【０００１】
本発明は、主に腫瘍の処置及び診断のための医薬調製物、並びに血漿の無脂質画分を分離するための方法に関する。
【０００２】
公表国際特許出願ＷＯ ００／４０２５６は、急性白血病に苦しむ患者から得られた血漿の腫瘍阻害作用に関する。当該出願においては、多数の実験が記載されており、この中で使用された調製物は、特定の型の腫瘍との関連において、コントロール群と比較して２０％の向上をもたらしている。この向上は、有意として言及されているものの下限に近いものである。
【０００３】
急性白血病の血液から作られた医薬調製物の利用は、ドナーとして使用され得る対象者が少ないこと、及びヒトの血液の使用に関連した厳密な倫理上及び法律上の検討すべき問題の存在によって限定されている。この分野において世界中でなされる腫瘍処置の優れた有意性及び研究の限界は、治療又は診断のいずれかにおける見通しとして明らかなあらゆる新規な解析方法を通じて判断される。
【０００４】
上文で引用した特許出願は、急性白血病に苦しむ患者の血液が、一般的な抗腫瘍効果を有する正確に限定されていない成分を含んで成る可能性を示した。
【０００５】
本発明の目的は、腫瘍の治療及び診断のために使用され得る新規医薬調製物を提供することであり、これには、腫瘍との戦いにおける役割を有する血漿の有効な分離のための目的を含んでおり、そして更なる目的として、その様な血液のドナーの適当な群を見出すことがある。
【０００６】
最初の段階におけるその目的を達成するために、更に有効な洗浄方法が考案されており、ここでは、有効成分が血漿の無脂質画分にあると仮定された。血漿の無脂質成分の分離は、血漿画分が第一有機溶媒で処理され、続いて非常に細かい粒子から成る界面活性剤が添加され、そして次に当該粒子に結合した無脂質画分の激しく混合したものが、遠心によって液体成分から分離され、この分離された画分が再び溶液にされる場合に好ましい方法で実施され得る。
【０００７】
洗浄は、溶解段階と分離段階が第二の有機溶媒を用いることによって繰り返され、続いて遠心が繰り返される場合により有効である。
【０００８】
界面活性剤の量は血漿の量に関して約０．５％であり、そしてその粒子サイズは約２００〜４００ｎｍの間である。好ましい材料は、例えばカオリン（ｂｏｌｕｓ ａｌｂａ）、活性炭又はメトセルである。
【０００９】
遠心は、好ましくは１５０００ｇの加速で行う。溶解は、有機溶媒の適用後、溶液が断続的な遠心によって上昇した温度でより長期間安定な場合に実現しやすい。
【００１０】
無脂質成分からの界面活性剤粒子の分離は、不可欠なものではなく、そして２回目の分離の後、当該粒子は、それらに結合した無脂質成分と一緒に、例えば生理溶液にされうる。
【００１１】
更なる精製方法に従い、無脂質成分は若干量の界面活性剤と一緒に溶液にされ、そして更に遠心することによって固体成分が分離され得る。
【００１２】
この方法で分離され、そして急性白血病を有するドナーから得られた無脂質産物は、上文で引用した特許出願に記載の産物よりも有意に有効であることが証明されていたので、前記目的の主要な観点が検討され、すなわちその様な抗腫瘍成分が急性白血病においてのみ見られるか否か、又はそれが腫瘍から治癒した対象者の血液中にも存在するか否か、が検討された。
【００１３】
その様な成分が腫瘍から治癒した対象者の血液に存在し、そしてこの存在が血漿の無脂質部分において起こることは認識されてきた。上述の洗浄方法を適用することによって、マウスのＳ １８０肉腫の場合において、腫瘍から治癒したドナーから得られた調製物を用いる場合、生存時間が実質的により長く、そしてその効果が腫瘍の型に依存しないようであり、そして異なる腫瘍から治癒したドナーから得られた血漿混合物から得られた無脂質画分が同様に有効な腫瘍阻害作用を持つことが実験的に証明されている。
【００１４】
腫瘍から治癒したドナーの数は、急性白血病を有する対象者の数よりも実質的に多く、そして彼らから得ることができる血液の量はほとんど制限されないが、広範な医療上の使用は、上文で言及したモラル及び法律上の限界に起因して予期され得ない。
【００１５】
基本的な目的を解決する更なるアプローチが、更に進歩的な発見へと導いた。この発見に至った経緯は、動物における腫瘍の自然な治癒の研究による。偶蹄目の動物の場合、レトロウイルスによって引き起こされる腫瘍の病気がむしろ特異的である。ある種において、この病気は腫瘍において現れ、そして感染した動物は死亡し、一方、他の種、主にウシ（キャトル）では、この病気は腫瘍において又はその動物の通常の健康状態における任意な病気において発現しない。当該感染は、血液中の抗体ＧＰ５１の存在によって検出されうる。
【００１６】
家畜（ウシ）は白血病に苦しむ個体から隔離しなければならないことは獣医学の最近の一般的な考えである。この考えは、表題「ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｒｅｅｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｏｃｋ」の、１９９２年のＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓの第四版において公表された見解によって立証されており、そしてこの見解は、ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅによってなされた。白血病の感染範囲はほぼ５０％であることが明らかとなった。更なる刊行物として、同一の雑誌の１９９７年の発行番号第９号は、白血病からの家畜の隔離の重大性を協調しているＴｅｌｋｅｓ， Ｌａｊｏｓ博士の論文「Ｆｒｅｅｉｎｇ ｃａｔｔｌｅ ｆｒｏｍ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｉｎ Ｈｕｎｇａｒｙ」を含んで成る。感染の範囲はより多くの農場で高いことが明らかとなっており、そして第二の論文の際には、感染範囲は約１７％であった。
【００１７】
前記発見の本質は、成功裡に、且つ症状なく白血病と戦った動物の血液、更に詳細にはそれらの血液の血漿の無脂質画分が、ヒトのドナーの血液で行われた実験において有効であることが証明された成分を含んで成ることに存する。この発見は、この仮定をいくつかの側面から確認した多くの実験に続き、そして腫瘍に対する戦いが開始されてから想像もつかなかったほど有効な腫瘍阻害作用の存在についての証拠を提供した。
【００１８】
当該作用の存在は更に、白血病に苦しんでいない動物から得られた同様の血液成分がその様な作用を有していなかったという発見によって確認された。
【００１９】
ヒト及び動物のドナーから得られた無脂質血漿の電気泳動試験によって、２つの範囲の分子量の同様の画分の存在が確認され、そしてこれらの画分は健康なドナーから得られた血漿には存在していなかった。「ボバイン（ｂｏｖｉｎ）４０」と以降言及される約４００００の分子量を有する第一画分及び「ボバイン（ｂｏｖｉｎ）３００」と以降言及される、３０００００〜３５００００の範囲にある分子量を有する第二画分が、腫瘍阻害作用について重要であるはずである。
【００２０】
本発明に従う解決法の知見においては、白血病を有する個体からの家畜の隔離の必要性についての全般的な修正が賢明なようである。
【００２１】
本発明に従い同定されたボバイン４０及びボバイン３００の画分は優れた腫瘍阻害作用を持ち、そして同時にそれらが存在しないことの検出は腫瘍の診断を確立するのを補助する。
【００２２】
本発明は実施例に関連して記載され、これは添付図面及び実験に引用される。
【００２３】
本発明に従う解決法の異なる詳細は、行われた実験の異なる段階の順序において知ることができる。重大さの順番に関係なく、実験に使用した材料の調製方法についての記載が必要とされる。
【００２４】
出発材料として使用した血液から、無脂質血漿成分が多段階の分離法を介して得られる。好ましい分離段階は以下の通りである。
【００２５】
出発血液が採集された後すぐ、それを抗凝血剤、好ましくはヘパリンで処理する。
【００２６】
微粒子の分離は、好ましくは４℃の温度で且つ５０００ｇの加速（ｇは標準重力の加速を意味する）の遠心によって実施される。遠心が、血液を採取された後すぐに行われない場合、凝固剤によって処理した血液は低温、好ましくは遠心の温度で多くて４８時間保存されうる。遠心の期間は、少なくとも約１０分である。更なる処理のために、上層の液体が使用される。このようにして得られた血漿は、−２０℃の温度にまで冷却されることがあり、そして異なるドナーから同様に得られた血漿と混合されることもある。更なる処理は、より高い血漿の質が必要な場合に行うことがある。本明細書に記載の実施例において、任意な特定のドナーから得られた血漿が異なるドナーから得られたものと混合され、そしてそれらに由来する何らかの差異が別々に報告される。
【００２７】
液体成分の除去の第一段階として、血漿が同量の第一有機溶媒、例えば９６％の純度のアルコールによって希釈され、そしてその様にして得られた溶液は混合される。
【００２８】
第二段階において、界面活性材料（剤）が０．５重量％の量で溶液に添加される。この界面活性材料の役割は、血漿の無脂質成分をそれらの表面上に結合させることである。界面活性剤は、カオリン、活性炭又はメトセルであってもよく、そしてそれらの平均粒子サイズは好ましくは２００〜４００ｎｍの間にある。記載した実施例の場合では、界面活性材料はカオリンである。
【００２９】
この血漿混合物は、室温で６時間の物理的干渉（混合）によって懸濁状態で永続的に保持され、続いて、５℃の温度で、それは１０〜１２時間インキュベートされる。インキュベーション期間、液体は３０分おきに一度、それぞれ短時間混合された。
【００３０】
インキュベーションに続いて、混合物を混合によって再懸濁し、そして懸濁物を４〜５℃の温度で１５０００ｇの加速で１０分間遠心した。
【００３１】
遠心したものから、界面活性剤粒子が結合した更に固体の成分が以降の工程のために分離され、そして液相は廃棄した。第二有機溶媒が、第一有機溶媒の重量と同量分離相に添加され、これは、例示的な場合においてアルコールとトルエンの５０重量％−５０重量％混合物であった。その様にして得られた混合物の処理は、第一溶媒の後の処理と同一であった。この工程の間、血漿混合物は、室温で６時間の物理的干渉（混合）によって懸濁状態で永続的に保持され、続いて、５℃の温度で、それは５〜１２時間インキュベートされた。インキュベーション期間、液体は１時間おきに一度、それぞれ短時間混合された。
【００３２】
インキュベーションに続いて、混合物を混合によって再懸濁し、そして懸濁物を５℃の温度で１５０００ｇの加速で１０分間遠心した。
【００３３】
遠心したものから、界面活性剤粒子が結合した固体成分が以降の工程のために分離され、そして液相は廃棄した。
【００３４】
固体成分は薄層を形成するために広げられ、続いてあらゆる残りの有機溶媒が減圧下に２時間据えられた除湿器内で除去された。
【００３５】
続いて、最初の血漿の重量と同量の生理食塩水が、分離した沈殿物に添加され、そしてこの材料は混合によって再懸濁された。この様にして得られた血漿調製物は、界面活性剤材料、カオリンの頭文字を意味する文字「ｂ」を用いて以下の明細書の部分において標識される。
