JP2004238384A - New method for screening - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening an agonist/an antagonist, and the like. <P>SOLUTION: This method for screening the agonist/antagonist is to screen a compound which changes binding of a receptor protein with β-alanine or L-carnocin or a salt of the compound by using a new G protein conjugating receptor protein containing the same or essentially the same amino acid sequence as an amino acid sequence expressed by sequence number 2 or 4, or its salt, and β-alanine or L-carnocin. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトおよびラット由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＴＧＲ７およびｒＣＢ７Ｔ０８４）の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプター蛋白質は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
ラット由来のｒＣＢ７Ｔ０８４のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている（特許文献１）。また、ｒＣＢ７Ｔ０８４と高い相同性を有するヒト由来のＴＧＲ７のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている（特許文献２〜７）。しかしながら、これらのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能およびその生理的リガンドは解明されていなかった。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−１７５６９号
【０００５】
【特許文献２】
ＷＯ ０１／８３７４８号
【０００６】
【特許文献３】
ＷＯ ０１／６６７５０号
【０００７】
【特許文献４】
ＷＯ ０１／４８１８８号
【０００８】
【特許文献５】
ＷＯ ０１／３６４７１号
【０００９】
【特許文献６】
ＷＯ ０１／５７０８５号
【００１０】
【特許文献７】
ＷＯ ０１／７０８１４号
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従来、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプター蛋白質の特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを決定することは、医薬品開発の標的ともなりうるアゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、現時点でもなお、機能未知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプター蛋白質が多数存在しており、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンド探索および機能解明が切望されている。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガンドが見出されなくても、該レセプター蛋白質の不活化実験（ノックアウト動物）から該レセプター蛋白質の生理作用を解析することにより、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することも可能である。これら該レセプター蛋白質に対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全や機能亢進に関連する疾患の予防・治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の遺伝子変異に基づく、生体での該レセプター蛋白質の機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプター蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター蛋白質遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター蛋白質遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプター蛋白質の塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプター蛋白質の遺伝子は、該レセプター蛋白質の機能不全に関与する疾患の予防・治療薬や診断薬に応用することもできる。
本発明は、機能未知のオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定および該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とそのリガンドの用途に関する。すなわち、本発明は、リガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩、およびリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）もしくは該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ラット由来のｒＣＢ７Ｔ０８４およびヒト由来のＴＧＲ７のリガンドがβ−アラニンまたはＬ−カルノシンであることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤、
［２］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤、
［３］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤、
［４］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤、
［５］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる中枢または末梢神経機能異常の診断剤、
［６］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏、しびれ、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難または感覚麻痺の診断剤、
［７］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤、
［８］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤、
［９］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤、
［１０］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤、
［１１］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンまたはＬ−カルノシンを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［１２］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンまたはＬ−カルノシンを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［１３］上記［１１］記載のスクリーニング方法または上記［１２］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
［１４］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
［１５］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
［１６］β−アラニンまたはＬ−カルノシンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、
［１７］中枢または末梢神経機能調節剤である上記［１６］記載の医薬、
［１８］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［１９］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［２０］上記［１８］記載のスクリーニング方法または上記［１９］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、β−アラニンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
［２１］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
［２２］（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
［２３］β−アラニンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、
［２４］中枢または末梢神経機能調節剤である上記［１６］記載の医薬、
［２５］配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤、
［２６］配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤、
［２７］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、中枢または末梢神経機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［２８］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる、当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、中枢または末梢神経機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［２９］上記［２７］記載のスクリーニング方法または上記［２８］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、中枢または末梢神経機能を調節する作用を有する化合物またはその塩、
［３０］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤、
［３１］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤、
［３２］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤、
［３３］試験化合物を配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストのスクリーニング方法、
［３４］β−アラニンまたはＬ−カルノシンを含有してなる配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達作用増強剤、
［３５］中枢または末梢神経機能調節剤である上記［３４］記載の剤、
［３６］抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤である上記［３４］記載の剤、
［３７］β−アラニンを含有してなる配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達作用増強剤、
［３８］中枢または末梢神経機能調節剤である上記［３７］記載の剤、
［３９］抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤である上記［３７］記載の剤、
［４０］哺乳動物に対して、▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする抗不安方法、催眠鎮静方法、筋弛緩方法、麻酔増強方法、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療方法、
