipox-GM-CSF in combination with recombinant poxvirus expressing HIV and SIV antigens in SIV and SHIV challenge model with Rhesus Maeaques
Avipox-GM-CSF, 10⁶-10¹⁰ It is given subcutaneously at a dose of pfu / infusion. Avipox-GM-CSF may be administered prior to (1 day to 1 week), concurrently, or with avipox-HIV antigen-TRICOM, avipox-SIV antigen-TRICOM, avipox-HIV antigen-B7, or avipox-SIV antigen-B7. Later (one day to one week), 10⁶-10¹⁰ Administer pfu / infusion.
[0166]
Consideration
GM-CSF is thought to act as a powerful biological adjuvant to vaccines by its ability to attract professional APCs to the site of local injection and subsequently migrate into local lymph nodes to mediate the host immune response (15,21, 22). Previous studies (15) in which recombinant GM-CSF protein was injected continuously for 4-5 days (15) showed that class II-expressing APCs grew in local lymph nodes and then correlated with a boost in host immunity. Reported that. GM-CSF was delivered to the site of immunization using a different vehicle. Some of these approaches include introducing the GM-CSF gene into a tumor cell vaccine via a retroviral vector (19, 20), fusion proteins (18) and replication-deletion (25) recombinant pox. Contains viruses. In this study, replication-deficient recombinant avipox [fowlpox virus, canarypox (ALVAC)] virus expressing GM-CSF was given once subcutaneously to B6 mice. Absolute number (Table 3), percent (Table 3), MFI (Table 3), and absolute number of class II-expressing cells (FIGS. 7A-7D) and CD11c within local draining lymph nodes⁺/ I-Ab⁺All resulting increases in cell numbers (FIG. 8) were consistent with the synthesis of biologically active GM-CSF by the recombinant avipoxvirus. Two different recombinant avipox viruses expressing GM-CSF were compared, fowlpox and canarypox (ALVAC), and no apparent differences were observed.
[0167]
The use of recombinant avipoxvirus to deliver GM-CSF to the site of immunization may have some advantages over using recGM-CSF. CD11c in local lymph nodes⁺/ I-Ab⁺The magnitude of the increase in the absolute number of cells was much greater in mice injected with avipox-GM-CSF virus than in recGM-CSF. For example, 4-5 days after recGM-CSF treatment, CD11c⁺/ I-Ab⁺The number of lymph node cells increased approximately 6-fold when compared to untreated mice (0.71 vs. 0.12 x 10⁶/ Section, FIG. 3). 10⁸ A single injection of any of the recombinant avipox-GM-CSF viruses of pfu resulted in CD11c⁺/ I-Ab⁺The absolute number of lymph node cells was boosted almost 70-fold (1.44 vs. 0.12 × 10⁶/ Section, FIG. 3). A second advantage of using recombinant avipoxviruses to deliver GM-CSF may be the temporal changes associated with APC enrichment in local lymph nodes. As shown in FIG. 8, recGM-CSF needs to be administered for 4 to 5 days to increase APC concentration in local lymph nodes. Upon discontinuation of recGM-CSF treatment, changes within the injection site disappear quickly (approximately 4-5 days). On the other hand, class II⁺And CD11c⁺/ I-Ab⁺The increase in absolute number of lymph node cells persisted in local lymph nodes of mice injected with any of the recombinant Avipox-GM-CSF viruses for 21-28 days (FIG. 8). Indeed, lymph node cells isolated 21 days after avipox (A) -GM-CSF injection generated a stronger allospecific CTL response in vitro, indicating that their functional integrity was (FIG. 9B). Some argue that the recombinant avipox-GM-CSF virus creates a reservoir of GM-CSF after injection, and that long-term changes found in local nodes may indicate a slow release of cytokines. May be. Such an opinion is unlikely because the in vivo half-life of GM-CSF is on the order of a few days. Without being bound by theory, a more plausible explanation is that the replication-deficient avipoxvirus remains at the site of injection and produces GM-CSF continuously, which is subsequently seen in the local lymph nodes Mediate any change.