【００３６】
第二の相対的に更に精製された別の血漿調製物を得る場合、界面活性剤材料は、組織に優しい洗剤を、血漿調製物を溶解し得る混合物「ｂ」に添加する方法で除去された。例示的な場合において、この洗剤は０．０１重量％のラウリル硫酸ナトリウムであった。適当な懸濁液を得るために、洗剤が一緒に添加された材料は、連続的に混合しながら６時間室温でインキュベートされ、続いて冷蔵庫内で８〜１２時間保存された。インキュベーションの間に沈殿物を形成した材料を再懸濁し、続いて冷却状態でそれを１５０００ｇに加速して遠心した。沈殿物を廃棄し、そして上層の液体は有用な材料を含んでおり、これは材料「ｂ」との識別のために、且つこの材料がより純度が高い（ｆｉｎｅｒ）ことを表すために、文字「ｆ」を用いて以下の明細書の部分において標識される。
【００３７】
マウスを用いて行われる実験を容易にするために、両方の型の生成物がそれぞれ１ｍｌの用量で与えられ、それらは続いて標識され、そして冷凍状態で保存された。
【００３８】
それらの調製物の生成物及び環境はともに滅菌されたものであり、それ故に当該材料は無菌であり、そして非経口適用が可能である。
【００３９】
１．Ｓ １８０肉腫の移植による実験
これら全ての実験は、２５ｇの平均重体重を有する同一の型の雌のＢＤＦ１マウスで実施された。実験される動物及びポジティブコントロール動物は共に、Ｓ １８０肉腫が皮下から移植された。動物の型に関しての実験の環境、移植された肉腫の型及び移植方法は、上文で引用した国際特許出願に記載のものと同一とした。各実験群は少なくとも５匹のマウスを含んでおり、そしてデータは関連する群におけるマウスの平均に関して報告した。マウスは、適当な群の数に従い識別され、そしてそれらは固有の数を有した。
【００４０】
実験１
急性白血病に苦しむ患者の血液から、「ｂ」型の血漿調製物を調製し、そして実験群において、各マウスは、１日おきに計８回０．１ｍｌそれらを皮下から受けた。
【００４１】
ポジティブコントロール群において、平均寿命は１９．６日であり、そして実験群においては、それは２３．５日であった。これは２０％の増大であり、有意な向上であるとみなされうる。同一の型の腫瘍との関連で、上文で引用した国際特許出願においては、最良の調製物が生存において５％の増大をもたらすという、有意な閾値よりもはるかに低いものであった。無脂質血漿成分の適当な分離は、それ故に非常に不可欠なのものである。
【００４２】
実験２
この実験は、６個の独立した実験結果を含んで成り、そしてそれは、血漿の無脂質成分に含まれると思われる、腫瘍に対して有効な材料が腫瘍から治癒した対象者の血液にも存在するという仮定に基づいている。腫瘍が発見されてから少なくとも１０年、そして多くて２７年間生存しており、それ故に治癒したとみなされうるその様な人々がドナーとして選択された。診断されたドナーの腫瘍の型は、順番に咽頭ガン、結腸ガン、乳ガン、リンパ性白血病、精巣及び前立腺の腫瘍並びに肺腫瘍であった。
【００４３】
血漿調製物「ｂ」型は、６人のドナー全ての場合に作成され、そしてマウスの各群をそれらで処置した。コントロール群の平均寿命は再び１９．６日であったが、処置群の平均は２５．５〜２７．３の間で変化し、それ故に処置群間でごくわずかな差異があった。その様な生存は、コントロール群と比較して３０％〜４０％の向上を構成し、これは非常に有意である。
【００４４】
更なる実験として、「ｂ」型の血漿産物が、微粒子の除去後に６人のドナー全てから得た血漿の等しい混合物から作成された。この産物は、コントロール群と比較して３８％の生存の増大を示した。
【００４５】
これらの実験は、このように、腫瘍から治癒した対象者の無脂質血漿成分が有効な腫瘍阻害材料を含むという仮定を確認した。更に、その様な材料の存在が実際の腫瘍の型に依存せず（少なくとも試験した腫瘍の型の場合）、それ故に混合物が等しく有効であることも証明された。
【００４６】
実験３
血液試験によりウシの白血病の存在が確認されたウシ（ビーフ）がドナーとして選択された。その様なドナーの血液から、「ｂ」及び「ｆ」型の血漿産物が作成された。同様に、血漿産物の両方の型が、血液が白血病の存在を示さなかったウシの血液から調製された。
【００４７】
試験は複数の変形版で行われ、変化するものとして、第一のパラメーターは１日おきに適用した処置の回数であり、第二のパラメーターは０．１〜０．１５ｍｌの間で変化した用量であり、そして第三のパラメーターは当該産物、すなわち「ｂ」又は「ｆ」型の純度であった。これらのパラメーターの試験の好ましい範囲が、実際の実験の前のパイロット実験によって決定されたのは、それぞれの最適値が用量と処置の回数に関して見出されたためである。
【００４８】
白血病を有するウシの血液から得た産物は、ドナーの利用可能性に関して、そして倫理上及又はモラルの検討材料に関して制限がないため、大規模な適用可能性の基準を満たす。生存データは、ヒトの血液から得た他の方法による好ましいデータを実質的に超えている。これは、これらの実験結果の詳細な説明の理由である。
【００４９】
実験の間、動物の平均体重、平均生存時間が試験され、更に当該試験のあらかじめ決定した時期に、１ｍｌの試験血液試料が各群のそれぞれのマウスから採取さされ、そして当該試料中における多数の腫瘍マーカーの存在が試験された。血液試料が採取されたマウスは、それらがその様な血液の量で生存し得ないために、以下の実験から除かれた。
【００５０】
生存時間に関する結果は、２つの主な群に分けられることがあり、すなわち処置は「ｂ」又は「ｆ」型の産物で実施される。白血病を有するウシに由来する起源は、略語「Ｂｂｏ」によって表され、それ故に第一の主な群の処置は材料Ｂｂｏ−ｂで実施され、そして第二の主な群のものは材料Ｂｂｏ−ｆで実施された。
【００５１】
日にちは腫瘍の移植の日から数えた。それぞれの曲線を、少なくとも５匹のマウスを含む群の平均に関して図１〜７に示した。
【００５２】
図１及び２は、材料Ｂｂｏ−ｆで処置した群の生存のダイアグラムを示す。ポジティブコントロール群のマウスは、正常な給餌とは別に、移植後の処置をなんらう受けず、処置群のマウスは、限定量を有する材料Ｂｂｏ−ｆによって１日おきに処置された。図１に示した群での各処置において、用量は０．１５ｍｍであった。２つの処置群は、互いに処置の回数が異なる。第一群においては８回の処置が適用され、一方第一の群においては処置の回数が１０回であり、その後、当該マウスは鎖卵成る処置をなんら受けなかった。１０回の処置を受けた群の場合、処置の終了後、すなわち、第２０日目の後、死亡率が突然増大したことが見られた。この突然の増大は、８回の処置を受けた群でも見ることができるが、増大が後で且つより緩やかな傾きで起こることは興味深い。１９．６日を有する、コントロール群と比較した平均生存時間は、８回の処置を受けた群では２４，８日であり、一方１０回の処置を受けた群では２３．２日である。
【００５３】
図２に示したそれぞれの群において、処置は二日おきに１０回行った。用量に差異がある。第一群のマウスは各処置において０．１５ｍｌの用量を受け、一方第二群は０．１ｍｌの用量で処置された。用量が減少した場合、差異は非常に明らかである。生存時間は３０日に増大し、これはポジティブコントロール動物群と比較して１５３％の向上を構成する。
【００５４】
材料Ｂｂｏ−ｂを用いた処置の結果を図の２つの群に示す。図３〜５の場合において、変化するパラメーターは用量である。図３に示した場合、処置は６回行い、そして生存時間が使用した用量にほとんど依存せず、そして低用量が若干好ましいことが見てとれる。しかしながら、生存時間は、平均生存時間が３７日であり、これがポジティブコントロールと比較してほぼ１８９％の向上であるため、材料Ｂｂｏ−ｆと比較して実質的に良かった。用量に由来する生存時間の依存性は、図４を考慮する場合に更に明らかとなる。ここでは、処置の回数は８回であった。０．１５ｍｌの用量の効果のもとで、生存時間は、６回の処置で得られた値と比較して減少し、そしてこのことは単に過量の結果であると思われる。反対に、０．１ｍｌの用量は、平均生存時間が実質的に増大し、そして５９日目までにダイアグラムが５０％の値にまだ達していなかったので８回の処置に最適であると思われる。このことによって、生存は３００％以上に増大し、これは著しく望ましい図である。
【００５５】
図５は、１０回の処置を受けたマウスの場合における平均生存時間を示す。ここで、０．１５ｍｌの用量が驚くべき事であるのは、この群において、生存が突然減少するが、同様の処置を受けた初期の群では平均がより良いためである。マウスの数が少ないために、１又は２匹のマウスの多少好ましい挙動から違いが生じていると思われる。突然死の割合は、３３日目の後に０．１ｍｌの用量の場合に増大し、これも過量の結果であると思われる。
【００５６】
図６及び７において、変化するパラメーターは処置の回数である。２つの図面の比較は、０．１ｍｌの用量による８回の処置の適用が最適であることを示す。図７由来の結果は、用量が多い場合に、向上が処置の回数の減少につれて増大することを記載しており、これはまた、用量が多すぎたことを示している。
【００５７】
腫瘍の治癒及び動物の平均体重
処置された群の動物の状況で経験した向上は、平均生存時間に基づくだけでは認識され得ない。出発時の体重が２５ｇの動物において、６〜８ｇの重量、すなわち動物の全重量のほぼ三分の一の大きな腫瘍が形成される。材料Ｂｂｏ−ｂ由来の０．１ｍｌの用量で周期の終わりまでに８回処置された動物において、よく認識されている処置が腫瘍の状態において行われ、肉腫が開かれ、そしてつぶれやすい材料が廃棄された。この材料は、死んだ腫瘍細胞を包含していた。当該動物の「こぶ」が消え、そして彼らは体重が増え始めた。
【００５８】
図８は、共に８回の処置を受けた群Ｂｂｏ−ｂ及びＢｂｏ−ｆ並びにポジティブコントロール群に関する、最初の１９日における動物の平均体重の値を示す。当該ダイアグラムは、特に材料Ｂｂｏ−ｂでの処置の場合において、上述した状態の報告と良好に相関している。当該ダイアグラムの欠点は、それが別々に腫瘍の量を示さないことにある。我々は腫瘍の重量について正確な値を得ることができず、それ故に全体重は腫瘍の重量も含む。処置した群において、最初の低下、続いて再生する増大が典型的であり、ポジティブコントロール群においては、重量は上下しながら増大し、これは主に腫瘍の増大によって引き起こされる。
【００５９】
上文の実験のうちの、最良のものとして現れたものは、白血病を有していない健康なウシから得た材料を用いて繰り返された。当該結果は、ポジティブコントロール群において得られたものと有意に異なることはなく、そしてこのことは、白血病を有するウシの血液から得られた材料のみが有効であることを確認した。
【００６０】
酵素腫瘍マーカーの試験結果
