JP2004500014A

JP2004500014A - Novel primers and probes for detecting HIV

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Publication number: JP2004500014A
Application number: JP2000582592A
Authority: JP
Inventors: ハバーハウゼン，ガード; カスパー，ピア; ケッスラー，クリストフ
Original assignee: ロシュ　ダイアグノスティックス　ゲーエムベーハー
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2004-01-08
Also published as: WO2000029611A3; WO2000029611A2; DE19850186A1; EP1124993A2

Abstract

本発明は、（ｉ）ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株の対応する領域、（ｉｉｉ）複数のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを用いて、サンプル中のＨＩＶをサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法に関する。The invention relates to (i) the LTR region of the HIV, the highly conserved region of the gag gene or the pol gene, (ii) the corresponding region of other HIV isolates, (iii) the plurality of HIV isolates HIV in a sample is subtype independent and / or at least one oligonucleotide comprising at least 10 contiguous nucleotides from the corresponding region of the consensus sequence, or a sequence complementary thereto. The present invention relates to a method for detecting species independently.

Description

【０００１】
本発明は、サンプル中のＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的検出方法、および該方法に好適なオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
ＨＩＶの検出は、分析診断学において、極めて重要である。ＨＩＶ特異的抗体、逆転写酵素などのＨＩＶタンパク質またはＨＩＶに特異的な核酸の免疫学的検出に基づく多くの検出方法がある。
【０００３】
ＨＩＶおよびその遺伝物質は、体液中に極めて低濃度でしか存在しないため、検出方法の感度が前記方法の有用性において重要な要因となる。
【０００４】
この理由のために、現在では、検出する核酸の増幅に基づくＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）が、より広範に用いられるようになりつつある。ＨＩＶを直接検出するための該方法の適用については、例えば、ＥＰ−Ｂ−０２００３６２およびＥＰ−Ｂ−０２０１１８４に記載されている。
【０００５】
ＰＣＲすなわちポリメラーゼ連鎖反応により、検出する核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（いわゆる、プライマー）を用いて、核酸を部分的に増幅できる。この過程で生成する増幅産物を、次に、他の特異的なオリゴヌクレオチド（いわゆる、プローブ）を用いて検出できる。
【０００６】
ＨＩＶの検出に成功するＰＣＲの必須条件は、一つには、用いるプライマーの相補的塩基配列が、検出する核酸の塩基配列とできるだけ正確に一致し、そのハイブリダイゼーションができるだけ特異的であることである。しかし、一方では、同じプライマーを用いて、できるだけ多くのＨＩＶ変異体を増幅できると有利である。
【０００７】
ＨＩＶ−１の発見以来、起源の異なるＨＩＶの核酸配列には相違があることがわかってきた。ＨＩＶ−１の種々のタイプは、通常、サブタイプと呼ばれている。現在、少なくとも９種のサブタイプが知られており、サブタイプＡ〜ＨおよびＯと命名されている（ヒトレトロウイルスおよびエイズ（ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ）、ＬｏｓＡｌａｍｏｓ，Ｎａｔｌ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＬｏｓＡｌａｍｏｓ，ＮｅｗＭｅｘｉｃｏ，１９９４；Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓら出版、Ｉ−Ａ−Ｉ）。ＨＩＶ−１の公知のサブタイプ全てを認識できるプライマーまたはプローブは、未だ開発されていない。さらに、同じプライマーおよびプローブで、ＨＩＶ−２およびそのサブタイプも検出できると有益でもある。現在、ＨＩＶ−２のサブタイプは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤが知られている。
【０００８】
いくつかの特許出願において、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブが開示されているが、それらは、本出願には包含されない。
【０００９】
ＷＯ９６／０２５５７は、ＨＩＶの増殖を阻害するため、および該ウイルスを検出するための、オリゴヌクレオチドの一般的な使用について記載している。しかし、種非依存的、またはサブタイプ非依存的な検出についての適合性は言及していない。
【００１０】
ＨＩＶ−１分離株Ｂｒｕ、ＭａｌおよびＥｌｉのｇａｇ、ｖｐｒ、およびｐｏｌ遺伝子の保存されている領域に由来の塩基配列、ならびにＨＩＶ−２のＲＯＤおよびＳＩＶＭａｃの対応する領域とそれぞれハイブリダイズするプライマーおよびプローブは、欧州特許出願ＥＰ０４０３３３３に記載されている。さらに、ＨＩＶ−１のＢｒｕ、ＭａｌおよびＥｌｉの、ｅｎｖ、ｎｅｆ１、ｖｉｆ１、およびｖｐｒ遺伝子に由来する部分とそれぞれハイブリダイズするプライマーおよびプローブ、ならびにＨＩＶ−２のＲＯＤおよびＳＩＶＭａｃの、ｎｅｆ２、ｖｉｆ２、およびｖｐｘ遺伝子に由来する部分とハイブリダイズするプライマーおよびプローブが開示されている。これらのオリゴヌクレオチドには、明らかに種非依存的にハイブリダイズするものもあるが、個々のウイルスのどのサブタイプが認識されるのかということに関する記載はない。
【００１１】
ＨＩＶ−１のサブタイプだけを検出できるさらなるＨＩＶ検出方法が、例えばＥＰ８３９９１７、ならびに、後に公開されたＥＰ８８７４２７、ＷＯ９９／０７８９８、およびＷＯ９８／５８０８６の出願に開示されている。ＨＩＶ−１のｐｏｌ遺伝子に対する配列部分を増幅し、それにより、ＨＩＶ−１の５種のサブタイプを認識できるプライマーおよびプローブが、欧州特許出願ＥＰ７２７４９７に開示されている。
【００１２】
ＥＰ０６１７１３２もまた、ＨＩＶ−１とその系統学的近縁種（ＨＴＬＶ−ＩＩまたはＨＩＶ−２など）を識別できる、ＨＩＶ−１検出用のプライマーおよびプローブを開示している。この場合、選択されるオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶゲノム由来の、ＬＴＲおよび構造遺伝子のほとんどを含む多くの領域とハイブリダイズする。しかし、サブタイプ非依存的な検出についての適合性には言及していない。
【００１３】
さらに、先行技術には、標的オリゴとのハイブリダイゼ―ションによる精製にオリゴヌクレオチドを用いる方法がある（例えば、ＷＯ９８／２７４２５）。しかし、このようなオリゴはＨＩＶのサブタイプ非依存的検出には適していない。
【００１４】
ＷＯ９０／０１０６９は、ＨＩＶ検出用のオリゴヌクレオチド対を開示しているが、かかるオリゴヌクレオチド対は酵素的増幅用のプライマーとしては用いられず、同一の鎖とハイブリダイズし、その結合後に所望の配列をそれら自身が示す。
【００１５】
以前から、１対のプライマーで、サブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出に好適なものはなく、現在は、数対のプライマーを用いて増幅させることが多い。しかし、これは、一つには、試薬の経費の増大をもたらし、またもう一つには、ＰＣＲが極度に複雑化する。
【００１６】
従って、本発明の目的は、サンプル中のＨＩＶのサブタイプ非依存的（重複する）および／または種非依存的（重複する）検出方法を提供することであった。特に、本発明の一つの目的は、以前に可能であったものより多くのＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のサブタイプを検出できる方法を提供することであった。
【００１７】
本発明のこの目的は、サンプル中のＨＩＶ核酸と少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせて、サンプル中のＨＩＶの核酸をサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法であって、この少なくと１種のオリゴヌクレオチドはＨＩＶ核酸と特異的にハイブリダイズするものであり、かつ
（ｉ）配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
または、これらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むものである、上記方法により達成される。
【００１８】
好ましくは、サンプル中のＨＩＶ核酸と、２種または数種のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの組合せとハイブリダイズさせて、増幅ステップを実施することにより、サンプル中のＨＩＶの核酸をサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法であって、該２種または数種のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ核酸と特異的にハイブリダイズするものであり、かつそれぞれが
（ｉ）配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
または、これらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むものである上記方法により、上記目的が達成される。
【００１９】
本発明の方法は、以前に先行技術を用いることで可能であったものより多くのＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のサブタイプを検出（サブタイプ非依存的検出）できる。サブタイプ非依存的検出は、それぞれの種の少なくとも２つのサブタイプを単一のプローブ、または単一のオリゴヌクレオチドの組合せを用いて検出できることを意味する。上述したように、以前は、ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプを、単一のプローブ、または２種のオリゴヌクレオチドからなる１対の増幅用プライマーを用いて、従来の検出方法を利用して検出することができなかった。現在、本発明の方法によれば、極めて少ない種のオリゴヌクレオチドを用いて、そして、最良の場合は、同一のオリゴヌクレオチドを用いて、ＨＩＶ−１の９種のサブタイプのうち少なくとも７種を、特に、他のサブタイプとともにサブタイプＯも含めて、検出可能である。好ましい実施形態では、すでに公知の９種のサブタイプの全てを検出できる。サブタイプ非依存的試験は、ＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのサブタイプのうち、少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、そして最も好ましくは全種の検出が可能である。サブタイプ非依存的検出に加えて、種非依存的なＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の核酸を検出することも可能である。種非依存的とは、免疫不全ウイルスの異なる種（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）を、同じヌクレオチドを用いて検出できることを意味する。好ましくは、現在公知の９種のＨＩＶ−１サブタイプのうち少なくとも７種と、その他に、現在公知のＨＩＶ−２のサブタイプが検出される。特に好ましくは、９種のＨＩＶ−１のサブタイプ全てに加えて、さらにＨＩＶ−２のサブタイプを、特に好ましくは、さらに現在公知の全てのＨＩＶ−２のサブタイプを検出できる。
