JP2004340957A - New screening method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＲ３９）の用途に関する。 The present invention relates to the use of a G protein-coupled receptor protein (GPR39).
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ペプチドホルモン、核酸、アミン、脂質等の生理活性物質の標的として、大変重要な役割を担っている。レセプター蛋白質は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質がまだ多く存在しているものと考えられ、それらのレセプター蛋白質に関しても、まだ同定されていないものが多く残っている。さらに、既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかや動物種差があるかどうかなど分かっていないことが多く残っている。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。またゲノム配列の解析から、未知の遺伝子を予測することも盛んに行われている。しかし、多くのＥＳＴやゲノム配列は配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
ヒト由来のＧＰＲ３９のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている（非特許文献１、特許文献１〜７）。しかしながら、これらのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能およびその生理的リガンドは解明されていなかった。
Many physiologically active substances such as hormones and neurotransmitters regulate the functions of living organisms through specific receptor proteins present in cell membranes. Many of these receptor proteins perform intracellular signal transduction through activation of conjugated guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as G protein), and have seven transmembrane domains. Since they have a common structure, they are collectively called G protein-coupled receptor protein (GPCR) or seven-transmembrane receptor protein (7TMR).
G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and serve as targets for molecules that regulate the functions of those cells and organs, for example, physiologically active substances such as peptide hormones, nucleic acids, amines, and lipids. Plays a very important role. The receptor protein transmits a signal into a cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as activation and suppression of the cell.
To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various organisms and their specific receptor proteins, especially G protein-coupled receptor proteins, it is necessary to clarify the functions of cells and organs of various organisms. And provide a very important means for drug development closely related to their functions.
For example, in various organs of a living body, physiological functions are regulated under the regulation by many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In particular, physiologically active substances are present at various sites in a living body, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins. It is considered that there are still many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the living body, and many of these receptor proteins have not yet been identified. Furthermore, it remains often unknown whether a known receptor protein has a subtype or whether there is an animal species difference.
It is a very important tool for drug development to clarify the relationship between a substance that regulates a complex function in a living body and its specific receptor protein. In addition, in order to efficiently screen for agonists and antagonists for receptor proteins and to develop pharmaceuticals, it is necessary to elucidate the functions of receptor protein genes expressed in vivo and to express them in an appropriate expression system. Was needed.
In recent years, as a means of analyzing genes expressed in a living body, studies for randomly analyzing the sequence of cDNA have been actively conducted. ) Is registered in the database and published. Also, prediction of unknown genes from analysis of genomic sequences has been actively performed. However, many ESTs and genome sequences are only sequence information, and it is difficult to estimate their functions.
An amino acid sequence of human-derived GPR39 and a DNA encoding the same have been reported (Non-Patent
従来、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプター蛋白質の特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを決定することは、医薬品開発の標的ともなりうるアゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、現時点でもなお、機能未知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプター蛋白質が多数存在しており、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンド探索および機能解明が切望されている。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガンドが見出されなくても、該レセプター蛋白質の不活化実験（ノックアウト動物）から該レセプター蛋白質の生理作用を解析することにより、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することも可能である。これら該レセプター蛋白質に対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全や機能亢進に関連する疾患の予防・治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の遺伝子変異に基づく、生体での該レセプター蛋白質の機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプター蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター蛋白質遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター蛋白質遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプター蛋白質の塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプター蛋白質の遺伝子は、該レセプター蛋白質の機能不全に関与する疾患の予防・治療薬や診断薬に応用することもできる。
本発明は、機能未知のオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ＧＰＲ３９に対するリガンドの決定および該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とそのリガンドの用途に関する。すなわち、本発明は、リガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩、およびリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）もしくは該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供することを目的とする。
Conventionally, substances that inhibit the binding between a G protein-coupled receptor protein and a physiologically active substance (that is, a ligand) and substances that bind to cause the same signal transduction as a physiologically active substance (that is, a ligand) include these receptor proteins. Have been utilized as specific drugs or antagonists of the biological functions as specific antagonists or agonists. Therefore, determining a specific ligand for a G protein-coupled receptor protein is a very important means for finding agonists and antagonists that can also be targets for drug development.
However, even at present, there are a large number of so-called orphan receptor proteins, of which the function is unknown, and whose corresponding ligands have not been identified. Is eagerly awaited.
G protein-coupled receptor proteins are useful for searching for new physiologically active substances (that is, ligands), and for searching for agonists or antagonists to the receptor protein, using the signal transduction action as an index. On the other hand, even if a physiological ligand is not found, it is also possible to produce an agonist or antagonist for the receptor protein by analyzing the physiological action of the receptor protein from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor protein. It is possible. These ligands, agonists or antagonists to the receptor protein can be expected to be used as preventive / therapeutic or diagnostic agents for diseases associated with dysfunction or hyperfunction of G protein-coupled receptor proteins.
Furthermore, a decrease or increase in the function of a G protein-coupled receptor protein in a living body based on a gene mutation thereof often causes some disease. In this case, not only administration of an antagonist or agonist to the receptor protein, but also introduction of the receptor protein gene into a living body (or a specific organ) or introduction of an antisense nucleic acid to the receptor protein gene It can also be applied to treatment. In this case, the nucleotide sequence of the receptor protein is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the gene of the receptor protein is used to prevent diseases associated with dysfunction of the receptor protein. -It can also be applied to therapeutic and diagnostic agents.
The present invention relates to the determination of a ligand for orphan G protein-coupled receptor protein GPR39 whose function is unknown, and to the use of the G protein-coupled receptor protein and its ligand. That is, the present invention provides a method for screening a compound (antagonist, agonist) or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and the G protein-coupled receptor protein, or a salt thereof, using the screening kit, the screening method or the screening kit. Compounds (antagonists, agonists) or salts thereof that alter the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein, and compounds thereof (antagonists and agonists) that alter the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein ) Or a compound containing a compound that changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, and the like.
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト由来のＧＰＲ３９のリガンドが特定の金属元素またはその塩であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 The present inventors have conducted intensive studies and found that the human-derived GPR39 ligand is a specific metal element or a salt thereof. The present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、
〔１〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）イオン化可能な金属元素またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と該金属元素またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が配列番号：１、配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）イオン化可能な金属元素またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と該金属元素またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング用キット、
〔４〕上記〔１〕記載のスクリーニング方法または上記〔３〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、イオン化可能な金属元素またはその塩と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩、
〔５〕イオン化可能な金属元素またはその塩と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含有してなる医薬、
〔６〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔７〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔８〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔９〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔１０〕試験化合物もしくは元素またはその塩を配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストのスクリーニング方法、
〔１１〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とイオン化可能な金属元素またはその塩との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔１２〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とイオン化可能な金属元素またはその塩との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
〔１３〕上記〔１１〕記載のスクリーニング方法または上記〔１２〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、
〔１４〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストを含有してなる医薬、
〔１５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔１６〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔１７〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔１８〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔１９〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の診断剤、
〔２０〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害、炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の診断剤、
〔２１〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔２２〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔２３〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の診断剤、
〔２４〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害、炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の診断剤、
〔２５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔２６〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔２７〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２８〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害を予防・治療する化合物またはその塩、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２９〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔３０〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害を予防・治療する化合物またはその塩、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療薬のスクリーニング用キット、
〔３１〕上記〔２７〕記載のスクリーニング方法または上記〔２９〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病を予防・治療する化合物またはその塩、
〔３２〕上記〔２８〕記載のスクリーニング方法または上記〔３０〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害を予防・治療する化合物またはその塩、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療する化合物またはその塩、
〔３３〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔３４〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔３５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔３６〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔３７〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療方法、
〔３８〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療方法、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進方法、
〔３９〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療方法、
〔４０〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療方法、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制方法、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療方法、
〔４１〕発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
〔４２〕膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
〔４３〕腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用、および
〔４４〕過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用を提供する。
That is, the present invention
[1] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) an ionizable metal element Or a method for screening a compound or an element or a salt thereof that changes the binding property or signal transduction between the receptor protein or a salt thereof and the metal element or a salt thereof, characterized by using a salt thereof.
[2] The screening method according to the above [1], wherein the G protein-coupled receptor protein is a G protein-coupled receptor protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8.
[3] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) an ionizable metal element Or a screening kit for a compound or an element or a salt thereof that alters the binding property or signal transduction between the receptor protein or a salt thereof and the metal element or a salt thereof, which comprises a salt thereof.
[4] The same or substantially the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained by using the screening method according to [1] or the screening kit according to [3]. A compound or element or a salt thereof, which alters the binding or signal transduction with a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, which contains the same amino acid sequence,
[5] Binding or signal transduction with a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with an ionizable metal element or a salt thereof A drug comprising a compound or an element or a salt thereof that changes
[6] poor growth, wounds, burns, coldness, comprising an agonist for a G protein-coupled receptor protein or an salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Impaired learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, enlarged prostate, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, Prophylactic / therapeutic agents for hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[7] hypotonic bladder based on decreased bladder perception comprising an agonist to a G protein-coupled receptor protein or an salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or an agent for preventing or treating hypotonic bladder due to bladder numbness after a surgical operation on the pelvis internal organs, or a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter,
[8] renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergy containing an antagonist to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof Preventive / therapeutic agent for dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease,
[9] Frequent urination and nocturnal frequency due to overactive bladder comprising an antagonist to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof Prophylactic / therapeutic agents for various disorders caused by urine, urinary frequency due to cystitis, pollakiuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or urinary stones, cytokines ( Eg, IL-8) secretion inhibitor or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disease; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia ) Or an agent for preventing or treating allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD))
[10] When a test compound or an element or a salt thereof is brought into contact with a cell containing a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Intracellular Ca 2+ A method for screening an agonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises measuring a concentration-increasing activity;
[11] (1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) the receptor protein or the same A method for screening for an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising using a compound or an element or a salt thereof that changes the binding property between a salt and an ionizable metal element or a salt thereof,
[12] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) the receptor protein or the same. A kit for screening an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises a compound or an element or a salt thereof that changes the binding property between a salt and an ionizable metal element or a salt thereof,
[13] contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained by using the screening method described in [11] or the screening kit described in [12]. Agonists or antagonists for G protein-coupled receptor proteins or salts thereof,
[14] a medicament comprising an agonist or antagonist to a G protein-coupled receptor protein or an salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
[15] poor growth, wound, burn containing a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 , Chilliness, decreased learning ability, sexual dysfunction, taste disorder, olfactory disturbance, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, liver cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains , Anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, prophylactic and therapeutic agents for depression or irregular menstruation,
[16] Based on a decrease in bladder perception comprising a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Prophylactic or therapeutic agent for hypotonic bladder due to hypotonic bladder or bladder palsy after surgical operation of pelvic viscera, or cytokine (eg, IL-8) secretion promoter,
[17] a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Poor growth, wounds, burns, chilliness, reduced learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, Prophylactic / therapeutic agents for cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, cardiac disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[18] a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Prophylactic or therapeutic agent for hypotonic bladder due to hypotonic bladder based on decreased bladder perception or bladder sensation after surgical operation of pelvic viscera, or cytokine (eg, IL-8) secretion promoter,
[19] a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Poor growth, wounds, burns, chilliness, reduced learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, Cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, menstrual irregular renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, perception Diagnostic agent for neuropathy or Wilson's disease,
[20] a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Hypotonia due to decreased bladder perception, hypotonia bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy , Urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urolithiasis, inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorders, etc .; ulcerative colon) Inflammatory bowel disease such as inflammation; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) Diagnostic agent,
[21] a renal dysfunction comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Prophylactic / therapeutic agents for pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease,
[22] by overactive bladder comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Prevention of various disorders caused by frequent urination, nocturia, frequent cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or urinary stones Therapeutic agent, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, diabetic complication such as neuropathy or macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; hypersensitivity) Prophylactic / therapeutic agents for genital bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD));
[23] poor growth or wound comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 , Burns, chills, reduced learning ability, sexual dysfunction, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes , Spots, anemia, hair loss, breathing disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson Diagnostic agents for diseases,
[24] An overactive bladder comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Frequent urination, nocturia, frequent cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urinary stones, inflammatory diseases (Eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis) , Diagnostic agent for chronic obstructive pulmonary disease (COPD),
[25] complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, prophylactic / therapeutic agent for sensory neuropathy or Wilson's disease, comprising a polynucleotide comprising a base sequence or a part thereof,
[26] complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Frequent urination due to overactive bladder, nocturia, pollakisuria due to cystitis, pollakisuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urinary urgency, urinary urgency Agent for preventing or treating various disorders caused by visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or urolithiasis, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, neuropathy, macrovascular disorder) Diabetic complications such as ulcerative colitis; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopy) Dermatitis, prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease (COPD)),
[27] Use of a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Changes the expression level of the receptor protein characterized by poor growth, wounds, burns, chilling, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, Compounds or salts thereof that prevent or treat renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease Ningu way,
[28] Use of a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof Change the expression level of the receptor protein characterized, hypotonic bladder based on decreased bladder perception, hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, Compounds or salts thereof for preventing and treating various disorders caused by urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urinary urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation symptoms, or urolithiasis, Cytokine (eg, IL-8) secretion modulators, or inflammatory diseases (eg, neuropathy, diabetic complications such as macrovascular disorders; ulcerative colitis) Screening of compounds or salts thereof to prevent or treat any inflammatory bowel disease; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)). Method,
[29] a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Changes the expression level of the receptor protein, resulting in poor growth, wounds, burns, chilling, reduced learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, liver cirrhosis, cholesterol accumulation , Reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, renal function For compounds or salts thereof to prevent or treat disorders, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease Kit,
[30] a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Hypotensive bladder based on a decrease in bladder perception, hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, cystitis For preventing or treating frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary frequency, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or various disorders caused by urolithiasis, or a salt thereof, cytokine ( Eg, IL-8) secretion modulators or inflammatory diseases (eg, neuropathy, diabetic complications such as macrovascular disorders; inflammation such as ulcerative colitis) Bowel disease; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (e.g., asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) prophylactic or therapeutic drug screening kit of the)
[31] containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method described in [27] or the screening kit described in [29]. Changes the expression level of G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof, resulting in poor growth, wounds, burns, chilling, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction , Stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, cardiac disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, Compounds or salts that prevent or treat depression, irregular menstruation, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease
[32] containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method described in [28] or the screening kit described in [30]. Hypotensive bladder based on a decrease in bladder perception, hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, and urinary frequency due to overactive bladder by changing the expression level of the G protein-coupled receptor protein or its partial peptide To prevent and treat various disorders caused by nocturia, nocturia, frequent cystitis, pollakiuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or urolithiasis Compound or its salt, cytokine (eg, IL-8) secretion modulator, or inflammatory disease (eg, diabetic complication such as neuropathy, macrovascular disorder; ulcerative) Compounds or salts thereof for preventing or treating inflammatory bowel diseases such as enteritis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)). ,
[33] a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Poor growth, wounds, burns, chilliness, reduced learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, Prophylactic / therapeutic agents for cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, cardiac disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[34] a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Prophylactic or therapeutic agent for hypotonic bladder due to hypotonic bladder based on decreased bladder perception or bladder sensation after surgical operation of pelvic viscera, or cytokine (eg, IL-8) secretion promoter,
[35] a compound or a salt thereof that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease
[36] a compound or a salt thereof which decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Urinary frequency due to overactive bladder, nocturia, pollakiuria due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or various symptoms caused by urinary calculus Prophylactic / therapeutic agent for dysfunction, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, neuropathy, diabetic complication such as macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis) Cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or an agent for preventing or treating allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD));
[37] With respect to mammals, (i) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof, ii) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (iii) sequence An agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (iv) identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or a G protein-coupled receptor protein containing a substantially identical amino acid sequence or a portion thereof Poor growth, wounds, burns, chilling, reduced learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, enlarged prostate, artery, characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that increases the expression level of the peptide Sclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, How to prevent and treat hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[38] For a mammal, (i) a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof, ii) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (iii) sequence An agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (iv) identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or a G protein-coupled receptor protein containing a substantially identical amino acid sequence or a portion thereof Prevention of hypotonic bladder due to hypotonic bladder based on reduction of bladder perception or bladder palsy after surgical operation of pelvic visceral organ characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that increases the expression level of peptide A method of treatment, or a method of promoting cytokine (eg, IL-8) secretion;
[39] An antibody against a mammal, which is (i) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof (Ii) complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Iii) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof Or (iv) identical or identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergy, which comprises administering an effective amount of a compound or a salt thereof that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing a qualitatively identical amino acid sequence. A method for preventing or treating dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease,
[40] an antibody against a mammal, which is (i) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof (Ii) complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Iii) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof Or (iv) identical or identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Frequent urination and nocturia due to overactive bladder, characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having a qualitatively identical amino acid sequence. Urine, frequent urination due to cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or various methods of preventing and treating disorders caused by urinary stones, cytokines ( Eg, IL-8) secretion suppression methods, or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) ) Or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD))
(41) poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, liver cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, For the manufacture of a prophylactic or therapeutic agent for gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, cardiac disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation ( i) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof; (ii) represented by SEQ ID NO: 1 Contains a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence (Iii) an agonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (iv) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Use of a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented,
[42] for producing a prophylactic / therapeutic agent for hypotonic bladder due to hypotonic bladder based on a decrease in bladder perception or bladder palsy following a surgical operation of the pelvic viscera or a cytokine (eg, IL-8) secretagogue; (I) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof; (ii) represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence; (iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 To a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as Or (iv) a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. use,
[43] (i) The same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic / therapeutic agent for renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease An antibody against a G protein-coupled receptor protein containing the same amino acid sequence, a partial peptide thereof or a salt thereof; (ii) a G protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a part thereof; (iii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as or a salt thereof Or a salt thereof, or (iv) a compound or a salt thereof, which decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The use of, and
[44] Due to frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or urinary calculus Agents for preventing or treating various disorders that occur, inhibitors of cytokine (eg, IL-8) secretion, or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disorder; inflammatory diseases such as ulcerative colitis) (I) Sequence for producing a preventive / therapeutic agent for intestinal disease; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)). An antibody against a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof; (ii) an amino acid represented by SEQ ID NO: 1 It comprises a base sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the acid sequence, or a part thereof. A polynucleotide, (iii) an antagonist to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or (iv) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Provided is a use of a compound or a salt thereof, which reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented.