[0168]
If these recombinant avipoxviruses should be used to deliver biologically active GM-CSF to the site of vaccination, they must be compatible with the particular anti-cancer vaccine . To test such a hypothesis, recombinant avipox-GM-CSF virus as well as recGM-CSF, when avipox-CEA was used as a tumor vaccine, they elicited CEA-specific host immunity. The ability to enhance in Tg mice was evaluated. With avipox-CEA, or with a recombinant vaccinia-CEA virus as previously reported (29), CEA. Vaccination of Tg mice induces CEA-specific humoral- and cell-mediated immunity. However, CEA.Vaccinated with the recombinant poxvirus-CEA vaccine. CEA-specific immunity generated in Tg mice was relatively weak. Indeed, in the present invention, avipox-CEA vaccination provides CEA. Transient growth inhibition of CEA-expressing subcutaneous tumors in Tg mice was induced (FIG. 13B). By incorporating GM-CSF as a recombinant avipoxvirus or as a recombinant protein, avipox-CEA-vaccinated CEA. In Tg mice, CEA-specific CD4⁺-Proliferative response (Table 4) and CD8⁺-Increased mediated lysis response (Fig. 12A). Indeed, the anti-CEA-specific cellular immune response is not recGM-CSF, but rather CEA.-AVI-OX-GM-CSF, a biological vaccine adjuvant. It was significantly more potent in Tg mice. Thus, it appears that the recombinant avipox virus expressing the tumor antigen and GM-CSF is compatible and can be co-injected. Furthermore, if the recombinant avipox-CEA virus produces CEA continuously for 21-28 days, the simultaneous presence of the antigen with increased local GM-CSF levels will result in dendritic cells having tumor antigens Will be continuously loaded.
[0169]
It may explain the improved cellular response to CEA, but those changes are due to avipox-CEA and avipox-GM-CSF vaccinated CEA. The reason why it did not mediate a stronger anti-tumor response in Tg mice remains unclear. One possible explanation is that by using an experimental model in which cell-mediated immunity is generated against self-antigens, host / tumor factors that can offset the anti-tumor response can be introduced. Things.
[0170]
Due to their ability to infect and express gene products, and their safety demonstrated in clinical trials (38-42), recombinant avipoxviruses are attractive candidates as cancer vaccines. Prior exposure to vaccinia does not alter the immune response to recombinant avipoxvirus (43), and in various prime-boost protocols, the two viruses induce antitumor immunity in a mouse model ( 36). This finding implies that using recombinant avipoxviruses involves delivering GM-CSF to concentrate APCs at the site of immunization, thereby increasing the production of antigen-specific anti-tumor immunity. Extended to Another finding was the ability of Avipox (A) -GM-CSF after repeated infusions to concentrate APC in regional lymph nodes. That happened despite the presence of anti-avipox serum antibody titers observed in these and other studies (24, 44). In fact, in recent clinical trials, multiple infusions of avipox-CEA administered to patients with advanced CEA-positive tumors caused a progressive increase in CEA-specific T cell precursor cell frequency . A third advantage of using the recombinant Avipox-GM-CSF virus is that it can be easily mixed with an immunogen such as Avipox-CEA, and 4-5 daily doses of recGM-CSF. The ease with which the vaccine can be administered as a single infusion compared to an infusion. This can simplify vaccine design and lower treatment costs, while possibly maximizing the adjuvant effect of GM-CSF.
[0171]
[Table 6]

[Brief description of the drawings]
These and other objects, features and many attendant advantages of the present invention will become better understood on reading the detailed description of the invention when considered in conjunction with the drawings accompanying this specification. Wa:
FIG. 1 shows the plasmid vector pT5091 for the production of rF-muGM-CSF.
FIG. 2 shows a plasmid vector pT5052 for the production of rF-huGM-CSF.
FIG. 3 shows a plasmid vector pT5051 for the production of rV-huGM-CSF.
FIGS. 4A-4E show the genomic structure of a recombinant poxvirus expressing GM-CSF. BamHI J is the site of insertion of a foreign gene in the fowlpox genome. Hind III J or Hind III M is an insertion site in the vaccinia virus genome. Deletion III is an insertion site in the MVA genome. 40K, C1, P1 and P2 are poxvirus promoters.
FIGS. 5A-5C show the genomic structure of a recombinant poxvirus expressing GM-CSF together with a tumor-associated antigen (TAA). BamHI J is the site of insertion of a foreign gene in the fowlpox genome. Hind III J is an insertion site in the vaccinia virus genome. Deletion III is an insertion site in the MVA genome. P1, P2 and P3 are poxvirus promoters.