【００２０】
本発明の方法は、プライマーとして、またはプローブとして機能可能な特定のオリゴヌクレオチドを用いて、ＨＩＶの核酸の部分を増幅することに基づいている。
【００２１】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖の直鎖状核酸分子である。一般に、オリゴヌクレオチドは、１０〜１００塩基を有している。本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜８０ヌクレオチド長であることが好ましく、特に好ましくは１０〜６０、さらに好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長であり、そして、最も好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長である。核酸と同様に、本明細書では、オリゴデオキシリボヌクレオチドとオリゴリボヌクレオチドとを区別する。しかしながら、オリゴリボヌクレオチドは水酸基の水素がアリル基などの有機残基で置換された化合物も含む。このような化合物は、当業者には、かなり以前から周知である。さらに、「オリゴヌクレオチド」という用語は、糖リン酸主鎖がペプチド主鎖に置き換わった分子も指すことがある。該化合物群は、ＰＮＡと呼ばれる。全てのオリゴヌクレオチドの共通な特徴としては、相補的な塩基と水素結合を形成できる塩基を主鎖に有していることである。該塩基は、天然の塩基である、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵを含み、ｄｅａｚａ−Ｇのような人工的な塩基も含む。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプライマーとは、第２の同様に一本鎖の核酸とハイブリダイズでき、続いて、例えばＤＮＡポリメラーゼのような適切な酵素により、鋳型として働く第２の核酸に沿ってヌクレオシド三リン酸により伸長して二本鎖核酸を形成するオリゴヌクレオチドである。従って、プライマーは、通常、３’末端つまりヌクレオチド成分が結合する末端にある糖の３’のＣ原子に水酸基を有している。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの組合せは、数種のオリゴヌクレオチドを含み、また好ましくは、プライマー対、または、プライマー対とプローブというような、プライマーおよびプローブの組合せを含む。プライマー対は、核酸の特定部分の増幅（好ましくは酵素的増幅）を可能にする２種のオリゴヌクレオチドプライマーからなる。好ましくは、プライマー対のプライマーの双方が、由来する核酸の異なる鎖とハイブリダイズし、それぞれの伸長産物が互いに重なり合う。その結果、各プライマーは他のプライマーの伸長産物とハイブリダイズでき、２つのプライマーの間の部分が増幅産物として増加する。いわゆるプローブもまた、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、プライマーとしても働くが、主に、すでに増幅された核酸の部分に特異的にハイブリダイズさせるのに用いられ、このことにより核酸の検出が可能になる。このように、オリゴヌクレオチドという名称は、機能のみが相違するプライマーという用語とプローブという用語を包含する。本発明の方法に用いるオリゴヌクレオチドは、放射性標識または蛍光標識などのマーカー基を含んでもよい。特に、プローブは標識を有する。
【００２４】
増幅とは、核酸または核酸の部分が増加することと解する。公知の増幅方法は、前述のＰＣＲである。該方法では、通常の二本鎖ＤＮＡ分子をまず変性させ、即ち一本鎖に開裂させる。続いて、増幅プライマーを、標的ＤＮＡ配列と該プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で添加する。その後、ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチド成分を用いて核酸鋳型に沿って該プライマーを伸長させる。続いて、新たに形成された二本鎖核酸を再び変性し、新たなポリメラーゼのサイクルを開始する。従来のＰＣＲ法は、典型的には２５〜４０サイクルを使用する。本発明の意味する増幅は、二本鎖ＤＮＡの変性などの核酸の増幅に必要な調製のステップも含むことがある。
【００２５】
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は、２本の相補的な核酸一本鎖が結合して、二本鎖を形成することを意味する。該一本鎖は、このために１００％の相補性を有している必要はなく、その塩基配列に偏りがあってもよい。しかし、本発明の方法における適切なハイブリダイゼーションを達成するには、該一本鎖（この場合は、オリゴヌクレオチド）が、一般的なハイブリダイゼーション条件下で十分な特異性を有していなければならない。
【００２６】
本明細書に記載の本発明の方法における上記の利点を確保するには、用いるオリゴヌクレオチドは少なくとも２つの条件を満たさなければならない。その一つは、該オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶに由来する核酸とだけハイブリダイズするよう、十分な特異性を有しなければならないことである。もう一つは、これらのウイルスは、ゲノムのいくつかの領域内で非常に大幅に変異していること、すなわち、塩基配列に比較的大きな相違があることである。一方では、これらの相違に基づいて、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２、ならびにいわゆるサブタイプ（同じウイルスの比較的近縁関係にある株を意味する）を識別する。本発明のオリゴヌクレオチドに関しては、このことは、該オリゴヌクレオチドが特定のウイルスまたは特定のサブタイプを認識できなければならないだけでなく、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のできるだけ多くのサブタイプと、または、公知のサブタイプ全てともハイブリダイゼーション可能であるか、あるいは、双方ともとハイブリダイゼーション可能な、塩基配列も有していなければならないことを意味する。
【００２７】
この目的のためには、通常、検出するウイルスのゲノムの比較的保存されている領域からオリゴヌクレオチドを選択し、そして、それぞれの相補的配列を用いる。高度に保存されている領域のいくつかは、先行技術によってすでに公知となっている（上記参照）。保存されている領域とは、ＨＩＶのゲノムの核酸の、残りのゲノムに比べて塩基配列に微差があるだけの部分である。このことは、パーセントで表示される塩基同一性、または相同性とも呼ばれる。
【００２８】
驚くべきことに、本発明において、ＨＩＶのサブタイプ非依存的検出ならびに種非依存的検出を可能にするオリゴヌクレオチドが見出された。該オリゴヌクレオチドは、新しく発見されたＨＩＶの高度に保存されている領域とハイブリダイズする。これらは、ＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子内に位置する。これらの領域は、比較的小さく、平均的には５０〜１００ヌクレオチド長であり、１つまたは数個のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能である。ほとんどの先行技術の引用文献にあるように、本明細書中のＨＩＶゲノムの該領域の位置は、ＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３１３、２７７−２８４（１９８５）に公表されている）の番号づけに基づいている。これら新規の高度に保存されている領域の配列は、それぞれ配列番号１〜１３に示されており、これらの配列はＨＩＶ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ＨＩＶ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．／）の登録番号Ｋ０３４５５のＨＩＶ−１ＨＸＢ２の配列を参照した配列である。かかる高度に保存されている配列の位置は、以下のとおりである：
配列番号１：ＬＴＲ領域、位置５０４〜５６５、６２ヌクレオチド長、
配列番号２：ｇａｇ遺伝子、位置７６１〜８２２、６２ヌクレオチド長、
配列番号３：ｇａｇ遺伝子、位置１７８６〜１８４７、６２ヌクレオチド長
配列番号４：ｐｏｌ遺伝子、位置２３０７〜２３６０、５４ヌクレオチド長、
配列番号５：ｐｏｌ遺伝子、位置２３７６〜２４３４、５９ヌクレオチド長、
配列番号６：ｐｏｌ遺伝子、位置２５６８〜２６３２、６５ヌクレオチド長、
配列番号７：ｐｏｌ遺伝子、位置３０９３〜３１４５、５３ヌクレオチド長、
配列番号８：ｐｏｌ遺伝子、位置４１３１〜４２０７、７７ヌクレオチド長、
配列番号９：ｐｏｌ遺伝子、位置４３３３〜４３９９、６７ヌクレオチド長、
配列番号１０：ｐｏｌ遺伝子、位置４６３８〜４６９６、５９ヌクレオチド長、
配列番号１１：ｐｏｌ遺伝子、位置４８８４〜４９８４、１０１ヌクレオチド長、
配列番号１２：ｐｏｌ遺伝子、位置５０３４〜５０９５、６２ヌクレオチド長、
配列番号１３：ｐｏｌ遺伝子、位置４４１０〜４５０６、９７ヌクレオチド長。
【００２９】
本発明の好適なオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上述の高度に保存されている領域に位置している塩基配列またはそれらに相補的な配列を有する。
【００３０】
「重複する（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、高度に保存されている領域のうちの１つに由来する少なくとも１０個の連続した塩基と重複していることを意味すると解するべきである。
【００３１】
好ましくは、各オリゴヌクレオチドは、配列番号４，５，９，１０および１３の領域のうち１つと、より好ましくは、配列番号４、５、９、および１０の領域のうち１つと重複する。他の好ましい実施形態では、各オリゴヌクレオチドが、配列番号６、８、１０、１１、および１３の領域のうち１つと重複する。
【００３２】
高度に保存されている領域を、単一のＨＩＶ−１ウイルス分離株に関して記載しているが、「高度に保存されている領域」という語は、もちろん単一の特定の配列以外にも適用され、従って、種々のＨＩＶの株、またはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２に関係するＨＩＶ分離株に由来する全ての対応する領域を含む。本発明の好適なオリゴヌクレオチド配列は、数種のＨＩＶ分離株またはＨＩＶ株の高度に保存されている領域に由来する共通配列を表す塩基配列を有してもよい。このことは、例えば、数塩基の塩基配列はあるＨＩＶ分離株に相当し、同じオリゴヌクレオチド内の他の塩基配列は、他のＨＩＶ分離株に対応するということを意味する。そして、該オリゴヌクレオチドは、異種塩基配列を含む。該オリゴヌクレオチドのそれぞれは、上述の領域のうちの１つに由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。該オリゴヌクレオチドのそれぞれが、１５〜３０個のそのようなヌクレオチドを含むと、より好ましい。
【００３３】
本発明の方法は、少なくとも以下のステップ：
（ａ）オリゴヌクレオチドがサンプル中に存在するＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２から選択されたＨＩＶ核酸とハイブリダイズする条件下で、サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させること、
（ｂ）サンプル中のＨＩＶ核酸の存在および／または量を決定すること、
ステップを含む。
【００３４】
増幅ステップは、ステップ（ｂ）で実施することが好ましい。
