JP2004504659A

JP2004504659A - 基板における所望領域の位置決め法

Info

Publication number: JP2004504659A
Application number: JP2002512708A
Authority: JP
Inventors: ウィルヘルムス・マリナス・カルパイジュ
Original assignee: パムジーン・ベー・ベー
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2004-02-12
Also published as: US20040019433A1; EP1301806A1; WO2002006854A1; AU2001279739A1

Abstract

基板内の少なくとも一領域の信号強度であってバックグランド強度を有するものをコンピュータによって評価する方法において、基板の散乱パラメータを決定する。また、領域及びその周囲を囲む評価ウィンドウ内に位置する画素強度のマトリックス（ＩＳ）が決定される。マトリックス（ＩＳ）の画素強度は画素強度のヒストグラムを得るのに用いる。この評価ヒストグラムは２つの分布ピークを示す。低い強度の第１の分布ピークは周囲画素に対応し、高い強度の第２の分布ピークは領域画素に対応する。２つの分布ピークを有する曲線はこの評価ヒストグラムでフィッティングされる。散乱パラメータを用いて、散乱についてマトリックス（ＩＳ）又はフィッティングされた曲線を補正する。領域での画素信号強度は、画素強度ヒストグラムでフィッティングされた曲線から得られたデータによって決定される。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板に埋め込まれている基板の少なくとも一の領域の信号強度であってバックグランド強度を有するものをコンピュータによって評価する方法、及び、基板に埋め込まれている基板の関心有力領域を位置決めする方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術題】
米国特許出願第５，７９５，７１６号明細書は、コンピュータ支援画像技術において使用されるこのタイプの方法及び塩基配列評価の分析装置を開示している。通常、基板は領域のアレイを備えている。ここで、各領域は、分析物と特別に結合することができる、公知の結合物質あるいはプローブを有する。アレイを用いることができる分析（検定）には、交雑（ハイブリダイゼーション）、免疫検査（測定）、レセプター／配位子検査等が含まれてもよい。例えば、アレイは、多数の分析物の存在のために、血液のような生物学的試料を遮蔽するために用いてもよい。基板を一又は二以上の分析物を含む液体に接触させるならば、反応パターンが生成されて、アレイの結合物質について分析物の特定の親和性を示すものでもよい。アレイは核酸プローブを含む領域から成ってもよい。アレイは、ウィルスあるいはバクテリアの核酸の検出及び／又は型別のため、又は突然変異の検出のために用いてもよい。同様に、アレイは免疫検査を実施するのに用いることもできる。その場合には、結合物質あるいはプローブは抗原（ペプチド）あるいは抗体であってもよい。分析物を結合物質に結合することによって、蛍光信号のような検出可能な信号は、例えば、第２の標識（ラベル付き）試薬に結合することによって生成される。例えば、スキャナーはイメージファイルを生成し、このイメージファイルを評価して各領域の信号強度を決定する。正確な情報を得るために、結合物質が配置する場所である当該領域の信号強度を正確に決定することが非常に重要である。公知の方法では、この信号強度は“ブランク”領域のバックグランド強度を用いることによって決定される。ここで、ブランク領域はバックグランド強度だけを与えると仮定されている。しかしながら、確実にバックグランド強度だけを提供する基板における領域を見つけることは非常に困難である。さらに、公知の方法の多くは、この方法で決定された一のバックグランド強度は、基板の表面に沿ったバックグランド強度の変動を全く考慮していない。