JP2004506896A

JP2004506896A - 微小流スプリッター

Info

Publication number: JP2004506896A
Application number: JP2002519931A
Authority: JP
Inventors: ルーベン・アルバート・トマシー
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2000-08-16
Filing date: 2001-08-14
Publication date: 2004-03-04
Also published as: WO2002014853A1; EP1325320A1; AU2001293774A1; US6289914B1

Abstract

この発明は、特に分析化学における分離技術、例えば、微小液クロマトグラフィー（ＭＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および補助的技術に使用される流れシステム用マイクロスプリッターに関する。このスプリッター系は、微小径チューブによって連結されたマイクロスプリッターとマイクロミキサーを具有する。チューブの長さと直径の特有の選択および制御スプリット比を得るための背圧レギュレーターの使用によって、サンプルピークの高分解能と高捕集率が達成される。

Description

【０００１】
（技術分野）
この発明は、特に分析化学における分離技術、例えば、微小液クロマトグラフィー（ＭＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および補助的技術（ａｎｃｉｌｌａｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）に使用される流れシステム用マイクロスプリッター（ｍｉｃｒｏｓｐｌｉｔｔｅｒ）に関する。
【０００２】
（背景技術）
ＭＬＣやＨＰＬＣのような分離技術は分析化学において一般的に使用されている。これらの分離技術は、有機反応生成物の分離と精製に対して、高い分離効率、高い質量感度および高い分解能を提供する。これらの技術は、薬剤開発のための薬学的研究において特に利用されている。通常は、サンプルの検出のためにはＵＶセルまたは光散乱セルが使用されている。このようなセルは、ＨＰＬＣスペクトロメーターとフラクションコレクター（ｆｒａｃｔｉｏｎｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）との間に直列的に配置され、ＨＰＬＣの流れが該セル内を通過する。しかしながら、ＵＶセルは物質の同定には不適当である。このため、サンプルの同定には、マススペクトロメーターのような別の検出装置が必要となる。
【０００３】
特定の検出器システムにおいては、ほんの僅かな量のサンプルが要求されるので、試料の調製規模で得られる比較的多量のサンプルを取扱うことはできない。これらの検出器システムにおいては、検出器からのサンプルを方向変換させるために、流れの中にスプリット（ｓｐｌｉｔ）を配置することが必要となる。サンプルに対して破壊的な方法、例えば、マススペクトロメトリーや光散乱法の場合には、サンプルの大部分をフラクションコレクターの方へ方向変換させることによって所望の物質を捕集するために、流れの中にスプリットを設けることが要求される。
【０００４】
流れスプリッターは既に知られている。ヨーロッパ特許公報ＥＰ４９５２５５Ａ１には、マイクロミキサーとマイクロスプリッターから成る流れスプリッターが記載されている。しかしながら、現在得られているその機能は、サンプルピーク（ｓａｍｐｌｅｐｅａｋ）の大きなブローディング（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ）をもたらすために、効率が失われ、純粋な形態で捕集されるべきサンプルの潜在的な再混合がおこる。
【０００５】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
本発明は、より高い捕集率、最小限のサンプル損失およびサンプルピークのより高い分解能をもたらす微小流（ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ）スプリッタアーシステムを提供するためになされたものである。
【０００６】
（その解決方法）
この課題は、本発明によれば、微小径チューブで連結されるマイクロスプリッターとマイクロミキサーを含むスプリッターシステムから成る微小流スプリッター装置によって解決される。高い捕集率とサンプルピークの高い分解能はチューブの長さと直径の固有の選定および制御スプリット比を得るための背圧レギュレーターの使用によって達成される。より具体的には、本発明は、微小分離技術、特に、マススペクトロメーターによって検出されて同定されるＨＰＬＣサンプルフラクションの捕集のための分離技術において普通流量（ｍｌ／分）を微小流量（μｌ／分）に変換させるための微小流スプリッター装置であって、微小径チューブ（４）によって連結されるマイクロスプリッター（２）とマイクロミキサー（３）を具備し、マイクロミキサー（３）がマイクロスプリッター（２）の後に配置され、マイクロスプリッター（２）が、背圧レギュレーター（１９）とフィルターフリット（ｆｉｌｔｅｒｆｒｉｔ）（１８）を具有するフラクションコレクター（９）の方向への流れのための大径チューブ（８）へ連結される微小流スプリッター装置を提供する
