JP2004500840A - pol配列を用いるHIVにおける変異検出の方法 - Google Patents
pol配列を用いるHIVにおける変異検出の方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2000年8月18日提出の米国特許第09/640,787号および2000年4月18日提出の欧州特許出願第00201433.0号の優先権を請求するが、これらは引用によって本明細書に組み入れられている。
【0002】
発明の分野
本発明は、HIV単離株のHIVpol遺伝子内の変異を、特にそれぞれプロテアーゼおよび逆転写酵素のコーディング領域の解析における使用のための増幅プライマーおよび配列決定プライマーの設計によって、検出するための方法に関する。
【0003】
発明の背景
HIVのような感染性因子の迅速かつ特異的な検出は、感染の診断および感染患者の治療のモニターの両方のために最も重要である。解析に要する期間を減少させるために、配列に基づくアプローチが多用されている。ハイブリダイゼーションに基づく検出方法は、非常に大きなウイルスの変異誘発のために信頼性の低下を免れない。したがって、配列決定に基づく方法は、生物学的サンプルの特定のウイルス配列を究明する道具として非常に望ましい。
【0004】
迅速で、ハイスループットの自動DNA配列決定技術の利用性は、ウイルス集団における変化およびウイルスゲノムにおける薬物耐性に関与する変異の検出を含む、臨床研究において明らかな応用性を有している。しかしながら、手動の配列決定またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく点変異アッセイによる臨床サンプルの解析は、野生株と変異HIVのゲノムの複雑な混合物が薬物療法中に出現しうることを明らかにした。したがって、特定の薬物療法に対するウイルス集団の有り得る感受性を検査するために、多数のゲノムにおける数個の耐性変異を同時に定量できるDNA配列解析を実施することが望まれるであろう。1個以上のpol遺伝子酵素(プロテアーゼおよび逆転写酵素)の配列を解析する特別の利点は、研究される材料が、研究されつつある特定の患者におけるウイルスゲノムの多様性を最大限に反映していることである。
【0005】
HIV感染の主標的細胞はT細胞のCD4+サブセットと同定された。複製のためには、HIVは先ず、gp120エンベロープタンパク質を介しての結合により、CD4表面タンパク質およびコ・レセプターを発現している細胞と相互作用する。エンベロープのgp41領域を介する融合に続いて、侵入が達成され、ウイルス粒子が崩壊され、そしてRNAゲノムが二本鎖の相補的DNA(cDNA)に転写される。この遺伝材料が前組み込み複合体の一部として細胞核中に運ばれ、そこでDNAはウイルスのインテグラーゼによってプロセスされ、続いて、構造タンパク質および酵素前駆体に翻訳される。ポリタンパク質、GagおよびGag−Pol含有のマトリックス、キャプシド、ヌクレオキャプシドならびに酵素逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼは、細胞膜に送られ、ここで、ウイルスのプロテアーゼによるタンパク質分解的切断およびビリオンパッケージングが起きる。これらの出来事のほとんどは広範に研究されており、ウイルスの複製を防ぐための可能な干渉の多数の段階が同定されている。これらは、宿主細胞への付着および侵入、逆転写酵素によるプロウイルスDNAの形成、インテグラーゼによる宿主細胞染色体中へのプロウイルスDNAの組み込み、ならびにウイルスのプロテアーゼによる、前駆体ウイルスタンパク質の切断を含むウイルス構築を包含する。臨床的に関連する薬剤は、2種のウイルス遺伝子、逆転写酵素およびプロテアーゼに対して開発された。
【0006】
これらの化合物の効能は、これらのタンパク質中に存在する変異に大きく依存する。HIVはプルーフリーディング機構をもたず、したがって高い変異誘発力を有している。この高い変異原性能は、これらの遺伝子における変異の導入によってウイルスを治療に対して耐性に誘導させる。
【0007】
レトロウイルスインヒビターは種々の方法でウイルスの複製を遮断できる。例えば、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)は、逆転写酵素によって伸長中のウイルスDNAへ組み込まれる天然のヌクレオシド三リン酸と競合する。これらの化合物を天然のヌクレオシドと区別する化学的改変がDNA鎖終結現象をもたらす。近年、利用しうるNRTIは、例えばジノブジン(ZDV)、ジダノシン(ddl)、ザルシタビン(ddC)、スタブジン(d4T)、ラミブジン(3TC)およびアバカビル(ABC)を含む。
【0008】
ヌクレオチド逆転写酵素インヒビター(NtRTI)はNRTIと同じ作用機作をもつが、それらは既にモノリン酸化されており、したがって少ない代謝段階しか要しないという点で異なる。例えば、アデフォビル(ビス−POM−PMEA)およびビス−POCPMPAがこの治療範疇に属する。
【0009】
非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NNRTI)は、非拮抗的に結合することによってHIV逆転写酵素を阻害するか、またはウイルスの逆転写酵素の活性部位に接近し、それによってその活性を阻害する、構造的に異なる化合物の1群である。この群において利用しうる化合物は、例えばネビラピン(NVP)、デラビルジン(DLV)およびエファビレンツを含む。
【0010】
プロテアーゼインヒビター(PI)は、擬ペプチド性であり、そしてウイルスプロテアーゼ酵素の活性部位に結合し、それによって感染性ビリオンの構造的および酵素的成分を生成するのに必要な前駆体ポリタンパク質の切断を阻害する。近年利用しうるPIは、例えばサキナビル(SQV)、リトナビル(RTV)、インジナビル(IDV)、ネルフィナビル(NFV)、アンプレナビル(APV)およびロピナビル(ABT−378)を含む。
【0011】
