JP2004344041A - 非水溶性セルロースの定量分析法 - Google Patents
非水溶性セルロースの定量分析法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度よく定量分析する方法を提供する。
【解決手段】試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料1gに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力10000ユニットから40000ユニットの範囲である非水溶性セルロースの定量分析法。
【選択図】 図1
【解決手段】試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料1gに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力10000ユニットから40000ユニットの範囲である非水溶性セルロースの定量分析法。
【選択図】 図1
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は非水溶性セルロースを選択的に、しかも精度よく定量分析する方法に関するものである。詳しくは高価な分析機器を使用することなく、簡便な操作で、危険性や環境負荷の大きい試薬を使用しない非水溶性セルロースの定量分析法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来の非水溶性セルロースの分析方法は、いずれも、単離されたパルプの純度測定に関する分析法であるので、未知試料を分析する方法としては好ましくないうえ、分析操作が煩雑である(例えば、非特許文献1、2)。
【0003】
また、例えば非特許文献3には、非水溶性セルロースを溶解する溶媒が記載されており、この溶媒を分析法に応用することが考えられる。すなわち、溶媒に試料中の非水溶性セルロースを溶解させ、分析に使用した試料の乾燥重量からろ過残分の乾燥重量を差し引き、非水溶性セルロースの重量とする方法が考えられる。溶媒としては、例えば、65%以上の硫酸、35.5%以上の塩酸、68%以上の硝酸などの強酸溶媒、6%水酸化リチウム、10%水酸化ナトリウムなどの強アルカリ溶媒、64%以上の塩化亜鉛または50%以上のチオシアン酸カルシウム溶媒、銅、コバルト、カドミウム、ニッケルなどの金属錯体溶媒、ジメチルスルホキシド、N−ジメチルホルムアミドなどを主成分とする非水系溶媒が知られている。
【0004】
強酸、強アルカリの場合、非水溶性セルロースのみを選択的に溶解するわけではなく、酸またはアルカリに溶解する成分を含む試料の場合、分析結果は正の誤差を含む可能性がある。しかも、これらの酸、アルカリは反応性が高く取り扱いには細心の注意が必要である。更に6%水酸化リチウム、または10%水酸化ナトリウムで分解する場合4℃に保つ必要があり、温度コントロールが分析値を大きく左右する。
【0005】
塩化亜鉛、チオシアン酸カルシウムを使用する方法は、100℃以上の高温で反応させる必要があり、操作性が悪い。金属錯体を使用する場合、それ自体有害物質であったり、廃液は環境汚染の原因になるおそれがあり、慎重な取り扱いや適切な設備が必要となる。非水系溶媒は、試料中に共存する有機物も溶解し、分析にあたり正の誤差を与える恐れがある。
【0006】
一方、溶媒を使用しないで非水溶性セルロースを水溶化する方法として、分解酵素であるセルラーゼ処理することによる低分子量化、あるいは、グルコースへの分解が考えられる。酵素であるセルラーゼは反応が選択的かつ温和である。しかも、食品用途にも使用されていることから、分析操作上の安全対策や分析後の廃液処理設備を必要としないうえ、分析残分は形態観察を含めて次の分析ができるという利点がある。
【0007】
しかし、従来のセルラーゼの使用量では可溶化率が低かったり、仮に可溶化したとしても長時間を要していた。例えば、試料として微粒径セルロース(商品名「アビセル(PH−101)」、旭化成(株)製、平均粒径40μm)を使用し、ろ紙崩壊力(非特許文献4)400ユニット/gのセルラーゼを試料1gに対して800ユニット使用した場合、処理日数2日で可溶化率が80%と、定量分析に使用できるレベルにはない(非特許文献5)。非特許文献5には97%分解した例の記載もあるが、処理日数に10日間を要している。微粒径セルロースであるアビセルは、表面積が大きくセルラーゼにより可溶化されやすいと推定されるが、短時間で高効率に可溶化することは困難である。
【0008】