【０００７】
別の態様においては、本発明は、微小分離技術、特に、サンプルを同定するためにマススペクトロメーターに接続しておこなうＨＰＬＣ技術において普通流量（ｍｌ／分）を微小流量（μｌ／分）に変換させるための微小流スプリッター装置の製法であって、以下のステップ（ａ）〜（ｅ）を含む該製法を提供する：
（ａ）マイクロミキサーをマイクロスプリッターの後に配置し、
（ｂ）マイクロスプリッターとマイクロミキサーを微小径チューブで連結させ、
（ｃ）フラクションコレクターの方向への流れのための大径チューブをマイクロスプリッターに連結させ、
（ｄ）背圧レギュレーターを大径チューブの内部へ挿入し、次いで、
（ｅ）フィルターフリットを大径チューブの内部へ挿入する。
【０００８】
本発明のさらに別の態様と利点は、以下の記載と添付図から明らかになるであろう。
図１は、本発明による微小流スプリッター装置の一態様を示す模式的構成図である。
図２は、微小流スプリット比を測定するためのステップを示す。
図３は、スプリッターを用いないＨＰＬＣトレース（Ａ）と市販のスプリッターを用いたＨＰＬＣトレース（Ｂ）の比較を示す。
図４は、スプリッターを用いないＨＰＬＣトレース（Ａ）と本発明によるスプリッターを用いたＨＰＬＣトレース（Ｂ）の比較を示す。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
微小流スプリッター装置（１）の構成を図１に示す。該装置は、微小径チューブ（４）によって連結されたマイクロスプリッター（２）とマイクロミキサー（３）を具備し、これらの構成部材は保護ボックス内に収納するのが好ましい。微小径チューブ（４）としては、一般的に半径が１０〜２５μｍで長さが２〜１０ｃｍの石英ガラスチューブを用いるのが有利である。マイクロスプリッター（２）は、ポート（５）とポート（７）を有するＴ−フィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）から成り、該ポート（５）はＨＰＬＣ流のためのＨＰＬＣチューブへ接続するのが好ましく、また、該ポート（７）はフラクションコレクター（９）へ接続するチューブ（８）内を流通する流れのためのポートである。マイクロミキサー（３）もＴ−フィッティングから成り、該フィッティングがポート（１０）と第二のポート（１２）を有しており、該ポート（１０）は補給流用チューブ（１１）のためのポートであり、また、該ポート（１２）は、検出器、例えば、マススペクトロメーター等へ接続されたチューブ（１３）のためのポートである。これらの構成部材の接続のためには、高い圧力に耐えると共に十分な化学的安定性を示すフィッティングであればいずれのタイプのもの（例えば、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）またはステンレス鋼等）であっても使用できる。
【００１０】
ＨＰＬＣからのＨＰＬＣ流はマイクロスプリッター（２）内へ流入し、Ｔ−フィッティングによって２つの流れ、即ち、フラクションコレクター（９）へ向かう流れＦ_１とマイクロミキサー（３）へ向かう流れＦ_２に分割される。本発明による微小流スプリッター装置によって達成されるスプリット比（ｓｐｌｉｔｒａｔｉｏ）は１０００：１〜１００００：１の範囲である。溶媒として水を使用することによって、５０００：１のスプリット比を達成することができる。スプリット比は、下記のハーゲン−ポアズイユ式を利用することにより、長さと直径が異なるチューブを用いることによって達成することができる。
Ｆ＝（πΔｐｒ^４）／（８Ｌη）
式中、Ｆはチューブを通る流量を示し、Δｐはチューブに沿った圧力差を示し、ｒはチューブの半径を示し、Ｌはチューブの長さを示し、また、ηはチューブ内を通過する流体の粘度を示す。
【００１１】
理論的には、スプリット比は次式によって決定される：
スプリット比＝流れＦ_１／流れＦ_２
式中、Ｆ_１はチューブ（８）内を流通する流量を示し、Ｆ_２はチューブ（４）内を流通する流量を示す。Ｆ_１とＦ_２は上記のハーゲン−ポアズイユ式によって計算することができる。実験的には、スプリット比は、図２に示すような流量測定装置を組み立てることによって決定される。微小流スプリッター（１）は２つの流れ（１５）と（１６）、即ち、ＨＰＬＣ流（２５ｍｌ／分）と補給流（０．１〜１．０ｍｌ／分）の閉鎖流路の間のコネクションとして配置される。これらの流れは同時に出発し、流量と溶剤組成（水またはアセトニトリル）を一定にした条件下で２４〜９６時間流動する。
【００１２】
流れの分割によって、メスシリンダー（１７）内の流体の体積は、スプリット比と実験をおこなう時間の関数として増加する。微小流の流量は、メスシリンダー（１７）内の流体の体積変化を測定し、この変化量を、実験をおこなった時間で割ることによって決定される（流量＝体積／時間）。スプリット比は、微小流の流量で割り算されるＨＰＬＣ流の流量として決定される。ＨＰＬＣ流の少量の変化は無視できるので（即ち、＜＜１％）、スプリット比はこの方法によって決定することができる。ハーゲン−ポアズイユ式によって理論的に決定されるスプリット比は実験によって、±１０％の範囲で確認することができる。