さらに、基板における散乱に起因する測定信号強度における効果も全く考慮されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述のタイプの改良型の方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明では、基板に埋め込まれている基板の少なくとも一の領域の信号強度であってバックグランド強度を有するものをコンピュータによって評価する方法において、基板の散乱パラメータを決定し、領域及びその周囲部を囲む評価ウィンドウ内に位置する画素の画素強度のマトリックス（Ｉ_Ｓ）を決定し、ここで、マトリックス（Ｉ_Ｓ）の画素強度は画素強度の評価ヒストグラムを得るのに用い、前記評価ヒストグラムは２つの分布ピークを示し、低い強度の第１の分布ピークは周囲画素に対応し、高い強度の第２の分布ピークは領域画素に対応し、２つの分布ピークを有する曲線は前記評価ヒストグラムでフィッティングされ、散乱パラメータを用いて、散乱についてマトリックス（ＩＳ）又はフィッティングされた曲線を補正し、領域での画素信号強度は前記評価ヒストグラムでフィッティングされた曲線から得られたデータによって決定されることを特徴とする。
【０００５】
このように、基板の散乱特性について、領域とその周囲の両方の画素強度を補正することによって、向上した精度で領域における画素の平均信号強度を決定する方法が得られる。本発明の方法では、バックグランド強度の評価は当該領域の信号強度の評価の本質的な一部である。それによって、バックグランド強度を決定するために基板の一部を位置決めする独立の段階は必要とされず、さらに、基板の表面に沿ったバックグランド強度の変動は評価結果には影響しないように、各領域のバックグランド強度が対応する領域に近接する位置で決定される。
【０００６】
本発明はさらに、基板周囲に埋め込まれている基板の所望の有力領域をコンピュータによって位置決めする方法において、基板のイメージファイルをローパスフィルタアルゴリズムで処理してイメージファイルの全画素について局所的平均値のマトリックスを決定し、局所的平均値のマトリックスはイメージファイルの実際の画素値のマトリックスと結合して、実際の画素値に依存する高又は低のいずれかが対応する局所的平均値より上又は低いのいずれかである高／低画素値の第１のマトリックスを得、第１のマトリックスの高／低画素値をさらに中央フィルタアルゴリズムで処理して中央画素値の第２のマトリックスを得、各中央画素値は第１のマトリックスの高／低画素値の多数と等しく、中央画素値を列毎及び行毎に処理して平均列値及び平均行値をそれぞれ決定し、最大平均列値及び最大平均行値は所望の有力領域の列中心線と行中心線の評価として選択し、ここで、それら列中心線と行中心線の交点が所望の有力領域の中心であることを特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
基板周囲に埋め込まれている基板の領域の信号強度を評価する本発明の方法は、コンピュータで使用するコンピュータプログラムとして使用される。この方法は、例えば、交雑された核酸プローブの信号強度を分析することによる塩基配列評価のために用いることができる。しかしながら、上述のように、基板は、免疫検査（測定）、レセプター／配位子検査等の他の分析について用いることができる。本発明の方法は信号強度の評価だけに関するので、塩基配列評価の方法は詳述しない。例えば、国際公開第９９０２２６６号パンフレットを参照されたい。
【０００８】
このような塩基配列評価においては、国際公開第９９０２２６６号パンフレットに記載されているような、例えば、図３で示しような場合において、各領域あるいはドットが公知の塩基配列を有するプローブを有する６×４領域１のアレイを有する基板が使用できる。蛍光ラベル（標識）を有する材料が基板の表面に接触するとき、標識材料の異なる濃度が異なるドット領域で見つけられる。基板の照明は、各ドット領域１に起因する蛍光を与え、図３はＣＣＤカメラによって得られたイメージを示す。この場合には蛍光が得られるが、本発明の方法は蛍光強度を評価することには限定されない。本発明の方法は、周囲に埋め込まれている領域からの信号強度の種類を評価することを含む。図３で示したイメージをコンピュータ、例えば、ハードディスクに、イメージファイルとして格納する。図３からわかるように、周囲からドット領域１への鋭い遷移（トランジッション）はなく、そのため、ドット領域１の近傍におけるバックグランド強度を決定するために位置を見つけることは困難である。ドット領域から周囲への漸進的なあるいはぼやけた遷移は標識材料の蛍光の散乱に起因する。この散乱効果を補正するために、基板の散乱パラメータを本発明の方法で決定する。
