JP2004344004A

JP2004344004A - Method for detecting histamine-producing bacterium and primer to be used in the same

Info

Publication number: JP2004344004A
Application number: JP2003119962A
Authority: JP
Inventors: Bon Kimura; 凡木村; Takeo Fujii; 建夫藤井; Hajime Takahashi; 肇高橋
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-04-24
Filing date: 2003-04-24
Publication date: 2004-12-09
Also published as: WO2004094632A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a histamine-producing bacterium and a method for identifying a strain and to obtain a primer useful in the detection method. <P>SOLUTION: A testing sample is subjected to PCR by using the primer designed on the basis of the histidine decarboxylase coding sequence of a histidine-producing bacterium, the histamine-producing bacterium is detected by electrophoresis of the obtained PCR product and the strain of the detected histamine-producing bacterium is identified by analysis of SSCP (single-stranded conformation polymorphism). A histamine-producing bacterium is accurately and readily detected by the method. A causative bacterium is readily specified and a pollution source is rapidly elucidated by the identification method. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒスタミン生産菌の検出方法、及び該方法で用いるプライマーに関するものである。さらに詳細に述べると、本発明は、新規なヒスタミン生産菌検出用プライマーを用いるヒスタミン生産菌の検出方法、及び該プライマーを用いてヒスタミン生産菌のＰＣＲ産物を得て、ＳＣＣＰ解析によりヒスタミン生産菌の菌種を同定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９５０年代初頭、日本各地において発生した赤身魚加工品によるアレルギー様食中毒は、原因食品の分析からヒスタミンがその主因であることが判明した。該食中毒は、食後５分〜３時間、平均３０分で発症し、顔面紅潮、じん麻疹、酩酊感、頭痛、希に嘔吐、下痢などの症状を呈し、２４時間以内に回復し、抗ヒスタミン薬剤の投与が有効とされている。１９８６年〜１９９５年の本食中毒の発生状況からは、マグロ、イワシ、サンマといった赤身魚類が原因となっている。また、ヒスタミンは熱に対して安定であるため、焼き魚、フライ、缶詰などに加工された食品においても頻発しており、最近は欧米でも魚食嗜好を反映して本食中毒の発生が増加傾向にある。
【０００３】
本食中毒の原因物質であるヒスタミンは、食品中に含まれる遊離ヒスチジンが微生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素の作用により脱炭酸化されることによって生成される。赤身魚において本食中毒が起きやすいのは、遊離ヒスチジン含量が白身魚では数ｍｇ〜数十ｍｇ／１００ｇであるのに対し、赤身魚では７００ｍｇ〜１８００ｍｇ／１００ｇと非常に高いためとされている。
【０００４】
現在までに、水産物において本食中毒の原因となるヒスチジン脱炭酸酵素を持つ細菌は、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラプランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、モロガネラモルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａｍｏｒｇａｎｉｉ）等の腸内細菌群で多く見出されている。これらはグラム陰性菌で、共通してピリドキサールリン酸依存型のヒスチジン脱炭酸酵素を持つことが知られている。
【０００５】
従来から、これらヒスタミン生産菌の分離や検出には生化学に基づく手法として、ニベン（Ｎｉｖｅｎ）培地が一般的に用いられてきたが、この培地は菌体の生成するアミンによる培地のｐＨ上昇を指示薬で判定するので、擬陽性や擬陰性のような不明瞭な判定となることも多く、ヒスタミン生産菌を正確に検出することは困難で、その判定にもかなりの時間と労力を要するものであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来の生化学的方法、及び培養法によるヒスタミン生産菌判定の不明瞭さ、大きな時間的、労力的負担を解決し、ヒスタミン生産菌を正確かつ容易に検出する方法を提供することを目的とする。
また本発明は、ヒスタミン生産菌の正確かつ容易な検出を可能にするポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと記載する。）用プライマーを提供することを目的とする。
さらに本発明は、ＳＳＣＰ解析を利用して、検出されたヒスタミン生産菌の菌種を、正確かつ容易に同定する方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、ヒスタミン生産菌の個別菌種又は菌株のＰＣＲ産物電気泳動パターンを有する、ヒスタミン生産菌同定用標準データシートを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため本発明者らは、公知のヒスタミン生産菌３菌種のヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子の共通配列をもとに、独自に分離したヒスタミン生産菌のヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子増幅、及び塩基配列の決定を繰り返した。この研究の結果、本発明らは、水産生鮮魚介類から分離されるほぼすべてのヒスタミン生産菌を非常に特異的かつ高感度に検出する共通ＰＣＲプライマーを見出した。
【０００８】
これにより本発明者らは、該ＰＣＲプライマーを用いて、ヒスタミン生産菌を正確かつ容易に検出する方法を完成させた。すなわち、被検試料中に該共通ＰＣＲプライマーの標的配列を有するＤＮＡが含まれていない場合、ＤＮＡの増幅が起こらないので遺伝子断片は増加しないが、該ＤＮＡが含まれる場合、増幅したＤＮＡを検出することによりヒスタミン生産菌が検出できるのである。
【０００９】
また、分離した多数のグラム陰性ヒスタミン生産菌のヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子を系統解析した結果、該遺伝子の多型性は限定されており、菌種の同定に使用可能であるという知見を得た。そこで、これまで２種以上の遺伝子における１塩基以上の差異の高感度検出に用いられていたＳＳＣＰ解析技術を、菌同定のために適用することができるのではないかと考え研究を行った。その結果、前記ヒスタミン生産菌検出用プライマーにより得たＰＣＲ産物を用いてＳＳＣＰ解析を行うヒスタミン生産菌の菌種同定を行う方法を完成させることができた。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒスタミン生産菌の検出方法であって、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを検査試料に加えること；該検査試料を用いてＰＣＲを行うこと；及び得られたＰＣＲ産物を電気泳動することを特徴とする該検出方法を提供する。また、該方法において検出するＰＣＲ産物は、ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列を含むものであってもよい。
【００１１】
また本発明は、特定の塩基配列、例えば、配列番号１の塩基配列を有する複数のフォワードプライマーを含むヒスタミン生産菌検出用プライマーを提供する。
さらに、本発明は、特定の塩基配列、例えば、配列番号３の塩基配列を有する複数のリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを提供する。
さらに本発明は、ヒスタミン生産菌の菌種同定方法であって、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを検査試料に加えること；該検査試料を用いてＰＣＲを行うこと；得られたＰＣＲ産物を電気泳動すること；電気泳動で得られたバンドから、ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列を含むＰＣＲ産物を回収すること；該ＰＣＲ産物を変性させて一本鎖ＤＮＡ断片とし、非変性条件下で電気泳動してＰＣＲ産物の泳動パターンを得ること；及び該泳動パターンをヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンと比較して菌種を同定することを特徴とする該菌種同定方法を提供する。該菌種同定方法において、変性させて一本鎖ＤＮＡ断片を得る前に、該ＰＣＲ産物を制限酵素、例えばＨｉｎｆＩにより切断してもよい。
【００１２】
さらに本発明は、ヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンを有する、ヒスタミン生産菌同定用標準データシートを提供する。
さらに本発明は、配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号３の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、ヒスタミン生産菌の検出用キットを提供する。
さらに本発明は、配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号３の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、ヒスタミン生産菌の菌種同定用キットを提供する。
【００１３】
次に本明細書における用語と定義について説明する。
本明細書における用語「ヒスタミン生産菌検出用プライマー」とは、ヒスタミン生産菌を特異的かつ高感度に検出する共通ＰＣＲプライマーをいい、フォワードプライマー及びリバースプライマーを複数含むものを意味する。
本明細書における用語「フォワードプライマー」とは、増幅したい遺伝子領域の５’末端部分に相当する塩基配列（センス側）を有する、アンチセンス鎖の３’側プライマーをいう。
本明細書における用語「リバースプライマー」とは、増幅したい遺伝子領域の３’末端部分に相補的な塩基配列（アンチセンス側）を有する、コード鎖の３’側プライマーをいう。
【００１４】