FIG. 6 shows production of mouse GM-CSF by recombinant avipox-GM-CSF virus. MC-38 cells were grown at 5 MOI Avipox (F) -GM-CSF, 5 MOI Avipox (F) -WT, 5 MOI Avipox (A) -GM-CSF or 5 MOI as outlined in Materials and Methods. Infections were made with any of the MOI Avipox (A) -RG. Control cells received no virus. Cells were grown for 3 days and supernatant was collected every 24 hours. Mouse GM-CSF levels were measured using a GM-CSF-dependent FDCP-1 indicator cell line and ng GM-CSF production / 10⁶Cells / 24h. Data are means ± SE from triplicate wells from representative experiments with similar results repeated.
7A-7D show MHC class II-expressing cells in regional lymph nodes of mice treated with a recombinant avipoxvirus expressing GM-CSF. 7A and 7B, the B6 mouse group (20-30 mice) contained 10⁷ pfu (2A) or 10⁸ One of avipox (F) -GM-CSF (black circle) or avipox (F) -WT (open circle) of pfu (2B) was s. c. Injection (day 1, arrow). 7C and 7D, B6 mice received 10 times each of avipox (A) -GM-CSF (solid circles) or avipox (A) -RG (open circles).⁷ pfu and 10⁸ Provided in pfu. Other B6 mice (n = 20) were injected daily with 20 μg of recGM-CSF (FIG. 7A, interrupted line, closed triangle) for 4 days (closed horizontal line). Control mice (open triangles, all panels) received 100 μl of HBSS. Mice (4-6 / group) were sacrificed at each time point, inguinal lymph nodes were collected, combined, and total lymph node cells were counted using a hemocytometer. The percentage of class II-expressing cells was determined using flow cytometry for I-Ab⁺Determined by cells and the total number of class II-expressing cells was calculated as follows: total lymph node cells x% class II⁺Cell = All Class II⁺cell. The data show results from 3-4 experiments where each time point is the average of 2-3 different assays (SD ≦ 15%).
FIG. 8 shows the total number of APCs per regional lymph node in mice treated with avipox-GM-CSF or recGM-CSF. For B6 mice (8-12 / group), as outlined in FIGS.⁸ Avipox (F) -CM-CSF (closed triangle), Avipox (F) -WT (open triangle), Avipox (A) -GM-CSF (closed square) or Avipox (A) -rabies of pfu (indicated by an arrow) Glycoprotein (RG) (open squares) was administered. Recombinant GM-CSF (20 μg, filled circles) was given to a cohort of mice (n = 15) for 4 consecutive days (solid black line). Control mice (break line) received HBSS. Local lymph nodes were harvested at the time indicated and CD11c⁺/ I-Ab⁺The total number of cells was determined as outlined in Materials and Methods. Data represent the mean ± SE of the synthesis of findings from 3-4 independent experiments tested 2-3 times for each time point.
FIGS. 9A-9B show the effect of Avipox (FIG. 10A) -GM-CSF on generation of alloreactive CTL. Naive B6 mice for 10⁸ pfu avipox (A) -GM-CSF (black triangle), 10⁸ Treated with any of pfu's Avipox (A) -RG (solid squares) as described above. Control mice received HBSS (filled circles). After 7 days (FIG. 9A) and 21 days (FIG. 9B), mice (3-4) were sacrificed, local lymph nodes were collected, and single cell suspensions were prepared. The lymph node cells were irradiated (5000 rad) and used as APC. To set up unidirectional MLC, responder (BALB / C splenocytes) and stimulator (irradiated B6 lymph node cells) in a 1: 1 ratio were added to 10 ml culture in T-25 flask For 5 days at 37 ° C. Cells were harvested and cytotoxicity was measured as described in Materials and Methods. Cell lysis was shown for allogeneic H-2b target cells (MC-38), whereas cell lysis for syngeneic H-2d cells (P815) was <8% for all groups. Data represent the mean ± SE from quadruplicate determinations from a single experiment that repeated the same results.
10A and 10B show changes in lymph node class II-expressing cells after multiple injections of (A) Avipox (A) -GM-CSF or Avipox (A) -RG. For B6 mice (15 / group), 10⁷ avipox (A) -GM-CSF (black circle) of pfu, 10⁷ Either pfu avipox (A) -RG (open circles) or HBSS (closed triangles) was injected. At each time point, 2-5 mice / group were sacrificed, bilateral inguinal lymph nodes were isolated, and all Class II expressing cells were determined as outlined for FIGS. 7A-7D. The data shows results from a single experiment (FIG. 10B). Serum samples from mice were analyzed for the presence of anti-avipox (A) (shaded bars) or anti-GM-CSF IgG (black bars) antibody titers (see Materials and Methods). Serum anti-avipox (A) and anti-GM-CSF antibody titers were analyzed on each time point and averaged from two separate mice from avipox (A) -GM-CSF and untreated groups. Yes (SE <10%).