抗レトロウイルス療法に関する見解は、新規薬剤が利用できるようになるにつれ、かなり改善された。抗レトロウイルス治療処方に関する現ガイドラインは、初期治療のための3剤組み合わせ療法、例えば1種のPIと2種のNRTIまたは1種のNNRTIと2種のNRTIを推奨する。これらの組み合わせ処方は、強い抗レトロウイルス活性を示し、そしてHAART(高度に活性な抗ウイルス療法)と呼ばれる。HAARTの導入は、これらの薬物への接近によってHIV−1患者集団における罹患率および死亡率の有意な減少をもたらした。
【0012】
HIV−1における変異の検出アッセイはウイルスのゲノム配列のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅に基づく。これらの増幅された配列が、次にハイブリダイゼーションまたは配列決定技術のいずれかを用いて解析される。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、DNA合成の選択的開始を可能にするために設計された合成オリゴヌクレオチドを使用するプライマー特異的PCRを含む。参照、Larder,B.A.,et al.,AIDS 5,137−144(1991);Richman,D.D.,et al.,J.Infect.Dis.164,1075−1081(1991);Gingeras,T.R.,et al.,J.Infect.Dis.164,1066−1074(1991)。プライマー配列が3’末端において標的配列(野生型または変異体)に合致する場合にのみ、標的配列の増幅が可能であり、そしてDNAフラグメントが生成される。プライマー配列の知識は、研究下のウイルス単離物(isolate)の配列を推定させるが、プライマー配列によってカバーされる領域についてのみ推定させる。他のハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、分別ハイブリダイゼーション(Eastman,P.S.et al.,J.Acq.Imm.Def.Syndr.Human Retrovirol.9,264−273(1995);Holodniy,M.et al.,J.Virol.69,3510−3516(1995);Eastman,P.S.et al.,J.Clin.Micro.33,2777−2780(1995));Line Probe Assay(LiPARHIV−11RT,Innogenetics)(Stuyver,L.et al.,Antimicrob.Agents Chemotherap.41,284−291(1997));オリゴヌクレオチド連結アッセイ(Edelstein,R.et al.,J.Clin.Micro.36(2),569−572(1998))およびGeneChip技術(Affymetrix)(D’Aquila,R.T.Clin.Diagnost.Virol.3,299−316(1995);Fodor,S.P.A.et al.,Nature 364,555−556(1993);Fodor,S.P.A.Nature 227,393−395(1997))を含む。DNA配列決定アッセイは、配列決定される領域の全ヌクレオチドに関する情報を提供する。標的配列はPCRによって増幅される。配列解析は、主として、伸長するDNA配列におけるジデオキシ鎖−終結ヌクレオチド(3’ヒドロキシル基を欠いている)の組み込みおよび得られる分子のゲル電気泳動分析に基づく。配列決定技術は半自動化することができ、そしてポリアクリルアミドゲルから配列を「読み」取るために蛍光標識されたプライマーもしくはddNTPを使用する。変異を検出する新規技術およびアプローチが開発されつつあり、そして研究下のサンプルに存在する変異を検出するのに同じように良く適合される。変異を検出する他のアッセイも利用できるようになった、例えば、InvaderRアッセイ(Third Wave Technologies,Inc.)、WAVERDNAアッセイ(Transgenomic,Inc.)、質量分光測定(Jachson P.,et al.,Molecular Medicine Today 6,271−276(2000))および表面プラズマ共鳴(Nakatani,K.et al.,Nature Biotechnology 19(1),18−19(2001))。ゲルに基づく分析およびゲルに基づかない分析を含む、現在使用される変異技術の概要は、Shi,M.Clin.Chem.2001(47:2)164−172において概観される。配列解析は、DNAおよびRNAに限定されないいずれの核酸材料において行われてもよい。
【0013】
プルーフリーディング機構を欠いたウイルスは高い変異誘発力を有している。この変異誘発能は、薬物標的を変えることによって、薬物治療を逃れる方法をもつ感染性因子を提供する。これは薬物効力の低下、耐性、結果として患者の罹患率と死亡率の増加をもたらす。薬理学的治療に対するウイルスの耐性を検出するための1つのアプローチは、ウイルスゲノムにおいて起きるそれらの変異の決定を必要とする。これらの変異を決定するために、数種のアプローチが利用できる。ハイブリダイゼーションに基づく方法(分別ハイブリダイゼーション、BioChips、LipaR、プライマー特異的PCR)が開発されたが、これらの方法は、1つの分析試行に当たって限られた変異セットしかスクリーニングできないという欠点をもっている。
【0014】
あるいはまた、配列決定方法も開発された。この技術は、ハイブリダイゼーション方法に比較した場合、信頼性を増大するけれども、現プロトコールは、信頼できず、そして許容できる解析実施期間内に、治療圧力下でウイルスの変異誘発で起きるかも知れない全ての変異をもつHIVpol遺伝子のような遺伝子を配列決定することは不可能である。したがって、迅速で、信頼性のある、そして完全な配列解析法についてのニーズがHIV診断の分野において高いにも拘らず、存在している配列決定法の診断的価値は限定される。
【0015】