［４１］哺乳動物に対して、▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療方法、
［４２］抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤を製造するための▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストの使用、
［４３］運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤を製造するための▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニストの使用、
［４４］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる中枢または末梢神経機能異常の診断剤、および
［４５］配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏、しびれ、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難または感覚麻痺の診断剤を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、
［４６］（ｉ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、本発明ＧＰＣＲと略記する場合もある）その部分ペプチドまたはその塩と、β−アラニンまたはＬ−カルノシンとを接触させた場合と、（ｉｉ）本発明ＧＰＣＲ、その部分ペプチドまたはその塩と、β−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記［１１］のスクリーニング方法、
［４７］（ｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを本発明ＧＰＣＲ、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物を本発明ＧＰＣＲ、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの本発明ＧＰＣＲ、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１１］のスクリーニング方法、
［４８］（ｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合における、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１１］のスクリーニング方法、
［４９］（ｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを本発明ＧＰＣＲを含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１１］のスクリーニング方法、
［５０］（ｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合と、（ｉｉ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物を当該質転換体の細胞膜に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合における、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの本発明ＧＰＣＲに対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１１］のスクリーニング方法、
［５１］（ｉ）本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物および試験化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合における、本発明ＧＰＣＲを介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記［１１］のスクリーニング方法、
［５２］本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物を、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合と、本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合における、本発明ＧＰＣＲを介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記［１１］のスクリーニング方法、
［５３］本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物がβ−アラニンまたはＬ−カルノシンである上記［５１］または［５２］のスクリーニング方法、
［５４］本発明ＧＰＣＲを含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記［１２］のスクリーニング用キット、
［５５］本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現した本発明ＧＰＣＲを含有することを特徴とする上記［１２］のスクリーニング用キット、
［５６］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、中枢もしくは末梢神経機能調節薬、または不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏、しびれ、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難もしくは感覚麻痺の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
［５７］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、中枢もしくは末梢神経機能調節薬、または不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
［５８］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、中枢もしくは末梢神経機能調節薬、または運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症もしくは感覚麻痺の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、および
［５９］各薬を該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、各薬と該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記［５６］〜［５８］記載の確認方法等を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
本発明ＧＰＣＲは、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
【００１５】
配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１６】
また、本発明ＧＰＣＲとしては、ａ）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
【００１７】
本明細書において本発明ＧＰＣＲは、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するｒＣＢ７Ｔ０８４をはじめとする本発明ＧＰＣＲは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明ＧＰＣＲがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明ＧＰＣＲに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明ＧＰＣＲには、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明ＧＰＣＲの具体例としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来のｒＣＢ７Ｔ０８４、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来のＴＧＲ７などが用いられる。前者は特開２０００−１７５６９１、後者はＷＯ ０１／６６７５０、ＷＯ ０１／４８１８８、ＷＯ ０１／３６４７１、ＷＯ ０１／５７０８５、ＷＯ ０１／７０８１４に記載されている公知の蛋白質である。
【００１８】
本発明ＧＰＣＲの部分ペプチド（以下、単に部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記した本発明ＧＰＣＲの部分アミノ酸配列を有するペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明ＧＰＣＲの蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、本発明ＧＰＣＲと実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有する本発明ＧＰＣＲの部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１９】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した本発明ＧＰＣＲと同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明ＧＰＣＲまたはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２０】
本発明ＧＰＣＲまたはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２１】
本発明ＧＰＣＲもしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００２２】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００２３】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２４】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２５】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００２６】
本発明ＧＰＣＲの部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明ＧＰＣＲを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明ＧＰＣＲを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および Ｍ．Ａ． Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド シンセシス （Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６６年） ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６５年）
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （１９７５年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 １、 蛋白質の化学ＩＶ、 ２０５、（１９７７年）
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第１４巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２７】
本発明ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明ＧＰＣＲをコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明ＧＰＣＲのｍＲＮＡを定量することができる。
