【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｍａｓアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト由来ｍａｓのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されており（特許文献１〜３）、精神分裂症に関与することが示唆されている（特許文献２および３）。
さらに、ヒトｍａｓがＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換能を有すること（非特許文献１）、ｍａｓ ＫＯマウスに記憶（ＬＴＰ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の増強や不安の亢進が見られること（非特許文献２）が報告されている。しかし、ｍａｓに対するリガンドは報告されていない。
ＳＣ−５１３２２はプロスタグランジンＥ２（ＥＰ１受容体）アンタゴニストとして知られている（非特許文献３）。
【化１】
ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅは妊娠に影響することが示唆されている（非特許文献４）。
【化２】
【０００３】
【特許文献１】
ＷＯ８７／０７４７２号
【０００４】
【特許文献２】
ＷＯ９４／４０５６９５号
【０００５】
【特許文献３】
ＵＳＰ５５０８３８４
【０００６】
【非特許文献１】
Ｃｅｌｌ ４５：７１１−７１９，１９８４
【０００７】
【非特許文献２】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１８６７−１１８７３，１９９８
【０００８】
【非特許文献３】
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，６０９
【０００９】
【非特許文献４】
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，１０８９−１０９９（１９８３）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ｍａｓに対してアゴニスト作用を示す物質を見出し、それを用いたｍａｓアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＳＣ−５１３２２およびｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅが予想外にもヒトｍａｓに対してアゴニスト作用を有することを見出し、さらにこれらを用いてｍａｓアゴニストまたはアンタゴニストを効率良くスクリーニングできることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
〔１〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕（１）標識されたＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（２）試験化合物および標識されたＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、標識されたＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅと該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕（１）標識されたＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および標識されたＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、標識されたＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅと該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕（１）ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物およびＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５〕試験化合物を配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ抑制活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストのスクリーニング方法、
〔６〕試験化合物が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物である上記〔２〕〜〔５〕記載のスクリーニング方法、
〔７〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔８〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの結合性を変化させる化合物またはその塩、
〔９〕アゴニストである上記〔８〕記載の化合物またはその塩、
〔１０〕アンタゴニストである上記〔８〕記載の化合物またはその塩、
〔１１〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔１２〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる不安症の予防・治療剤、
〔１３〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる腫瘍もしくは記憶障害の予防・治療剤、ＬＴＰ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）増強剤または向知能剤、
〔１４〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対する低分子合成アゴニストを含有してなる不安症の予防・治療剤、
〔１５〕低分子合成アゴニストがＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅである上記〔１４〕記載の剤、
〔１６〕哺乳動物に対して、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする不安症の予防・治療方法、
〔１７〕哺乳動物に対して、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする腫瘍もしくは記憶障害の予防・治療方法、ＬＴＰ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）増強方法または向知能方法、
〔１８〕哺乳動物に対して、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対する低分子合成アゴニストの有効量を投与することを特徴とする不安症の予防・治療方法、
〔１９〕不安症の予防・治療剤を製造するための、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストの使用、
〔２０〕腫瘍もしくは記憶障害の予防・治療剤、ＬＴＰ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）増強剤または向知能剤を製造するための、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストの使用、および
〔２１〕不安症の予防・治療剤を製造するための配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対する低分子合成アゴニストの使用などを提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、ｍａｓと略記する場合がある）は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
ｍａｓは、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、膵臓ランゲルハンス島、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
【００１４】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、ｍａｓとしては、a）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、b）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、c）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはd）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
【００１５】
本明細書におけるｍａｓは、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するｍａｓをはじめとするｍａｓは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ｍａｓがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものもｍａｓに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ｍａｓには、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。ｍａｓの具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ｍａｓ、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ｍａｓなどが用いられる。
【００１６】
ｍａｓの部分ペプチドとしては、上記したｍａｓの部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ｍａｓの蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるｍａｓの部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
ｍａｓの部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１７】
また、ｍａｓの部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、ｍａｓの部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ｍａｓの部分ペプチドには、上記したｍａｓと同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ｍａｓまたはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
ｍａｓまたはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載するｍａｓをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１８】
ｍａｓもしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢt、 ＨＯＯＢt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステルあるいはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１９】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００２０】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２１】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２２】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００２３】
ｍａｓの部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはｍａｓを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ｍａｓを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)ｂ）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, NewYork (1965年)
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２４】
ｍａｓをコードするポリヌクレオチドとしては、上記したｍａｓをコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、ｍａｓをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
ｍａｓをコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、ｍａｓのｍＲＮＡを定量することができる。
ｍａｓをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ｍａｓをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるｍａｓと実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ｍａｓをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ｍａｓをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００２６】
ｍａｓをコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ｍａｓ遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたｍａｓをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ｍａｓ遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはｍａｓ関連ＲＮＡとの相互作用を介してｍａｓ遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。ｍａｓ遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ｍａｓ遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２７】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２８】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡは、ｍａｓをコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
ｍａｓをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部をｍａｓをコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。ｍａｓをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。
【００２９】
ｍａｓの部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記したｍａｓの部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ｍａｓの部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるｍａｓと実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３０】
ｍａｓまたはその部分ペプチド（以下、ｍａｓと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ｍａｓの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをｍａｓの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたｍａｓをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
ｍａｓの発現ベクターは、例えば、（イ）ｍａｓをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００３１】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３２】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたｍａｓをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３３】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
【００３４】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveＴＭ 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３５】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Gene），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）, 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ｍａｓをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３６】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３７】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., ネイチャー（Nature）, 195, 788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にｍａｓを生成せしめることができる。
【００３８】
上記培養物からｍａｓを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
ｍａｓを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりｍａｓの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にｍａｓが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるｍａｓの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３９】
かくして得られるｍａｓが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するｍａｓを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成するｍａｓの活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００４０】
ｍａｓに対する抗体は、ｍａｓを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
ｍａｓに対する抗体は、ｍａｓを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
ｍａｓは、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプター蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４１】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター蛋白質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４２】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ｍａｓ抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からｍａｓに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４３】
ｍａｓに対してアゴニスト作用を示す物質として、ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅなどが挙げられる。本発明においては、ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅと同様にｍａｓに対してアゴニスト活性を示す物質（天然リガンド、低分子合成アゴニストも含む）であれば、同様に使用することができる。これらのｍａｓに対してアゴニスト活性を示す物質は、後述するアゴニストのスクリーニング方法を用いて得ることができる。
以下、これらのｍａｓに対してアゴニスト活性を示す物質（天然リガンドも含む）を「ｍａｓアゴニスト」と略記する。
【００４４】
（１）ｍａｓの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
ａ）ｍａｓアゴニスト、ｂ）ｍａｓまたはｃ）ｍａｓをコードするＤＮＡ（ｍａｓＤＮＡ）を、ｍａｓの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内においてｍａｓリガンドやｍａｓが減少しているために、ｍａｓリガンドの生理作用が期待できない（ｍａｓリガンドまたはｍａｓの欠乏症）患者がいる場合に、ａ）ｍａｓアゴニストやｍａｓを該患者に投与し、該ｍａｓアゴニストやｍａｓの量を補充したり、ｂ）（イ）ｍａｓＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞にｍａｓＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるｍａｓアゴニストやｍａｓの量を増加させ、ｍａｓの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、ｍａｓアゴニスト、ｍａｓまたはｍａｓＤＮＡは、安全で低毒性なｍａｓの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などとして有用である。
具体的には、ｍａｓアゴニスト、ｍａｓまたはｍａｓＤＮＡは、例えば、不安症の予防・治療剤として使用することができる。
ｍａｓアゴニストまたはｍａｓを上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、ｍａｓＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。ｍａｓＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）ｍａｓアゴニスト、ｂ）ｍａｓまたはｃ）ｍａｓＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）ｍａｓアゴニスト、ｂ）ｍａｓまたはｃ）ｍａｓＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００４５】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００４６】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
例えば、ｍａｓアゴニストまたはｍａｓの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
ｍａｓＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】
（２）遺伝子診断剤
ｍａｓＤＮＡ、ｍａｓＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、ｍａｓアンチセンスＤＮＡ）およびｍａｓに対するｓｉＲＮＡ（以下、ｍａｓ ｓｉＲＮＡ）は、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるｍａｓまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
ｍａｓＤＮＡ、ｍａｓアンチセンスＤＮＡまたはｍａｓ ｓｉＲＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍａｓの発現低下が検出された場合は、例えば、ｍａｓの機能不全に関連する疾患（例えば、不安症）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍａｓの発現過多が検出された場合は、例えば、ｍａｓの過剰発現に起因する疾患（例えば、腫瘍（前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などの悪性腫瘍等）、記憶障害）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００４８】
（３）ｍａｓの発現量を変化させる化合物を含有する医薬
ｍａｓＤＮＡは、プローブとして用いることにより、ｍａｓの発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれるｍａｓのｍＲＮＡ量を測定することによる、ｍａｓの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
ｍａｓのｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるｍａｓのｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ii）ｍａｓを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるｍａｓのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００４９】
ｍａｓの発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるｍａｓのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるｍａｓのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、ｍａｓの発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）ｍａｓの発現量を増加させることにより、ｍａｓを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など、特に細胞内ｃＡＭＰ生成の抑制活性または細胞内Ｃａ２＋遊離の促進活性）を増強させる化合物、（ロ）ｍａｓの発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記スクリーニング方法で得られるｍａｓの発現量を変化させる化合物は、ｍａｓの機能不全に関連する疾患（例えば、不安症）の予防および／または治療剤として用いることができる。
具体的には、ｍａｓの発現量を増加させる化合物は、ｍａｓの機能不全に関連する疾患（例えば、不安症）に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
ｍａｓの発現量を減少させる化合物は、ｍａｓの発現過多に起因する疾患（例えば、腫瘍（前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などの悪性腫瘍等）、記憶障害）に対する安全で低毒性な予防・治療剤、ＬＴＰ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）増強剤、向知能剤として有用である。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００５２】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
例えば、ｍａｓの発現量を増加させる化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、ｍａｓの発現量を減少させる化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、記憶障害患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、記憶障害患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５３】
（４）ｍａｓの定量法および診断方法
ｍａｓに対する抗体（以下、ｍａｓ抗体）は、ｍａｓを特異的に認識することができるので、被検液中のｍａｓの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）ｍａｓ抗体と、被検液および標識化されたｍａｓとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたｍａｓの割合を測定することを特徴とする被検液中のｍａｓの定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化したｍａｓ抗体および標識化された別のｍａｓ抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のｍａｓの定量法を提供する。