本発明は、全ての変異を含有するpol遺伝子を増幅し、そして配列決定するための手段を提供する1組のプライマーを必要とする改良された配列決定法に関する。さらに、また本方法は混合サンプルの分析も可能にする。本発明のプライマー組み合わせ物は、薬物耐性に関する全ての変異を同定するためにウイルスゲノムの一部を追加的にクローニングするかまたは再度配列決定するという必要な段階を回避して、1回の実験型式において全ての変異が配列決定できるので、分析期間を短縮させる。ウイルスの変異により定められたプライマーがその標的配列に適当にハイブリダイズしない場合には、ゲノムの再度の配列決定が必要になる。これは、実験のターンアラウンド時間を遅らせる。本発明のプロトコールを使用すれば、サンプルの配列は1日で信頼性をもって決定される。したがって、本発明の方法およびプライマー組み合わせ物は、薬物耐性のモニタリングを改良して、改善した患者管理をもたらす。
【0016】
かくして、本発明の目的は、HIVウイルス単離株のpol遺伝子の変異解析を実施するための、信頼性のある配列解析方法およびキットを提供することである。
【0017】
HIVのpol遺伝子は、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼを含む種々のタンパク質をコードしている。
【0018】
本発明は、
a)サンプルの単離、
b)単離されたサンプル材料のビリオンRNAの抽出、
c)配列番号:1(OUT3)および2(PRTO−5)において表されるアウター(outer)プライマーを用いる入れ子(nested)PCRによるRNAの増幅、
d)配列番号:3(PCR2.5)、4(PCR2.3)、5(SK107)および6(SK108)において表されるインナー(inner)プライマーから選ばれる5’および3’プライマーを用いる入れ子PCRによる該PCR生成物の増幅、および
e)配列番号:7〜12(Seq1FOR,Seq2FOR,Seq3F,Seq1B,Seq3B,Seq6R,Seq1F,Seq2A、Seq3A、Seq5A、Seq7A、Seq2B、Seq4B,Seq6B、Seq7B、Seq4A、Seq6A、Seq5B:表1参照)のいずれかから選ばれる少なくとも1個の配列決定プライマーを用いる、この第2の得られたPCR生成物の配列決定:
の段階を含む、HIVビリオンのHIVpol遺伝子の変異解析の方法に関する。
【0019】
本発明は、HIVのpol遺伝子の変異解析を記述する。HIVウイルス群が数ファミリーHIV−1およびHIV−2を含有することを理解すべきである。HIV−1は世界中に存在しているが、一方HIV−2は西アフリカに広く広がっている。HIV−1単離株はM群およびO群ウイルス、特にM群ウイルスを含む。変異を保持している混合集団は、少なくとも20%未満存在している場合に検出することができる。
【0020】
また、本発明は、
a)サンプルの単離、
b)単離されたサンプル材料のウイルスDNAの抽出、
c)配列番号:1(OUT3)および2(PRTO−5)において表されるアウタープライマーを用いる入れ子PCRによるDNAの増幅、
d)配列番号:3(PCR2.5)、4(PCR2.3)、5(SK107)および6(SK108)において表されるインナープライマーから選ばれる5’および3’プライマーを用いる入れ子PCRによる該PCR生成物の増幅、および
e)配列番号:7〜12(Seq1FOR,Seq2FOR,Seq3F,Seq1B,Seq3B,Seq6R,Seq1F,Seq2A、Seq3A、Seq5A、Seq7A、Seq2B、Seq4B,Seq6B、Seq7B、Seq4A、Seq6A、Seq5B:表1参照)のいずれかから選ばれる少なくとも1個の配列決定プライマーを用いるこの第2の得られたPCR生成物の配列決定:
の段階を含む、HIV単離株のHIVpol遺伝子の変異解析の方法を提供する。
【0021】
好適な方法にしたがって、該第2のPCR生成物は配列番号:7(Seq1FOR)において表されるプライマーを用いて配列決定される。
【0022】
好適な方法にしたがって、該第2のPCR生成物は配列番号:8(Seq2FOR)において表されるプライマーを用いて配列決定される。
【0023】
好適な方法にしたがって、該第2のPCR生成物は配列番号:9(Seq3F)において表されるプライマーを用いて配列決定される。
【0024】
好適な方法にしたがって、該第2のPCR生成物は配列番号:10(Seq1B)において表されるプライマーを用いて配列決定される。
【0025】
好適な方法にしたがって、該第2のPCR生成物は配列番号:11(Seq3B)において表されるプライマーを用いて配列決定される。
【0026】
好適な方法にしたがって、該第2のPCR生成物は配列番号:12(Seq6R)において表されるプライマーを用いて配列決定される。
【0027】
また本発明は、最初の配列決定プライマーの1種が1種もしくは1対の置換プライマーによって置換されている(表2)、本発明による方法を提供する。例えば、Seq2FOR(配列番号:8)が欠けていた場合はそれはSeq3A(配列番号:15)およびSeq5A(配列番号:16)によって置換される。しかしながら、原則的には、Seq2FOR(配列番号:8)がカバーすると期待された領域からの配列を得るいかなる記述されたプライマーが使用できる、すなわち、Seq3A(配列番号:15)、Seq4A(配列番号:22)もしくはSeq5A(配列番号:16)(図1参照)。さらに、Seq6A(配列番号:23)およびSeq5B(配列番号:24)は、また、特定の最初のプライマーを置換するために提案されたなかったが、それぞれの配列領域をカバーするために使用することができる(図1参照)。
【0028】
本発明による好適な方法では、配列番号:7(Seq1FOR)で表される最初の配列決定プライマーは、配列番号:13(Seq1F)および14(Seq2A)で表されるプライマーセットによって置換される。
【0029】
本発明による好適な方法では、配列番号:8(Seq2FOR)で表される最初の配列決定プライマーは、配列番号:15(Seq3A)および16(Seq5A)で表されるプライマーセットによって置換される。
【0030】
本発明による好適な方法では、配列番号:9(Seq3F)で表される最初の配列決定プライマーは、配列番号:16(Seq5A)および17(Seq7A)で表されるプライマーセットによって置換される。
【0031】
本発明による好適な方法では、配列番号:10(Seq1B)で表される最初の配列決定プライマーは、配列番号:4(PCR2.3)および18(Seq2B)で表されるプライマーセットによって置換される。
【0032】