本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。具体的には、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明ＧＰＣＲと実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２８】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ｒＣＢ７Ｔ０８４をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＴＧＲ７をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、本発明ＧＰＣＲ遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定された本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、本発明ＧＰＣＲ遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明ＧＰＣＲ関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明ＧＰＣＲ遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明ＧＰＣＲ関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明ＧＰＣＲ関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明ＧＰＣＲ遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。本発明ＧＰＣＲ遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、本発明ＧＰＣＲ遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２９】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３０】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ． Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ， Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．２４７， １９９２； Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．３９５， １９９２； Ｓ． Ｔ． Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３ などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３１】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明ＧＰＣＲと実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３２】
本発明ＧＰＣＲまたはその部分ペプチド（以下、包括的に本発明ＧＰＣＲと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明ＧＰＣＲの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明ＧＰＣＲの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３３】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明ＧＰＣＲの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００３４】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３５】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３６】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００３７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ， Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３， ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。
【００３８】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）， ６， ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３９】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ． Ａ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４０】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ， Ｔ．Ｃ．Ｃ．， ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）， １９５， ７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明ＧＰＣＲを生成せしめることができる。
【００４１】
上記培養物から本発明ＧＰＣＲを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明ＧＰＣＲを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明ＧＰＣＲの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明ＧＰＣＲが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明ＧＰＣＲの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００４２】
かくして得られる本発明ＧＰＣＲが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明ＧＰＣＲを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明ＧＰＣＲの活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００４３】
本発明ＧＰＣＲに対する抗体は、本発明ＧＰＣＲを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明ＧＰＣＲに対する抗体は、本発明ＧＰＣＲを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００４４】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明ＧＰＣＲは、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプター蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４５】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター蛋白質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４６】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４７】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明ＧＰＣＲ抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明ＧＰＣＲに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４８】
本発明ＧＰＣＲのリガンドはβ−アラニンまたはＬ−カルノシンである。Ｌ−カルノシンはβ−アラニンにヒスチジンが結合したものである。β−アラニンは抑制性神経伝達物質であるグリシンやＧＡＢＡと構造が類似している。また、本発明ＧＰＣＲは、小脳、脊髄後根神経節、膀胱、精巣、子宮などに特異的に発現している。したがって、本発明ＧＰＣＲは中枢性や末梢性の神経系において、神経伝達の調節に関与していると考えられる。
従って、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明ＧＰＣＲに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。
【００４９】
（１）本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患の予防・治療剤
本発明ＧＰＣＲは中枢または（および）末梢神経機能に関与すると考えられる。従って、ａ）本発明ＧＰＣＲまたはｂ）本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを、中枢または末梢神経機能調節剤や、本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患、特に中枢または（および）末梢神経機能異常に関連する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内において本発明ＧＰＣＲが減少しているために、リガンドであるβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの生理作用が期待できない（本発明ＧＰＣＲの欠乏症）患者がいる場合に、ａ）本発明ＧＰＣＲを該患者に投与し該ＧＰＣＲの量を補充したり、ｂ）（イ）本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内における該ＧＰＣＲの量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡは、安全で低毒性な該ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患、特に中枢または（および）末梢神経機能異常に関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
具体的には、本発明ＧＰＣＲまたは本発明のＤＮＡは、例えば、抗不安薬、催眠鎮静薬、筋弛緩薬、麻酔増強薬、抗痙攣薬、抗依存症薬、抗精神分裂病薬、抗てんかん薬、抗心身症薬などの中枢神経機能異常疾患予防・治療薬として、あるいは失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの末梢神経機能の異常に関連する疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。さらに、本発明ＧＰＣＲまたは本発明のＤＮＡは、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどの疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。
また、β−アラニンまたはＬ−カルノシンは本発明ＧＰＣＲのシグナル伝達作用増強薬、中枢または末梢神経機能調節薬などとして、本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患、特に中枢または（および）末梢神経機能異常に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。具体的には、β−アラニンまたはＬ−カルノシンは、抗不安薬、催眠鎮静薬、筋弛緩薬、麻酔増強薬、抗痙攣薬、抗依存症薬、抗精神分裂病薬、抗てんかん薬、抗心身症薬などの中枢神経機能異常疾患予防・治療薬として、あるいは失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの末梢神経機能の異常に関連する疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。さらに、β−アラニンまたはＬ−カルノシンは、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどの疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。