【０００９】
図１は例えば、基板の散乱パラメータを決定する方法を示している。図１は、この例では、６０μｍの層厚を有する基板を側方から照射したイメージである。図１では、ライン（線）２は画素強度が決定される線に沿って描かれている。“画素強度”の語は、ＣＣＤカメラあるいはアレイのイメージを提供するのに用いられる他の種類のイメージング装置の一の画素から得られた信号強度を示すために用いられることに留意されたい。このライン２に沿って測定された画素強度から、図２に示したような、この場合は３３．８μの特徴的な減衰を有する指数散乱関数を作ることができる。この特徴的な散乱減衰は基板の散乱効果について測定された画素強度を補正するために本発明の方法で用いる。この方法で決定された散乱減衰を基板の側方照射によって測定するときは、通常の測定環境において使用されるイメージング装置に直接向かう散乱されない照射は考慮されない。散乱なしで直接基板に起因するこのような信号強度を補正するために、例えば、全画素について受ける信号強度の予め決めた割合を差し引くことができる。
【００１０】
図１では乾燥（ドライ）基板を測定される点に留意されたい。ウェット状態についての同じ基板の散乱パラメータは対応する方法で決定することができる。異なる種類の基板についてさらなる散乱パラメータを決定してコンピュータに保存することができる。評価法では、格納された散乱パラメータを、使用される基板の種類及び状態に応じてコンピュータのメモリから選択することができる。適当な入力装置を介して使用される基板の公知の散乱パラメータを入れることも可能である。この点では、基板の散乱パラメータを決定する段階が、記載された方法での使用のために前に決定した散乱パラメータの入力の方法を包含することに留意されたい。
【００１１】
ドットの領域１はドット毎に評価される。この評価のために、一のドット領域１は、図５で示した評価（推定）ウィンドウ３によって基板イメージの残りの部分から、そのすぐ周囲部と共に孤立されている。評価ウィンドウ３のサイズは、全ドット領域１とそのすぐの周囲部とが評価ウィンドウ３内に配置するようになっている。図５の例では、窓３は５５×５５画素を備える。ドット領域１を孤立させる際に、まずコンピュータプログラムは図３の全イメージを評価し、各ドット領域１の中心に配置し、使用される評価ウィンドウ３のサイズを決定する。適当なユーザーインターフェースによって、各ドット領域の中心位置及び／又はウィンドウのサイズを変更することができる。ドットの中心を配置するために、図３の全イメージを評価する好適な方法を以下に記載する。
【００１２】
評価ウィンドウ３内の全画素の強度は画素強度のマトリックスＩ_Ｓにおいて挿入する。すなわち、この強度は基板の散乱効果を含む信号強度を表す。これらの画素強度はこの記載では散乱画素強度と称する。基板の散乱パラメータが公知であるとき、散乱効果を数学的に補正することができる。記載した方法の第１の実施形態では、散乱強度をデコンボルーション（逆重畳）によって考慮される。このようなデコンボルーション法は数学においては公知である。基板の散乱パラメータで散乱画素強度のマトリックスＩ_Ｓを逆重畳した結果は、非散乱画素強度マトリックスＩ_Ｄである。すなわち、これらの非散乱画素強度マトリックスは散乱効果について補正された信号強度を表す。図４は、デコンボルーション後、図３のイメージファイルのコンピュータモニターにおける表示を示している。この処理されたイメージファイルの表示においては、ドット領域及びその直ぐ周囲での変わり目での散乱のぼやけ効果が除去されることがわかる。
【００１３】
この実施形態の次の段階では、図６に示した画素強度評価ヒストグラムを決定するためにマトリックスＩ_Ｄの非散乱画素強度を用いる。明らかに、画素強度のこのヒストグラムは２つの分布ピーク４及び５を示し、ここでは、低い強度を有する第１の分布ピーク４は周囲部の画素を表し、高い強度を有する第２の分布ピーク５はドット領域１の画素を表している。
【００１４】