【００３５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ＨＩＶ核酸のサブタイプ非依存的および／または種非依存的検出は、少なくとも２種の本発明のオリゴヌクレオチドを使用することにより可能となる。好ましくは、これらのオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして使用して、例えば、それら各々が高度に保存されている領域の一方の末端の近傍にハイブリダイズさせて、それにより、増幅（好ましくはＰＣＲ）において、それぞれの高度に保存されている領域の部分に対応する増幅産物を作製する。その後、該増幅産物、およびこのＨＩＶ特異的核酸を、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの１つ、または、増幅された配列内にハイブリダイズする他のオリゴヌクレオチドをプローブに用いて検出できる。この好ましい実施形態の利点は、１対のオリゴヌクレオチドまたはプライマーで、十分にサブタイプおよび／または種に非依存的にＨＩＶを検出するということである。
【００３６】
増副産物の検出にプローブを使う代わりに、例えば、ＤＮＡ結合色素（例えば、サイバーグリーン（Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ））などのＤＮＡ結合性試薬を用いて検出することもできる（ＷＯ９７／４６７０７）。
【００３７】
本発明の方法の他の好ましい実施形態では、１つのオリゴヌクレオチドプライマーだけが１つの保存されている領域内に位置し、他方のプライマーはその領域の外側に位置するオリゴヌクレオチドの組合せまたはプライマー対を用いて、この方法により生成する増幅産物の一部だけが、高度に保存されている領域の１つに由来する塩基配列になるようにする。好ましくは、後者のプライマーはサブタイプ特異的および／または種特異的であり、それにより、かかる組合せを用いてサブタイプまたは種を特異的に検出できる。
【００３８】
この場合、その中の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、上述の配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、またはこれらに相補的な配列に由来する、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの組合せとして、２つ以上のプライマー対を用いることが好ましい。従って、プライマーの組合せ全体が、サブタイプおよび／または種に非依存的なＨＩＶの検出を可能にする。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の方法に好適なオリゴヌクレオチドの組合せは２種、好ましくは３種のオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー対またはプライマー対とプローブ）を含み、各オリゴヌクレオチドはそれぞれ、
（ｉ）配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子またはｐｏｌ遺伝子の同一で高度に保存されている領域、
（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株に由来する対応する領域、
（ｉｉｉ）数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。
【００４０】
少なくとも１種、および好ましくは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１のサブタイプ非依存的検出が可能となるように、即ち、ＨＩＶ−１の、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＯのサブタイプのうち少なくとも７種、およびより好ましくは全サブタイプが検出されるように選択することが好ましい。
【００４１】
サブタイプ非依存的検出には少なくとも１種、および好ましくは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、各オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１２、および１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４２】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のサブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出には、少なくとも１種、および好ましくは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、各オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、７、９、１０、および１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４３】
驚くべきことに、極めて特殊なオリゴヌクレオチドが本発明の方法に特に適していることが判明した。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号１４〜２５に示す配列により表されている。上述のように、これらのオリゴヌクレオチドは、天然または合成の核酸成分で、または前記のＰＮＡでも、構成されうる。好ましくは、本発明の方法に用いるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種は、１個または数個の標識を担持する。好適な標識物は、蛍光標識、または［^３２Ｐ］標識化オリゴヌクレオチドのような放射性標識である。
【００４４】
本発明のさらなる主題は、
（ｉ）配列番号４、５、９、または１０に示す配列のうちの１つで表されるＨＩＶのｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
または、それらに相補的であるか、もしくは配列番号１４〜２５に示す配列のうちの１つを含む配列に由来する、
少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１４〜２５に示すオリゴヌクレオチドの１つを含むことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは、１０〜８０ヌクレオチドである。特に好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、約２０〜３０塩基を有し、４０〜６０％のＧＣ含量を有する。該オリゴヌクレオチドが、３’末端に自己相補性がなく、さらに３’末端にＣＧの連続（ｒｕｎ）がない場合、さらに有利である。ＧＣの連続とは、塩基ＣおよびＧでほとんどまたは全てが構成されている塩基配列である。加えて、オリゴヌクレオチドはパリンドロームを含むべきではない。本発明のオリゴヌクレオチドは、全てのサブタイプの同じ位置において該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする対応配列とのミスマッチが２つ以下であることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端には、ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプ、ならびに／またはＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのサブタイプの核酸とミスマッチがないことが好ましい。
【００４６】
プライマー対の場合、該プライマーの５’末端が、検出する核酸にプライマーがハイブリダイズする領域において、互いのプライマーの５’末端から８０塩基以内に位置するように、それぞれのプライマーを選択する。特に好ましいプライマー対は、該プライマーにより増幅される領域内に、さらにＨＩＶ特異的配列があるプライマー対である。好ましくは、その後、この配列を、この配列に対して特異的なプローブにより該増幅産物を検出するのに使用できる。本発明のオリゴヌクレオチドが上記のマーカー基のうちの少なくとも１つを備えていることが好ましい。
【００４７】
また、本発明のさらなる態様は、上述した本発明の性質を双方のオリゴヌクレオチドが有しており、かつ、その全てがＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出に適している、２種以上のオリゴヌクレオチドの組合せである。
【００４８】
本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドの組合せを包含する。オリゴヌクレオチドのそれぞれが、
（ｉ）配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の、同一で高度に保存されている領域、
（ｉｉ）他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの組合せが好ましい。
【００４９】
また、本発明のさらなる態様は、少なくとも２種の本発明のオリゴヌクレオチドが存在し、かつ、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２の単一のサブタイプに特異的な配列をそれぞれが含むさらなるオリゴヌクレオチドが存在する、数種のオリゴヌクレオチドの組合せであり、該オリゴヌクレオチドの組合せ中の全てのオリゴヌクレオチドがＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出を可能にする。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、プライマーまたはプローブとして、少なくとも１種の本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明のオリゴヌクレオチドの組合せを含む、ＨＩＶまたはその核酸の検出用の試薬キット、ならびにサンプル中の核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅を行うのに適当な手段を提供することである。
【００５１】
本発明は、さらに、ＨＩＶの検出、および特に、サブタイプ非依存的および／または種非依存的検出のためのプライマーおよび／またはプローブとしてのオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの組合せの使用に関する。
【００５２】
以下の実施例では、一つの実例として本発明を説明することが目的であり、限定する意図ではない。
【００５３】
実施例
実施例１
ＨＩＶ血漿の連続的希釈物に基づく感度、特異性および動的測定範囲
血液サンプルを試験するために、ＲＮＡを初期濃度１５，０００ゲノム等量（ｇｅｑ）ＨＩＶ／ｍｌであるＨＩＶ−陽性血漿から単離した。この血漿を、陰性血漿中に連続して１０倍希釈し、サンプル調製の後、対応するプライマー対を用いて二回繰り返した測定において、それぞれのサンプルを増幅した。ＨＩＶ−陰性血漿と水を対照とした。特異性を決定するために、ＨＢＶ−陽性血漿およびＨＣＶ−陽性血漿を同様に処理した。全てのサンプルを増幅後に測定した（ＥＣＬ検出、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０）。
【００５４】
１．サンプル調製：
最初に４２０μｌの血漿を８０μｌのプロテイナーゼＫ（２５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、数秒間ボルテックス混合した。次に１μｇのキャリアＲＮＡ（ポリＡ／ｍｌ）を含む５００μｌの溶解バッファー（５．４Ｍグアニジニウムチオシアネート、１０ｍＭ尿素、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ４．４）を添加した。混合物をボルテックス混合し、続いて１０分間室温で振とうした。続いて、５００μｌのイソプロパノール−ＭＧＰを添加した（イソプロパノール中には６ｍｇの磁性ガラス粒子を含ませた）。混合物を再びボルテックス混合し、続いて２０分間室温で振とうした。ＭＧＰを磁気を利用して溶液から分離した。上清を除去し、廃棄した。７５０μｌの洗浄バッファー（２０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７０％エタノール）を添加し、ボルテックス混合してＭＧＰを再懸濁させ、再び磁気分離を行った。洗浄工程を合計５回繰り返し、最後に１００μｌのＤＥＭＣ水を溶出のために添加した。混合物を８０℃で１５分間振とうし、続いてさらに磁気分離を行った。１０μｌの溶出液をＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００５５】
２．使用したプライマーおよびプローブ：
使用したプライマーおよびプローブは、それらの各々の高度保存領域およびゲノム中の位置、およびプライマー対によって産生される増幅産物とともに以下の表１に示す。
【００５６】
【表１】