本発明ＧＰＣＲを上記医薬として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のＤＮＡを上記医薬として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）本発明ＧＰＣＲまたはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）本発明ＧＰＣＲまたはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００５０】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００５１】
また、上記医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明ＧＰＣＲの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５２】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明ＧＰＣＲまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明ＧＰＣＲの発現低下が検出された場合は、例えば、本発明ＧＰＣＲの機能不全、特に中枢または（および）末梢神経機能異常に関連する疾患に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明ＧＰＣＲの発現過多が検出された場合は、例えば、本発明ＧＰＣＲの過剰発現に起因する疾患、特に中枢または（および）末梢神経機能障害に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患としては、例えば、不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔抵抗性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症などの中枢神経機能異常疾患、あるいは失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの末梢神経機能異常疾患、さらには脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどが挙げられる。
本発明ＧＰＣＲの過剰発現に起因する疾患としては、例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などが挙げられる。
【００５３】
（３）本発明ＧＰＣＲの発現量を変化させる化合物を含有する医薬
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、本発明ＧＰＣＲの発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれる本発明ＧＰＣＲのｍＲＮＡ量を測定することによる、本発明ＧＰＣＲの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００５４】
本発明ＧＰＣＲのｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明ＧＰＣＲのｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ｉｉ）本発明ＧＰＣＲを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明ＧＰＣＲのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００５５】
本発明ＧＰＣＲの発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれる本発明ＧＰＣＲのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれる本発明ＧＰＣＲのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、本発明ＧＰＣＲの発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）本発明ＧＰＣＲの発現量を増加させることにより、本発明ＧＰＣＲを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を増強させる化合物、（ロ）本発明ＧＰＣＲの発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明ＧＰＣＲのリガンドは、上記のとおりβ−アラニンまたはＬ−カルノシンである。したがって、上記スクリーニング方法で得られる本発明ＧＰＣＲの発現量を変化させる化合物は、中枢または末梢神経機能調節薬剤や、本発明ＧＰＣＲの機能不全、特に中枢または（および）末梢神経機能異常に関連する疾患の予防・治療剤として用いることができる。
具体的には、本発明ＧＰＣＲの発現量を増加させ、細胞刺激活性を増強させる化合物は、本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
本発明ＧＰＣＲの発現量を減少させ、細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本発明ＣＰＣＲの発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患としては、例えば、不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔抵抗性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症などの中枢神経機能異常疾患、あるいは失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの末梢神経機能異常疾患、さらには脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどが挙げられる。
本発明ＧＰＣＲの過剰発現に起因する疾患としては、例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などが挙げられる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００５８】
また、上記医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５９】
（４）本発明ＧＰＣＲに対するリガンドの定量法および診断方法
本発明の抗体は、本発明ＧＰＣＲを特異的に認識することができるので、被検液中の該ＧＰＣＲの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明ＧＰＣＲとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明ＧＰＣＲの割合を測定することを特徴とする被検液中の該ＧＰＣＲの定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明ＧＰＣＲの定量法を提供する。
【００６０】
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明ＧＰＣＲのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が該ＧＰＣＲのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明ＧＰＣＲに対するモノクローナル抗体を用いて該ＧＰＣＲの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明ＧＰＣＲの定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明ＧＰＣＲ量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００６１】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＧＰＣＲあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明ＧＰＣＲ量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００６２】
本発明のサンドイッチ法による本発明ＧＰＣＲの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明ＧＰＣＲの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明ＧＰＣＲのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明ＧＰＣＲの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」 Ｖｏｌ． ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、 同書 Ｖｏｌ． ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、 同書 Ｖｏｌ． ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、 同書 Ｖｏｌ． ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ ： Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、 同書 Ｖｏｌ． ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、 同書 Ｖｏｌ． １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ ： Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明ＧＰＣＲを感度良く定量することができる。
【００６３】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明ＧＰＣＲの濃度を定量することによって、該ＧＰＣＲの濃度の減少が検出された場合、例えば、該ＧＰＣＲの機能不全、特に中枢または（および）末梢神経機能異常に関連する疾患に罹患している可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明ＧＰＣＲの濃度の増加が検出された場合には、例えば、該ＧＰＣＲの過剰発現に起因する疾患に罹患している可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患としては、例えば、不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔抵抗性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症などの中枢神経機能異常疾患、あるいは失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの末梢神経機能異常疾患、さらには脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどが挙げられる。
本発明ＧＰＣＲの過剰発現に起因する疾患としては、例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などが挙げられる。
【００６４】
（５）本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストのスクリーニング方法
β−アラニンまたはＬ−カルノシンが本発明ＧＰＣＲに結合することによって、細胞内ｃＡＭＰ生成の抑制が見られることから、本発明ＧＰＣＲはこの細胞内シグナルを指標として本発明ＧＰＣＲに対するβ−またはＬ−カルノシン以外のアゴニスト（天然リガンドを含む）を探索し、または決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、試験化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合における、本発明ＧＰＣＲを介した細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストの決定方法を提供する。試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、低分子合成化合物などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などを本発明ＧＰＣＲに添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