これら両方の分布４及び５は通常標準分布と似ているので、標準のフィッティング法を用いて２つの通常の分布曲線６及び７を分布ピーク４及び５にフィットさせることができる。このようなフィッティング法はこれ自体公知であるので、詳細な説明を必要がないだろう。例えば、最小二乗平均法を用いて、最適なフィッティング曲線を見つけることができる。通常の分布曲線６及び７の決定に際して、マトリックス（Ｉ_Ｓ）の画素強度にあるいは図３の基板の全イメージファイルの全画素強度に存在するノイズのノイズパラメータ、特に、このノイズの標準偏差を用いる。この標準偏差σ_{ｎｏｉｓｅ}は例えば、平均値０でかつ標準偏差σ＝σ_{ｎｏｉｓｅ}＊√２の分布となる隣接画素間の差をとることによって決定される。
【００１５】
最終的に、第１のフィットされた分布曲線６の平均値は、純粋なバックグランド強度の平均画素強度についての最良の評価としてとる。第２のフィットされた分布曲線７の平均値は、ドット領域１の平均画素強度、すなわち、標識材料の蛍光強度と合わせたバックグランド強度についての最良の評価としてとる。従って、両方の平均値の差が、ドット領域１すなわち標識材料における画素の平均蛍光強度を与える。
【００１６】
本発明の方法の第２の実施形態では、基板の散乱パラメータが異なる方法で考慮される。デコンボルーションはＣＣＤカメラから得られたデータに存在するノイズを増幅することが公知である。低強度信号の場合、デコンボルーションによる評価が低質の結果を与える。
【００１７】
本発明の第２の実施形態では、散乱パラメータは、図７Ａから図７Ｃで模式的に示したような予め決められた理論による標識領域の散乱応答を決定することによって考慮される。図７Ａでは、異なる散乱パラメータ、すなわち、異なる基板及び異なる基板条件についての散乱パラメータについては、異なる散乱応答が示されている。Ｘ＝１での直線は非散乱応答曲線に、すなわち、理論的な標識領域内の強度Ｉでその領域の周囲部での強度０であることに対応する。この非散乱応答を異なる散乱パラメータに結合すると、図７で示した異なる散乱応答になる。図７Ａでは、規格化された標識領域及び規格化された強度について、すなわち、領域の半径Ｒと強度Ｉとを１として、散乱応答を示している。図７Ｂは、対応する散乱応答曲線８と共に理論的標識領域の散乱応答を示す図５において使用される評価ウィンドウと同じサイズの評価ウィンドウを示している。この散乱応答曲線８は、評価ウィンドウの端まで理論的領域の中心から一の半径に沿って強度を示すので、図７Ｃで示したような画素強度の規格化されたヒストグラムは、散乱応答曲線８と標識領域の中心を囲繞する画素の数とによって与えられた画素強度値を用いることによって作成することができる。
【００１８】
図８は、本発明の方法の第２の実施形態における次の２段階を示す。図８Ａによれば、図７Ｃの規格化されたヒストグラムは、特定のバックグランド強度Ｉ_Ｂと領域強度Ｉ_Ａとを選択することによって倍率が変えられる。この倍率が変えられたヒストグラムは、上述の方法で得られたノイズ分布パラメータでたたみ込む。この方法では、理論散乱ヒストグラムを得て、この理論散乱ヒストグラムは散乱で生じたバックグランド強度と領域強度とを表す２つの分布ピーク９及び１０を示す。理論散乱ヒストグラムは、マトリックスＩ_Ｓの散乱された画素強度から得られた評価ヒストグラム上でフィッティングされる。標準的なフィッティング法を用いて、少なくともバックグランド強度Ｉ_Ｂ及び領域強度Ｉ_Ａの値を変えることによって最良のフィッティング理論散乱ヒストグラムを見つけることができる。他の変形として、理論領域の半径、ノイズの標準偏差及び使用される散乱パラメータ値を変えることも可能である。
【００１９】
図９は、最良のフィッティング散乱ヒストグラムを有するマトリックスＩ_Ｓの散乱画素強度から得られた評価ヒストグラムを示す。最良のフィッティング散乱ヒストグラム曲線を見つけるとき、対応するバックグランド強度と領域画素強度の値を、バックグランド強度及び領域画素強度についての最良の評価として用いる。領域画素強度とバックグランド強度との差はドット領域１における画素の蛍光強度に対応する。
【００２０】
記載された本方法の上述の例では、フィッティングされた曲線のピークの平均値だけを評価に用いられることに留意されたい。フィッティングされた曲線はさらに、検査用に用いることができる他の情報も含む。例えば、各ピークの表面領域を、ドット領域及び周囲バックグランドにおける画素数を決定するのに用いることができる。
