JP2004500335A - エプスタイン−バーウイルスの防御抗原 - Google Patents
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Abstract
本発明は、エプスタイン−バーウイルスの感染を予防または処置するためのサブユニットワクチンの同定に関する。特に、EBNA−1を、ワクチン抗原として同定した。特定の実施形態では、EBNA−1に対応する精製タンパク質が、強力なCD4+T細胞応答を誘発した。応答性CD4+T細胞は、機能において主にTH1である。特にEBNA−1を負荷した樹状細胞で、EBNA−1は、EBVに対する防御ワクチンのため、およびEBVの感染および新生物の免疫療法のための魅力的な候補である。
Description
【0001】
本研究は、国立衛生研究所助成金番号KI2−HD00850、ならびにNIAID助成金番号AI40045およびAI40874によって一部支援された。従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、エプスタイン−バーウイルス感染を予防または処置するためのワクチンの同定に関する。特に、EBNA−1抗原を、ワクチン抗原として同定した。EBNA−1への暴露が、ヒトおよび動物におけるその免疫防御効果について開発され得る。
【0003】
(発明の背景)
EBVは、Bリンパ球に対する親和性(tropism)を有する、ヒトγヘルペスウイルスである(KieffおよびLiebowitz,Virology,Fields,B.N.,Knipe,D.M.ら編,1889−1919頁,Raven Press,Ltd.:New York,1990)。成体集団のうちの95%より多くが、一生無症候性の感染としてEBVを保有する。しかし、EBVは、強力な増殖トランスフォーミング能力を有し(Klein,Cell,77:791−3,1994)、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、T細胞リンパ腫、胃癌、および子宮平滑筋肉腫を含む、一定範囲のEBV関連悪性疾患において、B細胞そしておそらく他の細胞型をトランスフォームする。
【0004】
3つの特定のEBV遺伝子が、腫瘍形成のために重要であり、そして細胞増殖ならびにアポトーシスに対する耐性を誘導する(Gregoryら,Nature,349:612−4,1991)。EBNA−1は、ダイマーとして、ウイルス複製起点と宿主細胞DNAとを連結し、そしてB細胞増殖の間のエピソーム性の複製を保証する(Bochkarevら,Cell,84:791−800;Shahら,J.Virol.,66:3355−62,1992)。この2つの潜伏性膜タンパク質(LMP)は、異なる役割を有する。LMP1のC末端部分は、CD40媒介性B細胞活性化を模擬することによって、直接的なオンコジーンとして作用し得る(Wangら,Cell,43:831−40,1985)(BuschおよびBishop、J.Immunol.162:2555−2561、1999)。従って、LMP1は、腫瘍壊死因子レセプターファミリーについてのシグナル伝達タンパク質に関与し(Mosialosら,Cell,80:389−99,1995)、そしてbcl−2の誘導によるアポトーシスに対して防御する(Hendersonら,Cell,65:1107−15,1991)。LMP2は、sykおよびlyn、タンパク質チロシンキナーゼを構成的に保証(engage)することによって、B細胞レセプターシグナル伝達を模擬する(Caldwellら,Immunity,9:405−11,1998)。これらの3つのタンパク質は、大半のEBV誘導性腫瘍において発現される排他的なEBV遺伝子であるようである(Millerら,Virology,Fields,B.N.,Knipe,D.M.ら編,1921−1958頁,Raven Press,Ltd.:New York,1990)。バーキットリンパ腫では、EBNA−1のみがEBVの永続性に必要とされる。なぜなら、トランスフォーメーションが、染色体転座を通したc−mycの開放を含むさらなる機構によって達成されるからである(Klein、前出)。
【0005】
大半のEBVキャリアがトランスフォーメーションを回避する理由は、未だ解明されていない。経験的にEBNA−1に対する免疫は、トランスフォーム細胞に対する耐性を提供し得るが、EBVの永続性のためのこの必須のタンパク質に対する特異的T細胞応答を検出することは困難であることが証明されている。実際、EBNA−1は、MHCクラスI提示のためのその自己のプロセシングをブロックする(Blakeら,Immunity,7:791−802,1997)。これは、N末端GA反復ドメインによって引き起こされる、そのプロテアソームのプロセシングにおける欠損に起因していた(Levitskayaら,Nature,375:68508,1995)。同様のGAストレッチは、プロテアソームによるIκBα分解を妨げる(Sharipoら,Nat Med.,4:939−44,1998)。他のEBV潜伏遺伝子産物は、強力なMHCクラスI拘束CTL応答、特にEBNA3A、3Bおよび3Cに集中する(Stevenら,J.Exp.Med.,184:1801−13,1996)。しかし、EBNA3タンパク質は、上記で言及したEBV関連腫瘍の大半において発現されず、そして代わりに、培養されたトランスフォーム株(B−LCL)および免疫抑制された患者における免疫細胞増殖性症候群(lymphoproliferative syndrome)において発現される。腫瘍関連LMP1タンパク質(Khannaら,Eur.J.Immunol.,28:451−8,1998)およびLMP2タンパク質(Leeら,Eur.J.Immunol.,26:1875−83,1996)に対するCD8+CTL応答が検出されたが、時折のみであった。
【0006】
有効なCD8+CTLの発達および持続は、CD4+T細胞の補助に依存することが明らかとなりつつある(KalamsおよびWalker,J.Exp.Med.,188:2199−204,1998)。CD4+T細胞によるEBV産物の認識は、CD8+応答と同じように詳細には研究されていなかった(RickinsonおよびMoss,Ann.Rev.Immunol.,15:405−31,1997)。樹状細胞(DC)は、CD4+およびCD8+T細胞免疫に対する強力な抗原提示細胞である(BanchereauおよびSteinman,Nature,392:245−52,1998)。
【0007】
従って、エプスタイン−バーウイルスにおける防御抗原を同定する試みは、結論に達しておらず、そして感染からの完全な防御を提供するために、単一の抗原が必要とされるのか、または、複数の抗原が必要とされるのかは、未だ知られていない。さらに、EBNA−1は、このウイルスに対する防御免疫を誘発するとは考えられない。
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、EBV由来の免疫防御抗原を有利に同定し、これは、ヒトにおけるEBV感染を予防または処置するためのワクチンおよび免疫療法アプローチにおいて使用され得る。
【0009】
1つの実施形態では、本発明は、免疫原性EBNA−1ポリペプチドおよびヒトにおける使用に受容可能なアジュバントを含むワクチンを提供する。この免疫原性EBNA−1ポリペプチドは、EBNA−1と異種アミノ酸配列との融合タンパク質であり得る。
【0010】
別の実施形態では、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された、免疫原性EBNA−1ポリペプチドをコードする配列を含む、ヒトにおける発現のための発現ベクターを提供する。本発明の好ましいベクターは、好ましくは、樹状細胞を標的化する。本発明は、詳細には、ウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘、AV−ポックス、および改変ワクシニアAnkara(MVA)ウイルスを意図する。
【0011】
また、エプスタイン−バーウイルスによる感染から被験体を防御するための方法を提供する。1つのこのような方法は、免疫学的に有効な量の免疫原性EBNA−1ポリペプチドを被験体に送達する工程を包含する。別のこのような方法は、免疫学的に防御する量の本発明の発現ベクターを被験体に送達する工程を包含する。好ましくは、このような発現ベクターは、インビボで樹状細胞を標的化する。これらの方法は、EBV関連新生物(例えば、上咽頭癌(しかし、これに限定されない))を予防または処置するために有用である。
【0012】
本発明をさらに、以下の詳細な説明の節および実施例の節において説明および例示する。
【0013】
(発明の詳細な説明)
本発明は、エプスタイン−バーウイルス(EBV)の防御抗原に関する予想外の発見に一部基づく。大半のEBVセロポジティブ成体において、強力なCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答が示された(Murrayら,J.Exp.Med.,1992,176:157−168)。しかし、これらは、核抗原、EBNA3A、3B、および3Cに対して優先的に指向され(Kieff,E.,Epstein−Barr Virus and Its Replication.In Fields Virology.B.N.Fields,D.M.Knipe,およびP.M.Howley編.1996,Lippincott−Raven Publishers,Philadelphia.2343−2396;Khannaら J.Exp.Med.,1992,176:169−176)、これらは、多くのEBV関連悪性疾患では発現されない。EBVトランスフォーム細胞は、発現されたEBV抗原のパネルによって互いから識別可能な3つの潜伏表現型のうちの1つを示す(Murrayら,1992,前出)。潜伏I(例えば、バーキットリンパ腫)では、EBNA−1のみが発現される。潜伏II(ホジキンリンパ腫によって例示される)では、LMP1およびLMP2、ならびにEBNA−1が発現される。潜伏IIIの免疫芽球性リンパ腫においてのみ、高度に免疫原性なEBNA3遺伝子が発現される。従って、多くのEBV関連悪性疾患は、EBV潜伏遺伝子産物に対するヒトCD8+T細胞応答に対する良好な標的を提供しないようである。
【0014】
本発明における証拠は、予想外に、エプスタイン−バーウイルス(EBV)がコードする核抗原(EBNA−1)がEBVワクチン、特に抗腫瘍ワクチンを開発するための有効な抗原であることを示唆する。EBNA−1免疫は、ウイルス複製を顕著に減少させる。なぜなら、この抗原は、EBVトランスフォームされたヒトB細胞を複製するにおいてEBVエピソームの維持のために重要であるからである(Yates,et al.,Nature,313:812−5,1985)。従って、すべてのEBV誘導された腫瘍は、この外来抗原を発現する。しかし、EBNA−1タンパク質は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)に対しては不可視である。gly−ala反復ドメインは、プロテアソーム依存性プロセシングを防ぎ、従って、MHCクラスIにおける提示を防ぐ(Levitskaya,et al.,前出)。今や、ほとんどの個体からのCD4+T細胞がEBNA−1に応答することが見出された。実際、CD4+細胞を刺激するEBV潜在抗原のうち、EBNA−1が優先的に認識される。認識は、樹状細胞(DC)のMHCクラスII分子におけるEBNA−1の内因的および外因的プロセシングを介して生じ得る。CD4+の応答としては、トランスフォームされたBリンパ球細胞株(B−LCL)の直接の細胞溶解が包含される。従って、この免疫系は、EBV維持のために重要であるEBNA−1タンパク質を認識し得る。
【0015】
この型のCD4+T細胞もまたこの応答に影響を与える(以下に概説される:O’Garra,and Murphy,Curr.Opin.Immunol.,1994,6:458−66.20)。TH1 CD4+細胞は、IFNγを分泌し、そして細胞性免疫の発達を支援する。これには、マクロファージの活性化が含まれる。TH2 CD4+細胞は、IL−4およびIL−5を分泌し、それにより、好酸球および抗体産生を刺激する。TH1細胞における特定のケモカインレセプターの発現は、TH1細胞の炎症の正常部位への移動を生じる。TH2細胞は、アレルギー性の応答により密接に関連する部位に移動する。CD4+T細胞はまた、標的を殺傷し得(以下に概説される:Hahn,et al.,Immunol Rev.,1995.,146:57−79)、これは主に、Fas−FasL相互作用を介する。細胞傷害性は、TH1 CD4+細胞とともに見い出されている(Erb,et al.,Cell Immunol.,1991,135:232−44; Erb,et al.,J.Immunol.,1990,144:790−795; Del Prete,et al.,J.Exp.Med.,1991,174:809−13; Nishimura,et al.,J.Exp.Med.,1999,190:617−628.)が、限定された数の細胞傷害性TH2 CD4+クローンが報告されている(Lancki,et al.,J.Immunol.,1991,146:3242−9)。
【0016】
血液から直接単離された細胞におけるEBNA−1特異的CD4+T細胞応答は主にTH1応答であるということが証拠により示唆されている。さらに、EBNA−1抗体応答のアイソタイプは、IgG1サブクラスについて非対称性であり、これは、インビボでのTH1局在化を反映する。この結果は、ウイルスおよび腫瘍に対する抵抗性についてTH1細胞が重要であり、従って長期免疫にとって鍵であるという新たな証拠に基づくEBNA−1に対する治療ワクチンについての重要な含意を有する。
【0017】
EBNA−1とEBVとの免疫療法により、安全性および有効性に顕著な利点が提供される。サブユニットワクチンは、最大程度の安全性を確実にする。なぜなら、病原体による感染の機会がないからである。これは、殺傷されたかまたは弱毒化されたウイルスで免役するときに何らかの問題が常にある。さらに、単一の成分は、ウイルスワクチン全体における無関連の抗原から生じ得る、有害な副作用(例えば、アナフィラキシーまたは抗原交叉反応)を最小限にする。EBNA−1が充填された樹状細胞には、実質的に治療上の可能性がある。さらに、EBNA−1は、EBN感染および腫瘍原性に関与することから、EBNA−1は、最も防御的な免疫応答を惹起して、EBV感染および関連する疾患もしくは障害を予防または処置する。別の代替のワクチンアプローチは、EBNA−1タンパク質におけるDR特異的ペプチドを規定することである。これらのペプチドを用いて樹状細胞を適用刺激すること、次いで被験体をその適用刺激された樹状細胞に感染させることにより、そのワクチン戦略の防御的効果が確立される。
【0018】
用語「ワクチン」とは、レシピエントにおける防御的免疫を惹起するために使用され得る組成物(タンパク質またはベクター;後者はまた、おおまかに「DNAワクチン」と呼ばれ得るが、RNAベクターもまた使用され得る)をいう。有効であるためには、本発明のワクチンは、その集団の一部における免疫を惹起し得ることに留意すべきである。なぜなら、いくつかの個体は、強力なまたは防御的な免疫応答を惹起しないかもしれず、あるいは、いくつかの場合では、まったく免疫応答を惹起しないかもしれないからである。この惹起できないことは、個体の遺伝的背景に起因し得るか、または免疫不全状態(後天性または先天性のいずれか)もしくは免疫抑制(例えば、臓器拒絶を予防するかもしくは自己免疫状態を抑制ための免疫抑制薬物での処置)に起因し得る。効力は、動物モデルにおいて決定され得る。
【0019】
用語「免疫療法(治療)」とは、病原特異的免疫応答の活性化に基づく、処置レジメンをいう。ワクチンは、免疫療法の1つの形態であり得る。樹状細胞にEBNA−1抗原を、好ましくは、刺激性サイトカイン(例えば、GM−CSFもしくはFlt3リガンド)とともに、エキソビボ(続いて被験体への移植)またはインビボで充填することもまた、免疫療法の形態である。
【0020】
本明細書において用いられる用語「防御(する)」とは、被験体におけるEBNV感染を、予防もしくは処置、または適切な場合その療法を行うことを意味する。従って、そのワクチンの予防的投与は、EBV感染からレシピエント被験体を防御し得る(例えば、感染性単核球症またはリンパ増殖性疾患を予防し得る)。そのワクチンまたは免疫療法の治療上の投与は、EBV感染が媒介する病因からそのレシピエントを防御して、例えば、EBV関連新生物のような疾患または障害を処置し得る。EBV関連としては、以下が挙げられる:ホジキンリンパ腫、流行性バーキットリンパ腫、上咽頭癌、T細胞リンパ腫、胃癌、および子宮平滑筋肉腫。
【0021】
本明細書において用いられる用語「被験体(被検体)」は、EBVを支持する動物をいう。特に、この用語は、ヒトをいう。
【0022】
本明細書において用いられる用語「ヒトにおける発現のためのベクター」は、そのベクターがヒト細胞において有効であるプロモーターを少なくとも含むこと、そして好ましくはそのベクターがヒトにおいて安全かつ有効であることを意味する。そのようなベクターは、例えば、免疫を発達することには関与しない外因性遺伝子を排除する。それがウイルスベクターである場合、そのベクターは、強力な感染の複製および発達を許容する領域を除外し、そしてインビボでの複製能の発達を回避するように操作される。そのようなベクターは、好ましくは、ヒトにおける使用に関して好ましくは安全であり;より好ましい実施形態において、そのベクターは、政府の規制機関(例えば、ヒトにおける臨床試験または使用については食品医薬品局(FDA))によって承認されている。特定のベクターを、以下により詳細に記載する。
【0023】
「アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を惹起する分子または組成物である。アジュバントは、それが以下に規定するように薬学的に受容可能である場合、「ヒトにおける使用に受容可能」である。アジュバントの例は、以下に提供される。
【0024】
(エプスタインバーウイルスの免疫防御抗原)
本発明は、EBV感染を予防もしくは処置するために、エプスタインバーウイルスの免疫防御抗原、防御性または治療性のタンパク質もしくはDNAワクチン、およびEBNA−1が充填された樹状細胞を用いた免疫療法を提供する。免疫防御抗原は、免疫原性EBNA−1ポリペプチドである。以下により詳細に考察するように、EBNA−1ポリペプチドは、EBNA−1タンパク質、アミノ酸配列を含む融合タンパク質、または免疫防御エピトープを含むEBNA−1のフラグメントであり得る。
【0025】
用語「免疫原性EBNA−1ポリペプチド」とは、EBNA−1タンパク質、またはその一部であって、免疫原性であり、かつ、動物に投与されるときに防御的免疫応答を惹起するものをいう。従って、EBNA−1免疫防御抗原は、タンパク質全体である必要はない。防御免疫応答は、概して、CD4+T細胞レベルでの細胞免疫を包含する。
【0026】
その免疫原性ポリペプチドは、上咽頭癌および感染した個体において見出されるような、エプスタインバーウイルスの任意の株由来の、免疫防御EBNA−1抗原、またはEBNA−1の配列改変体を含み得る(Chen et al.,J.Gen.Virol.,80:447,1999; Gutierrez et al.,J.Gen.Virol.,78:1663,1997)。
【0027】
本明細書において用いられる用語「免疫原性」とは、そのポリペプチドが体液性または細胞性、好ましくはその両方の免疫応答を惹起し得ることを意味する。免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性である。分子は、それが免疫グロブリン(抗体)またはT細胞抗原レセプターのような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用し得る場合に「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約5つの、そして好ましくは少なくとも10の、アミノ酸のエピトープを含む。あるポリペプチドの抗原性部分(本明細書においてまたエピトープとも呼ばれる)は、抗体またはT細胞レセプターの認識のために免疫優勢である部分であり得るか、またはそれは、免疫のためのキャリアポリペプチドとその抗原性部分とを結合体化することによってその分子に対する抗体を作製するために使用される部分であり得る。抗原性である分子は、それ自身が免疫原性である(すなわち、キャリアなしに免疫応答を惹起し得る)必要はない。
【0028】
本明細書において使用される用語「キャリアポリペプチド」とは、そのポリペプチドの免疫原性を増強するために免疫原性EBNA−1と結合体化または結合され得る、タンパク質またはその免疫原性フラグメントをいう。キャリアタンパク質の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:スカシガイヘモシアニン(KLY)、アルブミン、コレラ毒素(以下により詳細に考察する)、熱不安定性腸毒素(LT)など。EBNA−1の免疫防御エピトープを含むペプチドとキャリアポリペプチドとの化学架橋を使用して、免疫原性ポリペプチドを調製し得、好ましくはこの2つの成分は、融合ポリペプチドとして発現するためのキメラ構築物として調製される。
【0029】
さらに、免疫原性ポリペプチドと精製ハンドル(例えば、FLAGまたはGST(免疫精製のため)、またはHISタグ(Niキレート精製のため)のキメラ融合ポリペプチドが企図される。
【0030】
全長組換えEBNA−1が免疫原性ポリペプチドとして使用される場合、好ましくは、それは、ウイルス成分(例えば、殺傷または弱毒化されたウイルス全体を含むワクチンとの差別化という意味で)を含まない。EBNA−1ポリペプチドは、組換え発現後に精製され得るか、またはそれは、インサイチュでの発現により送達され得る(すなわち、ベクター(DNAワクチン)からの発現による)。
【0031】
さらに、本発明は、EBNA−1の、種々の変異体、配列保存改変体、および機能保存改変体の使用を、すべてのそのような改変体が要求される免疫防御成功かを保持する限り許容する。
【0032】
用語「変異体」および「変異」は、遺伝的材料における任意の検出可能な変化(例えば、DNAまたは任意のプロセス、機構、あるいはそのような変化の結果)を意味する。これは、遺伝子の構造(例えば、DNA配列)が変化した遺伝子変異、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはDNA,および改変された遺伝子もしくはDNA配列によって発現される任意の発現産物(例えば、タンパク質)を包含する。用語「改変体」もまた、改変または変化した遺伝子、DNA配列、酵素、細胞など(すなわち、任意の種類の変異体)を意味するために使用され得る。
【0033】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存改変体」とは、所定のコドン位置における1つ以上のヌクレオチドの変化がその位置においてコードされるアミノ酸においてなんら変化を生じない改変体である。対立遺伝子変異体は、配列保存改変体であり得る。
【0034】
「機能保存改変体」とは、タンパク質または酵素における所定のアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全体のコンフォメーションおよび機能を変更することなく改変された改変体をいう。ここで、そのような変化としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:あるアミノ酸を類似の特性(例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など)に置換すること。いくつかの対立遺伝子変異体は、アミノ酸置換は、タンパク質機能に劇的な影響を与えないような機能保存改変体を生じる。同様に、相同なタンパク質は、機能保存改変体であり得る。類似の特性を有するアミノ酸は、当該分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは、親水性塩基性アミノ酸であり、そして互換性であり得る同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置換され得る。そのような変化は、そのタンパク質またはポリペプチドの見かけ上の分子量または等電点に対して効果をほとんどまたはまったく有しないと予測される。保存的であると指摘されるもの以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、その結果、類似の機能の任意の2つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性%は、変動し得、そして例えば、Cluster Methodなどによるアラインメントスキームに従って決定されるように70%〜99%であり得る。Cluster Methodでは、類似性はMEGALIGNアルゴリズムに基づく。「機能保存改変体」はまた、BLASTまたはFASTAアルゴリズムによって決定されるように少なくとも60%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも75%、もっとも好ましくは少なくとも85%、そしてさらにより好ましくは少なくとも90%を有し、そしてそれが比較されるネイティブもしくは元のタンパク質または酵素と同じまたは実質的に類似する特性もしくは機能を有する、ポリペプチドまたは酵素を包含する。
【0035】
本明細書において使用される用語「相同(だ)」は、そのすべての文法的形態およびスペリングの改変において、「共通の進化的起源」を有するタンパク質間の関係をいう。これには、以下が含まれる:スーパーファミリー(例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー)および異なる種由来の相同タンパク質(例えば、ミオシン軽鎖など)(Reeck,et al.,Cell 50:667,1987)。そのようなタンパク質(およびそれをコードする遺伝子)は、その配列類似性に反映されるように、%類似性に関してであれ、特定の残基またはモチーフの存在に関してであれ、配列相同性を有する。
【0036】
従って、用語「配列類似性」とは、そのすべての文法的形態において、共通の進化的起源(Reeck Reeck,et al.、前出)を共有してもよく、しなくてもよいタンパク質の、核酸またはアミノ酸の配列の間の同一性もしくは対応の程度をいう。しかし、一般的な使用においておよび本願においては、用語「相同性」は、「高度に」のような副詞によって修飾される場合、配列類似性をいい得、そして共通の進化的起源に関連してもしなくてもよい。
【0037】
特定の実施形態において、2つのDNA配列は、配列比較アルゴリズム(例えば、BLAST、FASTA、DNAStriderなど)によって決定されるときに、他の配列からその配列を識別するために、そのDNA配列の規定された長さに亘って十分な数のヌクレオチドが適合する場合、「実質的に相同性」または「実質的に類似する」。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによるか、または例えば、その特定の系について規定されるようなストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーションにおいて同定され得る。
【0038】
同様に、特定の実施形態において、2つのアミノ酸配列は、他の配列からその配列を識別するために、そのアミノ酸の十分量が、規定された長さにわたって同一または類似(機能的に同一)する場合、「実質的に相同」または「実質的に類似する」。好ましくは、類似するまたは相同の配列は、例えば、以下を使用するアラインメントによって同定される:GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)パイルアッププログラム、または上記の任意のプログラム(BLAST、FASTAなど)。
【0039】
さらに、使用する発現系に依存して、発現されたタンパク質は、コード配列によってコードされる推定アミノ酸配列とは異なり得ることに留意すべきである。例えば、免疫原性ポリペプチドの発現のための構築物は、細胞プロセシングの間に切断されてもよくされなくてもよい、シグナル配列を含むタンパク質を発現し得る。さらに、他のタンパク質分解切断が発現の間に生じ得る。そのポリペプチドが真核生物細胞において発現される場合、そのポリペプチドがグリコシル化部位を含む場合そのポリペプチドはグリコシル化され得る。他の可能な変化は、Nメチル化などを包含する。
【0040】
本明細書において使用される用語「単離される(た)」は、その参照される材料がそのネイティブな環境(例えば、細胞)から取り出されることを意味する。従って、単離された生物学的材料は、いくつかまたはすべての細胞成分(すなわち、そのネイティブな材料が天然に生じる細胞の成分(例えば、細胞質または膜成分))を含まなくあり得る。材料は、それが細胞抽出物中に存在する場合か、あるいはそれが異種細胞または細胞抽出物中に存在する場合、単離されたとみなされる。核酸分子の場合において、単離された核酸としては以下が挙げられる」PCR産物、単離されたmRNA,cDNAまたは制限フラグメント別の実施形態において、単離された核酸は、好ましくは、それが見出され得る染色体から切り出され、そしてより好ましくは、非コード領域にもはや結合しなくあり得、近位にもなくあり得(しかし、そのネイティブの制御領域またはその一部には結合され得る)、その染色体において見出される場合に単離される核酸分子に含まれる遺伝子の上流または下流に位置する他の遺伝子にも結合しなくあり得る。なお別の実施形態において、単離された核酸は、1つ以上のイントロンを欠如する。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列(すなわち、それがキメラ組換え核酸構築物の部分を形成する場合)を含む。従って、特定の実施形態において、組換え核酸は、単離された核酸である。単離されたタンパク質には、そのタンパク質が細胞において随伴する、他のタンパク質または核酸あるいはその両方が、あるいはそれが膜結合型タンパク質意であるときは細胞膜が付随し得る。単離されたオルガネラ、細胞、または組織は、それが生物において見出される、解剖学的部位から取り出される。単離された材料は、精製されてもよいが、必ずしも必要ではない。
【0041】
本明細書において使用される用語「精製される(た)」とは、無関連の材料(すなわち、夾雑物)の存在を減少または除去する条件下で単離された材料をいう。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは、そのタンパク質と細胞中で一緒に存在する他のタンパク質も他の核酸も実質的に含まない。精製された核酸分子は、好ましくは、それとともに細胞中に見出され得るタンパク質も他の無関連の核酸分子も実質的に含まない。本明細書において使用される用語「実質的に含まない」とは、その材料の分析試験の文脈において、機能的に使用される。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製された材料は、少なくとも50%純粋であり;より好ましくは少なくとも90%純粋であり、そしてより好ましくはなお少なくとも99%純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当該分野において公知の他の方法によって評価され得る。
【0042】
精製のための方法は、当該分野において周知である。例えば、核酸は、以下によって精製され得る:沈降、クロマトグラフィー(限外調製固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および三重鎖螺旋クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない)、超遠心分離など。ポリペプチドおよびタンパク質は、種々の方法によって精製され得、これには、以下が含まれるがそれらに限定されない:調製用ディスクゲル電気泳動および等電点電気泳動;アフィニティークロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLC、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー;沈降および塩出クロマトグラフィー;抽出;ならびに対電流分配。いくつかの目的のために、そのタンパク質が以下を含むがそれらに限定されない、精製を容易にするさらなる配列タグを含む組換え系においてポリペプチドを生産することが好ましい:ポリヒスチジン配列、抗体に特異的に結合する配列(例えば、FLAGおよびGST)。ついで、このポリペプチドは、その宿主細胞の租溶解物から、適切な固相材料上のクロマトグラフィーによって精製され得る。あるいは、そのタンパク質に対して生成されたか、またはそれに由来するペプチドに対して生成された抗体は、精製試薬として使用され得る。細胞は、以下を含む種々の技術によって精製され得る:遠心分離、マトリクス分離(例えば、ナイロンウール分離)、パニングおよび他の免疫選択技術、枯渇(例えば、夾雑細胞の相補枯渇)、および細胞ソーティング(例えば、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS))。他の精製方法が可能であり、そして本明細書において企図される。精製された材料は、約50%未満の、好ましくは約75%未満の、そしてもっとも好ましくは約90%未満の、その材料がもともと一緒に存在していた細胞成分、培地、タンパク質または他の所望されない成分もしくは不純物(文脈に応じて)を含み得る。用語「実質的に純粋」とは、当該分野において公知の慣用される精製技術を用いて達成され得る純度の最高の程度をいう。
【0043】
特定の実施形態において、用語「約」または「およそ」とは、所定の値または範囲の、20%以内、好ましくは10%以内、そしてより好ましくは5%以内を意味する。あるいは、生物学において使用される対数用語では、用語「約
は、所定の値と同じ桁内にあること、より好ましくはその値の桁の2分の1以内の範囲にあることを意味する。
【0044】
(組換え発現系)
本発明は、本明細書に記載される免疫原性ポリペプチドの発現のための種々のクローニングおよび発現のベクターを企図する。そのような発現ベクターを用いて、細胞をインビトロで形質転換してタンパク質ワクチンのための免疫原性タンパク質を生成し得るか、またはDNAワクチンのためにインビボで免疫原性ポリペプチドを発現させ得る。
【0045】
免疫原性ポリペプチドのためのコード配列は、シグナル配列を含み得るか、または好ましくは含む。このシグナル配列は、異種シグナル配列(例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞における最適化されたシグナル配列プロセシングのために)であり得る。本明細書において用いられる用語「シグナル配列」は、分泌タンパク質をその細胞からの分泌のためのプロセシングのために識別する、ほとんどの分泌タンパク質に見出されるN末端の疎水性配列をいう。一般に、そのシグナル配列は、プロセシングの間に切断される。しかし、本発明の種々の構築物としては、部分的シグナル配列が挙げられる。その部分シグナル配列が正常にプロセシングされること、またはそれが発現の間に例えば細菌の周辺質にまでトランスロケーションを提供さえすることは、必ずしも正しくない。
【0046】
本発明に従って、当該分野の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術が使用され得る。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本明細書中「Sambrookら、1989」);DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻および第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1985)];Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1984)];Animal Cell Culture[R.I.Freshney編(1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)];B.Perbal,A PraticalGuide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。
【0047】
(分子生物学的定義)
「核酸分子」(あるいは「核酸」)とは、単鎖形態または二重鎖ヘリックス形態のいずれかのリボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン;「RNA分子」)またはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン;「DNA分子」)または任意のそれらのリン酸エステルアナログ(例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル)のリン酸エステルポリマー形態をいう。二重鎖DNA−DNA、DNA−RNAおよびRNA−RNAヘリックスがあり得る。この用語は、特に、直鎖状(例えば、制限フラグメント)または環状DNA分子、プラスミド、および染色体において見出される二重鎖DNAを含む。特定の二重鎖DNA分子の構造を議論することにおいて、配列は、DNAの非転写鎖(すなわち、mRNAに対して相同な配列を有する鎖)に沿って、5’から3’方向においてのみ配列を与えるという通常の慣習に従って本明細書中で記載され得る。「組換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
【0048】
「コード配列」または発現産物(例えば、RNA、ポリペプチド、タンパク質または酵素)を「コードする」配列は、発現される場合に、そのRNA、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産物を生じるヌクレオチド配列である(すなわち、そのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする)。タンパク質についてのコード配列は、開始コドン(通常は、ATG)および終止コドンを含み得る。
【0049】
本明細書中のコード配列は、天然の調節(発現制御)配列に隣接していてもよいし、異種配列(プロモーター、内部リボソーム進入部位(IRES)および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5’非コード領域および3’非コード領域などを含む)に関連していてもよい。
【0050】
用語「遺伝子」(「構造遺伝子」ともいわれる)は、1以上のタンパク質の全てもしくは一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードするかまたはこの特定の配列に対応するDNA配列を意味し、そして例えば、遺伝子が発現される条件を決定する調節DNA配列(例えば、プロモーター配列)を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【0051】
導入された遺伝子またはコード配列はまた、「クローニングされた」、「外来」、または「異種」の遺伝子または配列といわれ得、そして細胞の遺伝的機構により用いられる調節配列または制御配列を含み得る。この遺伝子または配列は、非機能的配列または未知の機能を有する配列を含み得る。
【0052】
用語「宿主細胞」は、細胞による物質の生成(例えば、遺伝子、DNAまたはRNA配列、タンパク質または酵素の細胞による発現)のために、選択されたか、改変されたか、形質転換されたか、増殖されたか、または使用されたかもしくはいずれかの方法において操作された任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、外因性または異種のDNAが細胞内部に導入されている場合、このようなDNAによりトランスフェクトされている。細胞は、トランスフェクトされたDNAが発現され、そしてこれらのDNAが発現される細胞に対して機能または表現型をもたらす場合、外因性または異種のDNAにより形質転換されている。用語「発現系」は、適合性の発現ベクターにより形質転換され、そして例えば、ベクターにより保有される外来DNAによりコードされ、かつ宿主細胞に導入されたタンパク質の発現のために適切な条件下で培養される宿主細胞を意味する。
【0053】