【００５７】
３．ＲＴ−ＰＣＲのための増幅用混合物およびサーモサイクラープロトコル：

【００５８】
４．検出：
全体の検出反応を、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０自動分析器を用いて完全に自動化した。
最初に１０μｌの増幅産物および３５μｌの変性溶液（ＢＭ−ＩＤ−Ｎｏ．１４６９０５３，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を取り出した。これらを反応容器中で３７℃、５分間インキュベートし、次いで１２０μｌのハイブリダイゼーション溶液（ＢＭ−ＩＤ−Ｎｏ．１４６９０４５，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、２５ｎｇ／ｍｌのルテニウム−標識プローブを添加したもの）を加えた。反応混合物を再び３７℃で３０分間インキュベートした。続いて３５μｌのＥｌｅｃｓｙｓＳＡ磁性ビーズ溶液（ＢＭ−ＩＤ−Ｎｏ．１７１９５５６，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を添加した。溶液を３７℃で１０分間インキュベートした。１２０μｌの反応混合物の電気化学的ルミネセンスを、Ｅｌｅｃｓｙｓ１０１０測定セル中で測定した。ハイブリダイゼーションのために、表１に記載の好適なルテニウム−標識プローブを使用した。
【００５９】
５．結果

【００６０】
新規プライマーのシグナルは対照標準と同様の感度を有していた。連続的希釈内での、良好なシグナルグラデーションが存在した。
【００６１】
プライマー対ＳＫおよびＧＨ−Ａ３を用いた場合のバックグラウンドの増加は、非最適の増幅プロトコルによると推定される。
【００６２】
配列表
配列番号：１
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：２
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：３
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：４
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：５４塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：５
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：５９塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：６
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６５塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：７
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：５３塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：８
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：７７塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：９
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６７塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１０
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：５９塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１１
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１０１塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１２
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１３
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：９７塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１４
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１５
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１６
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１８塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１７
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１８
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：１９
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１５塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：２０
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：２１
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：２２
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１９塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：２３
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：２４
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２５塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

配列番号：２５
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２３塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列