【００１３】
本発明によるマイクロスプリッターの効率にとって重要な点は、微小径チューブ（４）およびフラクションコレクター（９）へ接続されるチューブ（８）の直径を特有の値に選択することである。石英ガラス製の微小径チューブから成る微小径チューブ（４）は１０〜２５μｍ、好ましくは１５μｍの半径および２〜１０ｃｍ、好ましくは５ｃｍの長さを有する。フラクションコレクター（９）へ接続されるチューブ（８）は、一般的には４０〜８０Ｔｈｓ、好ましくは６０Ｔｈｓ（１Ｔｈ＝１／１０００インチ）の直径を有する大径チューブから構成されるべきである。ＨＰＬＣチューブ（６）は一般的にはＰＥＥＫ製またはステンレス鋼製であり、その直径は１０〜３０Ｔｈｓであり、また、その長さは５〜５０ｃｍ、好ましくは１０〜３０ｃｍである。層流を確実に発生させるために、フィルターフリット（１８）は、大径チューブ（８）の入口とポート（７）の間に配置させる。このフリット（１８）が存在しない場合には、乱流が発生し、サンプルのブロード化とサンプルの再混合が引き起こされる。より小さな直径および／またはより長い長さを有する大径チューブ（８）を使用する場合には、壁効果ｗａｌｌｅｆｆｅｃｔ）に起因して、サンプルの激しいブロード化がもたらされる。さらに、流れＦ_１とＦ_２は圧力差Δｐによって左右されるので、流れの不安定な変動を回避して制御された分割比を得るために、背圧レギュレーター（１９）を大径チューブ（８）の端部に設置する。有用な背圧は２０〜１００ｐｓｉ、好ましくは２０〜５０ｐｓｉである。
【００１４】
ＨＰＬＣ流は一般的には１０〜５０ｍｌ／分である。分割比が５０００：１の場合には、微小流は２〜１０μｌ／分となる。微小流の検出器への輸送を保証するために、０．１〜１．０ｍｌ／分の補給流を供給する。微小流Ｆ_２はマイクロミキサー（３）内において補給流と混合された後、検出器（１４）へ輸送される。フラクションコレクターへの流れＦ_１の到達を遅延させるためには、チューブ（８）内を通過するのに必要な時間を、チューブ（１３）内を通過するのに必要な時間よりも長くしなければならない。好ましくは、チューブ（８）の長さは約９０〜１５０ｃｍであり、約１〜７秒間の遅延時間が得られる。これによって、マススペクトロメーターまたはその他の検出器による検出の前に、サンプルがフラクションコレクターへ到達するのを遅延させることが可能となる。
【００１５】
サンプルのピーク幅に対する微小流スプリッター装置の効果を図３と図４に示す。図３と図４に示すグラフは全て同一のスケールで示している。標準サンプルのピーク幅と直接的に比較するために、全ての実験においては、サンプルの流動条件は同一にした。図３の（Ａ）においては、スプリッターを使用しない場合の標準サンプルのピーク幅を示す。ＨＰＬＣシステムに市販のスプリッター装置を使用した場合には、図３の（Ｂ）に示すようなサンプルのブロード化がもたらされた。サンプルの捕集は、マススペクトロメーターによって決定される捕集窓（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｗｉｎｄｏｗ）においておこなわれるので、図３（Ｂ）において灰色で示される部分のサンプルはサンプルコレクターによって捕集されないので失われる。図中の垂直線は、サンプルがＭＳ検出器によって捕集されるならば、捕集されるべきサンプルの幅を示す。本発明による微小流スプリッターの効果を図４（Ｂ）に示す。市販のスプリッターを使用した場合に比べて、より鋭いピークが得られており、失われるサンプル量はより少なくなる。灰色の領域はより狭くなっており、また、ピーク幅（ピークの半分の高さにおいて測定した幅）は、微小流スプリッターを使用しないときの標準サンプルのピーク幅と非常に近接している。
【００１６】
さらに、スプリット比が１０００：１〜１００００：１の場合、シグナルの検出のためには非常に少量のサンプルが使用されるので、検出シグナルのより高い分解能が達成される。これによって、壁効果に起因するサンプルのブロード化の抑制と共に、ＨＰＬＣから送給されるサンプルの回収率は８５〜９０％となり、この値は、市販の流れスプリッターによって達成される回収率（４５〜５５％）に比べてかなり高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による微小流スプリッター装置の一態様を示す模式的構成図である。
【図２】微小流スプリット比を測定するためのステップを示す。
【図３】スプリッターを用いないＨＰＬＣトレース（Ａ）と市販のスプリッターを用いたＨＰＬＣトレース（Ｂ）の比較を示す。
【図４】スプリッターを用いないＨＰＬＣトレース（Ａ）と本発明によるスプリッターを用いたＨＰＬＣトレース（Ｂ）の比較を示す。
【符号の説明】
１…微小流スプリッター装置
２…マイクロスプリッター
３…マイクロミキサー
４…微小径テューブ
５…ポート
７…ポート
８…大径テューブ
９…フラクションコレクター
１０…ポート
１１…補給流用テューブ
１２…ポート
１３…テューブ
１５…流れ
１６…流れ
１７…メスシリンダー
１８…フィルターフリット
１９…背圧レギュレーター