分析法として利用するには、長さが数mmレベルの非水溶性セルロース繊維を高効率にしかも短時間で可溶化できることが求められ、Christine M.Ladischらは、非水溶性セルロースをカドキセンに溶解させ、その後セルラーゼでグルコースユニットに分解し、グルコースを定量分析した例を報告している(非特許文献6)。この方法は、グルコースを定量分析している点では好ましいが、カドキセンは、カドミウムを含むため作業環境や環境汚染対策などが必要であり、使用を避けたい。また、グルコースの定量分析には高価な液体クロマトグラフを使用している。
【0009】
【非特許文献1】
日本規格協会編、JISハンドブック 紙・パルプJIS規格、1988年、p.118−119
【0010】
【非特許文献2】
日本分析化学会編、改訂二版 分析化学便覧、丸善株式社、1971年、p.1161−1176
【0011】
【非特許文献3】
セルロース学会編、セルロースの事典、朝倉書店、2000年11月10日、p.113〜131
【0012】
【非特許文献4】
厚生省医薬安全局審査研究会監修、製薬関係通知集1997年度版、薬業時報社、1997年9月30日、p.317−318
【0013】
【非特許文献5】
林徳子、高結晶性天然セルロースの酵素加水分解残渣の特徴、木材学会誌、1995年12月、Vol.41 NO.12 p.1132−1138
【0014】
【非特許文献6】
Christine M.Ladisch,Acid and Enzymatic Hydrolysis of Pretreated Cellulosic Materials as an Analytical Tool,Textile Research Journal,1982年7月、p.423−433
【0015】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度よく定量分析する方法を提供するものである。より詳しくは、高価な分析機器の使用、煩雑な操作、危険性や環境負荷の大きな有害試薬を使用することなく、また、分析後の非セルロース成分の形態観察を含めた分析を可能とする非水溶性セルロースの定量分析法を提供するものである。
【0016】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決するため、反応が選択的で、穏やかで、しかも環境負荷の少ないセルラーゼに着目し鋭意研究を重ね、試料1gに対するセルラーゼの使用量(ユニット数)を公知の使用量の約10〜50倍で、しかも、ある特定の範囲とすることにより、非水溶性セルロースをほぼ完全に可溶化できることを見出し本発明に至った。
【0017】
即ち、本発明の非水溶性セルロースの定量分析法は、試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料1gに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力10000ユニットから40000ユニットの範囲であることを特徴とする。
【0018】
【発明の実施の形態】
本発明の定量分析法について以下に具体的に説明する。
【0019】
本発明の定量分析法においては、分析対象である試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化し、好ましくは下記式(1)により、非水溶性セルロースの含有量を求める。
【0020】
非水溶性セルロース含有量[%]=((A−B−C)×100)/A (1)
A:試料の重量
B:セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量
C:水溶性成分の重量
【0021】
具体的には、試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化し、このセルラーゼ溶液をフィルターでろ過し、ろ過残分を水洗した後に100℃前後で恒量になるまで乾燥して求めたろ過残分の乾燥重量を、試料の乾燥重量からを差し引いて、非水溶性セルロース含有量を求める。
【0022】
この際、試料が水溶性成分を含む場合には、あらかじめ熱水抽出などにより試料から水溶性成分を除去して100℃前後で恒量になるまで乾燥するか、他の分析法で求めた試料中の水溶性成分量を差し引く必要がある。
【0023】
分析対象である試料としては、紙製品、製紙工程で発生する異物あるいは、綿リンター等が挙げられる。
【0024】
非水溶性セルロースを可溶化する際のセルラーゼの使用量は、試料1gに対して、ろ紙崩壊力10000ユニットから40000ユニットであり、好ましくは12000から36000ユニットである。
【0025】