[0001]
The present invention relates to a subtype-independent and / or species-independent detection method of HIV in a sample, and an oligonucleotide suitable for the method.
[0002]
HIV detection is extremely important in analytical diagnostics. There are many detection methods based on the immunological detection of HIV proteins such as HIV-specific antibodies, reverse transcriptase or HIV-specific nucleic acids.
[0003]
Since HIV and its genetic material are present at very low concentrations in body fluids, the sensitivity of the detection method is an important factor in the usefulness of said method.
[0004]
For this reason, PCR (polymerase chain reaction) based on the amplification of the nucleic acid to be detected is now being used more widely. The application of the method for directly detecting HIV is described, for example, in EP-B-0 200 362 and EP-B-0 201 184.
[0005]
By PCR, or polymerase chain reaction, nucleic acids can be partially amplified using oligonucleotides (so-called primers) that specifically hybridize to the nucleic acid to be detected. The amplification product generated in this process can then be detected using other specific oligonucleotides (so-called probes).
[0006]
One of the prerequisites for a successful PCR for HIV detection is that the complementary nucleotide sequence of the primers used matches the nucleotide sequence of the nucleic acid to be detected as accurately as possible, and that the hybridization is as specific as possible. is there. However, on the other hand, it is advantageous if the same primers can be used to amplify as many HIV variants as possible.
[0007]
Since the discovery of HIV-1, it has been found that there are differences in the nucleic acid sequences of HIV of different origins. The various types of HIV-1 are commonly called subtypes. Currently, at least nine subtypes are known and have been named subtypes AH and O (Human Retroviruses and AIDS), Los Alamos, Natl. Laboratory, Los Alamos, New. G. Meyers, et al., I-A-I). Primers or probes that can recognize all known subtypes of HIV-1 have not yet been developed. Further, it would be beneficial if HIV-2 and its subtypes could be detected with the same primers and probes. At present, the subtypes of HIV-2 are known as A, B, C and D.
[0008]
Although some patent applications disclose oligonucleotide primers and / or probes, they are not included in the present application.
[0009]
WO 96/02557 describes the general use of oligonucleotides to inhibit the growth of HIV and to detect the virus. However, suitability for species-independent or subtype-independent detection is not mentioned.
[0010]
Primers that hybridize with the conserved regions of the gag, vpr, and pol genes of the HIV-1 isolates Bru, Mal and Eli, and the corresponding regions of the HIV-2 ROD and SIV Mac, respectively. Probes are described in European patent application EP 0 403 333. In addition, primers and probes that respectively hybridize to the portions derived from the env, nef1, vif1, and vpr genes of Bru, Mal and Eli of HIV-1, and nef2, vif2, of ROD and SIV Mac of HIV-2, respectively. And primers and probes that hybridize to portions derived from the vpx gene are disclosed. Some of these oligonucleotides hybridize apparently species-independently, but there is no mention of which subtype of individual virus is recognized.
[0011]
Further HIV detection methods capable of detecting only HIV-1 subtypes are disclosed in, for example, EP 839 917 and the subsequently published applications of EP 887 427, WO 99/07898 and WO 98/58086. Primers and probes that amplify the sequence portion for the pol gene of HIV-1 and thereby recognize the five subtypes of HIV-1 are disclosed in European Patent Application EP 727 497.
[0012]
EP 0 617 132 also discloses primers and probes for HIV-1 detection that can distinguish HIV-1 and its phylogenetic relatives (such as HTLV-II or HIV-2). In this case, the selected oligonucleotide will hybridize to many regions from the HIV genome, including most of the LTRs and structural genes. However, it does not mention suitability for subtype independent detection.
[0013]
Further, the prior art includes a method using an oligonucleotide for purification by hybridization with a target oligo (for example, WO98 / 27425). However, such oligos are not suitable for subtype-independent detection of HIV.
[0014]
WO 90/01069 discloses an oligonucleotide pair for HIV detection, but such an oligonucleotide pair is not used as a primer for enzymatic amplification, hybridizes to the same strand and after binding its desired sequence Show themselves.
[0015]
Previously, no single pair of primers was suitable for subtype-independent and / or species-independent detection, and is now often amplified using several pairs of primers. However, this leads, in part, to increased reagent costs and, on the other hand, to extremely complex PCR.
[0016]
It was therefore an object of the present invention to provide a subtype-independent (overlapping) and / or species-independent (overlapping) detection method for HIV in a sample. In particular, one object of the present invention was to provide a method that could detect more HIV-1 and / or HIV-2 subtypes than previously possible.
[0017]
This object of the invention is a method for hybridizing HIV nucleic acids in a sample with at least one oligonucleotide to detect HIV nucleic acids in the sample in a subtype-independent and / or species-independent manner. The at least one oligonucleotide specifically hybridizes to an HIV nucleic acid; and
(I) a highly conserved region of the HIV LTR region, gag gene, or pol gene represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 13,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Alternatively, it is achieved by the method described above, which comprises at least 10 consecutive nucleotides derived from sequences complementary thereto.
[0018]
Preferably, the HIV nucleic acid in the sample is subtype-independent by hybridizing the HIV nucleic acid in the sample with an oligonucleotide combination comprising two or several oligonucleotides and performing an amplification step. And / or a species independent detection method, wherein said two or several oligonucleotides specifically hybridize with HIV nucleic acid and each
(I) a highly conserved region of the HIV LTR region, gag gene, or pol gene represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 13,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Alternatively, the above-mentioned object is achieved by the above-mentioned method comprising at least 10 consecutive nucleotides derived from a sequence complementary thereto.
[0019]
The method of the present invention can detect more subtypes of HIV-1 and HIV-2 than previously possible using the prior art (subtype independent detection). Subtype-independent detection means that at least two subtypes of each species can be detected using a single probe, or a single oligonucleotide combination. As mentioned above, previously, HIV-1 A, B, C, D, E, F, G, H, and O subtypes were identified as a single probe, or a pair of two oligonucleotides. It was not possible to detect using the amplification primers and the conventional detection method. At present, according to the method of the present invention, at least seven of the nine subtypes of HIV-1 are used with very few oligonucleotides and, best of all, with the same oligonucleotides. In particular, subtype O may be detected, as well as other subtypes. In a preferred embodiment, all nine known subtypes can be detected. The subtype-independent test is capable of detecting at least two, preferably at least three, and most preferably all of the HIV-2 A, B, C, and D subtypes. In addition to subtype independent detection, it is also possible to detect species independent HIV-1 and HIV-2 nucleic acids. Species-independent means that different species of immunodeficiency virus (eg, HIV-1 and HIV-2) can be detected using the same nucleotide. Preferably, at least seven of the nine currently known HIV-1 subtypes and, in addition, currently known HIV-2 subtypes are detected. Particularly preferably, in addition to all nine HIV-1 subtypes, further HIV-2 subtypes can be detected, particularly preferably all currently known HIV-2 subtypes can be detected.
[0020]
The method of the invention is based on amplifying a portion of the HIV nucleic acid using specific oligonucleotides that can function as primers or as probes.
[0021]
Oligonucleotides are single-stranded, linear nucleic acid molecules. Generally, oligonucleotides have between 10 and 100 bases. The oligonucleotides of the invention are preferably 10 to 80 nucleotides in length, particularly preferably 10 to 60, more preferably 10 to 30 nucleotides in length, and most preferably 20 to 30 nucleotides in length. As with nucleic acids, a distinction is made herein between oligodeoxyribonucleotides and oligoribonucleotides. However, oligoribonucleotides also include compounds in which the hydrogen of a hydroxyl group has been replaced with an organic residue such as an allyl group. Such compounds have been known to those skilled in the art for quite some time. Furthermore, the term “oligonucleotide” may also refer to a molecule in which the sugar phosphate backbone has been replaced by a peptide backbone. This group of compounds is called PNA. A common feature of all oligonucleotides is that they have a base capable of forming a hydrogen bond with a complementary base in the main chain. The bases include the natural bases, A, G, C, T and U, and also include artificial bases such as deaza-G.