【００５４】
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体がｍａｓのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がｍａｓのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、ｍａｓに対するモノクローナル抗体を用いてｍａｓの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
ｍａｓ抗体を用いるｍａｓの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ｍａｓ量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００５５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ｍａｓあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のｍａｓ量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００５６】
本発明のサンドイッチ法によるｍａｓの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、ｍａｓの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ｍａｓのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてｍａｓの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、ｍａｓ抗体を用いることによって、ｍａｓを感度良く定量することができる。
【００５７】
さらには、ｍａｓ抗体を用いてｍａｓの濃度を定量することによって、ｍａｓの濃度の減少が検出された場合、例えば、ｍａｓの機能不全に関連する疾患（例えば、不安症）である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ｍａｓの濃度の増加が検出された場合には、例えば、ｍａｓの過剰発現に起因する疾患（例えば、腫瘍（前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などの悪性腫瘍等）、記憶障害）である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００５８】
（５）ｍａｓアゴニストのスクリーニング方法
ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅがｍａｓに結合することによって、細胞内ｃＡＭＰ生成の抑制または細胞内Ｃａ２＋遊離の促進が見られることから、ｍａｓはこの細胞内シグナルを指標としてｍａｓに対するＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅ以外のアゴニスト（ｍａｓに対する天然リガンドを含む）を探索し、または決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、試験化合物をｍａｓを含有する細胞に接触させた場合における、ｍａｓを介した細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性または細胞内Ｃａ２＋遊離促進活性を測定することを特徴とするｍａｓアゴニストの決定方法を提供する。試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、低分子合成化合物などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをｍａｓに添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
【００５９】
具体的には、本発明のアゴニスト決定方法は、組換え型ｍａｓの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、ｍａｓを介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性または細胞内Ｃａ２＋遊離促進活性を有する化合物またはその塩を決定する方法である。
より具体的には、本発明は、次のような決定方法を提供する。
（１）試験化合物をｍａｓを含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性または細胞内Ｃａ２＋遊離促進活性を測定することを特徴とするｍａｓアゴニストの決定方法、および
（２）試験化合物をｍａｓＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したｍａｓに接触させた場合におけるｍａｓを介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性または細胞内Ｃａ２＋遊離促進活性を測定することを特徴とするｍａｓアゴニストの決定方法を提供する。
特に、試験化合物がｍａｓに結合することを確認した後に、上記の試験を行なうことが好ましい。
【００６０】
本発明のアゴニスト決定方法において、ｍａｓを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
ｍａｓを含有する細胞の膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したｍａｓと細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
【００６１】
ｍａｓを含有する細胞やその細胞膜画分中のｍａｓの量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のアゴニスト決定方法を実施するためには、ｍａｓを介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ｍａｓを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。アゴニスト決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋など）の生成が、細胞が含有する分解酵素の影響によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ生成抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
本発明のアゴニスト決定用キットは、ｍａｓを含有する細胞またはその細胞膜画分を含有するものである。
このようにして決定されるｍａｓアゴニストは、ｍａｓに結合してその生理的機能を調節するので、ｍａｓの機能に関連する疾患（例えば、不安症）の予防・治療剤として用いることができる。
【００６２】
（６）ｍａｓとｍａｓリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、およびｍａｓとｍａｓリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬
ｍａｓに対する天然リガンド（ｍａｓリガンド）に代えて、ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅ（本発明のｍａｓリガンド）を用いることによって、ｍａｓとｍａｓリガンドとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
すなわち、ｍａｓを用いるか、または組換え型ｍａｓの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、ｍａｓとｍａｓリガンドとの結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）ｍａｓを介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、ｍａｓアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、ｍａｓアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本発明のｍａｓとの結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドと本発明のｍａｓとの結合力を減少させる化合物などが含まれる。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられるが、特に細胞内ｃＡＭＰ生成の抑制活性または細胞内Ｃａ２＋遊離の促進活性が好ましい。
すなわち、本発明は、（ｉ）ｍａｓと本発明のｍａｓアゴニストとを接触させた場合と（ii）ｍａｓと本発明のｍａｓアゴニストおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、ｍａｓに対する本発明のｍａｓアンタゴニストの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
【００６３】
より具体的には、本発明は、
ａ）標識した本発明のｍａｓアゴニストを、ｍａｓに接触させた場合と、標識した本発明のｍａｓアゴニストおよび試験化合物をｍａｓに接触させた場合における、標識した本発明のｍａｓアゴニストのｍａｓに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）標識した本発明のｍａｓアゴニストをｍａｓを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のｍａｓアゴニストおよび試験化合物をｍａｓを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のｍａｓアゴニストの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）標識した本発明のｍａｓアゴニストをｍａｓＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したｍａｓに接触させた場合と、標識した本発明のｍａｓアゴニストおよび試験化合物をｍａｓＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したｍａｓに接触させた場合における、標識した本発明のｍａｓアゴニストのｍａｓに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００６４】
ｄ）ｍａｓを活性化する化合物（例えば、本発明のｍａｓアゴニストなど）をｍａｓを含有する細胞に接触させた場合と、ｍａｓを活性化する化合物および試験化合物をｍａｓを含有する細胞に接触させた場合における、ｍａｓを介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）ｍａｓを活性化する化合物（例えば、本発明のｍａｓアゴニストなど）をｍａｓＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したｍａｓに接触させた場合と、ｍａｓを活性化する化合物および試験化合物をｍａｓＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したｍａｓに接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
さらに、上記スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩をｍａｓリガンドとして用い、本発明のスクーニング方法を実施することもできる。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるｍａｓとしては、ｍａｓを含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来ｍａｓなどが適している。
【００６６】
ｍａｓを製造するには、上記の方法が用いられるが、ｍａｓＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のｍａｓをコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、ｍａｓとしては、それ自体公知の方法に従って精製したｍａｓであってもよいし、ｍａｓを含有する細胞を用いてもよく、またｍａｓを含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法において、ｍａｓを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
ｍａｓを含有する細胞としては、該ｍａｓを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したｍａｓと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
ｍａｓを含有する細胞や膜画分中のｍａｓの量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００６８】
ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当なｍａｓ画分と、標識した本発明のｍａｓアゴニストが必要である。
ｍａｓ画分としては、天然型のｍａｓ画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ｍａｓ画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した本発明のｍａｓアゴニストとしては、標識した本発明のｍａｓアゴニスト、標識した本発明のｍａｓアゴニストアナログ化合物などが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識された本発明のｍａｓアゴニストなどが用いられる。
具体的には、ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まずｍａｓを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりｍａｓ標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの本発明のｍａｓアゴニストとｍａｓとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のｍａｓアゴニストを添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のｍａｓアゴニストを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６９】
ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、ｍａｓを介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、ｍａｓを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋など）の生成が、細胞が含有する分解酵素の影響によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ生成抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なｍａｓを発現した細胞が必要である。ｍａｓを発現した細胞としては、天然型のｍａｓを有する細胞株、組換え型ｍａｓを発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、試験化合物としては、ｍａｓの活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ｍａｓの活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
【００７０】
ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ｍａｓ、ｍａｓを含有する細胞またはｍａｓを含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）ｍａｓ標品
ｍａｓを発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識リガンド
市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のｍａｓアゴニスト
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
ｄ）リガンド標準液
本発明のｍａｓアゴニストを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００７１】
２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のｍａｓ発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のｍａｓアゴニストを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍの本発明のｍａｓアゴニストを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
【００７２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）ｍａｓを介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、ｍａｓアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、ｍａｓアンタゴニスト）、（ハ）ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
また、化合物は、前記したｍａｓの活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて設計された化合物であってもよい。
ｍａｓアゴニストは、ｍａｓを活性化することができるので、安全で低毒性な医薬として有用である。
ｍａｓアンタゴニストは、ｍａｓリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、ｍａｓリガンドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合力を増強する化合物は、ｍａｓリガンドが有する生理活性を増強することができるので、ｍａｓリガンドが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合力を減少させる化合物は、ｍａｓリガンドが有する生理活性を減少させることができるので、ｍａｓリガンドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼ｍａｓアゴニストまたは▲２▼ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合力を増強する化合物またはその塩は、例えば、不安症などの疾患に対する予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼ｍａｓアンタゴニストまたは▲２▼ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合力を減少させる化合物またはその塩は、例えば、腫瘍もしくは記憶障害などの疾患に対する予防・治療剤、ＬＴＰ増強剤、向知能剤として有用である。
【００７３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、前述したｍａｓの発現量を変化させる化合物またはその塩、上記疾患に対する他の薬物などの薬剤（以下、併用薬剤と略記することがある）と組み合わせて用いることができる。この際、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩および併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば投与対象がヒトである場合、例えばアゴニスト１重量部に対し、併用薬剤を０．０１〜１００重量部用いればよい。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７５】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
例えば、ｍａｓアゴニストの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７６】
（７）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
ｍａｓを用いることによって、各種薬物がｍａｓを介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
(1)ｍａｓを用いることを特徴とする、▲１▼ＬＴＰ増強薬、▲２▼向知能薬、▲３▼抗腫瘍薬、▲４▼記憶障害治療薬または▲５▼抗不安薬がｍａｓに結合することを確認する方法、
(2)ｍａｓを用いることを特徴とする、▲１▼ＬＴＰ増強薬、▲２▼向知能薬、▲３▼抗腫瘍薬、▲４▼記憶障害治療薬がｍａｓアンタゴニストであることを確認する方法、
(3)ｍａｓを用いることを特徴とする、抗不安薬がｍａｓアゴニストであることを確認する方法、
(4)各薬をｍａｓに接触させた場合における、各薬とｍａｓとの結合量を測定することを特徴とする上記(1)〜(3)記載のスクリーニング方法を提供する。
この確認方法は、前記したｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、前記したｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がｍａｓを介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。
【００７７】
（８）細胞膜におけるｍａｓまたはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する医薬
ｍａｓ抗体は、ｍａｓを特異的に認識することができるので、細胞膜におけるｍａｓの量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるｍａｓを定量することによる、細胞膜におけるｍａｓの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ii）ｍａｓを発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるｍａｓを定量することによる、細胞膜におけるｍａｓの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（iii）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるｍａｓの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
（iv）ｍａｓを発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるｍａｓの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００７８】
細胞膜画分に含まれるｍａｓの定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００ＴＭ、ツイーン２０ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したｍａｓと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれるｍａｓは、例えば、ｍａｓ抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ii）ｍａｓを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるｍａｓを定量することができる。
【００７９】
細胞膜におけるｍａｓの量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜におけるｍａｓの量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜におけるｍａｓの量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれるｍａｓの確認は具体的には以下のようにして行なう。
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、ｍａｓ抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜における本発明のｍａｓの量を確認することができる。
（iv）ｍａｓを発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
【００８０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるｍａｓの量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）細胞膜におけるｍａｓの量を増加させることにより、ｍａｓを介する細胞刺激活性を増強させる化合物、（ロ）細胞膜におけるｍａｓの量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
細胞膜におけるｍａｓの量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物は、ｍａｓの機能不全に関連する疾患（例えば、不安症）に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
細胞膜におけるｍａｓの量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物は、ｍａｓの発現過多に起因する疾患（例えば、腫瘍（前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などの悪性腫瘍等）、記憶障害）に対する安全で低毒性な予防・治療剤、ＬＴＰ増強剤、向知能剤として有用である。
また、前記した併用薬剤と併用することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００８１】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
例えば、細胞膜におけるｍａｓの量を増加させる化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、不安症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８２】
（９）ｍａｓに対する抗体を含有してなる医薬
ｍａｓに対する抗体（ｍａｓ抗体）の中和活性とは、ｍａｓの関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、ｍａｓの関与するシグナル伝達、例えば、ｍａｓを介する細胞刺激活性を不活性化することができる。
したがって、ｍａｓに対する中和抗体は、ｍａｓの過剰発現などに起因する疾患（例えば、腫瘍（前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などの悪性腫瘍等）、記憶障害）の予防・治療剤として用いることができる。
また、前記した併用薬剤と併用することができる。
【００８３】
（１０）ｍａｓアンチセンスＤＮＡまたはｍａｓ ｓｉＲＮＡを含有してなる医薬
ｍａｓアンチセンスＤＮＡまたはｍａｓ ｓｉＲＮＡは、ｍａｓの過剰発現などに起因する疾患（例えば、腫瘍（前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などの悪性腫瘍等）、記憶障害）の予防・治療剤として用いることができる。また、前記した併用薬剤と併用することができる。
例えば、ｍａｓアンチセンスＤＮＡまたはｍａｓ ｓｉＲＮＡを用いる場合、ｍａｓアンチセンスＤＮＡまたはｍａｓ ｓｉＲＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。ｍａｓアンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、ｍａｓアンチセンスＤＮＡは、組織や細胞におけるｍａｓＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００８４】
（１１）ｍａｓＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性のｍａｓＤＮＡ（以下、外来性ｍａｓＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（外来性変異ｍａｓＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕外来性ｍａｓＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕外来性ｍａｓＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