本発明者は、単位試料重量に対するセルラーゼの使用量をろ紙崩壊性(ユニット)である範囲にすることにより、試料中の非水溶性セルロースを高効率で可溶化することができることを見出した。すなわち、図1に示すように試料1gに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力10000から40000ユニットの範囲である場合に、非水溶性セルロースは高効率で可溶化する。
【0026】
10000ユニット未満で可溶化率が低下する原因は、次のように考えている。
【0027】
一般的に酵素は自身が分解した分解生成物と結合し活性を失うことが知られている(例えば、Benderら著、伊勢典夫ら訳、酵素と触媒のはたらき、化学同人、1985年4月20日、p.33)。使用量が10000ユニット未満では、可溶化した非水溶性セルロース分解生成物によるセルラーゼの不活性化が起こり、非水溶性セルロースの可溶化が円滑に進まなくなる。しかし、10000ユニット以上のセルラーゼを使用することにより、セルラーゼの一部が不活性化しても、後の反応を維持することが可能な活性を保つことができ、その結果非水溶性セルロースを高効率で可溶化することができるので分析精度が向上する(分析値が真値に近くなる)と考えられる。
【0028】
一方、40000ユニットを超えると可溶化率が低下する原因は次のように考えている。
【0029】
セルラーゼの分子構造は非水溶性セルロースに結合するドメインと触媒中心ドメインを有すると考えられており(例えば、鮫島正浩 木材材学会誌 vol.42、No.9 p.811−816 1996)、結合ドメインが非水溶性セルロースに接近して吸着あるいは結合し、次いで触媒中心ドメインが非水溶性セルロース中のβ−1,4−グルコシド結合を加水分解すると考えられる。セルラーゼの使用量が40000ユニットを超えると、セルラーゼが非水溶性セルロースに多量に結合することに起因するセルラーゼ自身の骨格による立体障害により、触媒中心ドメインがβ−1,4−グルコシド結合に近づけなくなり加水分解が進まなくなる。その結果、可溶化率が低下するため、分析法として使用に耐えるものではなくなる(分析値が真値に比べて小さくなる)と考えられる。
【0030】
ここで、ろ紙崩壊力とは、セルラーゼ活性の指標の一つであり、せんい素崩壊力とも呼ばれる。ろ紙崩壊力は、セルラーゼがろ紙に37℃で作用するとき、1分間にろ紙を完全に崩壊する酵素量を1000ユニット/gとするものであり、前述の非特許文献4に記載の方法で求める。
【0031】
セルラーゼとしては、Trichoderma viride、Humicola insolens、Apergillus nigerのようなカビや、Phanerochaete chrysosporium 、Schizophyllum commune、Irpex lacteusのような白色木材腐朽菌などの糸状菌由来のものが挙げられ、これらのセルラーゼは試薬メーカー、酵素専業メーカーなどから高純度の学術研究用から工業用グレードまで多種類が市販されている。いずれも本発明に使用可能であるが、工業用グレードの中には操作性改善などの目的で増量剤等を添加しているものもあり、本発明で用いる場合、溶解させる粉体の量が増加し、操作性が低下する可能性があるので注意を要する。
【0032】
セルラーゼ溶液の濃度は、非水溶性セルロースの可溶化速度にかかわる因子と考えられ、高濃度ほど反応が速く進み、結果として分析時間が短くなるので好ましいと思われるが、セルラーゼの溶解度や、セルラーゼ溶液の粘度が高くなり操作性が低下するなどの制約から40から130ユニット/mlの範囲が好ましい。
【0033】
また、セルラーゼのろ紙崩壊性はpHにより大きく変化し、pHが3.0から6.0の範囲外では活性が低いことが知られており(例えば、セルラーゼ オノズカ3S技術資料 ヤクルト薬品工業)、セルラーゼを溶解する溶媒のpHは3.0から6.0の範囲が良いと考えられる。pHの調整は酢酸などのカルボン酸、塩酸などの鉱酸などにより可能であるが、試料の溶解によるpHの変動を心配する必要がない点で緩衝液の使用が好ましい。例えば,pH4.0緩衝液は0.1M酢酸水溶液82重量部と0.1M酢酸ナトリウム水溶液18重量部を混合することにより簡単に得ることができる。
【0034】
セルラーゼは一般に粉状で市販されており、セルラーゼ溶液は通常の水溶液の調整方法で調整することができる。未溶解部分が存在する場合は薬さじ等で未溶解部分を分散し、更に、超音波分散器などで数分から数十分処理するとことにより大半は溶解することができるが、正確な分析結果を得るためには、ろ過あるいは減圧ろ過などにより予め未溶解部分を除去しておくことが好ましい。
【0035】
また、セルラーゼによる非水溶性セルロースの加水分解は好気性反応であることが知られており(村尾沢夫ら セルラーゼ 講談社サイエンティフィク 1987年 p.99−101)、セルラーゼ溶液調整の段階で、超音波分散処理や減圧ろ過をした場合、空気バブリングなどにより溶存酸素濃度を高めておくことが好ましい。