本明細書における用語「ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素」とは、ヒスチジンを基質としヒスタミンを合成する酵素（ヒスチジン脱炭酸酵素）のうち、補酵素としてピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を必要とするものをいう。
本明細書における用語「ｈｄｃ遺伝子」とは、ヒスチジン脱炭酸酵素の遺伝情報をコードした遺伝子のことをいう。
本明細書における用語「ヒスチジン脱炭酸酵素」とは、ヒスチジンからヒスタミンを合成する酵素で、補酵素としてピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を必要とするＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素と、活性中心にピルボイル基をもつピルボイル型ヒスチジン脱炭酸酵素の２種類を含む。
【００１５】
本明細書における用語「非変性条件」とは、２本鎖ＤＮＡであるＰＣＲ産物が一本鎖に分かれた状態で維持される条件を意味する。
本発明の菌種同定方法で使用する「ＳＳＣＰ解析」（ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）とは、一本鎖ＤＮＡフラグメントを非変性条件下で電気泳動すると、移動度はＤＮＡ鎖長と配列に依存して異なることを利用したＤＮＡフラグメントの変異又は多型を高感度にスクリーニングする解析方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
アレルギー様食中毒を起こすヒスタミン生産菌の検討
本食中毒の原因となるヒスチジン脱炭酸酵素を持つ細菌としては、腸内細菌群のエンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラプランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、モルガネラモルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａｍｏｒｇａｎｉｉ）などや、海洋性細菌の強いヒスタミン生成能をもつホトバクテリウムヒスタミヌム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｉｓｔａｍｉｎｕｍ（＝Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅ））が報告されている。これらはグラム陰性菌で、共通してピリドキサールリン酸依存型のヒスチジン脱炭酸酵素を持つことが知られている。
【００１７】
また、チーズやキャベツの酢漬けなどの発酵食品、及びワインやビールのような飲料においても高濃度のヒスタミンが蓄積することがあり、これらはグラム陽性菌で、ピルボイル型のヒスチジン脱炭酸酵素をもつラクトバシルスブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉ）、レウコノストクオエノス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｏｅｎｏｓ）などの乳酸菌が主な生産菌であるとされている。これらヒスタミン生産菌のＰＣＲ検出は、Ｖｏｓｓｅｎらの論文（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，７８：３１６−３２６，１９９５）によってワイン中のグラム陽性ヒスタミン生成乳酸菌の検出として報告されている。
【００１８】
しかし、水産物の食中毒の原因となる、グラム陰性ヒスタミン生産菌についてはまだ行われておらず、衛生学的観点にもとづくこれら菌群の挙動の把握や食中毒の原因究明を簡便、正確かつ迅速に検出する方法が必要であった。本発明者らはＰＣＲ法によるグラム陰性ヒスタミン生産菌の検出法を検討し、グラム陰性ヒスタミン生産菌のヒスチジン脱炭酸酵素の分子系統学的知見を得、これに基づく同定法の確立、及び海洋性ヒスタミン生産菌Ｐ．ヒスタミヌムの分子系統の再度見直しを行い、ＰＣＲによる遺伝子同定の確度向上を図った。
【００１９】
ヒスタミン生産菌検出用プライマー
該検出用プライマーを作成する遺伝情報を得るため、食中毒を引き起こす可能性が指摘されているグラム陰性ヒスタミン生産菌のうち、エンテロバクターアエロゲネス、クレブシエラプランチコラ、モルガネラモルガニイを選択した。これらの菌は、共通してピリドキサールリン酸依存型のヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）を持つことが報告されているおり、またその遺伝子についても詳細な知見が得られている。
【００２０】
グラム陰性菌においてヒスチジン脱炭酸酵素の遺伝子の知見が得られているのは、上記３菌種のみであり、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）やハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）などの中にはヒスタミン生成能を持つ菌がいることは報告されているものの、その酵素や遺伝子についての知見はない。該遺伝子についての知見が得られている３菌種の塩基配列は、互いの相同性が７０％以上と大変高く、ＰＣＲ法等の分子生物学的手法による検出が可能であると考えられた。
【００２１】
プライマーの設計は次のように行った。国立遺伝研究所のデーターベース上に登録されているモルガネラモルガニイ（ＡＴＣＣ３５２００）、エンテロバクターアエロゲネス（ＡＴＣＣ４３１７５）、クレブシエラプランチコラ（ＡＴＣＣ４３１７６）のｈｄｃ塩基配列について、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃｖｅｒ．１０（ＳｏｆｔｗａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社）を用いてアライメントをとり、相同性が高く、プライマーに適していると思われる領域を特定した。
【００２２】
ＰＣＲ産物として増幅する領域を、ヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）の活性中心であるＳ−Ｘ−Ｈ−Ｇをコードしている部位を含む７０９ｂｐの範囲としてプライマーを設計した。ここでフォワードプライマーはｈｄｃ遺伝子の１３２−１５０塩基の位置、リバースプライマーは８１７−８４１塩基の位置を基準にそれぞれ作成した。プライマー配列はＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ１．０（Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ）ソフトウェアを用いて、Ｔｍ値、プライマーダイマーの可能性等を検討して決定した。
【００２３】
（フォワードプライマー）
本発明のフォワードプライマーは次の塩基配列を含むものである。
ｈｄｃ−ｆ（１）：５’−ＨＡＴＹＡＲＹＡＡＣＴＧＹＧＧＴＧＡＣＴＧＧＲ−３’ （２３ｂｐ）（配列番号１）
ｈｄｃ−ｆ（２）：５’−ＴＣＨＡＴＹＡＲＹＡＡＣＴＧＹＧＧＴＧＡＣＴＧＧＲＧ−３’ （２６ｂｐ）（配列番号２）
式中、Ｈはアデニン、シトシン又はチミン、Ｒはグアニン又はアデニン、かつＹはチミン又はシトシンである。
【００２４】
配列番号１の塩基配列はそれぞれ９６通りあり、したがって、フォワードプライマーはその塩基長が同じであれば９６種類存在する。本発明を実施する場合、必要に応じて各フォワードプライマーを組み合わせて、又はすべて使用することができる。
フォワードプライマーの長さは、配列番号１の塩基配列を含めば特に制限する必要はないが、通常２３〜４２塩基、好ましくは２３〜３２塩基である。また、配列番号２の塩基配列からなる２６塩基長さのフォワードプライマーを、組み合わせて又はすべて使用して、本発明の検出方法を実施することができる。
【００２５】
（リバースプライマー）
本発明のリバースプライマーは次の塩基配列を含むものである。
ｈｄｃ−ｒ（１）：５’− ＫＣＡＴＢＡＲＷＧＧＤＧＴＲＴＧＲ−３’ （１７ｂｐ）（配列番号３）
ｈｄｃ−ｒ（２）：５’− ＣＣＣＡＣＡＫＣＡＴＢＡＲＷＧＧＤＧＴＲＴＧＲＣＣ−３’ （２５ｂｐ）（配列番号４）
式中、Ｂはグアニン、シトシン又はチミンを、Ｋはグアニン又はチミン、Ｒはグアニン又はアデニン、かつＷはアデニン又はチミンである。
【００２６】
配列番号３の塩基配列はそれぞれ２８８通りあり、したがって、リバースプライマーはその塩基長が同じであれば２８８種類存在する。本発明を実施する場合、必要に応じて各フォワードプライマーを組み合わせて、又はすべて使用することができる。
リバースプライマーの長さは、配列番号３の塩基配列を含めば特に制限する必要はないが、通常１７〜４２塩基、好ましくは１７〜３２塩基である。また、配列番号４の塩基配列からなる２５塩基長さのフォワードプライマーを、組み合わせて又はすべて使用して、本発明の検出方法を実施することができる。
【００２７】
本発明のヒスタミン生産菌検出用プライマーは、複数の前記フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、ヒスタミン生産菌を特異的かつ高感度に検出する共通ＰＣＲプライマーである。前記フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは特に制限されないが、必要に応じて配列番号１の塩基配列すべてに対応するフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列すべてに対応するリバースプライマーを有する組み合わせを用いることもできる。
【００２８】
本発明のヒスタミン生産菌検出方法
本発明の被検試料には、食品衛生上、ヒスタミン生産菌検査を必要とするあらゆる食品、（例えば、魚介類、水産加工品、食肉・食肉製品、乳製品、穀類、野菜・果物、農産加工品等）、食品加工工場、又は調理施設などの廃液、廃棄物などがある。これらの被検試料からヒスタミン生産菌の核酸を含むＰＣＲ用試料を調製する。該被検試料からヒスタミン生産菌の核酸を含むＰＣＲ用試料の調製は、従来のゲノムＤＮＡの調製の場合と同様の手法により行うことができ、例えば、ＳＤＳ溶解法、フェノール／クロロホルム抽出、塩化セシウム密度勾配遠心法等を適宜組み合わせて行うことができる。
【００２９】
本発明のＰＣＲは、常法により、市販のＰＣＲ装置、例えばＡＢＩ社製２４００を用いて実施することができる。周知のようにＰＣＲ法の増幅反応は、ＤＮＡの熱変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼ伸長反応のそれぞれの温度条件で反応液をインキュベートすることによって進行し、この三つのステップからなる温度サイクルを繰り返すことで所望のＰＣＲ産物が得られる。本発明においては、使用する複数のプライマーの塩基長を均一にし至適条件を予備実験などによって確認することで高感度で目的とする増幅産物を得ることができる。
【００３０】
本発明で用いるプライマーと、ＰＣＲ産物の大きさを考慮すると、通常、ＤＮＡの熱変性は、９０〜１００℃で、５秒〜２分、特に９４〜９８℃で１５秒〜１分、アニーリングは、４５〜６５℃で、３０秒〜２分、特に５６〜６０℃で３０秒〜１分３０秒、かつポリメラーゼ伸長反応は６０〜７５℃で３０秒〜２分間、特に７０〜７２℃で３０秒〜１分とするのが好ましい。
特に、本発明では、配列番号２の塩基配列からなる均一長のフォワードプライマー、及び配列番号４の塩基配列からなる均一長のリバースプライマーを使用する場合、これらＰＣＲ反応の温度及び反応時間を予備実験により厳格に定めることにより極めて高い感度でヒスタミン生産菌の遺伝子に対応するＰＣＲ産物を得ることができる。
【００３１】