外来性ｍａｓＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、ｍａｓＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする外来性ｍａｓＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることによりｍａｓＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００８５】
外来性ｍａｓＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有しているｍａｓＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出されたｍａｓＤＮＡをいう。
変異ｍａｓＤＮＡとしては、元のｍａｓＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なｍａｓを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なｍａｓの機能を抑制するｍａｓを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
外来性ｍａｓＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。ｍａｓＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、ｍａｓＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ヒトｍａｓＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高いｍａｓＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、ヒトｍａｓＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによってｍａｓＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００８６】
ｍａｓの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００８７】
その他、目的とする外来性ｍａｓＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常なｍａｓの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ｍａｓＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なｍａｓの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における外来性ｍａｓＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、外来性ｍａｓＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに外来性ｍａｓＤＮＡを保持することを意味する。外来性ｍａｓＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに外来性ｍａｓＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における外来性ｍａｓＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において外来性ｍａｓＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに外来性ｍａｓＤＮＡを過剰に有することを意味する。外来性ｍａｓＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに外来性ｍａｓＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００８８】
正常ｍａｓＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、正常ｍａｓＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ｍａｓＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のｍａｓの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、正常ｍａｓＤＮＡ転移動物を用いて、ｍａｓの機能亢進症や、ｍａｓが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離したｍａｓの増加症状を有することから、ｍａｓに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ｍａｓＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来性ｍａｓＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における異常ｍａｓＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において異常ｍａｓＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。外来性ｍａｓＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００８９】
異常ｍａｓＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、異常ｍａｓＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ｍａｓＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にｍａｓの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、異常ｍａｓＤＮＡ転移動物を用いて、ｍａｓの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、異常ｍａｓＤＮＡ高発現動物は、ｍａｓの機能不活性型不応症における異常ｍａｓによるｍａｓの機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、外来異常ｍａｓＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離したｍａｓの増加症状を有することから、ｍａｓまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類のｍａｓＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼ｍａｓＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたｍａｓ組織を分析することによる、ｍａｓにより特異的に発現あるいは活性化するｍａｓとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼変異ｍａｓを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、ｍａｓＤＮＡ転移動物を用いて、ｍａｓの機能不活性型不応症などを含む、ｍａｓに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、ｍａｓに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、ｍａｓＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、ｍａｓ産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、ｍａｓおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、ｍａｓＤＮＡ転移動物を用いて、ｍａｓの機能不活性型不応症を含む、ｍａｓに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、ｍａｓＤＮＡ転移動物または外来性ｍａｓＤＮＡ発現ベクターを用いて、ｍａｓが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００９０】
（１２）ノックアウト動物
本発明は、ｍａｓＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞およびｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕ｍａｓＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕ｍａｓＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がｍａｓＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするｍａｓＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
ｍａｓＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有するｍａｓＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のｍａｓの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のｍａｓの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
ｍａｓＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００９１】
ｍａｓＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、ｍａｓＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有するｍａｓＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞についてｍａｓＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用したｍａｓＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等によりｍａｓＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００９２】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られるｍａｓＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のｍａｓまたはｍａｓの細胞生物学的検討において有用である。
【００９３】
ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターのｍａｓＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上のｍａｓＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、ｍａｓＤＮＡをノックアウトさせることができる。
ｍａｓＤＮＡがノックアウトされた細胞は、ｍａｓＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来のｍａｓＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、ｍａｓＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常なｍａｓＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異したｍａｓＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したｍａｓＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えたｍａｓＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のｍａｓのヘテロ発現不全個体であり、本発明のｍａｓのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のｍａｓのホモ発現不全個体を得ることができる。
【００９４】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えによりｍａｓＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにしてｍａｓＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
ｍａｓＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のｍａｓにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のｍａｓの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００９５】
（１２ａ）ｍａｓＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ｍａｓＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、ｍａｓＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられるｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９６】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の不安症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善された場合、該試験化合物を不安症に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のｍａｓの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、不安症）に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したｍａｓとｍａｓリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に不安症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常、不安症患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９７】
（１２ｂ）ｍａｓＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするｍａｓＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記したｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、ｍａｓＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がｍａｓＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
ｍａｓＤＮＡをレポーター遺伝子で置換されたｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子がｍａｓＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、ｍａｓをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ｍａｓの発現する組織で、本発明のｍａｓの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にｍａｓの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ｍａｓ欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ｍａｓＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００９８】
ｍａｓＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ｍａｓの発現を促進し、ｍａｓの機能を促進することができるので、例えば、ｍａｓの機能不全に関連する疾患（例えば、不安症）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
ｍａｓＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ｍａｓの発現を阻害し、ｍａｓの機能を阻害することができるので、例えば、本発明のｍａｓの発現過多に関連する疾患（例えば、腫瘍（前立腺癌、非小細胞癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌などの悪性腫瘍等）、記憶障害）などの予防・治療剤、ＬＴＰ増強剤、向知能剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００９９】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したｍａｓとｍａｓリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
例えば、ｍａｓＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば経口投与する場合、一般的に不安症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば注射剤の形で通常、不安症患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。このように、ｍａｓＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ｍａｓＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、ｍａｓＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のｍａｓのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのｍａｓを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のｍａｓそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１００】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【０１０１】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
＊ ：終止コドンに対応する
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【０１０２】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃl２Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【０１０３】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
ヒトｍａｓのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
ヒトｍａｓをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
ラットｍａｓのアミノ酸配列を示す。
配列番号：４
ラットｍａｓをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【０１０４】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【０１０５】
【実施例１】ＳＣ−５１３２２、ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅによるｍａｓ−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞のｃＡＭＰ産生量の抑制
検定には、ｍａｓのＣ末端にＧＦＰを融合したタンパク質を安定的に発現させたＣＨＯ細胞株、および対照としてＨＭ７４のＣ末端にＧＦＰを融合したタンパク質を安定的に発現させたＣＨＯ細胞株を、それぞれ自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドを用いて樹立し、各々４００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で９６穴プレートに播種し、３７℃・５％ＣＯ２で１晩培養したものを使用した。まず、アッセイ用緩衝液（ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に０．１％ウシ血清アルブミン、および０．２ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）を添加したもの）にて各細胞を洗浄した後、同アッセイ用緩衝液中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分プレインキュベーションした。該アッセイ用緩衝液を捨て、新しいアッセイ用緩衝液６０μｌ／ｗｅｌｌに置換し、そこにｃＡＭＰ産生の上昇を促す試薬であるホルスコリン（和光純薬工業、最終濃度２μＭ）とともにＳＣ−５１３２２（ＢＩＯＭＯＬ）、またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅ（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むアッセイ用緩衝液を４０μｌ／ｗｅｌｌずつさらに添加した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分培養した。各穴毎の細胞内ｃＡＭＰ量は、ｃＡＭＰ ｓｃｒｅｅｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）とプレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Wallac社）を用いて測定した。
その結果、ＳＣ−５１３２２、またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを添加することによりｍａｓ−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生量の抑制反応が認められた。
【０１０６】
【実施例２】ＳＣ−５１３２２、ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅによるｍａｓ−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞の細胞内カルシウム濃度変化
まず実施例１で用いたｍａｓ−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞株と該細胞作製時に用いた発現ベクターの元のプラスミドのみを安定的に導入したｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞株を、それぞれ３ｘ１０４個／１００μｌの細胞濃度に希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した。該細胞に対する被検試料による細胞内カルシウム濃度の変動測定はＦＬＩＰＲ（登録商標）システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて以下の要領で行った。Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ） ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファー［ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に １Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）を２０ｍｌ添加し、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後、さらに上記のＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し調製する。］に加え、蛍光色素溶液とした。上述の細胞培養プレートから各穴内の培地を除き、直ちに該蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、３７℃、５％ＣＯ２にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄後、各穴を同バッファー１００μｌに置換した。また細胞に添加するＳＣ−５１３２２、ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅの各被検試料は予めアッセイバッファーを用いて各々の濃度に希釈し、別途９６穴プレートに２００μｌずつ分注した。細胞含有プレート、被検試料プレートを同時にＦＬＩＰＲ（登録商標）システム（登録商標）にセットし、被検試料添加（５０μｌ）後の細胞内カルシウム濃度の変動を蛍光強度の変化として測定した。その結果、４μＭ ＳＣ−５１３２２、２μＭ ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅを添加することにより、ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞には認められないｍａｓ−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞特異的な細胞内カルシウム濃度の上昇が検出された。
【０１０７】
【発明の効果】
ＳＣ−５１３２２またはｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｆ２α １，１５−ｌａｃｔｏｎｅなどのｍａｓアゴニストとｍａｓを用いることによって、ｍａｓリガンドとｍａｓとの結合性を変化させる化合物またはその塩を効率良くスクリーニングすることができる。
【０１０８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｍａｓ−ＧＦＰ受容体を発現させたＣＨＯ細胞において細胞内ｃＡＭＰ量を比較した結果を示す。横軸のレーン１はフォルスコリン非添加、レーン２は２μＭフォルスコリン添加、レーン３は２μＭフォルスコリンおよび５０μＭ ＳＣ−５１３２２同時添加、レーン４は２μＭフォルスコリンおよび５μＭ ＳＣ−５１３２２同時添加、レーン５は２μＭフォルスコリンおよび２０μＭ prostagrandin Ｆ２α １，１５-lactone同時添加、レーン６は２μＭフォルスコリン、２μＭ prostagrandin Ｆ２α １，１５-lactone同時添加の場合を示す。縦軸はｃＡＭＰ量を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for screening a mas agonist or antagonist, and the like.
[0002]
[Prior art]
The amino acid sequence of human-derived mas and the DNA encoding it have been reported (Patent Documents 1 to 3), and have been suggested to be involved in schizophrenia (Patent Documents 2 and 3).
Furthermore, human mas has the ability to transform NIH3T3 cells (Non-Patent Document 1), and mas KO mice show enhanced memory (LTP: long term potentialization) and enhanced anxiety (Non-Patent Document 2). It has been reported. However, no ligand for mas has been reported.
SC-51322 is known as a prostaglandin E2 (EP1 receptor) antagonist (Non-Patent Document 3).
Embedded image
It has been suggested that prostaglandin F2α 1,15-lactone affects pregnancy (Non-Patent Document 4).
Embedded image
[0003]
[Patent Document 1]
WO87 / 07472
[0004]
[Patent Document 2]
WO94 / 405695
[0005]
[Patent Document 3]
USP5508384
[0006]
[Non-patent document 1]
Cell 45: 711-719, 1984.
[0007]
[Non-patent document 2]