さらに、本発明は、
〔４５〕（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、ＧＰＲ３９と略記する）、その部分ペプチドまたはその塩と、イオン化可能な金属元素（以下、金属元素と略記する）またはその塩とを接触させた場合と、（ii）ＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩と、金属元素またはその塩および試験化合物もしくは元素またはその塩とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４６〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素をＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素のＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４７〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４８〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素をＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４９〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素を、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素のＧＰＲ３９に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５０〕（ｉ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩および試験化合物をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５１〕ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩を、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５２〕ＧＰＲ３９を活性化する元素がイオン化可能な金属元素である上記〔５０〕または〔５１〕記載のスクリーニング方法、
〔５３〕ＧＰＲ３９を含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記〔３〕または〔１０〕記載のスクリーニング用キット、
〔５４〕ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９を含有することを特徴とする上記〔３〕または〔１０〕記載のスクリーニング用キット、
〔５５〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
〔５６〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
〔５７〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
〔５８〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療薬またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
〔５９〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
〔６０〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、および
〔６１〕各薬を該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、各薬と該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記〔５５〕〜〔６０〕記載の確認方法等を提供する。
Further, the present invention provides
[45] (i) a G protein-coupled receptor protein (hereinafter abbreviated as GPR39) characterized by containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A case where a partial peptide or a salt thereof is brought into contact with an ionizable metal element (hereinafter abbreviated as a metal element) or a salt thereof; and (ii) GPR39, a partial peptide or a salt thereof, and a metal element or a salt thereof. And the screening method according to the above [1], wherein the comparison is performed with the case of contacting with a test compound or an element or a salt thereof.
[46] (i) The case where the radioisotope of the metal element is brought into contact with GPR39, its partial peptide or its salt; and (ii) the case where the radioisotope of the metal element and the test compound or the element or its salt are GPR39, its part. The screening method according to the above [1], wherein the amount of binding of the radioisotope of the metal element to GPR39, its partial peptide or its salt when contacted with the peptide or its salt is measured and compared;
[47] (i) contacting a radioisotope of a metal element with a cell containing GPR39; and (ii) contacting a radioisotope of a metal element and a test compound or element or a salt thereof with a cell containing GPR39. The screening method according to the above [1], wherein the amount of binding of the radioisotope of the metal element to the cell is measured and compared.
[48] (i) a case where a radioisotope of a metal element is brought into contact with a membrane fraction of a cell containing GPR39; and (ii) a case where a radioisotope of a metal element and a test compound or an element or a salt thereof contain GPR39. The screening method according to the above [1], wherein the amount of binding of a radioisotope of a metal element to the membrane fraction of the cell in the case of being brought into contact with the membrane fraction of the cell is measured and compared.
[49] (i) A radioisotope of a metal element was expressed in the cell membrane of a transformant obtained by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA containing a DNA encoding GPR39. The radioisotope of the metal element when contacted with GPR39 and (ii) when the radioisotope of the metal element and the test compound or the element or its salt are brought into contact with GPR39 expressed on the cell membrane of the transformant The screening method according to the above [1], wherein the amount of binding to GPR39 is measured and compared.
[50] (i) GPR39-activating compound or element or a salt thereof is brought into contact with a GPR39-containing cell; and (ii) GPR39-activating compound or element or a salt thereof and a test compound as GPR39. The screening method according to the above [1], wherein the cell stimulating activity mediated by GPR39 when the cells are contacted with the cells is measured and compared.
[51] A compound or element that activates GPR39 or a salt thereof is cultured on a cell membrane of a transformant obtained by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA containing a DNA encoding GPR39. Measurement of GPR39-mediated cell stimulating activity in the case of contacting with expressed GPR39 and the case of contacting GPR39 expressed in the cell membrane of the transformant with a compound or element that activates GPR39 or a salt thereof and a test compound. The screening method according to the above [1], wherein the comparison is performed.
[52] the screening method of the above-mentioned [50] or [51], wherein the element activating GPR39 is an ionizable metal element;
[53] the screening kit of the above-mentioned [3] or [10], which comprises a cell containing GPR39 or a membrane fraction thereof;
[54] The above-mentioned [characterized by comprising the GPR39 expressed in the cell membrane of the transformant by culturing the transformant transformed with the recombinant vector containing the DNA containing the DNA encoding GPR39 [ 3] or the screening kit according to [10],
[55] a G-protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, characterized by poor growth, wounds, burns, and coldness , Reduced learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia Prevention of hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease A method for confirming that a therapeutic agent binds to the receptor protein or a salt thereof,
[56] hypotonia based on reduced bladder perception, characterized by using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Hypotonic bladder due to bladder numbness after bladder and pelvic viscera surgery, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvis Prophylactic / therapeutic agent for various disorders caused by visceral pain, dyspareunia, bladder irritation symptoms, or urolithiasis, cytokine (eg, IL-8) secretion regulator, or inflammatory disease (eg, neuropathy, macrovascular disorder) Inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease) How preventive and therapeutic agent to confirm that binding to the receptor protein or its salt (COPD)),
[57] a G-protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, characterized by poor growth, wound, burn, and cold , Reduced learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia A method for confirming that a preventive or therapeutic agent for hair loss, respiratory disorder, digestive disorder, heart disorder, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation is an agonist for the receptor protein or a salt thereof,
[58] Hypotonia based on reduced bladder perception, characterized by using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A method for confirming that an agent for preventing or treating hypotonic bladder or a cytokine (eg, IL-8) secretagogue is an agonist for the receptor protein or a salt thereof due to bladder numbness after a surgical operation on the bladder or pelvic viscera ,
[59] renal dysfunction, pulmonary dysfunction, comprising using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; A method for confirming that a preventive / therapeutic agent for allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease is an antagonist to the receptor protein or a salt thereof,
[60] using a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, including pollakiuria due to overactive bladder, Frequent urination, frequent urination due to cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or preventive or therapeutic agent for various disorders caused by urinary calculus (Eg, IL-8) secretion inhibitors or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; Neuralgia) or a prophylactic / therapeutic agent for an allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) is an antagonist to the receptor protein or a salt thereof. And [61] measuring the amount of each drug bound to the receptor protein, its partial peptide or its salt when each drug is contacted with the receptor protein, its partial peptide or its salt. The confirmation method described in the above [55] to [60] is provided.
ＧＰＲ３９とリガンドであるカドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩とを用いることによって、該金属元素またはその塩とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。また、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、活性がより強いアゴニストを見出すことできる。
ＧＰＲ３９に対するアゴニストは、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
ＧＰＲ３９に対するアンタゴニストは、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。
By using GPR39 and ligands such as cadmium, zinc, copper and nickel as ionizable metal elements or salts thereof, a compound capable of changing the binding property between the metal element or salts thereof and GPR39 can be efficiently screened. Can be. Further, by using the screening method of the present invention, an agonist having stronger activity can be found.
Agonists for GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, chilling, reduced learning ability, sexual dysfunction, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, infection Reduced resistance, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hypotonic bladder based on the decrease, metal deficiency such as hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, or a cytokine (eg, IL-8) secretagogue.
Antagonists to GPR39 include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis including interstitial cystitis, Prophylactic / therapeutic agents such as pollakiuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urolithiasis, cytokines (eg, IL -8) Secretory inhibitors or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergies It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).
本発明で使用されるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ＧＰＲ３９（以下、ＧＰＲ３９と略記する場合がある）は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
ＧＰＲ３９は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、腸管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋、膀胱など、特に、膀胱、中枢神経組織、下垂体、腎臓、胃・腸管組織、胎児脳、血管系初代培養細胞、腎臓系初代培養細胞または大腸がん細胞株に由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
G protein-coupled receptor protein GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as GPR39) used in the present invention is a receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is.
GPR39 is, for example, a human or mammal (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) in any cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells) , Mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or of these cells. Progenitor cells, stem cells or cancer cells, etc.) or cells of the blood cell lineage, or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, squamous nucleus, basal sphere, Horse, thalamus, hypothalamus, hypothalamus nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, Kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), intestinal tract, blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, Prostate, testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, bladder, etc., especially bladder, central nervous tissue, pituitary, kidney, stomach / intestinal tract tissue, fetal brain, primary cultured cells of vascular system, kidney It may be a protein derived from a primary cultured cell line or a colon cancer cell line, or may be a synthetic protein.
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
As the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, about 80% or more, preferably 90% or more, more preferably about 95% or more as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 And the like.
Examples of the protein of the present invention having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
The homology of amino acid sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool), and the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = BLOSUM62). Can be calculated.
Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction action. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal information transmission activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
The activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction activity can be measured according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.
また、ＧＰＲ３９としては、ａ）配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。 As GPR39, a) one or two or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8; , More preferably several (1-5) amino acids, b) SEQ ID NO: 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 An amino acid sequence to which the above (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids have been added; c) SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 6 or 1 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. Amino acids are other The amino acid sequence are substituted with amino acids, or d) be such as protein containing the amino acid sequence comprising a combination thereof is used.
本明細書におけるＧＰＲ３９は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとするＧＰＲ３９は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＧＰＲ３９がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明でいうＧＰＲ３９に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＧＰＲ３９には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
ＧＰＲ３９の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＧＰＲ３９、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＧＰＲ３９、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ＧＰＲ３９などが用いられる。ヒト由来ＧＰＲ３９は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７ Ｄｅｃ １５；４６（３）：４２６−３４、ＷＯ２００２／６１０８７号公報、ＵＳ２００２／００４４９１号公報、ＷＯ２００２／３９８８５号公報、ＷＯ２００２／７１９２８号公報、ＷＯ２００１／８１６３４号公報、ＷＯ２００２／７９４９２号公報、ＷＯ２００２／８６４４３号公報に記載されている公知の蛋白質である。
GPR39 in the present specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end in accordance with the convention of peptide labeling. GPR39 including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO − ), an amide (—CONH 2 ) or an ester (—COOR) at the C-terminus. Any of these may be used.
Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl And C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or C 7- alkyl such as α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl. In addition to the 14 aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group widely used as an oral ester is used.
When GPR39 has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the GPR39 of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Further, in the GPR39, the amino group of the N-terminal methionine residue in the protein described above is protected with a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as formyl group and acetyl). , A glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, amino group, imidazole group, Those in which an indole group, a guanidino group, etc.) are protected by a suitable protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as formyl group and acetyl), or a sugar chain bound thereto. Complex proteins such as so-called glycoproteins are also included.
Specific examples of GPR39 include, for example, human-derived GPR39 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, mouse-derived GPR39 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. Rat-derived GPR39 and the like are used. Human-derived GPR39 is described in Genomics, 1997
ＧＰＲ３９の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記したＧＰＲ３９の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＧＰＲ３９の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するＧＰＲ３９の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列の相同性は、前記と同様の相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、同様の条件にて計算することができる。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
The partial peptide of GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as a partial peptide) may be any of the above-mentioned partial peptides of GPR39. And a site having substantially the same receptor binding activity.
Specifically, as a partial peptide of GPR39 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis A peptide containing a part that has been analyzed. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
The number of amino acids in the partial peptide of the present invention is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more among the constituent amino acid sequences of the above-described receptor protein of the present invention. .
A substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with these amino acid sequences.
Amino acid sequence homology can be calculated using the same homology calculation algorithm NCBI BLAST as described above under the same conditions.
Here, “substantially the same receptor activity” has the same meaning as described above. "Substantially the same receptor activity" can be measured in the same manner as described above.
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＧＰＲ３９と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ＧＰＲ３９またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
Further, the partial peptide of the present invention has one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acid One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the sequence may be substituted with another amino acid.
In the partial peptide, the C-terminus carboxyl group of the present invention (-COOH), carboxylate (-COO -), may be any of an amide (-CONH 2) or an ester (-COOR). When the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Further, the partial peptide of the present invention includes, as in the above-mentioned GPR39, those in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected by a protecting group, Glutamine-oxidized products, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bound, such as a so-called glycopeptide, are also included.
Examples of the salt of GPR39 or a partial peptide thereof include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
ＧＰＲ３９またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載するＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
GPR39 or a salt thereof can be produced from the above-described human or mammalian cells or tissues by a known method for purifying a receptor protein, or a transformant containing a DNA encoding GPR39 described later is cultured. It can also be manufactured. Further, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described later or according thereto.
When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
ＧＰＲ３９もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢt、 ＨＯＯＢt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステルあるいはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
For the synthesis of GPR39 or its partial peptide, its salt or its amide, a commercially available resin for protein synthesis can be usually used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond forming reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof.
Regarding the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is previously activated as a symmetric acid anhydride or a HOBt ester or a HOOBt ester. After that, it can be added to the resin.
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。 The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Examples thereof include sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; and appropriate mixtures thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about −20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When a sufficient condensation cannot be obtained by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, tertiarypentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxy It can be protected by carbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. As a group suitable for this esterification, for example, a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, and a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
As a protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine, for example, Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用いられる。
原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt).
As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, meta-cresol, para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4- It is effective to add a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is extended to a desired chain length on the amino group side, and A protein from which only the protecting group for the α-amino group at the N-terminus of the peptide chain has been removed and a protein from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminus has been removed, and these proteins are mixed in the above-mentioned mixed solvent. To condense. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. The crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
In order to obtain an ester of a protein, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein is obtained in the same manner as the amide of the protein. be able to.
ＧＰＲ３９の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＧＰＲ３９を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ＧＰＲ３９を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
ｂ）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
The partial peptide of GPR39 or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se or by cleaving GPR39 with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting GPR39 with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following a) to e).
a) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
b) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
c) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
d) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of
e) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Pharmaceuticals Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten After the reaction, use a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. The partial peptide of the invention can be purified and isolated. When the partial peptide obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained in a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
ＧＰＲ３９をコードするポリヌクレオチドとしては、上記したＧＰＲ３９をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
ＧＰＲ３９をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、ＧＰＲ３９のｍＲＮＡを定量することができる。
ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるＧＰＲ３９と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
The polynucleotide encoding GPR39 may be any polynucleotide as long as it contains a base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding GPR39 described above. The polynucleotide is a DNA encoding GPR39, RNA such as mRNA, or the like, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the polynucleotide encoding GPR39, the mRNA of GPR39 can be quantified, for example, by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
The DNA encoding GPR39 may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be carried out directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cells / tissues.
Specifically, as the DNA encoding GPR39, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions It has a nucleotide sequence, and has substantially the same activity as GPR39 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, ligand binding activity, signal transduction action, cytokine (eg, IL-8) secretion promoting action, etc.) Any DNA may be used as long as it encodes a receptor protein having
Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. For example, DNA containing a base sequence having a property is used.
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるラットＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、配列番号：９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ＧＰＲ３９遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＧＰＲ３９をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＧＰＲ３９遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＧＰＲ３９関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧＰＲ３９遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＧＰＲ３９関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＧＰＲ３９関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＧＰＲ３９遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。ＧＰＲ３９遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ＧＰＲ３９遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
The homology of the nucleotide sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; filtering = ON; match score = 1; Mismatch score = −3).
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding human GPR39 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used. As the DNA encoding mouse GPR39 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or the like is used. As the DNA encoding rat GPR39 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the like are used.
A polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence of the DNA encoding GPR39 or a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA refers to the following DNA encoding the partial peptide of the present invention only. But also used to include RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the GPR39 gene is designed based on the cloned or determined nucleotide sequence information of the DNA encoding GPR39, Can be synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize to the RNA of the GPR39 gene and inhibit the synthesis or function of the RNA, or inhibit the expression of the GPR39 gene through interaction with a GPR39-related RNA. It can be adjusted and controlled. Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of GPR39-related RNA and that can specifically hybridize to GPR39-related RNA are useful for regulating and controlling GPR39 gene expression in vivo and in vitro. It is useful, and is useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5′-end hairpin loop, 5′-end 6-base pair repeat, 5′-end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation initiation codon, 3′-end untranslated region, 3 ′ end of GPR39 gene The terminal palindrome region and the 3′-end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the GPR39 gene may be selected as a target.
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。 The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that is complementary to at least a part of the target region and can hybridize can be said to be “antisense” with the target. Antisense polynucleotides include polydeoxyribonucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polyribonucleotides containing D-ribose, and other types of polynuclei that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Other polymers with nucleotides or non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymers are found in DNA or RNA Base pairs and nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxic , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides) having side chain groups, interacting compounds (for example, acridine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
Thus, many modifications are known in the art, for example, J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Examples of other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of an antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a G protein-coupled receptor protein. it can. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ＧＰＲ３９と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、前記した相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、同様の条件にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションの方法および条件は前記と同様である。
The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells / tissues, cDNA library derived from the above-described cells / tissues, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the above-described cells and tissues.