本発明で検出するヒスタミン生産菌の遺伝子は、該菌を検出できるものであれば特に制限されないが、好ましいのはＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列である。本発明では、ＰＣＲ法によりこれらの塩基配列に対応するＰＣＲ産物を得て、アガロースゲルによる電気泳動を行ってヒスタミン生産菌を検出する。
【００３２】
ヒスタミン生産菌の同定
本発明者らは、分離されたヒスタミン生産菌についてｈｄｃ遺伝子の塩基配列を決定し、得られた配列に関して系統解析を行い、当該配列がヒスタミン生産菌の属や種を反映し、菌種の同定や類縁関係の解析に応用が可能であるか否かを検討した。
ヒスタミン生産菌であるＭ．モルガニイ４株、Ｒ．プラチコラ２株、Ｐ．ダムセラエ２株、プロテウスブルガリス，エルウィニアｓｐ．，Ｐ．ホスホレウム各１株のｈｄｃ遺伝子の塩基配列を決定し、互いの相同性を調べたところ、ＤＮＡレベルで７３．８％〜９８．９％，アミノ酸レベルで８２．６％〜１００％の相同性を有していた。これらの配列は全く同じ位置にＰＬＰ依存型のヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心であるＳ−Ｇ−Ｈ−Ｋの配列を含んでいた。
【００３３】
当該遺伝子配列の進化系統を解析し、１６ＳｒＤＮＡの配列に基づく系統樹と比較したところ、類似した系統関係を示した（図４）。図４においてＡは１６ＳｒＤＮＡの配列に基づく系統樹であり、Ｂはｈｄｃ遺伝子配列に基づく系統樹である。
この比較から判るように１６ＳｒＤＮＡに基づく系統解析で近縁であるとされているＭ．モルガニイとＰｒ．ブルガリスはｈｄｃ遺伝子による系統解析でも近縁であり、同様に１６ＳｒＤＮＡによる系統的に近縁である海洋性細菌ホトバクテリウムに属する株は腸内細菌科の菌群とは別のクラスターを形成した。
【００３４】
このようにｈｄｃ遺伝子の種特異性が示され、またその系統解析により種内での保存性、種間での多型が明らかとなったため、この多型を検出し、菌種判別が可能であると判断された。
本発明ではｈｄｃ遺伝子の多型解析を塩基配列の決定ではなく、ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析により行う。
該ＳＳＣＰ解析は、解析する２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖に解離し、その塩基配列に依存した独自の高次構造をポリアクリルアミドゲル電気泳動することを原理としており、１塩基置換を移動度の差として検出できるので、遺伝子中の数塩基の変異を検出することが可能である。該解析において、ゲル濃度や泳動温度を一定にすることで極めて高い再現性を得ることができる。このような特質から該ＳＳＣＰ解析は遺伝子のポイント変異の解析や、環境中の微生物相の解析に利用されている。該ＳＳＣＰ解析は、多型解析法の一つであり、１９９１年、関谷らにより、ヒトがん細胞においてがん抑制遺伝子の１塩基変異を検出するために開発されたものである（Ｔ．Ｓｅｋｉｙａらの論文，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：２７６６−２７７０，１９８９）。
【００３５】
本発明においては、該ＳＳＣＰ解析にヒスタミン生産菌の検出で得た２本鎖ＤＮＡ、つまりＰＣＲ産物を利用する。すなわち該ＳＳＣＰ解析によりヒスタミン生産菌の標準株から菌種同定用泳動パターンを作成し、該パターンと前記検出方法で得たＰＣＲ産物の１本鎖ＤＮＡ電気泳動パターンを比較することにより、検出されたヒスタミン生産菌の菌種を特定するのである。
【００３６】
本発明においては、標準株から得た菌種同定用泳動パターンを集めて同定用標準データを作成する。該標準データは紙、プラスチックフィルムなどのデータシートとするか、又はこれらをコンピュータによりデータベースとする。
本発明においてＳＳＣＰ解析を常法により行う。該ＳＳＣＰ解析において、２本鎖ＤＮＡをホルムアミド、尿素、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒドなどの解離剤の存在下で処理し１本鎖ＤＮＡに解離させる。
また、電気泳動にもちいるポリアクリルアミドゲルのゲル濃度及び泳動温度は、使用するＰＣＲプライマーなどにより最適な条件を決めるのが好ましいが、ゲル濃度は、通常６〜３０％、特に２０〜２５％とするの好ましく、また泳動温度は通常５〜２５℃、特に１０〜１５℃とするのが好ましい。
【００３７】
本発明のプライマーにより得られるＰＣＲ産物は７００塩基以上と長いため、ＳＳＣＰ解析の必要に応じて制限酵素処理することが好ましい。該制限酵素は得られるＰＣＲ産物をＳＳＣＰ解析に適当な長さ、例えば２００〜３００塩基長に切断できるものであれば特に制限なく使用することができる。該制限酵素の例を挙げると、ＨｉｎｆＩ，ＭｓｅＩ，ＡｌｕＩ，ＭｂｏＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＲｓａＩ，ＴａｑＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，ＭａｅＩ，ＭｓｐＩ，ＭａｅＩＩなどがある。
なお、本発明のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｆＩで切断した場合、ほとんどの場合３〜４断片に切断された。例えば、その断片長はＭ．モルガニイでは２７７ｂｐ，２６１ｂｐ，１７１ｂｐ、またＲ．プラチコラでは２７７ｂｐ，２６１ｂｐ，１３０ｂｐ，４０ｂｐであった。
実施例により本発明を更に詳細に説明する。これら実施例は本発明の説明と理解促進することを目的とし、本発明の保護範囲の限定を意図するものではない。
【００３８】
【実施例】
（実施例１）プライマー特異性試験
ＰＣＲ用試料の調製
魚肉などの被検試料から市販の核酸抽出キットＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ（東洋紡績株式会社）を用い、添付のプロトコルに従いＰＣＲ用試料を調製した。抽出したＤＮＡの濃度は、波長２６０ｎｍにおける吸光値１ＯＤをＤＮＡ５０μｇ／ｍｌとして算出した。
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
ヒスタミン生産菌の所望の遺伝子を増幅してヒスタミン生産菌を検出するため、ヒスタミン生産菌検出用プライマー存在下で、前記ＰＣＲ用試料に対しＰＣＲによる増幅反応を行った。すなわち、各菌株のＤＮＡ（５ｎｇ／ＰＣＲ）、各々５μｌについて、配列番号２の塩基配列からなるすべてのフォワードプライマー２００ｎＭと配列番号４の塩基配列からなるすべてのリバースプライマー２００ｎＭを加え、２０μＬあたり１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ４種のデオキシヌクレオシド三リン酸、０．５ＵＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）となるよう反応液を調製した。
【００３９】
次いで、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、熱変性を９４℃で、３０秒行って増幅対象ＤＮＡを１本鎖とし、アニーリングを５８℃で、１分行い、次いで伸長反応を７２℃で、１分行う３ステップＰＣＲを３５サイクル実施した後、該ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（ＦＭＣ）を用い電気泳動し、エチジウムブロマイドにより染色した後、ＵＶトランスイルミネータ（２５４ｎｍ）によって検出した。
【００４０】
生成ヒスタミン量の測定
ヒスタミン生産菌のヒスタミン生成活性を、ヒスチジンブロス中で２５℃、２４時間培養し、蓄積したヒスタミン量をＨＰＬＣで測定することにより求めた。該培養液は口径０．２μｍのフィルターＤｉｓｍｉｃ−１３（アドバンテック東洋（株））を用いて濾過し、これを測定試料とした。魚肉懸濁液の試料では、５％過塩素酸で除タンパク処理を行った後、同様に濾過した。測定には蛍光検出器付きＨＰＬＣを用い、山中らの方法に従って行った（Ｙａｍａｎａｋａらの論文，Ｊ．ＦｏｏｄＨｙｇ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．３０：３９６−４００．１９８９）。
【００４１】
本実施例では、配列番号２の塩基配列からなるすべてのフォワードプライマーと配列番号４の塩基配列からなるすべてのリバースプライマーで構成されるヒスタミン生産菌検出用プライマーを用いた。
プライマーを設計した際に用いた菌株：Ｅ．アエロゲネス、Ｒ．プランチコラ及びＭ．モルガニイ、並びに菌株保存機関であるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＳ：ＪａｐａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）；応用微生物学研究所（ＩＡＭ：ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）から取り寄せた標準株を用い、さらに、市販鮮魚などから分離されたヒスタミン生産菌及びヒスタミン生成能を持たない一般細菌を分離した。すなわち、本発明のプライマーの特異性評価にもちいたヒスタミン生産菌は３７株、ヒスタミン生成能のない一般細菌は４７３株で合計５１０株を用いた。
【００４２】
各菌株でＰＣＲを行った結果、ヒスタミン生成能を持つグラム陰性菌３７株中、Ｐ．ヒスタミヌムを除く３６株において目的とする７０９ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。ヒスタミン生成能を持たない４７３株にはＰＣＲ産物は見られなかった（表１〜３）。すなわち１株を除いた５０９株においては、ヒスタミン生成能の有無とＰＣＲ産物の有無が完全に一致し、したがって、本発明のプライマーはグラム陰性ヒスタミン生産菌の検出に高い特異性を有していることが明らかとなった。
【００４３】
なお、鮮魚より分離したヒスタミン生産菌は、Ｖｉｔｅｋシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕＶｉｔｅｋｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎｃ．，Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，Ｍｏ．）によって同定し、これで同定できない菌群ラオウルテラはＡＰＩＩＤ３２Ｅ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕＶｉｔｅｋｓｙｓｔｅｍｓ）、ホトバクテリウムホスホレウムはコバヤシらの方法（Ｔ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの論文，Ｆｉｓｈ．Ｓｃｉ．６３：８０７−８１０，１９９７）を用いて同定した。
【００４４】
図１に目的とする７０９ｂｐのＰＣＲ産物を確認した電気泳動の結果を示す。図１中、レーンｍは１００ｂｐラダーマーカ、レーン１はモルガネラモルガニイＡＴＣＣ３５２００、レーン２はＭ．モルガニＪＣＭ１６７２Ｔ、レーン３はＭ．モルガニ８７４１１、レーン４はＭ．モルガニＡＰ２８、レーン５はＭ．モルガニＪＵ２７、レーン６はエンテロバクターアエロゲネスＡＴＣＣ４３１７５、レーン７はラオウルテラプランチコラＡＴＣＣ４３１７６、レーン８はＲ．プランチコラ８４３３、レーン９はＲ．プランチコラ４１３１、レーン１０はプロテウスブルガリスＡＵ３４、レーン１１はエルウィニアｓｐ、レーン１２はホトバクテリウムダムセラエＡＴＣＣ３３５３９Ｔ、レーン１３はＰ．ダムセラエＪＣＭ８９６８、レーン１４はＰ．ホスホレウムＭＢ３６及びレーン１５は陰性コントロールである。これらは下記表から明らかなようにすべてヒスタミン生産菌である。
【００４５】
また、下記表に各菌株のヒスタミン生成量、ＰＣＲの結果を示す。