J. Biol. Chem. 273: 11867-11873, 1998.
[0008]
[Non-Patent Document 3]
J. Med. Chem. 1996, 39, 609
[0009]
[Non-patent document 4]
Med. Chem. 26, 1089-1099 (1983)
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to find a substance exhibiting an agonistic action on mas and to provide a method for screening a mas agonist or antagonist using the substance.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies and found that SC-51322 and prostaglandin F2α 1,15-lactone unexpectedly have an agonistic effect on human mas. It has been found that antagonists can be efficiently screened. The present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
[0012]
That is, the present invention
[1] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) SC-51322 or prostaglandin A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and a ligand for the receptor protein or a salt thereof, comprising using F2α1,15-lactone;
[2] (1) a G protein-coupled receptor protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein labeled SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone is represented by SEQ ID NO: 1 And (2) a test compound and labeled SC-51322 or prostaglandin F2α 1,15-lactone were contacted with the receptor protein, the partial peptide or a salt thereof. Wherein the amount of binding between labeled SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone and the receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof is measured. ,
[3] (1) a G protein-coupled receptor protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for labeled SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone And (2) contacting a test compound and labeled SC-51322 or prostaglandin F2α 1,15-lactone with a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof. Measuring the amount of binding between labeled SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone and a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof when contacted with the above [1]. The described disk Ningu way,
[4] (1) SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone contains a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. (2) when the test compound and SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone are brought into contact with the cell containing the receptor protein or the cell membrane fraction thereof, Measuring the activity of inhibiting intracellular cAMP production, the screening method according to the above [1],
[5] Intracellular cAMP inhibitory activity when the test compound is contacted with a cell containing a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Screening method for an agonist for the receptor protein or a salt thereof, characterized by measuring
[6] The atomic coordinates of the active site and the position of the ligand binding pocket of a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, wherein the test compound has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A screening method according to the above [2] to [5], which is a compound designed to bind to a ligand binding pocket based on
[7] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) SC-51322 or prostaglandin A screening kit for a compound or a salt thereof, which comprises changing the binding property between the receptor protein or a salt thereof and a ligand to the receptor protein or a salt thereof, the kit comprising F2α 1,15-lactone;
[8] The same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, obtained by using the screening method according to any one of [1] to [5] or the screening kit according to [7]. A G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same amino acid sequence and a compound or a salt thereof that changes the binding property of a ligand to the receptor protein or a salt thereof;
[9] the compound of the above-mentioned [8], which is an agonist, or a salt thereof,
[10] the compound of the above-mentioned [8], which is an antagonist, or a salt thereof,
[11] The same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, obtained by using the screening method according to any one of [1] to [5] or the screening kit according to [7]. A pharmaceutical comprising a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same amino acid sequence and a compound or a salt thereof that alters the binding property of a ligand to the receptor protein or a salt thereof;
[12] The same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 obtained by using the screening method according to any one of the above [1] to [5] or the screening kit according to the above [7]. A prophylactic / therapeutic agent for anxiety comprising an agonist for a G protein-coupled receptor protein containing the same amino acid sequence or a salt thereof,
[13] The same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 obtained by using the screening method according to any one of [1] to [5] or the screening kit according to [7]. A prophylactic / therapeutic agent for a tumor or memory disorder, an LTP (long term potentiation) enhancer or a cognitive enhancer comprising an antagonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof having the same amino acid sequence;
[14] a prophylactic / therapeutic agent for anxiety comprising a small molecule synthetic agonist for a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
[15] the agent of the above-mentioned [14], wherein the low-molecular-weight synthetic agonist is SC-51322 or prostaglandin F2α 1,15-lactone;
[16] an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 obtained from a mammal using the screening method according to any one of [1] to [5] or the screening kit according to [7]; A method for preventing or treating anxiety, comprising administering an effective amount of an agonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as
[17] an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 obtained from a mammal using the screening method according to any one of [1] to [5] or the screening kit according to [7]; A method for preventing or treating tumors or memory disorders, comprising administering an effective amount of an antagonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as LTP (long term potentiation). ) Augmentation or intelligence methods,
[18] administering to a mammal an effective amount of a small molecule synthetic agonist for a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A method for preventing and treating anxiety, characterized by:
[19] SEQ ID NO: obtained by using the screening method according to any of [1] to [5] or the screening kit according to [7] for producing a prophylactic / therapeutic agent for anxiety. Use of an agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 1:
[20] The screening method according to any one of the above [1] to [5] or the above [[ 7] Use of an antagonist against a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is obtained using the screening kit described in the above, and
[21] A low-molecular-weight synthetic agonist for a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic / therapeutic agent for anxiety disorder Provide use and so on.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The G protein-coupled receptor protein (hereinafter sometimes abbreviated as mas) used in the present invention is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. .
mas is, for example, any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, pancreatic β cell, pancreatic Langerhans) of humans and mammals (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) Islets, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, Mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, Or progenitor cells of these cells, stem cells or cancer cells, etc.) or cells of the blood cell lineage, or any tissue in which these cells exist, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, Nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra, spinal cord, lower Pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood It may be a protein derived from peripheral blood cells, prostate, testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or may be a synthetic protein.
[0014]
As the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, about 85% or more, preferably 90% or more, more preferably about 95% or more as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 And the like.
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by 1 is preferred.
Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction effect. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
The activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction activity can be measured according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.
As mas, a) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Is an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids are deleted, b) one or more (preferably about 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 More preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids; c) one or more of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 An amino acid sequence in which two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids are substituted with other amino acids, or d) Those Proteins containing the combined amino acid sequences are also used.
[0015]
In the present specification, mas is the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end, according to the convention of peptide labeling. Mas, including mas containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, have carboxyl groups (—COOH) and carboxylate (—COO) at the C-terminus. − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR).
Here, R in the ester is, for example, C, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. 1-6 Alkyl groups such as C, cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 Cycloalkyl groups such as phenyl, α-naphthyl and the like; 6-12 Aryl groups, for example phenyl-C such as benzyl, phenethyl, etc. 1-2 An alkyl group or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as an alkyl group 7-14 In addition to aralkyl groups, pivaloyloxymethyl groups commonly used as oral esters are used.
When mas has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in mas. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the above-mentioned protein, the amino group of the N-terminal methionine residue has a protecting group (eg, formyl group, C 2-6 C such as alkanoyl group 1-6 Acyl group), a glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc. are suitable protecting groups (for example, formyl group, C 2-6 C such as alkanoyl group 1-6 (Eg, an acyl group), or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound. Specific examples of mas include, for example, human-derived mas having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, rat-derived mas having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the like.
[0016]
The partial peptide of mas may be any of the partial peptides of mas described above, but, for example, a portion of the mas protein molecule that is exposed outside the cell membrane and is substantially Those having the same receptor binding activity are used.
Specifically, the partial peptide of mas consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 was analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in hydrophobicity plot analysis. Peptide containing a moiety. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
The number of amino acids in the mas partial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the above-mentioned amino acid sequences constituting the receptor protein of the present invention.
A substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with these amino acid sequences.
Here, “substantially the same receptor activity” has the same meaning as described above. "Substantially the same receptor activity" can be measured in the same manner as described above.
[0017]
In the partial peptide of mas, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence are deleted, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acid sequence thereof One or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids therein may be substituted with another amino acid.
The partial peptide of mas has a carboxyl group (—COOH) and a carboxylate (—COO) at the C-terminus. − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR). When the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Further, similar to the above-mentioned mas, the partial peptide of mas has the amino group of the methionine residue at the N-terminus protected by a protective group, and Gln formed by cleavage of the N-terminal side in vivo has pyroglutamine oxidation. And those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
Examples of the salt of mas or its partial peptide include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
Mas or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cell or tissue by a method for purifying a receptor protein known per se, or a transformant containing a DNA encoding mas described below is cultured. Can also be manufactured. Further, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described later or according thereto.
When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
[0018]
For the synthesis of mas or its partial peptide, its salt or its amide, a commercially available resin for protein synthesis can be usually used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or its amide.
Regarding the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is previously activated as a symmetric acid anhydride or a HOBt ester or a HOOBt ester. After that, it can be added to the resin.
[0019]
The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond forming reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When a sufficient condensation cannot be obtained by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
[0020]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, tert-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, tertiary butoxy It can be protected by carbonylhydrazide, tritylhydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. As a group suitable for this esterification, for example, a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, and a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tert-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0021]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Esters with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. -Addition of a cation scavenger such as butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like is effective. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0022]
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is extended to a desired chain length on the amino group side, and A protein from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed and a protein from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminal has been removed, and these proteins are mixed in the above-mentioned mixed solvent. To condense. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. The crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
In order to obtain an ester of a protein, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, an ester of the desired protein is obtained in the same manner as the amide of the protein be able to.
[0023]
A partial peptide of mas or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving mas with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting mas with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following a) to e).
a) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) b) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
c) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
d) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemical Experiments 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
e) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten
After the reaction, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
[0024]
The polynucleotide encoding mas may be any polynucleotide containing a nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding mas described above. The polynucleotide is a DNA encoding mas, RNA such as mRNA, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the polynucleotide encoding mas, mas mRNA can be quantified by, for example, the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
The DNA encoding mas may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be carried out directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cells / tissues.
Specifically, the DNA encoding mas includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. It has a base sequence that hybridizes under high stringent conditions and has substantially the same activity as mas consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 (eg, ligand binding activity, signal information transmission) Any DNA may be used as long as it encodes a receptor protein having an action.
Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 include, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 And more preferably a DNA containing a base sequence having about 95% or more homology.
[0025]
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, the DNA encoding human-derived mas having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; As the DNA encoding rat-derived mas having the sequence, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and the like are used.
[0026]
A part of the nucleotide sequence of the DNA encoding mas or a polynucleotide containing a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA is not limited to the DNA encoding the partial peptide of the present invention described below. But also used to include RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting replication or expression of a mas gene is designed based on cloned or determined nucleotide sequence information of DNA encoding mas, Can be synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize to the RNA of the mas gene, inhibit the synthesis or function of the RNA, or inhibit the expression of the mas gene through interaction with mas-related RNA. It is useful for regulation and control, and is useful for treatment or diagnosis of diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 'end hairpin loop of mas gene, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation start codon, 3' end untranslated region, 3 ' The terminal palindrome region and the 3′-end hairpin loop can be selected as preferred regions of interest, but any region within the mas gene can be selected as the region of interest.
[0027]
The relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be "antisense" if the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide capable of hybridizing with the target is. Antisense polynucleotides include polydeoxynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polydeoxynucleotides containing D-ribose, N-glycosides of purine or pyrimidine bases and other types of polynucleotides. Other polymers with nucleotides or non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymers are found in DNA or RNA Base pairs and nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxic , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides) having side chain groups, interacting compounds (for example, acridine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
[0028]
The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
Thus, many modifications are known in the art, for example, J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, crude water-based substances such as phospholipid and cholesterol can be used. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of an antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a G protein-coupled receptor protein. it can. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
The siRNA against the polynucleotide of the present invention is a double-stranded RNA containing a part of RNA encoding mas and RNA complementary thereto.
The siRNA can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
A ribozyme containing a part of RNA encoding mas is designed based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). Can be manufactured. For example, it can be produced by substituting a part of a known ribozyme sequence with a part of RNA encoding mas. As a part of the RNA encoding mas, a sequence near a consensus sequence NUX (where N represents all bases and X represents a base other than G) which can be cleaved by a known ribozyme, and the like can be mentioned.
[0029]
The DNA encoding the mas partial peptide may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the mas partial peptide described above. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the above-described cells / tissues, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
Specifically, the DNA encoding the partial peptide of mas includes, for example, (1) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or (2) It has a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions, and substantially consists of mas comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 For example, a DNA having a partial base sequence of a DNA encoding a receptor protein having the same activity (eg, ligand binding activity, signal information transduction action) can be used.
The DNA capable of hybridizing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 includes, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. More preferably, DNA containing a base sequence having about 95% or more homology is used.
[0030]
As a means for cloning DNA that completely encodes mas or a partial peptide thereof (hereinafter sometimes abbreviated as mas), amplification by PCR using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of mas, or The DNA incorporated in an appropriate vector can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of mas or labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
Conversion of the DNA base sequence can be performed by PCR or a known kit, for example, Mutan. TM -Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM Using -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) or the like, it can be carried out according to a method known per se such as the ODA-LA PCR method, the Gapped Duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The cloned DNA encoding mas can be used as it is, or as desired, after digestion with a restriction enzyme or adding a linker. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
A mas expression vector can be produced, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding mas, and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. it can.
[0031]
Examples of the vector include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Among these, it is preferable to use the CMV promoter, SRα promoter and the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λP L When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an SPO1 promoter, an SPO2 promoter, a penP promoter, and the like are preferable. When the host is a yeast, a PHO5 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
[0032]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. Examples of the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r Neomycin resistance gene (hereinafter Neo). r G418 resistance). In particular, CHO (dhfr − ) When the dhfr gene is used as a selection marker using cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. When the host is a genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
Using the vector containing the DNA encoding mas thus constructed, a transformant can be produced.
[0033]
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12.DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology] 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] and the like are used. .
Examples of the Bacillus genus include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. )] Is used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22 and AH22R. − , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris, and the like.
[0034]
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High Five derived from eggs of Trichoplusia ni TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter CHO (dhfr). − ) Cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
[0035]
In order to transform Escherichia, for example, Procagings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 ( 1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Procesings of the National Academy of Sciences of Science -The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, Vol. 52, 456 (1973).
Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding mas is obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and among them, a carbon source necessary for growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.As a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
[0036]
As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3β-indolyl acrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, as a medium, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Sciences of Science] Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] or an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Processings of the National. Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and / or agitation are added as necessary.