Specifically, the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) a DNA having a partial nucleotide sequence. Has a base sequence that hybridizes under high stringent conditions to the base sequence represented by, and has substantially the same activity as GPR39 (eg, ligand binding activity, signal transduction action, cytokine (eg, IL-8)) For example, a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a receptor protein having a secretion promoting action) is used.
The DNA capable of hybridizing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. For example, DNA containing a base sequence having
The homology of the nucleotide sequences can be calculated under the same conditions using the homology calculation algorithm NCBI BLAST described above.
Hybridization methods and conditions are the same as described above.
ＧＰＲ３９またはその部分ペプチド（以下、ＧＰＲ３９と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ＧＰＲ３９の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＧＰＲ３９の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 As a means for cloning DNA that completely encodes GPR39 or a partial peptide thereof (hereinafter sometimes abbreviated as GPR39), amplification by a PCR method using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of GPR39, or The DNA incorporated in an appropriate vector can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of GPR39 or labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＧＰＲ３９をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
ＧＰＲ３９の発現ベクターは、例えば、（イ）ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
The DNA base sequence can be converted using the ODA-LA PCR method using PCR or a known kit, for example, Mutan ™ -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan ™ -K (Takara Shuzo), or the like. It can be carried out according to a method known per se, such as the Gapped Duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The cloned DNA encoding GPR39 can be used as it is depending on the purpose, or may be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The expression vector of GPR39 can be produced, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding GPR39, and (ii) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. it can.
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
Examples of the vector include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Among them, it is preferable to use the CMV promoter, SRα promoter and the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, .lambda.P L promoter, lpp promoter, etc. When the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter and penP promoter, the host is In the case of yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. As the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo r, G418 resistance). In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using CHO (dhfr − ) cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
Using the vector containing the DNA encoding GPR39 thus constructed, a transformant can be produced.
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12.DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology] 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] and the like are used. .
Examples of Bacillus spp. Include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. )] Is used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R - , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036, such as Pichia pastoris (Pichia pastoris) is employed Can be
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveＴＭ細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from the larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High Five ™ derived from egg of Trichoplusia ni Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
As the insect, for example, a silkworm larva is used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr − ) cells), and mouse L. Cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells and the like are used.
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Gene），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
In order to transform Escherichia, for example, Procagings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 ( 1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
For transforming yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences of Science -The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, Vol. 52, 456 (1973).
Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding GPR39 is obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and among them, a carbon source necessary for growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc., as a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3β-indolyl acrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, as a medium, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Sciences of Science Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Processings of the National. Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and / or agitation are added as necessary.
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., ネイチャー（Nature）, 195, 788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にＧＰＲ３９を生成せしめることができる。
When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the medium may be 10% bovine serum immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). And the like, to which the additives described above are appropriately added. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] and the like are used. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
As described above, GPR39 can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
上記培養物からＧＰＲ３９を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
ＧＰＲ３９を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＧＰＲ３９の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＧＰＲ３９が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＧＰＲ３９の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
GPR39 can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
When GPR39 is extracted from the cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culture, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. Alternatively, a method of obtaining a crude extract of GPR39 by centrifugation or filtration after disrupting the cells is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When GPR39 is secreted into the culture solution, after the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of GPR39 contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography And a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing.
かくして得られるＧＰＲ３９が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＧＰＲ３９を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成するＧＰＲ３９の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
When GPR39 thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when GPR39 is obtained as a salt, a method known per se or a method analogous thereto Can be converted to a free form or another salt.
GPR39 produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
The activity of GPR39 thus generated can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
ＧＰＲ３９に対する抗体は、ＧＰＲ３９を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
ＧＰＲ３９に対する抗体は、ＧＰＲ３９を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
The antibody against GPR39 may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize GPR39.
Antibodies to GPR39 can be produced using GPR39 as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＧＰＲ３９は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプター蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell GPR39 is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration, itself or together with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual having an antibody titer was selected from a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. By incubating at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently.
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター蛋白質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which an antigen of a receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactive A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a substance or an enzyme (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice) or protein A; A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a receptor protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. .
The selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
(B) Monoclonal antibody purification Monoclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method) in the same manner as ordinary polyclonal antibody separation and purification. , Ion-exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate the antibody Specific Purification Method for Obtaining).
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＧＰＲ３９抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＧＰＲ３９に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (GPR39 antigen) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described monoclonal antibody production method. Can be produced by separation and purification of
Regarding a complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a mammal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten should be such that the antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by crosslinking the carrier. Any kind may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 20 with respect to 1 hapten. Preferably, a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
ＧＰＲ３９のリガンドは、イオン化可能な金属元素またはその塩である。
イオン化可能な金属元素としては、例えば、亜鉛、銅、ニッケル、カドミウムなどが挙げられる。
これらの金属元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が用いられ、具体的には、塩化カドミウム、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、塩化銅、硫酸銅、塩化ニッケル、硫酸ニッケルなどが好ましく、特に塩化カドミウム、塩化亜鉛、塩化銅、塩化ニッケルが好ましい。
また、本願明細書においては、イオン化可能な金属元素には、（１）イオン状態の金属元素（例、亜鉛イオン、銅イオン、ニッケルイオン、カドミウムイオン）、（２）イオン化可能な金属元素を含む化合物（例、酸化亜鉛、酸化銅、酸化ニッケル、酸化カドミウムなどの酸化物など）なども含まれる。
以下、明細書中では、カドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩を単に「金属元素」と略記する。
ＧＰＲ３９、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、ＧＰＲ３９に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。
The ligand of GPR39 is an ionizable metal element or a salt thereof.
Examples of the ionizable metal element include zinc, copper, nickel, and cadmium.
As salts of these metal elements, for example, salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, acetic acid, and the like, specifically, cadmium chloride, zinc chloride, zinc acetate, copper chloride, copper sulfate, nickel chloride , Nickel sulfate and the like are preferable, and cadmium chloride, zinc chloride, copper chloride and nickel chloride are particularly preferable.
Further, in the present specification, the ionizable metal element includes (1) a metal element in an ion state (eg, zinc ion, copper ion, nickel ion, cadmium ion), and (2) a metal element that can be ionized. Compounds (eg, oxides such as zinc oxide, copper oxide, nickel oxide, and cadmium oxide) are also included.
Hereinafter, in the specification, an ionizable metal element such as cadmium, zinc, copper, and nickel or a salt thereof is simply abbreviated as “metal element”.
GPR39, a DNA encoding GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention), an antibody against GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense DNA against the DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as the antibody of the present invention) , May be abbreviated as antisense DNA of the present invention) has the following uses.
（１）ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤
ａ）ＧＰＲ３９またはｂ）ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内においてＧＰＲ３９が減少しているために、リガンドである金属元素の生理作用が期待できない（ＧＰＲ３９の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）ＧＰＲ３９を該患者に投与し、該ＧＰＲ３９の量を補充したり、ｂ）（イ）ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、または（ロ）対象となる細胞にＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＧＰＲ３９の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡは、安全で低毒性なＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
具体的には、ＧＰＲ３９または本発明のＤＮＡは、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として使用することができる。
ＧＰＲ３９を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）ＧＰＲ３９またはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）ＧＰＲ３９またはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
(1) Agent for preventing or treating a disease associated with dysfunction of GPR39 a) GPR39 or b) DNA encoding GPR39 can be used as a drug such as an agent for preventing or treating a disease associated with dysfunction of GPR39. it can.
For example, when there is a patient who cannot expect the physiological action of a metal element as a ligand (GPR39 deficiency) due to a decrease in GPR39 in a living body, a) administering GPR39 to the patient, Or b) (a) administering the GPR39-encoding DNA to the patient and expressing it, or (b) inserting the GPR39-encoding DNA into the target cell and expressing it, For example, by transplanting the compound into the patient, the amount of GPR39 in the body of the patient can be increased, and the effect of the ligand can be sufficiently exerted. That is, GPR39-encoding DNA is useful as a safe and low-toxicity agent for preventing and treating diseases associated with dysfunction of GPR39.
Specifically, GPR39 or the DNA of the present invention includes, for example, poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, Cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, menstruation Prophylactic / therapeutic agents such as hypotonia bladder based on decreased bladder perception due to irregularity or diabetes, hypotonia bladder such as hypotonia bladder due to bladder palsy after surgical operation of pelvic viscera, or cytokines (eg, IL-8) It can be used as a secretagogue.
When GPR39 is used as the above prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention is used alone or after insertion into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, and the like. It can be implemented according to the means. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
For example, a) GPR39 or b) DNA of the present invention can be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, if necessary, or water or other pharmaceutically acceptable. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with the liquid obtained, or suspensions. For example, a) GPR39 or b) the DNA of the present invention is required for the generally accepted formulation practice with known physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like. It can be manufactured by mixing in a unit dosage form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg,
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
ＧＰＲ３９の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of GPR39 varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in a cancer patient (with a body weight of 60 kg), it is generally about 0.1 per day. -100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
The dose of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in a cancer patient (with a body weight of 60 kg), about 10 The amount is 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるＧＰＲ３９またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＧＰＲ３９の発現低下または発現過剰が検出された場合は、例えば、ＧＰＲ３９の機能不全または過剰作用に関連する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患としては、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などが挙げられる。
ＧＰＲ３９の過剰作用に関連する疾患としては、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などが挙げられる。
(2) Gene Diagnostic Agent The DNA and antisense DNA of the present invention can be used as probes in humans or mammals (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.). Since abnormalities (genetical abnormalities) of DNA or mRNA encoding GPR39 or a partial peptide thereof can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, or increased or excessive expression of the DNA or mRNA It is useful as an agent for genetic diagnosis.
The above-described genetic diagnosis using the DNA or the antisense DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processing). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) be able to.
For example, when a decrease or overexpression of GPR39 is detected by Northern hybridization, for example, it is diagnosed that the disease is likely to be a disease associated with dysfunction or overactivity of GPR39 or is likely to be caused in the future. be able to.
Diseases associated with dysfunction of GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, Metal deficiency such as hypotonic bladder due to decreased bladder perception due to diabetes, hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, and the like.
Diseases associated with GPR39 overactivity include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, pollakiuria due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urolithiasis, or inflammatory diseases ( Diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, Chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).
（３）ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量を測定することによる、ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
(3) Pharmaceuticals Containing a Compound That Alters the Expression of GPR39 or a Salt Thereof The DNA of the present invention can be used for screening for a compound that alters the expression of GPR39 or a salt thereof by using it as a probe.
That is, the present invention relates to, for example, GPR39 contained in (a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of GPR39 by measuring the amount of mRNA is provided.
ＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には免疫不全モデルラット、マウス、ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ii）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
The measurement of the mRNA amount of GPR39 is specifically performed as follows.
(I) For normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, immunodeficient model rats, mice, rabbits, etc.) After applying a drug (eg, an immunomodulator) or a physical stress (eg, immersion stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), and after a certain period of time, blood or a specific organ (eg, brain, Liver, kidney, etc.), or tissues or cells isolated from an organ.
GPR39 mRNA contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a usual method and using, for example, a technique such as TaqMan PCR, and Northern blotting by a method known per se. The analysis can also be performed by performing.
(Ii) A transformant expressing GPR39 is prepared according to the above method, and the mRNA of GPR39 contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.
ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
Screening for a compound or a salt thereof that alters the expression level of GPR39 comprises:
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before or after 6 hours) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or simultaneously with the drug or physical stress. After administration, and after a lapse of a certain time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the amount of GPR39 mRNA contained in the cells is quantified and analyzed. By doing
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) ), By quantifying and analyzing the amount of GPR39 mRNA contained in the transformant.
As test compounds, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
The test compound may form a salt, and as a salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, Particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、ＧＰＲ３９の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）ＧＰＲ３９の発現量を増加させることにより、ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など、特に細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性（細胞内Ｃａ２＋遊離活性）、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用）を増強させる化合物、（ロ）ＧＰＲ３９の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
ＧＰＲ３９のリガンドは、カドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩である。
したがって、上記スクリーニング方法で得られるＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患（例、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症）または過剰作用に関連する疾患（例、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症）の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。
具体的には、ＧＰＲ３９の発現量を増加させる化合物またはその塩は、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として用いることができる。
一方、ＧＰＲ３９の発現量を減少させる化合物またはその塩は、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。
The compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an effect of changing the expression level of GPR39, and specifically, (a) increasing the expression level of GPR39 to thereby stimulate GPR39-mediated cell stimulation. Activity (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, Activities for promoting or suppressing pH reduction, cytokine secretion (eg, IL-8) secretion promoting activity, particularly intracellular Ca 2+ concentration increasing activity (intracellular Ca 2+ release activity), cytokines (eg, IL-8 A) a compound that enhances secretion promoting action), and (b) reducing the expression level of GPR39, Which is a compound that attenuates.
Compounds obtained using the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc., and these compounds may be novel compounds or known compounds. It may be.
As a salt of a compound obtained by using the screening method of the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, etc.) or a base (eg, an organic acid, etc.) is used. Are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
The ligand of GPR39 is an ionizable metal element such as cadmium, zinc, copper and nickel, or a salt thereof.
Therefore, a compound or a salt thereof that alters the expression level of GPR39 obtained by the above screening method can be used for diseases associated with GPR39 dysfunction (eg, poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, Taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart Metals such as hypotonic bladder due to reduced bladder perception due to disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc., hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of pelvic internal organs Deficiency) or disorders related to overactivity (eg, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, overactive bladder) Urinary frequency, nocturia, urinary frequency due to cystitis including interstitial cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, urinary tract stones Prophylactic / therapeutic agent for a variety of disorders such as hypermetalism occurring, a cytokine (eg, IL-8) secretion regulator, or an inflammatory disease (eg, a diabetic complication such as a neuropathy or a macrovascular disorder); Used as a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel diseases such as colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) and allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)). be able to.
Specifically, compounds or salts thereof that increase the expression level of GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, Myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, thyroid function Prophylactic / therapeutic agents such as hypotonic bladder based on decreased bladder perception due to depression, depression, irregular menstruation, diabetes, etc., metal deficiency such as hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of pelvic organs, or cytokines (eg , IL-8) secretion enhancer.
On the other hand, compounds that reduce the expression level of GPR39 or salts thereof include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, pollakiuria due to overactive bladder, nocturia, interstitial Urinary frequency due to cystitis including cystitis, pollakisuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urinary urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urinary stones, etc. Prophylactic / therapeutic agents, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitors, or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease); inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis Irritable bowel syndrome; neuralgia) and allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound or a salt thereof may be sterilized orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, coated with sugar or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions. For example, the compound or a salt thereof may be combined with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg,
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９の発現量を増加させる化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９の発現量を増加させる化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in a cancer patient (with a body weight of 60 kg), the dose is generally one day. The compound or its salt that increases the expression level of GPR39 is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg). About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of a compound or a salt thereof that increases the expression level of GPR39 per day is administered by intravenous injection. It is convenient. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
（４）本発明の抗体を用いる診断方法
本発明の抗体は、ＧＰＲ３９を特異的に認識することができるので、被検液中のＧＰＲ３９の検出や中和に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＧＰＲ３９とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＧＰＲ３９の割合を測定することを特徴とする被検液中のＧＰＲ３９の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧＰＲ３９の定量法を提供する。
(4) Diagnostic method using the antibody of the present invention Since the antibody of the present invention can specifically recognize GPR39, it can be used for detection and neutralization of GPR39 in a test solution.
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and labeled GPR39 competitively, and measuring the ratio of labeled GPR39 bound to the antibody in the test solution. And (ii) reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or successively, Provided is a method for quantifying GPR39 in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent.
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体がＧＰＲ３９のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がＧＰＲ３９のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、ＧＰＲ３９に対するモノクローナル抗体を用いてＧＰＲ３９の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＧＰＲ３９の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＧＰＲ３９量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
In the quantitative method (ii), it is preferable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of GPR39 and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of GPR39.
In addition, GPR39 can be quantified using a monoclonal antibody against GPR39, and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The method for quantifying GPR39 using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of an antigen (for example, the amount of GPR39) in a liquid to be measured is determined. Any measurement method may be used as long as it is detected by physical or physical means, and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＧＰＲ３９あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧＰＲ３９量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
For insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing GPR39 or an enzyme or the like may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of GPR39 in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. You may.
本発明のサンドイッチ法によるＧＰＲ３９の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、ＧＰＲ３９の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＧＰＲ３９のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧＰＲ３９の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、ＧＰＲ３９を感度良く定量することができる。
In the method for measuring GPR39 by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, antibodies having different GPR39 binding sites are preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of GPR39, the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal. Other than the above, for example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. The measurement system of GPR39 may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Second Edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al., Enzyme Immunoassay (Third Edition) (Medical Shoin, Showa) Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part C)) 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies). Academic Press Issue) and the like can be referred to.
As described above, GPR39 can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
さらには、本発明の抗体を用いてＧＰＲ３９の濃度を定量することによって、ＧＰＲ３９の濃度の減少が検出された場合、例えば、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＧＰＲ３９の濃度の増加が検出された場合には、例えば、ＧＰＲ３９の過剰作用に起因する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患としては、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などが挙げられる。
ＧＰＲ３９の過剰作用に関連する疾患としては、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などが挙げられる。
Furthermore, when a decrease in the concentration of GPR39 is detected by quantifying the concentration of GPR39 using the antibody of the present invention, for example, the disease may be associated with dysfunction of GPR39 or may be affected in the future. It can be diagnosed as high.
In addition, when an increase in the concentration of GPR39 is detected, for example, it can be diagnosed that the disease is caused by an excessive action of GPR39 or that the disease is likely to be caused in the future.