【００４６】

【００４７】

【００４８】
表１〜３の注釈
＊ａ他に示さない限り、魚から分離された菌株はＶＩＴＥＫシステムにより同定されたものである。すべての分離菌株の同定はさらに１６ＳｒＤＮＡの部分配列により確認した。
＊ｂＡＰＩＩＤ３２Ｅにより同定された。
＊ｃフジイらの方法により同定した（Ｆｕｊｉｉらの論文１９９７，Ｆｉｓｈ．Ｓｃｉ．６３：８０７−８１０）。
＊ｄＶＩＴＥＫシステム又はＡＰＩＩＤ３２Ｅのいずれかで同定されていない。１６ＳｒＤＮＡの部分配列によるとエルウィニアｓｐ．と９８％の同一性を示した。
【００４９】
＊ｅＶＩＴＥＫシステム又はＡＰＩＩＤ３２Ｅのいずれかで同定されていない。１６ＳｒＤＮＡの部分配列によるとプロテウスブルガリスと９８％の同一性を示した。
＊ｆヒスチジン倍地中において２５℃で２４時間培養した。培養倍地のヒスタミン量をＨＰＬＣで測定した。
＊ｇＮＤは未検出を意味する。
＊ｈ細菌の提供先：ＡＴＣＣ，ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅｏｆＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；ＪＣＭ，理化学研究所微生物系統保存施設（ＪａｐａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）埼玉県、日本国）；ＩＡＭ，応用微生物学研究所ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）東京、日本国；魚類から分離された細菌該細菌は異種の魚から得られた菌株とは無関係である。
【００５０】
（実施例２）純菌系におけるヒスタミン生産菌の検出
本発明のヒスタミン生産菌検出用プライマーの検出感度と、ヒスタミン生産菌のヒスタミン生成能の関係を調べるため、強いヒスタミン生成能を持つＭ．モルガニイを供試菌として用い、ヒスチジンブロス中におけるＭ．モルガニイの増殖、及びヒスタミン蓄積量の経時変化とＰＣＲにより検出が可能となる時間の関係について検討を行った（図２）。
【００５１】
当初１．０×１０^１ｃｆｕ／ｍｌであった菌は、培養のおよそ２時間後から対数増殖期に移行した。その後、速やかに増殖し、培養開始から１２時間後には１０^９ｃｆｕ／ｍｌとなり、定常期に移行、２４時間後まで定常期とみられる状態が続いた。一方、倍地でのヒスタミン蓄積はこの定常期に達したと考えられる培養１２時間後から始まり、その後１０時間で急激に増加し、最終的に２２８ｍｇ／１００ｍｌの蓄積が見られた。Ｍ．モルガニイのＰＣＲ検出は、培養開始から６時間後の菌数が１０^４／ｍｌに増殖した時点で可能となった。この結果から明らかなように、Ｍ．モルガニイを用いた純菌系実験ではヒスタミンが蓄積するかなり前の時点でその検出が可能になった。合計３回同一の系で実験を行い、再現性を確かめたところ、ほぼ一致した結果が得られた。
【００５２】
（実施例３）魚肉を用いた試験区におけるヒスタミン生産菌の検出
魚肉を用いた試験区において、一般生菌数１０^１ｃｆｕ／ｇの魚肉に同率（１０^１ｃｆｕ／ｇ）になるようにＭ．モルガニイを接種した。経時的な菌数、及びヒスタミン蓄積量を図３に示した。接種したＭ．モルガニイは魚肉中の一般生菌数と類似した挙動を示した。培養開始１６時間後にはおよそ１０^７ｃｆｕ／ｇまで増殖し、ヒスタミンの蓄積が始まった。その後、魚肉中の菌数は２０時間後に１０^８／ｇまで増加した後、４８時間後までほぼ水平に推移したが、魚肉中のヒスタミン量は経時的に増加し、最終計測点の４８時間後には４１．７ｍｇ／１００ｇのヒスタミンを蓄積した。
【００５３】
培養開始８時間後に１０^５ｃｆｕ／ｇとなった時点でＰＣＲによる検出が可能となった。対照とした非接種区のサンプルでは、一般生菌数は接種区と変わらない増殖曲線を示したが、魚肉由来のヒスタミン生産菌は検出されず、ＰＣＲを用いた検出においても増幅産物は見られなかった。この結果から明らかなように、Ｍ．モルガニイを用いた魚肉を用いた実験ではヒスタミンが蓄積するかなり前の時点でその検出が可能になった。合計３回同一の系で実験を行い、再現性を確かめたところ、ほぼ一致した結果が得られた。
【００５４】
（実施例４）市販鮮魚中のヒスタミン生産菌の検出
市販鮮魚１３検体から得た試料を用いてＰＣＲ検出の感度とヒスタミン蓄積量を調べた。８〜２０時間インキュベートを行った後、全１３検体のうち１０検体においてＰＣＲによるｈｄｃ遺伝子の増幅が確認された。これらの試料ではｈｄｃ遺伝子由来のＰＣＲ産物が検出された数時間後にヒスタミンの蓄積が始まり、ＰＣＲによるヒスタミン生産菌の検出は、魚肉中へのヒスタミンの蓄積に先行することが確認された。
【００５５】
（実施例５）ヒスタミン生産菌の菌種同定用データの作成
ヒスタミン生産菌の標準菌株、及び市販鮮魚由来のｈｄｃ遺伝子を持つ菌株を用いた。これらのｈｄｃ遺伝子の７１０ｂｐ領域を、実施例１と同じＰＣＲ法により増幅し、４塩基認識制限酵素ＨｉｎｆＩを用いて、該ＰＣＲ産物を切断した。該制限酵素処理は、３７℃で３〜５時間行い、終了後２％アガロースゲル（株式会社ニッポンジーン）を用いて電気泳動を行った。該泳動終了後、エチジウムブロマイドを用いてゲルの染色を行い制限酵素による切断を確認した。
【００５６】
制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物を用い、該処理終了後全量２０μｌあたりホルムアミド溶液（ｈｏｒｍａｍｉｄｅ／０．５ＭＥＤＴＡ＝４９：１）を１２μｌ加えた。沸騰水中で５分間処理し、ＰＣＲ産物を１本鎖ＤＮＡに変性した後、直ちに氷中で急冷した。該変性ＤＮＡに１０倍量の添加液（ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（株式会社タカラ））を加え、電気泳動に供した。該泳動には、１２％ポリアクリルアミドのプレキャストゲル（ＧｅｎｅＧｅｌＥｘｃｅｌ１２．５／２４Ｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社））及び、Ｇｅｎｅｐｈｏｒフラグメント解析装置（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた。該泳動は１２℃で、２５ｍＡ（７００Ｖ）の設定で１１０分間行い、泳動終了後ＰｌｕｓＯｎｅＤＮＡＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎｉｎｇＫｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてゲルの銀染色を行い、泳動パターンを得た。
【００５７】
本実施例で制限酵素ＨｉｎｆＩを使用した結果、ほとんどの菌株で、３〜４断片への切断が確認され、その切断断片長はＭ．モルガニイでは２７７ｂｐ，２６１ｂｐ，１７１ｂｐ、Ｒ．プラチコラでは２７７ｂｐ，２６１ｂｐ，１３０ｂｐ，４０ｂｐであった。データベース作成に使用したヒスタミン生産菌は計３４菌株であり、これらのｈｄｃ増幅産物をＳＳＣＰ解析した結果、２１のＳＳＣＰタイプに分類された。Ｍ．モルガニイ１３株は７タイプ、Ｒ．プラチコラ９株は３タイプ、Ｐ．ダムセラエ３株は２タイプのパターンが示され、他の株はそれぞれ異なる泳動パターンを示した。
【００５８】
図５に、これら標準菌株等の泳動パターンを含むデータシートを示す。図５中、レーンｍは１００ｂｐサイズのラダーマーカ、レーンａはエンテロバクターアムニゲネスの泳動パターン、レーンｂはモルガネラモルガニイの泳動パターン、レーンｃはＥ．アエロゲネスの泳動パターン、レーンｄはホトバクテリウムダムセラエの泳動パターン、レーンｅはＭ．モルガニイの泳動パターン、及びレーンｆはＭ．モルガニイの泳動パターンを示す。
【００５９】
（実施例６）ヒスタミン生産菌の菌種同定
実施例１と同じ方法で、魚肉１０検体からヒスタミン生産を検出した。該菌から得られたｈｄｃ遺伝子由来のＰＣＲ産物を実施例５と同じ方法でＳＳＣＰ解析し、泳動パターン９種を得た。図５の標準菌株等の泳動パターンと比較して菌種同定を試みた結果、Ｍ．モルガニイ４菌株、エンテロバクターアエロゲネス２菌株、Ｐ．ダムセラエ１菌株が、及びエンテロバクターｓｐ．１菌株が同定できた。残りの２菌株は一致する泳動パターンがなく、同定できなかった。
【００６０】
検体のｈｄｃ遺伝子由来ＰＣＲ産物の泳動パターンは図６に示されており、レーン１はマグロ１（１６時間培養）の泳動パターン、レーン２はマグロ１（２０時間培養）の泳動パターンであり、以下同様にレーン３はマグロ３（１６時間）、レーン４はマグロ３（２０時間）、レーン５はマグロ４（１６時間）、レーン６はマグロ４（２０時間）、レーン７はマグロ５（１６時間）、レーン８はマグロ５（２０時間）、レーン９はマグロ７（２０時間）、レーン１０はマグロ７（２４時間）、レーン１１はイワシ１（１１時間）、レーン１２はイワシ１（１６時間）、レーン１３はサバ（２０時間）、レーン１４はブリの稚魚（２４時間）、レーン１５はマアジ（１６時間）、レーン１６はマアジ（２０時間）、レーン１７はブリ（１６時間）、レーン１８はブリ（２０時間）であり、左右のレーンｍは１００ｂｐサイズのラダーマーカである。
【００６１】
図５のデータシートのレーンと比較すると、図６のレーン３及び４は図５のレーンａに対応しエンテロバクターａｍｎｉｇｅｎｅｓであることを示し、レーン７及び８はレーンｂのモルガネラモルガニイ、レーン９、１０、１７及び１８はレーンｃのＥ．アエロゲネス、レーン１１及び１２はレーンｄのホトバクテリウムダムセラエ、レーン１３及び１４はレーンｅのＭ．モルガニイ、レーン１５及び１６はレーンｆのＭ．モルガニイに対応し、それぞれの菌種を同定している。レーン１、２，５及び６は該データシートに対応するレーンがなく菌種を同定できなかった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明のプライマー及びヒスタミン生産菌検出方法により、従来の生化学的方法、及び培養法によるヒスタミン生産菌判定の不明瞭さ、大きな時間的、労力的負担が解決され、ヒスタミン生産菌を正確かつ容易に検出できるようになった。すなわち、本発明の検出方法により、従来の方法における擬陽性や擬陰性のない正確な検出が可能となり、さらに魚肉中へのヒスタミンの蓄積（高感度液体クロマトグラフによるヒスタミン検出法）よりも先行してヒスタミン生産菌を検出できるようになった。さらに、今まで、ヒスタミン食中毒が起きた場合、原因食材からヒスタミンを検出することはできても、冷凍や加熱によってヒスタミン生産菌が死滅している場合には原因菌の特定はできなかったが、本発明の検出方法では、菌自体が死滅していてもＤＮＡさえ残っていれば食品における原因菌の検出が可能になった。
【００６３】
また本発明のヒスタミン生産菌同定用標準データシート、及びＳＳＣＰ解析を利用して、ヒスタミン生産菌の菌種を、正確かつ容易に同定できるようになった。すなわち、本発明の同定方法により原因菌の特定が可能になり、これにより、どの原料から、あるいは、工場のどのラインから汚染が生じたのかを速やかに解明することが可能となった。
【００６４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グラム陰性ヒスタミン生産菌のｈｄｃ遺伝子由来ＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。
【図２】図２は、ヒスチジンブロス中におけるＭ．モルガニイの増殖、及びヒスタミン蓄積量の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、一般生菌数１０^１ｃｆｕ／ｇの魚肉に同率（１０^１ｃｆｕ／ｇ）になるようにＭ．モルガニイを接種した場合の経時的な菌数、及びヒスタミン蓄積量を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒスタミン生産菌の系統図である。
【図５】図５は、ＳＣＣＰ解析に用いるヒスタミン生産菌標準菌株等の泳動パターンを含むデータシートを示す。
【図６】図６は、ＳＣＣＰ解析により示された複数のヒスタミン生産菌の電気泳動パターンを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a histamine-producing bacterium and a primer used in the method. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a histamine-producing bacterium using a novel primer for detecting a histamine-producing bacterium, a PCR product of the histamine-producing bacterium obtained using the primer, and the histamine-producing bacterium obtained by SCCP analysis. The present invention relates to a method for identifying a bacterial species.
[0002]
[Prior art]
In the early 1950's, allergic food poisoning caused by processed red fish in various parts of Japan was found to be mainly caused by histamine from analysis of the causative food. The food poisoning develops for 5 minutes to 3 hours after the meal, on average 30 minutes, presents symptoms such as hot flush, urticaria, drunkenness, headache, rarely vomiting and diarrhea, and recovers within 24 hours. Is effective. According to the outbreak situation of this food poisoning from 1986 to 1995, red fish such as tuna, sardine, and saury is the cause. In addition, histamine is stable against heat, so it is frequent in foods processed into grilled fish, fried food, canned food, etc.In recent years, the incidence of poisoning has been increasing in Europe and the United States, reflecting fish food preferences. is there.
[0003]
Histamine, which is a causative substance of the present food poisoning, is produced by decarboxylation of free histidine contained in food by the action of histidine decarboxylase derived from microorganisms. It is said that this dietary poisoning easily occurs in red fish because the content of free histidine is very high, ranging from several mg to several tens of mg / 100 g for white fish, and 700 mg to 1800 mg / 100 g for red fish.
[0004]
To date, bacteria that have histidine decarboxylase, which causes food poisoning in marine products, include Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola, and many intestinal organisms of the Morgananella group in the Morgananella group, such as Klebsiella planticola. Have been found. These are gram-negative bacteria and are known to have in common a pyridoxal phosphate-dependent histidine decarboxylase.
[0005]
Hitherto, the separation and detection of these histamine-producing bacteria has been generally carried out by using a Niven medium as a biochemical-based technique. Since the determination is made using an indicator, the determination often becomes unclear such as false positive or false negative, and it is difficult to accurately detect histamine-producing bacteria, and the determination requires considerable time and effort. Was.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for accurately and easily detecting histamine-producing bacteria by solving the ambiguity of determining histamine-producing bacteria by a conventional biochemical method and culture method, and solving a large time and labor burden. With the goal.
Another object of the present invention is to provide a primer for polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR) that enables accurate and easy detection of histamine-producing bacteria.
A further object of the present invention is to provide a method for accurately and easily identifying the detected histamine-producing bacterial species using SSCP analysis.