[0037]
When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the medium may be 10% bovine serum immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). And the like, to which the additives described above are appropriately added. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] and the like are used. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
As described above, mas can be generated in the cells, the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
[0038]
The mas can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
When mas is extracted from the cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. Alternatively, a method of obtaining a crude extract of mas by centrifugation or filtration after disrupting the cells is used as appropriate. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. TM And the like. When mas is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the mas contained in the culture supernatant or extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography And a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing.
[0039]
When the mas thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, a method known per se or a method analogous thereto Can be converted to a free form or another salt.
The mas produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
The activity of the mas thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
[0040]
The antibody against mas may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize mas.
An antibody against mas can be produced by using mas as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
mas is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody upon administration, itself or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual having an antibody titer was selected from a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Incubation at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes allows efficient cell fusion.
[0041]
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which the antigen of the receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactively. A method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A labeled with a substance or enzyme, A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a receptor protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. .
The selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
(B) Purification of monoclonal antibody
Monoclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which an antibody alone is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. Can be performed according to
[0042]
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (mas antigen) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. Can be produced by separation and purification of
Regarding a complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a mammal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten should be such that the antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by crosslinking the carrier. Any kind may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 20 with respect to 1 hapten. Preferably, a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
[0043]
Substances that exhibit an agonistic effect on mas include SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone. In the present invention, as long as SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone, a substance (including a natural ligand and a low-molecular-weight synthetic agonist) that exhibits an agonistic activity on mas can be used in the same manner. . Substances that exhibit agonist activity against these mas can be obtained by using the agonist screening method described below.
Hereinafter, these substances (including natural ligands) that exhibit agonist activity against mas are abbreviated as “mas agonist”.
[0044]
(1) A preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with mas dysfunction
DNA encoding a) mas agonist, b) mas or c) mas (masDNA) can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of mas.
For example, when there is a patient in whom the physiological action of mas ligand cannot be expected (mas ligand or mas deficiency) due to a decrease in mas ligand or mas in a living body, a) administration of mas agonist or mas to the patient Then, the amount of the mas agonist or mas is supplemented, b) (a) administration of masDNA to the patient to allow expression thereof, or (b) insertion of masDNA into target cells and expression thereof, By transplanting cells into the patient, the amount of mas agonist or mas in the body of the patient can be increased, and the effect of mas can be sufficiently exerted. That is, the mas agonist, mas or masDNA is useful as an agent for preventing and / or treating a safe and low-toxic disease associated with dysfunction of mas.
Specifically, a mas agonist, mas or masDNA can be used, for example, as a prophylactic or therapeutic agent for anxiety.
When a mas agonist or mas is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when masDNA is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention is used alone or after insertion into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. can do. The masDNA can be administered as it is or together with an auxiliary for promoting uptake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
For example, a) a mas agonist, b) mas or c) mas DNA can be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, if necessary, or pharmaceutically or water-free. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with an acceptable liquid, or an injection such as a suspension. For example, a) a mas agonist, b) mas or c) mas DNA can be used in the practice of generally accepted formulations with known physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be manufactured by mixing in the required unit dosage form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
[0045]
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0046]
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
For example, the dose of a mas agonist or mas varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in an anxiety patient (as 60 kg), the daily dose is generally one day. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of an injection, for example, in an anxiety patient (as 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
The dosage of masDNA varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in general, for example, in an anxiety patient (60 kg), about 0.1 per day is used. -100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of an injection, for example, in an anxiety patient (as 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
[0047]
(2) Gene diagnostic agent
MasDNA, antisense DNA against masDNA (hereinafter, mas antisense DNA) and siRNA against mas (hereinafter, mas siRNA) can be used as probes to obtain human or mammal (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig). , Cats, dogs, monkeys, etc.), the abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding mas or a partial peptide thereof can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA. Also, it is useful as a diagnostic agent for genes such as an increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
The above-mentioned genetic diagnosis using masDNA, mas antisense DNA or mas siRNA can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, 5, 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) be able to.
For example, when a decrease in the expression of mas is detected by Northern hybridization, it is diagnosed that, for example, the disease is likely to be a disease associated with dysfunction of mas (eg, anxiety) or is likely to be contracted in the future. be able to.
In addition, when overexpression of mas is detected by Northern hybridization, for example, diseases caused by overexpression of mas (for example, tumors (prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, gastric cancer, lung cancer, bladder cancer, Malignant tumors such as breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), memory impairment) or a high possibility of future disease.
[0048]
(3) A medicine containing a compound that changes the expression level of mas
MasDNA can be used for screening for a compound that changes the expression level of mas by using it as a probe.
That is, the present invention relates to, for example, (a) non-human mammal a) blood, b) a specific organ, c) tissue or cell isolated from an organ, or (ii) mas contained in a transformant or the like. Provided is a method for screening a compound that changes the expression level of mas by measuring the amount of mRNA.
The measurement of the amount of mas mRNA is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained.
The mRNA of mas contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a usual method and using, for example, a technique such as TaqMan PCR, and Northern blotting by a method known per se. The analysis can also be performed by performing.
(Ii) A transformant expressing mas is prepared according to the above method, and the mRNA of mas contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.
[0049]
Screening for a compound that alters the expression level of mas
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or at the same time as the drug or physical stress. And after a certain period of time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the amount of mas mRNA contained in the cells is quantified, Can be done by analyzing
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) Days after), the amount of mas mRNA contained in the transformant can be quantified and analyzed.
[0050]
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the expression level of mas. Specifically, (a) increasing the expression level of mas Cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ In particular, the activity of promoting or inhibiting release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, decrease of pH, etc. Inhibitory activity of intracellular cAMP production or intracellular Ca 2+ And (b) a compound that decreases the expression level of mas, thereby attenuating the cell stimulating activity.
Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
The compound that alters the expression level of mas obtained by the above screening method can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of mas (eg, anxiety).
Specifically, compounds that increase the expression level of mas are useful as safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agents for diseases associated with dysfunction of mas (eg, anxiety).
Compounds that decrease the expression level of mas are used for diseases caused by excessive expression of mas (eg, tumors (prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer) And malignant tumors such as rectal cancer and colorectal cancer), safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agents for memory impairment, LTP (long term potentiation) enhancers, and cognitive enhancers.
[0051]
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0052]
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
For example, the dose of a compound that increases the expression level of mas or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, in general, for example, an anxiety patient (60 kg ), The amount is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of an injection, for example, in an anxiety patient (as 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
For example, the dose of a compound or a salt thereof that reduces the expression level of mas varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, generally, for example, a patient with a memory disorder (60 kg ), The amount is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. For example, in the case of an injection, it is usually used, for example, in a memory-impaired patient (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
[0053]
(4) Method for quantifying and diagnosing mas
Since an antibody against mas (hereinafter, mas antibody) can specifically recognize mas, it can be used for quantification of mas in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
That is, the present invention
(I) reacting the mas antibody with the test solution and the labeled mas competitively, and measuring the ratio of the labeled mas bound to the antibody to the mas in the test solution; Quantification method, and
(Ii) reacting a test solution with a mas antibody insolubilized on a carrier and another labeled mas antibody simultaneously or continuously, and then measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier. The present invention provides a method for quantifying mas in a test solution.
[0054]
In the quantitative method (ii), it is preferable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of mas and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of mas.
In addition, mas can be quantified using a monoclonal antibody against mas, and detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, and the F (ab ') 2 , Fab ′ or Fab fraction may be used.
The method for quantifying mas using a mas antibody is not particularly limited, and the amount of an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of an antigen (eg, the amount of mas) in a liquid to be measured is determined chemically or Any measurement method may be used as long as it is detected by physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
[0055]
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] is used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
For the insolubilization of the antigen or the antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing mas or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of mas in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In addition, in the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
[0056]
In the method for measuring mas by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different site to which mas binds is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of mas, the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal. In addition, for example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble sediment produced as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. A mas measurement system may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Third Edition), 3rd edition (Medical Shoin, Showa) Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies). Academic Press Issue) and the like can be referred to.
As described above, mas can be quantified with high sensitivity by using the mas antibody.
[0057]
Furthermore, if a decrease in the concentration of mas is detected by quantifying the concentration of mas using a mas antibody, the disease may be a disease associated with dysfunction of mas (eg, anxiety), or a disease that may occur in the future. It can be diagnosed that there is a high possibility of performing.
When an increase in the concentration of mas is detected, for example, a disease caused by overexpression of mas (for example, a tumor (prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, breast cancer, Malignant tumors such as cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), memory impairment), or the likelihood of future disease.
[0058]
(5) Method for screening mas agonist
The binding of SC-51322 or prostaglandin F2α 1,15-lactone to mas suppresses intracellular cAMP production or intracellular Ca. 2+ Since the promotion of release is observed, mas is used to search or determine an agonist (including a natural ligand for mas) other than SC-51322 or prostaglandin F2α 1,15-lactone for mas using this intracellular signal as an index. It is useful as a reagent.
That is, the present invention provides a mas-mediated inhibitory activity on cAMP production in a cell or intracellular Ca when a test compound is brought into contact with a cell containing mas. 2+ Provided is a method for determining a mas agonist, which comprises measuring the release promoting activity. Test compounds include known ligands (eg, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP (eg, PACAP27, PACAP38), secretin, Glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Related Polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide) ), Leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline And chemokine superfamily (eg, CXC chemokine subfamily such as IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, GCP-2, PF4, IP-10, Mig, PBSF / SDF-1; MCAF / MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, HCC-1, MIP-3α / LARC, MIP-3β / ELC, I-309, TARC , MIPF-1, MIPF-2 / eotaxin-2, MDC, DC-CK1 / PARC, CC chemokine subfamily such as SLC; C chemokine subfamily such as lymphotoactin; CX3C chemokine subfamily such as fractionalkine, etc.), endothelin, entero Gust Histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine 1-phosphate, etc.), as well as, for example, humans or mammals (eg, mice, rats, pigs, Tissue extracts of bovine, ovine, monkey, etc.), cell culture supernatants, low molecular weight synthetic compounds and the like are used. For example, the tissue extract, cell culture supernatant, or the like is added to mas, and fractionation is performed while measuring cell stimulating activity and the like, so that a single ligand can be finally obtained.
[0059]
Specifically, the agonist determination method of the present invention comprises constructing a recombinant mas expression system and using a receptor binding assay system using the expression system, thereby suppressing mas-mediated intracellular cAMP production inhibitory activity or cell expression. Inner Ca 2+ This is a method for determining a compound having a release promoting activity or a salt thereof.
More specifically, the present invention provides the following determination method.
(1) Intracellular cAMP production inhibitory activity or intracellular Ca when a test compound is brought into contact with cells containing mas 2+ A method for determining a mas agonist, which comprises measuring a release promoting activity, and
(2) Inhibition activity of mas-mediated intracellular cAMP production or intracellular Ca when a test compound is brought into contact with mas expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing masDNA 2+ Provided is a method for determining a mas agonist, which comprises measuring the release promoting activity.
In particular, it is preferable to conduct the above test after confirming that the test compound binds to mas.
[0060]
When cells containing mas are used in the method for determining an agonist of the present invention, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
The mas-containing cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by crushing cells and then obtained by a known method. As a method for crushing cells, a method of crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, spouting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press, etc. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed mas and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
[0061]
The amount of mas in cells containing mas and the cell membrane fraction thereof is 10 / cell. 3 -10 8 Preferably a molecule 5 -10 7 Preferably it is a molecule. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
In order to carry out the agonist determination method of the present invention, the activity of inhibiting cAMP production in cells via mas can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing mas are cultured in a multiwell plate or the like. Before determining the agonist, replace with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, extract the cells or collect the supernatant, The quantified product is quantified according to each method. Substances used as indicators of cell stimulating activity (for example, cAMP, Ca 2+ , Etc.) is difficult to assay due to the effect of a degrading enzyme contained in the cells, the assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like.