Diseases associated with dysfunction of GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, Metal deficiency such as hypotonic bladder due to decreased bladder perception due to diabetes, hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, and the like.
Diseases associated with GPR39 overactivity include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, pollakiuria due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urolithiasis, or inflammatory diseases ( Diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, Chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).
（５）ＧＰＲ３９に対するアゴニストのスクリーニング方法
リガンドである特定の金属元素がＧＰＲ３９に結合することによって、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇やＩＬ−８分泌促進が見られることから、ＧＰＲ３９は、この細胞内シグナルを指標としてＧＰＲ３９に対する前記の金属元素以外のアゴニスト（天然リガンド、合成リガンド、元素を含む）を探索し、または決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性またはＩＬ−８分泌促進作用を測定することを特徴とするＧＰＲ３９に対するアゴニストの決定方法を提供する。
試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、低分子合成化合物などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをＧＰＲ３９に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
該試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験元素としては、例えば、周期表に記載されている元素、好ましくは金属元素などが用いられる。
該試験元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が挙げられる。
(5) GPR39 Agonist Screening Method Binding of a specific metal element as a ligand to GPR39 results in an increase in intracellular Ca 2+ concentration and promotion of IL-8 secretion. Is useful as a reagent for searching or determining agonists (including natural ligands, synthetic ligands, and elements) other than the above-mentioned metal elements for GPR39 using as an index.
That is, the present invention is characterized in that when a test compound or an element or a salt thereof is brought into contact with a cell containing GPR39, the activity of increasing intracellular Ca 2+ concentration or the effect of promoting IL-8 secretion via GPR39 is measured. The present invention provides a method for determining an agonist for GPR39.
Test compounds include known ligands (eg, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP (eg, PACAP27, PACAP38), secretin, Glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Related Polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide) ), Leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline Chemokine superfamily (eg, CXC chemokine subfamily such as IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, GCP-2, PF4, IP-10, Mig, PBSF / SDF-1; MCAF / MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, HCC-1, MIP-3α / LARC, MIP-3β / ELC, I-309, TARC , MIPF-1, MIPF-2 / eotaxin-2, MDC, DC-CK1 / PARC, CC chemokine subfamily such as SLC; C chemokine subfamily such as lymphotoactin; CX3C chemokine subfamily such as fractionalkine, etc.), endothelin, entero Gust Histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine 1-phosphate, etc.), as well as, for example, humans or mammals (eg, mice, rats, pigs, A tissue extract of bovine, ovine, monkey, etc.), a cell culture supernatant, a low-molecular synthetic compound, and the like are used. For example, the tissue extract, cell culture supernatant and the like are added to GPR39, fractionated while measuring cell stimulating activity and the like, and finally a single ligand can be obtained.
As the salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable acid addition salt is used. preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
As the test element, for example, an element described in the periodic table, preferably a metal element is used.
Examples of the salt of the test element include salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and acetic acid.
（６）ＧＰＲ３９と金属元素との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、およびＧＰＲ３９と金属元素との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含有する医薬
ＧＰＲ３９を用いるか、または組換え型ＧＰＲ３９の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドである金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）もしくは元素またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物もしくは元素またはその塩には、（イ）ＧＰＲ３９を介して細胞刺激活性を有する化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト）、（ロ）ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性を阻害する化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアンタゴニスト）、（ハ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩、あるいは（ニ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩などが含まれる。
すなわち、本発明は、（ｉ）ＧＰＲ３９と金属元素とを接触させた場合と（ii）ＧＰＲ３９と金属元素および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、ＧＰＲ３９に対する金属元素の結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離（細胞内Ｃａ２＋濃度上昇）、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、ＧＰＲ３９発現細胞ＵＭ−ＵＣ−３などからのサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用などが挙げられるが、なかでも細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性、ＧＰＲ３９発現細胞ＵＭ−ＵＣ−３などからのサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用などが好ましい。
(6) A method for screening a compound or an element or a salt thereof (such as an agonist or an antagonist) that changes the binding property or signal transduction between GPR39 and a metal element, and a compound or a compound that changes binding property or signal transduction between GPR39 and a metal element Pharmaceuticals containing an element or a salt thereof By using GPR39 or by constructing an expression system for recombinant GPR39 and using a receptor binding assay system using the expression system, the binding between GPR39 and a metal element as a ligand can be achieved. Compounds that alter sex or signal transduction (eg, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or elements or salts thereof can be efficiently screened.
Such compounds or elements or salts thereof include (a) compounds or elements having GPR39-mediated cell stimulating activity (so-called agonists to GPR39), and (b) GPR39-mediated cell stimulating activities. Compounds or elements or salts thereof (so-called antagonists to GPR39), (c) Compounds or elements or salts thereof that enhance the binding force between metal elements and GPR39, or (d) Decreased binding forces between metal elements and GPR39 Compounds or elements or salts thereof are included.
That is, the present invention provides a comparison between (i) a case where GPR39 is brought into contact with a metal element and (ii) a case where GPR39 is brought into contact with a metal element and a test compound. To provide a method for screening a compound or element that changes binding to or signal transduction, or a salt thereof, or a salt thereof.
The screening method of the present invention is characterized in that, for example, the amount of binding of a metal element to GPR39, the cell stimulating activity, and the like in the cases (i) and (ii) are measured and compared.
Cell stimulating activity includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release (increased intracellular Ca 2+ concentration), intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular potential fluctuation The activity of promoting or suppressing protein phosphorylation, activation of c-fos, lowering of pH, etc., the activity of promoting secretion of cytokines (eg, IL-8) from GPR39-expressing cells UM-UC-3, and the like. Among them, the activity of increasing intracellular Ca 2+ concentration, the activity of promoting secretion of cytokines (eg, IL-8) from GPR39-expressing cells UM-UC-3, and the like are preferable.
より具体的には、本発明は、
ａ）金属元素の放射性同位元素を、ＧＰＲ３９に接触させた場合と、金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該ＧＰＲ３９に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）金属元素の放射性同位元素を、ＧＰＲ３９を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）金属元素の放射性同位元素を、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該ＧＰＲ３９に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、
More specifically, the present invention provides
a) The GPR39 of the metal isotope when the radioisotope of the metal element is brought into contact with GPR39, and when the radioisotope of the metal element and the test compound or the element or its salt are brought into contact with GPR39. A method for screening a compound or an element or a salt thereof, which changes the binding or signal transduction between a metal element and GPR39, which comprises measuring and comparing the amount of binding to a metal element;
b) when a radioisotope of a metal element is brought into contact with a cell containing GPR39 or a membrane fraction of the cell, a cell containing a radioisotope of the metal element and a test compound or an element or a salt thereof containing GPR39 or Measuring the amount of binding of the radioisotope of the metal element to the cell or the membrane fraction when brought into contact with the membrane fraction of the cell, and comparing the binding between the metal element and GPR39, A method for screening a compound or an element or a salt thereof that alters signal transduction,
c) When the radioisotope of the metal element is brought into contact with GPR39 expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA of the present invention, the radioisotope of the metal element and the test compound or element or When the salt is brought into contact with GPR39 expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, the amount of binding of a radioisotope of a metal element to the GPR39 is measured and compared. A method for screening a compound or an element or a salt thereof, which changes the binding property or signal transduction between a metal element and GPR39,
ｄ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物（例えば、金属元素またはその放射性同位元素など）をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物、元素またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物（例えば、金属元素またはその放射性同位元素など）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物および試験化合物もしくは元素またはその塩を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
さらに、ＧＰＲ３９に対するリガンドとして、前記の金属元素に代えて、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物、元素またはその塩（合成低分子化合物、特に合成低分子アゴニスト）を用いることもできる。この金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩は、例えば、リガンドとして金属元素を用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。以下のスクリーニング方法においては、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含めて、単にリガンドと表記する。
d) GPR39-activating compound (for example, a metal element or a radioisotope thereof) is brought into contact with a GPR39-containing cell, and GPR39-activating compound and a test compound or element or a salt thereof are treated with GPR39. Screening for compounds, elements or salts thereof that alter the binding or signal transduction between a metal element and GPR39, wherein the cell stimulating activity mediated by GPR39 is measured and compared when the cells are brought into contact with the containing cells. And e) when a compound that activates GPR39 (for example, a metal element or a radioisotope thereof) is brought into contact with GPR39 expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. And a compound that activates GPR39 and a test compound or element. Or a salt thereof is contacted with GPR39 expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, and the cell stimulating activity via the receptor is measured and compared. Provided is a method for screening a compound or an element or a salt thereof, which changes the binding property or signal transduction between a metal element and GPR39.
Further, as a ligand for GPR39, a compound, an element or a salt thereof (a synthetic low-molecular compound, particularly a synthetic low-molecular agonist) that changes the binding property between the metal element and GPR39 can be used instead of the above-mentioned metal element. The compound or element that changes the binding property between the metal element and GPR39 or a salt thereof can be obtained, for example, by using the metal element as a ligand and performing the below-described screening method of the present invention. In the following screening methods, a ligand including a compound or an element or a salt thereof that changes the binding property between a metal element and GPR39 is simply referred to as a ligand.
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＧＰＲ３９としては、上記したＧＰＲ３９を含有するものであれば何れのものであってもよいが、ＧＰＲ３９を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のＧＰＲ３９などが適している。
The specific description of the screening method of the present invention is as follows.
First, as the GPR39 used in the screening method of the present invention, any GPR39 containing the above-mentioned GPR39 may be used, but a cell membrane fraction of a mammalian organ containing GPR39 is preferable. However, since human organs are particularly difficult to obtain, GPR39 derived from human and expressed in large amounts using recombinants is suitable for screening.
ＧＰＲ３９を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ３９を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧＰＲ３９であってもよいし、該ＧＰＲ３９を含有する細胞を用いてもよく、また該ＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
The above method is used for producing GPR39, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells. A complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. In order to introduce a DNA fragment encoding GPR39 into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be prepared from a nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to baculovirus using insects as a host. It is preferable to incorporate the gene into the downstream of a polyhedrin promoter, an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a human heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SRα promoter, or the like. The quantity and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P .; Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
Therefore, in the screening method of the present invention, GPR39-containing GPR39 may be GPR39 purified according to a method known per se, or a GPR39-containing cell may be used. Alternatively, the membrane fraction of the cells to be used may be used.
本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ３９を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
ＧＰＲ３９を含有する細胞としては、該ＧＰＲ３９を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ３９と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＧＰＲ３９を含有する細胞や膜画分中のＧＰＲ３９の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
When cells containing GPR39 are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
The cell containing GPR39 refers to a host cell that has expressed the GPR39, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. Cells can be crushed by crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or squirting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed GPR39 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of GPR39 in the GPR39-containing cells or membrane fraction is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当なＧＰＲ３９画分と、標識したリガンドが必要である。
ＧＰＲ３９画分としては、天然型のＧＰＲ３９画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＧＰＲ３９画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、カドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素の放射性同位元素が用いられる。例えば、亜鉛６５（６５Ｚｎ）、ニッケル６３（６３Ｎｉ）などが用いられ、なかでもニッケル６３（６３Ｎｉ）が好ましい。
具体的には、リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニングを行なうには、まずＧＰＲ３９を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＧＰＲ３９標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとＧＰＲ３９との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
In order to carry out the above a) to c) for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property or signal transduction between a ligand and GPR39, for example, an appropriate GPR39 fraction and a labeled ligand are required. .
As the GPR39 fraction, a natural GPR39 fraction or a recombinant GPR39 fraction having an activity equivalent thereto is desirable. Here, “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
As the labeled ligand, a radioisotope of an ionizable metal element such as cadmium, zinc, copper, and nickel is used. For example, zinc 65 (65 Zn), and nickel 63 (63 Ni) is used, inter alia nickel 63 (63 Ni) is preferable.
Specifically, to screen for a compound or an element or a salt thereof that alters the binding between ligand and GPR39 or the signal transduction, first, cells containing GPR39 or a membrane fraction of the cells are buffered with a buffer suitable for screening. To prepare a GPR39 standard. The buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as a Tris-HCl buffer that does not inhibit the binding between the ligand and GPR39. For the purpose of reducing non-specific binding, a surfactant such as CHAPS, Tween-80 ™ (Kao-Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer. Furthermore, a protease inhibitor such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), pepstatin and the like can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor or ligand by the protease. To 0.01 to 10 ml of the receptor solution, a fixed amount (5000 to 500,000 cpm) of the labeled ligand is added, and 10 −4 M to 10 −10 M of the test compound is simultaneously allowed to coexist. A reaction tube containing a large excess of unlabeled ligand is also prepared to determine the amount of non-specific binding (NSB). The reaction is carried out at about 0 to 50 ° C, preferably about 4 to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. When the count (B 0 -NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B 0 ) when there is no antagonistic substance is defined as 100%, the specific binding amount (B-NSB) is, for example, , 50% or less can be selected as candidate substances having competitive inhibitory ability.
リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、ＧＰＲ３９を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰ、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧＰＲ３９を発現した細胞が必要である。ＧＰＲ３９を発現した細胞としては、天然型のＧＰＲ３９を有する細胞株、上記の組換え型ＧＰＲ３９を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験元素としては、例えば、周期表に記載されている元素が用いられ、なかでも金属元素が好ましい。
該試験元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が挙げられる。
また、試験化合物としては、ＧＰＲ３９の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＧＰＲ３９の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行なうことができる。
リガンドとＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物がアゴニストかアンタゴニストであるかは、上記したＧＰＲ３９に対するアゴニストのスクリーニング方法を用いて確認することができる。
具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記ａ）〜ｃ）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアンタゴニストである。
（ii）（ａ）試験化合物をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させ、上記した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアゴニストである。
（ｂ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物（例えば、金属元素）をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＧＰＲ３９を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアンタゴニストである。
In order to carry out the above-mentioned methods d) to e) for screening a compound or an element or a salt thereof that alters the binding between ligand and GPR39 or signal transduction, for example, a known method for GPR39-mediated cell stimulating activity is used. Alternatively, the measurement can be performed using a commercially available measurement kit.
Specifically, first, cells containing GPR39 are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, the cells were exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that was not toxic to cells, and a test compound was added and incubated for a certain period of time. The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, cAMP, arachidonic acid, etc.) as an indicator of cell stimulating activity is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. . In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring the cell stimulating activity, cells expressing appropriate GPR39 are required. As cells expressing GPR39, a cell line having natural GPR39, a cell line expressing the above-mentioned recombinant GPR39, and the like are desirable.
As test compounds, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
As the salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable acid addition salt is used. preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
As the test element, for example, an element described in the periodic table is used, and among them, a metal element is preferable.
Examples of the salt of the test element include salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and acetic acid.
As the test compound, a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of GPR39 and the position of the ligand binding pocket is preferably used. The measurement of the atomic coordinates of the active site of GPR39 and the position of the ligand binding pocket can be performed using a known method or a method analogous thereto.
Whether a compound that alters the binding property between a ligand and GPR39 is an agonist or an antagonist can be confirmed using the above-described method for screening an agonist for GPR39.
A specific evaluation method may follow (i) or (ii) below.
(I) After performing a binding assay shown by the screening methods a) to c) above to obtain a compound that changes the binding property (particularly, inhibits the binding) between the metal element and GPR39, It is determined whether or not it has the cell stimulating activity. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist for GPR39, and a compound having no such activity or a salt thereof is an antagonist for GPR39.
(Ii) (a) The test compound is brought into contact with cells containing GPR39, and the above-mentioned cell stimulating activity is measured. The compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist for GPR39.
(B) When a compound (for example, a metal element) that activates GPR39 is brought into contact with cells containing GPR39, and when a compound that activates GPR39 and a test compound are brought into contact with cells containing GPR39, The cell stimulating activity via GPR39 is measured and compared. A compound capable of decreasing the cell stimulating activity of a compound activating GPR39 or a salt thereof is an antagonist to GPR39.
リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ３９を含有する細胞、またはＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）ＧＰＲ３９標品
ＧＰＲ３９を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識リガンド
亜鉛６５（６５Ｚｎ）、ニッケル６３（６３Ｎｉ）などの放射性同位元素
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて一定のカウントになるように希釈する。
ｄ）リガンド標準液
リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
Screening kits for compounds or salts thereof that alter the binding or signal transduction between ligand and GPR39 include those containing GPR39, cells containing GPR39, or membrane fractions of cells containing GPR39.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagents a) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) supplemented with 0.05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C., or may be prepared at use.
b) GPR39 preparation CHO cells expressing GPR39 were subcultured on a 12-well plate at 5 × 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air for 2 days.
c) labeled ligand zinc 65 (65 Zn), save those in the state of the radioactive isotope solution, such as nickel 63 (63 Ni) at 4 ° C. or -20 ° C., a constant count with a buffer for the measurement Dilute to become.
d) Ligand standard solution Ligand is dissolved at 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (Sigma) and stored at -20 ° C.