FIG. 11 shows CEA. Figure 4 shows the generation of anti-CEA IgG serum titers in Tg mice. CEA. Tg mice were treated with avipox (A) -CEA alone (10⁸ pfu, panel B) or recGM-CSF (20 μg, panel C) or Avipox (A) -GM-CSF (10⁸ pfu, panel D), and were vaccinated as outlined in Materials and Methods (2x). Other mice were avipox (A) -RG (10⁸ pfu) or HBSS (panel A) were injected twice. Two weeks after the final treatment, mice were bled and sera were tested for the presence of anti-CEA IgG antibodies as described above. The data shows serum antibody titers of individual mice. A titer of <100 was considered negative.
12A-12B show avipox (A) -CEA vaccinated with avipox (A) -GM-CSF or recGM-CSF. CEA- in Tg mice_526-4334 shows the generation of a specific CTL response. CEA. Tg mice were vaccinated as outlined in Materials and Methods. Purified spleen T cells were subjected to three rounds of in vitro stimulation in the presence of 10 units of IL-2 and 1 μg of CEA peptide / ml. T cell lines were avipox (A) -CEA alone (（, ●), avipox (A) -CEA + Avipox (A) -GM-CSF (closed square, □) and avipox (A) -CEA + recGM-CSF (、, CEA. Proliferated from Tg mice. Cytolytic activity was 0.2 μg of CEA_526-522(Black) (FIG. 12A) or control peptide (ie, Flu NP_366-374) (White) were tested against EL4 target cells incubated in the presence of (white). The same T cell lines were incubated with freshly isolated and irradiated APC and 0.01-1 μg of CEA peptide for 48 hours and the supernatant was collected. IFN-γ production was determined by ELISA (FIG. 12B). Data were means ± SEM from three separate wells in a representative experiment with similar results repeated. No detectable IL-4 levels were found.
Figures 13A-13D show CEA. Vaccinated with Avipox (A) -CEA in combination with either Avipox (A) -GM-CSF (13A) or rGM-CSF (13B). Figure 4 shows anti-tumor immunity in Tg mice. Figures 13A and 13B show CEA. Vaccinated with Avipox-CEA in combination with either Avipox (A) -GM-CSF (13A, arrow) or rGM-CSF (13B, arrow, black horizontal line). 4 shows the growth of MC-38-CEA-2 tumors in Tg mice. N indicates the number of tumor free mice on day 56. The data combines two separate experiments. The black lines in FIGS. 13A and 13B indicate mice in which tumor regression was observed. Figure 13C shows CEA.Vaccinated with avipox (A). Tg mice, CEA. Vaccinated with avipox (A) -CEA alone (●), or in combination with avipox (A) -GM-CSF (closed square) or in combination with rGM-CSF (（). 2 shows the survival of Tg mice. Untreated CEA. Tg mice (break line) received HBSS. Vaccination with avipox (A) -RG alone or in combination with either avipox (A) -GM-CSF or rGM-CSF did not change overall survival (data not shown). FIG. 13D shows MC-38 after vaccination with Avipox (A) -CEA and Avipox (A) -GM-CSF (n = 5, ▲) or Avipox (A) -CEA + rGM-CSF (n = 4, ●). -CEA.2 that rejected CEA-2 tumors. Tg mice were 3 × 10⁵MC38-CEA-2 tumor cells. The dashed line represents 10 naＣＥve CEA. 2 shows the survival of Tg mice.
FIGS. 14A-14C show that Avipox (F) -GM-CSF enhances CEA-specific T-cell responses to CEA vaccine. FIG. 14A: T-cell responses from mice vaccinated with buffer (black box), Avipox (F) -WT (black diamond), or Avipox (F) -WT + Avipox (F) -GM-CSF (black circle). FIG. 14B: T-cell response from mice vaccinated with Avipox (F) -CEA (black diamond) or Avipox (F) -CEA + avipox (F) -GM-CSF (solid circle). FIG. 14C: Avipox (F) -CEA / TRICOM (ie, Avipox expressing CEA, B7.1, ICAM-1, and LFA-3; black diamond), or Avipox (F) -CEA / TRICOM + Abipox (F). -T-cell response from mice vaccinated with GM-CSF (filled circles). Insertions in each panel indicate that the T-cell responses to Con A (positive control) and ovalbumin (negative control) were identical for all groups.