本発明による好適な方法では、配列番号:11(Seq3B)で表される最初の配列決定プライマーは、配列番号:18(Seq2B)および19(Seq4B)で表されるプライマーセットによって置換される。
【0033】
本発明による好適な方法では、配列番号:12(Seq6R)で表される最初の配列決定プライマーは、配列番号:20(Seq6B)および21(Seq7B)で表されるプライマーセットによって置換される。
【0034】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:13(Seq1F)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0035】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:14(Seq2A)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0036】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:15(Seq3A)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0037】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:16(Seq5A)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0038】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:17(Seq7A)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0039】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:18(Seq2B)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0040】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:19(Seq4B)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0041】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:20(Seq6B)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0042】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:21(Seq7B)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0043】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:22(Seq4A)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0044】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:23(Seq6A)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0045】
好ましくは、本発明による方法は、該第2のPCR生成物が配列番号:24(Seq5B)において表されるプライマーを用いて配列決定される配列決定段階を伴う。
【0046】
さらに本発明は、配列番号:1〜24で表される配列に少なくとも80%の配列類似性、好ましくは、配列番号:1〜24で表される配列に少なくとも90%の配列類似性、より好ましくは、配列番号:1〜24で表される配列に少なくとも95%の配列類似性を有するプライマーに関する。
【0047】
さらに本発明は、少なくとも8個の連続するヌクレオチドの配列が配列番号:1〜24において存在している該少なくとも8個の連続するヌクレオチドを含有するプライマーに関する。
【0048】
プライマーは、複製される核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成のための開始点として働く。ハイブリダイゼーションの場所はプライマー−および標的配列によって決定される。当業者には既知であるように、アニーリングの特異性は、他の非標的配列に比べて独特である標的配列内の配列領域を選択することによって保証できる。それにもかかわらず、標的配列上へのプライマーの開始および停止は、この特異性を妨害することなく特定のプライマー部位の上流もしくは下流の若干のヌクレオチドに位置している。
【0049】
結果的に、また本発明は、配列決定プライマーが記述されたプライマー領域の上流もしくは下流のヌクレオチド1,2,3もしくは4個まで選ばれる、前記方法を提供する。
【0050】
また本発明は、アウタープライマーが記述されたプライマー領域の上流もしくは下流のヌクレオチド1,2,3もしくは4個まで選ばれる、前記方法を提供する。
【0051】
また本発明は、インナープライマーが記述されたプライマー領域の上流もしくは下流のヌクレオチド1,2,3もしくは4個まで選ばれる、前記方法を提供する。
【0052】
また本発明は、サンプルが遊離ビリオン粒子またはウイルス感染細胞を含有する、前記方法を提供する。
【0053】
特に、本発明は、また、サンプルが感染したヒト(もしくは動物)から直接か、または培養(例えば集積のための)後かいずれかに採取されるいずれかの生物学的材料である、前記方法を提供する。生物学的材料は、例えば、あらゆる種類の喀痰、気管支洗浄物、血液(血漿、血清)、皮膚組織、生検体、精子、精液、リンパ球血液培養材料、コロニー、液体培養物、糞サンプル、尿などであってもよい。
【0054】
本発明の1つの実施態様では、生物学的サンプルは、抗レトロウイルス薬物(antiretroviral)処方により治療されたか、または治療中のヒトもしくは動物から採取される。
【0055】
また本発明は、先に記述され(表1参照)、そしてHIV単離株のHIVpol遺伝子の配列を解析するために使用されるプライマーに関する。