悪性の過程を伴う代謝の変化の試験のために、臨床実験において幅広く決定される複数の酵素腫瘍マーカーがあり、そしてこれらの方法の中でも、型の数が決定され、これは慣習的な試験のために使用されうる。当該方法を選択する際、悪性の過程が複雑な生化学的障害を伴い、そしてしばしばそれによって維持されることを考慮した。従って、これらの考慮により、核酸の代謝（血清アルカリ性（塩基性）及び酸性デオキシリボヌクレアーゼ活性、５’−ヌクレオチダーゼ活性）；ポリアミン代謝（アルギナーゼ活性）；肝ミトコンドリアの機能（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性）；糖新生（ホスホヘキソースイソメラーゼ活性）；骨関連過程の同定（骨特異的アルカリホスファターゼ活性）のアッセイを実施するために必要であると思われる。列記した酵素の活性における変化は、悪性の過程を伴い、そして維持する代謝の変化及び適用した治療の結果に続く。
【００６１】
実験の間、血液試料は、腫瘍の移植から８日目、１５日目そして１９日目にマウスから採取された。データを表１に要約する。当該データは、全て別々に実験した、それぞれの５匹のマウスの平均に関する。
【００６２】
表の中の幾つかのカラムの意味
β−Ｇｌｙｃ：非特異的ホスファターゼ、β−グリセロホスフェート；この値は、腫瘍マーカーとして解釈され得るように、他のホスファターゼの値のものから引かれるべきである；
Ａｌｋ．Ｆ：アルカリホスファターゼ
５’−ＴＭＰ：５’−チミジン−５−モノホスフェート
ＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ
ＳＤＮａｚ：酸性デオキシリボヌクレアーゼ（酸性ＤＮＡアーゼ）
Σ．５’−ＮＤ：全ての５’−ヌクレオチダーゼの合計の値
【表１】
【００６３】
当該表において、３つの異なる群が見られる。最後の群は腫瘍を移植されていないマウスを有するコントロールに関連し、そしてこの群のマウス５１−５５は８日目に試験され、マウス５６−６０は１５日目に試験され、そしてマウス１０６−１１０は１９日目に試験された。
【００６４】
中段の群は、ポジティブコントロールに関連し、マウス１５１−１５５は８日目に試験され、マウス１０１−１０５は１５日目、そしてマウス４１−５０は１９日目に試験された。
【００６５】
最初の群は、２つの亜群に分けられ、１つは材料Ｂｂｏ−ｂによる処置を受けた、数字の２で始まるもの、そしてもう１つは材料Ｂｂｏ−ｆによる処置を受けた、数字の３で始まるものである。当該亜群Ｂｂｏ−ｂにおいて、マウス２７１−２７５の試験は８日目に、マウス２７６−２８０は１５日目に、マウス２７１−２７５は１９日目に、そして最後にマウス２４６−２５０の試験は、実質的な生存に関して随分遅い、４５日目に行った。
【００６６】
第二の亜群における、材料Ｂｂｏ−ｆで処置したマウスの、試験日に従う分布：３９６−４００：８日目；３９１−３９５：１５日目；３８５−３９０：１９日目。
【００６７】
結果を図９においてカラムダイアグラムの形態で要約する。この中で、横軸上に例示したマウスの群は縦軸上のデータと互いに関連しており、ここで、カラムの高さはデータの合計を表している。横軸において、マウスの群は別々に例示され、そして各群において、左から右の順番で試料データの順番が増大する。
【００６８】
３つの左側のカラムは、コントロール群と関連し、中央の３つのカラムはポジティブコントロール群と関連し、そして７つの右側のカラムのうちの最初の３つのカラムは亜群Ｂｂｏ−ｆに属し、そして残りの４つのカラムは亜群Ｂｂｏ−ｂに属する。
【００６９】
コントロール群において、データは自然に時間につれて変化せず、それらの変動は自然の範囲内である。ポジティブコントロール群の場合、全ての成分が極端に高く、そして瀕死の時期（最後のカラム）までに、それらは更に増大する。
【００７０】
反対に、両方で処置した亜群において、最初の値は既にポジティブコントロール群のデータよりも小さく、そしてそれらは更に時間につれて減少する。材料Ｂｂｏ−ｂは、好ましい生存データに従い、材料Ｂｂｏ−ｆによる処置よりも実質的により良いで結果を示した。減少は、１９日目の後も続き、そして実験の終了までに、データはコントロール群の標準的な値に近づく。
【００７１】
実験４
これまでの実験の間に得られた好ましい結果に基づき、無脂質血漿のどの成分が前記作用に原因があるかを試験した。我々は健康な人の血液、急性白血病の対象者由来の血液、腫瘍から治癒した対象者由来の血液、更には白血病のウシ及び白血病ではないウシから採取した血液を所持していたので、調製型「ｂ」が列記した各血液から作成され、そしてそれらは個別の電気泳動試験にかけられた。当該試験のために、出発材料が、使用されるポリアクリルアミドゲルの表面上に持ち込まれ、そして電気泳動処置の効果のもと、当該材料の成分がそれらの分子量の順番に従い分離された。
【００７２】
腫瘍処置の観点から効果的でないことが証明された血液、すなわち正常なヒト血液及び白血病でないウシから採取された血液から得られた画分は、腫瘍処置の観点から効果的である血液の型から得られた画分と比較された。最も明らかな差異は、白血病を有するウシから採取された血液の画分において見られ、そしてそれは分子量約４００００の画分、更には分子量３０００００〜３５００００の画分の存在下にあった。これらの２つの画分は、共に試料の８〜１２重量％を表した。腫瘍が治癒したドナーから採取された血液調製物の画分は、これらの成分をいずれも包含していたが、分子量４００００付近の画分の存在は亜更に明らかであり、そして画分の量は実質的に少なく、約２〜３％であった。急性白血病の血液から得られた調製物の画分の中でも、分子量４００００の成分がごくわずかに存在しており、他の画分は検出されなかった。
【００７３】
前記の２つの画分を同定する目的で、約４００００の分子量を有するものは「ボバイン４０」と言及され、そして３０００００〜３５００００の他の画分は「ボバイン３００」と表される。本明細書に記載の方法はこれらの２つの画分の間違いのない同定にとって十分である。これらの画分の構造の同定は現在行われている。示された結果の知識において、材料ボバイン４０及びボバイン３００の存在が示した作用にとって重要であることは、十分な根拠により述べることができる。
【００７４】
ＩＩ． Ｃ２６結腸直腸腫瘍の移植による実験
当該実験は、第一世代の内部交配（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｂｒｅｄ）したＢａｌｂ／ｃ雌性マウスを用いて実施した。
【００７５】
マウスの原産地はＴＮＯ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｒｉｆｋｓｗｉｊｋ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）であり、繁殖地はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｇａｒｙ）のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙであった。
【００７６】
動物の飼育環境は、ｍａｃｒｏｌｏｎ材料のケージ、２０〜２２℃の温度、相対湿度４５〜５５％、１２時間周期で変化する昼夜の維持、であった。給餌は、オートクレーブで滅菌されうる標準的な品質のマウスの餌（型：Ａｌｔｒｏｍｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で行い、寝具は経木から作成した。繁殖の衛生レベルは、既述のＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）条件に従った。動物の世話及び飼育は、「Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ」におけるヘルシンキ宣言に従い行った。
【００７７】
Ｃｏｌｏｎ−２６結腸腺ガンはＳＲＩ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， Ａｌａｂａｍａ， Ｕ．Ｓ．Ａ）から購入した。移植方法：維持した腫瘍由来の２０ｍｇの小片が、皮下から肩胛骨間の領域に移植された。
【００７８】
実験の間、動物を１０匹のマウスの群に分け、ポジティブコントロール群の動物は移植後に何ら処置を受けなかった。処置群においては、処置は前述のＢｂｏ−ｂ材料を用いて行った。この材料は、当該実験の文書化の間にＡＢＢ−７とも称された。実験シリーズＩを介して得られた経験が利用され、そして当該処置は、１〜９日目の間、合計８回、１日に１回同時に適用された。各群における差異は処置の方法及び適用した実験材料の量にあった。
【００７９】
生存データを図１０に要約する。ポジティブコントロール群の場合、１００％の生存時間は１９日であった。最初の群において、処置は０．１ｍｌの用量で腹腔内（ＩｐＩ）で実施し、第二群においては、適用方法は、用量が０．１５ｍｌであったことを除き同一であり、そして口を経口（ｐｅｒ ｏｓ）材料の適用も試験された。ここで、適当な用量の供給装置が、動物の胃に直接材料を運ぶために使用された。第一の経口（ｐｏ１）群においては、用量は０．２ｍｌの材料であり、そして第二の経口（ｐｏ２）群においては用量は０．３ｍｌであった。更なる群として、当該材料を０．１ｍｌの材料を用いて皮下（皮膚の下）から適用した、ｓｃも処置された。生存データは、１０匹のマウスの群の平均を示す。図面から、処置群のそれぞれにおいて実質的な向上が起こり、最も有効な２つの処置が０．１ｍｌの材料を用いるｉｐ適用及び０．２ｍｌの材料を用いるｐｏ処置であったことが見て取れる。
【００８０】
当該実験は、１０匹のマウスの更なる群において繰り返され、そして腫瘍の重量を測定するために、腫瘍は、動物が瀕死（すなわち死の直前）状態に達した場合に摘出され、そして腫瘍の重量が測定された。
【００８１】
図１１は、これらの実験結果を示す。カラムの上方に、関連する水準レベルの値を示し、これは、全ての場合において０．０５未満であり、すなわち当該データは非常に信頼性がある。
【００８２】
同様に処置した１０匹のマウスの更なる群において、５’−ヌクレオチダーゼ活性が、腫瘍移植から８日目、１６日目に、並びに実験シリーズＩの場合には瀕死状態において採集した試料上で決定された。これらのデータを図１２に示す。当該活性は、開始時の低い値から、１６日目までには最高のものへと増大し、瀕死状態に達した後は、当該活性はポジティブコントロール群で得られた値から実質的に低下した。
【００８３】
ＩＩＩ． ＭＸＴ乳ガンを移植する実験
実験ＩＩに記載の条件を維持しながら、記載されている起源の雌性のＢＤＦ１マウスが、ＭＸＴ乳ガンの場合における、材料Ｂｂｏ−ｂを用いる処置の効果を試験するために使用された。移植される腫瘍細胞の出所はＭＡＳＯＮ Ｒｅｓ． Ｉｎｓｔ． ＵＳＡである。維持された腫瘍由来の１ｍｍ３の体積の小片を肩胛骨間の領域に皮下から移植した。
【００８４】
当該動物から、１０匹のマウスの群が実験ＩＩの場合に形成され、そして各群において、それぞれが等しく処置された。材料Ｂｂｏ−ｂを用いる処置は、実験ＩＩの場合のように、すなわち８日間の間毎日１回同時に実施された。ポジティブコントロールの場合、平均生存時間は２４日であった。図１３は、異なる処置群の場合の生存時間を示す。多くの処置群が同一の方法で処置され、例えば０．１５ｍｌの用量の群ｉｐ１及びｉｐ２は腹腔内から同じように処置され、あるいは群ｐｏ２及びｐｏ３は経口から０．３ｍｌの用量で処置された。この腫瘍の型において、生存時間の増大は約４０％であり、これは経口処置の場合において最大であった。