タンパク質およびポリペプチドは、組換えDNAの発現により宿主細胞において生成され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸ベースのポリマー(これは、核酸によりコードされ得るか、または合成により調製され得る)をいう。ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質フラグメント、キメラタンパク質などであり得る。一般に、用語「タンパク質」とは、細胞内で内因的に発現されたポリペプチド(例えば、天然に存在する形態のアミノ酸ベースのポリマー)をいう。一般に、特定のタンパク質または酵素についての指示を有するDNAは、対応するRNAの配列に「転写」される。このRNA配列は、続いて、タンパク質または酵素を形成するアミノ酸配列に翻訳される。「アミノ酸配列」は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖である。
【0054】
「プロモーター配列」は、細胞中でRNAポリメラーゼを結合し得、かつ下流の(3’方向の)コード配列の転写を開始し得るDNA調節領域である。本発明を規定する目的で、このプロモーター配列は、転写開始部位の近くのその3’末端が境界であり、そしてバックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するに必要な塩基またはエレメントの最小数を含むように上流(5’方向)まで伸長する。プロモーター配列内で、転写開始部位(簡便には、例えば、ヌクレアーゼS1を用いたマッピングにより規定される)ならびにRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が見出される。
【0055】
コード配列は、RNAポリメラーゼがmRNAにコード配列を転写する場合、細胞において転写制御配列および翻訳(発現)制御配列の「制御下にある」か、またはこれらの配列と「作動可能に会合(連結)」しており、コード配列は次いで、トランスRNAスプライスされ(イントロンを含む場合)、そしてこのコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
【0056】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子またはDNA配列における情報を顕在化させる(例えば、対応する遺伝子またはDNA配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化させることによりタンパク質を生成する)ことを意味する。DNA配列は、細胞において発現されるか、または細胞により発現されて、タンパク質のような「発現産物」を形成する。発現産物自体(例えば、得られたタンパク質)はまた、細胞により「発現された」といわれ得る。発現産物は、細胞内、細胞外または分泌されたと特徴付けられ得る。用語「細胞内」は、細胞内部に存在する何かを意味する。用語「細胞外」は、細胞外部に存在する(細胞膜中にあるかまたは細胞から分泌されたかのいずれかの)何かを意味する。物質は、この物質が細胞の外部の外部媒体において、細胞上のどこかもしくは細胞内部より有意な尺度で発生するならば、細胞により「分泌」されている。
【0057】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、DNAもしくはRNAの配列(例えば、外来遺伝子)が、宿主を形質転換し、かつ導入された配列の発現(例えば、転写および翻訳)を促進するように宿主細胞に導入され得るビヒクルを意味する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。「カセット」とは、規定された制限部位においてベクターに挿入され得る発現産物をコードするDNAコード配列またはDNAのセグメントをいう。カセット制限部位は、適切なリーディングフレーム中にカセットを確実に挿入するように設計される。一般に、外来DNAは、ベクターDNAの1以上の制限部位に挿入され、次いで、このベクターにより、遺伝性の(transmissible)ベクターDNAとともに宿主細胞に運ばれる。挿入されたか、もしくは付加されたDNAを有するDNAのセグメントまたは配列(例えば、発現ベクター)はまた、「DNA構築物」とよばれ得る。多数のベクター(プラスミドおよび真菌ベクターを含む)は、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における複製および/または発現について記載されている。限定しない例としては、pKKプラスミド(Clontech)、pUCプラスミド、pETプラスミド(Novagen,Inc.,Madison,WI)、pRSETもしくはpREPプラスミド(Invitrogen,San Diego,CA)、またはpMALプラスミド(New England Biolabs,Beverly,MA)、および多数の適切な宿主細胞が挙げられ、本明細書中に開示または引用された方法または当業者に公知の他の方法が用いられる。組換えクローニングベクターは、しばしば、クローニングもしくは発現のための1以上の複製系、宿主における選択のための1以上のマーカー(例えば、抗生物質耐性)、および1以上の発現カセットを含む。
【0058】
用語「発現系」は、例えば、ベクターが保有し、かつ宿主細胞に導入された外来DNAによりコードされたタンパク質の発現について適切な条件下での宿主細胞および適合性のベクターを意味する。発現系は、細菌、昆虫、または哺乳動物の宿主細胞およびベクターを含む。細菌細胞および昆虫細胞の発現は、以下に例示される。適切な哺乳動物細胞としては、C12細胞、CHO細胞、HeLa細胞、293細胞および293T細胞(ヒト腎臓細胞)、COS細胞、マウス初代筋細胞、およびNIH 3T3細胞が挙げられる。
【0059】
用語「異種」とは、天然に存在しないエレメントの組合わせをいう。例えば、異種DNAは、細胞においてまたは細胞の染色体部位に天然に位置しないDNAをいう。好ましくは、異種DNAは、細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、天然において作動可能に会合している遺伝子ではなく、異なる遺伝子と作動可能に会合しているようなエレメントである。本発明の状況において、遺伝子は、クローニングまたは発現のために挿入される組換えベクターDNAに対して異種であり、そして遺伝子が発現されるこのようなベクターを含む宿主細胞(例えば、CHO細胞)に対して異種である。
【0060】
核酸分子は、単鎖形態の核酸分子が温度および溶液イオン強度の適切な条件(Sambrookら(前出)を参照のこと)下で他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子(例えば、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA)にハイブリダイズし得る。100ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについて、Tmを計算するための式が得られる(Sambrookら(前出)、9.50〜9.51を参照のこと)。より短い核酸(すなわち、オリゴヌクレオチド)とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambrookら(前出)11.7〜11.8を参照のこと)。ハイブリダイズ可能な核酸についての最小の長さは、少なくとも約10ヌクレオチドであり;好ましくは、少なくとも約15ヌクレオチドであり;そしてより好ましくは、長さが約20ヌクレオチドである。
【0061】
(発現ベクター)
広範に種々の宿主/発現ベクターの組合わせ(すなわち、発現系)は、本発明の免疫原性ポリペプチドを発現することにおいて用いられ得る。例えば、有用な発現ベクターは、染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列のセグメントからなり得る。適切なベクターとしては、SV40の誘導体および公知の細菌プラスミド(例えば、E.coliプラスミドcolEl、pCR1、pBR322、SV40およびpMal−C2、pET、pGEX(Smithら、Gene 67:31−40,1988)、pMB9およびそれらの誘導体、PR4のようなプラスミド);グラム陽性ベクター(例えば、Strep.gardonii);ファージDNAS(例えば、ファージ1の多くの誘導体(例えば、NM989))および他のファージDNA(例えば、M13および糸状単鎖ファージDNA);酵母プラスミド(例えば、2mプラスミドまたはその誘導体);真核生物細胞において有用なベクター(例えば、昆虫もしくは哺乳動物細胞において有用なベクター);プラスミドおよびファージDNAの組合わせに由来するベクター(例えば、ファージDNAもしくは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド)などが挙げられる。
【0062】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター/エンハンサーエレメントにより制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主において機能的でなければならない。遺伝子発現を制御するために用いられ得るプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第5,385,839号および同第5,168,062号)、SV40初期プロモーター領域(BenoistおよびChambon,Nature 290:304−310,1981)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら,Cell 22:787−797、1980)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441−1445,1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、Nature 296:39−42、1982);原核生物発現ベクター(例えば、β−ラクタマーゼプロモーター)(Villa−Komaroffら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727−3731,1983)またはtacプロモーター(DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25,1983);Scientific American,242:74−94,1980の「Useful protein from recombinant bacteria」もまた参照のこと;酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント(例えば、Gal4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター);および造血組織特異性を示す制御領域(特に、リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域)(Grosschedlら、Cell,38:647,1984;Adamesら、Nature 318:533,1985;Alexanderら、Mol.Cell Biol.7:1436、1987);骨髄細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域(Mogramら、Nature 315:338−340,1985;Kolliasら、Cell 46:89−94,1986)、造血幹細胞分化因子プロモーター;エリスロポエチンレセプタープロモーター(Maoucheら、Blood,15:2557,1991)など;および粘膜上皮細胞特異性を示す制御領域。
【0063】
好ましいベクター(特に、インビトロでの細胞アッセイおよびインビボもしくはエキソビボでのワクチン接種のため)は、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘、AV−ポックス、改変ワクシニアAnkara(modified vaccinia Ankara)(MVA)のようなウイルスベクターおよび所望の細胞向性を有する他の組換えウイルスである。特定の実施形態において、ワクシニアウイルスベクターは、樹状細胞に感染させるために用いられる。別の特定の実施形態において、EBNA−lを発現するバキュロウイルスベクターが調製される。従って、免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、ウイルスベクターを用いて、またはDNAの直接導入によりインビボ、エキソビボ、またはインビトロで導入され得る。標的化された組織における発現は、トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化する(例えば、ウイルスベクターもしくはレセプターリガンドを用いるか、組織特異的プロモーターを用いることによるか、またはその両方を用いる)ことにより、もたらされ得る。標的化された遺伝子送達は、国際特許出願WO95/28494(1995年10月公開)に記載される。
【0064】
インビボまたはエキソビボ標的化およびワクチン接種手順のために一般に用いられるウイルスベクターは、DNAベースのベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、そして用いるための方法は、当該分野で公知である(例えば、MillerおよびRosman,Bio Techniques、7:980−990,1992を参照のこと)。好ましくは、このウイルスベクターは、複製欠損である(すなわち、このベクターは、標的細胞において自律的に複製できない)。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小のウイルスである(すなわち、このウイルスは、ゲノムをキャプシド化してウイルス粒子を生成するために必要なそのゲノムの配列のみを保持する)。
【0065】
DNAウイルスベクターとしては、弱毒化DNAウイルスまたは欠損DNAウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピロマウイルス、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない)が挙げられる。特定のベクターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:欠損ヘルペスウイルス(HSV1)ベクター(Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.2:320−330,1991;国際特許公開番号WO94/21807(1994年9月29日公開);国際特許公開番号WO92/05263(1994年4月2日公開));弱毒化アデノウイルスベクター(例えば、Stratford−Perricaudetら(J.Clin.Invest.90:626−630,1992により記載される;La Salleら、Science 259:988−990,1993もまた参照のこと);および欠損アデノ随伴ウイルスベクター(Samulskiら、J.Virol.63:3096−3101,1987;Samulskiら、J.Virol..63:3822−3828,1989;Lebkowskiら、Mol.Cell.Biol.8:3988−3996,1988)。
【0066】
種々の仲間が市販のウイルスベクターを生成し、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:Avigen,Inc.(Alameda,CA;AAVベクター)、Cell Genesys(Foster City,CA;レトロウイルス、アデノウイルス、AAVのベクターおよびレンチウイルスベクター)、Clontech(レトロウイルスおよびバキュウロウイルスのベクター)、Genovo,Inc.(Sharon Hill,PA;アデノウイルスおよびAAVのベクター)、Genvec(アデノウイルスベクター)、IntroGene(Leiden,Netherlands;アデノウイルスベクター)、Molecular Medicine(レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、およびヘルペスウイルスベクター)、Norgen(アデノウイルスベクター)、Oxford BioMedica(Oxford,United Kingdom;レンチウイルスベクター)、およびTransgene(Strasbourg,France;アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスのベクター)。
【0067】
(アデノウイルスベクター)
アデノウイルスは、真核生物DNAウイルスであって、本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に送達するように改変され得る。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型のうち、本発明の範囲内で2型もしくは5型のヒトアデノウイルス(Ad2もしくはAd5)または動物起源のアデノウイルス(WO94/26914を参照のこと)を用いて、性能が与えられる。本発明の範囲内で用いられ得る動物起源のそれらのアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、マウス起源のアデノウイルス(例:Mav1、Beardら、Virology 75(1990):81)、ヒツジ、ブタ、トリおよびサル起源のアデノウイルス(例:SAV)が挙げられる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、より好ましくは、例えば、CAV2アデノウイルス(例えば、ManhattanまたはA26/61株(ATCC VR−800))である。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記載されている(WO94/26914、WO95/02697、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。本発明に従う複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術により調製され得る(Levreroら、Gene 101:195 1991;EP 185873;Graham,EMBO J.3:2917,1984;Grahamら、J.Gen.Virol.36:59 1977)。組換えアデノウイルスは、ヒト樹状細胞に対して効率的かつ混乱させない(non−purturbing)ベクターである(Zhongら、Eur.J.Immunol.29:964,1999;DiNicolaら、Cancer Gene Ther.5:350−6,1998)。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて回収および精製される。
【0068】
(アデノ随伴ウイルス)
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、安定かつ部位特異的様式で、これらのウイルスが感染する細胞のゲノムに組み込まれ得る比較的小さなサイズのDNAウイルスである。これらは、細胞増殖、細胞形態または細胞分化に対していずれの影響も誘導することなく広範なスペクトルの細胞に感染し得、そしてそれらは、ヒトの病状に関与しないと思われる。AAVゲノムは、クローニングされ、配列決定され、かつ特徴付けられている。インビトロおよびインビボで遺伝子を移入するためのAAVに由来するベクターの使用が記載されている(WO91/18088;WO93/09239;米国特許第4,797,368号、同第5,139,941号、EP 488528を参照のこと)。本発明に従う複製欠損組換えAAVは、2つのAAV逆末端反復(ITR)領域に隣接する目的の核酸配列を含むプラスミドおよびAAVキャプシド化遺伝子(repおよびcap遺伝子)を有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)に感染する細胞株に同時トランスフェクトすることにより調製され得る。次いで、生成されたこのAAV組換え体は、標準的技術により精製され得る。これらのウイルスベクターはまた、ヒト樹状細胞に遺伝子を移入するために効率的である(DiNicolaら(前出))。
【0069】
(レトロウイルスベクター)
別の実施形態において、遺伝子は、例えば、Andersonら、米国特許第5,399,346号;Mannら、1983,Cell 33:153;Teminら、米国特許第4,650,764号;Teminら、米国特許第4,980,289号;Markowitzら、1988、J.Virol.62:1120;Teminら、米国特許第5,124,263号;EP 453242、EP178220;Bernsteinら、Genet.Eng.7(1985)235;McCormick、BioTechnology 3(1985)689;Doughertyらによる国際特許公開番号WO95/07358(1995年3月16日公開);およびKuoら、1993、Blood 82:845に記載されるように、レトロウイルスベクターに導入され得る。レトロウイルスは、分裂している細胞に感染する組み込みウイルスである。レトロウイルスゲノムは、2つのLTR、キャプシド化配列および3つのコード領域(gag、polおよびenv)を含む。組換えレトロウイルスベクターにおいて、gag、polおよびenvの遺伝子は、一般に、全体または一部が欠失され、そして目的の異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス(例えば、HIV、MoMuLV(「マウスモロニー白血病ウイルス」)、MSV(「マウスモロニー肉腫ウイルス」)、HaSV(「ハーベイ肉腫ウイルス」);SNV(「脾臓壊死ウイルス」);RSV(「ラウス肉腫ウイルス」)およびフレンドウイルス)から構築され得る。適切なパッケージング細胞株は、従来技術において記載され、特に細胞株PA317(US4,861,719);PsiCRIP細胞株(WO90/02806)およびGP+envAm−12細胞株(WO89/07150)に記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのLTRおよびgag遺伝子の一部を含み得る広範なキャプシド化配列内に改変を含み得る(Benderら、J.Virol.61:1639,1987)。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準的な技術により精製される。
【0070】
レトロウイルスベクターはまた、1サイクルのレトロウイルス複製を可能にし、そしてトランスフェクション効率を拡大するDNAウイルスにより導入され得る(WO95/22617、WO95/26411、WO96/39036、WO97/19182を参照のこと)。
【0071】
(レンチウイルスベクター)
別の実施形態において、次いで、レンチウイルスベクターは、いくつかの組織型(脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む)における導入遺伝子の直接送達および持続的発現のための因子として用いられ得る。このベクターは、これらの組織において分裂細胞および非分裂細胞を効率的に形質導入し得、そして目的の遺伝子の長期発現を維持し得る。総説については、Naldini,Curr.Opin.Biotechnol.9:457−63,1998を参照のこと;Zuffereyら、J.Virol.72:9873−80,1998もまた参照のこと。レンチウイルスパッケージング細胞株は当該分野で利用可能であり、一般に公知である。これらの細胞株は、遺伝子治療のための高力価レンチウイルスベクターの生成を容易にする。例は、少なくとも3〜4日間にわたり106IU/mlより高い力価でウイルス粒子を生成し得るテトラサイクリン誘導性VSV−G偽型化(pseudotyped)レンチウイルスパッケージング細胞株である(Kafriら、J.Virol.73:576−587,1999)。誘導性細胞株により生成されるベクターは、インビトロおよびインビボで非分裂細胞を効率的に形質導入するために必要であるように濃縮され得る。
【0072】
(ワクシニアウイルスベクター)
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルスファミリーのメンバーであり、そしてそのサイズの大きさおよび複雑性によって特徴付けられている。ワクシニアウイルスDNAは、二本鎖であり、そして末端架橋されていて、その結果、一本鎖環が、DNAの変性に基いて形成される。このウイルスは、約200年間、痘瘡に対するワクチンとして用いられており、ワクチンとして用いた場合のこのウイルスの特徴は公知である(Paoletti,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93:11349〜53,1996;およびEllhner,Infection,26:263〜9,1998)。ワクシニアウイルスを用いたワクチン接種の危険性は、周知で、十分規定されており、そしてこのウイルスは、比較的良性であるとみなされている。ワクシニアウイルスベクターは、外来遺伝子の挿入および発現のために用いられ得る。ワクシニアベクターに外来遺伝子を挿入して、ワクシニアウイルスの合成組換え体を作成する基礎的な技術は、記載されている(米国特許第4,603,112号、米国特許第4,722,848号、米国特許第4,769,330号、および米国特許第5,364,773号を参照のこと)。多数の外来(すなわち、非ワクシニア)遺伝子が、ワクシニア中で発現されており、これは、しばしば、防御免疫を生じる(以下によって概説されている:Yamanouchi,Barnett、およびKai、Rev.Sci.Tech.,17:641〜53,1998;Yokoyamaら、J.Vet.Med.Sci.59:311〜22,1997;そして以下を参照のこと:Osterhausら、Vaccine,16:1479〜81 1998:およびGherardiら、J.Immunol.162:6742〜33,1999)。ワクシニアウイルスは、免疫無防備状態の個体または免疫抑制状態の個体への投与には適していないかもしれない。本発明において用いられ得る別のポックスウイルスとしては、家禽ポックス(Fowl pox)、AVポックス(AV−pox)、および改変ワクシニアアンカラ(Ankara)(MVA)ウイルスが挙げられる。これらの別のウイルスの免疫原としての能力を改善するために好ましい実施形態は、EBNA−1を含有するウイルスを直接、樹状細胞に送達すること、次いで樹状細胞を成熟させることである。
【0073】
(非ウイルスベクター)
別の実施形態において、このベクターは、裸のDNAとして、リポフェクチンによって、または他のトランスフェクション達成剤(ペプチド、ポリマーなど)を用いて、インビトロで導入され得る。合成のカチオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するのに用いられ得る(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413〜7417,1987;FelgnerおよびRingold,Science 337:387〜388,1989;以下を参照のこと:Mackeyら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027〜8031、1988;Ulmerら、Science 259:1745〜1748,1993)。核酸の移入のために有用な脂質化合物および脂質組成物は、以下に記載されている:国際特許出願WO95/18863およびWO96/17823、ならびに米国特許第5,459,127号。脂質は、標的化の目的のため、他の分子に化学的に結合され得る(Mackeyら、(前出)を参照のこと)。標的化ペプチド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子)は、リポソームに化学的に結合され得る。
【0074】
カチオン性オリゴペプチド(例えば、国際特許公開WO95/21931)、DNA結合タンパク質由来のペプチド(例えば、国際特許公開WO96/25508)、またはカチオン性ポリマー(例えば、国際特許公開WO95/21931)のような、他の分子がまた、インビボで核酸のトランスフェクションを容易にするために有用であり得る。
【0075】
あるいは、遺伝子治療のための非ウイルス性DNAベクターが、当該分野で公知の方法(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用(弾道トランスフェクション;例えば米国特許第5,204,253号;同第5,853,663号;同第5,885,795号;同第5,702,384号を参照のこと、そして以下を参照のこと:Sanford,TIB−TECH,6:299〜302,1988;Fynanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:11478〜11482,1993;およびYangら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1568〜9572,1990)、またはDNAベクタートランスポーターの使用(例えば、以下を参照のこと:Wuら、J.Biol.Chem.267:963〜967,1992;WuおよびWu,J.Biol.Chem.263:14621〜14624,1988;Hartmutら、1990年3月15日出願、カナダ特許出願番号2,012,311号;Williamsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726〜2730,1991))によって所望の宿主細胞に導入され得る。レセプター媒介DNA送達アプローチがまた用いられ得る(Curielら、Hum.Gene.Ther.3:147〜154,1992;WuおよびWu,J.Biol.Chem.262:4429〜4432,1987)。米国特許第5,580,859号および米国特許第5,589,466号は、哺乳動物において、トランスフェクション促進剤を使わない、内因性DNA配列の送達を開示している。近年、比較的低い電圧の、高い効率のインビボDNA移入技術(電気移入(electrotransfer)と名付けられる)が記載されている(Mirら、C.P.Acad.Sci.321:893,1998;WO 99/01157;WO 99/01158;WO 99/01175)。
【0076】
(ワクチン技術および免疫療法)
上記のように、本発明は、エプスタイン−バーウイルス感染、または関連の疾患(例えば、感染性単球増加、風土性バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、T細胞リンパ腫、胃癌、および平滑筋肉腫、ならびに慢性疲労症状のような潜在的な慢性疾患)を予防または処置するための、ポリペプチドワクチン、および免疫原性EBNA−1ポリペプチドを送達するDNAワクチンに関する。
【0077】
本発明のワクチンは、エプスタイン−バーウイルスによる感染から動物を防御するために広範に適用可能である。用語「防御(protect)」は、エプスタイン−バーウイルス感染の処置または予防を意味するとして、本明細書において用いられる。従って、このタイプの感染に感受性の任意の動物がワクチン接種され得る。EBVは、γヘルペスウイルス(gammaherpesvirus)、herpesvirus saimiri、およびウシ4型へルペスウイルスに対して、他のクラスのヘルペスよりも系統学的に大きい類似性を示す(Karlinら、J.Virol.68:1886;902,1994;およびBublotら、Virology,190:654〜65,1992)。EBVについての動物モデルは、同じ種の新世界ザル(New World monkey)において(Frankenら、J.Virol.69:8011〜9,1995)、ならびにマウスにおいて(MistrikovaおよびMrmusova,Acta.Virol.,42:79〜82,1998,Weckら、J.Virol.73:4651〜61,1999;ならびにSimasおよびEfstathiou、Trends Microbiol.,6:276〜82,1998)およびウサギにおいて(Wutzlerら、Arch.Virol.140:1979〜95,1995;およびHandleyら、Vet.Microbiol.,47:167〜81,1995)存在する。サルに感染する、少なくとも1つのEBV様ヘルペスウイルスは、EBNA−1に相同である遺伝子を含む(Liら、Int.J.Cancer,59:287〜95,1994)。EBV様ウイルスに感染した動物は、疾患を予防または処置するための本発明のワクチンで処置され得る。
【0078】
(ポリペプチドワクチン)
本明細書において用いる場合、用語「ポリペプチドワクチン」は、免疫原性ポリペプチドおよび一般にはアジュバントを含むワクチンをいう。用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物をいう。アジュバントは、抗原を緩徐に放出する組織デポ(貯蔵)として、そしてまた免疫応答を非特異的に増強するリンパ系アクチベータとして働き得る(Hoodら、Immunology,第2版、1984、Benjamin/Cummings:Menlo Park,California、p384)。しばしば、抗原のみ(アジュバントなし)での初回チャレンジは、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を惹起し得ない。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような表面活性化物質、プルロニック(pluronic)ポリマー、ポリアニオン、ペプチド、オイル、または炭水化物エマルジョン、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント(例えば、BCG(bacille Calmette−Guerin)およびCorynebacterium parvum)が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい合成アジュバントの例はQS−21である。あるいは、またはさらに、以下に記載するような、免疫刺激的タンパク質が、アジュバントとして、またはワクチンに対する免疫応答を増大するために、提供され得る。好ましくは、このアジュバントは、薬学的に受容可能である。
【0079】
句「薬学的に受容可能な(pharmaceutically acceptable)」とは、ヒトに投与された場合、生理学的に耐性であり、そして代表的には、アレルギー反応または類似の不都合な反応(例えば、異常亢進、眩暈など)を生じない分子および組成物をいう。好ましくは、本明細書において用いる場合、用語「薬学的に受容可能な」とは、連邦もしくは合衆国政府の監督官庁によって承認されたか、または米国薬局方もしくは動物、およびより詳細にはヒトにおける使用のための他の一般的に認識される薬局方に列挙されることを意味する。用語「キャリア」とは、この化合物と一緒に投与される稀釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。滅菌水または生理食塩水水溶液およびデキストラン水溶液およびグリセロール水溶液は、特に注射用溶液のために、好ましくはキャリアとして使用される。適切な薬学的キャリアは、E.W.Martinによって「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【0080】
上記の特定のアジュバント(特に鉱物油および鉱物油を含むアジュバント(例えば、フロイントのアジュバント))は、ヒトでの使用には受容できない。
【0081】
(「DNA」ワクチン)
用語「DNAワクチン」は、当該分野では非公式な用語であり、そして組換えベクターの手段によって送達されるワクチンをいうために、本明細書において用いられる。本明細書において用いられる別の、そしてより説明的な用語は、「ベクターワクチン」である(なぜなら、いくつかの可能性のあるベクター(例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルス)は、RNAウイルスであるからであり、そしてある場合には、DNAの代わりに非ウイルスRNAが細胞に送達され得るからである)。一般に、このベクターは、インビボで投与されるが、インビボで形質導入された細胞の投与を伴う、適切な抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)のエキソビボ導入がまた、意図される。上記のベクター系は、本発明の免疫原性ポリペプチドの発現のためのベクターの送達にとって理想的である。
【0082】
(ワクチン接種および免疫療法のストラテジー)
エプスタイン−バーウイルス感染に対して被験体をワクチン接種するために、種々のストラテジーを用い得る。ポリペプチドワクチン処方物は、皮下(subcutaneous)(s.c.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、皮下(subdermal)(s.d.)、皮内(i.d.)の投与によって、またはエキソビボでの抗原提示細胞への投与とそれに続くこの細胞の被験体への投与によって送達され得る。被験体への投与の前に、抗原提示細胞は、成熟させられてもよい。
【0083】
同様に、上記の任意の遺伝子送達方法は、被験体にベクターワクチンを投与するために用いられ得る(例えば、遺伝子銃または直接注射による、裸のDNAおよびRNAの送達)。
【0084】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激、免疫増強または炎症促進性のサイトカイン、リンホカイン、またはケモカインのような免疫刺激性分子(SalgallerおよびLodge、J.Surg.Oncol.68:122,1988)と、ワクチン(特にベクターワクチン)との同時投与によって増強され得る。例えば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子(例えば、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13、顆粒球マクロファージ(GM)コロニー刺激因子(CSF)および他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド(Lyman,Curr.Opin.Hematol.5:192,1998))、ならびにいくつかの重要な同時刺激分子またはそれらの遺伝子(例えば、B7.1,B7.2)が用いられ得る。これらの免疫刺激分子は、タンパク質として全身もしくは局所的に送達され得るか、またはこの分子の発現をコードするベクターの発現によって、送達され得る。免疫原性ポリペプチドの送達のための上記の技術はまた、免疫刺激分子に対して使用され得る。
【0085】
(樹状細胞標的化)
ワクチン接種および特に免疫療法は、樹状細胞の標的化を通じて達成され得る(Steinman,J.Lab.Clin.Med.,128:531,1996;Steinman,Exp.Hematol.24:859,1996;Taiteら、Leukemia,13:653,1999;Avigan,Blood Rev.,13:51,1999;DiNicolaら.,Cytokines Cell.Mol.Ther.4:265,1998)。樹状細胞は、T細胞依存性免疫の活性化に重要な役割を果たす。増殖する樹状細胞は、インサイチュで免疫原性形態でタンパク質抗原を捕獲し、次いでこれらの抗原を認識され得る形態で提示してT細胞を刺激するために用いられ得る(例えば、Steinman、Exper.Hematol.24:859〜862,1996;Inabaら、J.Exp.Med.188:2163〜73,1998および米国特許第5,851,756号を参照のこと)。エキソビボ刺激のために、樹状細胞を培養皿中にプレートし、そして抗原が樹状細胞に結合することを可能にするのに十分な量および十分な時間で、抗原に曝露(抗原を適用)する。さらに、樹状細胞は、Zhongら、Eur.J.Immunol.29:964〜72,1999;Van Tendelooら、Gene Ther.,5:700〜7,1998;Dieboldら、Hum.Gene Ther.10:775〜86,1999;FrancotteおよびUrbain,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:8149,1985および米国特許第5,891,432号(Casaresら、J.Exp.Med.186:1481〜6,1997)に記載のように種々の物理的または化学的手段を用いてDNAでトランスフェクトされ得る。次いで、適用した細胞を、処置を受けている被験体に、例えば静脈内注射によって、移植して戻し得る。好ましくは、自己樹状細胞(すなわち、処置を受けている被験体から得た樹状細胞)を用いるが、MHCクラスII適合樹状細胞を使用することも可能である。この樹状細胞は、型適合ドナーから、または樹状細胞の遺伝子操作によって獲得され、所望のMHC分子を発現(そして好ましくは所望されないMHC分子の発現を抑制)し得る。