[0022]
Oligonucleotide primers are capable of hybridizing to a second, similarly single-stranded nucleic acid, followed by a suitable enzyme such as, for example, a DNA polymerase, by a nucleoside triphosphate along the second nucleic acid serving as a template. Oligonucleotides that elongate to form double-stranded nucleic acids. Thus, primers typically have a hydroxyl group at the 3 'C terminus of the sugar at the 3' terminus, the terminus to which the nucleotide component is attached.
[0023]
The combination of oligonucleotides comprises several oligonucleotides and preferably comprises a combination of primers and probes, such as a primer pair or a primer pair and a probe. A primer pair consists of two oligonucleotide primers that allow amplification (preferably enzymatic amplification) of a particular portion of a nucleic acid. Preferably, both primers of the primer pair hybridize to different strands of the nucleic acid from which they are derived, and their extension products overlap each other. As a result, each primer can hybridize with the extension product of the other primer, and the portion between the two primers increases as an amplification product. So-called probes are also single-stranded oligonucleotides and also serve as primers, but are primarily used to specifically hybridize to already amplified portions of the nucleic acid, thereby enabling nucleic acid detection. Become. Thus, the name oligonucleotide encompasses the terms primer and probe, which differ only in function. The oligonucleotide used in the method of the present invention may contain a marker group such as a radioactive label or a fluorescent label. In particular, the probe has a label.
[0024]
Amplification is understood to mean an increase in the nucleic acid or a part of the nucleic acid. A known amplification method is the aforementioned PCR. In this method, a normal double-stranded DNA molecule is first denatured, ie, cleaved into single-stranded. Subsequently, amplification primers are added under conditions that allow hybridization of the primer with the target DNA sequence. The primer is then extended along the nucleic acid template using a polymerase enzyme and a nucleotide component. Subsequently, the newly formed double-stranded nucleic acid is denatured again and a new polymerase cycle is started. Conventional PCR methods typically use 25-40 cycles. Amplification in the sense of the present invention may also include preparative steps necessary for the amplification of nucleic acids, such as denaturation of double-stranded DNA.
[0025]
As used herein, the term "hybridization" means that two complementary nucleic acid single strands bind to form a double strand. The single strand does not need to have 100% complementarity for this, and its base sequence may be biased. However, to achieve proper hybridization in the method of the invention, the single strand (in this case, the oligonucleotide) must have sufficient specificity under common hybridization conditions. .
[0026]
To ensure the above advantages of the methods of the invention described herein, the oligonucleotides used must meet at least two conditions. One is that the oligonucleotide must have sufficient specificity to hybridize only with nucleic acids derived from HIV. Second, these viruses are highly mutated in some regions of the genome, ie, there are relatively large differences in base sequences. On the one hand, based on these differences, HIV-1 and HIV-2 are distinguished, as well as so-called subtypes (meaning relatively closely related strains of the same virus). For the oligonucleotides of the invention, this means that not only must the oligonucleotide be able to recognize a particular virus or a particular subtype, but also as many subtypes of HIV-1 or HIV-2 as possible, or Must be capable of hybridizing with all known subtypes, or have a base sequence capable of hybridizing with both.
[0027]
For this purpose, oligonucleotides are usually selected from relatively conserved regions of the genome of the virus to be detected and the respective complementary sequences are used. Some of the highly conserved regions are already known from the prior art (see above). The conserved region is a portion of the nucleic acid of the HIV genome that has only a slight difference in the nucleotide sequence as compared with the remaining genome. This is also called base identity, expressed as a percentage, or homology.
[0028]
Surprisingly, in the present invention, oligonucleotides have been found which allow subtype independent as well as species independent detection of HIV. The oligonucleotide hybridizes to a newly discovered highly conserved region of HIV. These are located in the LTR region, gag gene, and pol gene. These regions are relatively small, on average 50-100 nucleotides in length, and are capable of hybridizing with one or several oligonucleotides. As in most prior art references, the location of the region of the HIV genome herein is determined by the HIV-1 isolate HXB2 (Wong-Staal et al., Nature,313277-284 (1985)). The sequences of these new highly conserved regions are set forth in SEQ ID NOs: 1-13, respectively, and these sequences are registered in the HIV Sequence Database (http://HIV-web.lanl.gov./). This sequence is a reference to the sequence of HIV-1 HXB2 of No. K03455. The positions of such highly conserved sequences are as follows:
SEQ ID NO: 1 LTR region, positions 504-565, 62 nucleotides long,
SEQ ID NO: 2: gag gene, positions 761-822, 62 nucleotides in length,
SEQ ID NO: 3: gag gene, positions 1786-1847, 62 nucleotides long
SEQ ID NO: 4: pol gene, positions 2307-2360, 54 nucleotides long,
SEQ ID NO: 5: pol gene, positions 2376 to 2434, 59 nucleotides in length,
SEQ ID NO: 6: pol gene, positions 2568 to 2632, 65 nucleotides in length,
SEQ ID NO: 7: pol gene, positions 3093-3145, 53 nucleotides long,
SEQ ID NO: 8: pol gene, positions 4131 to 4207, 77 nucleotides in length,
SEQ ID NO: 9: pol gene, positions 4333-4399, 67 nucleotides long,
SEQ ID NO: 10: pol gene, positions 4638-4696, 59 nucleotides long,
SEQ ID NO: 11: pol gene, positions 4884-4984, 101 nucleotides in length,
SEQ ID NO: 12: pol gene, positions 5034 to 5095, 62 nucleotides in length,
SEQ ID NO: 13: pol gene, positions 4410-4506, 97 nucleotides in length.
[0029]
The preferred oligonucleotide of the present invention preferably has a nucleotide sequence located in the highly conserved region described above or a sequence complementary thereto.
[0030]
The term "overlapping" means that each of the oligonucleotides of the invention overlaps at least 10 contiguous bases from one of the highly conserved regions. Then you should understand.
[0031]
Preferably, each oligonucleotide overlaps one of the regions of SEQ ID NOs: 4, 5, 9, 10, and 13, and more preferably, one of the regions of SEQ ID NOs: 4, 5, 9, and 10. In other preferred embodiments, each oligonucleotide overlaps one of the regions of SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 11, and 13.
[0032]
Although highly conserved regions are described with respect to a single HIV-1 virus isolate, the term "highly conserved regions" applies, of course, to more than a single particular sequence. Thus, it includes all corresponding regions from various strains of HIV, or HIV isolates related to HIV-1 or HIV-2. Suitable oligonucleotide sequences of the present invention may have base sequences representing consensus sequences from several HIV isolates or highly conserved regions of HIV strains. This means, for example, that a base sequence of several bases corresponds to one HIV isolate, and another base sequence in the same oligonucleotide corresponds to another HIV isolate. The oligonucleotide contains a heterologous base sequence. Preferably, each of the oligonucleotides comprises at least 10 contiguous nucleotides from one of the regions described above. More preferably, each of said oligonucleotides comprises 15 to 30 such nucleotides.
[0033]
The method of the invention comprises at least the following steps:
(A) contacting the sample with the oligonucleotide under conditions in which the oligonucleotide hybridizes with an HIV nucleic acid selected from HIV-1 and / or HIV-2 present in the sample;
(B) determining the presence and / or amount of HIV nucleic acid in the sample;
Including steps.
[0034]
The amplification step is preferably performed in step (b).
[0035]
In a preferred embodiment of the method of the present invention, subtype independent and / or species independent detection of HIV nucleic acids is enabled by using at least two oligonucleotides of the invention. Preferably, these oligonucleotides are used as amplification primers, for example, each of which hybridizes near one end of a highly conserved region, thereby in amplification (preferably PCR) Amplification products corresponding to each highly conserved region are generated. Thereafter, the amplification product and this HIV-specific nucleic acid can be detected using one of the oligonucleotides used as primers or another oligonucleotide that hybridizes within the amplified sequence as a probe. An advantage of this preferred embodiment is that a pair of oligonucleotides or primers will detect HIV sufficiently in a subtype and / or species independent manner.