【００８５】
腫瘍の重量の試験は、実験ＩＩで記載したような瀕死状態の動物で実施され、そしてその結果を図１４及び１５に要約する。横軸に示した数は特定の群におけるマウスの連番に関連し、それらに特別な意味はない。カラムダイアグラムに示した縦の項は関連する群における偏差に関する。腫瘍の重量の減少は、経口から適用した処置でも、ここでは最も有意であった。
【００８６】
実験動物上で実施した５’−ヌクレオチダーゼの試験は、処置した群における実質的な低下を示し、その様な試験の完全な実験データの解析は、現時点ではまだ完了しておらず、それ故にそれらは表の形に要約することができない。
【００８７】
ＩＶ．急性Ｌ１２１０リンパ性白血病の移植による実験
材料Ｂｂｏ−ｂの作用は、急性Ｌ１２１０リンパ性白血病の場合において試験された。１０匹のマウスの群は、実験ＩＩ及びＩＩＩに関連して記載したように飼育された雌性のＢＤＦ１マウスから形成された。急性Ｌ１２１０リンパ性白血病が維持されたＤＢＡ／２マウスの腹水及び生理食塩水から、１０６個の細胞を含んで成る０．１ｍｌの液体が作成された。その液体から、０．１ｍｌが腹腔内から各実験マウスへと注射され、そして処置群においては、当該処置は、実験ＩＩ及びＩＩＩの様に８日間、１日に一回実施された。
【００８８】
図１６は、生存データを示す。ポジティブコントロール群における平均生存時間は９．９日であった。図１６においては、どの様に材料が適用されたかに依存して生存時間における非常に実質的な差異があることが見て取れる。腹腔内及び皮下の適用に応じて、生存時間は１７０％であり、そしてこれらに対して、０．２ｍｌの用量の経口適用は３２０％の生存時間をもたらしたが、この処置群においては、個体の動物間の差異が大きく、そしてそれらのいくつかは完全に治癒していた。この腫瘍の型において、相対的な腫瘍の重量を決定する方法がなく、そして腹腔で回収された腹水は、腸間膜に存在する腫瘍と一緒に、絶対的な腫瘍の重量を構成した。図１７は、瀕死の群においてその様に決定された絶対的な腫瘍の大きさの測定された重量を示す。３０日目に生存していた動物もこれらの群に属していた。図１７においては、処置した群のうちの３つにおいて測定可能な腫瘍の重量が見られなかったことが見て取れる。
【００８９】
図１８は、５日目及び８日目及び瀕死状態における５’−ヌクレオチダーゼ活性の変化を示す。当該ダイアグラムからは、実質的な向上が処置した群の全てにおいて起こること、そして幾つかの処置群において、標準的な値が得られてことが見て取れる。
【００９０】
複数の異なる日に実験Ｉ〜ＩＶに参加したマウスの更なる群において、組織学的な試験が実施された。当該試験には、１７の異なる臓器の組織学的解析を含めた。その様な組織学的試験に基づき、試験した腫瘍型のいずれにおいても転移は形成されていなかったと述べることができる。しかしながら、ポジティブコントロール群の場合においては、はっきりと認識可能な転移活性が見られた。これらは、以下の様に個々の腫瘍の型：リンパ腺及び肝臓におけるＳ１８０肉腫の場合；肝臓及び腸間膜のリンパ腺におけるＣ２６の場合；肝臓におけるＭＸＴ腫瘍の場合；骨髄におけるＬ１２１０の場合においても検出された。
【００９１】
上文の実験結果は、経験した有意な向上が、今回試験しなかった腫瘍の型においても起こることを有望なものする。それらの顕著な有意性により、全ての型の腫瘍を網羅する実験が必要であろう。それにも関わらず、上文の実験は、主要な効果の存在を支持するのに十分広いものであった。
【００９２】
本発明に従う解決方法は、腫瘍の処置のためだけでなく、追加治療のため、そして転移の形成を予防するために効果的に使用され得る。
【００９３】
前記作用に重要であるが、少なくとも画分ボバイン４０以外の２つの別々の画分が腫瘍を有する対象者の血液中に存在するという事実により、これらの画分の試験は腫瘍の診断に使用され得る。
【００９４】
本発明に従う調製物を用いて、そしてその診断的な可能性を用いて得られた結果は、腫瘍の効果的な処置及び診断に関する希望をもたらす。白血病を有するウシのストックは世界中に十分存在し、これにより大規模な製造が可能となる。更に、材料ボバイン４０及びボバイン３００の製造のための合成方法を見つけるための可能性が存在しているのは、これらの材料の徹底的な試験が予想通りにその様な製造をもたらしうるためである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０．１５ｍｌのＢｂｏ−ｆ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図２】図２は、Ｂｂｏ−ｆ材料を用いる１０回の処置の生存のダイアグラムである。
【図３】図３は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる６回の処置の生存のダイアグラムである。
【図４】図４は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる８回の処置の生存のダイアグラムである。
【図５】図５は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる１０回の処置の生存のダイアグラムである。
【図６】図６は、０．１ｍｌのＢｂｏ−ｂ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図７】図７は、０．１５ｍｌのＢｂｏ−ｂ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図８】図８は、１９日目までの動物の体重を示す。
【図９】図９は、酵素試験の結果を要約している一連のカラムダイアグラムである。
【図１０】図１０は、結腸直腸腫瘍Ｃ２６の移植後の処置の生存データを示す。
【図１１】図１１は、図１０の処置における相対的な腫瘍の重量を示す。
【図１２】図１２は、図１０の処置の場合における５’ヌクレオチダーゼの値を示す。
【図１３】図１３は、ＭＸＴ乳ガンを処置する場合に見られる生存のダイアグラムを示す。
【図１４】図１４は、図１３の処置の場合の相対的な腫瘍の重量を例示する。
【図１５】図１５は、処置の次なる型の場合における図１４版である。
【図１６】図１６は、Ｌ１２１０リンパ性白血病を処置する場合に見られる生存のダイアグラムを示す。
【図１７】図１７は、図１６の処置において得られた絶対的な腫瘍の重量を示す。
【図１８】図１８は、図１６の処置の場合における５’ヌクレオチダーゼの値を示す。[0001]
The present invention relates mainly to pharmaceutical preparations for the treatment and diagnosis of tumors, and to a method for separating the lipid-free fraction of plasma.
[0002]
Published international patent application WO 00/40256 relates to the tumor-inhibitory effect of plasma obtained from patients suffering from acute leukemia. In that application, a number of experiments are described, in which the preparation used results in a 20% improvement in relation to a particular type of tumor compared to the control group. This improvement is close to the lower limit of what is said to be significant.
[0003]
The use of pharmaceutical preparations made from acute leukemia blood is limited by the small number of subjects that can be used as donors and the strict ethical and legal considerations associated with the use of human blood. Limited. The superior significance and research limitations of tumor treatments performed worldwide in this field are determined through any novel analytical methods that are obvious as prospects in either therapy or diagnosis.
[0004]
The above-cited patent applications have shown that the blood of patients suffering from acute leukemia may comprise precisely non-limiting components with general anti-tumor effects.
[0005]
It is an object of the present invention to provide new pharmaceutical preparations which can be used for the treatment and diagnosis of tumors, with the aim for an effective separation of plasma having a role in the fight against tumors. Including, and for a further purpose, finding the appropriate group of such blood donors.
[0006]
To achieve its purpose in the first stage, more effective washing methods have been devised, where it was assumed that the active ingredient was in the lipid-free fraction of plasma. Separation of the lipid-free components of the plasma is accomplished by treating the plasma fraction with a first organic solvent, followed by the addition of a surfactant consisting of very fine particles, and then vigorously separating the lipid-free fraction bound to the particles. The mixture can be separated from the liquid components by centrifugation and can be carried out in a preferred manner if the separated fractions are again brought into solution.