FIG. 15 is isolated from mice immunized with β-gal in combination with incomplete Freund's adjuvant (IFA with or without fowlpox mouse GM-CSF (Fp-mu GM-CSF)). Shows lymphocyte proliferative response by splenocytes to total protein, β-galactosidase (β-gal) (● = untreated; ▲ = β-gal + IFA; Δ = β-gal + IFA + Fp-muGM-CSF 10⁷ pfu; closed square = β-gal + Fp-WT).

Claims (114)

A pharmaceutical composition comprising a replication-defective virus encoding granulocyte-monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF) and a pharmaceutically acceptable carrier. 2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the replication-defective virus encodes human GM-CSF. The virus has accession number no. To the American Type Culture Collection. The pharmaceutical composition according to claim 1, produced using a plasmid vector designated pT5052, deposited as PTA-2099. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the replication-defective virus is a poxvirus. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the replication-defective virus is an avipox virus. The pharmaceutical composition according to claim 5, wherein the avipoxvirus is selected from the group consisting of fowlpox virus, canarypoxvirus, MVA, and derivatives thereof. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 6, wherein the replication-defective virus further encodes at least one antigen or an immunological epitope thereof. The antigen is selected from the group consisting of a tumor-specific antigen, a tumor-associated antigen, a tissue-specific antigen, a bacterial antigen, a viral antigen, a yeast antigen, a fungal antigen, a protozoan antigen, a parasite antigen and a mitogen. The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein 8. The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the immunological epitope comprises at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 36 and combinations thereof. 2. The pharmaceutical composition according to claim 1, further comprising a vector encoding at least one costimulatory molecule. 11. The pharmaceutical composition according to claim 10, wherein the costimulatory molecule is B7.1. The pharmaceutical composition according to claim 10, wherein the costimulatory molecule is B7.1 / LFA-3 / ICAM-1. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 12, further comprising a vector encoding α-interferon, β-interferon, or γ-interferon. 13. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 12, further comprising a vector encoding at least one cytokine. 15. The pharmaceutical composition according to claim 14, wherein the cytokine is IL-12. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 6, further comprising an Fc receptor-directed bispecific antibody. 17. The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the Fc receptor is selected from the group consisting of FeγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FeγRIII (CD16). 17. The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the antibody is an anti-CD3-directed antibody. 19. The pharmaceutical composition according to any one of claims 16 to 18, wherein the bispecific antibody has tumor-directed specificity. 20. The pharmaceutical composition according to claim 19, wherein the specificity is selected from the group consisting of HER-2 / neu, EGF-receptor, CD15 antigen and EpCAM molecule. 17. The pharmaceutical composition according to claims 1 to 16, further comprising at least one antigen or immunological epitope source, and optionally a conventional adjuvant. Conventional adjuvants, Ribi Detox ^TM, alum, QS-21, is selected from the group consisting of complete adjuvant, and Freund's incomplete Freund's adjuvant, pharmaceutical composition according to claim 21. The antigen or immunological epitope source may be a protein, peptide, antibody, anti-idiotype antibody, lipid, carbohydrate, cell, cell extract, cell fragment, DNA encoding the antigen or an immunological epitope thereof, 22. The pharmaceutical composition according to claim 21, which is an RNA encoding an immunological epitope, or at least one antigen or a vector encoding the immunological epitope thereof. The antigen is selected from the group consisting of a tumor-specific antigen, a tumor-associated antigen, a tissue-specific antigen, a bacterial antigen, a viral antigen, a yeast antigen, a fungal antigen, a protozoan antigen, a parasite antigen and a mitogen. 22. The composition of claim 21, wherein 22. The composition of claim 21, wherein the immunological epitope comprises at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 36 and combinations thereof. Bacterial antigens include Chlamydia, Mycobacteria, Legionella, Meningiococus, Group A Streptococcus (Streptococcus), Hemophilus infalis salis, Monaco spp. 25. The composition of claim 24, wherein the composition is derived from a bacterium selected from the group consisting of: 25. The composition of claim 24, wherein the viral antigen is derived from a virus selected from the group consisting of a lentivirus, a retrovirus, a herpes virus, a hepatitis virus, an orthomyxovirus and a papilloma virus. 