[0036]
Instead of using a probe for detection of the by-product, detection can also be performed using a DNA-binding reagent such as a DNA-binding dye (for example, Cybergreen) (WO97 / 46707).
[0037]
In another preferred embodiment of the method of the present invention, only one oligonucleotide primer is located within one conserved region and the other primer is a combination of oligonucleotides or primer pairs located outside that region. In this case, only a part of the amplification product produced by this method is a base sequence derived from one of the highly conserved regions. Preferably, the latter primer is subtype-specific and / or species-specific so that such combinations can be used to specifically detect subtypes or species.
[0038]
In this case, each of the at least two oligonucleotides comprises at least 10 contiguous nucleotides derived from sequence (i), (ii), (iii) or a sequence complementary thereto as described above. It is preferable to use two or more primer pairs as a combination of oligonucleotides to be included. Thus, the entire primer combination allows subtype and / or species independent detection of HIV.
[0039]
In a further preferred embodiment, a combination of oligonucleotides suitable for the method of the invention comprises two, preferably three, oligonucleotides (eg a primer pair or a primer pair and a probe), each oligonucleotide comprising
(I) an identical and highly conserved region of the gag gene or pol gene of HIV represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 13,
(Ii) corresponding regions from other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or at least 10 nucleotides derived from a sequence complementary thereto.
[0040]
At least one, and preferably at least two, oligonucleotides are capable of subtype-independent detection of HIV-1, ie, A, B, C, D, E, F of HIV-1. , G, H, and O are preferably selected so that at least seven, and more preferably all, of the subtypes are detected.
[0041]
Preferably, at least one, and preferably at least two, oligonucleotides are used for subtype independent detection, each oligonucleotide comprising:
(I) HIV LTR, gag gene, or pol gene represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, and 13 Highly conserved areas of the
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or at least 10 contiguous nucleotides derived from a sequence complementary thereto.
[0042]
For subtype independent and / or species independent detection of HIV-1 and HIV-2 it is preferred to use at least one, and preferably at least two, oligonucleotides, each oligonucleotide comprising:
(I) Highly conserved of the HIV LTR, gag gene, or pol gene represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, and 13. Area,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or at least 10 contiguous nucleotides derived from a sequence complementary thereto.
[0043]
Surprisingly, it has been found that very specific oligonucleotides are particularly suitable for the method according to the invention. These oligonucleotides are represented by the sequences shown in SEQ ID NOs: 14-25. As mentioned above, these oligonucleotides may be composed of natural or synthetic nucleic acid components, or even with the aforementioned PNAs. Preferably, at least one of the oligonucleotides used in the method of the invention carries one or several labels. Suitable labels are fluorescent labels, or [³²P] a radioactive label such as a labeled oligonucleotide.
[0044]
A further subject of the invention is
(I) a highly conserved region of the HIV pol gene represented by one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, 9, or 10;
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or derived from a sequence complementary thereto or comprising one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 14-25,
Oligonucleotides containing at least 10 contiguous nucleotides.
[0045]
The oligonucleotide of the present invention preferably contains one of the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 14 to 25. The length of the oligonucleotide of the present invention is preferably 10 to 80 nucleotides. Particularly preferably, the oligonucleotide has about 20-30 bases and has a GC content of 40-60%. It is further advantageous if the oligonucleotide has no self-complementarity at the 3 'end and no CG run at the 3' end. The sequence of GC is a base sequence in which almost or all of the bases C and G are constituted. In addition, the oligonucleotide should not contain palindromes. The oligonucleotide of the present invention preferably has no more than two mismatches between the oligonucleotide and the corresponding sequence that hybridizes at the same position in all subtypes. At the 3 'end of the oligonucleotides of the invention, HIV-1 A, B, C, D, E, F, G, H and O subtypes and / or HIV-2 A, B, C, Preferably, there is no mismatch with the nucleic acids of subtypes D and D.
[0046]
In the case of a primer pair, each primer is selected such that the 5 'end of the primer is located within 80 bases from the 5' end of each primer in a region where the primer hybridizes to the nucleic acid to be detected. A particularly preferred primer pair is a primer pair further having an HIV-specific sequence in a region amplified by the primer. Preferably, this sequence can then be used to detect the amplification product with a probe specific for this sequence. It is preferred that the oligonucleotide of the invention comprises at least one of the above marker groups.
[0047]
A further aspect of the invention is that both oligonucleotides have the properties of the invention described above, all of which are suitable for subtype-independent and / or species-independent detection of HIV. A combination of two or more oligonucleotides.
[0048]
The invention further includes combinations of oligonucleotides. Each of the oligonucleotides is
(I) an identical, highly conserved region of the HIV LTR region, gag gene or pol gene represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 13,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or a combination of at least two oligonucleotides comprising at least 10 contiguous nucleotides derived from their complementary sequences is preferred.
[0049]
Also, a further aspect of the present invention is a further oligonucleotide wherein there are at least two oligonucleotides of the present invention, each comprising a sequence specific for a single subtype of HIV-1 and / or HIV-2. A combination of several oligonucleotides in which nucleotides are present, wherein all oligonucleotides in the combination of oligonucleotides allow subtype-independent and / or species-independent detection of HIV.
[0050]
A further object of the invention is a reagent kit for the detection of HIV or its nucleic acids, comprising as primers or probes at least one oligonucleotide of the invention or a combination of oligonucleotides of the invention, The purpose is to provide suitable means for performing hybridization and amplification.
[0051]
The invention further relates to the use of oligonucleotides or combinations of oligonucleotides as primers and / or probes for the detection of HIV, and in particular for subtype independent and / or species independent detection.
[0052]
The following examples are intended to illustrate, but not limit, the invention as an illustration.
[0053]
Example
Example 1
HIV Sensitivity, specificity and dynamic measurement range based on serial dilutions of plasma
For testing blood samples, RNA was isolated from HIV-positive plasma at an initial concentration of 15,000 genomic equivalents (geq) HIV / ml. This plasma was serially diluted 10-fold into negative plasma, and after sample preparation, each sample was amplified in duplicate measurements using the corresponding primer pair. HIV-negative plasma and water served as controls. To determine specificity, HBV-positive and HCV-positive plasma were similarly treated. All samples were measured after amplification (ECL detection, Elecsys® 1010).
[0054]
1. Sample preparation:
First, 420 μl of plasma was mixed with 80 μl of proteinase K (25 mg / ml) and vortex mixed for several seconds. Next, 500 μl of lysis buffer (5.4 M guanidinium thiocyanate, 10 mM urea, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X100, pH 4.4) containing 1 μg of carrier RNA (poly A / ml) was added. The mixture was vortex mixed followed by shaking for 10 minutes at room temperature. Subsequently, 500 μl of isopropanol-MGP was added (6 mg of magnetic glass particles were contained in isopropanol). The mixture was vortex mixed again, followed by shaking for 20 minutes at room temperature. The MGP was separated from the solution using magnetism. The supernatant was removed and discarded. 750 μl of a washing buffer (20 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 70% ethanol) was added, vortex-mixed to resuspend MGP, and magnetic separation was performed again. The washing step was repeated a total of 5 times, and finally 100 μl of DEMC water was added for elution. The mixture was shaken at 80 ° C. for 15 minutes, followed by further magnetic separation. 10 μl of the eluate was used for RT-PCR.
[0055]
2. Primers and probes used:
The primers and probes used are shown in Table 1 below, along with their respective highly conserved regions and locations in the genome, and the amplification products produced by the primer pairs.
[0056]
[Table 1]