２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養したＧＰＲ３９発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した放射性同位元素を０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
2. Assay method a) GPR39-expressing CHO cells cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of assay buffer, and then 490 μl of assay buffer is added to each well.
b) After adding 5 μl of a 10 −3 to 10 −10 M test compound solution, 5 μl of a labeled ligand is added, and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 5 μl of 10 −3 M ligand is added instead of the test compound.
c) Remove the reaction solution and wash three times with 1 ml of washing buffer. The radioisotope bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
d) Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B−NSB) / (B 0 −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value at the time of adding the sample NSB: Non-specific Binding (non-specific binding amount)
B 0 : maximum binding amount
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物もしくは元素またはその塩は、金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる作用を有する化合物もしくは元素またはその塩であり、具体的には、（イ）ＧＰＲ３９を介して細胞刺激活性を有する化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアンタゴニスト）、（ハ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩、または（ニ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる元素としては、例えば、周期表に記載されている元素が用いられ、なかでも金属元素が好ましい。
該元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が挙げられる。
ＧＰＲ３９に対するアゴニストは、ＧＰＲ３９に対するリガンドである金属元素が有する生理活性と同様の作用を有しているので、金属元素が有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
ＧＰＲ３９に対するアンタゴニストは、ＧＰＲ３９に対するリガンドである金属元素が有する生理活性を抑制することができるので、金属元素の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩は、金属元素が有する生理活性を増強することができるので、金属元素が有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩は、金属元素が有する生理活性を減少させることができるので、金属元素の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト、金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩は、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの疾患に対する予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
一方、ＧＰＲ３９に対するアンタゴニスト、金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩は、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの疾患に対する予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。
The compound or element or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound or an element or a salt thereof having an action of changing the binding between metal element and GPR39 or signal transduction. Include (a) a compound or element having a cell stimulating activity via GPR39 or a salt thereof (so-called agonist for GPR39), and (b) a compound or element having no cell-stimulating activity or a salt thereof (so-called GPR39). Antagonists), (c) compounds or elements or salts thereof that enhance the binding force between the metal element and GPR39, and (d) compounds or elements or salts thereof that decrease the binding force between the metal element and GPR39.
Compounds obtained using the screening method or the screening kit of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds. Or a known compound.
As the salt of the compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable acid addition salt is preferable. . Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
As an element obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention, for example, an element described in a periodic table is used, and among them, a metal element is preferable.
Examples of the salt of the element include salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and acetic acid.
Since an agonist for GPR39 has the same action as the physiological activity of a metal element which is a ligand for GPR39, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity of the metal element.
Since an antagonist to GPR39 can suppress the physiological activity of a metal element that is a ligand for GPR39, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of a metal element.
A compound or an element or a salt thereof that enhances the binding force between a metal element and GPR39 can enhance the physiological activity of the metal element, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity of the metal element. It is.
A compound or an element or a salt thereof that reduces the binding force between a metal element and GPR39 can reduce the physiological activity of the metal element, so that it is a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the metal element. Useful.
Specifically, an agonist for GPR39, a compound or an element or a salt thereof that enhances the binding force between a metal element and GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, chilling, decreased learning ability, decreased sexual function, and impaired taste. Olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, Metal deficiency such as gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, hypotonic bladder based on reduced bladder perception due to depression, irregular menstruation, diabetes, etc. Useful as a prophylactic / therapeutic agent for the above diseases or a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
On the other hand, an antagonist to GPR39, a compound or an element or a salt thereof that reduces the binding force between a metal element and GPR39 can be produced by, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, and overactive bladder. Frequent urination, nocturia, frequent cystitis, including interstitial cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, urinary tract stones Prophylactic / therapeutic agents for diseases such as hypermetallurgy such as various disorders, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitors, or inflammatory diseases (eg, neurological disorders, diabetic complications such as macrovascular disorders); ulcers Inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) Which is useful as a prophylactic or therapeutic agent.
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物もしくは元素またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
When the compound or element obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound or a salt thereof may be sterilized orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, coated with sugar or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions. For example, the compound or a salt thereof may be combined with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg,
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物もしくは元素またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９に対するアゴニストを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９に対するアゴニストを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or the element or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in a cancer patient (with a body weight of 60 kg), one dose is generally used. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of an agonist for GPR39 per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of an agonist for GPR39 per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
（７）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
ＧＰＲ３９を用いることによって、各種薬物がＧＰＲ３９を介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
（１）ＧＰＲ３９を用いることを特徴とする、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療薬がＧＰＲ３９に結合することを確認する方法、
（２）ＧＰＲ３９を用いることを特徴とする、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療薬、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進薬がＧＰＲ３９に対するアゴニストであることを確認する方法、
（３）ＧＰＲ３９を用いることを特徴とする、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療薬がＧＰＲ３９に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（４）各薬をＧＰＲ３９に接触させた場合における、各薬とＧＰＲ３９との結合量を測定することを特徴とする上記（１）〜（３）記載のスクリーニング方法を提供する。
この確認方法は、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がＧＰＲ３９を介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。
(7) Method of elucidating action mechanism of various drugs By using GPR39, it can be confirmed whether or not various drugs exert a pharmacological effect through GPR39.
That is, the present invention
(1) Use of GPR39, for example, poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis , Cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation , Hypotonic bladder based on decreased bladder perception due to diabetes, metal deficiency such as hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, pollakiuria due to overactive bladder, nocturia, pollakisuria due to cystitis including interstitial cystitis, pollakisuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, Prophylactic / therapeutic agents such as hypermetallic diseases such as bladder irritation symptoms, various disorders caused by urolithiasis, cytokine (eg, IL-8) secretion regulators, or inflammatory diseases (eg, neuropathy, macrovascular disorder, etc.) Diabetic complications; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) A method to confirm that a prophylactic / therapeutic agent such as binds to GPR39,
(2) GPR39 is used, for example, poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis , Cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation Prophylactic / therapeutic agents such as hypotonic bladder based on decreased bladder perception due to diabetes, hypotonic bladder such as hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of pelvic organs, or cytokine (eg, IL-8) secretion A method for confirming that the promoter is an agonist for GPR39,
(3) GPR39 is used, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, pollakiuria due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Prevention and treatment of urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urinary urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urinary calculi, etc. Drug, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, neuropathy, diabetic complication such as macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; irritability A method for confirming that a prophylactic / therapeutic agent such as bowel syndrome; neuralgia), an allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) is an antagonist to GPR39,
(4) The screening method according to any one of (1) to (3), wherein the amount of binding between each drug and GPR39 when each drug is brought into contact with GPR39 is measured.
This confirmation method can be performed by using the above-mentioned drug instead of a test compound in a method for screening a compound that changes the binding property between a metal element and GPR39.
The kit for a confirmation method of the present invention is a kit for screening a compound that changes the binding property between a metal element and GPR39, and contains the above-mentioned drug instead of a test compound.
As described above, by using the confirmation method of the present invention, it is possible to confirm that various drugs that are commercially available or in development are exhibiting pharmacological effects via GPR39.
（８）細胞膜におけるＧＰＲ３９またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明の抗体は、ＧＰＲ３９を特異的に認識することができるので、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９を定量することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ii）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９を定量することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（iii）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
（iv）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
(8) Pharmaceuticals Containing Compounds that Alter the Amount of GPR39 or Partial Peptide in Cell Membrane or Salts Thereof Since the antibody of the present invention can specifically recognize GPR39, a compound that alters the amount of GPR39 in the cell membrane Alternatively, it can be used for screening for salts thereof.
That is, the present invention, for example,
(I) After a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) tissue or cells isolated from an organ are destroyed, a cell membrane fraction is isolated, and GPR39 contained in the cell membrane fraction is quantified. A method for screening a compound or a salt thereof, which changes the amount of GPR39 in a cell membrane,
(Ii) Screening for a compound or a salt thereof that alters the amount of GPR39 in a cell membrane by disrupting a transformant or the like that expresses GPR39, isolating the cell membrane fraction, and quantifying GPR39 contained in the cell membrane fraction. Method,
(Iii) a non-human mammal a) blood, b) a specific organ, c) a tissue or a cell isolated from the organ, sectioned, and then the receptor on the cell surface by immunostaining. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the amount of GPR39 in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the protein.
(Iv) GPR39-expressing transformants and the like are sectioned, and the staining level of the receptor protein on the cell surface is quantified by immunostaining to confirm the protein on the cell membrane. And a method for screening a compound or a salt thereof that alters the amount of GPR39 in a cell membrane.
細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には免疫不全ラット、マウス、化ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００ＴＭ、ツイーン２０ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ３９と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ii）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９を定量することができる。
The quantification of GPR39 contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(I) For normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, immunodeficient rats, mice, rabbits, etc.) After applying a drug (for example, an immunomodulator or the like) or a physical stress (for example, immersion stress, electric shock, light and dark, low temperature, etc.), and after a certain period of time, blood or a specific organ (for example, the brain, Liver, kidney, etc.), or tissues or cells isolated from an organ. The obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hepes buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is destroyed. An activator (for example, Triton X100 ™ ,
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. Cells can be crushed by crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or squirting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed GPR39 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
GPR39 contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se.
(Ii) A transformant expressing GPR39 is prepared according to the method described above, and GPR39 contained in the cell membrane fraction can be quantified.
細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９の確認は具体的には以下のようにして行なう。
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には免疫不全モデルラット、マウス、ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を確認することができる。
（iv）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
Screening of a compound or a salt thereof that alters the amount of GPR39 in a cell membrane comprises:
(I) A predetermined time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before or after 6 hours) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or simultaneously with the drug or physical stress. After a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the amount of GPR39 in the cell membrane is determined. Can be
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) ), By quantifying the amount of GPR39 in the cell membrane.
Confirmation of GPR39 contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(Iii) For normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, immunodeficient model rats, mice, rabbits, etc.) After applying a drug (for example, an immunomodulator or the like) or a physical stress (for example, immersion stress, electric shock, light and dark, low temperature, etc.), and after a certain period of time, blood or a specific organ (for example, the brain, Liver, kidney, etc.), or tissues or cells isolated from an organ. The obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention. By quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface to confirm the protein on the cell membrane, the amount of GPR39 in the cell membrane can be quantitatively or qualitatively confirmed.
(Iv) The same can be confirmed by using a transformant expressing GPR39 or the like and performing the same procedure.
As test compounds, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
The test compound may form a salt, and as a salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, Particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させることにより、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介する細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩、（ロ）細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
具体的には、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させる化合物またはその塩は、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの疾患に対する予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
一方、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を減少させる化合物またはその塩は、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの疾患に対する予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound or a salt thereof having an action of changing the amount of GPR39 in a cell membrane, and specifically, (a) increasing the amount of GPR39 in a cell membrane A compound or a salt thereof, which enhances the cell stimulating activity via a G protein-coupled receptor, and (b) a compound or a salt thereof, which reduces the amount of GPR39 in a cell membrane to thereby reduce the cell stimulating activity.
Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
As the salt of the compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable acid addition salt is preferable. . Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A compound or a salt thereof, which enhances the cell stimulating activity by increasing the amount of GPR39 in the cell membrane, is useful as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of GPR39.
Compounds or salts thereof that reduce the cell stimulating activity by reducing the amount of GPR39 in the cell membrane are useful as safe and low-toxic preventive / therapeutic agents for diseases caused by excessive expression of GPR39.
Specifically, compounds or salts thereof that increase the amount of GPR39 in the cell membrane include, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis , Myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, thyroid Prophylactic / therapeutic agents for diseases such as hypotonic bladder based on decreased bladder perception due to functional decline, depression, irregular menstruation, diabetes, etc., hypotonic bladder etc. Useful as a cytokine (eg, IL-8) secretagogue.
On the other hand, compounds or salts thereof that reduce the amount of GPR39 in the cell membrane include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, pollakiuria due to overactive bladder, nocturia, interstitial Urinary frequency due to cystitis including cystitis, prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urinary urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation symptoms, various disorders caused by urinary stones, etc. Prophylactic / therapeutic agents for diseases, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory diseases (eg, neuropathy, diabetic complications such as macrovascular disorders); inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis Cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); and useful as a prophylactic / therapeutic agent for allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound or a salt thereof may be sterilized orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, coated with sugar or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions. For example, the compound or a salt thereof may be combined with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させる化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させる化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg,
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound or a salt thereof that increases the amount of GPR39 in the cell membrane. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of a compound or a salt thereof, which increases the amount of GPR39 in the cell membrane per day, is administered by intravenous injection. It is convenient to do so. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
（９）ＧＰＲ３９に対する抗体を含有してなる医薬
ＧＰＲ３９に対する抗体の中和活性とは、該ＧＰＲ３９の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該ＧＰＲ３９の関与するシグナル伝達、例えば、該ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など、特に細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性（細胞内Ｃａ２＋遊離活性）、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用）を不活性化することができる。
したがって、ＧＰＲ３９に対する抗体（例、中和抗体）は、ＧＰＲ３９の過剰作用や金属元素過多などに起因する疾患、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。
上記予防・治療剤は、前記したＧＰＲ３９またはＧＰＲ３９に対するアンタゴニストを含有する医薬と同様にして製造し、使用することができる。
(9) Drug Containing Antibody to GPR39 The neutralizing activity of an antibody to GPR39 means an activity of inactivating a signal transduction function involving GPR39. Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, signal transduction involving the GPR39, for example, cell stimulating activity via the GPR39 (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation) Activity for promoting or suppressing intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, lowering of pH, cytokine (eg, IL-8) It can inactivate the secretion promoting action, particularly the intracellular Ca 2+ concentration increasing activity (intracellular Ca 2+ releasing activity), and the cytokine (eg, IL-8) secretion promoting action.
Therefore, an antibody against GPR39 (eg, a neutralizing antibody) is used for diseases caused by excessive action of GPR39, excess metal elements, etc., for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, Frequent urination due to active bladder, nocturia, frequent cystitis including interstitial cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, urinary tract Prophylactic / therapeutic agents such as hypermetallic diseases such as various disorders caused by calculi, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitors, or diabetic complications such as inflammatory diseases (eg, neuropathy, macrovascular disorder); Prophylactic / therapeutic agents for inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) When It can be used Te.
The prophylactic / therapeutic agent can be produced and used in the same manner as in the aforementioned GPR39 or a drug containing an antagonist to GPR39.
（１０）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、ＧＰＲ３９の過剰作用や金属元素過多などに起因する疾患、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
(10) Pharmaceutical containing antisense DNA of the present invention The antisense DNA of the present invention is useful for diseases caused by excessive action of GPR39, excess of metal elements, etc., for example, renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis , Sensory neuropathy, Wilson's disease, pollakiuria due to overactive bladder, nocturia, pollakisuria due to cystitis including interstitial cystitis, pollakisuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, Prophylactic / therapeutic agents such as dyspareunia, bladder irritation symptoms, hypermetallic diseases such as various disorders caused by urinary calculi, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitors, or inflammatory diseases (eg, neuropathy, Diabetic complications such as vascular disorders; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease ( CO PD)) and the like.
For example, when using the antisense DNA, the antisense DNA can be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. The antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
（１１）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
(11) Preparation of the DNA-Introduced Animal of the Present Invention The present invention provides an exogenous DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as an exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (abbreviated as an exogenous mutant DNA of the present invention). A non-human mammal comprising
That is, the present invention
[1] a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
[2] the animal of [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[3] The animal according to [2], wherein the rodent is a mouse or a rat; and [4] a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. Things.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by transferring a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. In addition, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) As a system, one B6C3F system, one BDF system, one B6D2F system, a BALB / c system, an ICR system, or the like, or a rat (for example, Wistar, SD, etc.) is preferable.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なＧＰＲ３９を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＧＰＲ３９の機能を抑制するＧＰＲ３９を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
The exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA and the like are used, and also include abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses abnormal GPR39, and for example, a DNA that expresses GPR39 that suppresses the function of normal GPR39 is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is transferred, DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto is expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.
ＧＰＲ３９の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ii）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
Examples of GPR39 expression vectors include Escherichia coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, and animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. It is. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, for example, (i) a promoter of a DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); ) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Proteins, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen types I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, Lithate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine triphosphatase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA , Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α and β myosin heavy chains, myosin light chains 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α actin , Prep Enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常なＧＰＲ３９の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＧＰＲ３９の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal GPR39 translation region is derived from human, various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA, and various commercially available genomes. It can be obtained as a raw material from the DNA library as a whole or a part of genomic DNA, or a complementary DNA prepared from a liver, kidney, thyroid cell or fibroblast-derived RNA by a known method. The foreign abnormal DNA can be used to produce a translation region obtained by mutating the normal GPR39 translation region obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal by confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＧＰＲ３９の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能亢進症や、ＧＰＲ３９が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、ＧＰＲ３９の増加症状を有することから、ＧＰＲ３９に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention has high expression of the normal DNA of the present invention, and eventually develops hyperactivity of GPR39 by promoting the function of endogenous normal DNA. And can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of GPR39 and diseases associated with GPR39, and to examine methods for treating these diseases.
In addition, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of GPR39, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with GPR39.
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-described plasmid and used as a source material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all progeny have the DNA.
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＧＰＲ３９の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症における本発明の異常ＧＰＲ３９による正常ＧＰＲ３９の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、ＧＰＲ３９の増加症状を有することから、ＧＰＲ３９またはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ii）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＧＰＲ３９組織を分析することによる、ＧＰＲ３９により特異的に発現あるいは活性化するＧＰＲ３９との関連性についての解析、
（iii）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（iv）上記（iii）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異ＧＰＲ３９を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症などを含む、ＧＰＲ３９に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、ＧＰＲ３９に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、ＧＰＲ３９産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、ＧＰＲ３９およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症を含む、ＧＰＲ３９に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、ＧＰＲ３９が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, eventually inhibits the function of endogenous normal DNA, thereby causing a functionally inactive refractory to GPR39. It can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of GPR39 function-inactive refractory disease and to examine a method for treating this disease.
In addition, as a specific possibility, the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention is a model for elucidating the function inhibition (dominant negative action) of normal GPR39 by the abnormal GPR39 of the present invention in GPR39 inactive refractory disease. It becomes.
In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of GPR39, it can also be used for a therapeutic drug screening test for GPR39 or a functionally inactive refractory disease.