28. The composition of claim 27, wherein the lentivirus is HIV-1 or HIV-2. 28. The composition of claim 27, wherein the herpes virus is HSV or CMV. 28. The composition of claim 27, wherein the hepatitis virus is hepatitis A, B, C, D or E. 28. The composition of claim 27, wherein the orthomyxovirus is an influenza virus. Tumor associated antigen, tumor specific antigen or tissue-specific antigen is CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, point mutated ras oncogene, normal Or point mutated p53, overexpressed p53, CA-125, PSA, PSMA, C-erb / B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1 TAG72, KSA, HER-2 / neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, modified TAAs, splice variants of TAAs, their functional epitopes and epitope agonists. 25. The composition of claim 24, wherein The yeast or fungal antigen is a yeast selected from the group or a fungus from the group consisting of Aspergillus, Nocardia, Histoplasmosis, Candida, and Cryptosporidia. 25. The composition of claim 24, wherein 25. The composition of claim 24, wherein the parasite antigen is of the composition described in Plasmodium species, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Trypanosoma species, or Leishmania species of Leishmania. 24. The method of claim 23, wherein the vector encoding the antigen or immunological epitope thereof is selected from the group consisting of poxvirus, adenovirus, herpes virus, alphavirus, picornavirus, iridovirus, DNA plasmid, and RNA. Composition. 36. The composition of claim 35, wherein the poxvirus is orthopox, avipox, capripox or suipox. The antigen is selected from the group consisting of a tumor-specific antigen, a tumor-associated antigen, a tissue-specific antigen, a bacterial antigen, a viral antigen, a yeast antigen, a fungal antigen, a protozoan antigen, a parasite antigen, and a mitogen 36. The composition of claim 35, wherein 36. The composition of claim 35, wherein the immunological epitope comprises at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 36, and combinations thereof. 24. The composition of claim 23, wherein the antigen or immunological epitope source is a vector encoding at least one antigen or antigenic epitope thereof. The vector is from the group consisting of B7-1, B7-2, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, OX-40L, VCAM-1, their mammalian homologs and combinations thereof. 24. The composition of claim 23, which encodes at least one costimulatory molecule selected. 41. The composition of claim 40, wherein the costimulatory molecule is B7.1. 41. The composition of claim 40, wherein the costimulatory molecule is at least B7-1, ICAM-1 and LFA-3. The recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF is avipox, the antigen source is CEA or a vector encoding its epitope, and the costimulatory molecule is B7 or B7.1 / LFA-3 / ICAM-1. 41. The composition of claim 40, wherein 16. The composition according to any one of claims 1 to 15, further comprising a cytokine, chemokine or Flt-3L. 16. The composition according to any one of the preceding claims, further comprising at least one antibiotic, antifungal, anti-viral or a combination thereof. The composition of any one of claims 1 to 6, further comprising erythropoietin. 47. The composition of claim 46, wherein the erythropoietin is produced recombinantly. A host cell infected, transfected or induced with a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF according to any one of claims 1 to 15 and 21 to 47. 49. The host cell according to claim 48, which is an antigen presenting cell or a precursor cell thereof, a premalignant cell, a hyperplastic cell, a tumor cell, or a tumor cell fused with an antigen presenting cell. 50. The host cell of claim 49, wherein the antigen presenting cell is a dendritic cell or progenitor cell or derivative thereof, monocyte, macrophage, B-cell, fibroblast or muscle cell. 51. The host cell according to any one of claims 49 or 50, wherein the antigen presenting cell is derived from bone marrow, spleen, skin, peripheral blood, tumor, lymph node, or muscle. 51. The host cell of claim 50, wherein the derivative is a TNF [alpha] -treated dendritic cell, a CD40-treated dendritic cell, or a subpopulation of adherent cells. A dendritic cell or progenitor cell thereof comprising an exogenous nucleic acid sequence encoding GM-CSF provided by a recombinant replication-defective virus. A tumor cell or progenitor cell thereof comprising an exogenous nucleic acid sequence encoding GM-CSF provided by a recombinant replication-defective virus. 55. The cell of claim 53 or 54, further comprising an exogenous nucleic acid sequence encoding at least one costimulatory molecule. Co-stimulatory molecules are derived from B7-1, B7-2, ICAM-1, LFA-3, 4-1BBL, CD59, CD40, CD70, OX-40L, VCAM-1, their mammalian homologs, and combinations thereof. 56. The cell of claim 55, wherein the cell is selected from the group consisting of: 57. The cell of claim 56, wherein the costimulatory molecule is B7.1. 