[0007]
Washing is more effective when the lysis and separation steps are repeated by using a second organic solvent, followed by repeated centrifugation.
[0008]
The amount of surfactant is about 0.5% with respect to the amount of plasma and its particle size is between about 200-400 nm. Preferred materials are, for example, kaolin (bolus alba), activated carbon or methocel.
[0009]
Centrifugation is preferably performed at an acceleration of 15000 g. Dissolution is likely to be achieved if the solution is more stable at elevated temperatures due to intermittent centrifugation after application of the organic solvent.
[0010]
Separation of the surfactant particles from the lipid-free component is not essential, and after a second separation, the particles can be brought together with the lipid-free component attached thereto, eg, to a physiological solution.
[0011]
According to a further purification method, the lipid-free components can be brought into solution with some surfactant and the solid components separated by further centrifugation.
[0012]
The lipid-free products isolated in this way and obtained from donors with acute leukemia had been proved to be significantly more effective than the products described in the above-cited patent application, so that The main point of view was examined, ie, whether such an anti-tumor component was only found in acute leukemia or whether it was also present in the blood of a subject who had cured from the tumor.
[0013]
It has been recognized that such components are present in the blood of subjects who have healed from tumors, and that this occurs in the lipid-free portion of the plasma. By applying the washing method described above, in the case of mouse S180 sarcoma, the survival time is substantially longer when using a preparation obtained from a tumor-healing donor, and the effect depends on the tumor type. It does not appear to be dependent, and it has been experimentally demonstrated that lipid-free fractions obtained from plasma mixtures obtained from donors cured from different tumors have equally effective tumor inhibitory effects.
[0014]
Although the number of donors healed from tumors is substantially greater than the number of subjects with acute leukemia, and the amount of blood that can be obtained from them is almost unlimited, widespread medical use has been Can not be expected due to the morals and legal limitations mentioned in.
[0015]
Further approaches to solving basic objectives have led to more progressive discoveries. The reason for this finding is based on studies of the natural healing of tumors in animals. In artiodactyla, tumor diseases caused by retroviruses are rather specific. In some species, the disease manifests in tumors and the infected animal dies, while in other species, mainly cattle (cattle), the disease can be any disease in the tumor or in the normal health of the animal. Is not expressed in The infection can be detected by the presence of the antibody GP51 in the blood.
[0016]
It is a recent general idea in veterinary medicine that livestock (bovine) must be isolated from individuals suffering from leukemia. This idea was published in the Fourth Edition of the Journal of the Fourth Edition in the Fourth Edition of the Journal in the 1992 edition of the Thesis, which was published under the title "the inspection status of leukosis of the cattle in the country and the possibilities of the freeing the stock" in the 1992 edition of the Journal. This view was made by the Veterinary Committee of the Hungarian Academy of Science. Leukemia infection range was found to be almost 50%. As a further publication, Issue No. 9 of 1997 of the same journal includes the paper "Freeing from from leukosis in Hungary" by Dr. Telkes, Lajos, coordinating the importance of isolating livestock from leukemia. Consists of The extent of infection has been shown to be higher on more farms, and at the time of the second paper, the extent of infection was about 17%.
[0017]
The essence of the discovery is that the blood of animals that successfully and symptomatically fought leukemia, and more particularly the lipid-free fraction of the plasma of those bloods, was effective in experiments performed on human donor blood. It consists in comprising ingredients which have proven to be. This finding follows a number of experiments that confirmed this hypothesis in some respects, and provided evidence for the existence of an incredibly effective tumor inhibitory effect since the fight against tumors began.
[0018]
The existence of this effect was further confirmed by the finding that similar blood components obtained from animals not suffering from leukemia did not have such an effect.