A further object of the present invention is to provide a standard data sheet for identifying histamine-producing bacteria, which has an electrophoresis pattern of PCR products of individual strains or strains of histamine-producing bacteria.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors based on the common sequence of the histidine decarboxylase gene of three known histamine-producing bacteria, histidine decarboxylase gene amplification of histamine-producing bacteria independently isolated, and The determination of the base sequence was repeated. As a result of this study, the present inventors have found a common PCR primer that can detect almost all histamine-producing bacteria isolated from aquatic seafood with high specificity and high sensitivity.
[0008]
As a result, the present inventors have completed a method for accurately and easily detecting histamine-producing bacteria using the PCR primers. That is, if the test sample does not contain DNA having the target sequence of the common PCR primer, DNA amplification does not occur, so that the number of gene fragments does not increase. By doing so, histamine-producing bacteria can be detected.
[0009]
In addition, as a result of phylogenetic analysis of the histidine decarboxylase gene of a large number of isolated Gram-negative histamine-producing bacteria, it was found that the polymorphism of the gene was limited and that the gene could be used for identification of bacterial species. Therefore, the present inventor conducted research on the possibility that the SSCP analysis technique, which had been used for high-sensitivity detection of a difference of one or more bases in two or more genes, could be applied for bacterial identification. As a result, a method for identifying the histamine-producing bacteria by performing SSCP analysis using the PCR product obtained with the histamine-producing bacteria detection primers could be completed.
[0010]
Therefore, the present invention relates to a method for detecting a histamine-producing bacterium, comprising adding a histamine-producing bacterium-detecting primer to a test sample; performing PCR using the test sample; and electrophoresing the obtained PCR product. The detection method is provided. In addition, the PCR product detected in this method contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence SGHHK of the active center of PLP-dependent histidine decarboxylase, or a sequence complementary to the nucleotide sequence. You may.
[0011]
The present invention also provides a primer for detecting a histamine-producing bacterium comprising a plurality of forward primers having a specific nucleotide sequence, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
Further, the present invention provides a primer for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a plurality of reverse primers having a specific nucleotide sequence, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a histamine-producing bacterium, which comprises adding a primer for detecting histamine-producing bacterium to a test sample; performing PCR using the test sample; and electrophoresing the obtained PCR product. That, from the band obtained by electrophoresis, a PCR product containing the amino acid sequence SGHK of the active center of PLP-dependent histidine decarboxylase or a PCR product containing the complementary sequence of the base sequence Recovering; denaturing the PCR product into a single-stranded DNA fragment and electrophoresing under non-denaturing conditions to obtain a migration pattern of the PCR product; and analyzing the migration pattern for the identification of a histamine-producing strain. The present invention provides a method for identifying a bacterial species, which comprises identifying the bacterial species in comparison with a pattern. In the method for identifying a bacterial species, the PCR product may be cleaved with a restriction enzyme such as Hinf I before denaturing to obtain a single-stranded DNA fragment.
[0012]
Furthermore, the present invention provides a standard data sheet for identifying histamine-producing bacteria, which has a migration pattern for identifying histamine-producing bacteria.
Furthermore, the present invention provides a kit for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a primer for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a forward primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
Further, the present invention provides a kit for identifying a histamine-producing bacterium, comprising a histamine-producing bacterium-detecting primer, comprising a forward primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. .
[0013]
Next, terms and definitions in this specification will be described.
As used herein, the term “primer for detecting histamine-producing bacteria” refers to a common PCR primer that specifically and highly sensitively detects histamine-producing bacteria, and includes a plurality of forward primers and reverse primers.
As used herein, the term "forward primer" refers to a primer on the 3 'side of the antisense strand having a base sequence (sense side) corresponding to the 5' end of the gene region to be amplified.
As used herein, the term "reverse primer" refers to a primer on the 3 'side of the coding strand having a base sequence (antisense side) complementary to the 3' end of the gene region to be amplified.
[0014]
As used herein, the term “PLP-dependent histidine decarboxylase” refers to an enzyme that synthesizes histamine using histidine (histidine decarboxylase) and requires pyridoxal 5′-phosphate (PLP) as a coenzyme. To do.
As used herein, the term “hdc gene” refers to a gene that encodes the genetic information of histidine decarboxylase.
As used herein, the term “histidine decarboxylase” is an enzyme that synthesizes histamine from histidine, and a PLP-dependent histidine decarboxylase that requires pyridoxal 5′-phosphate (PLP) as a coenzyme, And two types of pyruvyl-type histidine decarboxylase having a pyruvyl group.
[0015]
As used herein, the term “non-denaturing conditions” refers to conditions under which a double-stranded DNA PCR product is maintained in a single-stranded state.
The “SSCP analysis” (Analysis of Single-strand conformation polymorphism) used in the bacterial species identification method of the present invention means that when a single-stranded DNA fragment is electrophoresed under non-denaturing conditions, the mobility is determined by the DNA chain length and sequence. This is an analysis method for screening a mutation or polymorphism of a DNA fragment with high sensitivity, utilizing the fact that the DNA fragments depend on each other.
[0016]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Examination of histamine-producing bacteria causing allergic food poisoning
Examples of bacteria having histidine decarboxylase that cause food poisoning include Enterobacter aerogenes, a group of enterobacteria, Klebsiella planticola, Morganella moriganii, and Morganella mori bacteria such as Morganella moriganii. Photobacterium histamine (= P. Damselae) having a histamine-producing ability has been reported. These are gram-negative bacteria and are known to have in common a pyridoxal phosphate-dependent histidine decarboxylase.
[0017]
High concentrations of histamine can also accumulate in fermented foods, such as pickled cheese and cabbage, and in beverages, such as wine and beer.Lactobacillus, which is a gram-positive bacterium and has a pyruvoil-type histidine decarboxylase. Lactic acid bacteria such as Lactobacillus buchneri and Leuconostoc oenos are considered to be the main producing bacteria. PCR detection of these histamine-producing bacteria was reported by Vossen et al. (J. Appl. Bacteriol, 78: 316-326, 1995) as detection of Gram-positive histamine-forming lactic acid bacteria in wine.
[0018]
However, gram-negative histamine-producing bacteria, which cause food poisoning of marine products, have not been tested yet.Since this is a simple, accurate, and rapid detection of the behavior of these bacterial groups and investigation of the cause of food poisoning from a hygienic point of view, I needed a way to do it. The present inventors studied a method for detecting gram-negative histamine-producing bacteria by PCR, obtained molecular phylogenetic knowledge of histidine decarboxylase of gram-negative histamine-producing bacteria, established an identification method based on this, and Histamine-producing bacteria The molecular system of histamine was reviewed again to improve the accuracy of gene identification by PCR.
[0019]
Primer for detecting histamine-producing bacteria
In order to obtain genetic information for preparing the primer for detection, out of Gram-negative histamine-producing bacteria which have been pointed out to cause food poisoning, Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola, and Morganella morganii were selected. It has been reported that these bacteria have a pyridoxal phosphate-dependent histidine decarboxylase (HDC) in common, and detailed knowledge of the gene has been obtained.
[0020]