57. The cell of claim 56, wherein the plurality of costimulatory molecules are at least B7-1, ICAM-1, and LFA-3. 59. The cell according to any one of claims 53 to 58, further comprising an exogenous nucleic acid sequence encoding at least one target antigen or immunological epitope thereof. An exogenous nucleic acid sequence encoding at least one target antigen or immunological epitope thereof is provided by a recombinant vector, RNA or DNA from a tumor cell lysate, or by fusion with a tumor cell containing said sequence. 60. The cell of claim 59. The target antigen or its immunological epitope is a tumor-specific antigen, a tumor-associated antigen, a tissue-specific antigen, a bacterial antigen, a viral antigen, a yeast antigen, a fungal antigen, a protozoan antigen, a parasite antigen and 61. The cell of any one of claims 59 or 60, wherein the cell is selected from the group consisting of a mitogen. 61. The cell according to any one of claims 59 or 60, wherein the immunological epitope comprises at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 36, and combinations thereof. . 63. A pharmaceutical composition comprising a cell according to any one of claims 53 to 62, and optionally a foreign source of a target antigen or an immunological epitope thereof. 48. A method of improving an immune response in an individual, comprising administering a composition according to any one of claims 1 to 15 and 21 to 47 in an amount sufficient to enhance the immune response. The administration route is intravenous, subcutaneous, intralymphatic, intratumoral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, rectal, vaginal, intranasal, oral, transvesical drug injection, intranasal, intraarterial, intravesicular (intravesical). 65. The method of claim 64, wherein the method is via scariation. 65. The method of claim 64, wherein the enhancement is migration of antigen presenting cells at an injection site, a regional lymph node, a tumor site, or a combination thereof. 67. The method of claim 66, wherein the antigen presenting cell expresses CD11c ⁺ / I-Ab ⁺ , MHC class II, or a combination thereof. 67. The method of claim 66, wherein the improvement is an increase in antigen-presenting cell proliferation or function or a combination thereof. 65. The method of claim 64, wherein the enhancing the immune response is enhancing a cell-mediated or humoral response. 65. The method of claim 64, wherein the enhancement is enhanced CD4 ⁺ T cell activation, enhanced CD8 ⁺ T cell activation, or a combination thereof. 65. The method of claim 64, wherein the improvement is an increase in IL-2 production, an increase in IFN- [gamma] production, an increase in TNF- [alpha] production, or a combination thereof. A method for improving an antigen-specific T-cell response in an individual against a target antigen or an immunological epitope thereof, comprising the steps of: encoding a recombinant replication-defective poxvirus encoding GM-CSF with the target antigen or an immunological epitope thereof And at least one recombinant nucleic acid sequence also encoding a foreign nucleic acid sequence encoding at least one B7 molecule, an exogenous nucleic acid sequence encoding ICAM-1, and a nucleic acid sequence encoding LFA-3. Such a method, comprising administering an effective amount to enhance one T-cell response. 73. The method of claim 72, wherein the enhancement is enhanced CD4 ⁺ T cell activation, enhanced CD8 ⁺ T cell activation, or a combination thereof. 73. The method of claim 72, wherein the improvement is an increase in IL-2 production, an increase in IFN-γ production, or a combination thereof. 73. The method of claim 72, wherein the improvement is an increase in antigen-specific cytotoxicity. 48. A method for improving an anti-tumor response in an individual having a tumor, comprising administering the composition of claim 1 to 15 or 21 to 47 in an amount effective to improve the anti-tumor response. , Said method. 77. The method of claim 76, further comprising administering the target antigen or immunological epitope thereof, cells expressing the target antigen or immunological epitope thereof, or cells pulsed with the target antigen or immunological epitope thereof. Method. 78. The method of any one of claims 76 or 77, wherein the composition is injected directly in situ into or adjacent to the tumor. 79. The method of claim 78, wherein the tumor is a head tumor, neck tumor, melanoma, breast tumor, pancreatic tumor, prostate tumor, colorectal tumor, or metastatic tumor. 80. The method of claim 79, wherein the tumor is a metastatic breast skin lesion. 80. The method of any one of claims 76-79, wherein the composition is injected during a surgical procedure. 82. The method of claim 81, wherein the tumor is a colorectal or pancreatic cancer. 80. The method of any one of claims 76-79, wherein the composition is injected into a lymph node remote from or draining from the tumor site. 80. The method of any one of claims 76 to 79, further comprising administering activated target antigen-specific lymphocytes. 