【0086】
好ましくは、樹状細胞は、EBNA−1の発現のためにインビボで特に標的される。抗原提示を媒介するレセプター(例えば、DEC−205)(Swiggardら、Cell.Immunol.165:302〜11,1995;Steinman,Exp.Hematol.24:859,1996)およびFcレセプターを使用することによって、種々のストラテジーが、インビボで樹状細胞を標的化するのに利用可能である。上記で考察した標的化ウイルスベクターがまた用いられ得る。さらに、樹状細胞は、ウイルスベクターによる感染後、インビボでの移植の前に、成熟するようにインビトロで誘導され得る。
【0087】
(粘膜ワクチン接種)
粘膜ワクチンストラテジーは、多くの病原性ウイルスにとって特に有効である。なぜなら、感染は、しばしば粘膜を介して起こるからである。さらに、組換えワクシニアウイルスワクチンの粘膜送達は、以前の痘瘡ワクチン接種に起因する痘瘡ウイルスに対するもともと存在する免疫を克服することができる(Belyakovら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:4512〜7,1999)。粘膜は、EBNA−1ワクチンおよび免疫療法の重要な標的である樹状細胞を覆ってしまう。従って、ポリペプチドワクチンおよびDNAワクチンの両方について粘膜ワクチン接種ストラテジーが意図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的化され得るが、粘膜に免疫原性タンパク質を送達するため、種々のストラテジーが使用されてきた(これらのストラテジーは、例えば、ベクター標的タンパク質として特異的粘膜標的タンパク質を用いることによる、または粘膜標的タンパク質との混合物としてワクチンベクターを送達することによる、DNAワクチンの送達を含む)。
【0088】
例えば、特定の実施形態において、免疫原性ポリペプチドまたはベクターワクチンは、コレラ毒素(例えば、コレラ毒素Bまたはコレラ毒素A/Bキメラ)との混合物として、またはコレラ毒素との結合体もしくはキメラ融合タンパク質として、投与され得る(Hajishengallis.,J Immunol.154:4322〜32,1995;JoblingおよびHolmes、Infect Immun.,60:4915〜24,1992)。コレラ毒素Bサブユニットの使用に基く粘膜ワクチンが記載されている(LebensおよびHolmgren,Dev Biol Stand 82:215〜27,1994)。別の実施形態において、熱不安定性エンテロトキシン(LT)との混合物が粘膜ワクチン接種のために調製され得る。
【0089】
他の粘膜免疫ストラテジーとしては、マイクロカプセル中の免疫原のカプセル化(米国特許第5,075,109号、同第5,820,883号、および同第5,853,763号)、および免疫増強膜性キャリアの使用(WO 98/0558)が挙げられる。経口投与された免疫原の免疫原性は、赤血球(rbc)またはrbcゴースト(米国特許第5,643,577号)を用いることによって、またはブルータング抗原(米国特許第5,690,938号)を用いることによって増強され得る。標的化免疫原の全身投与はまた、粘膜免疫を生じ得る(米国特許第5,518,725号を参照のこと)。
【0090】
種々のストラテジーを用いて、粘膜組織における発現のための遺伝子を送達し得る(これには、例えば、キメラレトロウイルス(米国特許第5,714,374号)、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、または核酸の特異的標的化(WO 97/05267)を使用する)。
【0091】
(実施例)
本発明は、以下の実施例に対する言及によってより良好に理解される。以下の実施例は、例示の目的のためであって、本発明の限定を意図しない。
【0092】
(実施例1:個々の潜在性EBV産物に対するCD4+反応陽性の同定)
EBNA−1について、本発明者らは、この抗原を組換えタンパク質として、外因的に(Zhangら、Nucleic Acids Res.,26:631〜7,1998;FrappierおよびO’Donnell,J.Biol.Chem.,266:7819〜26,1991)か、または組換えワクシニアウイルス構築物を介して内因的にのいずれかで送達した。本発明者は、T細胞活性化および増殖、IFNγ分泌、ならびにCTL活性によってモニターされるように、いずれかの経路によって提示されたENBA−1に対する強力なCD4+T細胞応答を発見した。この免疫応答は、EBV感染およびEBV関連悪性疾患に抵抗するために利用され得る。
【0093】
(材料および方法)
(細胞株)
EBVトランスフォームしたB細胞株であるLRM(HLA−A2、HLA−B44、HLA−DRB1*0401、HLA−DOA1*03、HLA−DQB1*0301、HLA−DP4)(Friedeら、Biochim.Biophys.Acta.1316:85〜101,1996)およびLG2(HLA−DRB1*0101、HLA−DQA*0101、HLA−DQB1*0501、HLA−DPA1*0101、HLA−DPB1*0201)(Gorgaら、J.Biol.Chem.26:16087〜94,1987)を用いた。B−LCLを、RPMI−1640+10%FCS+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシン中で培養した。LCL−BM(HLA−A1、HLA−A3,HLA−B7、HLA−B8、HLA−Cw6、HLA−Cw7、HLA−DR4、HLA−DRw14、HLA−DRw52、HLA−DRw53、HLA−DQw3)およびLCL−DC(HLA−A2、HLA−A24、HLA−B38、HLA−B46、HLA−Cw1、HLA−Cw7、HLA−DRB1*1502、HLA−DRB1*0901、HLA−DRB4*01、HLA−DRB5*0101、HLA−DQB1*0502、HLA−DQB1*0303)を、RPMI−1640+20%FCS+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシン+1μg/mlサイクロスポリンAの中で、マーモセット細胞株B95.8の上清を用いて、PBMCの健常型ドナーを培養することによって生成した。BSC40サル腎臓細胞株をDMEM+5%FCS+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシン中で増殖させ、そして組換えVVストックを力価測定するためのプラークアッセイに用いた。
【0094】
(樹状細胞(DC)およびPBMC調製物)
New York Blood Centerの白血球濃縮物(バフィーコート)、およびPBMCの供給源として役立った実験室のドナーからの白血球(Ficoll−Paque(Pharmacia)上の密度勾配遠心分離によって単離された).CD2+PBMCを、ノイラミニダーゼ(Calbiochem)処理ヒツジ赤血球(Colorado Serum Company)を用いてロゼット化すること、次いで1.666%塩化アンモニウムを用いる赤血球溶解によって分離した。指示された場合、CD8+T細胞またはCD4+T細胞を、Leu2a抗体もしくはOKT8抗体(CD8について)、またはHP2/6抗体(CD4について)を用いて枯渇させ、続いて、ヒツジαマウスIgG Dynabeadおよび磁性粒子濃縮器MCP−1(Dynal,Norway)を用いてインキュベーションした。DCを記載(Benderら、J.Immunol.Methods,196121〜35,1996;Romaniら、J.Immunol.Methods,196:137〜51,1996)のように、CD2−PBMCから生成した。106CD2+PBMC/mlを、RPMI−1640+1%単一ドナー血漿+1000U/ml rhIL−4+1000U/ml rhGM−CSF+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシンとともに6ウェルプレート中にプレーティングした。100μlを、200μl/ml RPMI−1640+1%単一ドナー血漿+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシンで置換し、そして1000U/ml rhIL−4、および1000U/ml rhGM−CSFを、2日目、4日目および6日目に添加した。7日目、浮遊している未熟なDCを、新しいプレートに3×105細胞/mlに移し、そして培地の半分を単球馴化培地で置換し、2日間、DCを成熟した。
【0095】
(ワクシニアウイルスストック生成およびDCの感染)
組換えワクシニアウイルスを、ウサギ腎臓RK13細胞中で増殖した。成熟DCを37℃で1時間2のMOIで感染させ、そして3回洗浄した。感染の効率を、記載のように、VV1−6B6抗体を用いた29kDのワクシニア早期タンパク質の細胞内染色を用いたFACSによって、6〜12時間後にチエックした。
【0096】
(CD4+T細胞株およびクローンの生成)
CD8−CD2+PBMCを、30:1(T:DC)の比で成熟DCを用いて刺激した。CM171198細胞株について、健常ドナーCMのT細胞(HLA−A*0201、HLA−A*6801、HLA−B*4402、HLA−B*4402、HLA−B*0702、HLA−C*0501、HLA−C*0702、HLA−DRB1*1501、HLA−DRB1*0401、HLA−DRB5*01、HLA−DQB4*01、HLA−DQB1*0602、HLA−DQB1*0301)を、vvEBNA−1ΔGA感染自己成熟DCを用いて4週間刺激し、これにはフィーダーとして自己CD2+PBMCを含む毎週の再刺激を伴い、そして次いで、EBVでトランスフォームしたHLA−DRがマッチした細胞株LRMまたはvvEBNA−1ΔGA感染DCを用いた変更を行う。CM110199細胞株を、10μMの組換えEBNA−1タンパク質(成熟刺激薬と一緒に7日目に添加した)とともにインキュベートしたDCを用いることによって、ドナーCMのT細胞から生成した。E.coliおよびバキュロウイルス/昆虫細胞の発現系から精製したrEBNA−1を代わりに用いた(Zhangら(前出)1998;FrappierおよびO’Donnell(前出))。指示された場合、E.coli誘導DNA−Cをコントロールタンパク質(E.coliコントロール)として用いた。DMEM+5%HS中の刺激の14日後、50U/ml rIL−2を補充した。自己B−LCLでの刺激のために、健常ドナーJTのCD2+PBMCを、DMEM+5%ヒト血清+10U/ml IL−2(Lymphocult,Dreieich,Germany)中で、1:10のB細胞対T細胞の比で、照射した自己LCL−JTを用いて、14日間刺激した。指示された場合、CD4+T細胞またはCD8+T細胞を枯渇させた。
【0097】
EBNA−1特異的CD4+CTLを、96ウェルプレート中で、白血球濃縮物由来の104の自己B−LCLを用いて105のCD8−CD2+PBMCを、14日間、刺激すること(7日目での再刺激を伴う)によって、限界希釈条件下でクローニングした。IL−2を、再刺激の間、最終濃度10U/ml(Lymphocult)に、培養に添加した。微量培養物をvvEBNA−1ΔGAまたはvvTK−に感染した自己DC、自己B−LCLまたはLCL721.221に対して、スプリットウェル51Cr放出アッセイにおいて試験した。この最初のT細胞数で、ウェルの30%未満がCTLを発生し、このことは、レスポンダーのクローン性について90%を超える可能性を示した(Taswellら、J.Exp.Med.151:1372〜85,1980)。
【0098】
(刺激されたCD4+T細胞集団およびPBMCのFACS分析)
RPMI−1640+5%HS中で、37℃1時間、2のMOIで組換えVVを用いて、または0.5のMOIでインフルエンザウイルス(PR8,PuertoRico/8/34,Spafas Inc.,Storrs,CT)を用いて、成熟DCを感染した。DCを2回洗浄し、そして3×103を、7日間96ウェルプレート中の105のCD8−CD2+PBMCに添加した。7日目に、培養物を1ウェルあたり、105のPBMCおよび3×103DCを用いて再刺激し、そしてさらに7日間インキュベートした。1ウェルあたり、105の照射した(3000rad)PBMCおよび3×103のDCを用いて、培養物を再刺激し、さらに7日間インキュベートした。14日後、1μlのSimultest CD4−FITC/CD8−PE(Becton Dickinson)含有100μl PBS+1%FCS+0.005%アジ化ナトリウムを用いて氷上で30分間、培養物を染色した。3回の洗浄後、培養物をFACScan(Becton Dickinson)で分析した。CD56抗体染色(PharMingen)には、二次抗体としてPE−ヤギαマウス−IgG抗体(Biosource)を用いた。PBMCを、一次抗体としてHLA−DR4抗体(Accurate)、および二次抗体としてFITC−ヤギα−マウスIgG抗体(Biosource)を用いて、HLA−DR4について分類した。
【0099】
(IFNγ分泌細胞についてのELISPOTアッセイ)
10μg/mlのαIFNγ抗体1−D1K(MABTECH)を含有する50μl/ウェルの50mM Na2CO3(pH9.5)を用いて、MAHA S45プレート(Millipore)を、4℃で一晩、コートした。プレートをPBSで4回洗浄して、DMEM+5% HSを用いて37℃で1時間ブロックした。その後、105のキラーT細胞(responder T cell)および3×103〜104の刺激因子DCを1ウェルあたりに添加して、37℃で1〜2日間インキュベートした。ついで、このプレートをPBS+0.05% Tween 20を用いて4回洗浄し、そして1μg/mlのビオチン化αIFNγ抗体7−B6−1(MABTECH)を含有するPBSを1ウェルあたり50μlを用いて、37℃で2時間インキュベートした。その後、このプレートを再度、PBS+0.1%Tween 20で4回洗浄し、そして室温で1時間事前準備したアビジン−ペルオキシダーゼ複合体VectastainABCキット(Vector laboratories)を用いて、室温で20分インキュベートした。PBS+0.1%Tween20でのさらに4回の洗浄後、50μl/ウェルの安定なDAB(Research Genetics)を室温で5分間添加した。プレートを水で3回洗浄し、そして風乾した。105細胞あたりのSFCを、実体顕微鏡を用いてカウントした(トリプレットの平均カウント)。指示された場合、αHLA−DR抗体L243(Lampson,およびLevy,J.Immunol.125:293〜9,1980)またはαHLA−A、B、C抗体B−H9(Biosource)を5μg/mlに添加した。
【0100】
(増殖アッセイ)
DMEM+5%HS中で5日間、3×103〜104の刺激因子DCとともにキラーT細胞(105)をインキュベートした。1ウェルあたり、1μCiの3H−チミジンを一晩添加し、そして自動デバイス(Skatron)によって回収し、そしてBetaplate 1205(LKB Wallac)中でカウントした。カウントは、三連の平均値を示す。
【0101】
(51Cr放出アッセイ)
50μCi Na2 51CrO4を用いて37℃で45分間、標的を標識した。標識した標的をCTLを含有するRPMI+10%FCS+2mMグルタミンを用いて4時間インキュベートした。上清をSkatron収集システムを用いて収集し、そして放射線活性をγカウンター(1470 Wizard,Wallac,Turku,Finland)中で測定した。比溶解性のパーセントは、以下である:([実験ウェルのcpm−自発的放出のcpm]/[最大放出のcpm−自発的放出のcpm])×100%。培地を用いて標識した標的をインキュベートすることによって自発的放出を決定し、そして1%Triton X−100溶液中で標的をインキュベートすることにより最大放出を決定した。
【0102】
(結果)
CD4+T細胞により認識される潜伏的EBV抗原を同定するために、CD8−CD2+末梢血液単核細胞(PBMC)を、EBV潜伏抗原(EBNA−1、3A、3B、3CおよびLMP1、2)を発現する組換えワクシニアウイルス構築物で感染した自己DCを用いて2週間刺激した。DCを用いた2つのシュミレーションの際に、増殖したCD4+T細胞(「芽細胞(blast)」)の存在によって、応答を評価した。詳細には、EBV組換え体のパネルのうち1つを用いて、培養の最初の週にCD+T細胞を刺激し、次いで、この培養物を2つに分け、第2週に、元来の組換えワクシニアウイルスを用いて、またはコントロールとしてvvTK−を用いて再刺激した。本発明者らは、初代EBV組換え体に対する特異的な,幼若化反応を見出した。7つ全てのドナーが、vvEBNA−1に対する強力な応答を示した(表1;図1A、B)。陰性コントロール(vvTK−)に対する応答は、表1から除外された1例のドナー以外は、全てにおいて弱かった(図1E)。全てのドナーは、インフルエンザ感染DC(陽性コントロールとして用いた)に応答した(図1F)。7つのドナーのうち、他のvvEBV構築物に反応したのはより少ない比率であった(すなわち、EBNA3B(4/7)、EBNA3A(1/7)、およびLMP1(3/7)(表1A))。組換えワクシニアウイルスが成熟DCのかなりの比率に感染することを確実にするため、29kDのワクシニアの初期タンパク質の細胞内発現を、フローサイトメトリーによって測定した。再現可能に、40〜60%のDCを、組換えワクシニアウイルスで感染させた。EBNA−1のCD4+認識の信頼性は、IFNγ分泌についてのELISPOTアッセイにおいて確認し得る。ここで、EBNA−1は、優先的に認識されたEBV潜伏遺伝子であった(表1B)。本発明者らは、インビトロにおけるEBNA−1に対するこれらのCD4+T細胞反応が、インビボにおける血液ドナーのEBV感染による最初のプライミングを反映しているとみなす。なぜなら、本発明者らは、EBNA−1を用いて臍帯血標品由来の新生児のT細胞を刺激した場合、2週内には幼若化反応を見出さなかったからである。本発明者らは、7つの発現されたHLA−DR4のうちの2つのみから、本発明者らのドナーがHLAクラスII多様性を示したことを証明した。
【0103】
【表1】
次に、本発明者らは、必須のMHC拘束エレメントおよび細胞株(HLA−DR4+ドナーに最初に由来する)CMを生成することによる経路のプロセシングを追及した。次いで、本発明者らは、EBNA−1を発現する組換えワクシニアウイルスで感染した、または可溶性EBNA−1タンパク質を適用した、DCとのT細胞株の反応性を試験した。内因性にプロセシングしたEBNA−1を用いてCD8−CD2+PBMCを刺激することによって、1つの株、CM171198を、確立した。従って、APCは、DR4−マッチしたB−LCL LRM、またはvvEBNA−1ΔGAで感染した自己DCのいずれかであった。後者の構築物は、MHCI提示をブロックし、そしてまたEBNA−1の発現を減じる、GA反復を欠失していた。他の株、CM110199を、外因的に供給したEBNA−1を用いて刺激した。従ってそれらの最終成熟の間、DCを、E.coli、またはバキュロウイルス−昆虫細胞系のいずれかにおいて発現した組換えEBNA−1タンパク質に暴露した。1ヶ月の培養の後、両方の株は、優先的にCD4+T細胞を含んだ(CM171198においては90%(図2A)、およびCM110199においては76%)。両方の株は以下のアッセイにおいて同様に実施した。従ってCM171198のデータのみを示す。
【0104】
CD4+T細胞株は、vvEBNA−1ΔGAで感染されるか、または組換えEBNA−1を外因的に供給されたDCを認識した(図2C、3A)。反応性は、ELISPOTアッセイにおいてIFNγ分泌として測定できる(図2)か、または増殖アッセイにおいて測定できる(図3)。T細胞応答は、抗HLA−DR抗体(L243)の添加によってブロックされたが、抗HLAクラスI抗体(B−H9)によってはブロックされなかった(図2D)。予想どおり、GA反復ドメインの存在は、このHLA−DR拘束提示に対して影響を有さなかった。なぜなら、全長vvEBNA−1で感染したDCはまた、EBNA−1発現がvvT7との同時感染によって増強され、この構築物におけるEBNA−1についてのT7プロモーターを駆動する限り、CM171198によって認識される(図2D)からである。全長EBNA−1発現ワクシニアウイルスで感染したDCにおけるEBNA−1のgly/alaマイナス形態が存在し得るが、本発明者らはまた、B−LCLの特異的T細胞認識を観察する(図3)。ここで、全長のEBNA−1のみが検出される(Blakeら、Immunity,1997,7:791〜802を参照のこと)。これは、gly/ala反復が、MHCクラスIIプロセシングおよび提示に影響を有さないことをさらに示唆する。
【0105】
さらに、EBV陰性ラモス(Ramos)バーキットリンパ球細胞株は、ワクシニアEBNA−1で感染したDCに匹敵するレベルでEBNA−1特異的T細胞を刺激した。しかしラモス細胞は、同種異系のLCL由来のEBNA−1、または高用量のEBNA−1タンパク質由来のENBA−1を捕獲できなかった。このデータは、EBNA−1が、B細胞株中で内因的にプロセシングされるという知見をさらに支持する。
【0106】
EBNA−1でチャージしたDCに加えて、CM171198細胞株は、さらなる抗原の追加なしに、EBVでトランスフォームしたB−LCLを認識した。しかし、LCL標的は、DR4対立遺伝子と適合されなければならない。従って、DR4+LCL(LRMおよびLCL−BM)は、増殖を誘導したが、DR4―細胞(LG2およびLCL−DC)は、誘導しなかった(図3B)。従って、EBNA−1特異的CD4+T細胞は、EBVでトランスフォームされたB細胞を認識するようである。
【0107】
EBNA−1がまたCD4+CTL応答のための抗原であるか否かを決定するため、本発明者らは、別の(ただし、HLA−DR4−ではない)健常ドナーJT由来のCD8−CD2+PBMCを、照射した自己B−LCL(全ての公知の潜伏性EBV抗原を発現する(KieffおよびLiebowitz(前出))を用いて、14日間刺激した(これには、7日後に再刺激1回を伴う)。CD8−CD2+T細胞の刺激に平行して、本発明者らは、バルクCD2+T細胞およびCD4−CD2+T細胞におけるB−LCLに対する応答を追跡した。51Cr放出アッセイをまず実施し、自己B−LCLに対する溶解活性を実証し、次いで異なる組換えEBV構築物で感染したDC標的を用いて、EBV特異性を評価した。刺激されたT細胞集団の内容を、FACSによって決定した。CD8−枯渇レスポンダーを、CD4+細胞について富化し(図4B)、CD4−枯渇レスポンダーを、CD8+細胞について富化し(図4C)、そしてバルクT細胞は、1:2のCD4/CD8比を有した(図4A〜C)。全てが、約25%のCD56+NK細胞を含んだ。刺激された集団の全て(すなわち、バルクT細胞(図4D)およびCD4(図4E)またはCD8(図4F))が、細胞を富化し、自己B−LCLを殺傷し、そしてT2細胞株の認識の乏しさを示した。後者は、おそらく、NK細胞が混入することが原因であり得る。しかし、著しいことに、異なるT細胞レスポンダーのEBV標的は、全く異なった(図4、G〜I)。CD4+T細胞は、好ましくは、EBNA−1、EBNA3CおよびLMP1(図4H)を認識したが、CD8+T細胞は、LMP2aを認識した(図4I)。バルクT細胞は、EBNA3C(このドナーにおけるCD4+細胞の優勢抗原)、およびLMP2a(CD8+T細胞の優勢抗原)を認識した(図4G)。
【0108】
刺激された細胞のCTL機能をさらに評価した。期待どおり、自己B−LCLの殺傷は、CD4富化集団を試験した場合のみ、L243抗HLA−DR抗体によって完全にブロックされた(図5B)。CD8富化培養物によるLCL−JT殺傷は、抗HLA−DR抗体によってブロックされず(図5C)、そしてバルクT細胞による殺傷は部分的阻害のみであった(図5A)。CD4富化T細胞はまたEBNA−1適用したDCを溶解した(図5E)が、CD8富化培養物は、溶解せず(図5F)、そしてバルクT細胞はわずかに溶解した(図5D)。従って、CD4 T細胞は、自己B−LCLを溶解し得、そしてEBVコード標的のうち1つがEBNA−1潜伏遺伝子である。
【0109】
個々のCD4+T細胞がEBNA−1および内因性にEBNA−1を発現するB−LCLでチャージしたDCを溶解したことを証明するため、本発明者らは、自己B−LCLで刺激した低温保存T細胞からの限界稀釈によってクローニングしたCD4+CTLを研究した。DC、T細胞および自己B−LCLを白血球濃縮物から誘導した。全てのEBNA−1特異的CD4+CTLは、自己B−LCLを殺傷し得る(図6A、6B)。vvTK−コントロールベクターまたはLCL721.221(HLAクラスI NK標的)で感染したDCの認識は、これらのクローンには欠しかった(図6A、6B)。従って、CD4+T細胞は、自己B−LCLを溶解し得、そして標的の1つはEBNA−1である。
【0110】
これらの知見は、EBVが潜伏的に感染したB細胞に対するCD4+T細胞の反応性を実証する。核抗原EBNA−1は、健常成人由来のCD4+T細胞によって繰り返し認識される。CD4+T細胞は、増殖、サイトカイン分泌、および細胞障害性の活性を有し得る。本発明者らが試験した他のEBV潜伏抗原(EBNA3A、3B、3C;LMP1、2;表1)はCD+T細胞によって認識され得るが、EBNA−1よりも確実性が劣った。一つのEBNA−1特異的CD4+T細胞クローンは、以前に記載されている(Khannaら、Int.Immunol.9:1537〜43,1997)。このクローンのみが、おそらく低親和性によって、内因性にプロセシングされたEBNA−1を用いて標的を殺傷した。本明細書において記載されたCD4+T細胞は、トランスフォームされたB−LCLのHLA−DR産物に存在するような生理学的な濃度でさえ、バルク培養物中で容易に同定され、そして外因性経路および内因性経路によってプロセシングされたEBNA−1を認識する。しかし、より一般的な場合、MHCクラスII上への内因性核抗原の首尾良いプロセシングは、通常ではない。ペプチドがB細胞のMHCクラスII分子から溶出した場合、同定されたペプチドの約20%のみが外因性起源である(Rammenseeら、MHC ligands and peptide motifs、Springer:Lands Bioscience,Austein,1997)。内因性に誘導されたペプチドはまた、H2−Ad上に核抗原様CBF359 〜 74(Rudenskyら、Nature、353:622〜7,1991)、HLA−DRB1*0405上にヒストンH3110 〜 127(Friedeら、前出、1996)、HLA−DRB1*0801上にc−myc371 〜 385(Chiczら、J.Exp.Med.178:27〜47,1993)、およびHLA−DRB1*1401上にヒストンH431 〜 45(Harrisら、Blood,87:5104〜12,1996)を含む。
【0111】
EBNA−1特異的CD+T細胞は、EBVトランスフォーム細胞に対して(例えば、その溶解性機能によって、またはLMP−1およびLMP−2のような他のリンパ腫関連EBV産物に対するCD8+CTL応答を維持することによって)直接の抵抗性を提供する。γヘルペスウイルスに対するCD4+T細胞防御についての環境的な証拠が文献としてかなりの量存在する。
【0112】
a)ワタの先端部のタマリンSanguinis oedipusにおけるEBVに対するCTL応答(Clearyら、Science,228:72204,1985)は、高い程度のMHCクラスII拘束に対する(Wilsonら、Clin.Exp.Immunol.,103:199〜205,1996)。MHCクラスI拘束された、EBV特異的CTLは、今日まで、この新世界ザルにおいて見出されておらず、そしてこの種は古典的なMHCクラスを欠く(しかし、これはHLA−GおよびHLA−Fのような非古典的なクラスI遺伝子の相同体を発現する(Watkinsら、Nature,346:60〜3,1990))。
【0113】
b)MHV−68による、マウスでのγ−ヘルペスウイルス感染は、IFNγを分泌するCD4+T細胞によって制御され得る(Christensenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:5135〜5140,1999)。
【0114】
c)CD4+T細胞によるバーキットリンパ腫細胞の増殖の制御は、培養物中で記載されており(Schattnerら、Blood,88:1375〜82)、そしてこのリンパ腫は、単一のEBV遺伝子(EBNA−1)だけを発現する。
【0115】
d)HIV−1感染の初期において、CD4+T細胞カウントが依然として高いが、CD4+T細胞機能が損なわれ始めた場合、患者は、単球増加ではなくバーキットリンパ腫を発生し得る(Levine,Blood,80:8〜20,1992)。
【0116】
e)CD4+反応の重要性は、SAP(T細胞同時刺激分子SLAMもしくはCDw150のインヒビター)の変異体または欠失を有する、X連鎖リンパ球増殖疾患患者においてみられるEBV誘導の感染性単球増加の原因であると考えられる(Sayosら、Nature,395:462〜9,1998)。
【0117】
f)EBNA−1に対する抗体応答は、ほとんどのドナーにおいて検出可能である(Roweら、J.Gen.Virol.69:1217〜28,1988)。このことは、本発明者が観察した、CD4+ヘルパー細胞の存在、およびEBNA−1がCD4+応答について単一の確実なEBV抗原であるということと整合性がある。
【0118】
これらの観察は、本明細書に記載される、EBNA−1に対するCD4+T細胞応答についての直接の証拠とともに、後期T細胞が、ほとんどの健常なEBV感染個体において、バーキット、ホジキン、および他のEBV関連悪性腫瘍に対する抵抗性を提供し得ることを示唆する。本発明者らのデータはまた、EBNA−1がこのような悪性腫瘍を予防および処置するための抗原として用いられ得ることを示唆する。
【0119】
例えば、EBNA−1を適用した樹状細胞を用いた上咽頭癌の免疫療法は、寛解を生じるはずである。免疫療法は、上咽頭癌を効果的に処置するのに重要であると考えられる(Tsukudaら、J.Cancer Res.Clin.Oncol.,120:115,1993)。
【0120】
上咽頭癌を処置する能力は、この疾患を管理するのに重要な進歩を示す。今までの処置としては、放射線療法、外科切除、および化学療法が挙げられる(SangurinetiおよびCorvo,Oncol.Rep.,6:377,1999)。しかし、この形態の癌は、処置が困難であり、そして処置レジメン(特に放射線療法)は、脳に対して付随する重大な損傷(例えば、放射線誘導両側性視覚神経障害)を引き起こす(Wijersら、Stohlenther.Oncol.,175:21,1999)。
【0121】
(実施例2:EBNA−1特異的CD4+T細胞は、機能において主にTH1である)
実施例1は、健常ドナー由来の血液細胞における、構成的なEBNA−1特異的CD4+T細胞応答を開示する。これらのCD4+T細胞(そのいくつかは、IFNγを分泌する)を検出するため、2週刺激培養を用いた。ここでは、DCが抗原提示細胞であり、そして精製されたCD4+T細胞がレスポンダーであった。本実施例は、EBNA−1特異的CD4+T細胞がTH1表現型に傾斜していること、およびこの応答がインビボで検出され得ることを確立する。
【0122】
(材料および方法)
(樹状細胞およびCD4+T細胞の調製)
DCの生成については、上記実施例1を参照のこと。いくつかの実験では、rEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を、成熟刺激薬とともに、示した濃度でDC細胞培養物に添加した。51Cr放出アッセイにおける標的としての使用のために、標的としての使用の前に、DCを1μg/mlのrEBNA−1タンパク質または1μg/mlのrPCNAコントロールのいずれかを用いて適用した。CD4+T細胞の陽性選択のために、CD14−細胞を、磁性マイクロビーズ(Miltenyi)に結合体化したモノクローナル抗ヒトCD4抗体で処理した。T細胞およびDCは、新鮮に、またはFCSおよび5%DMSO中での低温保存後に用いた。
【0123】
(組換えワクシニアウイルスワクチンでのDC感染)
ウイルスは以前に記載されている(Subkleweら、Eur.J.Immunol.1999,29:3995〜4001)。成熟DCを、ネガティブコントロールとしてチミジンキナーゼ(vvTK−)発現組換えワクシニアベクター、またはvvEBNA−1ΔGA発現組換えワクシニアベクターを用いて、2のMOIで37℃で1時間感染させた、そして5%ヒト血清を有する培地中で3回洗浄した。感染を、以前に記載のように(subkleweら、1999、前出)、ワクシニア早期タンパク質に対するVV1−6B6抗体を用いて、細胞内染色によって、続いてFACS分析によって、6〜12時間で検証した。DCの感染は、均一に40〜60%であった。
【0124】
(組換えEBNA−1およびPCNAコントロールタンパク質の発現および精製)
EBNA−1458 〜 641を発現ベクターpET15b(Novagen、Madison,WI)に挿入した。このベクターをE.coli BL21(DE3)pLysS細胞中にトランスフォーメーションした。増殖細胞核抗原(PCNA)がE.coli BL21(DE3)pLysS細胞(Ming Guo(コーネル医科大学、New York)より寄贈)において発現した。細菌培養物を、37℃で0.8のOD595まで増殖した。次いで、EBNA−1またはPCNA発現を1mM IPTGで3時間誘導した(GibcoBRL、Grand Island,NY)。遠心分離による回収後、細胞を50mM Na2PO4、300mM NaClおよび10mMイミダゾールに、5ml/gの細胞ペレットの容量まで、再懸濁した。リゾチームを氷上に30分間で1mg/mlまで添加し、この懸濁液を超音波処理して完全に溶解した。4℃で30分間20,000×gの遠心分離後、透明な上清を0.45μmフィルターを通して濾過し、そして溶解液10mlあたり、1mlのNi−NTAアガロース(Qiagen、Valencio、CA)を添加した。この懸濁液を4℃で1時間回転させ、そしてカラム(Biorad、Hercules、CA)に充填した。このマトリックスを、流出液のOD280が0.01未満になるまで、50mM NaH2PO4、300mM NaClおよび20mMイミダゾールで洗浄した。次いで組換えタンパク質を50mM Na2PO4、300mM NaClおよび250mMイミダゾールで溶出した。タンパク質含有画分をプールし、そしてPBSに対して4℃で一晩透析した。このタンパク質濃度を、OD280で決定し、純度をSDS PAGEで決定し、そしてEBNA−1特異的抗体(MAB8173)(CHEMICON Internat.Inc.,Temecula、CA)または6xH特異的抗体(AD1.1.10)(R&D System)を用いたウエスタンブロットによって同一性を決定した。
【0125】
(IFNγおよびIL4を分泌する細胞のELISPOTアッセイ)
ELISPOTアッセイを上記のように実施した。vvEBNA−1ΔGA応答は、それがネガティブコントロール(vvTK−)よりも10スポット多く、かつネガティブコントロールのスポットの少なくとも2倍である場合に、有意であるとみなされた。
【0126】
(EBNA−1特異的ELISPOTを産生する、CD4+T細胞の増殖)
陽性選択されたCD4+T細胞を、5%PHSを補充した培地中で、DC:T細胞比1:30で、vvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−感染DCとともに、7日間増殖した。いくつかの実験では、5μg/mlのW6/32抗MHCクラスIまたはL243抗MHCクラスIIのブロッキング抗体を、0日目、3日目、および7日目に添加した。7日目、増殖した細胞を、1μg/mlのrEBNA−1またはコントロールタンパク質であるrPCNAを適用したDCを用いて再刺激し、そしてIFNγまたはIL−4 ELISPOTについてアッセイした。他の実験では、ワクシニア増殖T細胞を、7日目に、rEBNA−1タンパク質またはPCNAコントロールタンパク質のいずれかの示された容量を適用したDCを用いて再刺激した。
【0127】
(新たに刺激されたPBMCにおけるサイトカイン分泌によるEBNA−1特異的細胞株の生成)
75×106個のPBMCを、5%PHSを補充した培地において、30:1の比率で、自己vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いて、7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたって刺激した。次いで、この細胞をMACS緩衝液で洗浄し、1800rpmで10分間遠心分離し、そして107細胞/80μl培地の濃度で、10%の胎仔ウシ血清(R10)を含む冷RPMIに再懸濁させた。次いで、抗IFNγまたは抗IL−4(Miltenyi)のいずれかに結合体化した一次抗CD45抗体を、107細胞当たり抗体10μlの比率で加えた。次いで、この細胞を5分間氷上に置き、引き続いて、温めたR10を、5×106細胞/mlの濃度まで加え、そして連続回転下で、37℃にて45分間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、細胞をMACS緩衝液で洗浄し、そして遠心分離した。このペレットを、MACS緩衝液80μl/107細胞で再懸濁し、そしてPE(Miltenyi)で標識されたIFNγまたはIL−4のいずれかに対する二次抗体10μlを、107細胞につき加えた。この細胞を、10分間氷上に置き、次いで、MACS緩衝液で洗浄し、そして遠心分離した。常磁性マイクロビーズ(Miltenyi)で標識された最後の抗PE抗体を、10μl/107細胞の比率で、4℃にて15分間加えた。上記のように磁性分離を行い、そして回収される細胞の純度を高めるために繰り返した。次いで、この細胞を遠心分離し、そして96ウェルプレートの1つのウェルにおいて、5%PHSおよび105個の照射CD14−フィーダー細胞を含む培地で培養した。この細胞を、毎週再刺激し;成熟刺激の時(5〜7日目)に、vvEBNA−1ΔGA感染DCを、2μg/mlのrEBNA−1を適用したDCと交替させる。3週間後、10U/mlのIL−2(Lymphocult、Biotest、Minneapolis、MN)を加えた。このようにして、本発明者らは、EBNA−1適用DCに反応してIFNγおよびIL−4を分泌する新鮮な血液中の細胞から株を調製し得た。
【0128】
(IFNγおよびIL−4細胞株のFACS分析および機能的分析)
上記のような株で開始してから3週間後、104個の細胞を、1:50のSimultest(CD4およびCD8、BD PharMingen、San Diego、CA)またはPE標識CD56抗体(Becton−Dickenson)によって、氷上で15分間染色した。3回の洗浄および4%のパラホルムアルデヒドによる固定後に、細胞をFACScan(Becton−Dickenson)で分析した。細胞傷害活性について、三連のこの細胞株を、指示されたエフェクター:標的の比率で、104個の標的に、5時間または24時間加えた。この標的を、50μCi Na2 51CrO4を用いて、37℃で1時間標識し、そしてR10で3回洗浄した。細胞溶解を測定するために、50μlの培養上清を、96ウェルサンプルプレートにおいて、シンチレーション流体(Wallac、Finland)100μlに加え、そしてγカウンター(1450 Microbeta counter、Wallac)において放射能を測定した。特異的溶解のパーセントを以下の式によって計算した:([cpm実験的ウェル−cpm自発的放出]/[cpm全放出−cpm自発的放出])×100%。自発的放出は、標識された標的を培地のみでインキュベートすることによって決定し;全放出は、標的を1%のTriton X−100と共にインキュベートすることによって決定した。