【0056】
好ましくは、本発明によるそのような方法は、定義された第1のPCR生成物の配列決定を必要とする。
【0057】
1つの実施態様では、本発明は、同定される変異が抗レトロウイルス薬物に対する耐性を付与する、前記方法に関する。
【0058】
さらなる実施態様では、本発明は、同定される変異がプロテアーゼインヒビターに対する耐性を付与する、前記方法に関する。
【0059】
1つの実施態様では、本発明は、同定される変異が逆転写酵素インヒビターに対する耐性を付与する、前記方法に関する。
【0060】
1つの実施態様では、本発明は、同定される変異がインテグラーゼインヒビターに対する耐性を付与する、前記方法に関する。
【0061】
また本発明は、表1において示されるような少なくとも1種のプライマーを含む、HIV−1単離株のHIVpol遺伝子の変異解析のための診断キットに関する。以下に示す定義は、本発明において使用される用語および表現を具体的に説明するために役立つ。
【0062】
用語「薬物−誘発性変異」は、共通の野生型配列とは異なるすべての変異を意味し、より特別には、それは、単独または他の変異と組み合わせてそれぞれの薬物に対する単離株の低下した感受性を与える、HIVプロテアーゼもしくはRTコーディング領域における変異を指す。
【0063】
本発明において言及される用語「標的配列」は、本発明による配列解析によって特異的に検出されるHIV−1単離株のプロテアーゼおよびRT遺伝子の野生型、多形性または薬物誘導性変異配列のヌクレオチド配列を述べている。このヌクレオチド配列は1個もしくは数個のヌクレオチド変化を包含してもよい。標的配列は、単一のヌクレオチド位置、アミノ酸をコードしているヌクレオチドまたは前述のヌクレオチド位置のいずれかをまたぐ配列を指してもよい。本発明では、該配列は、しばしば1もしくは2個の変化しうるヌクレオチド位置を含む。本方法によって検出される配列の変更は、限定されるものではないが単一のヌクレオチド変異、置換、欠失、挿入、逆位、反復または場合によっては種々の場所に存在する多数の変異をカバーする変異を含む。配列変更は、さらに、例えばメチル化に限定されない後成的配列変異に関してもよい。配列解析はRNAおよびDNAを含むあらゆる種類の核酸において行うことができる。
【0064】
該標的配列の補体は、また、ある場合には適当な標的配列であると理解されるべきである。
【0065】
分析されるべきサンプルにおける標的材料は、DNAもしくはRNAであってもよく、例えばゲノムDNA、メッセンジャーRNA、ウイルスRNA、プロウイルス核酸またはそれらの増幅された改変体でもよい。また、これらの分子はポリ核酸とも呼ばれる。本発明による方法ではHIVサンプルからのDNAもしくはRNA分子を使用することが可能である。
【0066】
周知の抽出および精製操作がサンプルからのRNAもしくはDNAの単離のために利用される(例えば、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)において)。
【0067】
用語「プライマー」は、複製されるべき核酸に相補的であるプライマー伸長生成物の合成のための開始点として作用しうる一本鎖配列−特異的オリゴヌクレオチドを指す。プライマーの長さと配列は、それらが伸長生成物の合成を開始できるようでなければならない。
【0068】
好ましくは、プライマーは約5−50ヌクレオチド長である。特定の長さと配列が、求められるDNAもしくはRNA標的の複雑さ、ならびに温度やイオン強度のようなプライマー使用の条件に依存するであろう。
【0069】
当業者は、本発明のプライマーがそれらの相補鎖によって置換できることを周知している。
【0070】
増幅プライマーが適当な増幅を保証すべく対応する鋳型に正確に合致する必要はないという事実は文献において広く報告されている(Kwok et al.1990)。
【0071】
また、本発明のプライマーは、FASTAもしくはBLAST論理にしたがって配列番号:1〜24における配列に少なくとも80%の類似性、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の類似性を有するそれらのオリゴヌクレオチドを含有する(Altschul et al.,”Basic local alignment search tool J.Mol.Biol.1990,215,403−410,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast;Lipman et al.,”Rapid and sensitive protein similarity searches,Science 1985,227,1435−1441.http://www.edi.ac.uk)。
【0072】
DNA配列に対する「配列類似性」は、何か特定の配列に限定されるものではなく、置換、挿入、欠失により改変されたそのような配列、ならびにそのコードされているタンパク質の機能もしくは作用が実質的に同レベルである当業者に既知の相当するものと定義される。ここでは、「類似性」は、参照配列に関して類似する配列内の同一ヌクレオチドの割合(%)と定義される。類似性は、例えば%同一性として表わされてもよい観察できる量であり、この場合、同一性は同一ヌクレオチドを意味する。相同性はこれらのデータから引き出された結論を指す。
【0073】
オリゴヌクレオチドは、一般に、いずれかポリリボ核酸もしくはポリデオキシリボ核酸を指し、これらは未改変のRNAもしくはDNAか、または改変されたRNAもしくはDNAであってもよい。かくして、例えば、本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドは一本鎖DNAもしくは一本鎖RNAを指す。ここで使用されるように、用語オリゴヌクレオチドは、1個以上の改変された塩基を含有する上記DNAもしくはRNAを含む。かくして、安定性または他の理由で改変された骨格をもつDNAもしくはRNAは、用語が本明細書で意図しているような「オリゴヌクレオチド」である。さらにまた、一般的でない塩基、例えばイノシン、または改変された塩基、例えばトリチル化塩基を含有するDNAもしくはRNAは、まさに2つの例を名指すために、用語がここで使用されるようなオリゴヌクレオチドである。多様な改変が、当業者に既知の多くの有用な目的に役立つDNAおよびRNAに対してなされたことは理解できるであろう。本明細書で使用されるような用語オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのそのような化学的、酵素的もしくは代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび中でも単細胞と複合細胞を含む細胞のDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドとしてしばしば呼ばれる短いポリヌクレオチドを包含する。