【００２１】
図１０Ａから図１０Ｄと図１１Ａから図１１Ｆとは、ドット領域１の中心を配置し、上述の方法において使用される評価ウィンドウ３のサイズを決定するために、図３に示されたような基板のイメージファイルを評価する方法の好適な実施形態における段階を示している。全イメージファイルを評価するこの方法は、一ドット領域を評価する方法と組み合わせて使用することができ、従って、この方法は上述の方法や他の特定のドット領域評価方法には限定されないことに留意されたい。
【００２２】
図１０Ａは、図３の基板に対応する基板のイメージファイルの表示を示している。このイメージファイルは明らかにノイズを有するが、当該有力（可能な、予定の）領域のいくつかはイメージファイルの画素の未処理画素値の表示におけるドット領域１として認識することができる。当該有力領域のすべてを配置するために、イメージファイルの画素値をローパスフィルタアルゴリズムにおいて処理してイメージファイルの全画素について局所的な平均値のマトリックスを決定する。イメージファイルの全画素について局所的な平均値の得られたマトリックスを図１０Ｂに示した。これらの局所的平均値は、ドット領域の信号強度を評価するために用いられる評価ウィンドウの好適には２５％から５０％のサイズを有する図示しない第２のウィンドウを用いることによって得られる。この第２のウィンドウは、画素毎にイメージファイルの画素に沿ってずらす。第２のウィンドウの各位置では、第２のウィンドウ内のイメージファイルの全画素の平均値を、第２のウィンドウの中心での画素の局所的平均値としてとる。第２のウィンドウをイメージファイルの全面に沿ってずらすことによって、イメージファイルの各画素について局所的平均値を決定する。このようにして、イメージファイルの実際の全高周波情報を除去する。
【００２３】
イメージファイルの全画素について高／低画素値の第１のマトリックスを得るために、イメージファイルの実際の画素値のマトリックスを上述の方法で得られた局所的平均値と組み合わせる。これらの高／低画素値は、実際の画素値が画素の対応する局所的平均値より上か下かに依存して高いか低い。これは、実際の画素値が対応する局所的平均値より上であれば、第１のマトリックスの高／低画素値は高く、他方、実際の画素値が対応する局所的平均値より下であれば、第１のマトリックスの高／低画素値は低いことを意味する。得られた第１のマトリックスを図１０Ｃに示す。
【００２４】
第１のマトリックスの高／低画素値を中央（メジアン）域フィルタアルゴリズムで処理して、イメージファイルの全画素について中央画素値の第２のマトリックスを得る。中央画素値の得られたマトリックスを図１０Ｄに示す。この中央域フィルタアルゴリズムによって、第１のマトリックスの各画素の高／低画素値をこの画素をすぐ囲む画素の高／低画素値と比較する。高／低画素値は、これらの周囲画素の高／低画素値の多数の値と等しく作られ、この新しい値を中央画素値と称する。
【００２５】
図１０Ｄで示すように、得られたマトリックスは当該可能な領域すべてを明瞭に示している。これらの可能な当該領域の中心の配置についての第１の粗い評価は、列毎及び行毎に平均列値及び平均行値を決定することによって得られる。これらの平均列値及び平均行値は、列毎及び行毎に、第２のマトリックスの全中央画素値を加えること、及び、得られた値を画素数で割ることによって得られる。これらの平均値は、図１０Ｄのイメージファイルの表示の下部及ぶ右側で曲線１０及び１１として示されている。６×４個の有力領域を有する基板を用いることは公知であるので、４個の最高平均列値と６個の最高平均行値とが、列中心線１２と行中心線１３の評価として選択される。これらの列及び行中心線１２，１３の交差点は、全有力領域の中心１４の位置として用いられる。
【００２６】
図１１Ａから図１１Ｆはさらに、当該有力領域の中心を配置する方法の段階を示すものである。図１１Ａは、列中心線１２と行中心線１３とを有する当該領域の評価ウィンドウを示す。さらなる段階では、線１１及び１２の交差点１４が真に当該領域の画素の重心１５にあるか否かを決定する。この結果、重心は、図１１Ａで示したような評価ウィンドウ内の第２のマトリックスの画素の中央画素値から決定される。この重心が交差点１４に一致しないならば、中心線１２，１３は、交差点が図１１Ｂで示したような重心１５に一致するようにずらされる。