【0129】
(IgGサブクラスについてのELISA)
96ウェルのポリスチレンプレート(Nunc、Rochester、NY)を、PBS中のrEEBNA−1タンパク質、マンプス皮膚抗原USP(Pasteur Merieux Connaught、Swiftwater、PA)、破傷風トキソイド(Lederle、Philadelphia、PA)、PBS中のカンジダアルビカンス細胞溶解産物(Allermed Lab、San Diego、CA)1μg/ウェル、またはPBSのみで4℃で一晩コーティングした。プレートを3%の脱脂粉乳50μl/ウェルで30分間ブロックし、引き続いて、3%のBSAを含むPBS中で30分間処理した。3%のBSAにおいて1:10または1:100に希釈された試験血漿サンプルを、RTにて20分間加えた。プレートをTBST(10mMのTris、140mMのNaCl、0.05%のTween 20)で3回洗浄した。ビオチンマウス抗ヒトIgG1抗体、ビオチンマウス抗ヒトIgG2抗体、ビオチンマウス抗ヒトIgG3抗体、ビオチンマウス抗ヒトIgG4抗体(PharMingen)を1:1000でRTにて20分間加えた。プレートをTBSTで3回洗浄し、アビジン結合ビオチン化HRPをRTにて20分間加え、引き続いて、TMB基質(R&D systems)を加え、RTにてこの応答を10分間展開し、そして1MのH2(SO4)を加え、この応答を停止させ、そしてこのプレートをマイクロプレートリーダー(Dynex、Chantilly、VA)で読み取った。
【0130】
(結果)
(培養されたPBMCにおけるEBNA−1に対するCD4+T細胞応答は、主にIFNγTH1細胞に関係する)
実施例1において、本発明者らは、組換えワクシニアEBNA−1ウイルス(vvEBNA−1ΔGA)で感染させたDCによる2つの週の長さの刺激を用いて、EBNA−1特異的なIFNγ分泌CD4+T細胞を同定した。本明細書中で、本発明者らは、この応答が1日間および1週間の培養で検出され得るか評価し、そして本発明者らは、IFNγ分泌細胞およびIL−4分泌細胞の両方を数えあげた。コントロールワクシニアウイルス(vvTK−)で感染させたDCで刺激した培養において、両方の時点で、EBNA−1依存性T細胞が全く検出され得なかった。vvEBNA−1ΔGAを発現するDCで、本発明者らは、培養1日後に、3/9の正常ドナーにおいてTH1細胞を見出したが、どのドナーにおいてもTH2細胞を見出さなかった(図7A、B)。培養1週間で、8/9のドナーが、IFNγ細胞の増大を示したが、1/9のみがEBNA−1依存性IL−4分泌を有した(図7A、B)。1つのIL−4分泌において、IFNγ ELISPOTSの数はIL−4 ELISPOTSより3倍多かった。従って、ほとんどのドナーにおいて、EBNA−1応答性CD4+T細胞がTH1表現型を有し、IFNγを分泌し、そしてIL−4を分泌しない。他者らが、EBNA−1特異的T細胞応答が、表現型においてTH1でなくTH2であると見出した(Steigerwald−Mullenら、J.Virol.、2000、74:6748−6759を参照のこと)ことを考えると、これは、驚くべき予想外の結果である。
【0131】
これらのCD4+T細胞応答がMHCクラスII拘束されたことを確証するために、本発明者らは、MHCクラスI(W6/32)またはHLA−DR(L243)に対するブロッキング抗体の非存在下、あるいは存在下で、vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いてT細胞を1週間刺激した。IFNγ分泌細胞をELISPOTによって数えあげた場合、3つの実験において、88〜100%の範囲で、L243モノクローナル抗体のみが応答を減少させた。本発明者らは、EBNA−1に対するCD4+T細胞応答は、主にMHCII拘束され、そしてTH1型であると結論付ける。
【0132】
図7のおける実験は、EBNA−1特異的細胞を1週間増大させるためとELISPOTアッセイにおける1日間の再刺激ための両方のために、ワクシニアベクターを用いた。従って、次いで、本発明者らは、ELISPOTアッセイにおける抗原としての精製されたEBNA−1タンパク質の効力を試験した。IPTG誘導後に、EBNA−1配列のアミノ酸458〜641からなる組換えEBNA−1タンパク質、またはコントロールタンパク質としてのrPCNA、形質転換されたE.coli培養物から抽出した。この抽出物を、PBSに対して一晩透析し、そしてSDS PAGEおよびウェスタンブロットによって、純度および特異性について調べた(図8A)。これらのタンパク質を、濃度を変える際に、DCに対して適用させ、そして、一週間の増大の後、vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いてIFNγ ELISPOTを読み取るために使用した。図8Bは、PCNAコントロールと比較した場合の、rEBNA−1タンパク質の滴定を用いて観察された用量応答曲線を示す。差し込みグラフは、vvTK−またはvvEBNA−1ΔGAで再刺激されたvvEBNA−1ΔGA増大細胞の応答を比較する。DCに対して適用されたrEBNA−1タンパク質の1μg/mlのみの用量が、組換えワクシニアEBNA−1の応答に匹敵する応答を与えた。この結果は、EBNA−1特異的TH1細胞が、とても低い用量のEBNA−1に対応し得ることを示す。
【0133】
(エキソビボで直接単離された、EBNA−1特異的なサイトカイン分泌細胞は主にCD4+である)
大半のドナーからのEBNA−1特異的ELISPOT応答は、TH1非対称(skewing)サイトカインIL−12(Cellaら、J.Exp.Med.、1996、184:747−752;Kochら、J.Exp.Med.、1996、184:741−746)の高いレベルを作製する、DCとのCD4+T細胞の1週間の培養を必要とするので、本発明者らは、EBNA−1特異的細胞をエキソビボで直接単離した。6つのドナー由来の新鮮なPBMCを、vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いて、7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)刺激した。次いで、この細胞を抗IFNγまたはIL−4抗体のいずれかに結合体化した抗CD45抗体で標識した。このようにして、サイトカインを分泌した細胞は、PEで標識された、IFNγまたはIL−4の別のエピトープに特異的な二次抗体を捕捉する。磁性マイクロビーズに結合体化した最後の抗PE抗体を加え、そしてこの細胞を磁場において選択した。この回収した細胞を、毎週の再刺激によって増大させ、vvEBNA−1ΔGA感染DCをrEBNA−1タンパク質を適用されたDCと交替させた。
【0134】
6つ全てのドナーにおいて、EBNA−1特異的なIFNγ分泌細胞株を確立し、そして3/6のドナーにおいて、IL−4分泌株を確立した。これらの株を(CD56、CD4またはCD8について)FACSによって分析すると、IFNγ株とIL−4株の両方は、主にCD4+細胞からなっていた。図9は、3つのドナー由来のIFNγ分泌株(すなわち、90%より多くのCD4を発現した細胞、および2%未満がCD8またはCD56(データは示さず))を示す。同様に、EBNA−1特異的IL−4分泌株は、90%より多くのCD4および2%未満のCD8またはCD56細胞からなる(データは示さず)。本発明者らは、健康な成体におけるEBNA−1特異的なサイトカイン分泌CD4+T細胞は、すでにインビボで分化されている(図9)が、これらの細胞は、代表的に、ELISPOTアッセイで検出されるため、インビトロで自己DCによって1週間増大させなくてはならない(図7)と結論付ける。
【0135】
(EBNA−1特異的TH2 CD4 T細胞ではなくEBNA−1特異的TH1 CD T4細胞は、EBNA−1発現DCを溶解し得る)
本発明者らは、EBNA−1特異的T細胞株は、EBNA−1タンパク質の異なる供給源を適用された自己B−LCLおよびDCを殺傷し得ることを示した。本発明者らは、他の抗原に対して特異的なCD4+T細胞によって観察されたように(Erbら、CellImmunol.、1991、135:232−44;Erbら、J.Immunol.、1990、144:790−795;Del Preteら、J.Exp.Med.、1991、174、809−13;Nishimuraら、J.Exp.Med.、1999、190、617−628)、この機能が、主にTH1株にって発現されるかについて評価した。5つのドナーからのIFNγ細胞株および3つのドナーからのIL−4株を、細胞傷害性およびELISPOTアッセイにおいて同時に研究した。EBNA−1依存性のIFNγまたはIL−4産生に基づいて、新鮮なPBMCから単離された細胞株は、外因性のIL−12またはIL−4の非存在下における数週間の刺激の後、TH1またはTH2極性を維持した(図10A、B)。本発明者らが、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DC、rEBNA−1タンパク質を負荷したDC、または自己B−LCLの溶解を試験すると、TH1株のみが、コントロールに対して、EBNA−1発現標的を溶解し、一方、TH2細胞株はIL−4の分泌を有するEBNA−1発現DCを認識した。図10C、Dは、段階的なエフェクター(Effector):標的(Target)比率でのこのデータを示し、一方、図10Eは、E:T比率が10:1でのいくつかの株についての殺傷をまとめる。TH2でなくTH1細胞株が、細胞溶解活性を有した(図10E)。
【0136】
(インビボのEBNA−1特異的IgGサブクラスはTH1免疫を反映する)
インビボでEBNA−1特異的なTH1およびTH2細胞の相対的活性を評価するために、本発明者らは、抗体応答のIgGサブクラスをモニターした。TH1サイトカインは、IgG1アイソタイプに対して抗体応答をゆがめ、そしてTH2はIgG4に対してゆがめたが、ヒトにおけるIgGサブクラスの分布は、マウスについて記載されたのと同じ程度厳密に偏向されない可能性がある(Bonifacioら、J.Immunol.、1999、163、525−32;Sousaら、Clin.Exp.Immunol.、1998、111、48−55;Hussainら、Immunology.、1999、98、238−43)。IgGサブクラスに対するELISAアッセイを用いて、7つのドナーにおけるEBNA−1特異的IgG抗体のアイソタイプを記載した。抗原として、本発明者らは、市販で入手可能なEBNA−1由来のgly−ala反復配列またはE.coliベクターによって発現されたC末端rEBNA−1タンパク質のいずれかを用いた。7つ全てのドナーが、それらのEBNA−1応答において、IgG1抗体の明確な優性を示した(図11)。これは、本発明者らが試験した3つの他の抗原(マンプス皮膚抗原、破傷風トキソイドおよびカンジダ溶解産物;図11)に対する応答と対照的であるが、2つのドナーは破傷風トキソイドに対して強いIgG1応答を示した。PBMCの新鮮および1週間の培養物おけるIFNγ分泌T細胞の即座の検出と組み合わせられた、抗体データは、健康なEBVキャリアにおけるインビボのEBNA−1に対する応答は、一貫してTH1型であることを示す。
【0137】
(考察)
新しいデータは、健康なEBVキャリアが、インビボでEBNA−1に対して、一貫してTH1型応答をなすことを示す。これらのT細胞は、血液中に存在し、そしてIgG1アイソタイプに対するEBNA−1抗体応答の明白な偏りの原因となる可能性がある(図10)。B細胞およびB細胞株は、IL−12を活発に産生することも、CD4+T細胞応答をTH1に偏向させることも知られていないので、本発明者らは、この様式において、DCがT細胞をゆがめるのを担うと推測する。ヒトDCは、瀕死のEBV感染B細胞由来のEBNA−1を効率的にプロセシングすること(Menzら、J.Exp.Med.、2000、191、1649−60)、そしてマウスのDCはインビボでTH1型にT細胞をゆがめること(Pulendranら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1999、96:1036−1041;Maldonado−Lopezら、J.Exp.Med.、1999、189:587−592)は現在公知である。ヒトのB細胞が、DCをインビボでEBNA−1を提示させるために、溶解性感染を受けなければならない場合、EBV感染に典型的である(RickinsonおよびKieff、Esptein−Barr Virus.In Virology.B.N.Fields、D.M.KnipeおよびP.M.Howley編 1996、Lippincott−Raven、Philadelphia.2397−2446)ように、EBNA−1特異的抗体の開発において遅延が予期される。従って、本発明者らは、EBNA−1に対するTH1の応答が、EBNA−1免疫の直接誘発物質として、感染B細胞と比べたDCについての優勢的役割を反映すると示唆する。
【0138】
CD4+T細胞は、ウイルス感染および腫瘍に対する耐性において重要である。HIV−1感染において、強力なCD4+T細胞応答が、長い期間の非プログレッサー(nonprogressor)で見出される(Rosenbergら、Science、1997、278:1447−1450)。HIV感染患者のこの少数派は、抗レトロウイルス治療なしで、高いCD4+T細胞数および低いウイルス負荷を有する。これらはまた、HIVp24およびgp160タンパク質に対してより強力なCD4+T細胞の増殖応答を示す。慢性的ウイルス感染におけるCD4+T細胞の役割は、マウスでより直接的に評価された(Cardinら、J.Exp.Med.、1996、184:863−871)。マウスのMHV−68γ−ヘルペスウイルスによる1次感染は、MHCクラスII−/−および+/+マウスにおいて同様に消散する。しかし、初期感染から3週間後に、このウイルスは、MHC IIノックアウトマウスにおいて再発し、次いでるいそうを発症し、そして4週間以内にこのマウスの大部分が死滅する。これは、初期ウイルスクリアランスが起こるという事実にもかかわらず、明らかにCD8+T細胞の細胞傷害性を通じて起こる。類似の知見が、CD4−/−マウスおよび野生型マウスにおけるLCMV感染に対するCD8+エフェクター機能の研究においてなされた(Zajacら、J.Exp.Med.、1998、188、2205−2213)。CD4−/−マウスは、より広範かつ慢性的な感染を引き起こすLCMV改変体を排除するのに失敗し、そしてこの改変体特異的CD8+Tリンパ球は、リンパ球の活性マーカーの発現にもかかわらず、(IFNγ分泌によって測定される場合)非機能的である。総合して、これらの結果は、CD4+T細胞がウイルス(KalamsおよびWalker、J.Exp.Med.、1998、188:2199−2204に概説される)および腫瘍(Toesら、J.Exp.Med.、1999、189:753−756に概説される)に対して有効なCD8+T細胞機能を維持するという新たな総意の一部である。
【0139】
CD4+T細胞についてのこの役割の基礎をなす機構は、抗原発現細胞、特にDCの機能改善を伴う可能性がある(Schoenbergerら、Nature、1998、393:480−483;Ridgeら、Nature、1998、393:474−478;Bennettら、Nature、1998、393:478−480)。CD4+T細胞との相互作用に引き続いて、DCは、それらの最初の増大と維持の両方において、CD8+T細胞のより有効な刺激物質となり得る。CD8+T細胞より活性化CD4+T細胞において大量に発現する、CD40Lは、DCに対する刺激物として、強く意図される。CD4は、DCにおいて豊富で、そしてその連結は、DCの発生および機能におけるいくつかの重要な工程を媒介する。これは、CD34+前駆体からのそれらの発生(Flores−Romoら、J.Exp.Med.、1997、185:341−349)、末梢組織からの動員(Moodycliffeら、J.Exp.Med.、2000、191:2011−20)、成熟(Cauxら、J.Exp.Med.、1994、180:1263−1272)、生存(Josienら、J.Exp.Med.、2000、191:495−501)およびサイトカイン分泌(特に、IL−12)(Cellaら、J.Exp.Med.、1996、184:747−752;Kochら、J.Exp.Med.、1996、184:741−746)を包含する。
【0140】
TH1は、ウイルスおよび腫瘍に対する耐性においてTH2 CD4+細胞より重要である。ヒトにおいて、TH1 CD4+Tリンパ球は、腎臓移植レシピエントにおいて一次CMV感染に耐性であるということが提案されている(Rentenaarら、J.Clin.Invest.、2000、105:541−8)。CMVポジティブ腎臓のCMVセロネガティブレシピエントを、移植後CMV特異的免疫応答についてモニターした。評価された全ての患者において、分極されたTH1応答が観察された。これらの患者は、免疫抑制性療法にもかかわらず、慢性のCMV疾患の徴候なしに、急性感染から回復した。さらに、マウスモデルの研究は、免疫学的耐性におけるTH1 CD4+細胞の重要性を強調する。オボアルブミンが代理抗原として腫瘍において発現される場合、オボアルブミン特異的TH1細胞の養子移入が、この抗原に対する同一のT細胞レセプターによるTH2細胞の養子移入よりも強いCD8+T細胞記憶を導いた(Nishimuraら、1999、上記)。IL−12と組み合わせたインフルエンザサブユニットワクチンで免疫された新生児マウスは、増強されたTH1サイトカイン発現を示し、そしてインフルエンザウイルスによるチャレンジ後に、インフルエンザサブユニットワクチンのみで免疫された新生児マウス間での55%の生存率と比較して、100%の生存を示した(Arulanandamら、J.Immunol.、2000、164:3698−704)。最近の研究は、水疱性口炎ウイルス(VSV)糖タンパク質に対して特異的な同一のTCR導入遺伝子を発現するTH1細胞およびTH2細胞のTCRβ−/−δ−/−マウスへの養子移入を利用した(Maloyら、J.Exp.Med.、2000、191:2159−70)。TH1とTH2の両方のT細胞は、ほぼおそらく、中和抗体の生成を通じて、VSV感染に対して組織的防御を与えた。しかし、TH1 CD4+T細胞のみは、致死的な鼻腔内感染に対して防御し得、そしてDTH応答を誘発し得た。これらの例は、一次ウイルス感染の制御、ならびに免疫的記憶の発生および維持におけるTH1 CD4+T細胞の重要な役割を示す。
【0141】
TH1 CD4+T細胞の防御的機能について可能な機構がいくつか存在する。IFNγ分泌は、B細胞を含む種々の細胞の型に影響を及ぼし、ここでは、IgGサブクラスを、マウスにおいてIgG2aに(Arulanandamら、2000、上記)、およびヒトにおいてIgG1に(Bonifacioら、1999、上記;Sousaら、1998、上記;Hussainら、1999、上記)、変更することに影響を及ぼす。これらの抗体は、オプソニン作用の有効性および補体の固定を増強し得る。インフルエンザに対するワクチン接種の前にIL−12を与えられた、新生児マウス由来の血清は、高められたレベルのインフルエンザ特異的なTH1依存性IgG2a抗体を示した(Arulanandamら、2000、上記)。これらのマウスからB細胞欠損マウスへの血清の受動移入は、生きたインフルエンザのチャレンジに対して、IL−12なしでワクチン接種されたマウス(これは、主にIgG1インフルエンザ特異的抗体を有する)由来の血清より良好な防御を与えた。しかし、他の研究において、サブクラスでなく、IgG抗体の量がウイルスチャレンジに対して防御を与えるのに重要であった(Backmannら、Science、1997、276:2024−2027)。TH1またはTH2のいずれかのトランスジェニックVSV特異的CD4+T細胞を注射されたTCRβ−/−δ−/−マウスは、VSVに対して分極されたIgG抗体を生成し、この両方が、防御免疫を与えた(Maloyら、2000、上記)。興味深いことに、本発明者らは、B細胞からの強い産生応答を指揮するDCの能力(Fayetteら、J.Exp.Med.、1997、185:1909−1918;Duboisら、J.Exp.Med.、1997、185:941−951)と一致して、EBNA−1に対するヒトのIgG,TH1型抗体応答は、他の抗体応答に大変大きく相関することを発見する(図11)。
【0142】
TH1 CD4+T細胞はまた、細胞傷害性を通じてウイルス感染を制御し得る。本研究において、TH1細胞のみが、EBNA−1発現標的を溶解し得る(図10)。TH1細胞に対する細胞傷害性の制御は、以前に記載された(Bonifacioら、1999、上記;Sousaら、1998、上記;Hussainら、1999、上記)。同様に、オボアルブミン特異的TH1およびTH2細胞がTCRトランスジェニックマウスから生成され、そしてオボアルブミンを発現するマウスの腫瘍細胞を溶解するそれらの能力について試験したモデルにおいて、IFNγ分泌CD4+T細胞のみが、腫瘍細胞を溶解した(Hussainら、1999、上記)。
【0143】
重要なことに、TH1細胞およびTH2細胞は、感染部位へホーミングする能力が異なる(Austrupら、Nature、1997、385:81−83;O’Garraら、Curr.Biol、1998、8:R646−9)。TH2細胞でなくTH1細胞は、感染組織で産生される対応するケモカイン(MCP−1、MigおよびIP−10)に応答して移動する(Maloyら、2000、上記)。これは、ケモカインレセプターの異なった発現(CCR2、CCR5およびCXCR3を発現するTH1細胞、ならびにCCR4を発現するTH2細胞)に起因する。
【0144】
上述されるように、腫瘍免疫のマウスのモデルにおいて、TH1またはTH2のいずれかの細胞の養子移入は、腫瘍を根絶するが、TH1細胞のみが腫瘍の再チャレンジに対して免疫記憶を発生させた(Hussainら、1999、上記)。興味深いことに、腫瘍根絶の機構は、2つの型のヘルパー細胞の間で大変異なっているように思われた。TH1細胞を受けたマウスにおいて、腫瘍は、主にリンパ球によって浸潤された。逆に、TH2細胞を受けたマウスは、好酸球および好中球によって特徴付けられた腫瘍浸潤を示した。
【0145】
EBNA−1タンパク質は、EBV関連の癌の全ての型において発現される単独のEBV潜伏タンパク質であり、そしてTH1 CD4+T細胞応答を誘発するので、このタンパク質は、ワクチン接種(特に、小児におけて)に対して、そしてEBV関連悪性疾患のための免疫療法に対して、新たな焦点を提供する。さらに、TH1応答に対する分極したEBNA−1特異的CD4+Tリンパ球を標的とする療法は、免疫原性DCへのEBNA−1の標的化に最も関与する。
【0146】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されない。実際、本発明の種々の改変は、本明細書中で記載される改変に加えて、前述の記載および添付の図面から、当業者に明らかである。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図する。
【0147】
さらに、全ての値はおよそであり、そして説明のために提供されることが理解されるべきである。
【0148】
本明細書中で引用される、全ての特許、特許出願、刊行物、および他のものは、それら全体において、ここに本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1A】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1B】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1C】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1D】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1E】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1F】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図2A】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図2B】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図2C】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図2D】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図3】種々のEBNA−1発現標的に対するCM171198細胞株の増殖応答。A:DC(DCのみ)およびT細胞(T細胞のみ)は、低いバックグラウンド増殖を示す。混合された場合(0)、ベクター単独(vvTK−)ではなくEBNA−1を発現する組換えワクシニアウイルス構築物(vvEBNA−1ΔGA)での感染に際して増加され得るいくらかの増殖が存在する。E.coli(eEBNA−1)およびバキュロウイルス/昆虫細胞(bEBNA−1)発現系由来の組換えEBNA−1タンパク質でのDCの外部負荷もまた、増殖を強めたが、E.coli由来のコントロールタンパク質(eコントロール)に対する反応性はなかった。B:CM171198細胞株とHLA−DR4対立遺伝子を共有するB−LCLは増殖を誘導する(LRMおよびLCL−BM)が、HLA−DR4が一致しないB−LCLは誘導しない(LG2およびLCL−DC)。
【図4A】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4B】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4C】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4D】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4E】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4F】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4G】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4H】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4I】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図5A】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5B】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5C】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5D】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5E】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5F】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図6A】CD4+CTLクローンの特異性。B−LCLを、2つの白血球濃縮物のサンプルから生成した。次いで、低温保存されたCD8−CD2+PBMCを、限界希釈下でこれらの自己B−LCLで2週間刺激した。その後、ウェルを分割し、そしてvvEBNA−1ΔGA(白色棒)またはvvTK−(黒色棒)感染DC、ならびに自己B−LCL(灰色棒)およびLCL721.221(第2の白色棒)、HLAクラスI NK標的に対する51Cr放出アッセイにおいて試験した。EBVトランスフォームB細胞上のEBNA−1エピトープを認識する11個のクローンを示す。これらは、2回の独立した実験(A,B)において2つの白血球濃縮物に由来した。
【図6B】CD4+CTLクローンの特異性。B−LCLを、2つの白血球濃縮物のサンプルから生成した。次いで、低温保存されたCD8−CD2+PBMCを、限界希釈下でこれらの自己B−LCLで2週間刺激した。その後、ウェルを分割し、そしてvvEBNA−1ΔGA(白色棒)またはvvTK−(黒色棒)感染DC、ならびに自己B−LCL(灰色棒)およびLCL721.221(第2の白色棒)、HLAクラスI NK標的に対する51Cr放出アッセイにおいて試験した。EBVトランスフォームB細胞上のEBNA−1エピトープを認識する11個のクローンを示す。これらは、2回の独立した実験(A,B)において2つの白血球濃縮物に由来した。
【図7】EBNA−1特異的T細胞応答は、TH1サイトカイン分泌によって支配される。CD4+T細胞を、vvEBNA−1ΔGAまたはvvTK−(ネガティブコントロール)に感染させた樹状細胞で刺激し、そしてT細胞単離の日(1日目)および1週間の増大後(7日目)におけるIFN−γ(A)またはIL−4(B)のその分泌を試験した。示される値は、三連の平均であり、そしてEBNA−1特異的スポットの数からネガティブコントロールを差し引くことによって導き出された。vvTK−コントロールの値は、0〜105の範囲であった。vvEBNA−1ΔGA応答は、それがvvTK−ネガティブコントロールよりも少なくとも10スポット多く、かつネガティブコントロールのスポットの少なくとも2倍である場合に、有意とみなした。
【図8A】EBNA−1特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えEBNA−1タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原(PCNA)タンパク質を、E.coli発現ベクターから溶出した。A.タンパク質を、一晩透析し、そしてSDS PAGEで純度について試験した。回収されたrEBNA−1タンパク質を、抗EBNA−1抗体MAB8173を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体AD1.1.10は、rEBNA−1タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。B.vvEBNA−1ΔGA感染DCを使用して、1週間の培養においてCD4+T細胞を増大させた。増大させたT細胞を、示される濃度のrEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を適用したDCを用いて最刺激し、そしてELISPOTで読み取った。rEBNA−1タンパク質を、DC培養の成熟相(6〜8日目)の間にDCに添加した。差込みグラフは、1週間vvEBNA−1ΔGA感染DCで増大され、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−コントロールのいずれかで再刺激されたCD4+T細胞に関するELISPOT結果を示す。
【図8B】EBNA−1特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えEBNA−1タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原(PCNA)タンパク質を、E.coli発現ベクターから溶出した。A.タンパク質を、一晩透析し、そしてSDS PAGEで純度について試験した。回収されたrEBNA−1タンパク質を、抗EBNA−1抗体MAB8173を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体AD1.1.10は、rEBNA−1タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。B.vvEBNA−1ΔGA感染DCを使用して、1週間の培養においてCD4+T細胞を増大させた。増大させたT細胞を、示される濃度のrEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を適用したDCを用いて最刺激し、そしてELISPOTで読み取った。rEBNA−1タンパク質を、DC培養の成熟相(6〜8日目)の間にDCに添加した。差込みグラフは、1週間vvEBNA−1ΔGA感染DCで増大され、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−コントロールのいずれかで再刺激されたCD4+T細胞に関するELISPOT結果を示す。
【図8C】EBNA−1特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えEBNA−1タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原(PCNA)タンパク質を、E.coli発現ベクターから溶出した。A.タンパク質を、一晩透析し、そしてSDS PAGEで純度について試験した。回収されたrEBNA−1タンパク質を、抗EBNA−1抗体MAB8173を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体AD1.1.10は、rEBNA−1タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。B.vvEBNA−1ΔGA感染DCを使用して、1週間の培養においてCD4+T細胞を増大させた。増大させたT細胞を、示される濃度のrEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を適用したDCを用いて最刺激し、そしてELISPOTで読み取った。rEBNA−1タンパク質を、DC培養の成熟相(6〜8日目)の間にDCに添加した。差込みグラフは、1週間vvEBNA−1ΔGA感染DCで増大され、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−コントロールのいずれかで再刺激されたCD4+T細胞に関するELISPOT結果を示す。
【図9】新鮮な血液由来のEBNA−1特異的細胞は、CD4+T細胞である。新鮮な単離されたPBMCを、IFNγの最大産生のための7時間か、またはIL−4のための18時間のいずれかにわたって、vvEBNA−1ΔGA感染樹状細胞で刺激した。次いで、これらを、IFNγまたはIL−4のいずれかの選択に基づいて、陽性選択した。IFNγ細胞株を、6/6のドナーにおいて確立し、そしてIL−4細胞株を3/6のドナーにおいて確立した。示されるのは、FACSによって分析された3つのIFNγ株のコントロール株(A,B,C)CD4およびCD8株(D,E,F)である。ゲート(gate)を、ヨウ化プロピジウム染色によって決定されるような、リンパ球集団および生細胞に対して設定した。
【図10A】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10B】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10C】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10D】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10E】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図11A】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11B】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11C】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11D】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11E】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
本研究は、国立衛生研究所助成金番号KI2−HD00850、ならびにNIAID助成金番号AI40045およびAI40874によって一部支援された。従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、エプスタイン−バーウイルス感染を予防または処置するためのワクチンの同定に関する。特に、EBNA−1抗原を、ワクチン抗原として同定した。EBNA−1への暴露が、ヒトおよび動物におけるその免疫防御効果について開発され得る。
【0003】
(発明の背景)
EBVは、Bリンパ球に対する親和性(tropism)を有する、ヒトγヘルペスウイルスである(KieffおよびLiebowitz,Virology,Fields,B.N.,Knipe,D.M.ら編,1889−1919頁,Raven Press,Ltd.:New York,1990)。成体集団のうちの95%より多くが、一生無症候性の感染としてEBVを保有する。しかし、EBVは、強力な増殖トランスフォーミング能力を有し(Klein,Cell,77:791−3,1994)、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、T細胞リンパ腫、胃癌、および子宮平滑筋肉腫を含む、一定範囲のEBV関連悪性疾患において、B細胞そしておそらく他の細胞型をトランスフォームする。
【0004】
3つの特定のEBV遺伝子が、腫瘍形成のために重要であり、そして細胞増殖ならびにアポトーシスに対する耐性を誘導する(Gregoryら,Nature,349:612−4,1991)。EBNA−1は、ダイマーとして、ウイルス複製起点と宿主細胞DNAとを連結し、そしてB細胞増殖の間のエピソーム性の複製を保証する(Bochkarevら,Cell,84:791−800;Shahら,J.Virol.,66:3355−62,1992)。この2つの潜伏性膜タンパク質(LMP)は、異なる役割を有する。LMP1のC末端部分は、CD40媒介性B細胞活性化を模擬することによって、直接的なオンコジーンとして作用し得る(Wangら,Cell,43:831−40,1985)(BuschおよびBishop、J.Immunol.162:2555−2561、1999)。従って、LMP1は、腫瘍壊死因子レセプターファミリーについてのシグナル伝達タンパク質に関与し(Mosialosら,Cell,80:389−99,1995)、そしてbcl−2の誘導によるアポトーシスに対して防御する(Hendersonら,Cell,65:1107−15,1991)。LMP2は、sykおよびlyn、タンパク質チロシンキナーゼを構成的に保証(engage)することによって、B細胞レセプターシグナル伝達を模擬する(Caldwellら,Immunity,9:405−11,1998)。これらの3つのタンパク質は、大半のEBV誘導性腫瘍において発現される排他的なEBV遺伝子であるようである(Millerら,Virology,Fields,B.N.,Knipe,D.M.ら編,1921−1958頁,Raven Press,Ltd.:New York,1990)。バーキットリンパ腫では、EBNA−1のみがEBVの永続性に必要とされる。なぜなら、トランスフォーメーションが、染色体転座を通したc−mycの開放を含むさらなる機構によって達成されるからである(Klein、前出)。
【0005】
大半のEBVキャリアがトランスフォーメーションを回避する理由は、未だ解明されていない。経験的にEBNA−1に対する免疫は、トランスフォーム細胞に対する耐性を提供し得るが、EBVの永続性のためのこの必須のタンパク質に対する特異的T細胞応答を検出することは困難であることが証明されている。実際、EBNA−1は、MHCクラスI提示のためのその自己のプロセシングをブロックする(Blakeら,Immunity,7:791−802,1997)。これは、N末端GA反復ドメインによって引き起こされる、そのプロテアソームのプロセシングにおける欠損に起因していた(Levitskayaら,Nature,375:68508,1995)。同様のGAストレッチは、プロテアソームによるIκBα分解を妨げる(Sharipoら,Nat Med.,4:939−44,1998)。他のEBV潜伏遺伝子産物は、強力なMHCクラスI拘束CTL応答、特にEBNA3A、3Bおよび3Cに集中する(Stevenら,J.Exp.Med.,184:1801−13,1996)。しかし、EBNA3タンパク質は、上記で言及したEBV関連腫瘍の大半において発現されず、そして代わりに、培養されたトランスフォーム株(B−LCL)および免疫抑制された患者における免疫細胞増殖性症候群(lymphoproliferative syndrome)において発現される。腫瘍関連LMP1タンパク質(Khannaら,Eur.J.Immunol.,28:451−8,1998)およびLMP2タンパク質(Leeら,Eur.J.Immunol.,26:1875−83,1996)に対するCD8+CTL応答が検出されたが、時折のみであった。