[0019]
Electrophoretic studies of lipid-free plasma obtained from human and animal donors confirmed the presence of similar fractions in two ranges of molecular weight, and these fractions were found in plasma obtained from healthy donors. Did not exist. A first fraction having a molecular weight of about 40,000 hereinafter referred to as "bovin 40" and a second fraction having a molecular weight in the range of 300,000 to 350000, hereinafter referred to as "bovin 300". But should be important for tumor inhibitory effects.
[0020]
In the knowledge of the solution according to the invention, it seems sensible to make general corrections on the need for the isolation of livestock from individuals with leukemia.
[0021]
The fractions of bobain 40 and bobain 300 identified according to the present invention have excellent tumor inhibitory activity, and at the same time, their absence detection helps to establish a tumor diagnosis.
[0022]
The present invention will be described with reference to examples, which are referenced in the accompanying drawings and experiments.
[0023]
Different details of the solution according to the invention can be found in the order of the different stages of the experiment performed. Regardless of the order of significance, a description is required of how to prepare the materials used in the experiments.
[0024]
From the blood used as starting material, the lipid-free plasma components are obtained via a multi-stage separation method. Preferred separation steps are as follows.
[0025]
Immediately after the starting blood has been collected, it is treated with an anticoagulant, preferably heparin.
[0026]
The separation of the microparticles is preferably carried out by centrifugation at a temperature of 4 ° C. and an acceleration of 5000 g (g means acceleration at standard gravity). If the centrifugation is not performed immediately after the blood is collected, the blood treated with the coagulant can be stored at a low temperature, preferably at the temperature of the centrifugation, for at most 48 hours. The duration of the centrifugation is at least about 10 minutes. The upper layer liquid is used for further processing. The plasma thus obtained may be cooled to a temperature of −20 ° C. and may be mixed with plasma obtained from different donors as well. Further processing may be performed when higher plasma quality is required. In the examples described herein, plasma obtained from any particular donor is mixed with that obtained from a different donor, and any differences derived therefrom are reported separately.
[0027]
As a first step in the removal of the liquid components, the plasma is diluted with an equal amount of a first organic solvent, for example alcohol of 96% purity, and the solution thus obtained is mixed.
[0028]
In a second step, a surfactant material (agent) is added to the solution in an amount of 0.5% by weight. The role of this surfactant material is to bind the lipid-free components of the plasma onto their surface. The surfactant may be kaolin, activated carbon or methocel, and their average particle size is preferably between 200 and 400 nm. In the case of the embodiment described, the surfactant material is kaolin.
[0029]
This plasma mixture is kept permanently in suspension by physical interference (mixing) for 6 hours at room temperature, followed by incubation at a temperature of 5 ° C. for 10-12 hours. During the incubation period, the liquids were each briefly mixed once every 30 minutes.
[0030]
Following the incubation, the mixture was resuspended by mixing and the suspension was centrifuged at a temperature of 4-5 ° C. at an acceleration of 15000 g for 10 minutes.
[0031]
From the centrifugation, more solid components with bound surfactant particles were separated for further processing and the liquid phase was discarded. A second organic solvent was added to the separated phase in an amount equal to the weight of the first organic solvent, which in an exemplary case was a 50% -50% by weight mixture of alcohol and toluene. The treatment of the mixture so obtained was identical to the subsequent treatment of the first solvent. During this step, the plasma mixture was kept permanently in suspension by physical interference (mixing) for 6 hours at room temperature, followed by incubation at a temperature of 5 ° C. for 5-12 hours. During the incubation period, the liquids were each briefly mixed once every hour.
[0032]
Following incubation, the mixture was resuspended by mixing, and the suspension was centrifuged at a temperature of 5 ° C. and an acceleration of 15000 g for 10 minutes.
[0033]
From the centrifugation, the solid component with bound surfactant particles was separated for further processing and the liquid phase was discarded.
[0034]
The solid components were spread to form a thin layer, followed by removal of any remaining organic solvent in a dehumidifier placed under reduced pressure for 2 hours.
[0035]
Subsequently, the same amount of saline as the original plasma weight was added to the separated sediment, and the material was resuspended by mixing. The plasma preparation thus obtained is labeled in the following part of the description with the letter "b", which stands for the surfactant material, kaolin.
[0036]
When obtaining a second, relatively more purified, alternative plasma preparation, the detergent material was removed by adding a tissue-friendly detergent to the mixture "b", which can dissolve the plasma preparation. . In an exemplary case, the detergent was 0.01% by weight sodium lauryl sulfate. To obtain a suitable suspension, the materials with the detergent added were incubated for 6 hours at room temperature with continuous mixing, and then stored in a refrigerator for 8-12 hours. The material that formed a precipitate during the incubation was resuspended, followed by centrifugation at 15,000 g in the cold. The precipitate is discarded, and the upper liquid contains useful material, which is identified by the letter "b" and to indicate that the material is finer. Labeled in the following part of the description with "f".
[0037]
To facilitate experiments performed with mice, both types of products were given in 1 ml doses each, which were subsequently labeled and stored frozen.
[0038]
Both the product and the environment of the preparations are sterile, so that the materials are sterile and capable of parenteral application.
[0039]
1. Experiment with transplantation of S180 sarcoma
All these experiments involved the same type of female BDF with an average weight of 25 g. 1 Performed in mice. Both experimental and positive control animals were implanted with S180 sarcoma subcutaneously. The experimental environment for the animal type, the type of sarcoma transplanted and the method of transplantation were identical to those described in the international patent application cited above. Each experimental group contained at least 5 mice, and data was reported on the average of mice in the relevant group. Mice were identified according to the number of appropriate groups, and they had a unique number.
[0040]
Experiment 1
Plasma preparations of type "b" were prepared from the blood of patients suffering from acute leukemia, and in the experimental group, each mouse received 0.1 ml of them subcutaneously eight times every other day.
[0041]
In the positive control group, the average lifespan was 19.6 days, and in the experimental group it was 23.5 days. This is a 20% increase, which can be considered a significant improvement. In the context of the same type of tumor, in the above-cited international patent application, the best preparation resulted in a 5% increase in survival, far below the significant threshold. Proper separation of lipid-free plasma components is therefore very essential.
[0042]
Experiment 2
This experiment comprised the results of six independent experiments, which are also present in the blood of subjects whose tumor-effective material has healed from the tumor, which appears to be contained in the lipid-free components of the plasma. Is based on the assumption that Such people who have been alive for at least 10 years and at most 27 years since the tumor was discovered, and therefore could be considered cured, were selected as donors. The tumor types of the diagnosed donors were, in order, pharyngeal, colon, breast, lymphocytic leukemia, testicular and prostate tumors, and lung tumors.
[0043]
Plasma preparation type "b" was made in all six donors and each group of mice was treated with them. The average life expectancy of the control group was again 19.6 days, while the average of the treatment groups varied between 25.5 and 27.3, and therefore there were negligible differences between the treatment groups. Such survival constitutes a 30% to 40% improvement compared to the control group, which is very significant.
[0044]
As a further experiment, a "b" type plasma product was made from an equal mixture of plasma obtained from all six donors after microparticle removal. This product showed a 38% increase in survival compared to the control group.
[0045]
These experiments thus confirmed the hypothesis that the subject's lipid-free plasma components cured from the tumor contained effective tumor-inhibitory materials. Furthermore, it has also been demonstrated that the presence of such a material does not depend on the actual tumor type (at least in the case of the tested tumor types) and therefore the mixture is equally effective.
[0046]
Experiment 3
Cattle (beef) whose blood test confirmed the presence of bovine leukemia were selected as donors. From such donor blood, "b" and "f" type plasma products were made. Similarly, both types of plasma products were prepared from bovine blood whose blood did not indicate the presence of leukemia.
[0047]
The test is performed in multiple variants and varies, the first parameter being the number of treatments applied every other day and the second parameter being the dose varying between 0.1 and 0.15 ml. And the third parameter was the purity of the product, ie, “b” or “f” form. The preferred range of testing of these parameters was determined by pilot experiments before the actual experiment, as each optimal value was found in terms of dose and number of treatments.
[0048]
Products obtained from the blood of bovine with leukemia meet the criteria of large scale applicability, as there are no restrictions on donor availability and on ethical or moral considerations. Survival data substantially exceeds other favorable data obtained from human blood. This is the reason for the detailed explanation of these experimental results.
[0049]
During the experiment, the average weight of the animals, the average survival time was tested, and at a predetermined time in the test, a 1 ml test blood sample was taken from each mouse in each group, and multiple The presence of tumor markers was tested. Mice from which blood samples were taken were excluded from the following experiments because they could not survive such amounts of blood.
[0050]
Survival results may be divided into two main groups, ie, treatment is performed on products of type "b" or "f". The origin from cattle with leukemia is represented by the abbreviation "Bbo", so that the treatment of the first main group is carried out with the material Bbo-b and that of the second main group with the material Bbo- f.
[0051]
Dates were counted from the day of tumor implantation. Each curve is shown in FIGS. 1-7 for the average of a group containing at least 5 mice.