【0036】
【実施例】
以下に実施例により本発明を説明する。
【0037】
<実施例1>
試料として、キムワイプ ワイパーS−200((株)クレシア製、針葉樹由来のバージンウッドパルプ100%)を90℃で恒量となるまで乾燥し、約0.05gを下4桁の測定が可能な電子天秤で精秤し、50mlのサンプルビンにとる。
【0038】
セルラーゼ(商品名「オノズカRS」、Trichoderma viride由来、ヤクルト薬品工業(株)製、ろ紙崩壊力2500ユニット/g)を、pH=4.01の緩衝液(キシダ化学(株)製)に溶解させ、60ユニット/gのセルラーゼ溶液を調整し、孔径1.0μmのメンブレンフィルターでろ過する。
【0039】
このセルラーゼ溶液15gを、試料を計量したサンプルビンにとり、よく混合し、45℃に調整した振盪器付き恒温水槽にセットし、48時間反応させる。
【0040】
反応終了後、予め90℃で乾燥し恒量にした孔径1μmのメンブレンフィルターで反応液をろ過し、更に、ろ過残分を蒸留水で洗浄する。ついで、ろ過残分の入ったメンブレンフィルターを90℃で恒量になるまで乾燥し、下4桁の測定が可能な電子天秤で精秤する。
【0041】
また、水溶性成分の重量を求めるために、セルラーゼを含まないpH=4.01の緩衝液(キシダ化学(株)製)で同様の操作を行った。
【0042】
これらの結果に基づき、式(1)より非水溶性セルロース含有量を計算した。分析結果は表1に示すように良好であった。
【0043】
非水溶性セルロース含有量[%]=((A−B−C)×100)/A (1)
A:試料の重量[g]
B:セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量[g]
C:水溶性成分の重量[g]
【0044】
ここで、
B=D−E
D:セルラーゼ溶液で処理した後のろ過残分を含むメンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
E:メンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
【0045】
A−C=G−H
G:セルラーゼを含まない緩衝液で処理した後のろ過残分を含むメンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
H:メンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
【0046】
<実施例2>
試料として、パルプ含有量85%、填料(クレー)15%からなる上質塗工用原紙(坪量74g/m2)に68g/m2のポリプロピレンを基材とした粘着テープを両面、あるいは片面に貼り付けたモデルラミネート紙を調製した。
【0047】
セルラーゼでの処理時間を24時間とした以外は実施例1と同様に分析した。
【0048】
分析結果は表1に示すように良好であった。また、ろ過残分はシート状透明樹脂様物であり形態観察を含めた分析を継続するのに十分な形態を保持していた。
【0049】
<実施例3>
試料として、ろ紙No.1(綿リンター 100%)を使用し、試料1g当たりのセルラーゼ使用量を36000ユニット/g(90ユニット/gに調製したセルラーゼ溶液を20g使用)、セルラーゼでの処理温度を50℃、処理時間を7日間(振盪なし)とした以外は実施例1と同様に分析した。分析結果は表1に示すように良好であった。
【0050】
<比較例1>
試料1g当たりのセルラーゼ使用量を2400ユニット/g(8ユニット/gに調製したセルラーゼ溶液を15g使用)とした以外は実施例1と同様に分析した。分析結果は表1に示すように問題があった。
【0051】
<比較例2>
試料1g当たりのセルラーゼ使用量を51000ユニット/g(170ユニット/gに調製したセルラーゼ溶液を15g使用)とした以外は実施例1と同様に分析した。分析結果は表1に示すように問題があった。
【0052】
【表1】
【0053】
【発明の効果】
本発明の分析法は、高価な分析機器の使用、煩雑な操作、危険性や環境負荷の大きな有害試薬を使用することなく、試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度が良く分析することができ、更に分析後の非セルロース成分の形態観察を含めた分析を可能とする効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図1】セルラーゼ使用量と非水溶性セルロースの可溶化率との関係を示すグラフ。
【発明の属する技術分野】