80. The method of any one of claims 76-79, wherein the anti-tumor response is tumor regression, increased interval in the absence of disease, or increased survival. 63. A method for improving an immune response in an individual, comprising administering a cell according to any one of claims 48 to 62 in an amount sufficient to enhance an immune response. 55. A method of improving an immune response in an individual, comprising administering the tumor cell of claim 49 or 54, or a precursor cell thereof, in an amount sufficient to enhance the immune response. 88. The method of any one of claims 86 or 87, wherein the cells are autologous to the individual, syngeneic or allogeneic to the individual. 88. The method of claim 86 or 87, wherein the cells have been pulsed with the target antigen or an epitope thereof. 88. The method of any one of claims 86 or 87, further comprising a target cell, a target antigen or an immunological epitope thereof. 91. The method of any one of claims 86-90, further comprising administering activated, target antigen-specific lymphocytes. Administering a first recombinant vector encoding GM-CSF, followed by administering a second recombinant vector encoding GM-CSF, wherein the immune response to the antigen or immunological epitope thereof in the individual is determined. A method of improving, wherein said at least one recombinant vector is a replication-defective virus. 93. The method of claim 92, wherein the replication-defective virus is selected from the group consisting of a poxvirus, a herpes virus, an adenovirus and an adeno-associated virus. 94. The method of claim 93, wherein the poxvirus is selected from the group consisting of fowlpox virus, canarypox and a modified vaccinia Ankara strain. 93. The method of claim 92, wherein the second recombinant vector is capable of replication. 97. The method of claim 95, wherein the second vector is vaccinia. A method of treating neutropenia in an individual, comprising administering a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF in an amount effective to treat neutropenia. 100. The method of claim 97, further comprising administering an antibiotic, antifungal, antiparasitic, or antiviral. 100. The method of claim 97, wherein the neutropenia results from chemotherapy, corticosteroid therapy, radiation, or infection. 100. The method of any one of claims 97-99, wherein the dose increases neutrophil counts to normal levels. Treating cytopenia in a patient with myelodysplastic syndrome, comprising administering a recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF with erythropoietin in an amount effective to treat cytopenia. Way for. 102. The method of claim 101, wherein the recombinant replication-defective virus encoding GM-CSF at a dose ranging from about 10 < ⁵ > to about 10 < ¹⁰ > pfu is administered every other week or every month. 103. The method of any one of claims 101 or 102, wherein a dose of erythropoietin ranging from about 150 to about 300 u / k is administered. 105. The method of any one of claims 101-104, wherein the dose is provided every other day. 105. The method of any one of claims 101-104, wherein the treatment increases neutrophil counts and erythroid progenitor cells. A method for improving an anti-tumor immune response, comprising administering a replication-defective virus encoding GM-CSF in combination with a bispecific antibody. 107. The method of claim 106, wherein the bispecific antibody has tumor-directed specificity. 108. The method of claim 107, wherein the bispecific antibody has a specificity selected from the group consisting of HER-2 / neu, EGF-receptor, CD15 antigen and EpCAM molecule. 109. The method of any one of claims 107-108, wherein the bispecific antibody is directed against a tumor cell epitope and a cytotoxic trigger molecule. A method of improving an immune response to vaccination comprising administering to a vaccination site or a local lymph node a replication-defective virus encoding GM-CSF in an amount effective to enhance the immune response to the vaccine. . 1 12. The method of claim 1 10, wherein the vaccine comprises at least one tumor antigen or tumor associated antigen. Vaccines are DPT vaccine, Td vaccine, DtaP vaccine, Hib vaccine, DtaP-Hib vaccine, MMR vaccine, hepatitis A vaccine, hepatitis B vaccine, Lyme disease vaccine, influenza vaccine, tetravalent meningococcal polysaccharide, pneumococcus 111. The method of claim 110, wherein the method is selected from the group consisting of a polysaccharide vaccine, an anthrax vaccine, a cholera vaccine, a plague vaccine, a yellow fever vaccine, and a Bacillus Calmette-Guerin vaccine. An immunological adjuvant comprising a replication-defective virus encoding a granulocyte-monocyte-colony stimulating factor. Accession No. to American Type Culture Collection. Plasmid vector encoding human granulocyte-monocyte-colony stimulating factor deposited as PTA-2099.

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