【００６５】
具体的には、本発明のアゴニスト決定方法は、本発明の組換え型ＧＰＣＲの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発明ＧＰＣＲを介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を有する化合物またはその塩を決定する方法である。
より具体的には、本発明は、次のような決定方法を提供する。
（１）試験化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストの決定方法、および
（２）試験化合物を本発明ＧＰＣＲＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合における本発明ＧＰＣＲを介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストの決定方法を提供する。
特に、試験化合物が本発明ＧＰＣＲに結合することを確認した後に、上記の試験を行なうことが好ましい。
【００６６】
本発明のアゴニスト決定方法において、本発明ＧＰＣＲを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明ＧＰＣＲを含有する細胞の膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明ＧＰＣＲと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
【００６７】
本発明ＧＰＣＲを含有する細胞やその細胞膜画分中の本発明ＧＰＣＲの量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のアゴニスト決定方法を実施するためには、本発明ＧＰＣＲを介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明ＧＰＣＲを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。アゴニスト決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰなど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ生成抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
本発明のアゴニスト決定用キットは、本発明ＧＰＣＲを含有する細胞またはその細胞膜画分を含有するものである。
このようにして決定される本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストは、本発明ＧＰＣＲに結合してその生理的機能を調節するので、中枢または末梢神経機能調節剤や本発明ＧＰＣＲの機能に関連する疾患の予防・治療剤として用いることができる。具体的には、抗不安薬、催眠鎮静薬、筋弛緩薬、麻酔増強薬、あるいは痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの疾患に対する予防・治療薬として有用である。さらに、本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストは、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどの疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。
【０００６８】
（６）本発明ＧＰＣＲとリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、および本発明ＧＰＣＲとリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬
本発明ＧＰＣＲを用いるか、または組換え型の該ＧＰＣＲ発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドであるβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）本発明ＧＰＣＲを介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、本発明ＧＰＣＲに対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明ＧＰＣＲに対するアンタゴニスト）、（ハ）β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明ＧＰＣＲとβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとを接触させた場合と（ｉｉ）本発明ＧＰＣＲとβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、本発明ＧＰＣＲに対するβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられるが、なかでもｃＡＭＰ生成抑制活性などが好ましい。
【００６９】
より具体的には、本発明は、
ａ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを、本発明ＧＰＣＲに接触させた場合と、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物を本発明ＧＰＣＲに接触させた場合における、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの該ＧＰＣＲに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと該ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを、本発明ＧＰＣＲを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合と、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合における、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンの該ＧＰＣＲに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと該ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００７０】
ｄ）本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物（例えば、β−アラニンまたはＬ−カルノシンなど）を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合と、本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物および試験化合物を本発明ＧＰＣＲを含有する細胞に接触させた場合における、本発明ＧＰＣＲを介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドと該ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物（例えば、β−アラニンまたはＬ−カルノシンなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合と、本発明ＧＰＣＲを活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明ＧＰＣＲに接触させた場合における、レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
さらに、リガンドとしては、β−アラニンまたはＬ−カルノシンに代えて、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることもできる。このβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとしてβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。以下のスクリーニング方法においては、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含めて、単にβ−アラニンまたはＬ−カルノシンと表記する。
【００７１】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明ＧＰＣＲとしては、上記した本発明ＧＰＣＲを含有するものであれば何れのものであってもよいが、本発明ＧＰＣＲを含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のＴＧＲ７などが適している。
【００７２】
本発明ＧＰＣＲを製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ，Ｐ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．），２６７巻，１９５５５〜１９５５９頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、本発明ＧＰＣＲを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製した本発明ＧＰＣＲであってもよいし、該ＧＰＣＲを含有する細胞を用いてもよく、また該ＧＰＣＲを含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００７３】
本発明のスクリーニング方法において、本発明ＧＰＣＲを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明ＧＰＣＲを含有する細胞としては、該ＧＰＣＲを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明ＧＰＣＲと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
本発明ＧＰＣＲを含有する細胞や膜画分中の該ＧＰＣＲの量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００７４】
β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当な本発明ＧＰＣＲ画分と、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンが必要である。
本発明ＧＰＣＲ画分としては、天然型の本発明ＧＰＣＲ画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型該ＧＰＣＲ画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとしては、標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシン、あるいは標識したβ−アラニンアナログまたは標識したＬ−カルノシンなどが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたβ−アラニンまたはＬ−カルノシンなどが用いられる。
具体的には、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず本発明ＧＰＣＲを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより該ＧＰＣＲ標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプター蛋白質やリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該レセプター蛋白質溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを添加し、同時に１０−４〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００７５】
β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、本発明ＧＰＣＲを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など、特に細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、本発明ＧＰＣＲを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明ＧＰＣＲを発現した細胞が必要である。本発明ＧＰＣＲを発現した細胞としては、天然型の本発明ＧＰＣＲを有する細胞株、上記の組換え型の該ＧＰＣＲを発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