本発明は非水溶性セルロースを選択的に、しかも精度よく定量分析する方法に関するものである。詳しくは高価な分析機器を使用することなく、簡便な操作で、危険性や環境負荷の大きい試薬を使用しない非水溶性セルロースの定量分析法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来の非水溶性セルロースの分析方法は、いずれも、単離されたパルプの純度測定に関する分析法であるので、未知試料を分析する方法としては好ましくないうえ、分析操作が煩雑である(例えば、非特許文献1、2)。
【0003】
また、例えば非特許文献3には、非水溶性セルロースを溶解する溶媒が記載されており、この溶媒を分析法に応用することが考えられる。すなわち、溶媒に試料中の非水溶性セルロースを溶解させ、分析に使用した試料の乾燥重量からろ過残分の乾燥重量を差し引き、非水溶性セルロースの重量とする方法が考えられる。溶媒としては、例えば、65%以上の硫酸、35.5%以上の塩酸、68%以上の硝酸などの強酸溶媒、6%水酸化リチウム、10%水酸化ナトリウムなどの強アルカリ溶媒、64%以上の塩化亜鉛または50%以上のチオシアン酸カルシウム溶媒、銅、コバルト、カドミウム、ニッケルなどの金属錯体溶媒、ジメチルスルホキシド、N−ジメチルホルムアミドなどを主成分とする非水系溶媒が知られている。
【0004】
強酸、強アルカリの場合、非水溶性セルロースのみを選択的に溶解するわけではなく、酸またはアルカリに溶解する成分を含む試料の場合、分析結果は正の誤差を含む可能性がある。しかも、これらの酸、アルカリは反応性が高く取り扱いには細心の注意が必要である。更に6%水酸化リチウム、または10%水酸化ナトリウムで分解する場合4℃に保つ必要があり、温度コントロールが分析値を大きく左右する。
【0005】
塩化亜鉛、チオシアン酸カルシウムを使用する方法は、100℃以上の高温で反応させる必要があり、操作性が悪い。金属錯体を使用する場合、それ自体有害物質であったり、廃液は環境汚染の原因になるおそれがあり、慎重な取り扱いや適切な設備が必要となる。非水系溶媒は、試料中に共存する有機物も溶解し、分析にあたり正の誤差を与える恐れがある。
【0006】
一方、溶媒を使用しないで非水溶性セルロースを水溶化する方法として、分解酵素であるセルラーゼ処理することによる低分子量化、あるいは、グルコースへの分解が考えられる。酵素であるセルラーゼは反応が選択的かつ温和である。しかも、食品用途にも使用されていることから、分析操作上の安全対策や分析後の廃液処理設備を必要としないうえ、分析残分は形態観察を含めて次の分析ができるという利点がある。
【0007】
しかし、従来のセルラーゼの使用量では可溶化率が低かったり、仮に可溶化したとしても長時間を要していた。例えば、試料として微粒径セルロース(商品名「アビセル(PH−101)」、旭化成(株)製、平均粒径40μm)を使用し、ろ紙崩壊力(非特許文献4)400ユニット/gのセルラーゼを試料1gに対して800ユニット使用した場合、処理日数2日で可溶化率が80%と、定量分析に使用できるレベルにはない(非特許文献5)。非特許文献5には97%分解した例の記載もあるが、処理日数に10日間を要している。微粒径セルロースであるアビセルは、表面積が大きくセルラーゼにより可溶化されやすいと推定されるが、短時間で高効率に可溶化することは困難である。
【0008】
分析法として利用するには、長さが数mmレベルの非水溶性セルロース繊維を高効率にしかも短時間で可溶化できることが求められ、Christine M.Ladischらは、非水溶性セルロースをカドキセンに溶解させ、その後セルラーゼでグルコースユニットに分解し、グルコースを定量分析した例を報告している(非特許文献6)。この方法は、グルコースを定量分析している点では好ましいが、カドキセンは、カドミウムを含むため作業環境や環境汚染対策などが必要であり、使用を避けたい。また、グルコースの定量分析には高価な液体クロマトグラフを使用している。
【0009】
【非特許文献1】
日本規格協会編、JISハンドブック 紙・パルプJIS規格、1988年、p.118−119
【0010】
【非特許文献2】
日本分析化学会編、改訂二版 分析化学便覧、丸善株式社、1971年、p.1161−1176
【0011】
【非特許文献3】
セルロース学会編、セルロースの事典、朝倉書店、2000年11月10日、p.113〜131
【0012】
【非特許文献4】
厚生省医薬安全局審査研究会監修、製薬関係通知集1997年度版、薬業時報社、1997年9月30日、p.317−318
【0013】
【非特許文献5】
林徳子、高結晶性天然セルロースの酵素加水分解残渣の特徴、木材学会誌、1995年12月、Vol.41 NO.12 p.1132−1138