In addition, other possible uses of the above two kinds of DNA transgenic animals of the present invention include, for example,
(I) use as a cell source for tissue culture;
(Ii) Association with GPR39 specifically expressed or activated by GPR39 by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing GPR39 tissue expressed by DNA Analysis on gender,
(Iii) culturing cells of DNA-bearing tissue by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture;
(Iv) Screening of a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in (iii) above, and (v) isolation and purification of the mutant GPR39 of the present invention and production of an antibody thereof are conceivable.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, clinical symptoms of GPR39-related diseases, including GPR39-function-insensitive refractory disease, can be examined. A more detailed pathological finding is obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-transferred animal of the present invention, cut it into pieces, and then use a protease such as trypsin to obtain the released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to examine the specificity of GPR39-producing cells, the relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them, and to investigate their abnormalities, etc., which is an effective research material for elucidating GPR39 and its action. It becomes.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, including a GPR39-function-insensitive refractory disease, to develop a therapeutic agent for a disease associated with GPR39, using the above-described test method and quantitative method, It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease. Further, using the transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with GPR39.
（１２）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしているＧＰＲ３９の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的にＧＰＲ３９の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
(12) Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
[1] a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
[2] the embryonic stem cell according to [1], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
[3] the embryonic stem cell according to [1], which is neomycin-resistant;
[4] the embryonic stem cell according to [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[5] the embryonic stem cell of [4], wherein the rodent is a mouse;
[6] a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
[7] the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention [6]. The non-human mammal according to the item,
[8] the non-human mammal according to [6], wherein the non-human mammal is a rodent;
[9] administering a test compound to the non-human mammal according to [8], wherein the rodent is a mouse, and [10] the animal according to [7], and detecting the expression of a reporter gene; And a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA, or By substantially losing the activity of GPR39 encoded by the DNA, the non-human mammal whose DNA does not substantially have the ability to express GPR39 (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention) can be obtained. Refers to embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). Transferrase gene) or a reporter gene or the like as a representative to destroy the function of the exon, or insert a DNA sequence that terminates the transcription of the gene into an intron between the exons (eg, a polyA addition signal, etc.) By preventing the synthesis of complete messenger RNA Then, a DNA chain having a DNA sequence constructed so as to eventually disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells PCR using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe and a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as a primer And selecting the knockout ES cells of the present invention.
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129-line ES cells are generally used. for example the purpose of acquiring the obvious ES cells, the BDF 1 mice (C57BL / 6 and DBA / 2 for the egg collection number of lack of C57BL / 6 mice and C57BL / 6 were improved by crossing with DBA / 2 Those established using F 1 ) can also be used favorably. BDF 1 mice are often egg number, and, in addition to the advantage that the egg is tough, since with C57BL / 6 mice in the background, when the ES cells obtained therefrom, which were generated pathological model mice , C57BL / 6 mice can be advantageously used in that their genetic background can be replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけるＧＰＲ３９またはＧＰＲ３９の細胞生物学的検討において有用である。
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. Using this method, conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the cells are knocked out of normal cells (for example, chromosomes in mice). It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this manner usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% on a suitable feeder cell such as STO fibroblast) in the presence of LIF (1-10000 U / ml). The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are made into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985]. The DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiation are useful in in vitro GPR39 or cell biological studies of GPR39.
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＧＰＲ３９のヘテロ発現不全個体であり、ＧＰＲ３９のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＧＰＲ３９のホモ発現不全個体を得ることができる。
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. The determination can be made by analysis by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammalian cells. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or a blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual having a heterozygous expression of GPR39, which can be crossed with an individual having a heterozygous expression of GPR39, and an individual having a homozygous expression of GPR39 can be obtained from their offspring.
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＧＰＲ３９により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＧＰＲ３９の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
When an egg cell is used, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by breeding the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by GPR39, it can serve as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of GPR39. It is useful for investigating the causes of diseases and studying treatment methods.
（１２ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症）に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進薬のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物または試験元素を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験元素としては、例えば、周期表に記載されている元素が用いられ、なかでも金属元素が好ましい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物または試験元素で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物または試験元素の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物または試験元素で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物または試験元素の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物または試験元素の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
(12a) A method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic or preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the DNA of the present invention. Diseases such as poor growth, wounds, burns, chills, reduced learning ability, sexual dysfunction, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, liver cirrhosis, cholesterol accumulation, Reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, alopecia, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc. Compounds that have therapeutic and / or preventive effects on hypotonic bladder based on decreased bladder perception and metal deficiency such as hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis Or a salt thereof, or a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
That is, the present invention comprises administering a test compound or a test element to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. To provide a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect against a disease caused by the above.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
As the salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable acid addition salt is used. preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
As the test element, for example, an element described in the periodic table is used, and among them, a metal element is preferable.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound or a test element, and compared with an untreated control animal, to examine changes in organs, tissues, disease symptoms and the like of the animal. The therapeutic / preventive effect of the test compound or test element can be tested as an index.
As a method of treating a test animal with a test compound or a test element, for example, oral administration, intravenous injection or the like is used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound or the test element, and the like. The dose of the test compound or test element can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物または試験元素を投与した場合、該試験動物の上記疾患が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上治癒した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＧＰＲ３９の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症）に対する安全で低毒性な治療・予防剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＧＰＲ３９と金属元素との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物またはその塩を注射剤の形で通常、癌患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
In the screening method, when a test compound or a test element is administered to a test animal, the above-mentioned disease in the test animal is cured by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. The compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect against the above-mentioned diseases or a salt thereof.
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above-described test compounds, and is a disease caused by GPR39 deficiency or damage (eg, poor growth, wound, burn, coldness, learning ability) Hypotension, hypogonadism, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, Hypotonic bladder based on decreased bladder perception due to respiratory disorders, digestive disorders, cardiac disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc., bladder palsy after surgical operation of pelvic organs Safe and low-toxic therapeutic / prophylactic agents for metal deficiency such as hypotonic bladder caused by physicians, or physicians such as cytokines (eg, IL-8) secretagogues It can be used as. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
As a salt of a compound obtained by the screening method, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, an organic acid, etc.) or a base (eg, an alkali metal, etc.) is used. Preferred are acid addition salts that are chemically acceptable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the drug containing a compound that alters the binding between GPR39 and a metal element or signal transduction.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on a target disease, a subject to be administered, an administration route, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound or a salt thereof per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound or a salt thereof is usually administered in the form of an injection to a cancer patient (body weight). 60 mg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound or a salt thereof is administered by intravenous injection per day. It is convenient to do so. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
（１２ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＧＰＲ３９の発現する組織で、ＧＰＲ３９の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＧＰＲ３９の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＧＰＲ３９欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
(12b) Method for Screening Compound or Its Salt that Promotes or Inhibits Promoter Activity on DNA of the Present Invention The present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention to increase the expression of a reporter gene. The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which is characterized by being detected.
In the above-described screening method, the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding GPR39 is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, β-galactosidase is originally expressed instead of GPR39 in a tissue that expresses GPR39. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate of β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), GPR39 can be easily prepared. The expression state in the animal body can be observed. Specifically, a GPR39-deficient mouse or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal-containing staining solution at room temperature or at about 37 ° C. After reacting for 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue sample with a 1 mM EDTA / PBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound or a salt thereof selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
As a salt of the compound obtained by the screening method, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable salt is used. Acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の発現を促進し、ＧＰＲ３９の機能を促進することができるので、例えば、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤などの医薬として有用である。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の発現を阻害し、ＧＰＲ３９の機能を阻害することができるので、例えば、ＧＰＲ３９の機能過多に関連する疾患などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤などの医薬として有用である。
ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患としては、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などが挙げられる。
ＧＰＲ３９の機能過多に関連する疾患としては、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などが挙げられる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
Since the compound or its salt of the present invention which promotes the promoter activity for DNA can promote the expression of GPR39 and promote the function of GPR39, for example, a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of GPR39, etc. It is useful as a drug such as a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
Since the compound or its salt of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA inhibits the expression of GPR39 and can inhibit the function of GPR39, for example, a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with hyperfunction of GPR39, etc. It is useful as a drug such as a cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor.
Diseases associated with dysfunction of GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, Metal deficiency such as hypotonic bladder due to decreased bladder perception due to diabetes, hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, and the like.
Diseases associated with excessive function of GPR39 include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urolithiasis, or inflammatory diseases ( Diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis); Chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＧＰＲ３９またはその塩と金属元素との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常、癌患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、ＧＰＲ３９のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのＧＰＲ３９を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、ＧＰＲ３９そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing a compound or a salt thereof that changes the binding property between GPR39 or a salt thereof and a metal element. .
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, when a compound or a salt thereof that promotes a promoter activity for DNA of the present invention is orally administered, it is generally used. For a cancer patient (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound or a salt thereof is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA may be in the form of an injection. Usually, when administered to a cancer patient (with a body weight of 60 kg), the compound or a salt thereof is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient to administer the degree by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by the disease or to develop preventive and therapeutic drugs.
Further, using a DNA containing the promoter region of GPR39, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene-transferred animal). It is also possible to specifically synthesize the GPR39 and examine its action in a living body. Furthermore, by binding an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line in which this is expressed, a search system for a low molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of GPR39 itself in the body. Can be used as
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
＊ ：終止コドンに対応する
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Gly: glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine Ile: isoleucine Ser: serine Thr: threonine Cys: cysteine Met: methionine Glu: glutamic acid Asp: aspartic acid Lysine arginine arginine : Tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid *: corresponding to a stop codon Me: methyl group Et: ethyl group Bu: butyl group Ph: phenyl group TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記
する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃl２Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Further, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl Cl 2 Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: benzyloxymethyl Z: benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyl Oxycarbonyl Boc: t-butoxycarbonyl DNP: dinitrophenol Trt: trityl Bum: t-butoxymethyl Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBT: 3,4-dihydro-3-hydroxy -4-oxo-
1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
ヒト由来ＧＰＲ３９のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
ヒト由来ＧＰＲ３９をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
以下の実施例３におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４
以下の実施例３におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：５
以下の実施例３におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：６
マウス由来ＧＰＲ３９のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７
マウス由来ＧＰＲ３９をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：８
ラット由来ＧＰＲ３９のアミノ酸配列を示す。
配列番号：９
ラット由来ＧＰＲ３９をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１０
以下の実施例７におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１１
以下の実施例７におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１２
以下の実施例７におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：１３
以下の実施例９におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１４
以下の実施例９におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１５
以下の実施例９におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
SEQ ID NO: 1
2 shows the amino acid sequence of human-derived GPR39.
SEQ ID NO: 2
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding human-derived GPR39.
SEQ ID NO: 3
The base sequence of the primer used in the TaqMan PCR reaction in Example 3 below is shown.
SEQ ID NO: 4
The base sequence of the primer used in the TaqMan PCR reaction in Example 3 below is shown.
SEQ ID NO: 5
The base sequence of the probe used in the TaqMan PCR reaction in Example 3 below is shown.
SEQ ID NO: 6
2 shows the amino acid sequence of mouse-derived GPR39.
SEQ ID NO: 7
2 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse-derived GPR39.
SEQ ID NO: 8
2 shows the amino acid sequence of rat-derived GPR39.
SEQ ID NO: 9
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding rat-derived GPR39.
SEQ ID NO: 10
The base sequence of the primer used in the TaqMan PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 11
The base sequence of the primer used in the TaqMan PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 12
The base sequence of the probe used in the TaqMan PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 13
The base sequence of the primer used in the TaqMan PCR reaction in Example 9 below is shown.
SEQ ID NO: 14
The base sequence of the primer used in the TaqMan PCR reaction in Example 9 below is shown.
SEQ ID NO: 15
The base sequence of the probe used in the TaqMan PCR reaction in Example 9 below is shown.
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, the gene using Escherichia coli followed the method described in Molecular cloning (Molecular cloning).
〔実施例１〕ヒト型ＧＰＲ３９−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の取得
ヒト型ＧＰＲ３９のＣ末端に翻訳のフレーム合わせてオワンクラゲより単離されたＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ） ｃＤＮＡをつないだ融合蛋白を発現させるための発現プラスミドを構築した。その際ＧＦＰ ｃＤＮＡにはＧＦＰの発現ベクターｐＱＢＩ２５（宝酒造）から切り出した断片を用いた。ＧＰＲ３９はＰＣＲ法によりその終止コドンを制限酵素ＮｈｅＩの認識配列に修正し、ここにＧＦＰ断片を連結して、動物細胞での発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｈｉｎｕｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１２１９，２５１−２５９，１９９４記載のｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈと同一のプラスミドベクター）に挿入した。このベクターを用いて自体公知の方法でＧＰＲ３９−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を取得した。
[Example 1] Acquisition of CHO cells expressing human GPR39-GFP fusion protein A fusion protein in which Green Fluorescent Protein (GFP) cDNA isolated from Oan jellyfish was framed for translation at the C-terminus of human GPR39 and the translational frame. An expression plasmid for expression was constructed. At that time, a fragment cut out from the GFP expression vector pQBI25 (Takara Shuzo) was used as the GFP cDNA. GPR39 modifies its stop codon to a recognition sequence for the restriction enzyme NheI by PCR, ligates it to a GFP fragment, and expresses the vector pAKKO-111H in animal cells (Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et. al., 1219, 251-259, 1994, the same plasmid vector as pAKKO-1.11H). Using this vector, CHO cells expressing the GPR39-GFP fusion protein were obtained by a method known per se.
〔実施例２〕ＧＰＲ３９に対する金属元素のアゴニスト活性の検出
ＧＰＲ３９に対するアゴニストの探索を下記の方法で行った結果、特定の金属元素がＧＰＲ３９のアゴニストであることが判明した。
実施例１で作製したヒトＧＰＲ３９−ＧＦＰ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰ）を３ｘ１０４個／１００μｌの細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて以下の方法で測定した。Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ） ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファー［ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）を２０ｍｌ添加し、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらに上記のＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し調製する。］に加え、蛍光色素溶液を調製した。細胞プレートの培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄しＦＬＩＰＲにセットした。また細胞に添加する金属元素の化合物はアッセイバッファーを用いて各々の濃度に希釈し、リガンド用のプレートに分注しＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて金属元素添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定しアゴニスト作用の検討を行った。その結果、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）を加えたときに、ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰの細胞内カルシウム濃度が用量依存的に上昇した（図１〜図４）。受容体を発現していないＣＨＯ細胞やＧＰＲ３９以外のＧＰＣＲを発現しているＣＨＯ細胞では、このような応答は見られなかった。従って、これらの金属塩（金属イオン）がＧＰＲ３９に対する特異的なアゴニストであることが判明した。
Example 2 Detection of Agonist Activity of Metal Element for GPR39 As a result of searching for an agonist for GPR39 by the following method, it was found that a specific metal element was an agonist of GPR39.
The CHO cell line (CHO / hGPR39-GFP) into which the human GPR39-GFP expression vector prepared in Example 1 was introduced was diluted so as to contain 3 × 10 4 cells / 100 μl of cells, and Black walled 96-well plate (Costar) was used. After dispensing 100 μl per well, the mixture was cultured overnight in a CO 2 incubator. The fluctuation of the intracellular calcium concentration was measured by the following method using FLIPR (Molecular Device). 50 μg of Fluo-3AM (DOJIN) was dissolved in 21 μl of DMSO (DOJIN), and an equal amount of 20% pluronic acid (Molecular Probes) was added and mixed. 20 ml of 1M HEPES (pH 7.4) (DOJIN) was added to (Invitrogen), 710 mg of probenecid (Sigma) was dissolved in 5 ml of 1N NaOH, and then 5 ml of the above HBSS / HEPES solution was added. Prepare. ] To prepare a fluorescent dye solution. Immediately after removing the medium from the cell plate, the fluorescent dye solution was dispensed at 100 μl per well, and cultured in a CO 2 incubator for 1 hour to incorporate the fluorescent dye into the cells. The cells after the culturing were washed with the above-mentioned assay buffer and set on the FLIPR. The metal element compound to be added to the cells was diluted to each concentration using an assay buffer, dispensed into a ligand plate, and set on the FLIPR. After performing the above pretreatment, the fluctuation of intracellular calcium concentration after addition of a metal element was measured by FLIPR, and the agonist action was examined. As a result, when cadmium chloride (CdCl 2 ), zinc chloride (ZnCl 2 ), copper chloride (CuCl 2 ), and nickel chloride (NiCl 2 ) were added, the intracellular calcium concentration of CHO / hGPR39-GFP was dose-dependent. (FIGS. 1 to 4). No such response was observed in CHO cells not expressing the receptor or CHO cells expressing a GPCR other than GPR39. Therefore, it was found that these metal salts (metal ions) are specific agonists for GPR39.