Among the Gram-negative bacteria, only the above three bacterial strains have knowledge of the gene for histidine decarboxylase, and histamine-producing ability is found in Citrobacter, Hafnia and the like. Although it is reported that there is a bacterium, there is no knowledge about its enzyme or gene. The nucleotide sequences of the three strains for which knowledge of the gene has been obtained have a very high homology to each other of 70% or more, and it was considered that detection by molecular biological techniques such as the PCR method was possible.
[0021]
The design of the primer was performed as follows. For the hdc base sequences of Morganella morganii (ATCC35200), Enterobacter aerogenes (ATCC43175), and Klebsiella planticola (ATCC43176) registered on the database of the National Institute of Genetics, the gene analysis software GENETYX-Mac ver. Using 10 (Software Development), alignment was performed, and regions having high homology and considered to be suitable for primers were identified.
[0022]
Primers were designed such that a region to be amplified as a PCR product had a range of 709 bp including a site encoding SXHG, which is an active center of histidine decarboxylase (HDC). Here, the forward primer was prepared based on the 132-150 base position of the hdc gene, and the reverse primer was prepared based on the 817-841 base position. The primer sequence was determined using PrimerExpress1.0 (Perkin-Elmer) software by examining the Tm value, the possibility of primer dimer, and the like.
[0023]
(Forward primer)
The forward primer of the present invention contains the following nucleotide sequence.
hdc-f (1): 5'-HATY ARY AAC TGY GGT GAC TGG R-3 '(23 bp) (SEQ ID NO: 1)
hdc-f (2): 5'-TCH ATY ARY AAC TGY GGT GAC TGG RG-3 '(26 bp) (SEQ ID NO: 2)
Where H is adenine, cytosine or thymine, R is guanine or adenine, and Y is thymine or cytosine.
[0024]
There are 96 base sequences of SEQ ID NO: 1, respectively, and therefore, there are 96 forward primers as long as their base lengths are the same. In practicing the present invention, each of the forward primers may be used in combination, or all may be used as necessary.
The length of the forward primer is not particularly limited as long as it includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is usually 23 to 42 bases, preferably 23 to 32 bases. In addition, the detection method of the present invention can be carried out using a combination or all of the 26-base forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
[0025]
(Reverse primer)
The reverse primer of the present invention contains the following nucleotide sequence.
hdc-r (1): 5'-KCA TBA RWG GDG TRT GR-3 '(17 bp) (SEQ ID NO: 3)
hdc-r (2): 5'-CCC ACA KCA TBA RWG GDG TRT GRC C-3 '(25 bp) (SEQ ID NO: 4)
Where B is guanine, cytosine or thymine, K is guanine or thymine, R is guanine or adenine, and W is adenine or thymine.
[0026]
There are 288 nucleotide sequences in SEQ ID NO: 3, and accordingly, there are 288 reverse primers having the same nucleotide length. In practicing the present invention, each of the forward primers may be used in combination, or all may be used as necessary.
The length of the reverse primer is not particularly limited as long as it includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but is usually 17 to 42 bases, preferably 17 to 32 bases. Further, the detection method of the present invention can be carried out using a combination or all of the 25-base forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4.
[0027]
The primer for detecting a histamine-producing bacterium of the present invention is a common PCR primer containing a plurality of the forward primers and the reverse primer, and specifically and highly sensitively detecting the histamine-producing bacterium. The combination of the forward primer and the reverse primer is not particularly limited, but if necessary, a combination having a forward primer corresponding to all the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer corresponding to all the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 is used. You can also.
[0028]
Histamine-producing bacteria detection method of the present invention
The test sample of the present invention includes, for food hygiene, any food requiring a histamine-producing bacterial test, such as seafood, processed fishery products, meat / meat products, dairy products, cereals, vegetables / fruits, and agricultural processing. Products, food processing factories, cooking facilities, etc. From these test samples, PCR samples containing nucleic acids of histamine-producing bacteria are prepared. Preparation of a PCR sample containing nucleic acid of a histamine-producing bacterium from the test sample can be performed by the same method as in the case of conventional preparation of genomic DNA. For example, SDS dissolution method, phenol / chloroform extraction, cesium chloride Density gradient centrifugation and the like can be appropriately combined.
[0029]
The PCR of the present invention can be carried out by a conventional method using a commercially available PCR device, for example, 2400 manufactured by ABI. As is well known, the amplification reaction of the PCR method proceeds by incubating the reaction solution under the respective temperature conditions of DNA thermal denaturation, primer annealing, and polymerase extension reaction, and a temperature cycle consisting of these three steps is repeated. Thereby, a desired PCR product is obtained. In the present invention, the desired amplification product can be obtained with high sensitivity by making the base lengths of a plurality of primers used uniform and confirming the optimal conditions by preliminary experiments and the like.
[0030]
In consideration of the primers used in the present invention and the size of the PCR product, usually, thermal denaturation of DNA is performed at 90 to 100 ° C for 5 seconds to 2 minutes, particularly at 94 to 98 ° C for 15 seconds to 1 minute, and annealing is performed. 30 to 2 minutes at 45 to 65 ° C, especially 30 to 1 minute and 30 seconds at 56 to 60 ° C, and the polymerase extension reaction is 30 to 2 minutes at 60 to 75 ° C, especially 30 to 72 ° C. The time is preferably from one second to one minute.
In particular, in the present invention, when a uniform-length forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer having a uniform length consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 are used, the temperature and reaction time of these PCR reactions are determined by preliminary experiments. By strictly defining the above, a PCR product corresponding to the gene of the histamine-producing bacterium can be obtained with extremely high sensitivity.
[0031]
The gene of the histamine-producing bacterium to be detected in the present invention is not particularly limited as long as the histamine-producing bacterium can be detected. Preferably, the gene is the amino acid sequence SGHK of the active center of PLP-dependent histidine decarboxylase. It is a base sequence to encode or a sequence complementary to the base sequence. In the present invention, histamine-producing bacteria are detected by obtaining PCR products corresponding to these nucleotide sequences by the PCR method and performing electrophoresis on an agarose gel.
[0032]
Identification of histamine-producing bacteria
The present inventors determined the base sequence of the hdc gene for the isolated histamine-producing bacteria, performed phylogenetic analysis on the obtained sequence, and the sequence reflected the genus and species of the histamine-producing bacteria, and identified the bacterial species. We examined whether it could be applied to the analysis of the relationship or the relationship.
M. histamine-producing bacteria. Morgani 4 strains, R. Platicola 2 strains, P. Damserae 2 strains, Proteus vulgaris, Erwinia sp. , P .; The nucleotide sequence of the hdc gene of each of the phosphoreleum strains was determined, and the homology was determined. The homology was 73.8% to 98.9% at the DNA level and 82.6% to 100% at the amino acid level. Had. These sequences contained the sequence of SGHK, which is the active center of PLP-dependent histidine decarboxylase, at exactly the same position.
[0033]
The evolved lineage of the gene sequence was analyzed and compared with a phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence, showing a similar lineage relationship (FIG. 4). In FIG. 4, A is a phylogenetic tree based on the sequence of 16S rDNA, and B is a phylogenetic tree based on the hdc gene sequence.
As can be seen from this comparison, the M. allele is considered to be closely related to phylogenetic analysis based on 16S rDNA. Morgany and Pr. Bulgaris is also closely related to phylogenetic analysis by the hdc gene, and similarly, strains belonging to the marine bacterium Photobacterium which are systematically related to 16S rDNA formed a different cluster from the Enterobacteriaceae group.
[0034]