【0014】
【非特許文献6】
Christine M.Ladisch,Acid and Enzymatic Hydrolysis of Pretreated Cellulosic Materials as an Analytical Tool,Textile Research Journal,1982年7月、p.423−433
【0015】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度よく定量分析する方法を提供するものである。より詳しくは、高価な分析機器の使用、煩雑な操作、危険性や環境負荷の大きな有害試薬を使用することなく、また、分析後の非セルロース成分の形態観察を含めた分析を可能とする非水溶性セルロースの定量分析法を提供するものである。
【0016】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決するため、反応が選択的で、穏やかで、しかも環境負荷の少ないセルラーゼに着目し鋭意研究を重ね、試料1gに対するセルラーゼの使用量(ユニット数)を公知の使用量の約10〜50倍で、しかも、ある特定の範囲とすることにより、非水溶性セルロースをほぼ完全に可溶化できることを見出し本発明に至った。
【0017】
即ち、本発明の非水溶性セルロースの定量分析法は、試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料1gに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力10000ユニットから40000ユニットの範囲であることを特徴とする。
【0018】
【発明の実施の形態】
本発明の定量分析法について以下に具体的に説明する。
【0019】
本発明の定量分析法においては、分析対象である試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化し、好ましくは下記式(1)により、非水溶性セルロースの含有量を求める。
【0020】
非水溶性セルロース含有量[%]=((A−B−C)×100)/A (1)
A:試料の重量
B:セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量
C:水溶性成分の重量
【0021】
具体的には、試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化し、このセルラーゼ溶液をフィルターでろ過し、ろ過残分を水洗した後に100℃前後で恒量になるまで乾燥して求めたろ過残分の乾燥重量を、試料の乾燥重量からを差し引いて、非水溶性セルロース含有量を求める。
【0022】
この際、試料が水溶性成分を含む場合には、あらかじめ熱水抽出などにより試料から水溶性成分を除去して100℃前後で恒量になるまで乾燥するか、他の分析法で求めた試料中の水溶性成分量を差し引く必要がある。
【0023】
分析対象である試料としては、紙製品、製紙工程で発生する異物あるいは、綿リンター等が挙げられる。
【0024】
非水溶性セルロースを可溶化する際のセルラーゼの使用量は、試料1gに対して、ろ紙崩壊力10000ユニットから40000ユニットであり、好ましくは12000から36000ユニットである。
【0025】
本発明者は、単位試料重量に対するセルラーゼの使用量をろ紙崩壊性(ユニット)である範囲にすることにより、試料中の非水溶性セルロースを高効率で可溶化することができることを見出した。すなわち、図1に示すように試料1gに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力10000から40000ユニットの範囲である場合に、非水溶性セルロースは高効率で可溶化する。
【0026】
10000ユニット未満で可溶化率が低下する原因は、次のように考えている。
【0027】
一般的に酵素は自身が分解した分解生成物と結合し活性を失うことが知られている(例えば、Benderら著、伊勢典夫ら訳、酵素と触媒のはたらき、化学同人、1985年4月20日、p.33)。使用量が10000ユニット未満では、可溶化した非水溶性セルロース分解生成物によるセルラーゼの不活性化が起こり、非水溶性セルロースの可溶化が円滑に進まなくなる。しかし、10000ユニット以上のセルラーゼを使用することにより、セルラーゼの一部が不活性化しても、後の反応を維持することが可能な活性を保つことができ、その結果非水溶性セルロースを高効率で可溶化することができるので分析精度が向上する(分析値が真値に近くなる)と考えられる。
【0028】
一方、40000ユニットを超えると可溶化率が低下する原因は次のように考えている。
【0029】