また、試験化合物としては、本発明ＧＰＣＲの活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。本発明ＧＰＣＲの活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物がアゴニストかアンタゴニストであるかは、上記した本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストのスクリーニング方法を用いて確認することができる。
【００７６】
β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明ＧＰＣＲ、本発明ＧＰＣＲを含有する細胞、または本発明ＧＰＣＲを含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）本発明ＧＰＣＲ標品
本発明ＧＰＣＲを発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識β−アラニンまたはＬ−カルノシン
市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識したβ−アラニンまたはＬ−カルノシン
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
ｄ）β−アラニンまたはＬ−カルノシン標準液
β−アラニンまたはＬ−カルノシンを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００７７】
２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明ＧＰＣＲ発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識β−アラニンまたはＬ−カルノシンを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのβ−アラニンまたはＬ−カルノシンを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
【００７８】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、本発明ＧＰＣＲに対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明ＧＰＣＲに対するアンタゴニスト）、（ハ）β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、中枢または末梢神経機能調節薬として有用である。
本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストは、本発明ＧＰＣＲに対するリガンドであるβ−アラニンまたはＬ−カルノシンが有する生理活性と同様の作用を有しているので、β−アラニンまたはＬ−カルノシンが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明ＧＰＣＲに対するアンタゴニストは、本発明ＧＰＣＲに対するリガンドであるβ−アラニンまたはＬ−カルノシンが有する生理活性を抑制することができるので、β−アラニンまたはＬ−カルノシンの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を増強する化合物は、本発明ＧＰＣＲに対するリガンドであるβ−アラニンまたはＬ−カルノシンが有する生理活性を増強することができるので、β−アラニンまたはＬ−カルノシンが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を減少させる化合物は、本発明ＧＰＣＲに対するリガンドであるβ−アラニンまたはＬ−カルノシンが有する生理活性を減少させることができるので、β−アラニンまたはＬ−カルノシンの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストまたは▲２▼β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を増強する化合物またはその塩は、例えば、抗不安薬、催眠鎮静薬、筋弛緩薬、麻酔増強薬、あるいは痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの疾患に対する予防・治療薬として有用である。さらに、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストまたは▲２▼β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を増強する化合物またはその塩は、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどの疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼本発明ＧＰＣＲに対するアンタゴニストまたは▲２▼β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲとの結合力を減少させる化合物またはその塩は、例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などの疾患に対する予防・治療薬として有用である。
【００７９】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００８０】
また、上記医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
例えば、本発明ＧＰＣＲに対するアゴニストの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８１】
（６）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
本発明ＧＰＣＲを用いることによって、各種薬物が本発明ＧＰＣＲを介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
（１）本発明ＧＰＣＲを用いることを特徴とする、中枢もしくは末梢神経機能調節薬、または不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏、しびれ、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難もしうは感覚麻痺の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
（２）本発明ＧＰＣＲを用いることを特徴とする、中枢もしくは末梢神経機能調節薬、または不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
（３）本発明ＧＰＣＲを用いることを特徴とする、中枢もしくは末梢神経機能調節薬、または運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症もしくは感覚麻痺の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（４）各薬を本発明ＧＰＣＲに接触させた場合における、各薬と本発明ＧＰＣＲとの結合量を測定することを特徴とする上記（１）〜（３）記載のスクリーニング方法を提供する。
この確認方法は、前記したリガンドと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、前記したリガンドと本発明ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物が本発明ＧＰＣＲを介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。
【００８２】
（７）細胞膜における本発明ＧＰＣＲまたはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する医薬
本発明の抗体は、本発明ＧＰＣＲを特異的に認識することができるので、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明ＧＰＣＲを定量することによる、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉ）本発明ＧＰＣＲを発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明ＧＰＣＲを定量することによる、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ｉｖ）本発明ＧＰＣＲを発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００８３】
細胞膜画分に含まれる本発明ＧＰＣＲの定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００ＴＭ、ツイーン２０ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明ＧＰＣＲと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明ＧＰＣＲは、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ｉｉ）本発明ＧＰＣＲを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明ＧＰＣＲを定量することができる。
【００８４】
細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を変化させる化合物のスクリーニングは、（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を定量することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明ＧＰＣＲの確認は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉｉｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を確認することができる。
（ｉｖ）本発明ＧＰＣＲを発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
【００８５】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を増加させることにより、本発明ＧＰＣＲを介する細胞刺激活性を増強させる化合物、（ロ）細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、中枢または末梢神経機能調節薬として有用である。
細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物は、本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本発明ＧＰＣＲの発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
具体的には、本発明ＧＰＣＲの量を増加する化合物またはその塩は、例えば、抗不安薬、催眠鎮静薬、筋弛緩薬、麻酔増強薬、あるいは痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの疾患に対する予防・治療薬として使用することができる。さらに、本発明ＧＰＣＲの量を増加する化合物またはその塩は、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどの疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。
本発明ＧＰＣＲの量を減少させる化合物またはその塩は、例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などの疾患に対する予防・治療薬として使用することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００８６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