The kit for determining an agonist of the present invention contains cells containing mas or a cell membrane fraction thereof.
Since the mas agonist determined in this way binds to mas and regulates its physiological function, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases related to mas function (for example, anxiety).
[0062]
(6) Screening method for compounds (agonists, antagonists, etc.) that alter the binding between mas and mas ligand, and pharmaceuticals containing compounds that alter the binding between mas and mas ligand
By using SC-51322 or prostaglandin F2α 1,15-lactone (mas ligand of the present invention) in place of the natural ligand for mas (mas ligand), compounds that alter the binding between mas and mas ligand are screened. be able to.
That is, a compound (for example, peptide) that changes the binding between mas and a mas ligand by using mas or by constructing a recombinant mas expression system and using a receptor binding assay system using the expression system. , Proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be efficiently screened.
Such compounds include (a) a compound having a cell stimulating activity via mas (a so-called mas agonist), (b) a compound not having the cell stimulating activity (a so-called mas antagonist), and (c) a ligand. The compound of the present invention that enhances the binding force to mas, or (d) the compound that decreases the binding force of ligand to mas of the present invention, and the like are included.
Cell stimulating activity includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. In particular, the inhibitory activity of intracellular cAMP production or intracellular Ca 2+ Release promoting activity is preferred.
That is, the present invention is characterized by comparing (i) the case where mas is contacted with the mas agonist of the present invention and (ii) the case where mas is contacted with the mas agonist and the test compound of the present invention. The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the binding between mas ligand and mas.
The screening method of the present invention is characterized by, for example, measuring and comparing the amount of the mas antagonist of the present invention to mas, the cell stimulating activity, and the like in the cases (i) and (ii).
[0063]
More specifically, the present invention provides
a) Amount of binding of labeled mas agonist of the present invention to mas when mas is contacted with a labeled mas agonist of the present invention and when mas is contacted with a labeled mas agonist of the present invention and a test compound A method of screening for a compound or a salt thereof that alters the binding property between mas ligand and mas, comprising measuring and comparing
b) When the labeled mas agonist of the present invention is brought into contact with a mas-containing cell or a membrane fraction of the cell, and when the labeled mas agonist and a test compound of the present invention are contacted with a mas-containing cell or a membrane of the cell Measuring the amount of the labeled mas agonist of the present invention bound to the cell or the membrane fraction when contacted with the fraction, and comparing the measured amount with the mas ligand and the mas ligand. Or a method of screening for a salt thereof,
c) When the labeled mas agonist of the present invention is brought into contact with mas expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing masDNA, and when the labeled mas agonist of the present invention and the test compound contain masDNA. When the transformant is cultured and brought into contact with mas expressed on the cell membrane, the amount of the labeled mas agonist of the present invention bound to mas is measured and compared with the mas ligand and mas. A method for screening a compound that changes binding property or a salt thereof,
[0064]
d) When a compound that activates mas (for example, a mas agonist of the present invention) is brought into contact with cells containing mas, and when a compound that activates mas and a test compound are brought into contact with cells containing mas A method of screening for a compound or a salt thereof that alters the binding between mas ligand and mas, wherein the mas-mediated cell stimulating activity is measured and compared.
e) When a compound that activates mas (for example, the mas agonist of the present invention) is brought into contact with mas expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing masDNA, and a compound that activates mas And measuring and comparing the receptor-mediated cell stimulating activity when the test compound is brought into contact with mas expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing masDNA, and comparing the mas ligand with mas. To provide a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding to a compound.
Furthermore, using the compound obtained by the above-mentioned screening method or a salt thereof as a mas ligand, the screening method of the present invention can also be performed.
[0065]
The specific description of the screening method of the present invention is as follows.
First, as the mas used in the screening method of the present invention, a cell membrane fraction of a mammalian organ containing mas is suitable. However, since it is extremely difficult to obtain human-derived organs, human-derived mas and the like, which are expressed in large amounts using recombinants, are suitable for screening.
[0066]
The above-mentioned method is used for producing mas, but it is preferably carried out by expressing masDNA in mammalian cells or insect cells. A complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. In order to introduce the mas-encoding DNA fragment of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be converted to a nuclear polyhedrosis virus (nuclear polyhedrosis virus; It is preferable to incorporate the promoter into the downstream of the polyhedrin promoter of NPV), the promoter derived from SV40, the retrovirus promoter, the metallothionein promoter, the human heat shock promoter, the cytomegalovirus promoter, the SRα promoter and the like. The quantity and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P .; Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
Therefore, in the screening method of the present invention, mas may be mas purified according to a method known per se, a mas-containing cell may be used, or a membrane fraction of a mas-containing cell may be used. May be used.
[0067]
When cells containing mas are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
The cell containing mas refers to a host cell expressing the mas, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like. The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. The cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or squirting the cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed mas and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of mas in cells containing mas or in the membrane fraction was 10 per cell. 3 -10 8 Preferably a molecule 5 -10 7 Preferably it is a molecule. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
[0068]
In order to carry out the above a) to c) for screening for a compound that alters the binding between mas ligand and mas, for example, an appropriate mas fraction and a labeled mas agonist of the present invention are required.
As the mas fraction, a natural mas fraction or a recombinant mas fraction having an activity equivalent thereto is desirable. Here, “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
As the labeled mas agonist of the present invention, a labeled mas agonist of the present invention, a labeled mas agonist analog compound of the present invention, or the like is used. For example, [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like, the mas agonist of the present invention or the like is used.
Specifically, to screen for a compound that alters the binding between mas ligand and mas, cells containing mas or a membrane fraction of cells are first suspended in a buffer suitable for screening by mas. Prepare a standard. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding of the mas agonist of the present invention to mas, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer. Further, in order to reduce non-specific binding, CHAPS, Tween-80 are used. TM Surfactants such as (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, a protease inhibitor such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor by the protease. To 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution, a fixed amount (5000 cpm to 500,000 cpm) of the labeled mas agonist of the present invention is added, and -4 M-10 -10 M test compounds are allowed to coexist. A reaction tube containing a large excess of an unlabeled mas agonist of the present invention is also prepared to determine the non-specific binding amount (NSB). The reaction is carried out at about 0-50 ° C, preferably about 4-37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist (B 0 ) Minus the amount of non-specific binding (NSB) (B 0 -NSB) as 100%, a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
[0069]
In order to carry out the above methods d) to e) of screening for a compound that alters the binding between mas ligand and mas, for example, a known method or a commercially available kit for measuring mas-mediated cell stimulating activity can be used. It can be measured using:
Specifically, first, cells containing mas are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, the cells were exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that does not show toxicity to cells, and a test compound was added and incubated for a certain period of time. The product is quantified according to the respective method. Substances used as indicators of cell stimulating activity (for example, cAMP, Ca 2+ , Etc.) is difficult to assay due to the effect of a degrading enzyme contained in the cells, the assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing an appropriate mas are required. As a cell expressing mas, a cell line having a natural mas, a cell line expressing a recombinant mas, and the like are desirable.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound. Further, as the test compound, a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of mas and the position of the ligand binding pocket is preferably used. The measurement of the atomic coordinates of the active site of mas and the position of the ligand binding pocket can be performed using a known method or a method analogous thereto.
[0070]
Screening kits for compounds or salts thereof that alter the binding between mas ligand and mas include those containing mas, cells containing mas or the membrane fraction of cells containing mas.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagent
a) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) supplemented with 0.05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C., or may be prepared at use.
b) mas standard
CHO cells expressing mas were placed in a 12-well plate at 5 × 10 5 5 Passage at 37 ° C, 5% CO 2 , Cultured at 95% air for 2 days.
c) Labeled ligand
Commercially available [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S], etc. of the mas agonist of the present invention
The aqueous solution is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer before use.
d) Ligand standard solution
The mas agonist of the present invention is dissolved to a concentration of 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
[0071]
2. Measurement method
a) The mas-expressing CHO cells of the present invention cultured on a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and then 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
b) 10 -3 -10 -10 After adding 5 μl of the M test compound solution, 5 μl of the labeled mas agonist of the present invention is added, and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 10 -3 5 μl of M mas agonist of the present invention is added.
c) Remove the reaction solution and wash three times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
d) Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B-NSB) / (B 0 −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample was added
NSB: Non-specific Binding
B 0 : Maximum binding amount
[0072]
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between mas ligand and mas, and specifically, (a) via mas A compound having a cell stimulating activity (a so-called mas agonist); (b) a compound having no cell stimulating activity (a so-called mas antagonist); ) A compound that reduces the binding force between mas ligand and mas.
Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
Further, the compound may be a compound designed based on the atomic coordinates of the active site of mas and the position of the ligand binding pocket.
Mas agonists are useful as safe and low toxic drugs because they can activate mas.
Since mas antagonists can suppress the physiological activity of mas ligand, they are useful as safe and low-toxic drugs for suppressing the physiological activity of mas ligand.
A compound that enhances the binding force between a mas ligand and mas can enhance the physiological activity of the mas ligand, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity of the mas ligand.
A compound that decreases the binding force between mas ligand and mas can reduce the physiological activity of the mas ligand, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the mas ligand.
Specifically, a compound or a salt thereof that enhances the binding force between (1) a mas agonist or (2) mas ligand and mas obtained using the screening method or the screening kit of the present invention includes, for example, anxiety disorder It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases of the disease.
Compounds or salts thereof that decrease the binding force between (1) mas antagonist or (2) mas ligand and mas obtained using the screening method or screening kit of the present invention can be used, for example, for diseases such as tumors or memory disorders. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent, LTP enhancer, and cognitive enhancer.
[0073]
A compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound or a salt thereof that alters the expression level of mas, a drug such as another drug for the above-mentioned disease (hereinafter abbreviated as a concomitant drug). May be used in combination. At this time, the administration time of the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention and the concomitant drug is not limited, and these may be administered simultaneously to the subject to be administered, or with a time lag. May be administered. The dose of the concomitant drug can be appropriately selected based on the clinically used dose. In addition, the compounding ratio of the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention and the concomitant drug can be appropriately selected depending on the administration subject, administration route, target disease, symptom, combination and the like. For example, when the administration subject is a human, for example, 0.01 to 100 parts by weight of the concomitant drug may be used for 1 part by weight of the agonist.
[0074]
When the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0075]
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
For example, the dose of a mas agonist varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in general, for example, in an anxiety patient (as 60 kg), about The amount is 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of an injection, for example, in an anxiety patient (as 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
[0076]
(7) Elucidation of the mechanism of action of various drugs
By using mas, it is possible to confirm whether or not various drugs exert pharmacological effects via mas.
That is, the present invention
(1) Characterized by using mas, (1) LTP enhancer, (2) Nootropic agent, (3) Antitumor drug, (4) Remedies for memory impairment or (5) Antianxiety drug becomes mas How to make sure they join
(2) A method for confirming that a (1) LTP enhancer, (2) a cognitive stimulant, (3) an antitumor agent, and (4) a therapeutic agent for memory impairment is a mas antagonist, characterized by using mas. ,
(3) a method of confirming that the anxiolytic is a mas agonist, characterized by using mas,
(4) The screening method according to any one of (1) to (3) above, wherein the amount of binding between each drug and mas when each drug is brought into contact with mas is measured.
This confirmation method can be performed by using the above-mentioned drug in place of the test compound in the above-mentioned method for screening a compound that changes the binding property between mas ligand and mas.
The kit for a confirmation method of the present invention is the above-mentioned kit for screening a compound that alters the binding property between mas ligand and mas, and contains the above drug in place of the test compound.
As described above, by using the confirmation method of the present invention, it is possible to confirm that various drugs that are commercially available or are under development exert pharmacological effects through mas.
[0077]
(8) A medicine containing a compound that changes the amount of mas or its partial peptide in the cell membrane
Since the mas antibody can specifically recognize mas, it can be used for screening for a compound that changes the amount of mas in the cell membrane.