セルラーゼの分子構造は非水溶性セルロースに結合するドメインと触媒中心ドメインを有すると考えられており(例えば、鮫島正浩 木材材学会誌 vol.42、No.9 p.811−816 1996)、結合ドメインが非水溶性セルロースに接近して吸着あるいは結合し、次いで触媒中心ドメインが非水溶性セルロース中のβ−1,4−グルコシド結合を加水分解すると考えられる。セルラーゼの使用量が40000ユニットを超えると、セルラーゼが非水溶性セルロースに多量に結合することに起因するセルラーゼ自身の骨格による立体障害により、触媒中心ドメインがβ−1,4−グルコシド結合に近づけなくなり加水分解が進まなくなる。その結果、可溶化率が低下するため、分析法として使用に耐えるものではなくなる(分析値が真値に比べて小さくなる)と考えられる。
【0030】
ここで、ろ紙崩壊力とは、セルラーゼ活性の指標の一つであり、せんい素崩壊力とも呼ばれる。ろ紙崩壊力は、セルラーゼがろ紙に37℃で作用するとき、1分間にろ紙を完全に崩壊する酵素量を1000ユニット/gとするものであり、前述の非特許文献4に記載の方法で求める。
【0031】
セルラーゼとしては、Trichoderma viride、Humicola insolens、Apergillus nigerのようなカビや、Phanerochaete chrysosporium 、Schizophyllum commune、Irpex lacteusのような白色木材腐朽菌などの糸状菌由来のものが挙げられ、これらのセルラーゼは試薬メーカー、酵素専業メーカーなどから高純度の学術研究用から工業用グレードまで多種類が市販されている。いずれも本発明に使用可能であるが、工業用グレードの中には操作性改善などの目的で増量剤等を添加しているものもあり、本発明で用いる場合、溶解させる粉体の量が増加し、操作性が低下する可能性があるので注意を要する。
【0032】
セルラーゼ溶液の濃度は、非水溶性セルロースの可溶化速度にかかわる因子と考えられ、高濃度ほど反応が速く進み、結果として分析時間が短くなるので好ましいと思われるが、セルラーゼの溶解度や、セルラーゼ溶液の粘度が高くなり操作性が低下するなどの制約から40から130ユニット/mlの範囲が好ましい。
【0033】
また、セルラーゼのろ紙崩壊性はpHにより大きく変化し、pHが3.0から6.0の範囲外では活性が低いことが知られており(例えば、セルラーゼ オノズカ3S技術資料 ヤクルト薬品工業)、セルラーゼを溶解する溶媒のpHは3.0から6.0の範囲が良いと考えられる。pHの調整は酢酸などのカルボン酸、塩酸などの鉱酸などにより可能であるが、試料の溶解によるpHの変動を心配する必要がない点で緩衝液の使用が好ましい。例えば,pH4.0緩衝液は0.1M酢酸水溶液82重量部と0.1M酢酸ナトリウム水溶液18重量部を混合することにより簡単に得ることができる。
【0034】
セルラーゼは一般に粉状で市販されており、セルラーゼ溶液は通常の水溶液の調整方法で調整することができる。未溶解部分が存在する場合は薬さじ等で未溶解部分を分散し、更に、超音波分散器などで数分から数十分処理するとことにより大半は溶解することができるが、正確な分析結果を得るためには、ろ過あるいは減圧ろ過などにより予め未溶解部分を除去しておくことが好ましい。
【0035】
また、セルラーゼによる非水溶性セルロースの加水分解は好気性反応であることが知られており(村尾沢夫ら セルラーゼ 講談社サイエンティフィク 1987年 p.99−101)、セルラーゼ溶液調整の段階で、超音波分散処理や減圧ろ過をした場合、空気バブリングなどにより溶存酸素濃度を高めておくことが好ましい。
【0036】
【実施例】
以下に実施例により本発明を説明する。
【0037】
<実施例1>
試料として、キムワイプ ワイパーS−200((株)クレシア製、針葉樹由来のバージンウッドパルプ100%)を90℃で恒量となるまで乾燥し、約0.05gを下4桁の測定が可能な電子天秤で精秤し、50mlのサンプルビンにとる。
【0038】
セルラーゼ(商品名「オノズカRS」、Trichoderma viride由来、ヤクルト薬品工業(株)製、ろ紙崩壊力2500ユニット/g)を、pH=4.01の緩衝液(キシダ化学(株)製)に溶解させ、60ユニット/gのセルラーゼ溶液を調整し、孔径1.0μmのメンブレンフィルターでろ過する。
【0039】
このセルラーゼ溶液15gを、試料を計量したサンプルビンにとり、よく混合し、45℃に調整した振盪器付き恒温水槽にセットし、48時間反応させる。
【0040】
反応終了後、予め90℃で乾燥し恒量にした孔径1μmのメンブレンフィルターで反応液をろ過し、更に、ろ過残分を蒸留水で洗浄する。ついで、ろ過残分の入ったメンブレンフィルターを90℃で恒量になるまで乾燥し、下4桁の測定が可能な電子天秤で精秤する。