〔実施例３〕ヒト型ＧＰＲ３９ｍＲＮＡ発現
ｍＲＮＡの発現量の定量にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。発現量の定量に用いるプライマー［５’−ＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＧＣＴ−３’（配列番号：３）、５’−ＣＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：４）］とプローブ［５’−ＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＴＣＡ−３’（配列番号：５）］は、ヒト型ＧＰＲ３９の塩基配列（配列番号：２）をもとにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ専用のソフトウエアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社）を利用してデザインした。鋳型となるｃＤＮＡは、ヒト各種組織、細胞由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇからランダムプライマーを用いて逆転写反応して合成したものを使用した。逆転写反応は逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を使用し、添付のプロトコールにしたがって行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒの反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を７．５μｌ、各プライマーを０．９μＭ、プローブを０．２５μＭ、ｃＤＮＡ溶液を混ぜ合わせ、蒸留水で１５μｌとして調製した。反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返して行った。
ヒト各種組織や細胞でのｍＲＮＡの発現を図５〜図７に示す。中枢神経組織、下垂体、腎臓、胃・腸管組織、胎児脳、血管系初代培養細胞、腎臓系初代培養細胞、あるいは大腸がん細胞株に高発現していた。
[Example 3] Human GPR39 mRNA expression ABI PRISM 7900HT Sequence Detector (Applied Biosystems) was used for quantification of mRNA expression level. Primers [5′-TGTGGACATTGGCCGTATGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 3), 5′-CAGTCGTGCTTGGGTTTTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4)] and probe [5′-TGCCCAACCAGATTCGGAGGATCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5)] was designed based on the nucleotide sequence of human GPR39 (SEQ ID NO: 2) using PrimerExpress (Applied Biosystems), a software dedicated to ABI PRISM Sequence Detector. The cDNA used as the template was synthesized by reverse transcription using 1 μg of total RNA derived from various human tissues and cells using a random primer. The reverse transcription reaction was performed using SuperScriptII (GIBCO BRL) as a reverse transcriptase according to the attached protocol. The reaction solution of ABI PRISM 7900HT Sequence Detector was prepared by mixing 7.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0.9 μM of each primer, 0.25 μM of the probe, and 15 μl of distilled water with a cDNA solution. . The reaction was carried out by repeating a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1
The expression of mRNA in various human tissues and cells is shown in FIGS. Highly expressed in central nervous tissue, pituitary gland, kidney, stomach / intestinal tract tissue, fetal brain, vascular primary cultured cells, renal primary cultured cells, or colon cancer cell lines.
〔参考例１〕ヒトＧＰＲ３９、ラットＧＰＲ３９、およびマウスＧＰＲ３９発現細胞の取得
ヒトＧＰＲ３９、ラットＧＰＲ３９、およびマウスＧＰＲ３９のｃＤＮＡは、それぞれ、ＡＦ０３４６３３．１（ヒト）、ＸＭ＿２２２５７８（ラット）、ＡＫ０１６８１７とＡＫ０８２９４１．１（マウス）の公知の配列を基にして、腸管を含むｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲで取得した。得られたＤＮＡ断片を動物細胞での発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｈｉｎｕｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１２１９，２５１−２５９，１９９４記載のｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈと同一のプラスミドベクター）に挿入した。このベクターを用いて自体公知の方法でＧＰＲ３９を発現するＣＨＯ細胞を取得した。
[Reference Example 1] Acquisition of cells expressing human GPR39, rat GPR39, and mouse GPR39 cDNAs of human GPR39, rat GPR39, and mouse GPR39 were AF034633.1 (human), XM_222578 (rat), AK016817, and AK082941.1, respectively. Based on the known sequence of (mouse), it was obtained by RT-PCR from cDNA containing the intestinal tract. The obtained DNA fragment is used as an expression vector pAKKO-111H in animal cells (the same plasmid vector as pAKKO-1.11H described in Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251-259, 1994). ). Using this vector, CHO cells expressing GPR39 were obtained by a method known per se.
〔実施例４〕サイトセンサーを用いたシグナルの検出
サイトセンサーを用いてリガンドによる細胞内シグナル伝達系の活性化を、細胞の物質代謝によるｐＨの変化を指標に測定した。
方法は、前日にヒトＧＰＲ３９発現ＣＨＯ細胞株を培養用フラスコにコンフルエントまで培養した後、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した後、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてはがし、遠心して回収した後、培地に懸濁し、３ｘ１０５細胞／ｍｌに調整した。そして、サイトセンサーカプセルキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）のカプセルを１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）にセットし、その中に細胞懸濁液を１ｍｌ入れ、蓋をして３７℃インキュベーター内で翌日まで培養した。測定当日サイトセンサーを説明書通りに起動した後、サイトセンサーＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を調製し平衡化した後、前日に調製した細胞をまいたカプセル内にスペーサーを入れ、サイトセンサーにセットした。培地で平衡化した後、流露の切り替えによりサンプルを細胞に投与し、ｐＨの変化を測定した。
その結果、塩化ニッケルを添加したとき、ＧＰＲ３９を発現していないｍｏｃｋ細胞、および他の受容体であるＴＧＲ７では反応か検出されないのに対し、ＧＰＲ３９発現細胞ではニッケルに対する特異的な細胞応答が検出された（図８）。
[Example 4] Detection of signal using a site sensor Activation of an intracellular signal transduction system by a ligand was measured using a site sensor using a change in pH caused by metabolism of cells as an index.
The method is as follows: a human GPR39-expressing CHO cell line is cultured in a culture flask to confluence the day before, washed with PBS (Invitrogen), peeled off using trypsin (Invitrogen), collected by centrifugation, and suspended in a medium. Adjusted to 3 × 10 5 cells / ml. Then, the capsules of the cytosensor capsule kit (Molecular Device) were set in a 12-well plate (Coster), 1 ml of the cell suspension was placed therein, the lid was closed, and the cells were cultured in a 37 ° C incubator until the next day. On the day of the measurement, after starting the site sensor according to the instructions, a site sensor RPMI1640 medium (pH 7.4) (Invitrogen) was prepared and equilibrated, and a spacer was placed in a capsule in which the cells prepared the day before were seeded. I set it on the sensor. After equilibration with the medium, the sample was administered to the cells by switching the flow and the change in pH was measured.
As a result, when nickel chloride was added, no reaction was detected in mock cells not expressing GPR39 and TGR7, which is another receptor, whereas a specific cell response to nickel was detected in GPR39-expressing cells. (FIG. 8).
〔実施例５〕ラット型ＧＰＲ３９に対する金属元素のアゴニスト活性の検出
ラット型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞株を用いてＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウムの上昇反応を指標に金属イオンのアゴニスト活性の検出を行った。用いたラット型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞株は１０％ 牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むハムαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。アッセイを行う前日にヒトＧＰＲ３９発現ＣＨＯ細胞株を培養用フラスコにコンフルエントまで培養した後、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを用いてはがし、遠心して回収した後、培地に懸濁し、３ｘ１０５細胞／ｍｌに調整する。そして、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。
アッセイ当日は前日に調製した、細胞に対し各種試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施した。まず、細胞に蛍光色素Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）を添加するため、あるいはＦＬＩＰＲアッセイを行う直前に細胞を洗浄するためのアッセイバッファーを作成した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０００ｍｌに１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）２０ｍｌを加えた溶液（以下、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液）に、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらにＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し、この溶液をアッセイバッファーとした。次にＦｌｕｏ−３ＡＭ ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファーに加え、蛍光色素溶液を調製した。ヒト型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞の培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した後、ＦＬＩＰＲにセットした。また、ラット型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞に添加する試験サンプルはアッセイバッファーを用いて調製し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定した。その結果、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）を加えたときに、ＣＨＯ／ｒＧＰＲ３９の細胞内カルシウム濃度が用量依存的に上昇し、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト活性が検出された（図９〜図１３）。
[Example 5] Detection of agonistic activity of metal element on rat GPR39 Using a CHO cell line stably expressing rat GPR39, detection of the agonist activity of metal ions using FLIPR as an index of an increase in intracellular calcium was used as an indicator. went. The used CHO cell line stably expressing rat-type GPR39 was cultured using a ham αMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (Invitrogen). The day before the assay, the human GPR39-expressing CHO cell line was cultured to confluence in a culture flask, washed with PBS, peeled off using trypsin, collected by centrifugation, suspended in a medium, and suspended at 3 × 10 5 cells / ml. Adjust to Then, after dispensing 100 μl per well into a Black walled 96-well plate (Costar), the cells were cultured overnight in a CO 2 incubator.
On the day of the assay, various test samples were added to the cells prepared the day before, and the change in intracellular calcium concentration at this time was measured using FLIPR (Molecular Device). In order to measure the fluctuation of intracellular calcium concentration by FLIPR, the following pretreatment was performed. First, an assay buffer was prepared for adding the fluorescent dye Fluo-3AM (DOJIN) to the cells or washing the cells immediately before performing the FLIPR assay. To a solution (hereinafter, HBSS / HEPES solution) obtained by adding 20 ml of 1 M HEPES (pH 7.4) (DOJIN) to 1000 ml of HBSS (Invitrogen), 710 mg of probenecid (Sigma) is dissolved in 5 ml of 1N NaOH, and then the HBSS / HEPES solution is further dissolved. 10 ml of a solution obtained by adding and mixing 5 ml was added, and this solution was used as an assay buffer. Next, 50 μg of Fluo-3AM was dissolved in 21 μl of DMSO (DOJIN), an equal amount of 20% pluronic acid (Molecular Probes) was added and mixed, and then added to 10.6 ml of assay buffer containing 105 μl of fetal calf serum. A fluorescent dye solution was prepared. The medium of the CHO cells that stably expressed human GPR39 was removed, and immediately after dispensing 100 μl of a fluorescent dye solution per well, the cells were cultured in a CO 2 incubator for 1 hour to incorporate the fluorescent dye into the cells. The cells after the culture were washed with the above-mentioned assay buffer, and then set on the FLIPR. In addition, a test sample to be added to CHO cells stably expressing rat GPR39 was prepared using an assay buffer, and simultaneously set in the FLIPR. After the above pretreatment, the fluctuation of intracellular calcium concentration after addition of various test samples was measured by FLIPR. As a result, when cobalt chloride (CoCl 2 ), nickel chloride (NiCl 2 ), copper chloride (CuCl 2 ), zinc chloride (ZnCl 2 ), and cadmium chloride (CdCl 2 ) were added, the intracellular calcium of CHO / rGPR39 was increased. The concentration increased in a dose-dependent manner, and agonist activity for GPR39 was detected (FIGS. 9 to 13).
〔実施例６〕マウス型ＧＰＲ３９に対する金属元素のアゴニスト活性の検出
マウス型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞株を用いてＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウムの上昇反応を指標に金属イオンのアゴニスト活性の検出を実施例５に記載の方法に従って行った。その結果、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）を加えたときに、ＣＨＯ／ｍＧＰＲ３９の細胞内カルシウム濃度が用量依存的に上昇し、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト活性が検出された（図１４〜図１８）。
Example 6 Detection of Agonist Activity of Metal Element on Mouse GPR39 Using a CHO cell line stably expressing mouse GPR39, detection of an agonist activity of a metal ion using FLIPR as an index for an increase in intracellular calcium was used as an indicator. Performed according to the method described in Example 5. As a result, when cobalt chloride (CoCl 2 ), nickel chloride (NiCl 2 ), copper chloride (CuCl 2 ), zinc chloride (ZnCl 2 ), and cadmium chloride (CdCl 2 ) were added, the intracellular calcium of CHO / mGPR39 was increased. The concentration increased in a dose-dependent manner, and agonist activity on GPR39 was detected (FIGS. 14 to 18).
〔実施例７〕ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ３９ｍＲＮＡのラットにおける組織分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットより各種臓器を摘出し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）により、マニュアルにしたがって調製した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて、マニュアルに従いｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ換算で２５ｎｇ／μｌの溶液とし、以後のＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いた。 ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７９００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴ−３’（配列番号：１０），５’−ＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＡ−３’（配列番号：１１）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−ＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：１２）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．１３５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを０．７５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を１μｌ加え、蒸留水で総反応液量を１５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたラット各種組織におけるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ発現量はｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりのコピー数として算出した（図１９）。
[Example 7] Examination of tissue distribution of GPR39 mRNA in rats by RT-PCR Various organs were excised from Wistar rats, and total RNA was prepared using Isogen (Nippon Gene) according to the manual. Using 1 μm of the obtained total RNA, cDNA was synthesized according to the manual using a random primer and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) as a reverse transcriptase. The synthesized cDNA was used as a solution of 25 ng / μl in terms of total RNA and used as a template for subsequent RT-PCR. RT-PCR was performed using Sequence Detection System Prism 7900 (PE Biosystems), and 5′-CCCATGGAGGTTCTACAGCATCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 10), 5′-TGTGGGAGCTGAGAGA as a primer for amplification and detection was used. 11) and 5 '-(Fam) -TGGAACCCCCTGAACCACACCCA- (Tamra) -3' (SEQ ID NO: 12) was used as TaqMan probe. The RT-PCR reaction solution was added to 7.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.135 μl of the 100 μM primer solution, 0.75 μl of the 5 μM TaqMan probe, and 1 μl of the cDNA solution prepared above. The total reaction volume was adjusted to 15 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute were repeated 40 times. GPR39 mRNA expression levels in the obtained rat tissues were calculated as the number of copies per 25 ng of total RNA (FIG. 19).
〔実施例８〕Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いた膀胱におけるＧＰＲ３９ｍＲＮＡの発現分布の検討
雄性Ｗｉｓｔａｒラットを屠殺し、膀胱を取り出しＰＢＳで洗浄した後、ＯＣＴコンパウンド中で液体窒素により凍結し、−８０℃で保存した。
ＧＰＲ３９アンチセンス、センスプローブは以下の方法で調製した。まず、プラスミドベクターｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）に自体公知の方法でラット型ＧＰＲ３９ｃＤＮＡを挿入した。このｃＤＮＡを、Ｍ１３プライマー（インビトロジェン社）・Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ ｋｉｔ（クロンテック社）を用いたＰＣＲにて増幅・直鎖化し、エタノール沈殿法により精製した。このｃＤＮＡから、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ＫＩＴ（ＳＰ６／Ｔ７）（ロッシュ社）にてＳＰ６もしくはＴ７によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い（４０μｌスケール）、エタノール沈殿により精製した後、蒸留水にて１００μｌに溶解した。ｃＤＮＡの挿入方向から、ＳＰ６により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがアンチセンスプローブ、Ｔ７により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがセンスプローブであった。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには新鮮凍結切片を使用した。まず前述した膀胱凍結組織をクライオスタットＣＭ３０５０（ライカ社）を用いてシランコートスライド上に８μｍの厚さで薄切した。切片を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにて１０分間固定した後、ＰＢＳにてよく洗い、０．２５％無水酢酸を含む０．１Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）による処理（室温・１０分）にてアセチル化を行った。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応には、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０％ホルムアミド，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ，１０％デキストラン硫酸，６００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２５％ ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）でアンチセンスプローブもしくはセンスプローブを２００倍に希釈し、８５℃で１０分変性した後、切片に加え５０℃で１２時間以上反応させた。引き続き、非特異的にｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎしたプローブを洗浄するため以下の操作を行った。１）２×ＳＳＣ（ＳＳＣ；１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）／５０％ホルムアミド処理（６０℃・３０分・１回）、２）２×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・１回）、３）０．１×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・２回）。以上の操作を行った後、ＤＩＧラベルプローブを検出するための免疫組織化学を行った。まず、ＤＩＧ−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、１．５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１による処理（３７℃・１時間）にて非特異反応のブロッキングを行い、ａｎｔｉ−ＤＩＧ ｆａｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１（１：１０００）を室温で１時間反応させた。ＤＩＧ−１で十分洗浄した後、ＤＩＧ−３（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）でリンスし、０．１８ｍｇ／ｍｌ ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＢＣＩＰ）を含むジメチルホルムアミド、および０．３４ｍｇ／ｍｌ ４−ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）を含む７０％ジメチルホルムアミド、およびｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｈｏｌを、ＤＩＧ−３ １０ｍｌにつきそれぞれ０．３５ｍｌ、０．４５ｍｌ、３％加えた溶液によって、室温にて発色反応を行った。適時に発色を流水洗浄により止めた後、９０％グリセロールを含むＰＢＳで封入し、光学顕微鏡で観察した。その結果、ＧＰＲ３９アンチセンスプローブにより、膀胱において移行上皮に陽性シグナルが観察された。これに対し、センスプローブによるシグナルはどの部位においても検出されなかった。粘膜固有層・筋層・血管内皮細胞にはアンチセンスプローブによるシグナルは検出されなかった。以上の結果から、膀胱においてＧＰＲ３９ｍＲＮＡは移行上皮に特異的に発現していることが判明した。
Example 8 Investigation of GPR39 mRNA Expression Distribution in Bladder Using In Situ Hybridization Method Male Wistar rats were sacrificed, the bladder was removed, washed with PBS, frozen in liquid OCT compound with liquid nitrogen, and then −80 ° C. Saved with.
GPR39 antisense and sense probes were prepared by the following method. First, rat GPR39 cDNA was inserted into a plasmid vector pCRII TOPO (Invitrogen) by a method known per se. This cDNA was amplified and linearized by PCR using M13 primer (Invitrogen) and Advantage2 PCR kit (Clontech), and purified by ethanol precipitation. The cDNA was subjected to in vitro transcription with SP6 or T7 (40 μl scale) using a DIG RNA Labeling KIT (SP6 / T7) (Roche), purified by ethanol precipitation, and dissolved in 100 μl with distilled water. From the cDNA insertion direction, the DIG-labeled riboprobe generated by SP6 was an antisense probe, and the DIG-labeled riboprobe generated by T7 was a sense probe.