That is, the present invention, for example,
(I) a) the blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) the tissue or cells isolated from the organ are destroyed, and then the cell membrane fraction is isolated and the mas contained in the cell membrane fraction is determined. Screening method for a compound that alters the amount of mas in a cell membrane,
(Ii) a method for screening a compound that alters the amount of mas in a cell membrane by disrupting a mas-expressing transformant or the like, isolating a cell membrane fraction, and quantifying mas contained in the cell membrane fraction;
(Iii) a non-human mammal a) blood, b) a specific organ, c) a tissue or a cell isolated from the organ, sectioned, and then the receptor on the cell surface by immunostaining. The present invention provides a method for screening a compound that changes the amount of mas in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the protein.
(Iv) After transforming the mas-expressing transformant, etc., the protein is identified on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface using immunostaining. A method of screening for a compound that alters the amount of mas in the cell membrane.
[0078]
The quantification of mas contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hepes buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is destroyed. Activator (eg, Triton X100 TM , Tween 20 TM And the like, and further using a method such as centrifugation, filtration, or column fractionation to obtain a cell membrane fraction.
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. The cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or squirting the cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed mas and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The mas contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, a sandwich immunoassay using a mas antibody, Western blot analysis, or the like.
Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se.
(Ii) A transformant expressing mas is prepared according to the method described above, and mas contained in the cell membrane fraction can be quantified.
[0079]
Screening for compounds that alter the amount of mas in the cell membrane
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or at the same time as the drug or physical stress. And after a certain period of time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the amount of mas in the cell membrane is determined. It is possible,
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) A day later) by quantifying the amount of mas in the cell membrane.
The confirmation of mas contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(Iii) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using a mas antibody. By quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface, the amount of the mas of the present invention in the cell membrane can be quantitatively or qualitatively confirmed by confirming the protein on the cell membrane. .
(Iv) It can also be confirmed by using a similar method using a transformant expressing mas.
[0080]
The compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is a compound having an action of changing the amount of mas in the cell membrane. Specifically, (a) by increasing the amount of mas in the cell membrane, (b) a compound that reduces the amount of mas in the cell membrane to thereby reduce the cell stimulating activity.
Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
A compound that enhances cell stimulating activity by increasing the amount of mas in the cell membrane is useful as a safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of mas (eg, anxiety).
Compounds that attenuate the cell stimulating activity by decreasing the amount of mas in the cell membrane are used for diseases caused by overexpression of mas (eg, tumors (prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, lung cancer, bladder cancer). And malignant tumors such as breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), memory disorders), safe and low toxic prophylactic / therapeutic agents, LTP enhancers, and cognitive agents.
Further, it can be used in combination with the above-mentioned concomitant drug.
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
[0081]
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
For example, the dose of a compound or a salt thereof that increases the amount of mas in the cell membrane varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, in general, for example, an anxiety patient ( (As 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of an injection, for example, in an anxiety patient (as 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
[0082]
(9) A medicine containing an antibody against mas
The neutralizing activity of an antibody against mas (mas antibody) means an activity of inactivating a signal transduction function involving mas. Therefore, when the antibody has neutralizing activity, it can inactivate mas-related signal transduction, for example, mas-mediated cell stimulating activity.
Therefore, neutralizing antibodies against mas can be used for diseases caused by overexpression of mas (eg, tumors (prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, gastric cancer, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer) And malignant tumors such as rectal cancer and colorectal cancer) and memory disorders).
Further, it can be used in combination with the above-mentioned concomitant drug.
[0083]
(10) A medicine containing mas antisense DNA or mas siRNA
Mas antisense DNA or mas siRNA can be used for diseases caused by overexpression of mas (eg, tumors (prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, gastric cancer, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer) And malignant tumors such as rectal cancer and colorectal cancer) and memory disorders). Further, it can be used in combination with the above-mentioned concomitant drug.
For example, when mas antisense DNA or mas siRNA is used, mas antisense DNA or mas siRNA is inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by conventional means. Can be implemented. The mas antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, mas antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of masDNA in tissues and cells.
[0084]
(11) Preparation of masDNA-introduced animal
The present invention provides a non-human mammal having exogenous masDNA (hereinafter abbreviated as exogenous masDNA) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as an exogenous mutated masDNA).
That is, the present invention
[1] a non-human mammal having exogenous masDNA or a mutant DNA thereof,
[2] the animal of [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[3] the animal of [2], wherein the rodent is a mouse or a rat, and
[4] It is to provide a recombinant vector containing exogenous masDNA or its mutant DNA and capable of being expressed in mammals.
Non-human mammals having exogenous masDNA or its mutant DNA (hereinafter abbreviated as masDNA transgenic animals) are preferably used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. During the stage of embryonic development in human mammal development (more preferably, at the stage of a single cell or a fertilized egg and generally before the 8-cell stage), a calcium phosphate method, an electric pulse method, a lipofection method, an agglutination method, a microinjection method, a particle gun It can be produced by transferring the target DNA by the method, DEAE-dextran method or the like. In addition, by the DNA transfer method, an exogenous masDNA of interest can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. A masDNA transgenic animal can also be created by fusing cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) B6C3F as a system 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD etc.) is preferred.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
[0085]
The exogenous masDNA is not the masDNA originally possessed by the non-human mammal but refers to the masDNA once isolated and extracted from the mammal.
As the mutated masDNA, those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original masDNA, specifically, DNA in which addition or deletion of a base, substitution with another base, or the like has occurred are used. And also includes abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses abnormal mas, and for example, a DNA that expresses mas that suppresses the function of normal mas is used.
The exogenous masDNA may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. In transferring masDNA to a target animal, it is generally advantageous to use masDNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when transferring human masDNA, downstream of various promoters capable of expressing DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having masDNA highly homologous thereto. Then, a DNA construct (eg, a vector, etc.) to which human masDNA is bound is microinjected into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg, whereby a DNA-transferred mammal that highly expresses masDNA can be produced.
[0086]
As a mas expression vector, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as λ phage, a retrovirus such as Moloney leukemia virus, an animal virus such as vaccinia virus or baculovirus, etc. are used. Can be Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, but are not limited to, promoters for DNA derived from (1) viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, polio virus, etc.); ▼ Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophy Fin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin , Α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α Aku Down, pre-pro-enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal (generally called a terminator). For example, a sequence of each DNA derived from a virus and various mammals can be used. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.
[0087]
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region or in the translation region for the purpose of further expressing the desired exogenous masDNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal mas translation region may be derived from human, various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts, and various commercially available genomes. From the DNA library, it is possible to obtain the whole or a part of the genomic DNA, or the complementary DNA prepared from the liver, kidney, thyroid cells and fibroblast-derived RNA by a known method as a raw material. In addition, a foreign abnormal masDNA can produce a translation region obtained by mutating a normal mas translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of exogenous masDNA at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal. The presence of exogenous masDNA in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all progeny of the produced animal will retain the exogenous masDNA in all of their germ cells and somatic cells. The offspring of such animals that have inherited the exogenous masDNA will have the exogenous masDNA in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal by confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
Transfer of exogenous masDNA at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of exogenous masDNA in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all of the offspring of the produced animal will have excess exogenous masDNA in all of its germ cells and somatic cells. Progeny of such animals that have inherited the exogenous masDNA have an excess of the exogenous masDNA in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
[0088]
Non-human mammals having a normal masDNA may have a high expression of the normal masDNA, and may eventually develop the mas hyperfunction of the present invention by promoting the function of the endogenous normal masDNA, It can be used as a disease model animal. For example, by using a normal masDNA transgenic animal, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of mas and mas-related diseases and to examine a method for treating these diseases.
In addition, mammals to which exogenous normal DNA has been transferred have increased symptoms of free mas, and thus can be used for screening tests for therapeutic drugs for mas-related diseases.
On the other hand, a non-human mammal having an exogenous abnormal DNA can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous masDNA is stably maintained by mating. Further, the desired exogenous masDNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a source material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of abnormal masDNA at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal masDNA in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The offspring of such animals that have inherited the exogenous masDNA have the abnormal DNA of the invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
[0089]
Non-human mammals having an abnormal masDNA, in which the abnormal masDNA is highly expressed, may eventually become a mas function inactive refractory disease by inhibiting the function of endogenous normal masDNA. It can be used as a disease model animal. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of mas-function inactive refractory disease and to examine a method for treating this disease using an abnormal masDNA transgenic animal.
In addition, as a specific possibility, an abnormal masDNA-expressing animal serves as a model for elucidating the inhibition of mas function (dominant negative action) by the abnormal mas in mas inactive refractory disease.
In addition, since a mammal to which a foreign abnormal masDNA has been transferred has an increased symptom of free mas, it can be used for a therapeutic drug screening test for mas or a functionally inactive refractory disease.
In addition, other possible uses of the above two masDNA transgenic animals include, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) Mas DNA by directly analyzing DNA or RNA in the tissues of transgenic animals, or by analyzing mas tissues expressed by DNA, for the relationship with mas specifically expressed or activated by mas. analysis,
{Circle around (3)} The cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture.
(4) screening for a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in (3) above, and
{Circle around (5)} Isolation and purification of the mutant mas and production of its antibody can be considered.
Furthermore, the masDNA-transferred animal can be used to examine clinical symptoms of mas-related diseases, including mas-inactive refractory disease, etc., and to obtain more detailed information on each organ of a mas-related disease model in each organ. The pathological findings can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from a masDNA transgenic animal, cut it into small pieces, and then use a proteolytic enzyme such as trypsin to obtain the released DNA transfected cells, culture them, or systematize the cultured cells. Furthermore, it is possible to investigate the specification of mas-producing cells, their relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or their signal transduction mechanisms, and to investigate their abnormalities, etc., which is an effective research material for elucidating mas and its effects. It becomes.
Furthermore, in order to develop a therapeutic agent for mas-related diseases, including mas-function inactive refractory disease, using masDNA-transferred animals, an effective and rapid method using the above-described test method and quantitative method is used. It is possible to provide a screening method for a therapeutic agent for such diseases. In addition, using a masDNA transgenic animal or an exogenous masDNA expression vector, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for mas-related diseases.
[0090]
(12) Knockout animal
The present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which masDNA is inactivated and a non-human mammal deficient in masDNA expression.
That is, the present invention
[1] a non-human mammalian embryonic stem cell in which masDNA has been inactivated,
[2] the embryonic stem cell according to [1], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
[3] the embryonic stem cell according to [1], which is neomycin-resistant;
[4] the embryonic stem cell according to [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[5] the embryonic stem cell of [4], wherein the rodent is a mouse;
[6] a non-human mammal deficient in expression of the DNA in which masDNA is inactivated,
[7] The DNA according to [6], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for masDNA. Non-human mammals,
[8] the non-human mammal according to [6], wherein the non-human mammal is a rodent;
[9] the non-human mammal of [8], wherein the rodent is a mouse, and
[10] A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity against masDNA, comprising administering a test compound to the animal according to item [7] and detecting the expression of a reporter gene. .
A non-human mammalian embryonic stem cell in which masDNA has been inactivated refers to a DNA that suppresses the expression ability of DNA by artificially mutating masDNA of the non-human mammal, or encodes the DNA. By substantially losing the activity of the mas of the present invention, a non-human mammal whose DNA does not substantially have the ability to express the mas of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention) can be obtained. Refers to embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
Methods for artificially mutating masDNA can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence, inserting or replacing another DNA by genetic engineering techniques. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
[0091]
Specific examples of non-human mammalian embryonic stem cells in which masDNA has been inactivated (hereinafter abbreviated as masDNA-inactivated ES cells or knockout ES cells of the present invention) include, for example, a non-human mammal of interest. masDNA is isolated and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or a reporter gene represented by lacZ (β-galactosidase gene) or cat (chloramphenicol acetyltransferase gene). Or the insertion of a DNA sequence that terminates gene transcription (for example, a polyA additional signal) into the introns between exons, thereby preventing the synthesis of complete messenger RNA. By A DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually disrupt the gene (hereinafter, abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells are transcribed on masDNA. Alternatively, the DNA sequence is analyzed by Southern hybridization analysis using a DNA sequence in the vicinity thereof as a probe or by a PCR method using a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than masDNA used for the preparation of the targeting vector as primers, and the knockout of the present invention is performed. It can be obtained by selecting ES cells.