【００２７】
高い値を有する評価ウィンドウ内の画素が真に当該領域を表すか又はただのランダムノイズであるか、すなわち、基板のこの位置での結合実体は分析物に結合しなかったか否かを決定するために、以下の段階を実施する。図１１Ｃ及び図１１Ｅは、評価ウィンドウ内の２つの有力領域を示す。第１に、第２のマトリックスの評価ウィンドウ内の高い値を有する画素の表面を決定し、この表面から当該領域の半径を決定する。さらに、この表面の半径をこの表面の周縁から決定する。図１１Ｃに示したように、高い値を有する画素は正確な円を表さず、そのため、この領域の周縁から決定された半径は図１１Ｃで示した正確な円１６の半径より大きい。しかしながら、２つの半径の比は、所定の参照値例えば、２より小さいべきである。図１１Ｄは、高い値を有する画素の表面の周縁での高い値を有する全画素を示す。周縁から得られた半径と表面から得られた半径との比はこの場合、１．４７である。これは、当該領域が存在することを意味する。図１１Ｆでは、図１１Ｅで示した表面の周縁での高い値を有する全画素を示し、周縁から得られた“半径”と図１１Ｅで示した表面から得られた半径との比はこの場合、４．４７である。これは、図１１Ｅの場合における評価ウィンドウが当該領域を囲繞しない、すなわち、当該領域が存在しないことを意味する。
【００２８】
当該領域の存在又は欠落を決定するために、代替の段階あるいはさらなる段階として、当該可能な領域の重心を、図１１で示したような評価ウィンドウ内の高い値を有する全画素の表面に対応する表面を有する虚の（想像上の）円ウィンドウの中心としてとることも可能である。その後、この虚の円ウィンドウは、ある位置を見つけるために重心に対して移動でき、ここで、虚の円ウィンドウは、例えば、全画素の少なくとも９０％で高い値を有する所定数の画素をカバーする。このような位置を見つけることができないならば、当該領域は存在しない。このような位置を見つけることができるならば、当該領域が存在する。
【００２９】
当該可能な領域を調べるため、かつ、当該領域の信号強度を評価するためにのに用いられるサイズは、高い値を有する画素の数が低い数の画素の数に一致するように決定される。これは、ドット領域１の存在する場合では、ドット画素の数とバックグランド画素の数とが等しい、すなわち、全画素数の５０％であることを意味する。評価ウィンドウ内にノイズだけが存在するならば、このような分布も存在し、すなわち、評価ウィンドウ内の画素の５０％が平均値より上であり、５０％が平均値より下である。このような評価ウィンドウは、ドット領域の信号強度を評価する上述の方法において高い信頼性でフィッティングを行うことができるという利点を示す。また、ユーザーがドット領域の中心を移動したいあるいは評価ウィンドウのサイズを変更したいならば、ユーザーは適当なユーザーインターフェースによってそうすることができる。
【００３０】
本発明は、上述の実施形態に限定されず、特許請求の範囲内で多くの変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】基板の散乱パラメータを決定するために用いる画像を示す説明図である。
【図２】図１の画像から得られた散乱減衰関数を示す図である。
【図３】各領域が公知のプローブを有する６×４領域のアレイを有する基板であって、基板上に標識材料の堆積後のイメージを示す図である。
【図４】散乱効果を機械的に除去した後の図３のイメージを示す図である。
【図５】図４の領域のうちの一つ上の評価ウィンドウを示す図である。
【図６】２つのフィッティングされた曲線を有する
【図７】本発明の方法の第２の実施形態においてフィッティングのために用いられる理論的散乱ヒストグラム決定を示す図である。
【図８】本発明の方法の第２の実施形態においてフィッティングのために用いられる理論的散乱ヒストグラム決定を示す図である。
【図９】図７及び図８で示された方法で得られるフィッティングされる理論的ヒストグラムと共に、図３の領域のマトリックス画素強度Ｉ_Ｓから得られた評価ヒストグラムを示す図である。
【図１０】（Ａ）図３で示した基板のイメージファイルを評価するために本発明に係る方法の好適な一実施形態の一段階の説明図である。（Ｂ）他の段階の説明図である。（Ｃ）他の段階の説明図である。（Ｄ）他の段階の説明図である。