【0006】
有効なCD8+CTLの発達および持続は、CD4+T細胞の補助に依存することが明らかとなりつつある(KalamsおよびWalker,J.Exp.Med.,188:2199−204,1998)。CD4+T細胞によるEBV産物の認識は、CD8+応答と同じように詳細には研究されていなかった(RickinsonおよびMoss,Ann.Rev.Immunol.,15:405−31,1997)。樹状細胞(DC)は、CD4+およびCD8+T細胞免疫に対する強力な抗原提示細胞である(BanchereauおよびSteinman,Nature,392:245−52,1998)。
【0007】
従って、エプスタイン−バーウイルスにおける防御抗原を同定する試みは、結論に達しておらず、そして感染からの完全な防御を提供するために、単一の抗原が必要とされるのか、または、複数の抗原が必要とされるのかは、未だ知られていない。さらに、EBNA−1は、このウイルスに対する防御免疫を誘発するとは考えられない。
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、EBV由来の免疫防御抗原を有利に同定し、これは、ヒトにおけるEBV感染を予防または処置するためのワクチンおよび免疫療法アプローチにおいて使用され得る。
【0009】
1つの実施形態では、本発明は、免疫原性EBNA−1ポリペプチドおよびヒトにおける使用に受容可能なアジュバントを含むワクチンを提供する。この免疫原性EBNA−1ポリペプチドは、EBNA−1と異種アミノ酸配列との融合タンパク質であり得る。
【0010】
別の実施形態では、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された、免疫原性EBNA−1ポリペプチドをコードする配列を含む、ヒトにおける発現のための発現ベクターを提供する。本発明の好ましいベクターは、好ましくは、樹状細胞を標的化する。本発明は、詳細には、ウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘、AV−ポックス、および改変ワクシニアAnkara(MVA)ウイルスを意図する。
【0011】
また、エプスタイン−バーウイルスによる感染から被験体を防御するための方法を提供する。1つのこのような方法は、免疫学的に有効な量の免疫原性EBNA−1ポリペプチドを被験体に送達する工程を包含する。別のこのような方法は、免疫学的に防御する量の本発明の発現ベクターを被験体に送達する工程を包含する。好ましくは、このような発現ベクターは、インビボで樹状細胞を標的化する。これらの方法は、EBV関連新生物(例えば、上咽頭癌(しかし、これに限定されない))を予防または処置するために有用である。
【0012】
本発明をさらに、以下の詳細な説明の節および実施例の節において説明および例示する。
【0013】
(発明の詳細な説明)
本発明は、エプスタイン−バーウイルス(EBV)の防御抗原に関する予想外の発見に一部基づく。大半のEBVセロポジティブ成体において、強力なCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答が示された(Murrayら,J.Exp.Med.,1992,176:157−168)。しかし、これらは、核抗原、EBNA3A、3B、および3Cに対して優先的に指向され(Kieff,E.,Epstein−Barr Virus and Its Replication.In Fields Virology.B.N.Fields,D.M.Knipe,およびP.M.Howley編.1996,Lippincott−Raven Publishers,Philadelphia.2343−2396;Khannaら J.Exp.Med.,1992,176:169−176)、これらは、多くのEBV関連悪性疾患では発現されない。EBVトランスフォーム細胞は、発現されたEBV抗原のパネルによって互いから識別可能な3つの潜伏表現型のうちの1つを示す(Murrayら,1992,前出)。潜伏I(例えば、バーキットリンパ腫)では、EBNA−1のみが発現される。潜伏II(ホジキンリンパ腫によって例示される)では、LMP1およびLMP2、ならびにEBNA−1が発現される。潜伏IIIの免疫芽球性リンパ腫においてのみ、高度に免疫原性なEBNA3遺伝子が発現される。従って、多くのEBV関連悪性疾患は、EBV潜伏遺伝子産物に対するヒトCD8+T細胞応答に対する良好な標的を提供しないようである。
【0014】
本発明における証拠は、予想外に、エプスタイン−バーウイルス(EBV)がコードする核抗原(EBNA−1)がEBVワクチン、特に抗腫瘍ワクチンを開発するための有効な抗原であることを示唆する。EBNA−1免疫は、ウイルス複製を顕著に減少させる。なぜなら、この抗原は、EBVトランスフォームされたヒトB細胞を複製するにおいてEBVエピソームの維持のために重要であるからである(Yates,et al.,Nature,313:812−5,1985)。従って、すべてのEBV誘導された腫瘍は、この外来抗原を発現する。しかし、EBNA−1タンパク質は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)に対しては不可視である。gly−ala反復ドメインは、プロテアソーム依存性プロセシングを防ぎ、従って、MHCクラスIにおける提示を防ぐ(Levitskaya,et al.,前出)。今や、ほとんどの個体からのCD4+T細胞がEBNA−1に応答することが見出された。実際、CD4+細胞を刺激するEBV潜在抗原のうち、EBNA−1が優先的に認識される。認識は、樹状細胞(DC)のMHCクラスII分子におけるEBNA−1の内因的および外因的プロセシングを介して生じ得る。CD4+の応答としては、トランスフォームされたBリンパ球細胞株(B−LCL)の直接の細胞溶解が包含される。従って、この免疫系は、EBV維持のために重要であるEBNA−1タンパク質を認識し得る。
【0015】
この型のCD4+T細胞もまたこの応答に影響を与える(以下に概説される:O’Garra,and Murphy,Curr.Opin.Immunol.,1994,6:458−66.20)。TH1 CD4+細胞は、IFNγを分泌し、そして細胞性免疫の発達を支援する。これには、マクロファージの活性化が含まれる。TH2 CD4+細胞は、IL−4およびIL−5を分泌し、それにより、好酸球および抗体産生を刺激する。TH1細胞における特定のケモカインレセプターの発現は、TH1細胞の炎症の正常部位への移動を生じる。TH2細胞は、アレルギー性の応答により密接に関連する部位に移動する。CD4+T細胞はまた、標的を殺傷し得(以下に概説される:Hahn,et al.,Immunol Rev.,1995.,146:57−79)、これは主に、Fas−FasL相互作用を介する。細胞傷害性は、TH1 CD4+細胞とともに見い出されている(Erb,et al.,Cell Immunol.,1991,135:232−44; Erb,et al.,J.Immunol.,1990,144:790−795; Del Prete,et al.,J.Exp.Med.,1991,174:809−13; Nishimura,et al.,J.Exp.Med.,1999,190:617−628.)が、限定された数の細胞傷害性TH2 CD4+クローンが報告されている(Lancki,et al.,J.Immunol.,1991,146:3242−9)。
【0016】
血液から直接単離された細胞におけるEBNA−1特異的CD4+T細胞応答は主にTH1応答であるということが証拠により示唆されている。さらに、EBNA−1抗体応答のアイソタイプは、IgG1サブクラスについて非対称性であり、これは、インビボでのTH1局在化を反映する。この結果は、ウイルスおよび腫瘍に対する抵抗性についてTH1細胞が重要であり、従って長期免疫にとって鍵であるという新たな証拠に基づくEBNA−1に対する治療ワクチンについての重要な含意を有する。
【0017】
EBNA−1とEBVとの免疫療法により、安全性および有効性に顕著な利点が提供される。サブユニットワクチンは、最大程度の安全性を確実にする。なぜなら、病原体による感染の機会がないからである。これは、殺傷されたかまたは弱毒化されたウイルスで免役するときに何らかの問題が常にある。さらに、単一の成分は、ウイルスワクチン全体における無関連の抗原から生じ得る、有害な副作用(例えば、アナフィラキシーまたは抗原交叉反応)を最小限にする。EBNA−1が充填された樹状細胞には、実質的に治療上の可能性がある。さらに、EBNA−1は、EBN感染および腫瘍原性に関与することから、EBNA−1は、最も防御的な免疫応答を惹起して、EBV感染および関連する疾患もしくは障害を予防または処置する。別の代替のワクチンアプローチは、EBNA−1タンパク質におけるDR特異的ペプチドを規定することである。これらのペプチドを用いて樹状細胞を適用刺激すること、次いで被験体をその適用刺激された樹状細胞に感染させることにより、そのワクチン戦略の防御的効果が確立される。
【0018】
用語「ワクチン」とは、レシピエントにおける防御的免疫を惹起するために使用され得る組成物(タンパク質またはベクター;後者はまた、おおまかに「DNAワクチン」と呼ばれ得るが、RNAベクターもまた使用され得る)をいう。有効であるためには、本発明のワクチンは、その集団の一部における免疫を惹起し得ることに留意すべきである。なぜなら、いくつかの個体は、強力なまたは防御的な免疫応答を惹起しないかもしれず、あるいは、いくつかの場合では、まったく免疫応答を惹起しないかもしれないからである。この惹起できないことは、個体の遺伝的背景に起因し得るか、または免疫不全状態(後天性または先天性のいずれか)もしくは免疫抑制(例えば、臓器拒絶を予防するかもしくは自己免疫状態を抑制ための免疫抑制薬物での処置)に起因し得る。効力は、動物モデルにおいて決定され得る。
【0019】
用語「免疫療法(治療)」とは、病原特異的免疫応答の活性化に基づく、処置レジメンをいう。ワクチンは、免疫療法の1つの形態であり得る。樹状細胞にEBNA−1抗原を、好ましくは、刺激性サイトカイン(例えば、GM−CSFもしくはFlt3リガンド)とともに、エキソビボ(続いて被験体への移植)またはインビボで充填することもまた、免疫療法の形態である。
【0020】
本明細書において用いられる用語「防御(する)」とは、被験体におけるEBNV感染を、予防もしくは処置、または適切な場合その療法を行うことを意味する。従って、そのワクチンの予防的投与は、EBV感染からレシピエント被験体を防御し得る(例えば、感染性単核球症またはリンパ増殖性疾患を予防し得る)。そのワクチンまたは免疫療法の治療上の投与は、EBV感染が媒介する病因からそのレシピエントを防御して、例えば、EBV関連新生物のような疾患または障害を処置し得る。EBV関連としては、以下が挙げられる:ホジキンリンパ腫、流行性バーキットリンパ腫、上咽頭癌、T細胞リンパ腫、胃癌、および子宮平滑筋肉腫。
【0021】
本明細書において用いられる用語「被験体(被検体)」は、EBVを支持する動物をいう。特に、この用語は、ヒトをいう。
【0022】
本明細書において用いられる用語「ヒトにおける発現のためのベクター」は、そのベクターがヒト細胞において有効であるプロモーターを少なくとも含むこと、そして好ましくはそのベクターがヒトにおいて安全かつ有効であることを意味する。そのようなベクターは、例えば、免疫を発達することには関与しない外因性遺伝子を排除する。それがウイルスベクターである場合、そのベクターは、強力な感染の複製および発達を許容する領域を除外し、そしてインビボでの複製能の発達を回避するように操作される。そのようなベクターは、好ましくは、ヒトにおける使用に関して好ましくは安全であり;より好ましい実施形態において、そのベクターは、政府の規制機関(例えば、ヒトにおける臨床試験または使用については食品医薬品局(FDA))によって承認されている。特定のベクターを、以下により詳細に記載する。
【0023】
「アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を惹起する分子または組成物である。アジュバントは、それが以下に規定するように薬学的に受容可能である場合、「ヒトにおける使用に受容可能」である。アジュバントの例は、以下に提供される。
【0024】
(エプスタインバーウイルスの免疫防御抗原)
本発明は、EBV感染を予防もしくは処置するために、エプスタインバーウイルスの免疫防御抗原、防御性または治療性のタンパク質もしくはDNAワクチン、およびEBNA−1が充填された樹状細胞を用いた免疫療法を提供する。免疫防御抗原は、免疫原性EBNA−1ポリペプチドである。以下により詳細に考察するように、EBNA−1ポリペプチドは、EBNA−1タンパク質、アミノ酸配列を含む融合タンパク質、または免疫防御エピトープを含むEBNA−1のフラグメントであり得る。
【0025】
用語「免疫原性EBNA−1ポリペプチド」とは、EBNA−1タンパク質、またはその一部であって、免疫原性であり、かつ、動物に投与されるときに防御的免疫応答を惹起するものをいう。従って、EBNA−1免疫防御抗原は、タンパク質全体である必要はない。防御免疫応答は、概して、CD4+T細胞レベルでの細胞免疫を包含する。
【0026】
その免疫原性ポリペプチドは、上咽頭癌および感染した個体において見出されるような、エプスタインバーウイルスの任意の株由来の、免疫防御EBNA−1抗原、またはEBNA−1の配列改変体を含み得る(Chen et al.,J.Gen.Virol.,80:447,1999; Gutierrez et al.,J.Gen.Virol.,78:1663,1997)。
【0027】
本明細書において用いられる用語「免疫原性」とは、そのポリペプチドが体液性または細胞性、好ましくはその両方の免疫応答を惹起し得ることを意味する。免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性である。分子は、それが免疫グロブリン(抗体)またはT細胞抗原レセプターのような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用し得る場合に「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約5つの、そして好ましくは少なくとも10の、アミノ酸のエピトープを含む。あるポリペプチドの抗原性部分(本明細書においてまたエピトープとも呼ばれる)は、抗体またはT細胞レセプターの認識のために免疫優勢である部分であり得るか、またはそれは、免疫のためのキャリアポリペプチドとその抗原性部分とを結合体化することによってその分子に対する抗体を作製するために使用される部分であり得る。抗原性である分子は、それ自身が免疫原性である(すなわち、キャリアなしに免疫応答を惹起し得る)必要はない。
【0028】
本明細書において使用される用語「キャリアポリペプチド」とは、そのポリペプチドの免疫原性を増強するために免疫原性EBNA−1と結合体化または結合され得る、タンパク質またはその免疫原性フラグメントをいう。キャリアタンパク質の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:スカシガイヘモシアニン(KLY)、アルブミン、コレラ毒素(以下により詳細に考察する)、熱不安定性腸毒素(LT)など。EBNA−1の免疫防御エピトープを含むペプチドとキャリアポリペプチドとの化学架橋を使用して、免疫原性ポリペプチドを調製し得、好ましくはこの2つの成分は、融合ポリペプチドとして発現するためのキメラ構築物として調製される。
【0029】
さらに、免疫原性ポリペプチドと精製ハンドル(例えば、FLAGまたはGST(免疫精製のため)、またはHISタグ(Niキレート精製のため)のキメラ融合ポリペプチドが企図される。
【0030】
全長組換えEBNA−1が免疫原性ポリペプチドとして使用される場合、好ましくは、それは、ウイルス成分(例えば、殺傷または弱毒化されたウイルス全体を含むワクチンとの差別化という意味で)を含まない。EBNA−1ポリペプチドは、組換え発現後に精製され得るか、またはそれは、インサイチュでの発現により送達され得る(すなわち、ベクター(DNAワクチン)からの発現による)。
【0031】
さらに、本発明は、EBNA−1の、種々の変異体、配列保存改変体、および機能保存改変体の使用を、すべてのそのような改変体が要求される免疫防御成功かを保持する限り許容する。
【0032】
用語「変異体」および「変異」は、遺伝的材料における任意の検出可能な変化(例えば、DNAまたは任意のプロセス、機構、あるいはそのような変化の結果)を意味する。これは、遺伝子の構造(例えば、DNA配列)が変化した遺伝子変異、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはDNA,および改変された遺伝子もしくはDNA配列によって発現される任意の発現産物(例えば、タンパク質)を包含する。用語「改変体」もまた、改変または変化した遺伝子、DNA配列、酵素、細胞など(すなわち、任意の種類の変異体)を意味するために使用され得る。
【0033】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存改変体」とは、所定のコドン位置における1つ以上のヌクレオチドの変化がその位置においてコードされるアミノ酸においてなんら変化を生じない改変体である。対立遺伝子変異体は、配列保存改変体であり得る。
【0034】
「機能保存改変体」とは、タンパク質または酵素における所定のアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全体のコンフォメーションおよび機能を変更することなく改変された改変体をいう。ここで、そのような変化としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:あるアミノ酸を類似の特性(例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など)に置換すること。いくつかの対立遺伝子変異体は、アミノ酸置換は、タンパク質機能に劇的な影響を与えないような機能保存改変体を生じる。同様に、相同なタンパク質は、機能保存改変体であり得る。類似の特性を有するアミノ酸は、当該分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは、親水性塩基性アミノ酸であり、そして互換性であり得る同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置換され得る。そのような変化は、そのタンパク質またはポリペプチドの見かけ上の分子量または等電点に対して効果をほとんどまたはまったく有しないと予測される。保存的であると指摘されるもの以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、その結果、類似の機能の任意の2つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性%は、変動し得、そして例えば、Cluster Methodなどによるアラインメントスキームに従って決定されるように70%〜99%であり得る。Cluster Methodでは、類似性はMEGALIGNアルゴリズムに基づく。「機能保存改変体」はまた、BLASTまたはFASTAアルゴリズムによって決定されるように少なくとも60%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも75%、もっとも好ましくは少なくとも85%、そしてさらにより好ましくは少なくとも90%を有し、そしてそれが比較されるネイティブもしくは元のタンパク質または酵素と同じまたは実質的に類似する特性もしくは機能を有する、ポリペプチドまたは酵素を包含する。
【0035】
本明細書において使用される用語「相同(だ)」は、そのすべての文法的形態およびスペリングの改変において、「共通の進化的起源」を有するタンパク質間の関係をいう。これには、以下が含まれる:スーパーファミリー(例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー)および異なる種由来の相同タンパク質(例えば、ミオシン軽鎖など)(Reeck,et al.,Cell 50:667,1987)。そのようなタンパク質(およびそれをコードする遺伝子)は、その配列類似性に反映されるように、%類似性に関してであれ、特定の残基またはモチーフの存在に関してであれ、配列相同性を有する。
【0036】
従って、用語「配列類似性」とは、そのすべての文法的形態において、共通の進化的起源(Reeck Reeck,et al.、前出)を共有してもよく、しなくてもよいタンパク質の、核酸またはアミノ酸の配列の間の同一性もしくは対応の程度をいう。しかし、一般的な使用においておよび本願においては、用語「相同性」は、「高度に」のような副詞によって修飾される場合、配列類似性をいい得、そして共通の進化的起源に関連してもしなくてもよい。
【0037】
特定の実施形態において、2つのDNA配列は、配列比較アルゴリズム(例えば、BLAST、FASTA、DNAStriderなど)によって決定されるときに、他の配列からその配列を識別するために、そのDNA配列の規定された長さに亘って十分な数のヌクレオチドが適合する場合、「実質的に相同性」または「実質的に類似する」。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによるか、または例えば、その特定の系について規定されるようなストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーションにおいて同定され得る。
【0038】
同様に、特定の実施形態において、2つのアミノ酸配列は、他の配列からその配列を識別するために、そのアミノ酸の十分量が、規定された長さにわたって同一または類似(機能的に同一)する場合、「実質的に相同」または「実質的に類似する」。好ましくは、類似するまたは相同の配列は、例えば、以下を使用するアラインメントによって同定される:GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)パイルアッププログラム、または上記の任意のプログラム(BLAST、FASTAなど)。
【0039】
さらに、使用する発現系に依存して、発現されたタンパク質は、コード配列によってコードされる推定アミノ酸配列とは異なり得ることに留意すべきである。例えば、免疫原性ポリペプチドの発現のための構築物は、細胞プロセシングの間に切断されてもよくされなくてもよい、シグナル配列を含むタンパク質を発現し得る。さらに、他のタンパク質分解切断が発現の間に生じ得る。そのポリペプチドが真核生物細胞において発現される場合、そのポリペプチドがグリコシル化部位を含む場合そのポリペプチドはグリコシル化され得る。他の可能な変化は、Nメチル化などを包含する。
【0040】
本明細書において使用される用語「単離される(た)」は、その参照される材料がそのネイティブな環境(例えば、細胞)から取り出されることを意味する。従って、単離された生物学的材料は、いくつかまたはすべての細胞成分(すなわち、そのネイティブな材料が天然に生じる細胞の成分(例えば、細胞質または膜成分))を含まなくあり得る。材料は、それが細胞抽出物中に存在する場合か、あるいはそれが異種細胞または細胞抽出物中に存在する場合、単離されたとみなされる。核酸分子の場合において、単離された核酸としては以下が挙げられる」PCR産物、単離されたmRNA,cDNAまたは制限フラグメント別の実施形態において、単離された核酸は、好ましくは、それが見出され得る染色体から切り出され、そしてより好ましくは、非コード領域にもはや結合しなくあり得、近位にもなくあり得(しかし、そのネイティブの制御領域またはその一部には結合され得る)、その染色体において見出される場合に単離される核酸分子に含まれる遺伝子の上流または下流に位置する他の遺伝子にも結合しなくあり得る。なお別の実施形態において、単離された核酸は、1つ以上のイントロンを欠如する。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列(すなわち、それがキメラ組換え核酸構築物の部分を形成する場合)を含む。従って、特定の実施形態において、組換え核酸は、単離された核酸である。単離されたタンパク質には、そのタンパク質が細胞において随伴する、他のタンパク質または核酸あるいはその両方が、あるいはそれが膜結合型タンパク質意であるときは細胞膜が付随し得る。単離されたオルガネラ、細胞、または組織は、それが生物において見出される、解剖学的部位から取り出される。単離された材料は、精製されてもよいが、必ずしも必要ではない。
【0041】
本明細書において使用される用語「精製される(た)」とは、無関連の材料(すなわち、夾雑物)の存在を減少または除去する条件下で単離された材料をいう。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは、そのタンパク質と細胞中で一緒に存在する他のタンパク質も他の核酸も実質的に含まない。精製された核酸分子は、好ましくは、それとともに細胞中に見出され得るタンパク質も他の無関連の核酸分子も実質的に含まない。本明細書において使用される用語「実質的に含まない」とは、その材料の分析試験の文脈において、機能的に使用される。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製された材料は、少なくとも50%純粋であり;より好ましくは少なくとも90%純粋であり、そしてより好ましくはなお少なくとも99%純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当該分野において公知の他の方法によって評価され得る。
【0042】
精製のための方法は、当該分野において周知である。例えば、核酸は、以下によって精製され得る:沈降、クロマトグラフィー(限外調製固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および三重鎖螺旋クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない)、超遠心分離など。ポリペプチドおよびタンパク質は、種々の方法によって精製され得、これには、以下が含まれるがそれらに限定されない:調製用ディスクゲル電気泳動および等電点電気泳動;アフィニティークロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLC、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー;沈降および塩出クロマトグラフィー;抽出;ならびに対電流分配。いくつかの目的のために、そのタンパク質が以下を含むがそれらに限定されない、精製を容易にするさらなる配列タグを含む組換え系においてポリペプチドを生産することが好ましい:ポリヒスチジン配列、抗体に特異的に結合する配列(例えば、FLAGおよびGST)。ついで、このポリペプチドは、その宿主細胞の租溶解物から、適切な固相材料上のクロマトグラフィーによって精製され得る。あるいは、そのタンパク質に対して生成されたか、またはそれに由来するペプチドに対して生成された抗体は、精製試薬として使用され得る。細胞は、以下を含む種々の技術によって精製され得る:遠心分離、マトリクス分離(例えば、ナイロンウール分離)、パニングおよび他の免疫選択技術、枯渇(例えば、夾雑細胞の相補枯渇)、および細胞ソーティング(例えば、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS))。他の精製方法が可能であり、そして本明細書において企図される。精製された材料は、約50%未満の、好ましくは約75%未満の、そしてもっとも好ましくは約90%未満の、その材料がもともと一緒に存在していた細胞成分、培地、タンパク質または他の所望されない成分もしくは不純物(文脈に応じて)を含み得る。用語「実質的に純粋」とは、当該分野において公知の慣用される精製技術を用いて達成され得る純度の最高の程度をいう。
【0043】
特定の実施形態において、用語「約」または「およそ」とは、所定の値または範囲の、20%以内、好ましくは10%以内、そしてより好ましくは5%以内を意味する。あるいは、生物学において使用される対数用語では、用語「約
は、所定の値と同じ桁内にあること、より好ましくはその値の桁の2分の1以内の範囲にあることを意味する。
【0044】
(組換え発現系)
本発明は、本明細書に記載される免疫原性ポリペプチドの発現のための種々のクローニングおよび発現のベクターを企図する。そのような発現ベクターを用いて、細胞をインビトロで形質転換してタンパク質ワクチンのための免疫原性タンパク質を生成し得るか、またはDNAワクチンのためにインビボで免疫原性ポリペプチドを発現させ得る。
【0045】
免疫原性ポリペプチドのためのコード配列は、シグナル配列を含み得るか、または好ましくは含む。このシグナル配列は、異種シグナル配列(例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞における最適化されたシグナル配列プロセシングのために)であり得る。本明細書において用いられる用語「シグナル配列」は、分泌タンパク質をその細胞からの分泌のためのプロセシングのために識別する、ほとんどの分泌タンパク質に見出されるN末端の疎水性配列をいう。一般に、そのシグナル配列は、プロセシングの間に切断される。しかし、本発明の種々の構築物としては、部分的シグナル配列が挙げられる。その部分シグナル配列が正常にプロセシングされること、またはそれが発現の間に例えば細菌の周辺質にまでトランスロケーションを提供さえすることは、必ずしも正しくない。
【0046】
本発明に従って、当該分野の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術が使用され得る。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本明細書中「Sambrookら、1989」);DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻および第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1985)];Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins編(1984)];Animal Cell Culture[R.I.Freshney編(1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)];B.Perbal,A PraticalGuide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。
【0047】
(分子生物学的定義)
「核酸分子」(あるいは「核酸」)とは、単鎖形態または二重鎖ヘリックス形態のいずれかのリボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン;「RNA分子」)またはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン;「DNA分子」)または任意のそれらのリン酸エステルアナログ(例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル)のリン酸エステルポリマー形態をいう。二重鎖DNA−DNA、DNA−RNAおよびRNA−RNAヘリックスがあり得る。この用語は、特に、直鎖状(例えば、制限フラグメント)または環状DNA分子、プラスミド、および染色体において見出される二重鎖DNAを含む。特定の二重鎖DNA分子の構造を議論することにおいて、配列は、DNAの非転写鎖(すなわち、mRNAに対して相同な配列を有する鎖)に沿って、5’から3’方向においてのみ配列を与えるという通常の慣習に従って本明細書中で記載され得る。「組換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
【0048】
「コード配列」または発現産物(例えば、RNA、ポリペプチド、タンパク質または酵素)を「コードする」配列は、発現される場合に、そのRNA、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産物を生じるヌクレオチド配列である(すなわち、そのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする)。タンパク質についてのコード配列は、開始コドン(通常は、ATG)および終止コドンを含み得る。
【0049】
本明細書中のコード配列は、天然の調節(発現制御)配列に隣接していてもよいし、異種配列(プロモーター、内部リボソーム進入部位(IRES)および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5’非コード領域および3’非コード領域などを含む)に関連していてもよい。
【0050】
用語「遺伝子」(「構造遺伝子」ともいわれる)は、1以上のタンパク質の全てもしくは一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードするかまたはこの特定の配列に対応するDNA配列を意味し、そして例えば、遺伝子が発現される条件を決定する調節DNA配列(例えば、プロモーター配列)を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【0051】
導入された遺伝子またはコード配列はまた、「クローニングされた」、「外来」、または「異種」の遺伝子または配列といわれ得、そして細胞の遺伝的機構により用いられる調節配列または制御配列を含み得る。この遺伝子または配列は、非機能的配列または未知の機能を有する配列を含み得る。
【0052】
用語「宿主細胞」は、細胞による物質の生成(例えば、遺伝子、DNAまたはRNA配列、タンパク質または酵素の細胞による発現)のために、選択されたか、改変されたか、形質転換されたか、増殖されたか、または使用されたかもしくはいずれかの方法において操作された任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、外因性または異種のDNAが細胞内部に導入されている場合、このようなDNAによりトランスフェクトされている。細胞は、トランスフェクトされたDNAが発現され、そしてこれらのDNAが発現される細胞に対して機能または表現型をもたらす場合、外因性または異種のDNAにより形質転換されている。用語「発現系」は、適合性の発現ベクターにより形質転換され、そして例えば、ベクターにより保有される外来DNAによりコードされ、かつ宿主細胞に導入されたタンパク質の発現のために適切な条件下で培養される宿主細胞を意味する。
【0053】
タンパク質およびポリペプチドは、組換えDNAの発現により宿主細胞において生成され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸ベースのポリマー(これは、核酸によりコードされ得るか、または合成により調製され得る)をいう。ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質フラグメント、キメラタンパク質などであり得る。一般に、用語「タンパク質」とは、細胞内で内因的に発現されたポリペプチド(例えば、天然に存在する形態のアミノ酸ベースのポリマー)をいう。一般に、特定のタンパク質または酵素についての指示を有するDNAは、対応するRNAの配列に「転写」される。このRNA配列は、続いて、タンパク質または酵素を形成するアミノ酸配列に翻訳される。「アミノ酸配列」は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖である。
【0054】
「プロモーター配列」は、細胞中でRNAポリメラーゼを結合し得、かつ下流の(3’方向の)コード配列の転写を開始し得るDNA調節領域である。本発明を規定する目的で、このプロモーター配列は、転写開始部位の近くのその3’末端が境界であり、そしてバックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するに必要な塩基またはエレメントの最小数を含むように上流(5’方向)まで伸長する。プロモーター配列内で、転写開始部位(簡便には、例えば、ヌクレアーゼS1を用いたマッピングにより規定される)ならびにRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が見出される。
【0055】
コード配列は、RNAポリメラーゼがmRNAにコード配列を転写する場合、細胞において転写制御配列および翻訳(発現)制御配列の「制御下にある」か、またはこれらの配列と「作動可能に会合(連結)」しており、コード配列は次いで、トランスRNAスプライスされ(イントロンを含む場合)、そしてこのコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
【0056】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子またはDNA配列における情報を顕在化させる(例えば、対応する遺伝子またはDNA配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化させることによりタンパク質を生成する)ことを意味する。DNA配列は、細胞において発現されるか、または細胞により発現されて、タンパク質のような「発現産物」を形成する。発現産物自体(例えば、得られたタンパク質)はまた、細胞により「発現された」といわれ得る。発現産物は、細胞内、細胞外または分泌されたと特徴付けられ得る。用語「細胞内」は、細胞内部に存在する何かを意味する。用語「細胞外」は、細胞外部に存在する(細胞膜中にあるかまたは細胞から分泌されたかのいずれかの)何かを意味する。物質は、この物質が細胞の外部の外部媒体において、細胞上のどこかもしくは細胞内部より有意な尺度で発生するならば、細胞により「分泌」されている。
【0057】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、DNAもしくはRNAの配列(例えば、外来遺伝子)が、宿主を形質転換し、かつ導入された配列の発現(例えば、転写および翻訳)を促進するように宿主細胞に導入され得るビヒクルを意味する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。「カセット」とは、規定された制限部位においてベクターに挿入され得る発現産物をコードするDNAコード配列またはDNAのセグメントをいう。カセット制限部位は、適切なリーディングフレーム中にカセットを確実に挿入するように設計される。一般に、外来DNAは、ベクターDNAの1以上の制限部位に挿入され、次いで、このベクターにより、遺伝性の(transmissible)ベクターDNAとともに宿主細胞に運ばれる。挿入されたか、もしくは付加されたDNAを有するDNAのセグメントまたは配列(例えば、発現ベクター)はまた、「DNA構築物」とよばれ得る。多数のベクター(プラスミドおよび真菌ベクターを含む)は、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における複製および/または発現について記載されている。限定しない例としては、pKKプラスミド(Clontech)、pUCプラスミド、pETプラスミド(Novagen,Inc.,Madison,WI)、pRSETもしくはpREPプラスミド(Invitrogen,San Diego,CA)、またはpMALプラスミド(New England Biolabs,Beverly,MA)、および多数の適切な宿主細胞が挙げられ、本明細書中に開示または引用された方法または当業者に公知の他の方法が用いられる。組換えクローニングベクターは、しばしば、クローニングもしくは発現のための1以上の複製系、宿主における選択のための1以上のマーカー(例えば、抗生物質耐性)、および1以上の発現カセットを含む。