As the ES cells from which masDNA is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or newly established ES cells may be newly established according to the known Evans and Kaufma method. It may be something. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetic background is used. For example, to obtain ES cells in which BDF is clearly known, for example, BDF in which the number of eggs collected by C57BL / 6 mice or C57BL / 6 was improved by hybridization with DBA / 2 1 Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2) 1 ) Can also be used favorably. BDF 1 In addition to the advantage that the number of eggs collected and the eggs are robust, the mice have C57BL / 6 mice as their background. / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
[0092]
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. Using this method, conventionally, it has been necessary to carry out about 10 6 Since the number of ES cells is required, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient, so that the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female. In addition, by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be significantly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the normal cells (for example, chromosomes in mice) are knocked out. It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are made into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985]. The cells deficient in expression of masDNA obtained by differentiation are useful in mas of the present invention or in cell biology of mas in vitro.
[0093]
A non-human mammal deficient in masDNA expression can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
Non-human mammals deficient in masDNA expression can be obtained, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the DNA sequence in which the masDNA of the targeting vector is inactivated by gene homologous recombination. Thus, masDNA can be knocked out by performing homologous recombination replacing masDNA on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells.
The cells in which the masDNA was knocked out were the DNA sequence on the southern hybridization analysis or the targeting vector using the DNA sequence on or near the masDNA as a probe, and the DNA sequence in the neighboring region other than the mouse-derived masDNA used for the targeting vector. Can be determined by an analysis by a PCR method using as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which masDNA has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, an 8-cell stage non-human mammalian embryo or The chimeric embryo is injected into a blastocyst and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudohumanly non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having a normal masDNA locus and cells having an artificially mutated masDNA locus.
When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated masDNA locus, masDNA in which all tissues are artificially mutated from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual It can be obtained by selecting individuals composed of cells having loci, for example, by judging coat color or the like. The individual obtained in this manner is usually an individual lacking the heterozygous expression of mas of the present invention, and mated with an individual lacking the heterozygous expression of the mas of the present invention, and homozygously expressing the mas of the present invention from their offspring. Defective individuals can be obtained.
[0094]
In the case of using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method, and these transgenic non-human mammals can be obtained. Compared to mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation in the masDNA locus by homologous recombination of the gene.
In the individual whose masDNA is knocked out in this manner, the animal individual obtained by mating can confirm that the DNA has been knocked out, and can be reared in a normal breeding environment.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
A non-human mammalian embryonic stem cell in which masDNA has been inactivated is very useful for producing a non-human mammal deficient in masDNA expression.
In addition, a non-human mammal deficient in masDNA expression lacks various biological activities that can be induced by the mas of the present invention, and thus can serve as a model for a disease caused by inactivation of the mas biological activity of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
[0095]
(12a) Method for screening compound having therapeutic / preventive effect on diseases caused by masDNA deficiency or damage
A non-human mammal deficient in masDNA expression can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by deficiency or damage of masDNA.
That is, the present invention provides a method for treating a disease caused by deficiency or damage of masDNA, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in masDNA expression, and observing and measuring changes in the animal. A method for screening a compound having a prophylactic effect or a salt thereof is provided.
Examples of the non-human mammal deficient in masDNA expression used in the screening method include the same as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in masDNA expression is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and treated with a test compound using the change in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an indicator.・ The preventive effect can be tested.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0096]
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, anxiety symptoms of the test animal are improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. The compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on anxiety.
The compound obtained using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a safe and low-toxic treatment for a disease (eg, anxiety) caused by deficiency or damage of mas of the present invention. It can be used as a medicine such as a prophylactic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). ) Is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as a drug containing a compound that alters the binding between mas and a mas ligand.
The preparation obtained in this way is safe and low toxic, and thus can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, generally, in an anxiety patient (with a body weight of 60 kg), one dose is required. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound is usually administered in the form of an injection to an anxiety patient (with a body weight of 60 kg). In such a case, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
[0097]
(12b) Method for screening for a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for masDNA
The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for masDNA, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in masDNA expression and detecting expression of a reporter gene. I do.
In the above-mentioned screening method, as the non-human mammal deficient in masDNA expression, among the non-human mammals deficient in masDNA expression, masDNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene controls the promoter for masDNA. Those that can be expressed below are used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in masDNA expression in which masDNA is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for masDNA, the activity of the promoter is detected by tracing the expression of a substance encoded by the reporter gene. can do.
For example, when a part of the DNA region encoding mas is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, β-galactosidase is expressed in place of mas of the present invention in a mas-expressing tissue. I do. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), mas can be easily obtained. The expression state in the animal body can be observed. Specifically, a mas-deficient mouse or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or at about 37 ° C. After reacting for 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue sample with a 1 mM EDTA / PBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for masDNA.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may include a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) and a base (eg, an organic acid). And particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
[0098]
Since the compound or its salt that promotes the promoter activity for masDNA can promote the expression of mas and promote the function of mas, for example, prevention of diseases associated with dysfunction of mas (eg, anxiety) and the like -It is useful as a medicament such as a therapeutic agent.
A compound or a salt thereof that inhibits promoter activity against masDNA can inhibit the expression of mas and inhibit the function of mas. Therefore, for example, a disease associated with overexpression of mas of the present invention (eg, a tumor (prostate) Cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), prophylactic / therapeutic agents such as memory disorders), LTP It is useful as a pharmaceutical such as an enhancer or a cognitive enhancer.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
[0099]
A drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as a drug containing a compound that alters the binding between mas and a mas ligand.
The preparation obtained in this way is safe and low toxic, and thus can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
For example, the dose of the compound or a salt thereof that promotes promoter activity against masDNA varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. )), The compound is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, when administered to an anxiety patient (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection, one dose is usually used. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg. As described above, a non-human mammal deficient in masDNA expression is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for masDNA, and investigates or prevents the cause of various diseases caused by deficient masDNA expression. -It can greatly contribute to the development of therapeutic drugs.
Also, using a DNA containing the mas promoter region of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene-transferred animal). Once created, the mas can be specifically synthesized and its action in living organisms examined. Furthermore, if a suitable reporter gene is linked to the above-mentioned promoter portion, and a cell line that expresses the same is established, a low-molecular compound having the action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of mas itself of the present invention. Can be used as a search system.
[0100]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: Cytosine
RNA: ribonucleic acid
mRNA: messenger ribonucleic acid
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
[0101]
Gly: glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: cysteine
Met: methionine
Glu: glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: lysine
Arg: Arginine
His: histidine
Phe: phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
*: Corresponds to the stop codon
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
[0102]
Further, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Tos: p-toluenesulfonyl
CHO: Formyl
Bzl: benzyl
Cl 2 Bzl: 2,6-dichlorobenzyl
Bom: benzyloxymethyl
Z: benzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butoxycarbonyl
DNP: dinitrophenol
Trt: Trityl
Bum: t-butoxymethyl
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine
HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
[0103]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
SEQ ID NO: 1
1 shows the amino acid sequence of human mas.
SEQ ID NO: 2
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding human mas.
SEQ ID NO: 3
2 shows the amino acid sequence of rat mas.
SEQ ID NO: 4
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding rat mas.
[0104]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, the gene using Escherichia coli followed the method described in Molecular cloning (Molecular cloning).
[0105]
Example 1 Inhibition of c-AMP production in mas-GFP-expressing CHO cells by SC-51322 and prostaglandin F2α 1,15-lactone
For the assay, a CHO cell line stably expressing a protein in which GFP was fused to the C-terminus of mas and a CHO cell line in which a protein in which GFP was fused to the C-terminus of HM74 were stably expressed were used as controls. Each of them was established using an expression plasmid for animal cells by a method known per se, and seeded at a concentration of 40000 cells / well in a 96-well plate at 37 ° C./5% CO 2. 2 Was used overnight. First, each cell was washed with an assay buffer (HBSS (GibcoBRL) to which 0.1% bovine serum albumin and 0.2 mM IBMX (Sigma) were added), and then washed in the same assay buffer. ℃, 5% CO 2 Preincubation was performed for 30 minutes under the conditions. Discard the assay buffer, replace with a new assay buffer 60 μl / well, and add SC-51322 (BIOMOL) together with forskolin (Wako Pure Chemical Industries, final concentration 2 μM) which is a reagent that promotes an increase in cAMP production. Alternatively, an assay buffer containing prostaglandin F2α 1,15-lactone (Cayman chemical) is further added in an amount of 40 μl / well at 37 ° C. and 5% CO 2. 2 The cells were cultured under the conditions for 30 minutes. The amount of intracellular cAMP in each well was measured using a cAMP screen kit (Applied Biosystems) and a plate reader (ARVO sx multilabel counter, Wallac).
As a result, the addition of SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone resulted in a suppression reaction of the amount of intracellular cAMP production specifically for mas-GFP-expressing CHO cells.
[0106]
Example 2 Change in intracellular calcium concentration of mas-GFP-expressing CHO cells by SC-51322 and prostaglandin F2α 1,15-lactone
First, the mas-GFP-expressing CHO cell line used in Example 1 and the mock CHO cell line stably transfected with only the original plasmid of the expression vector used in preparing the cells were each 3 × 10 6 4 After diluting the cells to a cell concentration of 100 μl / 100 μl and dispensing 100 μl per well into a Black walled 96-well plate (Costar), 37 ° C., 5% CO 2 2 Overnight. The variation of the intracellular calcium concentration of the cells with the test sample was measured using the FLIPR (registered trademark) system (Molecular Device) in the following manner. 50 μg of Fluo-3AM (DOJIN) was dissolved in 21 μl of DMSO (DOJIN), and an equal amount of 20% pluronic acid (Molecular Probes) was added and mixed. (Invitrogen), 20 ml of 1 M HEPES (pH 7.4) (DOJIN) was added, 710 mg of probenecid (Sigma) was dissolved in 5 ml of 1N NaOH, and then 5 ml of the above HBSS / HEPES solution was added, and 10 ml of the mixed solution was added. And prepare. ] To give a fluorescent dye solution. The medium in each well was removed from the above-described cell culture plate, and the fluorescent dye solution was immediately dispensed in an amount of 100 μl per well. 2 For 1 hour to incorporate fluorescent dye into the cells. The cells after the culture were washed with the above-mentioned assay buffer, and each well was replaced with 100 μl of the same buffer. In addition, each test sample of SC-51322 and prostaglandin F2α1,15-lactone to be added to the cells was diluted to the respective concentrations using an assay buffer in advance, and 200 μl was separately dispensed into a 96-well plate. The cell-containing plate and the test sample plate were simultaneously set in the FLIPR (registered trademark) System (registered trademark), and the change in intracellular calcium concentration after the addition of the test sample (50 μl) was measured as a change in fluorescence intensity. As a result, by adding 4 μM SC-51322 and 2 μM prostaglandin F2α 1,15-lactone, an increase in intracellular calcium concentration specific to mas-GFP-expressing CHO cells, which was not observed in mock CHO cells, was detected.
[0107]
【The invention's effect】
By using a mas agonist such as SC-51322 or prostaglandin F2α1,15-lactone and mas, a compound or a salt thereof that changes the binding property between the mas ligand and mas can be efficiently screened.
[0108]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of comparing intracellular cAMP levels in CHO cells expressing a mas-GFP receptor. Lane 1 on the horizontal axis is without forskolin, lane 2 was with 2 μM forskolin, lane 3 was with 2 μM forskolin and 50 μM SC-51322, lane 4 was with 2 μM forskolin and 5 μM SC-51322, and lane 5 was Lane 2 shows the case of simultaneous addition of 2 μM forskolin and 20 μM prostagrandin F2α 1,15-lactone, and Lane 6 shows the case of simultaneous addition of 2 μM forskolin and 2 μM prostagrandin F2α 1,15-lactone. The vertical axis indicates the amount of cAMP.