Thus, the species specificity of the hdc gene was shown, and its phylogenetic analysis revealed conservedness within species and polymorphism between species. Therefore, this polymorphism can be detected and the species can be identified. It was determined that there was.
In the present invention, the polymorphism analysis of the hdc gene is carried out not by determining the nucleotide sequence but by SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) analysis.
The SSCP analysis is based on the principle that a double-stranded DNA fragment to be analyzed is dissociated into a single strand, and a polyacrylamide gel electrophoresis of a unique higher-order structure depending on the base sequence is performed. , It is possible to detect mutations of several bases in the gene. In the analysis, extremely high reproducibility can be obtained by keeping the gel concentration and the migration temperature constant. Due to such characteristics, the SSCP analysis is used for the analysis of point mutations in genes and the analysis of microflora in the environment. The SSCP analysis is one of polymorphism analysis methods and was developed by Sekiya et al. In 1991 to detect a single nucleotide mutation in a tumor suppressor gene in human cancer cells (T. Sekiya). Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766-2770, 1989).
[0035]
In the present invention, a double-stranded DNA obtained by detecting a histamine-producing bacterium, that is, a PCR product is used for the SSCP analysis. That is, it was detected by preparing a migration pattern for strain identification from the standard strain of histamine-producing bacteria by the SSCP analysis and comparing the pattern with the single-stranded DNA electrophoresis pattern of the PCR product obtained by the detection method. It specifies the species of histamine-producing bacteria.
[0036]
In the present invention, standardized data for identification is prepared by collecting the migration patterns for bacterial species identification obtained from the standard strain. The standard data is a data sheet such as paper or plastic film, or a database using a computer.
In the present invention, SSCP analysis is performed by a conventional method. In the SSCP analysis, double-stranded DNA is treated in the presence of a dissociating agent such as formamide, urea, sodium hydroxide, and formaldehyde to dissociate into single-stranded DNA.
It is preferable that the gel concentration and the electrophoresis temperature of the polyacrylamide gel used for electrophoresis are determined under optimum conditions depending on the PCR primers used, but the gel concentration is usually 6 to 30%, particularly 20 to 25%. The electrophoresis temperature is usually 5 to 25 ° C, particularly preferably 10 to 15 ° C.
[0037]
Since the PCR product obtained with the primer of the present invention is as long as 700 bases or more, it is preferable to treat with a restriction enzyme as required for SSCP analysis. The restriction enzyme can be used without any particular limitation as long as the obtained PCR product can be cut into a length suitable for SSCP analysis, for example, 200 to 300 bases. Examples of the restriction enzyme include Hinf I, Mse I, Alu I, Mbo I, Hae III, Rsa I, Taq I, Sau3A I, Mae I, Msp I, and Mae II.
In addition, when the PCR product of the present invention was cut with the restriction enzyme HinfI, it was cut into 3 to 4 fragments in most cases. For example, the fragment length is In Morgany, 277 bp, 261 bp, 171 bp, In the case of Platinum, they were 277 bp, 261 bp, 130 bp, and 40 bp.
The present invention will be described in more detail by way of examples. These examples are for the purpose of promoting the explanation and understanding of the present invention, and are not intended to limit the protection scope of the present invention.
[0038]
【Example】
(Example 1) Primer specificity test
PCR Preparation of sample for use
A PCR sample was prepared from a test sample such as fish meat using a commercially available nucleic acid extraction kit Mag Extractor-Genome (Toyobo Co., Ltd.) according to the attached protocol. The concentration of the extracted DNA was calculated assuming that the absorbance value 1 OD at a wavelength of 260 nm was 50 μg / ml of DNA.
PCR by DNA amplification
In order to amplify a desired gene of the histamine-producing bacterium and detect the histamine-producing bacterium, an amplification reaction by PCR was performed on the PCR sample in the presence of a histamine-producing bacterium detection primer. That is, for each 5 μl of DNA (5 ng / PCR) of each strain, 200 nM of all forward primers consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and 200 nM of all reverse primers consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 were added, and 10 mM Tris per 20 μL was added. -HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM 4 deoxynucleoside triphosphates, and 0.5 U Taq polymerase (Takara Bio Inc.).
[0039]
Then, using GeneAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems), heat denaturation was performed at 94 ° C for 30 seconds to make the DNA to be amplified single-stranded, annealing was performed at 58 ° C for 1 minute, and extension reaction was performed at 72 ° C. After performing 35 cycles of 3-step PCR for 1 minute, the PCR product was subjected to electrophoresis using 1% agarose gel (FMC), stained with ethidium bromide, and detected with a UV transilluminator (254 nm).
[0040]
Measurement of the amount of histamine produced
The histamine-producing activity of the histamine-producing bacteria was determined by culturing in histidine broth at 25 ° C. for 24 hours, and measuring the amount of accumulated histamine by HPLC. The culture solution was filtered using a filter Dismic-13 (Advantech Toyo Co., Ltd.) having a diameter of 0.2 μm, and this was used as a measurement sample. The fish suspension sample was subjected to a protein removal treatment with 5% perchloric acid and then filtered in the same manner. The measurement was carried out using HPLC with a fluorescence detector according to the method of Yamanaka et al. (Paper by Yamanaka et al., J. Food Hyg. Soc. Jpn. 30: 396-400. 1989).
[0041]
In this example, a primer for detecting histamine-producing bacteria comprising all forward primers consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and all reverse primers consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 was used.
Strain used for designing primers: E. coli Aerogenes, R.A. Planticola and M.P. Morgany, as well as the American Type Culture Collection (ATCC), a strain preservation organization, the RIKEN Microorganism System Preservation Facility (JCS: Japan Collection of Microorganisms); the Institute for Applied Microbiology (IAM: Institute of Microbiology) Further, histamine-producing bacteria and general bacteria having no histamine-producing ability isolated from commercially available fresh fish and the like were further separated. That is, 37 histamine-producing bacteria and 473 non-histamine-producing general bacteria were used for the evaluation of the specificity of the primer of the present invention, and a total of 510 strains were used.
[0042]
As a result of performing PCR on each strain, among 37 strains of Gram-negative bacteria capable of producing histamine, P. The target 709 bp PCR product was confirmed in 36 strains excluding histamine. No PCR product was found in the 473 strain having no histamine-producing ability (Tables 1 to 3). That is, in the 509 strains excluding one strain, the presence or absence of the histamine-producing ability and the presence or absence of the PCR product completely coincide with each other, and therefore, the primer of the present invention has high specificity for detecting Gram-negative histamine-producing bacteria. It became clear.
[0043]
The histamine-producing bacteria isolated from the fresh fish were identified by the Vitek system (Bio Merieu Vitek systems. Inc., Hazeelwood, Mo.). Was identified using the method of Kobayashi et al. (T. Kobayashi et al., Fish. Sci. 63: 807-810, 1997).
[0044]
FIG. 1 shows the results of electrophoresis confirming the desired 709 bp PCR product. In FIG. 1, lane m is a 100 bp ladder marker, lane 1 is Morganella Morgani ATCC 35200, and lane 2 is M. Morgani JCM1672T, lane 3 Morgani 87411, lane 4 Morgani AP28, lane 5 shows M. Morgani JU27, lane 6 is Enterobacter aerogenes ATCC 43175, lane 7 is Raoultera planticola ATCC 43176, and lane 8 is R. Planticola 8433, lane 9 is R. Planticola 4131, lane 10 is Proteus vulgaris AU34, lane 11 is Erwinia sp, lane 12 is P. aeruginosa ATCC33539T, lane 13 is P. aureus. Damserae JCM8968, lane 14 Phosphorium MB36 and lane 15 are negative controls. These are all histamine-producing bacteria as is clear from the table below.
[0045]
The following table shows the amount of histamine produced by each strain and the results of PCR.