【0074】
核酸を増幅するためには、報告されたいくつかの方法がある。これらの方法は、サイクリング技術、等温反応およびそれらの組み合わせを含む。使用される増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR;Saiki et al.1988)、リガーゼ連鎖反応(LCR;Landgren et al.1988;Wu and Wallace 1989;Barany 1991)、核酸配列に基づく増幅(NASBA;Guatelli et al.1990;Compton 1991)、転写に基づく増幅系(TAS;Kwoh et al.1989)、鎖置換増幅(SDA;Duck 1990;Walker et al.1992)、ローリングサークル増幅(Lizardi,1998,Zhang 1998,”Circular probe amplification using energy−transfer primers”provisional application field)またはQssレプリカーゼによる増幅(Lizardi et al.1988;Lomeli et al.1989)、または当該分野において既知の核酸分子を増幅するためのいずれか他の適当な方法のいずれでもよい。
【0075】
プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、また、ヌクレオチド同族体、例えばホスホチエート(Matsukura et al.1987)、アルキルホスホロチエート(Miller et al.1979)もしくはペプチド核酸(Nielsen et al.1991;Nielsen et al.1993)を含んでもよく、またはインターカレーティング剤(Asseline et al.1984)を含有してもよい。
【0076】
配列決定反応におけるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、また、標識を含有してもよい。これらの標識は、限定されるものではないが放射性ヌクレオチド、蛍光標識、ビオチン、化学発光標識を含む。
【0077】
本発明のオリゴヌクレオチドは、増幅されたフラグメントの捕捉を可能にする基、例えばビオチンによって標識されてもよい。これらの捕捉リガンドは、それらを含有するヌクレオチドもしくは増幅フラグメントの検出、またはそれらを含有するオリゴヌクレオチドもしくは増幅フラグメントの複雑な混合物からの回収の両方を可能にさせる。
【0078】
また、本発明において使用されるヌクレオチドは、例えばビオチン、蛍光標識もしくは放射性ヌクレオチドによって置換されてもよく、または非天然の塩基を含有してもよい。
【0079】
本発明のために使用されるオリゴヌクレオチドは、当該分野において既知の種々の配列決定技術、例えばジデオキシシーケンシング、サイクルシーケンシング、ミニシーケンシングおよびそれらのいずれかの変法のために使用できる。
【0080】
図および表
以下に示される図、表および実施例は本発明を例証する。
【0081】
図1:HIV−1単離株のプロテアーゼ−RTコーディング領域の全コーディング領域の図による概要。プロテアーゼ領域は黒いボックスによって、RTコーディング領域は陰影をつけたボックスによって示される。両コーディング領域のヌクレオチドの長さが指示される。それぞれの記述される配列決定プライマーを用いて配列決定される領域が示される。第1の配列および第2の配列が図により提示される。
【0082】
【表1】
【0083】
【表2】
【0084】
【表3】
【0085】
変異は本発明の方法により明らかにされた。数字は、プロテアーゼまたは逆転写酵素のいずれかにおける正確なアミノ酸位置に対応している。アミノ酸はそれらの1文字コードによって表される。このコードは当該分野では周知である(参照、Alberts et al.The Molecular Biology of the Cell,1994)。
【0086】
【表4】
【0087】
【表5】
【0088】
【表6】
【0089】
実施例
以下の実施例は、本発明を例証するためにあり、そして本発明の範囲を限定するものではない。
【0090】
発明の実施方式:
I.序論
標的核酸の増幅および配列決定のためのオリゴヌクレオチドおよびプライマーの選択は、アッセイの感度および特異性のために重要である。増幅される配列は、通常、複雑なマトリックス、例えば患者の血液サンプル中に微量でのみ存在する。したがって、プライマーは、標的核酸の効率的増幅と、続く配列決定を可能にするよう標的配列に対して十分に相補的でなければならない。プライマーが標的領域に適当にアニールしないと、増幅は重大な影響を受け、そして結果として誤った結果をもたらす。プライマー配列が、次の要件:GおよびC含量、プライマー間で二重らせんを形成しないこと、プライマー内でヘアピンを形成しないこと、選ばれたヌクレオチドのセットについて誤った開始部位がないこと、それ自体とハイブリダイズしないこと、に関して合致するかまたは最適化される場合は、プライマー依存性解析の信頼性は、さらに増強されることが分かった。要件はまた相補鎖に関係するという証拠がある。配列決定プライマーは標的配列に正確に合致する必要がないという証拠が報告されていた(Kwok et al.1990)。
【0091】
A.HIV−1プロテアーゼ−逆転写酵素コーディング領域の増幅