【0058】
用語「発現系」は、例えば、ベクターが保有し、かつ宿主細胞に導入された外来DNAによりコードされたタンパク質の発現について適切な条件下での宿主細胞および適合性のベクターを意味する。発現系は、細菌、昆虫、または哺乳動物の宿主細胞およびベクターを含む。細菌細胞および昆虫細胞の発現は、以下に例示される。適切な哺乳動物細胞としては、C12細胞、CHO細胞、HeLa細胞、293細胞および293T細胞(ヒト腎臓細胞)、COS細胞、マウス初代筋細胞、およびNIH 3T3細胞が挙げられる。
【0059】
用語「異種」とは、天然に存在しないエレメントの組合わせをいう。例えば、異種DNAは、細胞においてまたは細胞の染色体部位に天然に位置しないDNAをいう。好ましくは、異種DNAは、細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、天然において作動可能に会合している遺伝子ではなく、異なる遺伝子と作動可能に会合しているようなエレメントである。本発明の状況において、遺伝子は、クローニングまたは発現のために挿入される組換えベクターDNAに対して異種であり、そして遺伝子が発現されるこのようなベクターを含む宿主細胞(例えば、CHO細胞)に対して異種である。
【0060】
核酸分子は、単鎖形態の核酸分子が温度および溶液イオン強度の適切な条件(Sambrookら(前出)を参照のこと)下で他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子(例えば、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA)にハイブリダイズし得る。100ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについて、Tmを計算するための式が得られる(Sambrookら(前出)、9.50〜9.51を参照のこと)。より短い核酸(すなわち、オリゴヌクレオチド)とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambrookら(前出)11.7〜11.8を参照のこと)。ハイブリダイズ可能な核酸についての最小の長さは、少なくとも約10ヌクレオチドであり;好ましくは、少なくとも約15ヌクレオチドであり;そしてより好ましくは、長さが約20ヌクレオチドである。
【0061】
(発現ベクター)
広範に種々の宿主/発現ベクターの組合わせ(すなわち、発現系)は、本発明の免疫原性ポリペプチドを発現することにおいて用いられ得る。例えば、有用な発現ベクターは、染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列のセグメントからなり得る。適切なベクターとしては、SV40の誘導体および公知の細菌プラスミド(例えば、E.coliプラスミドcolEl、pCR1、pBR322、SV40およびpMal−C2、pET、pGEX(Smithら、Gene 67:31−40,1988)、pMB9およびそれらの誘導体、PR4のようなプラスミド);グラム陽性ベクター(例えば、Strep.gardonii);ファージDNAS(例えば、ファージ1の多くの誘導体(例えば、NM989))および他のファージDNA(例えば、M13および糸状単鎖ファージDNA);酵母プラスミド(例えば、2mプラスミドまたはその誘導体);真核生物細胞において有用なベクター(例えば、昆虫もしくは哺乳動物細胞において有用なベクター);プラスミドおよびファージDNAの組合わせに由来するベクター(例えば、ファージDNAもしくは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド)などが挙げられる。
【0062】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター/エンハンサーエレメントにより制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主において機能的でなければならない。遺伝子発現を制御するために用いられ得るプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第5,385,839号および同第5,168,062号)、SV40初期プロモーター領域(BenoistおよびChambon,Nature 290:304−310,1981)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら,Cell 22:787−797、1980)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441−1445,1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、Nature 296:39−42、1982);原核生物発現ベクター(例えば、β−ラクタマーゼプロモーター)(Villa−Komaroffら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727−3731,1983)またはtacプロモーター(DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25,1983);Scientific American,242:74−94,1980の「Useful protein from recombinant bacteria」もまた参照のこと;酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント(例えば、Gal4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター);および造血組織特異性を示す制御領域(特に、リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域)(Grosschedlら、Cell,38:647,1984;Adamesら、Nature 318:533,1985;Alexanderら、Mol.Cell Biol.7:1436、1987);骨髄細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域(Mogramら、Nature 315:338−340,1985;Kolliasら、Cell 46:89−94,1986)、造血幹細胞分化因子プロモーター;エリスロポエチンレセプタープロモーター(Maoucheら、Blood,15:2557,1991)など;および粘膜上皮細胞特異性を示す制御領域。
【0063】
好ましいベクター(特に、インビトロでの細胞アッセイおよびインビボもしくはエキソビボでのワクチン接種のため)は、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘、AV−ポックス、改変ワクシニアAnkara(modified vaccinia Ankara)(MVA)のようなウイルスベクターおよび所望の細胞向性を有する他の組換えウイルスである。特定の実施形態において、ワクシニアウイルスベクターは、樹状細胞に感染させるために用いられる。別の特定の実施形態において、EBNA−lを発現するバキュロウイルスベクターが調製される。従って、免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、ウイルスベクターを用いて、またはDNAの直接導入によりインビボ、エキソビボ、またはインビトロで導入され得る。標的化された組織における発現は、トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化する(例えば、ウイルスベクターもしくはレセプターリガンドを用いるか、組織特異的プロモーターを用いることによるか、またはその両方を用いる)ことにより、もたらされ得る。標的化された遺伝子送達は、国際特許出願WO95/28494(1995年10月公開)に記載される。
【0064】
インビボまたはエキソビボ標的化およびワクチン接種手順のために一般に用いられるウイルスベクターは、DNAベースのベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、そして用いるための方法は、当該分野で公知である(例えば、MillerおよびRosman,Bio Techniques、7:980−990,1992を参照のこと)。好ましくは、このウイルスベクターは、複製欠損である(すなわち、このベクターは、標的細胞において自律的に複製できない)。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小のウイルスである(すなわち、このウイルスは、ゲノムをキャプシド化してウイルス粒子を生成するために必要なそのゲノムの配列のみを保持する)。
【0065】
DNAウイルスベクターとしては、弱毒化DNAウイルスまたは欠損DNAウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピロマウイルス、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない)が挙げられる。特定のベクターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:欠損ヘルペスウイルス(HSV1)ベクター(Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.2:320−330,1991;国際特許公開番号WO94/21807(1994年9月29日公開);国際特許公開番号WO92/05263(1994年4月2日公開));弱毒化アデノウイルスベクター(例えば、Stratford−Perricaudetら(J.Clin.Invest.90:626−630,1992により記載される;La Salleら、Science 259:988−990,1993もまた参照のこと);および欠損アデノ随伴ウイルスベクター(Samulskiら、J.Virol.63:3096−3101,1987;Samulskiら、J.Virol..63:3822−3828,1989;Lebkowskiら、Mol.Cell.Biol.8:3988−3996,1988)。
【0066】
種々の仲間が市販のウイルスベクターを生成し、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:Avigen,Inc.(Alameda,CA;AAVベクター)、Cell Genesys(Foster City,CA;レトロウイルス、アデノウイルス、AAVのベクターおよびレンチウイルスベクター)、Clontech(レトロウイルスおよびバキュウロウイルスのベクター)、Genovo,Inc.(Sharon Hill,PA;アデノウイルスおよびAAVのベクター)、Genvec(アデノウイルスベクター)、IntroGene(Leiden,Netherlands;アデノウイルスベクター)、Molecular Medicine(レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、およびヘルペスウイルスベクター)、Norgen(アデノウイルスベクター)、Oxford BioMedica(Oxford,United Kingdom;レンチウイルスベクター)、およびTransgene(Strasbourg,France;アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスのベクター)。
【0067】
(アデノウイルスベクター)
アデノウイルスは、真核生物DNAウイルスであって、本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に送達するように改変され得る。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型のうち、本発明の範囲内で2型もしくは5型のヒトアデノウイルス(Ad2もしくはAd5)または動物起源のアデノウイルス(WO94/26914を参照のこと)を用いて、性能が与えられる。本発明の範囲内で用いられ得る動物起源のそれらのアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、マウス起源のアデノウイルス(例:Mav1、Beardら、Virology 75(1990):81)、ヒツジ、ブタ、トリおよびサル起源のアデノウイルス(例:SAV)が挙げられる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、より好ましくは、例えば、CAV2アデノウイルス(例えば、ManhattanまたはA26/61株(ATCC VR−800))である。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記載されている(WO94/26914、WO95/02697、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。本発明に従う複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術により調製され得る(Levreroら、Gene 101:195 1991;EP 185873;Graham,EMBO J.3:2917,1984;Grahamら、J.Gen.Virol.36:59 1977)。組換えアデノウイルスは、ヒト樹状細胞に対して効率的かつ混乱させない(non−purturbing)ベクターである(Zhongら、Eur.J.Immunol.29:964,1999;DiNicolaら、Cancer Gene Ther.5:350−6,1998)。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて回収および精製される。
【0068】
(アデノ随伴ウイルス)
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、安定かつ部位特異的様式で、これらのウイルスが感染する細胞のゲノムに組み込まれ得る比較的小さなサイズのDNAウイルスである。これらは、細胞増殖、細胞形態または細胞分化に対していずれの影響も誘導することなく広範なスペクトルの細胞に感染し得、そしてそれらは、ヒトの病状に関与しないと思われる。AAVゲノムは、クローニングされ、配列決定され、かつ特徴付けられている。インビトロおよびインビボで遺伝子を移入するためのAAVに由来するベクターの使用が記載されている(WO91/18088;WO93/09239;米国特許第4,797,368号、同第5,139,941号、EP 488528を参照のこと)。本発明に従う複製欠損組換えAAVは、2つのAAV逆末端反復(ITR)領域に隣接する目的の核酸配列を含むプラスミドおよびAAVキャプシド化遺伝子(repおよびcap遺伝子)を有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)に感染する細胞株に同時トランスフェクトすることにより調製され得る。次いで、生成されたこのAAV組換え体は、標準的技術により精製され得る。これらのウイルスベクターはまた、ヒト樹状細胞に遺伝子を移入するために効率的である(DiNicolaら(前出))。
【0069】
(レトロウイルスベクター)
別の実施形態において、遺伝子は、例えば、Andersonら、米国特許第5,399,346号;Mannら、1983,Cell 33:153;Teminら、米国特許第4,650,764号;Teminら、米国特許第4,980,289号;Markowitzら、1988、J.Virol.62:1120;Teminら、米国特許第5,124,263号;EP 453242、EP178220;Bernsteinら、Genet.Eng.7(1985)235;McCormick、BioTechnology 3(1985)689;Doughertyらによる国際特許公開番号WO95/07358(1995年3月16日公開);およびKuoら、1993、Blood 82:845に記載されるように、レトロウイルスベクターに導入され得る。レトロウイルスは、分裂している細胞に感染する組み込みウイルスである。レトロウイルスゲノムは、2つのLTR、キャプシド化配列および3つのコード領域(gag、polおよびenv)を含む。組換えレトロウイルスベクターにおいて、gag、polおよびenvの遺伝子は、一般に、全体または一部が欠失され、そして目的の異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス(例えば、HIV、MoMuLV(「マウスモロニー白血病ウイルス」)、MSV(「マウスモロニー肉腫ウイルス」)、HaSV(「ハーベイ肉腫ウイルス」);SNV(「脾臓壊死ウイルス」);RSV(「ラウス肉腫ウイルス」)およびフレンドウイルス)から構築され得る。適切なパッケージング細胞株は、従来技術において記載され、特に細胞株PA317(US4,861,719);PsiCRIP細胞株(WO90/02806)およびGP+envAm−12細胞株(WO89/07150)に記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのLTRおよびgag遺伝子の一部を含み得る広範なキャプシド化配列内に改変を含み得る(Benderら、J.Virol.61:1639,1987)。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準的な技術により精製される。
【0070】
レトロウイルスベクターはまた、1サイクルのレトロウイルス複製を可能にし、そしてトランスフェクション効率を拡大するDNAウイルスにより導入され得る(WO95/22617、WO95/26411、WO96/39036、WO97/19182を参照のこと)。
【0071】
(レンチウイルスベクター)
別の実施形態において、次いで、レンチウイルスベクターは、いくつかの組織型(脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む)における導入遺伝子の直接送達および持続的発現のための因子として用いられ得る。このベクターは、これらの組織において分裂細胞および非分裂細胞を効率的に形質導入し得、そして目的の遺伝子の長期発現を維持し得る。総説については、Naldini,Curr.Opin.Biotechnol.9:457−63,1998を参照のこと;Zuffereyら、J.Virol.72:9873−80,1998もまた参照のこと。レンチウイルスパッケージング細胞株は当該分野で利用可能であり、一般に公知である。これらの細胞株は、遺伝子治療のための高力価レンチウイルスベクターの生成を容易にする。例は、少なくとも3〜4日間にわたり106IU/mlより高い力価でウイルス粒子を生成し得るテトラサイクリン誘導性VSV−G偽型化(pseudotyped)レンチウイルスパッケージング細胞株である(Kafriら、J.Virol.73:576−587,1999)。誘導性細胞株により生成されるベクターは、インビトロおよびインビボで非分裂細胞を効率的に形質導入するために必要であるように濃縮され得る。
【0072】
(ワクシニアウイルスベクター)
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルスファミリーのメンバーであり、そしてそのサイズの大きさおよび複雑性によって特徴付けられている。ワクシニアウイルスDNAは、二本鎖であり、そして末端架橋されていて、その結果、一本鎖環が、DNAの変性に基いて形成される。このウイルスは、約200年間、痘瘡に対するワクチンとして用いられており、ワクチンとして用いた場合のこのウイルスの特徴は公知である(Paoletti,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93:11349〜53,1996;およびEllhner,Infection,26:263〜9,1998)。ワクシニアウイルスを用いたワクチン接種の危険性は、周知で、十分規定されており、そしてこのウイルスは、比較的良性であるとみなされている。ワクシニアウイルスベクターは、外来遺伝子の挿入および発現のために用いられ得る。ワクシニアベクターに外来遺伝子を挿入して、ワクシニアウイルスの合成組換え体を作成する基礎的な技術は、記載されている(米国特許第4,603,112号、米国特許第4,722,848号、米国特許第4,769,330号、および米国特許第5,364,773号を参照のこと)。多数の外来(すなわち、非ワクシニア)遺伝子が、ワクシニア中で発現されており、これは、しばしば、防御免疫を生じる(以下によって概説されている:Yamanouchi,Barnett、およびKai、Rev.Sci.Tech.,17:641〜53,1998;Yokoyamaら、J.Vet.Med.Sci.59:311〜22,1997;そして以下を参照のこと:Osterhausら、Vaccine,16:1479〜81 1998:およびGherardiら、J.Immunol.162:6742〜33,1999)。ワクシニアウイルスは、免疫無防備状態の個体または免疫抑制状態の個体への投与には適していないかもしれない。本発明において用いられ得る別のポックスウイルスとしては、家禽ポックス(Fowl pox)、AVポックス(AV−pox)、および改変ワクシニアアンカラ(Ankara)(MVA)ウイルスが挙げられる。これらの別のウイルスの免疫原としての能力を改善するために好ましい実施形態は、EBNA−1を含有するウイルスを直接、樹状細胞に送達すること、次いで樹状細胞を成熟させることである。
【0073】
(非ウイルスベクター)
別の実施形態において、このベクターは、裸のDNAとして、リポフェクチンによって、または他のトランスフェクション達成剤(ペプチド、ポリマーなど)を用いて、インビトロで導入され得る。合成のカチオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するのに用いられ得る(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413〜7417,1987;FelgnerおよびRingold,Science 337:387〜388,1989;以下を参照のこと:Mackeyら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027〜8031、1988;Ulmerら、Science 259:1745〜1748,1993)。核酸の移入のために有用な脂質化合物および脂質組成物は、以下に記載されている:国際特許出願WO95/18863およびWO96/17823、ならびに米国特許第5,459,127号。脂質は、標的化の目的のため、他の分子に化学的に結合され得る(Mackeyら、(前出)を参照のこと)。標的化ペプチド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子)は、リポソームに化学的に結合され得る。
【0074】
カチオン性オリゴペプチド(例えば、国際特許公開WO95/21931)、DNA結合タンパク質由来のペプチド(例えば、国際特許公開WO96/25508)、またはカチオン性ポリマー(例えば、国際特許公開WO95/21931)のような、他の分子がまた、インビボで核酸のトランスフェクションを容易にするために有用であり得る。
【0075】
あるいは、遺伝子治療のための非ウイルス性DNAベクターが、当該分野で公知の方法(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用(弾道トランスフェクション;例えば米国特許第5,204,253号;同第5,853,663号;同第5,885,795号;同第5,702,384号を参照のこと、そして以下を参照のこと:Sanford,TIB−TECH,6:299〜302,1988;Fynanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:11478〜11482,1993;およびYangら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1568〜9572,1990)、またはDNAベクタートランスポーターの使用(例えば、以下を参照のこと:Wuら、J.Biol.Chem.267:963〜967,1992;WuおよびWu,J.Biol.Chem.263:14621〜14624,1988;Hartmutら、1990年3月15日出願、カナダ特許出願番号2,012,311号;Williamsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726〜2730,1991))によって所望の宿主細胞に導入され得る。レセプター媒介DNA送達アプローチがまた用いられ得る(Curielら、Hum.Gene.Ther.3:147〜154,1992;WuおよびWu,J.Biol.Chem.262:4429〜4432,1987)。米国特許第5,580,859号および米国特許第5,589,466号は、哺乳動物において、トランスフェクション促進剤を使わない、内因性DNA配列の送達を開示している。近年、比較的低い電圧の、高い効率のインビボDNA移入技術(電気移入(electrotransfer)と名付けられる)が記載されている(Mirら、C.P.Acad.Sci.321:893,1998;WO 99/01157;WO 99/01158;WO 99/01175)。
【0076】
(ワクチン技術および免疫療法)
上記のように、本発明は、エプスタイン−バーウイルス感染、または関連の疾患(例えば、感染性単球増加、風土性バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、T細胞リンパ腫、胃癌、および平滑筋肉腫、ならびに慢性疲労症状のような潜在的な慢性疾患)を予防または処置するための、ポリペプチドワクチン、および免疫原性EBNA−1ポリペプチドを送達するDNAワクチンに関する。
【0077】
本発明のワクチンは、エプスタイン−バーウイルスによる感染から動物を防御するために広範に適用可能である。用語「防御(protect)」は、エプスタイン−バーウイルス感染の処置または予防を意味するとして、本明細書において用いられる。従って、このタイプの感染に感受性の任意の動物がワクチン接種され得る。EBVは、γヘルペスウイルス(gammaherpesvirus)、herpesvirus saimiri、およびウシ4型へルペスウイルスに対して、他のクラスのヘルペスよりも系統学的に大きい類似性を示す(Karlinら、J.Virol.68:1886;902,1994;およびBublotら、Virology,190:654〜65,1992)。EBVについての動物モデルは、同じ種の新世界ザル(New World monkey)において(Frankenら、J.Virol.69:8011〜9,1995)、ならびにマウスにおいて(MistrikovaおよびMrmusova,Acta.Virol.,42:79〜82,1998,Weckら、J.Virol.73:4651〜61,1999;ならびにSimasおよびEfstathiou、Trends Microbiol.,6:276〜82,1998)およびウサギにおいて(Wutzlerら、Arch.Virol.140:1979〜95,1995;およびHandleyら、Vet.Microbiol.,47:167〜81,1995)存在する。サルに感染する、少なくとも1つのEBV様ヘルペスウイルスは、EBNA−1に相同である遺伝子を含む(Liら、Int.J.Cancer,59:287〜95,1994)。EBV様ウイルスに感染した動物は、疾患を予防または処置するための本発明のワクチンで処置され得る。
【0078】
(ポリペプチドワクチン)
本明細書において用いる場合、用語「ポリペプチドワクチン」は、免疫原性ポリペプチドおよび一般にはアジュバントを含むワクチンをいう。用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物をいう。アジュバントは、抗原を緩徐に放出する組織デポ(貯蔵)として、そしてまた免疫応答を非特異的に増強するリンパ系アクチベータとして働き得る(Hoodら、Immunology,第2版、1984、Benjamin/Cummings:Menlo Park,California、p384)。しばしば、抗原のみ(アジュバントなし)での初回チャレンジは、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を惹起し得ない。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような表面活性化物質、プルロニック(pluronic)ポリマー、ポリアニオン、ペプチド、オイル、または炭水化物エマルジョン、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント(例えば、BCG(bacille Calmette−Guerin)およびCorynebacterium parvum)が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい合成アジュバントの例はQS−21である。あるいは、またはさらに、以下に記載するような、免疫刺激的タンパク質が、アジュバントとして、またはワクチンに対する免疫応答を増大するために、提供され得る。好ましくは、このアジュバントは、薬学的に受容可能である。
【0079】
句「薬学的に受容可能な(pharmaceutically acceptable)」とは、ヒトに投与された場合、生理学的に耐性であり、そして代表的には、アレルギー反応または類似の不都合な反応(例えば、異常亢進、眩暈など)を生じない分子および組成物をいう。好ましくは、本明細書において用いる場合、用語「薬学的に受容可能な」とは、連邦もしくは合衆国政府の監督官庁によって承認されたか、または米国薬局方もしくは動物、およびより詳細にはヒトにおける使用のための他の一般的に認識される薬局方に列挙されることを意味する。用語「キャリア」とは、この化合物と一緒に投与される稀釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。滅菌水または生理食塩水水溶液およびデキストラン水溶液およびグリセロール水溶液は、特に注射用溶液のために、好ましくはキャリアとして使用される。適切な薬学的キャリアは、E.W.Martinによって「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【0080】
上記の特定のアジュバント(特に鉱物油および鉱物油を含むアジュバント(例えば、フロイントのアジュバント))は、ヒトでの使用には受容できない。
【0081】
(「DNA」ワクチン)
用語「DNAワクチン」は、当該分野では非公式な用語であり、そして組換えベクターの手段によって送達されるワクチンをいうために、本明細書において用いられる。本明細書において用いられる別の、そしてより説明的な用語は、「ベクターワクチン」である(なぜなら、いくつかの可能性のあるベクター(例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルス)は、RNAウイルスであるからであり、そしてある場合には、DNAの代わりに非ウイルスRNAが細胞に送達され得るからである)。一般に、このベクターは、インビボで投与されるが、インビボで形質導入された細胞の投与を伴う、適切な抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)のエキソビボ導入がまた、意図される。上記のベクター系は、本発明の免疫原性ポリペプチドの発現のためのベクターの送達にとって理想的である。
【0082】
(ワクチン接種および免疫療法のストラテジー)
エプスタイン−バーウイルス感染に対して被験体をワクチン接種するために、種々のストラテジーを用い得る。ポリペプチドワクチン処方物は、皮下(subcutaneous)(s.c.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、皮下(subdermal)(s.d.)、皮内(i.d.)の投与によって、またはエキソビボでの抗原提示細胞への投与とそれに続くこの細胞の被験体への投与によって送達され得る。被験体への投与の前に、抗原提示細胞は、成熟させられてもよい。
【0083】
同様に、上記の任意の遺伝子送達方法は、被験体にベクターワクチンを投与するために用いられ得る(例えば、遺伝子銃または直接注射による、裸のDNAおよびRNAの送達)。
【0084】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激、免疫増強または炎症促進性のサイトカイン、リンホカイン、またはケモカインのような免疫刺激性分子(SalgallerおよびLodge、J.Surg.Oncol.68:122,1988)と、ワクチン(特にベクターワクチン)との同時投与によって増強され得る。例えば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子(例えば、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13、顆粒球マクロファージ(GM)コロニー刺激因子(CSF)および他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド(Lyman,Curr.Opin.Hematol.5:192,1998))、ならびにいくつかの重要な同時刺激分子またはそれらの遺伝子(例えば、B7.1,B7.2)が用いられ得る。これらの免疫刺激分子は、タンパク質として全身もしくは局所的に送達され得るか、またはこの分子の発現をコードするベクターの発現によって、送達され得る。免疫原性ポリペプチドの送達のための上記の技術はまた、免疫刺激分子に対して使用され得る。
【0085】
(樹状細胞標的化)
ワクチン接種および特に免疫療法は、樹状細胞の標的化を通じて達成され得る(Steinman,J.Lab.Clin.Med.,128:531,1996;Steinman,Exp.Hematol.24:859,1996;Taiteら、Leukemia,13:653,1999;Avigan,Blood Rev.,13:51,1999;DiNicolaら.,Cytokines Cell.Mol.Ther.4:265,1998)。樹状細胞は、T細胞依存性免疫の活性化に重要な役割を果たす。増殖する樹状細胞は、インサイチュで免疫原性形態でタンパク質抗原を捕獲し、次いでこれらの抗原を認識され得る形態で提示してT細胞を刺激するために用いられ得る(例えば、Steinman、Exper.Hematol.24:859〜862,1996;Inabaら、J.Exp.Med.188:2163〜73,1998および米国特許第5,851,756号を参照のこと)。エキソビボ刺激のために、樹状細胞を培養皿中にプレートし、そして抗原が樹状細胞に結合することを可能にするのに十分な量および十分な時間で、抗原に曝露(抗原を適用)する。さらに、樹状細胞は、Zhongら、Eur.J.Immunol.29:964〜72,1999;Van Tendelooら、Gene Ther.,5:700〜7,1998;Dieboldら、Hum.Gene Ther.10:775〜86,1999;FrancotteおよびUrbain,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:8149,1985および米国特許第5,891,432号(Casaresら、J.Exp.Med.186:1481〜6,1997)に記載のように種々の物理的または化学的手段を用いてDNAでトランスフェクトされ得る。次いで、適用した細胞を、処置を受けている被験体に、例えば静脈内注射によって、移植して戻し得る。好ましくは、自己樹状細胞(すなわち、処置を受けている被験体から得た樹状細胞)を用いるが、MHCクラスII適合樹状細胞を使用することも可能である。この樹状細胞は、型適合ドナーから、または樹状細胞の遺伝子操作によって獲得され、所望のMHC分子を発現(そして好ましくは所望されないMHC分子の発現を抑制)し得る。
【0086】
好ましくは、樹状細胞は、EBNA−1の発現のためにインビボで特に標的される。抗原提示を媒介するレセプター(例えば、DEC−205)(Swiggardら、Cell.Immunol.165:302〜11,1995;Steinman,Exp.Hematol.24:859,1996)およびFcレセプターを使用することによって、種々のストラテジーが、インビボで樹状細胞を標的化するのに利用可能である。上記で考察した標的化ウイルスベクターがまた用いられ得る。さらに、樹状細胞は、ウイルスベクターによる感染後、インビボでの移植の前に、成熟するようにインビトロで誘導され得る。
【0087】
(粘膜ワクチン接種)
粘膜ワクチンストラテジーは、多くの病原性ウイルスにとって特に有効である。なぜなら、感染は、しばしば粘膜を介して起こるからである。さらに、組換えワクシニアウイルスワクチンの粘膜送達は、以前の痘瘡ワクチン接種に起因する痘瘡ウイルスに対するもともと存在する免疫を克服することができる(Belyakovら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:4512〜7,1999)。粘膜は、EBNA−1ワクチンおよび免疫療法の重要な標的である樹状細胞を覆ってしまう。従って、ポリペプチドワクチンおよびDNAワクチンの両方について粘膜ワクチン接種ストラテジーが意図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的化され得るが、粘膜に免疫原性タンパク質を送達するため、種々のストラテジーが使用されてきた(これらのストラテジーは、例えば、ベクター標的タンパク質として特異的粘膜標的タンパク質を用いることによる、または粘膜標的タンパク質との混合物としてワクチンベクターを送達することによる、DNAワクチンの送達を含む)。
【0088】
例えば、特定の実施形態において、免疫原性ポリペプチドまたはベクターワクチンは、コレラ毒素(例えば、コレラ毒素Bまたはコレラ毒素A/Bキメラ)との混合物として、またはコレラ毒素との結合体もしくはキメラ融合タンパク質として、投与され得る(Hajishengallis.,J Immunol.154:4322〜32,1995;JoblingおよびHolmes、Infect Immun.,60:4915〜24,1992)。コレラ毒素Bサブユニットの使用に基く粘膜ワクチンが記載されている(LebensおよびHolmgren,Dev Biol Stand 82:215〜27,1994)。別の実施形態において、熱不安定性エンテロトキシン(LT)との混合物が粘膜ワクチン接種のために調製され得る。
【0089】
他の粘膜免疫ストラテジーとしては、マイクロカプセル中の免疫原のカプセル化(米国特許第5,075,109号、同第5,820,883号、および同第5,853,763号)、および免疫増強膜性キャリアの使用(WO 98/0558)が挙げられる。経口投与された免疫原の免疫原性は、赤血球(rbc)またはrbcゴースト(米国特許第5,643,577号)を用いることによって、またはブルータング抗原(米国特許第5,690,938号)を用いることによって増強され得る。標的化免疫原の全身投与はまた、粘膜免疫を生じ得る(米国特許第5,518,725号を参照のこと)。
【0090】
種々のストラテジーを用いて、粘膜組織における発現のための遺伝子を送達し得る(これには、例えば、キメラレトロウイルス(米国特許第5,714,374号)、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、または核酸の特異的標的化(WO 97/05267)を使用する)。
【0091】
(実施例)
本発明は、以下の実施例に対する言及によってより良好に理解される。以下の実施例は、例示の目的のためであって、本発明の限定を意図しない。
【0092】
(実施例1:個々の潜在性EBV産物に対するCD4+反応陽性の同定)