[0052]
1 and 2 show diagrams of the survival of the group treated with the material Bbo-f. Mice in the positive control group received no post-transplant treatment, apart from normal feeding, and mice in the treatment group were treated every other day with a limited amount of material Bbo-f. For each treatment in the group shown in FIG. 1, the dose was 0.15 mm. The two treatment groups differ from each other in the number of treatments. In the first group, 8 treatments were applied, while in the first group, the number of treatments was 10, after which the mice did not receive any treatment of ova. In the group receiving 10 treatments, a sudden increase in mortality was seen after the end of the treatment, ie on day 20. This sudden increase can also be seen in the group that received eight treatments, but it is interesting that the increase occurs later and with a more gradual slope. The average survival time compared to the control group, having 19.6 days, is 24,8 days for the group receiving 8 treatments, while 23.2 days for the group receiving 10 treatments.
[0053]
In each group shown in FIG. 2, treatment was performed 10 times every two days. There is a difference in dose. The first group of mice received a dose of 0.15 ml for each treatment, while the second group was treated with a 0.1 ml dose. If the dose is reduced, the difference is very apparent. Survival time is increased by 30 days, which constitutes a 153% improvement compared to the positive control animal group.
[0054]
The results of the treatment with the material Bbo-b are shown in the two groups in the figure. In the case of FIGS. 3-5, the changing parameter is the dose. In the case shown in FIG. 3, the treatment was performed six times, and the survival time is almost independent of the dose used, and it can be seen that the lower dose is slightly preferred. However, the survival time was substantially better compared to material Bbo-f, with an average survival time of 37 days, which is almost a 189% improvement compared to the positive control. The dependence of the survival time from the dose becomes even more apparent when considering FIG. Here, the number of treatments was eight. Under the effect of a dose of 0.15 ml, the survival time is reduced compared to the value obtained with the 6 treatments, and this appears to be merely a consequence of the overdose. Conversely, a dose of 0.1 ml appears to be optimal for eight treatments as the mean survival time was substantially increased and the diagram had not yet reached a value of 50% by day 59. . This increases survival by over 300%, which is a highly desirable picture.
[0055]
FIG. 5 shows the average survival time for mice receiving 10 treatments. Here, the 0.15 ml dose is surprising because the survival is suddenly reduced in this group, but the average is better in the earlier group receiving similar treatment. It is likely that the small number of mice makes a difference from the somewhat favorable behavior of one or two mice. The rate of sudden death increased after the 33rd day with the 0.1 ml dose, which also appears to be the result of overdose.
[0056]
In FIGS. 6 and 7, the changing parameter is the number of treatments. Comparison of the two figures shows that the application of 8 treatments with a dose of 0.1 ml is optimal. The results from FIG. 7 indicate that at higher doses, the improvement increases with decreasing number of treatments, which also indicates that the dose was too high.
[0057]
Tumor healing and average animal weight
The improvement experienced in the context of the treated group of animals cannot be discerned based solely on the mean survival time. In an animal weighing 25 g at the start, a large tumor is formed, weighing 6-8 g, ie almost one third of the total weight of the animal. In animals treated 8 times by the end of the cycle with a dose of 0.1 ml from the material Bbo-b, a well-recognized treatment is performed in the state of the tumor, sarcomas are opened and crushable material is discarded. Was done. This material contained dead tumor cells. The animal's "bulge" disappeared, and they began to gain weight.
[0058]
FIG. 8 shows the values of the average body weight of the animals on the first 19 days for the groups Bbo-b and Bbo-f, both of which received 8 treatments, and for the positive control group. The diagram correlates well with the reporting of conditions described above, especially in the case of treatment with the material Bbo-b. The drawback of the diagram is that it does not separately indicate the amount of tumor. We cannot get an accurate value for the weight of the tumor, so the total weight also includes the weight of the tumor. In the treated group, the initial decline is followed by a regenerative increase, while in the positive control group the weight increases and decreases, mainly caused by tumor growth.
[0059]
The above experiments that appeared to be the best were repeated using material obtained from healthy cows without leukemia. The results were not significantly different from those obtained in the positive control group, which confirmed that only material obtained from blood of bovine leukemia was effective.
[0060]
Test results of enzyme tumor markers
For the study of metabolic changes associated with the malignant process, there are several enzyme tumor markers that are widely determined in clinical trials, and among these methods, the number of types is determined, which is Can be used for In selecting the method, it was considered that the malignant process was complicated by and often maintained by biochemical disorders. Therefore, considering these considerations, nucleic acid metabolism (serum alkaline (basic) and acidic deoxyribonuclease activity, 5'-nucleotidase activity); polyamine metabolism (arginase activity); liver mitochondrial function (ornithine carbamoyltransferase activity); It may be necessary to perform assays for neogenesis (phosphohexose isomerase activity); identification of bone-related processes (bone-specific alkaline phosphatase activity). Changes in the activity of the listed enzymes are associated with malignant processes and are followed by changes in metabolism that are maintained and the results of the applied treatment.
[0061]
During the experiment, blood samples were taken from mice on days 8, 15, and 19 after tumor implantation. The data is summarized in Table 1. The data relate to the average of each 5 mice, all tested separately.
[0062]
Meaning of some columns in the table
β-Glyc: non-specific phosphatase, β-glycerophosphate; this value should be subtracted from that of other phosphatases so that it can be interpreted as a tumor marker;
Alk. F: Alkaline phosphatase
5'-TMP: 5'-thymidine-5-monophosphate
PDE: phosphodiesterase
SDNaz: acid deoxyribonuclease (acid DNAase)
Σ. 5'-ND: total value of all 5'-nucleotidases
[Table 1]
[0063]
In the table, there are three different groups. The last group relates to controls with mice that have not been implanted with tumors, and mice 51-55 of this group are tested on day 8, mice 56-60 are tested on day 15, and mice 106- 110 was tested on day 19.
[0064]
The middle group was associated with the positive control, mice 151-155 were tested on day 8, mice 101-105 were tested on day 15, and mice 41-50 were tested on day 19.
[0065]
The first group was divided into two subgroups, one treated with the material Bbo-b, one starting with the number 2, and the other treated with the material Bbo-f, It starts with 3. In this subgroup Bbo-b, testing of mouse 271-275 on day 8, mouse 276-280 on day 15, mouse 271-275 on day 19, and finally testing of mouse 246-250 Performed on day 45, much slower for substantial survival.
[0066]
Distribution of mice treated with the material Bbo-f in the second subgroup according to the test day: 396-400: day 8; 391-395: day 15; 385-390: day 19.
[0067]
The results are summarized in FIG. 9 in the form of a column diagram. In this, the group of mice exemplified on the horizontal axis is related to the data on the vertical axis, where the column height represents the total of the data. On the horizontal axis, groups of mice are illustrated separately, and in each group, the order of the sample data increases from left to right.
[0068]
The three left columns are associated with the control group, the middle three columns are associated with the positive control group, and the first three of the seven right columns belong to subgroup Bbo-f, and The remaining four columns belong to subgroup Bbo-b.
[0069]
In the control group, the data does not naturally change over time, and their variability is within the natural range. In the case of the positive control group, all components are extremely high, and by the time of moribundity (last column), they increase further.
[0070]
Conversely, in the subgroups treated with both, the initial values are already smaller than the data of the positive control group, and they further decrease over time. Material Bbo-b showed substantially better results than treatment with material Bbo-f according to favorable survival data. The decrease continues after day 19, and by the end of the experiment, the data approaches the standard values of the control group.
[0071]
Experiment 4
Based on the favorable results obtained during the previous experiments, it was tested which components of the lipid-free plasma were responsible for this effect. Because we had blood from healthy people, blood from subjects with acute leukemia, blood from subjects healed from tumors, as well as blood from leukemic and non-leukemic cattle, "B" was made from each blood listed and they were subjected to individual electrophoresis tests. For the test, the starting materials were brought onto the surface of the polyacrylamide gel used and, under the effect of the electrophoretic treatment, the components of the materials were separated according to their molecular weight order.
[0072]
Blood that has proven to be ineffective from a tumor treatment perspective, i.e., fractions obtained from normal human blood and blood collected from non-leukemic cattle, can be obtained from blood types that are effective from a tumor treatment perspective. It was compared with the obtained fraction. The most obvious difference was seen in the fraction of blood collected from cattle with leukemia, which was in the presence of a fraction with a molecular weight of about 40,000, as well as a fraction with a molecular weight of 300,000 to 350,000. These two fractions together represented 8-12% by weight of the sample. Fractions of blood preparations collected from tumor-healed donors contained both of these components, although the presence of a fraction with a molecular weight around 40,000 was even more evident, and the amount of fraction was Substantially low, about 2-3%. Among the fractions of the preparation obtained from the blood of acute leukemia, only a minor component with a molecular weight of 40,000 was present, and no other fractions were detected.
[0073]
For the purpose of identifying the two fractions, one having a molecular weight of about 40,000 is referred to as "Bobain 40" and the other fraction between 300,000 and 350,000 is designated "Bobain 300". The method described herein is sufficient for the correct identification of these two fractions. Identification of the structure of these fractions is ongoing. In the knowledge of the results shown, it can be stated on a sound basis that the presence of the materials bobaine 40 and bobaine 300 is important for the effect shown.