[0057]
3. Amplification mix and thermocycler protocol for RT-PCR:

[0058]
4. detection:
The entire detection reaction was fully automated using an Elecsys® 1010 automated analyzer.
First, 10 μl of the amplification product and 35 μl of the denaturation solution (BM-ID-No. 1469053, Boehringer Mannheim) were removed. These were incubated in a reaction vessel at 37 ° C. for 5 minutes, and then 120 μl of a hybridization solution (BM-ID-No. 1469045, Boehringer Mannheim, supplemented with 25 ng / ml ruthenium-labeled probe) was added. The reaction mixture was again incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 35 μl of Elecsys SA magnetic bead solution (BM-ID-No. 1719556, Boehringer Mannheim) was added. The solution was incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The electrochemical luminescence of 120 μl of the reaction mixture was measured in an Elecsys 1010 measuring cell. For hybridization, the suitable ruthenium-labeled probes listed in Table 1 were used.
[0059]
5. result

[0060]
The signal of the new primer was as sensitive as the control. There was good signal gradation within serial dilutions.
[0061]
The increase in background with primer pair SK and GH-A3 is presumed to be due to a non-optimal amplification protocol.
[0062]
Sequence listing
SEQ ID NO: 1
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 62 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 2
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 62 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 3
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 62 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
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SEQ ID NO: 4
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 54 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
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SEQ ID NO: 5
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 59 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
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SEQ ID NO: 6
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 65 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 7
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 53 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 8
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 77 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 9
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 67 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 10
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 59 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
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SEQ ID NO: 11
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 101 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 12
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 62 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 13
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 97 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: double-stranded
(D) Topology: linear
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SEQ ID NO: 14
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 20 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 15
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 26 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 16
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 18 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 17
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 20 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 18
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 26 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 19
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 15 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
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(D) Topology: linear
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SEQ ID NO: 20
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 24 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
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(Xi) Array

SEQ ID NO: 21
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 20 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 22
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 19 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 23
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 26 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 24
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 25 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

SEQ ID NO: 25
(I) Sequence characteristics
(A) Sequence length: 23 base pairs
(B) Sequence type: nucleotide
(C) Number of chains: single strand
(D) Topology: linear
(Xi) Array

Claims

By hybridizing the HIV nucleic acid in the sample with a combination of oligonucleotides comprising two or more oligonucleotides and performing an enzymatic amplification step, the HIV nucleic acid in the sample is subtype independent and And / or species independent detection, wherein said two or more oligonucleotides specifically hybridize with HIV nucleic acid, and each comprises (i) a sequence shown in SEQ ID NOS: 1 to 13. An identical and highly conserved region of the HIV LTR region, gag gene, or pol gene, represented by one of the following:
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or the method described above, comprising 10 to 80 consecutive nucleotides derived from a sequence complementary thereto.

The following steps:
(A) contacting the sample with the oligonucleotide under conditions in which the oligonucleotide hybridizes to an HIV-1 and / or HIV-2 derived HIV nucleic acid present in the sample;
(B) determining the presence and / or amount of HIV nucleic acid in the sample;
The method of claim 1, comprising:

3. The method according to claim 1 or 2, wherein a single combination of oligonucleotides is used.

At least seven HIV-1 subtypes selected from the HIV-1 A, B, C, D, E, F, G, H and O subtypes, and HIV-2 A, B, C and D The oligonucleotide according to any one of claims 1 to 3, wherein the oligonucleotide is selected so as to be detected in a subtype-independent manner in a manner of detecting at least two HIV-2 subtypes selected from the following subtypes. The described method.

At least seven HIV-1 subtypes selected from the HIV-1 A, B, C, D, E, F, G, H and O subtypes, and HIV-2 A, B, C and The oligonucleotide according to any one of claims 1 to 3, wherein said oligonucleotide is selected for species-independent detection in a manner that detects at least one HIV-2 subtype selected from the D subtype. The described method.

By hybridizing the HIV nucleic acid in the sample with a combination of two or more oligonucleotides and performing an enzymatic amplification step, the HIV nucleic acid in the sample is subtype independent and / or species independent. A method for detecting in a dependent manner, wherein each oligonucleotide combination comprises:
(I) a highly conserved region of the HIV LTR region, gag gene, or pol gene represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 13,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or a first oligonucleotide comprising 10 to 80 contiguous nucleotides derived from a sequence complementary thereto and a second oligonucleotide capable of subtype-specific and / or species-specific hybridization with HIV nucleic acid And wherein the oligonucleotide combination allows subtype-independent and / or species-independent detection of HIV as a whole.

At least seven HIV-1 subtypes selected from the HIV-1 A, B, C, D, E, F, G, H and O subtypes, and HIV-2 A, B, C and D 7. The method of claim 6, wherein said oligonucleotide is selected for subtype independent detection in a manner that detects at least two HIV-2 subtypes selected from the following subtypes:

At least two oligonucleotides are used for detection, each oligonucleotide comprising (i) one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12 and 13. A highly conserved region of the HIV LTR gene, gag gene, or pol gene,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or the method of claim 7, comprising 10 to 80 contiguous nucleotides derived from a sequence complementary thereto.

At least seven HIV-1 subtypes selected from the HIV-1 A, B, C, D, E, F, G, H and O subtypes, and HIV-2 A, B, C and 7. The method according to claim 6, wherein said oligonucleotide is selected for species-independent detection in a manner that detects at least one HIV-2 subtype selected from the D subtype.

At least two oligonucleotides are used for detection, each oligonucleotide comprising (i) one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5,7,9,10 and 13 A highly conserved region of the HIV LTR gene, gag gene, or pol gene,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or the method of claim 9, comprising 10 to 80 contiguous nucleotides derived from a sequence complementary thereto.

The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the oligonucleotide has or comprises the sequence shown in SEQ ID NOs: 14-25.

12. The method according to any one of the preceding claims, wherein at least one oligonucleotide has one or several labels.

The following areas:
(I) a highly conserved region of the HIV pol gene represented by one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, 9, or 10;
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or an oligonucleotide comprising 10-80 contiguous nucleotides derived from a sequence complementary thereto, but not comprising the following nucleotide sequence: CTACTACTCC TTGACTTTGGGGATTG, or a complement thereof.

The following areas:
(I) a highly conserved region of the HIV pol gene represented by one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 4, 5 or 9;
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
14. The oligonucleotide according to claim 13, comprising 10 to 80 consecutive nucleotides derived from a sequence complementary thereto.

An oligonucleotide comprising at least one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 16, 17, 18, 20, 22, 23, 24 and 25.

At the 3 ′ end of the oligonucleotide, a nucleic acid of HIV-1 subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O, and HIV-2 subtypes A, B, C and D, The oligonucleotide according to any one of claims 13 to 15, wherein the oligonucleotide has no mismatch.

The oligonucleotide according to any one of claims 13 to 16, having one or several labels.

A combination of several oligonucleotides comprising at least two oligonucleotides, wherein each of the at least two oligonucleotides is:
(I) a highly conserved region of the HIV LTR region, gag gene or pol gene represented by one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 13,
(Ii) corresponding regions of other HIV isolates,
(Iii) corresponding regions of the consensus sequence from several HIV isolates,
Or a combination comprising 10-80 contiguous nucleotides derived from a sequence complementary thereto and wherein the combination is selected to allow for enzymatic amplification.

18. At least two oligonucleotides selected from the oligonucleotides according to any one of claims 13 to 17, optionally with a sequence specific for a single subtype of HIV-1 and / or HIV-2. A combination of several oligonucleotides, including the additional oligonucleotides each containing, wherein said oligonucleotides together allow subtype-independent and / or species-independent detection of HIV. .

An oligonucleotide according to any one of claims 13 to 17, or a combination of oligonucleotides according to claim 18 or 19, as a primer and / or probe for detecting HIV or its nucleic acid, and in a sample. A reagent kit comprising a means for performing nucleic acid hybridization and amplification.

20. Use of an oligonucleotide or a combination of oligonucleotides according to any one of claims 13 to 19 as a primer and / or probe for subtype independent and / or species independent detection of HIV.