例えば、細胞膜における本発明ＧＰＣＲの量を増加させる化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８７】
（８）本発明ＧＰＣＲに対する抗体を含有してなる医薬
本発明ＧＰＣＲに対する抗体の中和活性とは、該ＧＰＣＲの関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該ＧＰＣＲの関与するシグナル伝達、例えば、該ＧＰＣＲを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不活性化することができる。
したがって、本発明ＧＰＣＲに対する中和抗体は、中枢または末梢神経機能調節薬や、該ＧＰＣＲの過剰発現などに起因する疾患（例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などの疾患）の予防・治療薬として用いることができる。
【００８８】
（９）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、中枢または末梢神経機能調節薬や、本発明ＧＰＣＲの過剰発現などに起因する疾患（例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などの疾患）の予防・治療薬として用いることができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００８９】
（１０）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００９０】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明ＧＰＣＲを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明ＧＰＣＲの機能を抑制するＧＰＣＲを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００９１】
本発明ＧＰＣＲの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
【００９２】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明ＧＰＣＲの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常な本発明ＧＰＣＲの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００９３】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明ＧＰＣＲの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明ＧＰＣＲの機能亢進症や、本発明ＧＰＣＲが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明ＧＰＣＲの増加症状を有することから、本発明ＧＰＣＲに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００９４】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明ＧＰＣＲの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明ＧＰＣＲの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明ＧＰＣＲの機能不活性型不応症における本発明の異常ＧＰＣＲによる正常ＧＰＣＲの機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明ＧＰＣＲの増加症状を有することから、本発明ＧＰＣＲの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された本発明ＧＰＣＲを分析することによる、本発明ＧＰＣＲにより特異的に発現あるいは活性化する本発明ＧＰＣＲとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ＧＰＣＲを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明ＧＰＣＲの機能不活性型不応症などを含む、本発明ＧＰＣＲに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明ＧＰＣＲに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明ＧＰＣＲ産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明ＧＰＣＲおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明ＧＰＣＲの機能不活性型不応症を含む、本発明ＧＰＣＲに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明ＧＰＣＲが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００９５】
（１１）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明ＧＰＣＲの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明ＧＰＣＲの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００９６】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００９７】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ及びＭ． Ｈ． Ｋａｕｆｍａｎ， ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ． Ｃ． Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明ＧＰＣＲまたは本発明ＧＰＣＲの細胞生物学的検討において有用である。
【００９８】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明ＧＰＣＲのヘテロ発現不全個体であり、本発明ＧＰＣＲのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明ＧＰＣＲのホモ発現不全個体を得ることができる。
【００９９】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明ＧＰＣＲにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明ＧＰＣＲの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１００】
（１１ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０１０１】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明ＧＰＣＲの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔抵抗性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症などの疾患に対する予防・治療薬など）に対する安全で低毒性な治療・予防剤、中枢または末梢神経機能調節剤などの医薬として使用することができる。さらに、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどの疾患の予防・治療薬などとして使用することができる。
また、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明ＧＰＣＲとリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０２】
（１１ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明ＧＰＣＲの発現する組織で、本発明ＧＰＣＲの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明ＧＰＣＲの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明ＧＰＣＲ欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１０３】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、中枢または末梢神経機能調節薬として有用である。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明ＧＰＣＲの発現を促進し、該ＧＰＣＲの機能を促進することができるので、例えば、本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患などの予防・治療薬などの医薬として有用である。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明ＧＰＣＲの発現を阻害し、該ＧＰＣＲの機能を阻害することができるので、例えば、本発明ＧＰＣＲの発現過多に関連する疾患などの予防・治療薬などの医薬として有用である。
本発明ＧＰＣＲの機能不全に関連する疾患としては、例えば、不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔抵抗性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症（脊髄損傷、頭部外傷）、術後後遺症（脳・脊髄腫瘍を含むその他の脳性疾患、その他のミエロパチー）、疼痛、知覚過敏、しびれなどが挙げられる。
本発明ＧＰＣＲの過剰発現に起因する疾患としては、例えば、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺などが挙げられる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１０４】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明ＧＰＣＲまたはその塩とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、精神分裂病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明ＧＰＣＲのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのＧＰＣＲを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明ＧＰＣＲそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１０５】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【０１０６】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
＊ ：終止コドンに対応する
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【０１０７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃｌ２Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【０１０８】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
本発明のラット由来ｒＣＢ７Ｔ０８４をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：２
本発明のラット由来ｒＣＢ７Ｔ０８４のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３
本発明のヒト由来ＴＧＲ７をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：４
本発明のヒト由来ＴＧＲ７のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５
実施例２で用いたＴＧＲ７用プライマーの塩基配列を表す。
配列番号：６
実施例２で用いたＴＧＲ７用プライマーの塩基配列を表す。
配列番号：７
実施例２で用いたＴＧＲ７用プローブの塩基配列を表す。