[0074]
II. C 26 Experiments with colorectal tumor transplantation
The experiments were performed using first generation internally bleed Balb / c female mice.
[0075]
The place of origin of the mice was TNO Institute (Rifkswijk, The Netherlands), and the breeding place was the Department of Experential Pharmacopoeia of the National Institute of Oncology (Hungary).
[0076]
The animal breeding environment was a cage of macrolon material, a temperature of 20-22 ° C., a relative humidity of 45-55%, and day / night maintenance, varying on a 12 hour cycle. Feeding was performed with standard quality mouse chow (type: Altromin, Germany), which can be sterilized in an autoclave, and the bedding was made from wood. The breeding hygiene level was in accordance with the SPF (Specified Pathogen Free) conditions described above. The care and breeding of the animals was carried out in accordance with the Declaration of Helsinki in "Guiding Principles for the Care and Use of Animals".
[0077]
Colon-26 colon adenocarcinoma was purchased from SRI (Birmingham, Alabama, USA). Implantation method: A small 20 mg piece from the maintained tumor was implanted subcutaneously into the interscapular area.
[0078]
During the experiment, animals were divided into groups of 10 mice, and animals in the positive control group received no treatment after transplantation. In the treatment group, treatment was performed using the aforementioned Bbo-b material. This material was also designated as ABB-7 during the documentation of the experiment. The experience gained through experimental series I was utilized, and the treatment was applied simultaneously from day 1 to day 9 for a total of eight times a day. The differences in each group were in the method of treatment and the amount of experimental material applied.
[0079]
Survival data is summarized in FIG. In the case of the positive control group, the 100% survival time was 19 days. In the first group, the treatment was performed intraperitoneally (IpI) at a dose of 0.1 ml, in the second group the method of application was identical except that the dose was 0.15 ml, and the mouth was The application of per os materials was also tested. Here, an appropriate dose delivery device was used to deliver the material directly to the animal's stomach. In the first oral (po1) group, the dose was 0.2 ml of material and in the second oral (po2) group, the dose was 0.3 ml. As a further group, sc, the material was applied subcutaneously (under the skin) with 0.1 ml of material was also treated. Survival data shows the average of a group of 10 mice. From the figures, it can be seen that substantial improvement occurred in each of the treatment groups, with the two most effective treatments being ip application with 0.1 ml of material and po treatment with 0.2 ml of material.
[0080]
The experiment was repeated in an additional group of 10 mice, and to determine the weight of the tumor, the tumor was excised when the animal reached moribund (ie, just before death) and the tumor was excised. The weight was measured.
[0081]
FIG. 11 shows the results of these experiments. At the top of the column the value of the relevant level level is shown, which in all cases is less than 0.05, ie the data is very reliable.
[0082]
In an additional group of 10 mice treated similarly, 5'-nucleotidase activity was observed on samples collected at days 8 and 16 after tumor implantation and, in the case of experimental series I, in moribund condition. It has been determined. These data are shown in FIG. The activity increased from a low value at the start to the highest by day 16, and after reaching moribund, the activity was substantially reduced from the value obtained in the positive control group .
[0083]
III. Experiment to transplant MXT breast cancer
Female BDF of the described origin, while maintaining the conditions described in Experiment II 1 Mice were used to test the effect of treatment with material Bbo-b in the case of MXT breast cancer. The source of the transplanted tumor cells is MASON Res. Inst. USA. 1 mm from the maintained tumor 3 Small pieces were implanted subcutaneously in the interscapular area.
[0084]
From the animals, groups of 10 mice were formed in Experiment II, and in each group, each was treated equally. Treatment with the material Bbo-b was performed simultaneously as in Experiment II, ie once daily for 8 days. For the positive control, the average survival time was 24 days. FIG. 13 shows the survival times for the different treatment groups. Many treatment groups were treated in the same way, for example, groups ip1 and ip2 at a dose of 0.15 ml were similarly treated intraperitoneally, or groups po2 and po3 were treated at a dose of 0.3 ml orally. . In this tumor type, the increase in survival time was about 40%, which was greatest with oral treatment.
[0085]
Tumor weight studies were performed on moribund animals as described in Experiment II, and the results are summarized in FIGS. The numbers shown on the horizontal axis relate to the serial number of the mice in a particular group and have no special significance. The vertical terms shown in the column diagrams relate to the deviations in the relevant groups. The reduction in tumor weight was also most significant here, even with treatment applied orally.
[0086]
Tests of 5'-nucleotidase performed on experimental animals show a substantial reduction in the treated group, and the analysis of the complete experimental data of such tests is not yet complete at this time and therefore They cannot be summarized in tabular form.
[0087]
IV. Acute L 1210 Experiments with lymphocytic leukemia transplantation
The action of the material Bbo-b is 1210 Tested in the case of lymphocytic leukemia. Groups of 10 mice consisted of female BDF housed as described in connection with Experiments II and III. 1 Formed from mice. Acute L 1210 From ascites and saline of DBA / 2 mice with maintained lymphocytic leukemia, 10 6 A 0.1 ml liquid comprising individual cells was made. From the liquid, 0.1 ml was injected intraperitoneally into each experimental mouse, and in the treatment group, the treatment was performed once a day for 8 days as in experiments II and III.
[0088]
FIG. 16 shows survival data. The average survival time in the positive control group was 9.9 days. In FIG. 16, it can be seen that there is a very substantial difference in survival time depending on how the material was applied. Depending on the intraperitoneal and subcutaneous application, the survival time was 170%, whereas for a 0.2 ml dose oral application resulted in a 320% survival time, in this treatment group the individual The differences between the animals were large, and some of them were completely healed. In this tumor type, there was no way to determine the relative tumor weight, and ascites collected in the peritoneal cavity, together with the tumor present in the mesentery, constituted the absolute tumor weight. FIG. 17 shows the absolute tumor size measured weights so determined in the moribund group. Animals that survived on day 30 also belonged to these groups. In FIG. 17, it can be seen that no measurable tumor weight was seen in three of the treated groups.
[0089]
FIG. 18 shows the change in 5′-nucleotidase activity on day 5 and day 8 and in moribund condition. From the diagram it can be seen that substantial improvement occurs in all of the treated groups, and that in some treated groups standard values were obtained.
[0090]
Histological studies were performed on additional groups of mice that participated in Experiments I-IV on multiple different days. The study included histological analysis of 17 different organs. Based on such histological examination, it can be stated that no metastases had formed in any of the tumor types tested. However, in the case of the positive control group, clearly recognizable metastatic activity was observed. These are the individual tumor types as follows: for S180 sarcoma in lymph glands and liver; for C26 in liver and mesenteric lymph glands; for MXT tumors in liver; L in bone marrow. 1210 Was detected in the case of.
[0091]
The above experimental results show that the significant improvement experienced is likely to occur in tumor types not tested this time. Due to their significant significance, experiments covering all types of tumors will be needed. Nevertheless, the above experiment was broad enough to support the existence of a major effect.
[0092]
The solution according to the invention can be used effectively not only for the treatment of tumors, but also for additional treatments and for preventing the formation of metastases.
[0093]
Important to said effect, testing of these fractions was used to diagnose tumors due to the fact that at least two separate fractions other than fraction bovine 40 were present in the blood of subjects with tumors. obtain.
[0094]
The results obtained with the preparation according to the invention and with its diagnostic potential offer hope for an effective treatment and diagnosis of tumors. Stocks of cattle with leukemia are abundant worldwide, which allows for large-scale production. Furthermore, the possibility exists to find a synthetic method for the production of the materials Bobaine 40 and Bobaine 300, since exhaustive testing of these materials can lead to such production as expected. is there.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram of the survival of a treatment with 0.15 ml of Bbo-f material.
FIG. 2 is a diagram of the survival of 10 treatments with Bbo-f material.
FIG. 3 is a diagram of the survival of six treatments with Bbo-b material.
FIG. 4 is a diagram of the survival of eight treatments with Bbo-b material.
FIG. 5 is a diagram of the survival of 10 treatments with Bbo-b material.
FIG. 6 is a diagram of the survival of the treatment with 0.1 ml of Bbo-b material.
FIG. 7 is a diagram of the survival of the treatment with 0.15 ml of Bbo-b material.
FIG. 8 shows the weight of the animals by day 19.
FIG. 9 is a series of column diagrams summarizing the results of the enzyme test.
FIG. 10 shows colorectal tumor C 26 7 shows survival data for treatments after transplantation of.
FIG. 11 shows the relative tumor weights for the treatment of FIG.
FIG. 12 shows 5 ′ nucleotidase values for the treatment of FIG.
FIG. 13 shows a diagram of the survival seen when treating MXT breast cancer.
FIG. 14 illustrates relative tumor weights for the treatment of FIG.
FIG. 15 is a version of FIG. 14 for the next type of procedure.
FIG. 16 shows a diagram of survival seen when treating L1210 lymphocytic leukemia.
FIG. 17 shows the absolute tumor weight obtained in the treatment of FIG.
FIG. 18 shows 5 ′ nucleotidase values for the treatment of FIG.