RNAはBoomら(1990)によって記述された方法にしたがって血漿100μlから単離され、そしてHIV−1特異的下流プライマー(OUT3、表1参照)を用いて、製造者によって記述されているようなGeneAmp逆転写酵素キット(Perkin Elmer)を用いて逆転写された。2回の連続する入れ子PCRは、特異的なアウタープライマー(PRTO−5およびOUT3)およびインナープライマー(PCR2.5およびPCR2.3)をそれぞれ用いて設定された(表1参照)。アウタープライマー反応は、WO97/27480およびHertogs et al.Antimicrob.Agents Chemotherap.1998に記述されるように実施された。インナー増幅は次のように96穴プレートにおいて行われた:アウター増幅生成物4μlは、15mMMgCl2含有の10XPCR5μl、dNTP(10mM)1μl、PCR2.5(0.25μg/ml)0.5μl、PCR2.3(0.25μg/ml)0.5μl、Expand High Fidelity(3.5U/μl)0.4μlおよびMQ水からなる10X増幅混合液を用いて最終容量50μlに希釈された。増幅は、アウタープライマーを用いて作成された増幅生成物の短時間の変性(94℃で2分)後に開始された。それぞれ94℃で15秒の変性段階、60℃で30秒のアニーリング段階および72℃で2分のポリメラーゼ段階からなる10回の増幅サイクルが開始された。この増幅は、その後直ちに、それぞれ94℃で15秒の変性段階、60℃で30秒のアニーリング段階および72℃でx分のポリメラーゼ段階からなる25サイクルへと続いた;この場合、xは2分5秒で開始し、各サイクルを5秒づつ増加した。増幅はさらなるポリメラーゼ段階(72℃で7分)によって終結された。続いて、反応物は、さらなる解析まで4℃で保たれるか、または−20℃(短期間)もしくは−70℃(より長期間)で保存された。増幅生成物を解析するために、DNAアガロースゲルが実施され、そして増幅生成物がUV検出を用いて可視化された。得られたPCR生成物は、製造者による記述のようにQIAquick94穴プレートシステム(Qiagen)を用いて精製された。
【0092】
B.polコーディング領域の配列決定
増幅されたフラグメントに存在するpol遺伝子のコーディング領域は、標準の配列決定技術を用いる配列決定をへて解析された。好ましくは、HIV−プロテアーゼおよび逆転写酵素タンパク質のコーディング領域をカバーするいる6種のプライマー(Seq1ROR、Seq2FOR、Seq3F、Seq1B、Seq3BおよびSeq6R)のセットにより最初に出発した。配列およびコーディング領域上の位置は、それぞれ表1および図1に示される。配列決定は、各保存物がカラムにピペットで滴下される96穴プレート上にプライマー保存物(4.0μM)4μlを先ず分配することによって開始された。第2段階では、MQ14μl、希釈バッファー17.5μl、サンプル(PCRフラグメント)7μlおよびBig Dye Terminater Mix14μlからなるマスター混合液が作成された。特異的なPCRフラグメントを含有する各マスター混合液のフラクション(7.5μl)が、各サンプルフラクションが異なるPCRプライマーセットと混合されるように、96穴プレート中の特定の場所に移された。サンプルは列を横断してピペットで注入された。サンプルはサーマルサイクラー中に置かれ、そして配列決定サイクルが開始した。配列決定反応は、それぞれ96℃で10秒、50℃で5秒および60℃で4分の25回反復サイクルからなった。最後に、配列反応物は、さらなる解析まで4℃で保たれるか、または前記のように保存された。配列決定反応物は標準のエタノール沈殿操作を用いて沈殿され、ホルムアミド2μlに再懸濁され、そしてサーマルサイクラーにおいて92℃2分間加熱された。サンプルは負荷されるまで氷上で冷却された。各反応物1μlが377シーケンサーシステムにおける4.25%の垂直なアクリルアミドゲルに負荷され、そしてゲルはフラグメントの分離が完了するまで泳動された。
【0093】
C.polコーディング領域の配列解析
サンプル配列は、特別プロジェクトとしてSequencher(Genecodes)の配列マネジャーに導入され、そして野生型HXB2 Pro/RT参照配列(例えばHIVHXB2配列、Genbank配列受託番号327742)と比較された。配列は自動的に集合され、そして85%最小一致に設定された。第2のピークが検索され、そして最小が60%に設定された。参照配列の5’末端もしくは3’末端に付いていたすべての配列は除去された。同じ鎖からの配列間の重複領域が達せられた時点で、もっとも低質の配列が重複部5−10塩基を残して除去された。不明瞭な塩基コール(call)は正確な塩基コールに十分一致しないと見なされる。配列の集合は、編纂できるコンティグ(contig)内に保存された。
【0094】
得られた配列は、塩基コールが容易に解釈できるように編纂された。不明瞭な配列が回収され、そして可能性あるエラーまたは異質の点についてチェックされた。不明瞭な点が正しいと考えられた(配列の両鎖は一致するが参照配列と異なる)場合、それは変異体であると解釈された。参照配列は、コンティグおよび全サイズに対するガイドを構築するため、そして切除(trimming)するために使用されたが、塩基コールを決定するためには使用されなかった。両鎖が一致した場合のみ変化とされた。すべてのギャップは、それらが両配列鎖のデータ形式に基づいて3の複数の近接グループ中に起きていないならば(I.E.完全コドンの挿入もしくは欠失)、削除されるかまたは満たされた。編纂が完了した時点で、新しいコンティグ配列は共通配列として保存され、そしてさらなる解析のために使用された。
【0095】
詳細な配列編纂は、ある法則にしたがって実施された:A)ABIプライマー・ブロブ(blob)は1つの連続する塩基がスケール外に残っている5’末端において切除される;最初の25塩基が1つの不明瞭部(ambiguity)未満を含有するまで、配列は25%未満に切除される;5’末端からの少なくとも最初の10塩基が除去される、B)3’末端は、5’切除部後に始まる300塩基を切除される;2つの不明瞭部以上を含有する最初の25塩基は除去される;最後の25塩基が1つの不明瞭部未満を含有するまで3’末端から切除される。切除後に得られた配列フラグメントの最大長は550塩基である。