【図１１】（Ａ）図３で示した基板のイメージファイルを評価するために本発明に係る方法の好適な一実施形態の一段階の説明図である。（Ｂ）他の段階の説明図である。（Ｃ）他の段階の説明図である。（Ｄ）他の段階の説明図である。（Ｅ）他の段階の説明図である。（Ｆ）他の段階の説明図である。
【符号の説明】
１　ドット領域
２　ライン
３　評価ウィンドウ
４　第１の分布ピーク
５　第２の分布ピーク
６，７　通常の分布曲線
８　散乱応答曲線
１２　列中心線
１３　行中心線
１４　領域の中心
１５　重心

Claims

基板に埋め込まれている基板の少なくとも一の領域の信号強度であってバックグランド強度を有するものをコンピュータによって評価する方法において、
基板の散乱パラメータを決定し、前記領域及びその周囲部を囲む評価ウィンドウ内に位置する画素の画素強度のマトリックス（Ｉ_Ｓ）を決定するものであり、ここで、マトリックス（Ｉ_Ｓ）の画素強度は画素強度の評価ヒストグラムを得るのに用いられ、前記評価ヒストグラムは２つの分布ピークを示し、低い強度の第１の分布ピークは前記周囲の画素に対応し、高い強度の第２の分布ピークは前記領域の画素に対応し、２つの分布ピークを有する曲線は前記評価ヒストグラムでフィッティングされ、ここで、散乱パラメータを用いて散乱に対してマトリックス（Ｉ_Ｓ）又はフィッティングされた曲線のいずれかが補正され、前記領域での画素の信号強度は前記評価ヒストグラムでフィッティングされた曲線から得られたデータによって決定されることを特徴とする方法。
画素強度のマトリックス（Ｉ_Ｓ）を散乱パラメータを用いて処理してマトリックス（Ｉ_Ｓ）のデコンボルーションを決定して非散乱画素強度のマトリックス（Ｉ_Ｄ）を得するものであり、ここで、前記非散乱画素強度を用いて評価ヒストグラムが得られ、マトリックス（Ｉ_Ｓ）の画素強度から得られたノイズパラメータによって決定された通常の分布曲線は前記の２つの分布のいずれかでフィッティングされ、ここで、第１のフィッティングされた分布曲線の平均値はバックグランド強度の平均画素強度とされ、かつ、第２のフィッティングされた分布曲線の平均値は領域強度の平均画素強度とされ、ここで、平均値の差は領域における画素の信号強度に対応する請求項１に記載の方法。
画素強度の理論上の散乱ヒストグラムが、予め決められた信号強度（Ｉ_Ａ）を有する理論上の領域と、マトリックス（Ｉ_Ｓ）の値と散乱パラメータとマトリックス（Ｉ_Ｓ）の画素強度から得られるノイズパラメータとを決定するために用いられる評価ウィンドウに対応する評価ウィンドウ内に位置するバックグランド強度（Ｉ_Ｂ）を有する周囲とを用いて決定されるものであり、ここで、前記評価ヒストグラムがマトリックス（Ｉ_Ｓ）の画素強度から成り、理論上の散乱ヒストグラムが少なくとも前記バックグランドと前記の理論上の散乱ヒストグラムとを変えることによって前記評価ヒストグラムでフィッティングされ、領域強度とフィッティングされた理論上のヒストグラムとの差が評価される領域における画素の信号強度に対応する請求項１に記載の方法。
規格化された散乱応答曲線の表を、規格化された理論上の領域と規格化された予め決められた強度とバックグランド強度なしの周囲とを用いて作成するものであり、ここで、各散乱応答曲線は、異なる基板と基板状態とに対して多数の散乱パラメータのそれぞれについて、前記の理論上の領域の中心から前記評価ウィンドウの端までの半径に沿って決定され、ここで、散乱応答曲線は、基板と使用される基板の基板状態とに対応する表から選択され、ここで、選択された散乱応答曲線を用いて使用される画素強度を決定して散乱ヒストグラムを作成し、ノイズパラメータをこの散乱ヒストグラムを用いてたたみ込んで理論上の散乱ヒストグラムを得る請求項３に記載の方法。
前記ノイズパラメータはマトリックス（Ｉ_Ｓ）の画素強度に存在するノイズの標準偏差であり、ここで、ノイズの標準偏差は例えば、２つの隣接画素の間の差の分布を決定することによって決定するのが好ましい請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