【0041】
また、水溶性成分の重量を求めるために、セルラーゼを含まないpH=4.01の緩衝液(キシダ化学(株)製)で同様の操作を行った。
【0042】
これらの結果に基づき、式(1)より非水溶性セルロース含有量を計算した。分析結果は表1に示すように良好であった。
【0043】
非水溶性セルロース含有量[%]=((A−B−C)×100)/A (1)
A:試料の重量[g]
B:セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量[g]
C:水溶性成分の重量[g]
【0044】
ここで、
B=D−E
D:セルラーゼ溶液で処理した後のろ過残分を含むメンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
E:メンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
【0045】
A−C=G−H
G:セルラーゼを含まない緩衝液で処理した後のろ過残分を含むメンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
H:メンブレンフィルターの恒量(乾燥重量)[g]
【0046】
<実施例2>
試料として、パルプ含有量85%、填料(クレー)15%からなる上質塗工用原紙(坪量74g/m2)に68g/m2のポリプロピレンを基材とした粘着テープを両面、あるいは片面に貼り付けたモデルラミネート紙を調製した。
【0047】
セルラーゼでの処理時間を24時間とした以外は実施例1と同様に分析した。
【0048】
分析結果は表1に示すように良好であった。また、ろ過残分はシート状透明樹脂様物であり形態観察を含めた分析を継続するのに十分な形態を保持していた。
【0049】
<実施例3>
試料として、ろ紙No.1(綿リンター 100%)を使用し、試料1g当たりのセルラーゼ使用量を36000ユニット/g(90ユニット/gに調製したセルラーゼ溶液を20g使用)、セルラーゼでの処理温度を50℃、処理時間を7日間(振盪なし)とした以外は実施例1と同様に分析した。分析結果は表1に示すように良好であった。
【0050】
<比較例1>
試料1g当たりのセルラーゼ使用量を2400ユニット/g(8ユニット/gに調製したセルラーゼ溶液を15g使用)とした以外は実施例1と同様に分析した。分析結果は表1に示すように問題があった。
【0051】
<比較例2>
試料1g当たりのセルラーゼ使用量を51000ユニット/g(170ユニット/gに調製したセルラーゼ溶液を15g使用)とした以外は実施例1と同様に分析した。分析結果は表1に示すように問題があった。
【0052】
【表1】
【0053】
【発明の効果】
本発明の分析法は、高価な分析機器の使用、煩雑な操作、危険性や環境負荷の大きな有害試薬を使用することなく、試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度が良く分析することができ、更に分析後の非セルロース成分の形態観察を含めた分析を可能とする効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図1】セルラーゼ使用量と非水溶性セルロースの可溶化率との関係を示すグラフ。
Claims (3)
- 試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料1gに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力10000ユニットから40000ユニットの範囲であることを特徴とする非水溶性セルロースの定量分析法。
- 下記式(1)により非水溶性セルロース含有量を求めることを特徴とする請求項1に記載の非水溶性セルロースの定量分析法。
非水溶性セルロース含有量[%]=((A−B−C)×100)/A (1)
A:試料の重量
B:セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量
C:水溶性成分の重量 - 前記試料が、紙製品、製紙工程で発生する異物あるいは、綿リンターであることを特徴とする請求項1または2に記載の非水溶性セルロースの定量分析法。
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- 2003-05-21 JP JP2003143186A patent/JP2004344041A/ja active Pending
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