Fresh frozen sections were used for in situ hybridization. First, the above-mentioned frozen bladder tissue was sliced to a thickness of 8 μm on a silane-coated slide using a cryostat CM3050 (Leica). The sections were fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde for 10 minutes, washed well with PBS, and treated with 0.1 M triethanolamine (pH 8.0) containing 0.25% acetic anhydride (room temperature, 10 minutes). Was acetylated. The hybridization reaction was carried out in a hybridization buffer (50% formamide, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 × Denhardt's solution, 200 μg / ml tRNA, 10% dextran sulfate, 600 mM NaCl, 0.25% SDS, 1 mM EDTA). The antisense probe or the sense probe was diluted 200-fold, denatured at 85 ° C. for 10 minutes, added to a section, and reacted at 50 ° C. for 12 hours or more. Subsequently, the following operation was performed to wash the non-specifically hybridized probe. 1) 2 × SSC (SSC; 1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) / 50% formamide treatment (60 ° C., 30 minutes, once), 2) 2 × SSC treatment (60 ° C., 60 ° C.) 3) 0.1 × SSC treatment (60 ° C., 15 minutes × 2 times). After performing the above operations, immunohistochemistry for detecting the DIG label probe was performed. First, after washing with DIG-1 (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20), treatment with DIG-1 containing 1.5% Blocking reagent (Roche) (37 ° C./1) ), Non-specific reaction was blocked, and DIG-1 (1: 1000) containing anti-DIG fab-fragment antibody conjugated with alkaline phosphatase (Roche) was reacted at room temperature for 1 hour. After sufficiently washing with DIG-1, rinsing with DIG-3 (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2 ) and 0.18 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- Dimethylformamide containing phosphate (BCIP), and 70% dimethylformamide containing 0.34 mg / ml 4-nitroblue tetrazolium (NBT), and polyvinylalchol are added in 0.35 ml, 0.45 ml, and 3%, respectively, for 10 ml of DIG-3. A coloring reaction was carried out at room temperature with the resulting solution. After the color development was appropriately stopped by washing with running water, the cells were sealed with PBS containing 90% glycerol and observed with an optical microscope. As a result, with the GPR39 antisense probe, a positive signal was observed in the transitional epithelium in the bladder. In contrast, no signal from the sense probe was detected at any site. No signal from the antisense probe was detected in the lamina propria / muscle layer / vascular endothelial cells. From the above results, it was revealed that GPR39 mRNA was specifically expressed in the transitional epithelium in the bladder.
〔実施例９〕ＧＰＲ３９発現細胞株の選択
用いた細胞株は大日本製薬より購入し、培養方法は添付資料に従った。５６３７（ヒト由来）は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＨＴ−１１９７（ヒト由来）およびＨＴ−１３７６（ヒト由来）は１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＵＭ−ＵＣ−３（ヒト由来）およびＮＢＴ−ＩＩ（ラット由来）は１０％ＦＣＳ、１％ＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ、１ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｂａｔｅを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。Ｔ２４（ヒト由来）およびＭＢＴ−２（マウス由来）は１０％ＦＣＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。培養した細胞はＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ／ＥＤＴＡではがし、遠心して回収した後、−８０℃で保存した。ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成はＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ）のマニュアルに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製した。抽出したＲＮＡ １μｇはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマニュアルに従ってランダムを用いてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成後エタノール沈殿してＴＥ １０μｌに溶解した。ＴａｑＭａｎ を用いた定量は細胞株由来ｃＤＮＡ（２５ ｎｇ ＲＮＡ相当）に対し、増幅反応試薬ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）、ＧＰＲ３９検出用ＴａｑＭａｎ（商標）プライマー−プローブセットを用いて行った。ヒト由来のサンプルは実施例３に記載のプライマー−プローブセットを用いた。ラット由来のサンプルは実施例７に記載のプライマー−プローブセットを用いた。また、マウス由来のサンプルについては、プライマーとして５’−ＧＴＡＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣ−３’（配列番号：１３），５’−ＴＡＴＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＴＣＧＴ−３’（配列番号：１４）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−ＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：１５）を使用した。反応は１５μｌの合計反応液量で行った。各プライマー、プローブの最終濃度はマニュアルに従った。
ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期はＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）のマニュアルに従った。
増幅生成物の定量的ＴａｑＭａｎ解析は、７９００ＨＴ ＳＤＳソフトウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いて行った。コピー数の算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のｃＤＮＡ 断片（ＧＰＲ３９）またはＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ（ＧＰＲ３９）を用いた１０７コピー／ｗｅｌｌから１０２コピー／ｗｅｌｌまでの対数６点におけるＣＴ値から作成した。
その結果、５６３７、ＨＴ−１１９７、ＨＴ−１３７６、ＵＭ−ＵＣ−３、ＮＢＴ−ＩＩ、Ｔ２４およびＭＢＴ−２のすべての細胞株においてのＧＰＲ３９の発現が認められた（図２０）。
[Example 9] Selection of GPR39-expressing cell line The cell line used was purchased from Dainippon Pharmaceutical, and the culture method was in accordance with the attached document. 5637 (derived from human) was cultured in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% FCS until it became pre-confluent. HT-1197 (human origin) and HT-1376 (human origin) become pre-confluent in MINIMUM ESENTIAL MEDIUM with 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS (culture up to WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE). did. UM-UC-3 (human origin) and NBT-II (rat origin) were MINIMESSENTIAL MEDIUM containing 10% FCS, 1% MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS, 1 mM Sodium pyriumate (WITH EARLE'S IT SALLS, (GLUTAMINE) until the cells became pre-confluent. T24 (derived from human) and MBT-2 (derived from mouse) were cultured in MINIMUM ESENTIAL MEDIUM containing 10% FCS (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) until they became pre-confluent. The cultured cells were washed with PBS, detached with PBS / EDTA, collected by centrifugation, and stored at -80 ° C. For RNA extraction and cDNA synthesis, total RNA was extracted and purified according to the manual of ISOGEN (Nippon gene). 1 μg of the extracted RNA was randomly synthesized according to the manual of SuperScript II (Invitrogen) to synthesize first strand cDNA, ethanol precipitated, and dissolved in 10 μl of TE. For quantification using TaqMan, amplification reaction reagent TaqMan (trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan, Inc.), TaqMan (trademark) primer-probe set for GPR39 detection were used for cell line-derived cDNA (equivalent to 25 ng RNA). This was performed using The human-derived sample used the primer-probe set described in Example 3. For the rat-derived sample, the primer-probe set described in Example 7 was used. For the sample derived from the mouse, 5'-GTACCCACTCACAAGGGACTCAAC-3 '(SEQ ID NO: 13), 5'-TATTGGAGTTTCCCAGGTCATCATGT-3' (SEQ ID NO: 14) and 5 '-(Fam) -CAACCTCTCTCCCCCCC as TaqMan probe were used. -(Tamra) -3 '(SEQ ID NO: 15) was used. The reaction was performed with a total reaction volume of 15 μl. The final concentration of each primer and probe was in accordance with the manual.
TaqMan ™ PCR was performed on an ABI PRISM ™ 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems Japan, Inc.) and the temperature cycle used was TaqMan ™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan, Inc.) manual. Followed.
Quantitative TaqMan analysis of the amplification products was performed using 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan). Calibration curve used for calculating the copy number in the logarithmic 6 points from 10 7 copies / well using a known concentration of the cDNA fragment containing the amplified region full length (GPR39) or Plasmid DNA (GPR39) up to 10 2 copies / well Created from CT values.
As a result, expression of GPR39 was observed in all cell lines of 5637, HT-1197, HT-1376, UM-UC-3, NBT-II, T24 and MBT-2 (FIG. 20).
〔実施例１０〕ヒト膀胱癌細胞株での金属イオンに対する反応性の確認
用いた細胞株は大日本製薬より購入し、培養方法は添付資料に従った。５６３７は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＨＴ−１１９７およびＨＴ−１３７６は１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＵＭ−ＵＣ−３およびＮＢＴ−ＩＩは１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。Ｔ２４およびＭＢＴ−２は１０％ＦＣＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＦＬＩＰＲを用いた細胞内カルシウム濃度の変動の測定は実施例５に記載の方法に従って行った。その結果、ＵＭ−ＵＣ−３およびＨＴ−１１９７においてニッケルによる反応が検出された。
[Example 10] Confirmation of reactivity to metal ions in human bladder cancer cell line The cell line used was purchased from Dainippon Pharmaceutical, and the culture method was in accordance with the attached material. 5637 was cultured in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% FCS until it became pre-confluent. HT-1197 and HT-1376 were cultured in MINIMUM ESENTIAL MEDIUM containing 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) until they became pre-confluent. UM-UC-3 and NBT-II were cultured in MINIMUM ESENTIAL MEDIUM containing 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) until they became pre-confluent. T24 and MBT-2 were cultured in MINIMUM ESENTIAL MEDIUM containing 10% FCS (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) until they became pre-confluent. The measurement of the change in intracellular calcium concentration using FLIPR was performed according to the method described in Example 5. As a result, a reaction with nickel was detected in UM-UC-3 and HT-1197.
〔実施例１１〕金属イオンによるＧＰＲ３９発現細胞ＵＭ−ＵＣ−３からのＩＬ−８の分泌促進
ＧＰＲ３９の発現細胞株であるＵＭ−ＵＣ−３を用いて、ＧＰＲ３９アゴニストである金属イオンの添加効果を検討した。
アッセイ前日にＵＭ−ＵＣ−３を１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した後、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンを用いてはがし、遠心して回収した後、培地に懸濁し、１．５ｘ１０５細胞／ｍｌに調整した。その後、６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ）に１穴あたり５ｍｌずつ分注し、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。
アッセイ当日は前日に調製した細胞の培地を除いた後、ＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）で洗浄、さらに５ｍｌずつ各ウェルに添加し、１時間ＣＯ２培養器にて３７℃で培養した。その後、各種試験サンプルを添加したＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）を５ｍｌずつ各ウェルに添加し、１２時間ＣＯ２培養器にて３７℃で培養した。培養上清を回収した後、ＥＩＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、サンプル中に含まれるＩＬ−８を定量した結果、塩化銅１ｍＭ存在下では非存在下に対し、約２倍の蓄積量であることが確認され、ＧＰＲ３９の機能の一つとして、ＩＬ−８などのサイトカインの分泌を促進することが明らかになった。
[Example 11] Promotion of secretion of IL-8 from GPR39-expressing cells UM-UC-3 by metal ions Using UM-UC-3 which is a GPR39-expressing cell line, the effect of adding metal ions that are GPR39 agonists was evaluated. investigated.
On the day before the assay, UM-UC-3 was cultured in MINIMUM ESENTIAL MEDIUM containing 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE), and then cultured in PBS. Then, the cells were peeled off using trypsin, collected by centrifugation, suspended in a medium, and adjusted to 1.5 × 10 5 cells / ml. Thereafter, 5 ml was dispensed per well into a 6-well plate (Falcon) and cultured overnight in a CO 2 incubator.
On the day of the assay, after removing the medium of the cells prepared on the previous day, the cells were washed with MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM containing MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE), and further added to each well by 5 ml. The cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour in a CO 2 incubator. Thereafter, 5 ml of MINIMUM ESENTIAL MEDIUM containing MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS containing various test samples (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) was added to each well, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 12 hours in a CO 2 incubator. And cultured. After collecting the culture supernatant, the amount of IL-8 contained in the sample was quantified by EIA (Amersham). As a result, it was confirmed that the accumulated amount was about twice that in the presence of 1 mM copper chloride as compared to the absence thereof. As a result, it has been revealed that as one of the functions of GPR39, secretion of cytokines such as IL-8 is promoted.
〔実施例１２〕覚醒ラットに対するＧＰＲ３９アゴニストの影響
９から１０週齡の雌性ＳＤラットにケタミン（５０ｍｇ／ｍＬ）とキシラジン（２０ｍｇ／ｍＬ）を５：１で混合した溶液を０．１ｍＬ／１００ｇで筋注することによって麻酔した。正中切開により膀胱を露出させ２０Ｇの注射針で穴を開けてポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０）を挿入し、木綿糸で膀胱に縫いつけた。膀胱に装着したポリエチレンチューブを１ｃｍほどの長さで切り、シリコンチューブ（Ｎｏ．００）に繋いで、皮下を通して背中に出した。動物は個別ケージで実験に供するまで飼育した。
手術１日後、動物をハロタン麻酔し、ボールマンケージに入れて動物を拘束した。膀胱に繋がったチューブに三方活栓を繋ぎ、生理食塩水注入用のチューブと膀胱内圧（注入抵抗）測定用のチューブを接続した。ボールマンケージの下に電子天秤を置き、排尿量を同時に記録した。麻酔が完全に覚めてから、膀胱内に生理食塩水の注入を開始し、膀胱内圧と排尿量をＡ−Ｄ変換器（ＭＰ−１００、ＢＩＯＰＡＣ ｓｙｓｔｅｍｓ）を介してパソコンに取り込み、専用ソフトウェア（ＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅ、ＢＩＯＰＡＣ ｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。
膀胱内に生理食塩水を６ｍＬ／ｈの速度で注入し、安定した排尿が記録できるまで、１〜２時間注入を続けた。膀胱への薬物の浸透性を高めるため、硫酸プロタミン（１０ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を１時間膀胱内に注入した（Ｃｈｕａｎｇ Ｙ，ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ｕｒｏｌｏｇｙ ６３，ｐ．６６４−６７０）。プロタミンの注入によって、排尿間隔は、注入前とほとんど変化がなかった。その後、再び生理食塩水を膀胱内に注入し、プロタミンが完全に洗浄されるように２時間以上排尿を記録した。排尿間隔がほぼ一定になった時点で、ＧＰＲ３９アゴニストとして１ ｍＭの塩化第二銅（ＣｕＣｌ２）生理食塩水溶液に切り替え、約１時間観察した。ＣｕＣｌ２の注入を開始してから約３０分後から６０分後の間の平均排尿間隔を求め、ＣｕＣｌ２を注入する前の約３０分間における平均排尿間隔に対する割合（％ ｏｆ ｐｒｅ−ｖａｌｕｅ）を求めた。
持続注入溶液を生理食塩水からＣｕＣｌ２溶液に変えると、基底圧には影響がみられず、排尿間隔が短縮した。その割合は、注入前を１００％とすると４２．２±６．１％（ｎ＝４）に短縮した。従って、膀胱内に注入したＣｕＣｌ２は、ＧＰＲ３９を介して頻尿状態にさせたことを示唆し、ＧＰＲ３９が排尿調節に関与していることが判明した。
Example 12 Influence of GPR39 Agonist on Awake Rats 9 to 10-week-old female SD rats were mixed with ketamine (50 mg / mL) and xylazine (20 mg / mL) at a ratio of 5: 1 at 0.1 mL / 100 g. Anesthetized by intramuscular injection. The bladder was exposed by a midline incision, a hole was made with a 20G injection needle, a polyethylene tube (PE-50) was inserted, and the bladder was sewn to the bladder with a cotton thread. A polyethylene tube attached to the bladder was cut into a length of about 1 cm, connected to a silicone tube (No. 00), and put out under the skin through the skin. The animals were kept in individual cages until they were used for the experiments.
One day after the operation, the animals were halothane anesthetized and placed in a Ballman cage to restrain the animals. A three-way cock was connected to the tube connected to the bladder, and a tube for injecting physiological saline and a tube for measuring intravesical pressure (injection resistance) were connected. An electronic balance was placed under the Ballman cage and the amount of urine was recorded simultaneously. After the anesthesia was completely awakened, infusion of physiological saline into the bladder was started, and the bladder pressure and urine output were taken into a personal computer via an A / D converter (MP-100, BIOPAC systems), and dedicated software (AcqKnowledge). , BIOPAC systems).
Physiological saline was infused into the bladder at a rate of 6 mL / h and the infusion continued for 1-2 hours until stable voiding could be recorded. To increase the permeability of the drug into the bladder, protamine sulfate (10 mg / mL in PBS) was injected into the bladder for 1 hour (Chuang Y, et. Al., 2003, Urology 63, p. 664-670). With protamine infusion, micturition interval was almost unchanged from before infusion. Thereafter, saline was again injected into the bladder, and urination was recorded for 2 hours or more so that protamine was completely washed. When the urination interval became almost constant, the solution was switched to a 1 mM cupric chloride (CuCl 2 ) saline solution as a GPR39 agonist and observed for about 1 hour. The average urination interval between about 30 minutes and 60 minutes after starting the infusion of CuCl 2 was determined, and the ratio (% of pre-value) to the average urination interval in about 30 minutes before injecting CuCl 2 was calculated. I asked.
Changing the continuous infusion solution from saline to CuCl 2 solution did not affect basal pressure and shortened the urination interval. The ratio was reduced to 42.2 ± 6.1% (n = 4) assuming 100% before injection. Therefore, it was suggested that CuCl 2 injected into the bladder caused frequent urination via GPR39, and GPR39 was found to be involved in urination control.
ＧＰＲ３９とリガンドであるカドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩とを用いることによって、該金属元素またはその塩とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。また、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、活性がより強いアゴニストを見出すことできる。
ＧＰＲ３９に対するアゴニストは、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
ＧＰＲ３９に対するアンタゴニストは、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、性交痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。
By using GPR39 and ligands such as cadmium, zinc, copper and nickel as ionizable metal elements or salts thereof, a compound capable of changing the binding property between the metal element or salts thereof and GPR39 can be efficiently screened. Can be. Further, by using the screening method of the present invention, an agonist having stronger activity can be found.
Agonists for GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, chilling, reduced learning ability, sexual dysfunction, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, infection Reduced resistance, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hypotonic bladder based on the decrease, metal deficiency such as hypotonic bladder due to bladder palsy after surgical operation of the pelvis internal organs, or a cytokine (eg, IL-8) secretagogue.
Antagonists to GPR39 include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis including interstitial cystitis, Prophylactic / therapeutic agents such as pollakiuria due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, various disorders caused by urolithiasis, cytokines (eg, IL -8) Secretory inhibitors or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergies It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).
Claims (39)
Frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, dyspareunia, bladder irritation, or various symptoms caused by urolithiasis (I) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof for producing a prophylactic / therapeutic agent for a disorder (Ii) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; A polynucleotide comprising a complementary base sequence or a part thereof, (iii) identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or an antagonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing substantially the same amino acid sequence, or (iv) containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Use of a compound or a salt thereof that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof.
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