散乱パラメータは、前記表面に平行な方向で基板の側部から照明することによって決定するものであり、ここで、前記照明方向において前記側部から表面上の一の線に沿った画素強度を決定して指数散乱減衰関数を得る請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
散乱パラメータは散乱なしの場合の信号強度に対して補正される請求項６に記載の方法。
基板の異なる状態について異なる基板の散乱パラメータが決定されかつ格納されるものであり、ここで、散乱パラメータは基板の状態に対応する評価における使用に対して選択される請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
基板は領域のアレイを有し、画素強度のマトリックスを各領域及び対応する周囲について決定する請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
基板の全表面を評価して、各領域の中心を位置決めしかつ評価ウィンドウのサイズを決定するものであり、各領域の位置決めはユーザーインターフェースを通して補正することができ、その後各領域の信号強度を評価する請求項９に記載の方法。
基板周囲に埋め込まれている基板の所望の有力領域をコンピュータを用いて位置決めする方法において、基板のイメージファイルをローパスフィルタアルゴリズムで処理してイメージファイルの全画素に対して局所的平均値のマトリックスを決定するものであり、ここで、局所的平均値のマトリックスはイメージファイルの実際の画素値のマトリックスと結合して、実際の画素値に依存する高又は低のいずれかが局所的平均値より上又は低いのいずれかに対応するところの高／低画素値の第１のマトリックスを得、ここで、第１のマトリックスの高／低画素値をさらに中央フィルタアルゴリズムで処理して中央画素値の第２のマトリックスを得、ここで、各中央画素値は第１のマトリックスの高／低画素値の多数と等しく、ここで、中央画素値を列毎及び行毎に処理して平均列値及び平均行値をそれぞれ決定し、ここで、最大平均列値及び最大平均行値は所望の有力領域の列中心線と行中心線の評価値として選択され、ここで、所望の有力領域の中心がそれら列中心線と行中心線の交点がであることを特徴とする方法。
局所的平均値のマトリックスを決定するローパスフィルタアルゴリズムは、所望の予想有力領域及びその周囲を囲繞する一のサイズを有する第２のウィンドウを用いること、イメージマトリックスに沿って画素毎に前記第２のウィンドウをずらすこと、及び、第２のウィンドウの各位置で第２のウィンドウ内の全画素の平均値を第２のウィンドウの中心での各画素の局所的平均値とすることを含む請求項１１に記載の方法。
中央フィルタアルゴリズムは、各画素の高／低画素値を周囲画素の高／低画素値と比較することを含むものであり、ここで、高／低画素値は周囲画素の高／低画素の多数と等しくされている請求項１１又は１２のいずれかに記載の方法。
所望の有力領域の各中心について、第２のウィンドウ内の高い値を有する中央画素値から重心を決定するものであり、ここで、重心を所望の有力領域の中心とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
所望の有力領域の各中心について、高い値を有する中央画素値の表面とこの表面の周縁とから所望の有力領域の半径を決定するものであり、ここで、所望の領域の存在あるいは欠如を決めるために２つの半径の比を決定する請求項１４に記載の方法。
所望の有力領域の重心を、高い値を有する中央画素値の表面に対応する表面を有する虚の円ウィンドウの中心とするものであり、ここで、虚の円ウィンドウは重心に対して移動して高い値を有する所定数の画素をカバーする位置を見つけ、ここで、所望の領域の存在あるいは欠如についての決定はそのような位置が見つかるか否かに依存して行われる請求項１４又は１５のいずれかに記載の方法。
所望の領域を評価する評価ウィンドウのサイズは、高い値を有する画素数が低い値を有する画素数に一致するように決定される請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施するように適合されたコンピュータプログラムコードを備え、コンピュータ上で作動するコンピュータプログラム。
コンピュータ読込可能媒体あるいはコンピュータにダウンロード可能なファイルに格納された請求項１７に記載のコンピュータプログラム。