[0046]

[0047]

[0048]
Notes for Tables 1-3
* A Unless otherwise indicated, strains isolated from fish were those identified by the VITEK system. The identity of all isolates was further confirmed by the partial sequence of 16S rDNA.
* B Identified by API ID32E.
* C Identified by the method of Fujii et al. (Fujii et al., 1997, Fish. Sci. 63: 807-810).
* D Not identified in either the VITEK system or API ID32E. According to the partial sequence of 16Sr DNA, Erwinia sp. And 98% identity.
[0049]
* E Not identified in either the VITEK system or API ID32E. The partial sequence of 16Sr DNA showed 98% identity with Proteus vulgaris.
* F Cultured in histidine medium at 25 ° C for 24 hours. The amount of histamine in the culture medium was measured by HPLC.
* G ND means not detected.
* H Bacteria provided by: ATCC, American Type of Culture Collection (Rockville, MD); JCM, RIKEN Microbial Strain Preservation Facility (Japan Collection of Microorganisms) Microbiology Research Institute, Saitama Prefecture, Japan; of Applied Microbiology) Tokyo, Japan; bacteria isolated from fish The bacteria are independent of strains obtained from heterologous fish.
[0050]
(Example 2) Detection of histamine-producing bacteria in a pure cell system
In order to examine the relationship between the detection sensitivity of the primer for detecting histamine-producing bacteria of the present invention and the histamine-producing ability of the histamine-producing bacteria, it was confirmed that M. Morgani was used as a test bacterium, and M. mori in histidine broth was used. The relationship between the time-dependent changes in the growth of Morganii and the amount of accumulated histamine and the time at which detection was possible by PCR was examined (FIG. 2).
[0051]
1.0 × 10 initially¹Bacteria that were cfu / ml entered the logarithmic growth phase approximately 2 hours after culture. Thereafter, the cells rapidly proliferated, and 10 hours after the start of the culture, 10⁹It became cfu / ml, and shifted to the stationary phase, and the state considered to be the stationary phase continued until 24 hours later. On the other hand, histamine accumulation in the medium started 12 hours after the culture, which is considered to have reached the stationary phase, and then increased sharply in 10 hours, and finally accumulation of 228 mg / 100 ml was observed. M. Morganyi PCR was detected when the number of bacteria was 10 hours after the start of culture.⁴/ Ml at the time of growth. As is clear from this result, M.P. In a pure strain experiment using Morgani, it was possible to detect histamine well before the accumulation of histamine. Experiments were carried out with the same system a total of three times, and reproducibility was confirmed. As a result, almost the same results were obtained.
[0052]
(Example 3) Detection of histamine-producing bacteria in a test plot using fish meat
In a test plot using fish meat, the number of general viable bacteria was 10¹Same rate for cfu / g fish meat (10¹cfu / g). Morgani was inoculated. The number of bacteria over time and the amount of accumulated histamine are shown in FIG. Inoculated M. Morgani behaved similarly to the general viable cell count in fish meat. About 16 hours after the start of the culture, about 10⁷Proliferated to cfu / g and histamine accumulation began. After that, the number of bacteria in fish meat was 10 hours after 20 hours.⁸/ G, after which the histamine level in the fish meat increased over time until 48 hours later, and 41.7 mg / 100 g of histamine was accumulated 48 hours after the final measurement point.
[0053]
8 hours after the start of culture, 10⁵When it became cfu / g, detection by PCR became possible. The control non-inoculated sample showed a growth curve with the same viable cell count as the inoculated group, but no histamine-producing bacteria derived from fish meat were detected, and amplification products were also detected by PCR. Did not. As is clear from this result, M.P. Experiments with fish meat using Morgani enabled detection of histamine well before histamine accumulation. Experiments were carried out with the same system a total of three times, and reproducibility was confirmed. As a result, almost the same results were obtained.
[0054]
(Example 4) Detection of histamine-producing bacteria in commercially available fresh fish
The sensitivity of PCR detection and the amount of accumulated histamine were examined using samples obtained from 13 commercially available fresh fish. After incubation for 8 to 20 hours, amplification of the hdc gene by PCR was confirmed in 10 of the 13 samples. In these samples, accumulation of histamine started several hours after the detection of the PCR product derived from the hdc gene, and it was confirmed that the detection of histamine-producing bacteria by PCR precedes the accumulation of histamine in fish meat.
[0055]
(Example 5) Preparation of data for identifying the species of histamine-producing bacteria
A standard strain of histamine-producing bacteria and a strain having an hdc gene derived from commercially available fresh fish were used. The 710 bp region of these hdc genes was amplified by the same PCR method as in Example 1, and the PCR product was cleaved using the 4-base recognition restriction enzyme Hinf I. The restriction enzyme treatment was performed at 37 ° C. for 3 to 5 hours, and after completion, electrophoresis was performed using a 2% agarose gel (Nippon Gene Co., Ltd.). After the completion of the electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide to confirm cleavage by a restriction enzyme.
[0056]
After the completion of the treatment, 12 μl of a formamide solution (hormamide / 0.5 M EDTA = 49: 1) was added per 20 μl of the PCR product which had been subjected to the restriction enzyme treatment. After treatment in boiling water for 5 minutes to denature the PCR product into single-stranded DNA, the mixture was immediately quenched on ice. A 10-fold amount of a loading buffer (loading buffer (Takara)) was added to the denatured DNA and subjected to electrophoresis. For the electrophoresis, a precast gel of 12% polyacrylamide (GeneGel Excel 12.5 / 24 Kit (Amersham Bioscience)) and a Genephor fragment analyzer (Amersham Bioscience) were used. The electrophoresis was performed at 12 ° C. for 110 minutes at a setting of 25 mA (700 V). After the electrophoresis, the gel was stained with silver using a Plus One DNA Silver Staining Kit (Amersham Bioscience) to obtain an electrophoresis pattern.
[0057]
As a result of using the restriction enzyme Hinf I in this example, cleavage into 3 to 4 fragments was confirmed in most strains, and the length of the cut fragment was M. In Morgany, 277 bp, 261 bp, 171 bp, R. In the case of Platinum, they were 277 bp, 261 bp, 130 bp, and 40 bp. The histamine-producing bacteria used for database creation were a total of 34 strains, and these hdc amplified products were classified into 21 SSCP types as a result of SSCP analysis. M. Morgani 13 strains are 7 types, R. Nine strains of Platinum are three types, P. Three strains of Damserae showed two types of patterns, and the other strains showed different migration patterns.
[0058]
FIG. 5 shows a data sheet including the migration patterns of these standard strains and the like. In FIG. 5, lane m is a ladder marker having a size of 100 bp, lane a is a migration pattern of Enterobacter amunigenes, lane b is a migration pattern of Morganella morganii, and lane c is E. coli. Aerogenes electrophoresis pattern, lane d is electrophoresis pattern of Photobacterium damselae, lane e is M. Morgany's migration pattern, and lane f, 1 shows the migration pattern of Morgani.
[0059]
Example 6 Identification of Histamine Producing Bacteria
Histamine production was detected from 10 fish meat samples in the same manner as in Example 1. The PCR product derived from the hdc gene obtained from the bacterium was subjected to SSCP analysis in the same manner as in Example 5 to obtain nine electrophoresis patterns. As a result of attempting to identify the strain by comparing with the electrophoresis pattern of the standard strain and the like in FIG. Morgani 4 strains, Enterobacter aerogenes 2 strains, One strain of Damserae and Enterobacter sp. One strain was identified. The remaining two strains did not have a matching migration pattern and could not be identified.
[0060]
The migration pattern of the PCR product derived from the hdc gene of the sample is shown in FIG. 6, lane 1 is the migration pattern of tuna 1 (cultured for 16 hours), lane 2 is the migration pattern of tuna 1 (cultured for 20 hours), and Similarly, lane 3 is tuna 3 (16 hours), lane 4 is tuna 3 (20 hours), lane 5 is tuna 4 (16 hours), lane 6 is tuna 4 (20 hours), and lane 7 is tuna 5 (16 hours). ), Lane 8 is tuna 5 (20 hours), lane 9 is tuna 7 (20 hours), lane 10 is tuna 7 (24 hours), lane 11 is sardine 1 (11 hours), lane 12 is sardine 1 (16 hours) ), Lane 13 is mackerel (20 hours), lane 14 is fry of yellowtail (24 hours), lane 15 is maji (16 hours), lane 16 is maji (20 hours), lane 17 is yellowtail (16:00) ), Lane 18 is a yellowtail (20 hours), the left and right lanes m is Radamaka of 100bp size.
[0061]
Compared to the data sheet lane of FIG. 5,

lanes

3 and 4 of FIG. 6 correspond to lane a of FIG. 5 and indicate Enterobacter amnigenes, and

lanes

7 and 8 are Morganella morganii of lane b,

lane

9, 10, 17, and 18 show E. coli in lane c. Aerogenes,

lanes

11 and 12 are Photobacterium damselae in lane d,

lanes

13 and 14 are M. in lane e. Morgany,

lanes

15 and 16 show M. f. Corresponding to Morgani, each strain is identified.

Lanes

1, 2, 5, and 6 did not have a lane corresponding to the data sheet, and the bacterial species could not be identified.
[0062]
【The invention's effect】
The primer and the method for detecting a histamine-producing bacterium of the present invention can solve the ambiguity of the histamine-producing bacterium determination by a conventional biochemical method and a culture method, and can solve a large time and labor burden. Can now be detected. That is, the detection method of the present invention enables accurate detection without false positives or false negatives in the conventional method, and precedes the accumulation of histamine in fish meat (histamine detection method by high-sensitivity liquid chromatography). Histamine-producing bacteria can now be detected. Furthermore, until now, when histamine food poisoning occurred, histamine could be detected from the causative ingredients, but if the histamine-producing bacteria had been killed by freezing or heating, the causative bacteria could not be identified, According to the detection method of the present invention, even if the bacterium itself has been killed, the causative bacterium can be detected in the food as long as the DNA remains.
[0063]
In addition, the histamine-producing bacteria can be accurately and easily identified using the histamine-producing bacteria identification standard data sheet and the SSCP analysis of the present invention. In other words, the identification method of the present invention makes it possible to identify the causative bacteria, thereby making it possible to quickly ascertain from which raw material or from which line of the factory the contamination has occurred.
[0064]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an electrophoresis pattern of a PCR product derived from an hdc gene of a Gram-negative histamine-producing bacterium.
FIG. 2. M. in histidine broth. It is a graph which shows the time-dependent change of the growth of Morganii, and the amount of histamine accumulation.
FIG. 3 is a graph showing a general viable cell count of 10¹Same rate for cfu / g fish meat (10¹cfu / g). 4 is a graph showing the number of bacteria over time and the amount of histamine accumulated when Morgani was inoculated.
FIG. 4 is a phylogenetic diagram of histamine-producing bacteria.
FIG. 5 shows a data sheet containing an electrophoresis pattern of a standard histamine-producing bacterium used for SCCP analysis.
FIG. 6 shows electrophoresis patterns of a plurality of histamine-producing bacteria shown by SCCP analysis.

Claims

A method for detecting a histamine-producing bacterium,
Adding a primer for detecting histamine-producing bacteria to a test sample;
Performing the PCR using the test sample; and electrophoresing the obtained PCR product.

In the electrophoresis, a band of a PCR product containing the amino acid sequence SGHHK of the active center of PLP-dependent histidine decarboxylase or a complementary sequence of the base sequence is detected. Item 2. The detection method according to Item 1.

The detection method according to claim 1, wherein the primer for detecting a histamine-producing bacterium comprises a plurality of forward primers having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

The method according to claim 3, wherein the length of the forward primer is 23 to 42 bases.

The method according to claim 1, wherein the primer for detecting a histamine-producing bacterium comprises a plurality of forward primers having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

The detection method according to claim 1, wherein the primer for detecting a histamine-producing bacterium comprises a plurality of reverse primers having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

The detection method according to claim 6, wherein the length of the reverse primer is 17 to 42 bases.

The detection method according to claim 1, wherein the histamine-producing bacteria detection primer comprises a plurality of reverse primers having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

A primer for detecting a histamine-producing bacterium comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

The primer for detecting a histamine-producing bacterium according to claim 9, wherein the length of the base sequence is 23 to 42 bases.

A primer for detecting a histamine-producing bacterium comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

A primer for detecting a histamine-producing bacterium comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

The primer for detecting a histamine-producing bacterium according to claim 12, wherein the length of the base sequence is 17 to 42 bases.

A primer for detecting a histamine-producing bacterium comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

A method for identifying a histamine-producing strain, comprising:
Adding a primer for detecting histamine-producing bacteria to a test sample;
Performing PCR using the test sample;
Electrophoresing the resulting PCR product;
From the band obtained by the electrophoresis, a base sequence encoding the amino acid sequence SGHK of the active center of PLP-dependent histidine decarboxylase or a PCR product containing the complementary sequence of the base sequence is recovered. thing;
Denaturing the PCR product into a single-stranded DNA fragment and electrophoresing under non-denaturing conditions to obtain a migration pattern of the PCR product; and comparing the migration pattern with a migration pattern for identifying a histamine-producing strain. And a method for identifying a bacterial species.

The method according to claim 15, further comprising a step of cleaving the PCR product with a restriction enzyme before obtaining a single-stranded DNA fragment by denaturation.

17. The method according to claim 16, wherein the restriction enzyme is Hinf I.

A standard data sheet for identifying histamine-producing bacteria, having a migration pattern for identifying the species of histamine-producing bacteria.

Enterobacter amnigenes, Morganella morganii, E. 19. The standard data sheet for identifying a histamine-producing bacterium according to claim 18, which has an electrophoresis pattern for identifying a species of at least one histamine-producing bacterium selected from the group consisting of Aerogenes and Photobacterium damselae.

A kit for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a primer for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a forward primer including the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer including the base sequence of SEQ ID NO: 3.

21. The kit according to claim 20, comprising a primer for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a forward primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

A kit for identifying a histamine-producing bacterium, comprising a primer for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a forward primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

The kit according to claim 22, comprising a primer for detecting a histamine-producing bacterium, comprising a forward primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

The kit according to claim 22 or 23, comprising a restriction enzyme for cleavage of a PCR product.

24. The kit according to claim 22 or 23, comprising a standard data sheet for identifying histamine-producing bacteria, having a migration pattern for identifying the species of histamine-producing bacteria.