EBNA−1について、本発明者らは、この抗原を組換えタンパク質として、外因的に(Zhangら、Nucleic Acids Res.,26:631〜7,1998;FrappierおよびO’Donnell,J.Biol.Chem.,266:7819〜26,1991)か、または組換えワクシニアウイルス構築物を介して内因的にのいずれかで送達した。本発明者は、T細胞活性化および増殖、IFNγ分泌、ならびにCTL活性によってモニターされるように、いずれかの経路によって提示されたENBA−1に対する強力なCD4+T細胞応答を発見した。この免疫応答は、EBV感染およびEBV関連悪性疾患に抵抗するために利用され得る。
【0093】
(材料および方法)
(細胞株)
EBVトランスフォームしたB細胞株であるLRM(HLA−A2、HLA−B44、HLA−DRB1*0401、HLA−DOA1*03、HLA−DQB1*0301、HLA−DP4)(Friedeら、Biochim.Biophys.Acta.1316:85〜101,1996)およびLG2(HLA−DRB1*0101、HLA−DQA*0101、HLA−DQB1*0501、HLA−DPA1*0101、HLA−DPB1*0201)(Gorgaら、J.Biol.Chem.26:16087〜94,1987)を用いた。B−LCLを、RPMI−1640+10%FCS+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシン中で培養した。LCL−BM(HLA−A1、HLA−A3,HLA−B7、HLA−B8、HLA−Cw6、HLA−Cw7、HLA−DR4、HLA−DRw14、HLA−DRw52、HLA−DRw53、HLA−DQw3)およびLCL−DC(HLA−A2、HLA−A24、HLA−B38、HLA−B46、HLA−Cw1、HLA−Cw7、HLA−DRB1*1502、HLA−DRB1*0901、HLA−DRB4*01、HLA−DRB5*0101、HLA−DQB1*0502、HLA−DQB1*0303)を、RPMI−1640+20%FCS+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシン+1μg/mlサイクロスポリンAの中で、マーモセット細胞株B95.8の上清を用いて、PBMCの健常型ドナーを培養することによって生成した。BSC40サル腎臓細胞株をDMEM+5%FCS+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシン中で増殖させ、そして組換えVVストックを力価測定するためのプラークアッセイに用いた。
【0094】
(樹状細胞(DC)およびPBMC調製物)
New York Blood Centerの白血球濃縮物(バフィーコート)、およびPBMCの供給源として役立った実験室のドナーからの白血球(Ficoll−Paque(Pharmacia)上の密度勾配遠心分離によって単離された).CD2+PBMCを、ノイラミニダーゼ(Calbiochem)処理ヒツジ赤血球(Colorado Serum Company)を用いてロゼット化すること、次いで1.666%塩化アンモニウムを用いる赤血球溶解によって分離した。指示された場合、CD8+T細胞またはCD4+T細胞を、Leu2a抗体もしくはOKT8抗体(CD8について)、またはHP2/6抗体(CD4について)を用いて枯渇させ、続いて、ヒツジαマウスIgG Dynabeadおよび磁性粒子濃縮器MCP−1(Dynal,Norway)を用いてインキュベーションした。DCを記載(Benderら、J.Immunol.Methods,196121〜35,1996;Romaniら、J.Immunol.Methods,196:137〜51,1996)のように、CD2−PBMCから生成した。106CD2+PBMC/mlを、RPMI−1640+1%単一ドナー血漿+1000U/ml rhIL−4+1000U/ml rhGM−CSF+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシンとともに6ウェルプレート中にプレーティングした。100μlを、200μl/ml RPMI−1640+1%単一ドナー血漿+5mMグルタミン+20μg/mlゲンタマイシンで置換し、そして1000U/ml rhIL−4、および1000U/ml rhGM−CSFを、2日目、4日目および6日目に添加した。7日目、浮遊している未熟なDCを、新しいプレートに3×105細胞/mlに移し、そして培地の半分を単球馴化培地で置換し、2日間、DCを成熟した。
【0095】
(ワクシニアウイルスストック生成およびDCの感染)
組換えワクシニアウイルスを、ウサギ腎臓RK13細胞中で増殖した。成熟DCを37℃で1時間2のMOIで感染させ、そして3回洗浄した。感染の効率を、記載のように、VV1−6B6抗体を用いた29kDのワクシニア早期タンパク質の細胞内染色を用いたFACSによって、6〜12時間後にチエックした。
【0096】
(CD4+T細胞株およびクローンの生成)
CD8−CD2+PBMCを、30:1(T:DC)の比で成熟DCを用いて刺激した。CM171198細胞株について、健常ドナーCMのT細胞(HLA−A*0201、HLA−A*6801、HLA−B*4402、HLA−B*4402、HLA−B*0702、HLA−C*0501、HLA−C*0702、HLA−DRB1*1501、HLA−DRB1*0401、HLA−DRB5*01、HLA−DQB4*01、HLA−DQB1*0602、HLA−DQB1*0301)を、vvEBNA−1ΔGA感染自己成熟DCを用いて4週間刺激し、これにはフィーダーとして自己CD2+PBMCを含む毎週の再刺激を伴い、そして次いで、EBVでトランスフォームしたHLA−DRがマッチした細胞株LRMまたはvvEBNA−1ΔGA感染DCを用いた変更を行う。CM110199細胞株を、10μMの組換えEBNA−1タンパク質(成熟刺激薬と一緒に7日目に添加した)とともにインキュベートしたDCを用いることによって、ドナーCMのT細胞から生成した。E.coliおよびバキュロウイルス/昆虫細胞の発現系から精製したrEBNA−1を代わりに用いた(Zhangら(前出)1998;FrappierおよびO’Donnell(前出))。指示された場合、E.coli誘導DNA−Cをコントロールタンパク質(E.coliコントロール)として用いた。DMEM+5%HS中の刺激の14日後、50U/ml rIL−2を補充した。自己B−LCLでの刺激のために、健常ドナーJTのCD2+PBMCを、DMEM+5%ヒト血清+10U/ml IL−2(Lymphocult,Dreieich,Germany)中で、1:10のB細胞対T細胞の比で、照射した自己LCL−JTを用いて、14日間刺激した。指示された場合、CD4+T細胞またはCD8+T細胞を枯渇させた。
【0097】
EBNA−1特異的CD4+CTLを、96ウェルプレート中で、白血球濃縮物由来の104の自己B−LCLを用いて105のCD8−CD2+PBMCを、14日間、刺激すること(7日目での再刺激を伴う)によって、限界希釈条件下でクローニングした。IL−2を、再刺激の間、最終濃度10U/ml(Lymphocult)に、培養に添加した。微量培養物をvvEBNA−1ΔGAまたはvvTK−に感染した自己DC、自己B−LCLまたはLCL721.221に対して、スプリットウェル51Cr放出アッセイにおいて試験した。この最初のT細胞数で、ウェルの30%未満がCTLを発生し、このことは、レスポンダーのクローン性について90%を超える可能性を示した(Taswellら、J.Exp.Med.151:1372〜85,1980)。
【0098】
(刺激されたCD4+T細胞集団およびPBMCのFACS分析)
RPMI−1640+5%HS中で、37℃1時間、2のMOIで組換えVVを用いて、または0.5のMOIでインフルエンザウイルス(PR8,PuertoRico/8/34,Spafas Inc.,Storrs,CT)を用いて、成熟DCを感染した。DCを2回洗浄し、そして3×103を、7日間96ウェルプレート中の105のCD8−CD2+PBMCに添加した。7日目に、培養物を1ウェルあたり、105のPBMCおよび3×103DCを用いて再刺激し、そしてさらに7日間インキュベートした。1ウェルあたり、105の照射した(3000rad)PBMCおよび3×103のDCを用いて、培養物を再刺激し、さらに7日間インキュベートした。14日後、1μlのSimultest CD4−FITC/CD8−PE(Becton Dickinson)含有100μl PBS+1%FCS+0.005%アジ化ナトリウムを用いて氷上で30分間、培養物を染色した。3回の洗浄後、培養物をFACScan(Becton Dickinson)で分析した。CD56抗体染色(PharMingen)には、二次抗体としてPE−ヤギαマウス−IgG抗体(Biosource)を用いた。PBMCを、一次抗体としてHLA−DR4抗体(Accurate)、および二次抗体としてFITC−ヤギα−マウスIgG抗体(Biosource)を用いて、HLA−DR4について分類した。
【0099】
(IFNγ分泌細胞についてのELISPOTアッセイ)
10μg/mlのαIFNγ抗体1−D1K(MABTECH)を含有する50μl/ウェルの50mM Na2CO3(pH9.5)を用いて、MAHA S45プレート(Millipore)を、4℃で一晩、コートした。プレートをPBSで4回洗浄して、DMEM+5% HSを用いて37℃で1時間ブロックした。その後、105のキラーT細胞(responder T cell)および3×103〜104の刺激因子DCを1ウェルあたりに添加して、37℃で1〜2日間インキュベートした。ついで、このプレートをPBS+0.05% Tween 20を用いて4回洗浄し、そして1μg/mlのビオチン化αIFNγ抗体7−B6−1(MABTECH)を含有するPBSを1ウェルあたり50μlを用いて、37℃で2時間インキュベートした。その後、このプレートを再度、PBS+0.1%Tween 20で4回洗浄し、そして室温で1時間事前準備したアビジン−ペルオキシダーゼ複合体VectastainABCキット(Vector laboratories)を用いて、室温で20分インキュベートした。PBS+0.1%Tween20でのさらに4回の洗浄後、50μl/ウェルの安定なDAB(Research Genetics)を室温で5分間添加した。プレートを水で3回洗浄し、そして風乾した。105細胞あたりのSFCを、実体顕微鏡を用いてカウントした(トリプレットの平均カウント)。指示された場合、αHLA−DR抗体L243(Lampson,およびLevy,J.Immunol.125:293〜9,1980)またはαHLA−A、B、C抗体B−H9(Biosource)を5μg/mlに添加した。
【0100】
(増殖アッセイ)
DMEM+5%HS中で5日間、3×103〜104の刺激因子DCとともにキラーT細胞(105)をインキュベートした。1ウェルあたり、1μCiの3H−チミジンを一晩添加し、そして自動デバイス(Skatron)によって回収し、そしてBetaplate 1205(LKB Wallac)中でカウントした。カウントは、三連の平均値を示す。
【0101】
(51Cr放出アッセイ)
50μCi Na2 51CrO4を用いて37℃で45分間、標的を標識した。標識した標的をCTLを含有するRPMI+10%FCS+2mMグルタミンを用いて4時間インキュベートした。上清をSkatron収集システムを用いて収集し、そして放射線活性をγカウンター(1470 Wizard,Wallac,Turku,Finland)中で測定した。比溶解性のパーセントは、以下である:([実験ウェルのcpm−自発的放出のcpm]/[最大放出のcpm−自発的放出のcpm])×100%。培地を用いて標識した標的をインキュベートすることによって自発的放出を決定し、そして1%Triton X−100溶液中で標的をインキュベートすることにより最大放出を決定した。
【0102】
(結果)
CD4+T細胞により認識される潜伏的EBV抗原を同定するために、CD8−CD2+末梢血液単核細胞(PBMC)を、EBV潜伏抗原(EBNA−1、3A、3B、3CおよびLMP1、2)を発現する組換えワクシニアウイルス構築物で感染した自己DCを用いて2週間刺激した。DCを用いた2つのシュミレーションの際に、増殖したCD4+T細胞(「芽細胞(blast)」)の存在によって、応答を評価した。詳細には、EBV組換え体のパネルのうち1つを用いて、培養の最初の週にCD+T細胞を刺激し、次いで、この培養物を2つに分け、第2週に、元来の組換えワクシニアウイルスを用いて、またはコントロールとしてvvTK−を用いて再刺激した。本発明者らは、初代EBV組換え体に対する特異的な,幼若化反応を見出した。7つ全てのドナーが、vvEBNA−1に対する強力な応答を示した(表1;図1A、B)。陰性コントロール(vvTK−)に対する応答は、表1から除外された1例のドナー以外は、全てにおいて弱かった(図1E)。全てのドナーは、インフルエンザ感染DC(陽性コントロールとして用いた)に応答した(図1F)。7つのドナーのうち、他のvvEBV構築物に反応したのはより少ない比率であった(すなわち、EBNA3B(4/7)、EBNA3A(1/7)、およびLMP1(3/7)(表1A))。組換えワクシニアウイルスが成熟DCのかなりの比率に感染することを確実にするため、29kDのワクシニアの初期タンパク質の細胞内発現を、フローサイトメトリーによって測定した。再現可能に、40〜60%のDCを、組換えワクシニアウイルスで感染させた。EBNA−1のCD4+認識の信頼性は、IFNγ分泌についてのELISPOTアッセイにおいて確認し得る。ここで、EBNA−1は、優先的に認識されたEBV潜伏遺伝子であった(表1B)。本発明者らは、インビトロにおけるEBNA−1に対するこれらのCD4+T細胞反応が、インビボにおける血液ドナーのEBV感染による最初のプライミングを反映しているとみなす。なぜなら、本発明者らは、EBNA−1を用いて臍帯血標品由来の新生児のT細胞を刺激した場合、2週内には幼若化反応を見出さなかったからである。本発明者らは、7つの発現されたHLA−DR4のうちの2つのみから、本発明者らのドナーがHLAクラスII多様性を示したことを証明した。
【0103】
【表1】
次に、本発明者らは、必須のMHC拘束エレメントおよび細胞株(HLA−DR4+ドナーに最初に由来する)CMを生成することによる経路のプロセシングを追及した。次いで、本発明者らは、EBNA−1を発現する組換えワクシニアウイルスで感染した、または可溶性EBNA−1タンパク質を適用した、DCとのT細胞株の反応性を試験した。内因性にプロセシングしたEBNA−1を用いてCD8−CD2+PBMCを刺激することによって、1つの株、CM171198を、確立した。従って、APCは、DR4−マッチしたB−LCL LRM、またはvvEBNA−1ΔGAで感染した自己DCのいずれかであった。後者の構築物は、MHCI提示をブロックし、そしてまたEBNA−1の発現を減じる、GA反復を欠失していた。他の株、CM110199を、外因的に供給したEBNA−1を用いて刺激した。従ってそれらの最終成熟の間、DCを、E.coli、またはバキュロウイルス−昆虫細胞系のいずれかにおいて発現した組換えEBNA−1タンパク質に暴露した。1ヶ月の培養の後、両方の株は、優先的にCD4+T細胞を含んだ(CM171198においては90%(図2A)、およびCM110199においては76%)。両方の株は以下のアッセイにおいて同様に実施した。従ってCM171198のデータのみを示す。
【0104】
CD4+T細胞株は、vvEBNA−1ΔGAで感染されるか、または組換えEBNA−1を外因的に供給されたDCを認識した(図2C、3A)。反応性は、ELISPOTアッセイにおいてIFNγ分泌として測定できる(図2)か、または増殖アッセイにおいて測定できる(図3)。T細胞応答は、抗HLA−DR抗体(L243)の添加によってブロックされたが、抗HLAクラスI抗体(B−H9)によってはブロックされなかった(図2D)。予想どおり、GA反復ドメインの存在は、このHLA−DR拘束提示に対して影響を有さなかった。なぜなら、全長vvEBNA−1で感染したDCはまた、EBNA−1発現がvvT7との同時感染によって増強され、この構築物におけるEBNA−1についてのT7プロモーターを駆動する限り、CM171198によって認識される(図2D)からである。全長EBNA−1発現ワクシニアウイルスで感染したDCにおけるEBNA−1のgly/alaマイナス形態が存在し得るが、本発明者らはまた、B−LCLの特異的T細胞認識を観察する(図3)。ここで、全長のEBNA−1のみが検出される(Blakeら、Immunity,1997,7:791〜802を参照のこと)。これは、gly/ala反復が、MHCクラスIIプロセシングおよび提示に影響を有さないことをさらに示唆する。
【0105】
さらに、EBV陰性ラモス(Ramos)バーキットリンパ球細胞株は、ワクシニアEBNA−1で感染したDCに匹敵するレベルでEBNA−1特異的T細胞を刺激した。しかしラモス細胞は、同種異系のLCL由来のEBNA−1、または高用量のEBNA−1タンパク質由来のENBA−1を捕獲できなかった。このデータは、EBNA−1が、B細胞株中で内因的にプロセシングされるという知見をさらに支持する。
【0106】
EBNA−1でチャージしたDCに加えて、CM171198細胞株は、さらなる抗原の追加なしに、EBVでトランスフォームしたB−LCLを認識した。しかし、LCL標的は、DR4対立遺伝子と適合されなければならない。従って、DR4+LCL(LRMおよびLCL−BM)は、増殖を誘導したが、DR4―細胞(LG2およびLCL−DC)は、誘導しなかった(図3B)。従って、EBNA−1特異的CD4+T細胞は、EBVでトランスフォームされたB細胞を認識するようである。
【0107】
EBNA−1がまたCD4+CTL応答のための抗原であるか否かを決定するため、本発明者らは、別の(ただし、HLA−DR4−ではない)健常ドナーJT由来のCD8−CD2+PBMCを、照射した自己B−LCL(全ての公知の潜伏性EBV抗原を発現する(KieffおよびLiebowitz(前出))を用いて、14日間刺激した(これには、7日後に再刺激1回を伴う)。CD8−CD2+T細胞の刺激に平行して、本発明者らは、バルクCD2+T細胞およびCD4−CD2+T細胞におけるB−LCLに対する応答を追跡した。51Cr放出アッセイをまず実施し、自己B−LCLに対する溶解活性を実証し、次いで異なる組換えEBV構築物で感染したDC標的を用いて、EBV特異性を評価した。刺激されたT細胞集団の内容を、FACSによって決定した。CD8−枯渇レスポンダーを、CD4+細胞について富化し(図4B)、CD4−枯渇レスポンダーを、CD8+細胞について富化し(図4C)、そしてバルクT細胞は、1:2のCD4/CD8比を有した(図4A〜C)。全てが、約25%のCD56+NK細胞を含んだ。刺激された集団の全て(すなわち、バルクT細胞(図4D)およびCD4(図4E)またはCD8(図4F))が、細胞を富化し、自己B−LCLを殺傷し、そしてT2細胞株の認識の乏しさを示した。後者は、おそらく、NK細胞が混入することが原因であり得る。しかし、著しいことに、異なるT細胞レスポンダーのEBV標的は、全く異なった(図4、G〜I)。CD4+T細胞は、好ましくは、EBNA−1、EBNA3CおよびLMP1(図4H)を認識したが、CD8+T細胞は、LMP2aを認識した(図4I)。バルクT細胞は、EBNA3C(このドナーにおけるCD4+細胞の優勢抗原)、およびLMP2a(CD8+T細胞の優勢抗原)を認識した(図4G)。
【0108】
刺激された細胞のCTL機能をさらに評価した。期待どおり、自己B−LCLの殺傷は、CD4富化集団を試験した場合のみ、L243抗HLA−DR抗体によって完全にブロックされた(図5B)。CD8富化培養物によるLCL−JT殺傷は、抗HLA−DR抗体によってブロックされず(図5C)、そしてバルクT細胞による殺傷は部分的阻害のみであった(図5A)。CD4富化T細胞はまたEBNA−1適用したDCを溶解した(図5E)が、CD8富化培養物は、溶解せず(図5F)、そしてバルクT細胞はわずかに溶解した(図5D)。従って、CD4 T細胞は、自己B−LCLを溶解し得、そしてEBVコード標的のうち1つがEBNA−1潜伏遺伝子である。
【0109】
個々のCD4+T細胞がEBNA−1および内因性にEBNA−1を発現するB−LCLでチャージしたDCを溶解したことを証明するため、本発明者らは、自己B−LCLで刺激した低温保存T細胞からの限界稀釈によってクローニングしたCD4+CTLを研究した。DC、T細胞および自己B−LCLを白血球濃縮物から誘導した。全てのEBNA−1特異的CD4+CTLは、自己B−LCLを殺傷し得る(図6A、6B)。vvTK−コントロールベクターまたはLCL721.221(HLAクラスI NK標的)で感染したDCの認識は、これらのクローンには欠しかった(図6A、6B)。従って、CD4+T細胞は、自己B−LCLを溶解し得、そして標的の1つはEBNA−1である。
【0110】
これらの知見は、EBVが潜伏的に感染したB細胞に対するCD4+T細胞の反応性を実証する。核抗原EBNA−1は、健常成人由来のCD4+T細胞によって繰り返し認識される。CD4+T細胞は、増殖、サイトカイン分泌、および細胞障害性の活性を有し得る。本発明者らが試験した他のEBV潜伏抗原(EBNA3A、3B、3C;LMP1、2;表1)はCD+T細胞によって認識され得るが、EBNA−1よりも確実性が劣った。一つのEBNA−1特異的CD4+T細胞クローンは、以前に記載されている(Khannaら、Int.Immunol.9:1537〜43,1997)。このクローンのみが、おそらく低親和性によって、内因性にプロセシングされたEBNA−1を用いて標的を殺傷した。本明細書において記載されたCD4+T細胞は、トランスフォームされたB−LCLのHLA−DR産物に存在するような生理学的な濃度でさえ、バルク培養物中で容易に同定され、そして外因性経路および内因性経路によってプロセシングされたEBNA−1を認識する。しかし、より一般的な場合、MHCクラスII上への内因性核抗原の首尾良いプロセシングは、通常ではない。ペプチドがB細胞のMHCクラスII分子から溶出した場合、同定されたペプチドの約20%のみが外因性起源である(Rammenseeら、MHC ligands and peptide motifs、Springer:Lands Bioscience,Austein,1997)。内因性に誘導されたペプチドはまた、H2−Ad上に核抗原様CBF359 〜 74(Rudenskyら、Nature、353:622〜7,1991)、HLA−DRB1*0405上にヒストンH3110 〜 127(Friedeら、前出、1996)、HLA−DRB1*0801上にc−myc371 〜 385(Chiczら、J.Exp.Med.178:27〜47,1993)、およびHLA−DRB1*1401上にヒストンH431 〜 45(Harrisら、Blood,87:5104〜12,1996)を含む。
【0111】
EBNA−1特異的CD+T細胞は、EBVトランスフォーム細胞に対して(例えば、その溶解性機能によって、またはLMP−1およびLMP−2のような他のリンパ腫関連EBV産物に対するCD8+CTL応答を維持することによって)直接の抵抗性を提供する。γヘルペスウイルスに対するCD4+T細胞防御についての環境的な証拠が文献としてかなりの量存在する。
【0112】
a)ワタの先端部のタマリンSanguinis oedipusにおけるEBVに対するCTL応答(Clearyら、Science,228:72204,1985)は、高い程度のMHCクラスII拘束に対する(Wilsonら、Clin.Exp.Immunol.,103:199〜205,1996)。MHCクラスI拘束された、EBV特異的CTLは、今日まで、この新世界ザルにおいて見出されておらず、そしてこの種は古典的なMHCクラスを欠く(しかし、これはHLA−GおよびHLA−Fのような非古典的なクラスI遺伝子の相同体を発現する(Watkinsら、Nature,346:60〜3,1990))。
【0113】
b)MHV−68による、マウスでのγ−ヘルペスウイルス感染は、IFNγを分泌するCD4+T細胞によって制御され得る(Christensenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:5135〜5140,1999)。
【0114】
c)CD4+T細胞によるバーキットリンパ腫細胞の増殖の制御は、培養物中で記載されており(Schattnerら、Blood,88:1375〜82)、そしてこのリンパ腫は、単一のEBV遺伝子(EBNA−1)だけを発現する。
【0115】
d)HIV−1感染の初期において、CD4+T細胞カウントが依然として高いが、CD4+T細胞機能が損なわれ始めた場合、患者は、単球増加ではなくバーキットリンパ腫を発生し得る(Levine,Blood,80:8〜20,1992)。
【0116】
e)CD4+反応の重要性は、SAP(T細胞同時刺激分子SLAMもしくはCDw150のインヒビター)の変異体または欠失を有する、X連鎖リンパ球増殖疾患患者においてみられるEBV誘導の感染性単球増加の原因であると考えられる(Sayosら、Nature,395:462〜9,1998)。
【0117】
f)EBNA−1に対する抗体応答は、ほとんどのドナーにおいて検出可能である(Roweら、J.Gen.Virol.69:1217〜28,1988)。このことは、本発明者が観察した、CD4+ヘルパー細胞の存在、およびEBNA−1がCD4+応答について単一の確実なEBV抗原であるということと整合性がある。
【0118】
これらの観察は、本明細書に記載される、EBNA−1に対するCD4+T細胞応答についての直接の証拠とともに、後期T細胞が、ほとんどの健常なEBV感染個体において、バーキット、ホジキン、および他のEBV関連悪性腫瘍に対する抵抗性を提供し得ることを示唆する。本発明者らのデータはまた、EBNA−1がこのような悪性腫瘍を予防および処置するための抗原として用いられ得ることを示唆する。
【0119】
例えば、EBNA−1を適用した樹状細胞を用いた上咽頭癌の免疫療法は、寛解を生じるはずである。免疫療法は、上咽頭癌を効果的に処置するのに重要であると考えられる(Tsukudaら、J.Cancer Res.Clin.Oncol.,120:115,1993)。
【0120】
上咽頭癌を処置する能力は、この疾患を管理するのに重要な進歩を示す。今までの処置としては、放射線療法、外科切除、および化学療法が挙げられる(SangurinetiおよびCorvo,Oncol.Rep.,6:377,1999)。しかし、この形態の癌は、処置が困難であり、そして処置レジメン(特に放射線療法)は、脳に対して付随する重大な損傷(例えば、放射線誘導両側性視覚神経障害)を引き起こす(Wijersら、Stohlenther.Oncol.,175:21,1999)。
【0121】
(実施例2:EBNA−1特異的CD4+T細胞は、機能において主にTH1である)
実施例1は、健常ドナー由来の血液細胞における、構成的なEBNA−1特異的CD4+T細胞応答を開示する。これらのCD4+T細胞(そのいくつかは、IFNγを分泌する)を検出するため、2週刺激培養を用いた。ここでは、DCが抗原提示細胞であり、そして精製されたCD4+T細胞がレスポンダーであった。本実施例は、EBNA−1特異的CD4+T細胞がTH1表現型に傾斜していること、およびこの応答がインビボで検出され得ることを確立する。
【0122】
(材料および方法)
(樹状細胞およびCD4+T細胞の調製)
DCの生成については、上記実施例1を参照のこと。いくつかの実験では、rEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を、成熟刺激薬とともに、示した濃度でDC細胞培養物に添加した。51Cr放出アッセイにおける標的としての使用のために、標的としての使用の前に、DCを1μg/mlのrEBNA−1タンパク質または1μg/mlのrPCNAコントロールのいずれかを用いて適用した。CD4+T細胞の陽性選択のために、CD14−細胞を、磁性マイクロビーズ(Miltenyi)に結合体化したモノクローナル抗ヒトCD4抗体で処理した。T細胞およびDCは、新鮮に、またはFCSおよび5%DMSO中での低温保存後に用いた。
【0123】
(組換えワクシニアウイルスワクチンでのDC感染)
ウイルスは以前に記載されている(Subkleweら、Eur.J.Immunol.1999,29:3995〜4001)。成熟DCを、ネガティブコントロールとしてチミジンキナーゼ(vvTK−)発現組換えワクシニアベクター、またはvvEBNA−1ΔGA発現組換えワクシニアベクターを用いて、2のMOIで37℃で1時間感染させた、そして5%ヒト血清を有する培地中で3回洗浄した。感染を、以前に記載のように(subkleweら、1999、前出)、ワクシニア早期タンパク質に対するVV1−6B6抗体を用いて、細胞内染色によって、続いてFACS分析によって、6〜12時間で検証した。DCの感染は、均一に40〜60%であった。
【0124】
(組換えEBNA−1およびPCNAコントロールタンパク質の発現および精製)
EBNA−1458 〜 641を発現ベクターpET15b(Novagen、Madison,WI)に挿入した。このベクターをE.coli BL21(DE3)pLysS細胞中にトランスフォーメーションした。増殖細胞核抗原(PCNA)がE.coli BL21(DE3)pLysS細胞(Ming Guo(コーネル医科大学、New York)より寄贈)において発現した。細菌培養物を、37℃で0.8のOD595まで増殖した。次いで、EBNA−1またはPCNA発現を1mM IPTGで3時間誘導した(GibcoBRL、Grand Island,NY)。遠心分離による回収後、細胞を50mM Na2PO4、300mM NaClおよび10mMイミダゾールに、5ml/gの細胞ペレットの容量まで、再懸濁した。リゾチームを氷上に30分間で1mg/mlまで添加し、この懸濁液を超音波処理して完全に溶解した。4℃で30分間20,000×gの遠心分離後、透明な上清を0.45μmフィルターを通して濾過し、そして溶解液10mlあたり、1mlのNi−NTAアガロース(Qiagen、Valencio、CA)を添加した。この懸濁液を4℃で1時間回転させ、そしてカラム(Biorad、Hercules、CA)に充填した。このマトリックスを、流出液のOD280が0.01未満になるまで、50mM NaH2PO4、300mM NaClおよび20mMイミダゾールで洗浄した。次いで組換えタンパク質を50mM Na2PO4、300mM NaClおよび250mMイミダゾールで溶出した。タンパク質含有画分をプールし、そしてPBSに対して4℃で一晩透析した。このタンパク質濃度を、OD280で決定し、純度をSDS PAGEで決定し、そしてEBNA−1特異的抗体(MAB8173)(CHEMICON Internat.Inc.,Temecula、CA)または6xH特異的抗体(AD1.1.10)(R&D System)を用いたウエスタンブロットによって同一性を決定した。
【0125】
(IFNγおよびIL4を分泌する細胞のELISPOTアッセイ)
ELISPOTアッセイを上記のように実施した。vvEBNA−1ΔGA応答は、それがネガティブコントロール(vvTK−)よりも10スポット多く、かつネガティブコントロールのスポットの少なくとも2倍である場合に、有意であるとみなされた。
【0126】
(EBNA−1特異的ELISPOTを産生する、CD4+T細胞の増殖)
陽性選択されたCD4+T細胞を、5%PHSを補充した培地中で、DC:T細胞比1:30で、vvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−感染DCとともに、7日間増殖した。いくつかの実験では、5μg/mlのW6/32抗MHCクラスIまたはL243抗MHCクラスIIのブロッキング抗体を、0日目、3日目、および7日目に添加した。7日目、増殖した細胞を、1μg/mlのrEBNA−1またはコントロールタンパク質であるrPCNAを適用したDCを用いて再刺激し、そしてIFNγまたはIL−4 ELISPOTについてアッセイした。他の実験では、ワクシニア増殖T細胞を、7日目に、rEBNA−1タンパク質またはPCNAコントロールタンパク質のいずれかの示された容量を適用したDCを用いて再刺激した。
【0127】
(新たに刺激されたPBMCにおけるサイトカイン分泌によるEBNA−1特異的細胞株の生成)
75×106個のPBMCを、5%PHSを補充した培地において、30:1の比率で、自己vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いて、7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたって刺激した。次いで、この細胞をMACS緩衝液で洗浄し、1800rpmで10分間遠心分離し、そして107細胞/80μl培地の濃度で、10%の胎仔ウシ血清(R10)を含む冷RPMIに再懸濁させた。次いで、抗IFNγまたは抗IL−4(Miltenyi)のいずれかに結合体化した一次抗CD45抗体を、107細胞当たり抗体10μlの比率で加えた。次いで、この細胞を5分間氷上に置き、引き続いて、温めたR10を、5×106細胞/mlの濃度まで加え、そして連続回転下で、37℃にて45分間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、細胞をMACS緩衝液で洗浄し、そして遠心分離した。このペレットを、MACS緩衝液80μl/107細胞で再懸濁し、そしてPE(Miltenyi)で標識されたIFNγまたはIL−4のいずれかに対する二次抗体10μlを、107細胞につき加えた。この細胞を、10分間氷上に置き、次いで、MACS緩衝液で洗浄し、そして遠心分離した。常磁性マイクロビーズ(Miltenyi)で標識された最後の抗PE抗体を、10μl/107細胞の比率で、4℃にて15分間加えた。上記のように磁性分離を行い、そして回収される細胞の純度を高めるために繰り返した。次いで、この細胞を遠心分離し、そして96ウェルプレートの1つのウェルにおいて、5%PHSおよび105個の照射CD14−フィーダー細胞を含む培地で培養した。この細胞を、毎週再刺激し;成熟刺激の時(5〜7日目)に、vvEBNA−1ΔGA感染DCを、2μg/mlのrEBNA−1を適用したDCと交替させる。3週間後、10U/mlのIL−2(Lymphocult、Biotest、Minneapolis、MN)を加えた。このようにして、本発明者らは、EBNA−1適用DCに反応してIFNγおよびIL−4を分泌する新鮮な血液中の細胞から株を調製し得た。
【0128】
(IFNγおよびIL−4細胞株のFACS分析および機能的分析)
上記のような株で開始してから3週間後、104個の細胞を、1:50のSimultest(CD4およびCD8、BD PharMingen、San Diego、CA)またはPE標識CD56抗体(Becton−Dickenson)によって、氷上で15分間染色した。3回の洗浄および4%のパラホルムアルデヒドによる固定後に、細胞をFACScan(Becton−Dickenson)で分析した。細胞傷害活性について、三連のこの細胞株を、指示されたエフェクター:標的の比率で、104個の標的に、5時間または24時間加えた。この標的を、50μCi Na2 51CrO4を用いて、37℃で1時間標識し、そしてR10で3回洗浄した。細胞溶解を測定するために、50μlの培養上清を、96ウェルサンプルプレートにおいて、シンチレーション流体(Wallac、Finland)100μlに加え、そしてγカウンター(1450 Microbeta counter、Wallac)において放射能を測定した。特異的溶解のパーセントを以下の式によって計算した:([cpm実験的ウェル−cpm自発的放出]/[cpm全放出−cpm自発的放出])×100%。自発的放出は、標識された標的を培地のみでインキュベートすることによって決定し;全放出は、標的を1%のTriton X−100と共にインキュベートすることによって決定した。
【0129】
(IgGサブクラスについてのELISA)
96ウェルのポリスチレンプレート(Nunc、Rochester、NY)を、PBS中のrEEBNA−1タンパク質、マンプス皮膚抗原USP(Pasteur Merieux Connaught、Swiftwater、PA)、破傷風トキソイド(Lederle、Philadelphia、PA)、PBS中のカンジダアルビカンス細胞溶解産物(Allermed Lab、San Diego、CA)1μg/ウェル、またはPBSのみで4℃で一晩コーティングした。プレートを3%の脱脂粉乳50μl/ウェルで30分間ブロックし、引き続いて、3%のBSAを含むPBS中で30分間処理した。3%のBSAにおいて1:10または1:100に希釈された試験血漿サンプルを、RTにて20分間加えた。プレートをTBST(10mMのTris、140mMのNaCl、0.05%のTween 20)で3回洗浄した。ビオチンマウス抗ヒトIgG1抗体、ビオチンマウス抗ヒトIgG2抗体、ビオチンマウス抗ヒトIgG3抗体、ビオチンマウス抗ヒトIgG4抗体(PharMingen)を1:1000でRTにて20分間加えた。プレートをTBSTで3回洗浄し、アビジン結合ビオチン化HRPをRTにて20分間加え、引き続いて、TMB基質(R&D systems)を加え、RTにてこの応答を10分間展開し、そして1MのH2(SO4)を加え、この応答を停止させ、そしてこのプレートをマイクロプレートリーダー(Dynex、Chantilly、VA)で読み取った。
【0130】
(結果)
(培養されたPBMCにおけるEBNA−1に対するCD4+T細胞応答は、主にIFNγTH1細胞に関係する)
実施例1において、本発明者らは、組換えワクシニアEBNA−1ウイルス(vvEBNA−1ΔGA)で感染させたDCによる2つの週の長さの刺激を用いて、EBNA−1特異的なIFNγ分泌CD4+T細胞を同定した。本明細書中で、本発明者らは、この応答が1日間および1週間の培養で検出され得るか評価し、そして本発明者らは、IFNγ分泌細胞およびIL−4分泌細胞の両方を数えあげた。コントロールワクシニアウイルス(vvTK−)で感染させたDCで刺激した培養において、両方の時点で、EBNA−1依存性T細胞が全く検出され得なかった。vvEBNA−1ΔGAを発現するDCで、本発明者らは、培養1日後に、3/9の正常ドナーにおいてTH1細胞を見出したが、どのドナーにおいてもTH2細胞を見出さなかった(図7A、B)。培養1週間で、8/9のドナーが、IFNγ細胞の増大を示したが、1/9のみがEBNA−1依存性IL−4分泌を有した(図7A、B)。1つのIL−4分泌において、IFNγ ELISPOTSの数はIL−4 ELISPOTSより3倍多かった。従って、ほとんどのドナーにおいて、EBNA−1応答性CD4+T細胞がTH1表現型を有し、IFNγを分泌し、そしてIL−4を分泌しない。他者らが、EBNA−1特異的T細胞応答が、表現型においてTH1でなくTH2であると見出した(Steigerwald−Mullenら、J.Virol.、2000、74:6748−6759を参照のこと)ことを考えると、これは、驚くべき予想外の結果である。
【0131】
これらのCD4+T細胞応答がMHCクラスII拘束されたことを確証するために、本発明者らは、MHCクラスI(W6/32)またはHLA−DR(L243)に対するブロッキング抗体の非存在下、あるいは存在下で、vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いてT細胞を1週間刺激した。IFNγ分泌細胞をELISPOTによって数えあげた場合、3つの実験において、88〜100%の範囲で、L243モノクローナル抗体のみが応答を減少させた。本発明者らは、EBNA−1に対するCD4+T細胞応答は、主にMHCII拘束され、そしてTH1型であると結論付ける。
【0132】
図7のおける実験は、EBNA−1特異的細胞を1週間増大させるためとELISPOTアッセイにおける1日間の再刺激ための両方のために、ワクシニアベクターを用いた。従って、次いで、本発明者らは、ELISPOTアッセイにおける抗原としての精製されたEBNA−1タンパク質の効力を試験した。IPTG誘導後に、EBNA−1配列のアミノ酸458〜641からなる組換えEBNA−1タンパク質、またはコントロールタンパク質としてのrPCNA、形質転換されたE.coli培養物から抽出した。この抽出物を、PBSに対して一晩透析し、そしてSDS PAGEおよびウェスタンブロットによって、純度および特異性について調べた(図8A)。これらのタンパク質を、濃度を変える際に、DCに対して適用させ、そして、一週間の増大の後、vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いてIFNγ ELISPOTを読み取るために使用した。図8Bは、PCNAコントロールと比較した場合の、rEBNA−1タンパク質の滴定を用いて観察された用量応答曲線を示す。差し込みグラフは、vvTK−またはvvEBNA−1ΔGAで再刺激されたvvEBNA−1ΔGA増大細胞の応答を比較する。DCに対して適用されたrEBNA−1タンパク質の1μg/mlのみの用量が、組換えワクシニアEBNA−1の応答に匹敵する応答を与えた。この結果は、EBNA−1特異的TH1細胞が、とても低い用量のEBNA−1に対応し得ることを示す。