Claims

微小分離技術において普通流量（ｍｌ／分）を微小流量（μｌ／分）に変換させるための微小流スプリッター装置であって、微小径チューブ（４）によって連結されるマイクロスプリッター（２）とマイクロミキサー（３）を具備し、マイクロミキサー（３）がマイクロスプリッター（２）の後に配置され、マイクロスプリッター（２）が、背圧レギュレーター（１９）とフィルターフリット（１８）を具有するフラクションコレクター（９）の方向への流れのための大径チューブ（８）へ連結される微小流スプリッター装置。
マイクロスプリッター（２）がＴ−フィッティングから成る請求項１記載の微小流スプリッター装置。
マイクロミキサー（３）がＴ−フィッティングから成る請求項１記載の微小流スプリッター装置。
大径チューブ（８）が４０〜８０Ｔｈｓの直径を有する請求項１記載の微小流スプリッター装置。
微小径チューブ（４）が半径１０〜２５μｍの石英ガラス製チューブである請求項１記載の微小流スプリッター装置。
微小径チューブ（４）が２〜１０ｃｍの長さを有する請求項１記載の微小流スプリッター装置。
フィルターフリット（１８）が、大径チューブ（８）の入り口に配置される請求項１記載の微小流スプリッター装置。
背圧レギュレーター（１９）が大径チューブ（８）の端部に配置される請求項１記載の微小流スプリッター装置。
背圧レギュレーター（１９）によってもたらされる背圧が２０〜１００ｐｓｉである請求項１記載の微小流スプリッター装置。
背圧レギュレーター（１９）によってもたらされる背圧が２０〜５０ｐｓｉである請求項９記載の微小流スプリッター装置。
微小分離技術において普通流量（ｍｌ／分）を微小流量（μｌ／分）に変換させるための微小流スプリッター装置の製法であって、以下のステップ（ａ）〜（ｅ）を含む該製法：
（ａ）マイクロミキサー（３）をマイクロスプリッター（２）の後に配置し、
（ｂ）マイクロスプリッター（２）とマイクロミキサー（３）を微小径チューブ（４）で連結させ、
（ｃ）フラクションコレクター（９）の方向への流れのための大径チューブ（８）をマイクロスプリッター（２）に連結させ、
（ｄ）背圧レギュレーター（１９）を大径チューブ（８）の内部へ挿入し、次いで、
（ｅ）フィルターフリット（１８）を大径チューブ（８）の内部へ挿入する。