【0096】
整列に失敗した配列は集合から除かれ、そして新しい配列解析から保存されたデータによって置換された。さらなる失敗が起きた場合は、PCR反応が繰り返された。クロマトグラムはIBMソフトウェアシステムを用いて可視化された(表3および4)。
【0097】
D.クローン臨床サンプルの検出−異質の(heterozygous)塩基コールについての検出限界
クローン臨床サンプルは、システムの検出限界を決定するために既知の比率で野生型HXB2と混合された。検出限界は、血漿から約1000RNAコピー/mlであることが見い出された;混合した変異集団は、20%以下で存在する場合に検出できるであろう。
【0098】
本明細書において引用される参考文献が以下に列挙される:
【0099】
【表7】
【0100】
【表8】
【0101】
【表9】
【0102】
【表10】
Claims (23)
- a)サンプルの単離、
b)単離されたサンプル材料のビリオンRNAの抽出、
c)第1のPCR生成物を得るための、配列番号:1および2において表されるアウタープライマーを用いる入れ子PCRによるRNAの増幅、
d)配列番号:3、4、5および6において表されるインナープライマーから選ばれる5’および3’プライマーを用いる入れ子PCRによる該第1のPCR生成物の増幅、および
e)配列番号:7〜12のいずれかから選ばれる少なくとも1個の配列決定プライマーを用いる、この第2の得られたPCR生成物の配列決定:
の段階を含む、HIV−1単離株のpol遺伝子の変異解析の方法。 - a)サンプルの単離、
b)単離された材料のウイルスDNAの抽出、
c)第1のPCR生成物を得るための、配列番号:1および2において表されるアウタープライマーを用いる入れ子PCRによるDNAの増幅、
d)配列番号:3、4、5および6において表されるインナープライマーから選ばれる5’および3’プライマーを用いる入れ子PCRによる該第1のPCR生成物の増幅、および
e)配列番号:7〜12のいずれかから選ばれる少なくとも1個の配列決定プライマーを用いるこの第2の得られたPCR生成物の配列決定:
の段階を含む、HIV−1単離株のpol遺伝子の変異解析の方法。 - 最初の配列決定プライマーの1種が1種もしくは1対の置換プライマーによって置換されている、請求項1もしくは2記載の方法。
- 配列決定プライマーが記載されたプライマー領域の上流もしくは下流のヌクレオチド1,2,3もしくは4個まで選ばれる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- アウタープライマーが記載されたプライマー領域の上流もしくは下流のヌクレオチド1,2,3もしくは4個まで選ばれる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- インナープライマーが記載されたプライマー領域の上流もしくは下流のヌクレオチド1,2,3もしくは4個まで選ばれる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- サンプルが遊離ビリオン粒子またはウイルス感染細胞を含有する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- HIV−1単離株のHIVpol遺伝子の配列を解析するために使用される配列番号:1および5〜12において表されるプライマー。
- HIV−1単離株のHIVpol遺伝子配列の配列を解析するための配列番号:13〜24において表されるプライマー。
- 相補鎖を含む請求項8もしくは9記載のプライマー。
- 配列番号:1〜24で表される配列に少なくとも80%の配列類似性を有する、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド。
- 配列番号:1〜24で表される配列に少なくとも90%の配列類似性を有する、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド。
- 配列番号:1〜24で表される配列に少なくとも95%の配列類似性を有する、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド。
- 請求項1もしくは2の方法における使用のための請求項9記載のプライマー。
- 少なくとも8個の連続するヌクレオチドが配列番号:1〜24において存在している該少なくとも8個の連続するヌクレオチドを含有する、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド。
- 該配列が配列番号:5〜24において存在している、請求項10記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列決定が第1のPCR生成物において実施される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 同定される変異が抗レトロウイルス薬物に対する耐性を付与する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 同定される変異がプロテアーゼインヒビターに対する耐性を付与する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 同定される変異が逆転写酵素インヒビターに対する耐性を付与する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 同定される変異がインテグラーゼインヒビターに対する耐性を付与する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 配列番号:1〜12において表される配列を有する少なくとも1種のプライマーを含む、HIV−1単離株のHIVpol遺伝子の変異解析のための診断キット。
- 配列番号:13〜24から選ばれる少なくとも1種のプライマーを含む、HIV単離株のHIVpol遺伝子の変異解析のための診断キット。
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