【0133】
(エキソビボで直接単離された、EBNA−1特異的なサイトカイン分泌細胞は主にCD4+である)
大半のドナーからのEBNA−1特異的ELISPOT応答は、TH1非対称(skewing)サイトカインIL−12(Cellaら、J.Exp.Med.、1996、184:747−752;Kochら、J.Exp.Med.、1996、184:741−746)の高いレベルを作製する、DCとのCD4+T細胞の1週間の培養を必要とするので、本発明者らは、EBNA−1特異的細胞をエキソビボで直接単離した。6つのドナー由来の新鮮なPBMCを、vvEBNA−1ΔGA感染DCを用いて、7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)刺激した。次いで、この細胞を抗IFNγまたはIL−4抗体のいずれかに結合体化した抗CD45抗体で標識した。このようにして、サイトカインを分泌した細胞は、PEで標識された、IFNγまたはIL−4の別のエピトープに特異的な二次抗体を捕捉する。磁性マイクロビーズに結合体化した最後の抗PE抗体を加え、そしてこの細胞を磁場において選択した。この回収した細胞を、毎週の再刺激によって増大させ、vvEBNA−1ΔGA感染DCをrEBNA−1タンパク質を適用されたDCと交替させた。
【0134】
6つ全てのドナーにおいて、EBNA−1特異的なIFNγ分泌細胞株を確立し、そして3/6のドナーにおいて、IL−4分泌株を確立した。これらの株を(CD56、CD4またはCD8について)FACSによって分析すると、IFNγ株とIL−4株の両方は、主にCD4+細胞からなっていた。図9は、3つのドナー由来のIFNγ分泌株(すなわち、90%より多くのCD4を発現した細胞、および2%未満がCD8またはCD56(データは示さず))を示す。同様に、EBNA−1特異的IL−4分泌株は、90%より多くのCD4および2%未満のCD8またはCD56細胞からなる(データは示さず)。本発明者らは、健康な成体におけるEBNA−1特異的なサイトカイン分泌CD4+T細胞は、すでにインビボで分化されている(図9)が、これらの細胞は、代表的に、ELISPOTアッセイで検出されるため、インビトロで自己DCによって1週間増大させなくてはならない(図7)と結論付ける。
【0135】
(EBNA−1特異的TH2 CD4 T細胞ではなくEBNA−1特異的TH1 CD T4細胞は、EBNA−1発現DCを溶解し得る)
本発明者らは、EBNA−1特異的T細胞株は、EBNA−1タンパク質の異なる供給源を適用された自己B−LCLおよびDCを殺傷し得ることを示した。本発明者らは、他の抗原に対して特異的なCD4+T細胞によって観察されたように(Erbら、CellImmunol.、1991、135:232−44;Erbら、J.Immunol.、1990、144:790−795;Del Preteら、J.Exp.Med.、1991、174、809−13;Nishimuraら、J.Exp.Med.、1999、190、617−628)、この機能が、主にTH1株にって発現されるかについて評価した。5つのドナーからのIFNγ細胞株および3つのドナーからのIL−4株を、細胞傷害性およびELISPOTアッセイにおいて同時に研究した。EBNA−1依存性のIFNγまたはIL−4産生に基づいて、新鮮なPBMCから単離された細胞株は、外因性のIL−12またはIL−4の非存在下における数週間の刺激の後、TH1またはTH2極性を維持した(図10A、B)。本発明者らが、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DC、rEBNA−1タンパク質を負荷したDC、または自己B−LCLの溶解を試験すると、TH1株のみが、コントロールに対して、EBNA−1発現標的を溶解し、一方、TH2細胞株はIL−4の分泌を有するEBNA−1発現DCを認識した。図10C、Dは、段階的なエフェクター(Effector):標的(Target)比率でのこのデータを示し、一方、図10Eは、E:T比率が10:1でのいくつかの株についての殺傷をまとめる。TH2でなくTH1細胞株が、細胞溶解活性を有した(図10E)。
【0136】
(インビボのEBNA−1特異的IgGサブクラスはTH1免疫を反映する)
インビボでEBNA−1特異的なTH1およびTH2細胞の相対的活性を評価するために、本発明者らは、抗体応答のIgGサブクラスをモニターした。TH1サイトカインは、IgG1アイソタイプに対して抗体応答をゆがめ、そしてTH2はIgG4に対してゆがめたが、ヒトにおけるIgGサブクラスの分布は、マウスについて記載されたのと同じ程度厳密に偏向されない可能性がある(Bonifacioら、J.Immunol.、1999、163、525−32;Sousaら、Clin.Exp.Immunol.、1998、111、48−55;Hussainら、Immunology.、1999、98、238−43)。IgGサブクラスに対するELISAアッセイを用いて、7つのドナーにおけるEBNA−1特異的IgG抗体のアイソタイプを記載した。抗原として、本発明者らは、市販で入手可能なEBNA−1由来のgly−ala反復配列またはE.coliベクターによって発現されたC末端rEBNA−1タンパク質のいずれかを用いた。7つ全てのドナーが、それらのEBNA−1応答において、IgG1抗体の明確な優性を示した(図11)。これは、本発明者らが試験した3つの他の抗原(マンプス皮膚抗原、破傷風トキソイドおよびカンジダ溶解産物;図11)に対する応答と対照的であるが、2つのドナーは破傷風トキソイドに対して強いIgG1応答を示した。PBMCの新鮮および1週間の培養物おけるIFNγ分泌T細胞の即座の検出と組み合わせられた、抗体データは、健康なEBVキャリアにおけるインビボのEBNA−1に対する応答は、一貫してTH1型であることを示す。
【0137】
(考察)
新しいデータは、健康なEBVキャリアが、インビボでEBNA−1に対して、一貫してTH1型応答をなすことを示す。これらのT細胞は、血液中に存在し、そしてIgG1アイソタイプに対するEBNA−1抗体応答の明白な偏りの原因となる可能性がある(図10)。B細胞およびB細胞株は、IL−12を活発に産生することも、CD4+T細胞応答をTH1に偏向させることも知られていないので、本発明者らは、この様式において、DCがT細胞をゆがめるのを担うと推測する。ヒトDCは、瀕死のEBV感染B細胞由来のEBNA−1を効率的にプロセシングすること(Menzら、J.Exp.Med.、2000、191、1649−60)、そしてマウスのDCはインビボでTH1型にT細胞をゆがめること(Pulendranら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1999、96:1036−1041;Maldonado−Lopezら、J.Exp.Med.、1999、189:587−592)は現在公知である。ヒトのB細胞が、DCをインビボでEBNA−1を提示させるために、溶解性感染を受けなければならない場合、EBV感染に典型的である(RickinsonおよびKieff、Esptein−Barr Virus.In Virology.B.N.Fields、D.M.KnipeおよびP.M.Howley編 1996、Lippincott−Raven、Philadelphia.2397−2446)ように、EBNA−1特異的抗体の開発において遅延が予期される。従って、本発明者らは、EBNA−1に対するTH1の応答が、EBNA−1免疫の直接誘発物質として、感染B細胞と比べたDCについての優勢的役割を反映すると示唆する。
【0138】
CD4+T細胞は、ウイルス感染および腫瘍に対する耐性において重要である。HIV−1感染において、強力なCD4+T細胞応答が、長い期間の非プログレッサー(nonprogressor)で見出される(Rosenbergら、Science、1997、278:1447−1450)。HIV感染患者のこの少数派は、抗レトロウイルス治療なしで、高いCD4+T細胞数および低いウイルス負荷を有する。これらはまた、HIVp24およびgp160タンパク質に対してより強力なCD4+T細胞の増殖応答を示す。慢性的ウイルス感染におけるCD4+T細胞の役割は、マウスでより直接的に評価された(Cardinら、J.Exp.Med.、1996、184:863−871)。マウスのMHV−68γ−ヘルペスウイルスによる1次感染は、MHCクラスII−/−および+/+マウスにおいて同様に消散する。しかし、初期感染から3週間後に、このウイルスは、MHC IIノックアウトマウスにおいて再発し、次いでるいそうを発症し、そして4週間以内にこのマウスの大部分が死滅する。これは、初期ウイルスクリアランスが起こるという事実にもかかわらず、明らかにCD8+T細胞の細胞傷害性を通じて起こる。類似の知見が、CD4−/−マウスおよび野生型マウスにおけるLCMV感染に対するCD8+エフェクター機能の研究においてなされた(Zajacら、J.Exp.Med.、1998、188、2205−2213)。CD4−/−マウスは、より広範かつ慢性的な感染を引き起こすLCMV改変体を排除するのに失敗し、そしてこの改変体特異的CD8+Tリンパ球は、リンパ球の活性マーカーの発現にもかかわらず、(IFNγ分泌によって測定される場合)非機能的である。総合して、これらの結果は、CD4+T細胞がウイルス(KalamsおよびWalker、J.Exp.Med.、1998、188:2199−2204に概説される)および腫瘍(Toesら、J.Exp.Med.、1999、189:753−756に概説される)に対して有効なCD8+T細胞機能を維持するという新たな総意の一部である。
【0139】
CD4+T細胞についてのこの役割の基礎をなす機構は、抗原発現細胞、特にDCの機能改善を伴う可能性がある(Schoenbergerら、Nature、1998、393:480−483;Ridgeら、Nature、1998、393:474−478;Bennettら、Nature、1998、393:478−480)。CD4+T細胞との相互作用に引き続いて、DCは、それらの最初の増大と維持の両方において、CD8+T細胞のより有効な刺激物質となり得る。CD8+T細胞より活性化CD4+T細胞において大量に発現する、CD40Lは、DCに対する刺激物として、強く意図される。CD4は、DCにおいて豊富で、そしてその連結は、DCの発生および機能におけるいくつかの重要な工程を媒介する。これは、CD34+前駆体からのそれらの発生(Flores−Romoら、J.Exp.Med.、1997、185:341−349)、末梢組織からの動員(Moodycliffeら、J.Exp.Med.、2000、191:2011−20)、成熟(Cauxら、J.Exp.Med.、1994、180:1263−1272)、生存(Josienら、J.Exp.Med.、2000、191:495−501)およびサイトカイン分泌(特に、IL−12)(Cellaら、J.Exp.Med.、1996、184:747−752;Kochら、J.Exp.Med.、1996、184:741−746)を包含する。
【0140】
TH1は、ウイルスおよび腫瘍に対する耐性においてTH2 CD4+細胞より重要である。ヒトにおいて、TH1 CD4+Tリンパ球は、腎臓移植レシピエントにおいて一次CMV感染に耐性であるということが提案されている(Rentenaarら、J.Clin.Invest.、2000、105:541−8)。CMVポジティブ腎臓のCMVセロネガティブレシピエントを、移植後CMV特異的免疫応答についてモニターした。評価された全ての患者において、分極されたTH1応答が観察された。これらの患者は、免疫抑制性療法にもかかわらず、慢性のCMV疾患の徴候なしに、急性感染から回復した。さらに、マウスモデルの研究は、免疫学的耐性におけるTH1 CD4+細胞の重要性を強調する。オボアルブミンが代理抗原として腫瘍において発現される場合、オボアルブミン特異的TH1細胞の養子移入が、この抗原に対する同一のT細胞レセプターによるTH2細胞の養子移入よりも強いCD8+T細胞記憶を導いた(Nishimuraら、1999、上記)。IL−12と組み合わせたインフルエンザサブユニットワクチンで免疫された新生児マウスは、増強されたTH1サイトカイン発現を示し、そしてインフルエンザウイルスによるチャレンジ後に、インフルエンザサブユニットワクチンのみで免疫された新生児マウス間での55%の生存率と比較して、100%の生存を示した(Arulanandamら、J.Immunol.、2000、164:3698−704)。最近の研究は、水疱性口炎ウイルス(VSV)糖タンパク質に対して特異的な同一のTCR導入遺伝子を発現するTH1細胞およびTH2細胞のTCRβ−/−δ−/−マウスへの養子移入を利用した(Maloyら、J.Exp.Med.、2000、191:2159−70)。TH1とTH2の両方のT細胞は、ほぼおそらく、中和抗体の生成を通じて、VSV感染に対して組織的防御を与えた。しかし、TH1 CD4+T細胞のみは、致死的な鼻腔内感染に対して防御し得、そしてDTH応答を誘発し得た。これらの例は、一次ウイルス感染の制御、ならびに免疫的記憶の発生および維持におけるTH1 CD4+T細胞の重要な役割を示す。
【0141】
TH1 CD4+T細胞の防御的機能について可能な機構がいくつか存在する。IFNγ分泌は、B細胞を含む種々の細胞の型に影響を及ぼし、ここでは、IgGサブクラスを、マウスにおいてIgG2aに(Arulanandamら、2000、上記)、およびヒトにおいてIgG1に(Bonifacioら、1999、上記;Sousaら、1998、上記;Hussainら、1999、上記)、変更することに影響を及ぼす。これらの抗体は、オプソニン作用の有効性および補体の固定を増強し得る。インフルエンザに対するワクチン接種の前にIL−12を与えられた、新生児マウス由来の血清は、高められたレベルのインフルエンザ特異的なTH1依存性IgG2a抗体を示した(Arulanandamら、2000、上記)。これらのマウスからB細胞欠損マウスへの血清の受動移入は、生きたインフルエンザのチャレンジに対して、IL−12なしでワクチン接種されたマウス(これは、主にIgG1インフルエンザ特異的抗体を有する)由来の血清より良好な防御を与えた。しかし、他の研究において、サブクラスでなく、IgG抗体の量がウイルスチャレンジに対して防御を与えるのに重要であった(Backmannら、Science、1997、276:2024−2027)。TH1またはTH2のいずれかのトランスジェニックVSV特異的CD4+T細胞を注射されたTCRβ−/−δ−/−マウスは、VSVに対して分極されたIgG抗体を生成し、この両方が、防御免疫を与えた(Maloyら、2000、上記)。興味深いことに、本発明者らは、B細胞からの強い産生応答を指揮するDCの能力(Fayetteら、J.Exp.Med.、1997、185:1909−1918;Duboisら、J.Exp.Med.、1997、185:941−951)と一致して、EBNA−1に対するヒトのIgG,TH1型抗体応答は、他の抗体応答に大変大きく相関することを発見する(図11)。
【0142】
TH1 CD4+T細胞はまた、細胞傷害性を通じてウイルス感染を制御し得る。本研究において、TH1細胞のみが、EBNA−1発現標的を溶解し得る(図10)。TH1細胞に対する細胞傷害性の制御は、以前に記載された(Bonifacioら、1999、上記;Sousaら、1998、上記;Hussainら、1999、上記)。同様に、オボアルブミン特異的TH1およびTH2細胞がTCRトランスジェニックマウスから生成され、そしてオボアルブミンを発現するマウスの腫瘍細胞を溶解するそれらの能力について試験したモデルにおいて、IFNγ分泌CD4+T細胞のみが、腫瘍細胞を溶解した(Hussainら、1999、上記)。
【0143】
重要なことに、TH1細胞およびTH2細胞は、感染部位へホーミングする能力が異なる(Austrupら、Nature、1997、385:81−83;O’Garraら、Curr.Biol、1998、8:R646−9)。TH2細胞でなくTH1細胞は、感染組織で産生される対応するケモカイン(MCP−1、MigおよびIP−10)に応答して移動する(Maloyら、2000、上記)。これは、ケモカインレセプターの異なった発現(CCR2、CCR5およびCXCR3を発現するTH1細胞、ならびにCCR4を発現するTH2細胞)に起因する。
【0144】
上述されるように、腫瘍免疫のマウスのモデルにおいて、TH1またはTH2のいずれかの細胞の養子移入は、腫瘍を根絶するが、TH1細胞のみが腫瘍の再チャレンジに対して免疫記憶を発生させた(Hussainら、1999、上記)。興味深いことに、腫瘍根絶の機構は、2つの型のヘルパー細胞の間で大変異なっているように思われた。TH1細胞を受けたマウスにおいて、腫瘍は、主にリンパ球によって浸潤された。逆に、TH2細胞を受けたマウスは、好酸球および好中球によって特徴付けられた腫瘍浸潤を示した。
【0145】
EBNA−1タンパク質は、EBV関連の癌の全ての型において発現される単独のEBV潜伏タンパク質であり、そしてTH1 CD4+T細胞応答を誘発するので、このタンパク質は、ワクチン接種(特に、小児におけて)に対して、そしてEBV関連悪性疾患のための免疫療法に対して、新たな焦点を提供する。さらに、TH1応答に対する分極したEBNA−1特異的CD4+Tリンパ球を標的とする療法は、免疫原性DCへのEBNA−1の標的化に最も関与する。
【0146】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されない。実際、本発明の種々の改変は、本明細書中で記載される改変に加えて、前述の記載および添付の図面から、当業者に明らかである。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図する。
【0147】
さらに、全ての値はおよそであり、そして説明のために提供されることが理解されるべきである。
【0148】
本明細書中で引用される、全ての特許、特許出願、刊行物、および他のものは、それら全体において、ここに本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1A】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1B】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1C】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1D】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1E】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図1F】EBNA−1は、CD4+T細胞によって優先的に認識される。CD4+T細胞による芽球形成(blast formation)(CD4−FITC)を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己DCで刺激した、CD2+CD8−T細胞の培養物を分析した。A.培養物を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。B.培養物の芽球化を、vvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激し、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCで再刺激した。C.培養物を、vvEBNA3A感染DCで刺激し、そしてvvTK−感染DCで再刺激した。D.T細胞を、vvEBNA3A感染DCで刺激および再刺激した。E.ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、vvTK−感染DCで刺激および再刺激した。F.陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染DCに応答するCD2+CD8−T細胞。すべての培養物を同じドナー(表1における番号5)から調製した。芽球化部分集団のパーセント(矢印)を示す。
【図2A】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図2B】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図2C】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図2D】内因性経路および外因性経路による、DCに与えられるEBNA−1の認識。A.CD4+(CD4−FITC)対CD8+(CD8−PE)含量。B.CD8+(CD56−PE)含量。C.組換えバキュロウイルス発現EBNA−1タンパク質を負荷したDCで刺激した(DC+bEBNA−1)か、または負荷なしで刺激した(DC)IFNγスポット形成細胞(spot forming cell)/105細胞。D.vvTK−感染DC(DC + vvTK−),vvEBNA−1ΔGA感染DC(DC + vvEBNA−1ΔGA),vvT7感染DC(DC + vvT7),vvEBNA−1感染DC(DC + vvEBNA−1)およびvvEBNA−1/vvT7二重感染DC(DC + vvEBNA−1 +vvT7)とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体L243,αHLA−DR,(+L243)およびB−H9,αHLAクラスI(+B−H9)を使用して、MHC拘束を分析する。さらに、HLA−DR4+ B−LCL,LRM(LRM)対HLA−DR4− B−LCL,LG2(LG2)での刺激に際したスポット形成を示す。
【図3】種々のEBNA−1発現標的に対するCM171198細胞株の増殖応答。A:DC(DCのみ)およびT細胞(T細胞のみ)は、低いバックグラウンド増殖を示す。混合された場合(0)、ベクター単独(vvTK−)ではなくEBNA−1を発現する組換えワクシニアウイルス構築物(vvEBNA−1ΔGA)での感染に際して増加され得るいくらかの増殖が存在する。E.coli(eEBNA−1)およびバキュロウイルス/昆虫細胞(bEBNA−1)発現系由来の組換えEBNA−1タンパク質でのDCの外部負荷もまた、増殖を強めたが、E.coli由来のコントロールタンパク質(eコントロール)に対する反応性はなかった。B:CM171198細胞株とHLA−DR4対立遺伝子を共有するB−LCLは増殖を誘導する(LRMおよびLCL−BM)が、HLA−DR4が一致しないB−LCLは誘導しない(LG2およびLCL−DC)。
【図4A】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4B】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4C】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4D】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4E】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4F】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4G】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4H】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図4I】T細胞サブセットの細胞傷害活性およびEBV潜伏抗原特異性。左側の欄(A〜C)は、3つのPBMC応答動物集団のCD8対CD4 FACS染色を示す:(A)CD2+PBMC,(B)CD8−CD2+PBMCおよび(C)CD4−CD2+PBMC。中間の欄(D〜F)は、これらの応答動物による自己LCL(LCL−JT;黒色丸)およびT2細胞(T2;白色丸)に関して観察された溶解を示す。右側の欄(G〜I)は、3つの応答動物集団のEBV潜伏抗原特異性を、ELISPOTアッセイにおいて研究した(E1:vvEBNA−1ΔGA,E2:vvEBNA2,E3B:vvEBNA3B,E3C:vvEBNA3C,L1:vvLMP1,L2a:vvLMP2A,B1:vvBMLF1,LCL:LCL−JT)。
【図5A】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5B】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5C】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5D】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5E】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図5F】CTLサブセットによるHLA−DR拘束およびEBNA−1認識。上部に示されるエフェクターは、CD2+PBMC(A,D),CD8−CD2+PBMC(B,E)またはCD4−CD2+PBMC(C,F)のいずれかであった。上部の列(A〜C)は、5μg/mlのL243,αHLA−DR抗体(LCL−JT + L243)の存在下(白色丸、点線)または不在下(黒色丸)における自己B−LCL(LCL−JT)の細胞溶解性を示す。T2細胞(黒色三角)をコントロールとして使用した。下部の列(D〜F)は、E.coli由来のコントロールタンパク質を適用(pulse)された自己DC(eコントロール;黒色丸)、E.coli由来のEBNA−1タンパク質(eEBNA−1;白色丸)、またはバキュロウイルス/昆虫細胞由来のEBNA−1タンパク質(bEBNA−1;黒色三角)に対する比較における、自己B−LCL(LCL−JT;白色三角)に対する溶解活性を示す。
【図6A】CD4+CTLクローンの特異性。B−LCLを、2つの白血球濃縮物のサンプルから生成した。次いで、低温保存されたCD8−CD2+PBMCを、限界希釈下でこれらの自己B−LCLで2週間刺激した。その後、ウェルを分割し、そしてvvEBNA−1ΔGA(白色棒)またはvvTK−(黒色棒)感染DC、ならびに自己B−LCL(灰色棒)およびLCL721.221(第2の白色棒)、HLAクラスI NK標的に対する51Cr放出アッセイにおいて試験した。EBVトランスフォームB細胞上のEBNA−1エピトープを認識する11個のクローンを示す。これらは、2回の独立した実験(A,B)において2つの白血球濃縮物に由来した。
【図6B】CD4+CTLクローンの特異性。B−LCLを、2つの白血球濃縮物のサンプルから生成した。次いで、低温保存されたCD8−CD2+PBMCを、限界希釈下でこれらの自己B−LCLで2週間刺激した。その後、ウェルを分割し、そしてvvEBNA−1ΔGA(白色棒)またはvvTK−(黒色棒)感染DC、ならびに自己B−LCL(灰色棒)およびLCL721.221(第2の白色棒)、HLAクラスI NK標的に対する51Cr放出アッセイにおいて試験した。EBVトランスフォームB細胞上のEBNA−1エピトープを認識する11個のクローンを示す。これらは、2回の独立した実験(A,B)において2つの白血球濃縮物に由来した。
【図7】EBNA−1特異的T細胞応答は、TH1サイトカイン分泌によって支配される。CD4+T細胞を、vvEBNA−1ΔGAまたはvvTK−(ネガティブコントロール)に感染させた樹状細胞で刺激し、そしてT細胞単離の日(1日目)および1週間の増大後(7日目)におけるIFN−γ(A)またはIL−4(B)のその分泌を試験した。示される値は、三連の平均であり、そしてEBNA−1特異的スポットの数からネガティブコントロールを差し引くことによって導き出された。vvTK−コントロールの値は、0〜105の範囲であった。vvEBNA−1ΔGA応答は、それがvvTK−ネガティブコントロールよりも少なくとも10スポット多く、かつネガティブコントロールのスポットの少なくとも2倍である場合に、有意とみなした。
【図8A】EBNA−1特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えEBNA−1タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原(PCNA)タンパク質を、E.coli発現ベクターから溶出した。A.タンパク質を、一晩透析し、そしてSDS PAGEで純度について試験した。回収されたrEBNA−1タンパク質を、抗EBNA−1抗体MAB8173を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体AD1.1.10は、rEBNA−1タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。B.vvEBNA−1ΔGA感染DCを使用して、1週間の培養においてCD4+T細胞を増大させた。増大させたT細胞を、示される濃度のrEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を適用したDCを用いて最刺激し、そしてELISPOTで読み取った。rEBNA−1タンパク質を、DC培養の成熟相(6〜8日目)の間にDCに添加した。差込みグラフは、1週間vvEBNA−1ΔGA感染DCで増大され、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−コントロールのいずれかで再刺激されたCD4+T細胞に関するELISPOT結果を示す。
【図8B】EBNA−1特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えEBNA−1タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原(PCNA)タンパク質を、E.coli発現ベクターから溶出した。A.タンパク質を、一晩透析し、そしてSDS PAGEで純度について試験した。回収されたrEBNA−1タンパク質を、抗EBNA−1抗体MAB8173を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体AD1.1.10は、rEBNA−1タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。B.vvEBNA−1ΔGA感染DCを使用して、1週間の培養においてCD4+T細胞を増大させた。増大させたT細胞を、示される濃度のrEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を適用したDCを用いて最刺激し、そしてELISPOTで読み取った。rEBNA−1タンパク質を、DC培養の成熟相(6〜8日目)の間にDCに添加した。差込みグラフは、1週間vvEBNA−1ΔGA感染DCで増大され、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−コントロールのいずれかで再刺激されたCD4+T細胞に関するELISPOT結果を示す。
【図8C】EBNA−1特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えEBNA−1タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原(PCNA)タンパク質を、E.coli発現ベクターから溶出した。A.タンパク質を、一晩透析し、そしてSDS PAGEで純度について試験した。回収されたrEBNA−1タンパク質を、抗EBNA−1抗体MAB8173を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体AD1.1.10は、rEBNA−1タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。B.vvEBNA−1ΔGA感染DCを使用して、1週間の培養においてCD4+T細胞を増大させた。増大させたT細胞を、示される濃度のrEBNA−1タンパク質またはrPCNAコントロールタンパク質を適用したDCを用いて最刺激し、そしてELISPOTで読み取った。rEBNA−1タンパク質を、DC培養の成熟相(6〜8日目)の間にDCに添加した。差込みグラフは、1週間vvEBNA−1ΔGA感染DCで増大され、そしてvvEBNA−1ΔGA感染DCまたはvvTK−コントロールのいずれかで再刺激されたCD4+T細胞に関するELISPOT結果を示す。
【図9】新鮮な血液由来のEBNA−1特異的細胞は、CD4+T細胞である。新鮮な単離されたPBMCを、IFNγの最大産生のための7時間か、またはIL−4のための18時間のいずれかにわたって、vvEBNA−1ΔGA感染樹状細胞で刺激した。次いで、これらを、IFNγまたはIL−4のいずれかの選択に基づいて、陽性選択した。IFNγ細胞株を、6/6のドナーにおいて確立し、そしてIL−4細胞株を3/6のドナーにおいて確立した。示されるのは、FACSによって分析された3つのIFNγ株のコントロール株(A,B,C)CD4およびCD8株(D,E,F)である。ゲート(gate)を、ヨウ化プロピジウム染色によって決定されるような、リンパ球集団および生細胞に対して設定した。
【図10A】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10B】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10C】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10D】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図10E】EBNA−1特異的TH2細胞ではなく、EBNA−1特異的TH1細胞は、EBNA−1発現DCを溶解する。7時間(IFNγ)または18時間(IL−4)のいずれかにわたってvvEBNA−1ΔGA感染DCで刺激されたPBMCから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、IFNγまたはIL−4の分泌に基づいて陽性選択した。EBNA−1特異的IFNγおよびIL−4産生細胞を、それぞれ、6/6のドナーおよび3/6のドナーから単離した。これらの細胞を、rEBNA−1タンパク質を適用したDCと交替する照射vvEBNA−1ΔGA感染DCの毎週の再刺激によって増大させた。A,B.細胞を、vvEBNA−1ΔGA感染(白色棒)またはvvTK−感染(黒色棒)DCで再刺激し、そして3週間の増大後に、IFNγまたはIL−4のいずれかの分泌について試験した。TH1細胞株の代表であるLD03から単離されたIFNγ分泌細胞株を、パネルAに示し、そしてLD01由来の代表的なEBNA−1特異的IL−4分泌細胞株をパネルBに例示する。C,D.次いで、細胞を、51Cr放出アッセイによって、vvEBNA−1ΔGA感染DCを溶解するその能力について試験した。C.LD03細胞株からの51Cr放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、6つ全ての確立されたIFNγ細胞株の代表である。D.示される結果は、LD01から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのIL−4分泌細胞株の代表である。E.10:1の比率のエフェクター:標的でのCTLアッセイの結果を、コントロール(それぞれ、vvTK,rPCNAコントロールタンパク質,T2細胞)と比較した場合の、EBNA−1抗原(vvEBNA−1ΔGA,rEBNA−1またはBLCLにおいて生理的に発現されるタンパク質)の3つの供給源についての5つのIFNγ細胞株および3つのIL−4株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がTH1細胞株そして黒色がTH2細胞株である。同一ドナーから単離されたTH1細胞株およびTH2細胞株は、記号の形状を共有する。
【図11A】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11B】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11C】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11D】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
【図11E】EBNA−1特異的抗体は、主にIgG1である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各IgGサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル(A)を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。rEBNA−1タンパク質に対して特異的な抗体のIgGサブクラス分配を示し(B)、同様に、破傷風トキソイド(C)、カンジダ属(D)およびマンプス(E)に対するIgGサブクラス分配を示す。
Claims (19)
- 免疫原性EBNA−1ポリペプチドおよびヒトにおける使用に受容可能なアジュバントを含む、ワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドがE.coliにおいて発現される、請求項1に記載のワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドが、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用して発現される、請求項1に記載のワクチン。
- 前記免疫原性ポリペプチドが、EBNA−1のアミノ酸配列および異種アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項1に記載のワクチン。
- ヒトにおける発現のための発現ベクターであって、発現制御配列に作動可能に連結された、免疫原性EBNA−1ポリペプチドをコードする配列を含む、発現ベクター。
- 樹状細胞を優先的に標的化する、請求項6に記載のベクター。
- 前記ポリペプチドが、EBNA−1のアミノ酸配列および異種アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項6に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項6に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが遺伝子操作されたワクシニアウイルスである、請求項8に記載のベクター。
- 被験体をエプスタイン−バーウイルスによる感染から防御するための方法であって、免疫原性EBNA−1ポリペプチドの免疫学的に有効な量を該被験体に送達する工程を包含する、方法。
- 免疫活性化サイトカインまたは炎症性サイトカインの免疫刺激量を前記被験体に送達する工程をさらに包含する、請求項10に記載の方法。
- 被験体をエプスタイン−バーウイルスによる感染から防御するための方法であって、請求項5に記載の発現ベクターの免疫防御量を該被験体に送達する工程を包含する、方法。
- 免疫活性化サイトカインまたは炎症性サイトカインの免疫刺激量を前記被験体に送達する工程をさらに包含する、請求項12に記載の方法。
- 前記発現ベクターを送達する工程が、該発現ベクターを保有する樹状細胞を前記被験体に移植する工程を包含する、請求項12に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、インビボにおいて樹状細胞を標的化する、請求項12に記載の方法。
- EBV関連新生物を予防または処置するための、請求項10に記載の方法。
- 前記新生物が上咽頭癌である、請求項16に記載の方法。
- EBV関連新生物を予防または処置するための、請求項12に記載の方法。
- 前記新生物が上咽頭癌である、請求項18に記載の方法。
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