配列番号：８
実施例２で用いたｒＣＢ７Ｔ０８４用プライマーの塩基配列を表す。
配列番号：９
実施例２で用いたｒＣＢ７Ｔ０８４用プライマーの塩基配列を表す。
配列番号：１０
実施例２で用いたｒＣＢ７Ｔ０８４用プローブの塩基配列を表す。
【０１０９】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【０１１０】
【実施例１】ｒＣＢ７Ｔ０８４およびＴＧＲ７に対するβ−アラニンの反応性の確認
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、特に記載が無い限り１０％ 牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むハムＦ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。トランスフェクションを行う前日に１０ｃｍ２あたり４．５ｘ１０５個の細胞を播き、５％ ＣＯ２濃度に調整された ＣＯ２培養器にて３７℃で１５時間以上培養した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、試薬添付の方法に準じて操作を行った。培養器に６−ｗｅｌｌプレートを使用する場合は、以下のように行った。まず、１．５ｍｌ容チューブを２本用意し、それぞれにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μｌ分注した。次に、片方のチューブに発現ベクターを１μｇ、もう片方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を６μｌ添加後、両者を混合し、２０分間室温に静置した。この溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を８００μｌ加えたトランスフェクション用混合液を、あらかじめＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を用いて洗浄したＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加後、ＣＯ２培養器にて６時間培養した。培養後の細胞は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリンスした後、０．０５％ トリプシン・ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥がし、遠心操作にて回収した。得られた細胞の数を測定し、培地２００μｌあたり５ｘ１０４個の細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり２００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。上記トランスフェクション操作にて一過性に受容体を発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞に各種試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施した。まず、細胞に蛍光色素Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）を添加するため、あるいはＦＬＩＰＲアッセイを行う直前に細胞を洗浄するためのアッセイバッファーを作成した。 ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０００ｍｌに１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）２０ｍｌを加えた溶液（以下、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液）に、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらにＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し、この溶液をアッセイバッファーとした。次にＦｌｕｏ−３ＡＭ ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％ プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファーに加え、蛍光色素溶液を調製した。トランスフェクション処理を施したＣＨＯ−Ｋ１細胞の培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した後、ＦＬＩＰＲにセットした。また、受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加する試験サンプルはアッセイバッファーを用いて調製し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定した結果、β−アラニンを１０−４Ｍ〜１０−５Ｍ加えたときに、ラットｒＣＢ７Ｔ０８４（図２）およびそのヒト型のＴＧＲ７（図１）を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞が特異的に応答（細胞内カルシウム濃度の上昇）することを発見した。コントロールの発現ベクターのみを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞（図３）では、このような応答は見られなかった。すなわち、ｒＣＢ７Ｔ０８４およびそのヒト型のＴＧＲ７のリガンドがβ−アラニンであることが判明した。
【０１１１】
【参考例１】ｒＣＢ７Ｔ０８４およびＴＧＲ７の発現ベクターの構築
ｒＣＢ７Ｔ０８４およびＴＧＲ７をコードするＤＮＡ断片はそれぞれ、ＷＯ２０００／２０５８０１およびＷＯ２００１／８３７４８に記載の方法に従ってクローンし、得られたＤＮＡ断片をｐＡＫＫＯ−１１１ベクターのＳａｌＩ部位とＳｐｅＩ部位に導入し、それぞれの発現ベクターを構築した。
【０１１２】
【実施例２】ＲＴ−ＰＣＲによるＴＧＲ７ｍＲＮＡのヒトにおける組織分布の検討
鋳型となるｃＤＮＡには、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）から以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＧＧＣＴＴＴＣＧＡＡＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号：５），５’−ＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号：６）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−ＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：７）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたヒト各種組織におけるＴＧＲ７のｍＲＮＡ発現量はｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりのコピー数として算出した（図４）。
【０１１３】
【実施例３】ＲＴ−ＰＣＲによるｒＣＢ７Ｔ０８４ｍＲＮＡのラットにおける組織分布の検討
鋳型となるｃＤＮＡには、ラット各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号：８），５’−ＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号：９）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）ＣＴＧＴＧＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＧＡＣＡＡ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：１０）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたラット各種組織におけるｒＣＢ７Ｔ０４８のｍＲＮＡ発現量はｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりのコピー数として算出した（図５）。
【０１１４】
【実施例４】ＴＧＲ７およびｒＣＢ７Ｔ０８４を発現させたＣＨＯ細胞における、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のβ−アラニンおよびＬ−カルノシンによる抑制作用
ＴＧＲ７およびｒＣＢ７Ｔ０８４を発現させたＣＨＯ細胞をアッセイ用培地（ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．２ｍＭ ＩＢＭＸを添加したもの）にて洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分培養した。アッセイ用培地にて希釈した各濃度のβ−アラニン（１．０×１０−３Ｍ〜３．０×１０−７Ｍ）およびＬ−カルノシン（１．０×１０−３Ｍ〜３．０×１０−７Ｍ）を添加し、その後ホルスコリン１μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分培養した。培養上清を捨てて、ｃＡＭＰ ｓｃｒｅｅｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールに従い、細胞内のｃＡＭＰ量をプレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Ｗａｌｌａｃ社）を用いて測定した。
その結果、ベクターのみを導入したＣＨＯ細胞（ｍｏｃｋ）に比べ、ＴＧＲ７およびｒＣＢ７Ｔ０８４遺伝子を導入したＣＨＯ細胞特異的に、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のβ−アラニン（図６）およびＬ−カルノシン（図７）による用量依存的かつ特異的な減少が検出された。この活性を追うことにより、内因性リガンドの精製が可能であると考えられた。
【０１１５】
【実施例５】ＴＧＲ７に対するアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法の設定
（１）細胞内カルシウム濃度変化を指標としたＴＧＲ７に対するアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法の設定
ＴＧＲ７に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索を行うための系を以下の方法で設定した。
参考例１で作製したヒトＴＧＲ７発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトＴＧＲ７を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＴＧＲ７）を３ｘ１０４個／１００μｌの細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。方法を以下に記載した。
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファー［ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）を２０ｍｌ添加し、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらに上記のＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し調製する。］に加え、蛍光色素溶液を調製した。細胞プレートの培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて３７℃で１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した。細胞に添加する被検体化合物はアッセイバッファーを用いて各々の濃度に希釈し、プレートに分注した。アンタゴニスト測定用に９０μＭ β−アラニン溶液（反応時の終濃度で３０μＭ）を別のプレートに分注し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて被検体化合物添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定しアゴニスト作用を、続いてβ−アラニンを添加してアンタゴニスト作用の測定を行った。被検体化合物がアゴニストであれば、細胞内カルシウム濃度の上昇が起こり、被検体化合物がアンタゴニストであれば、後で加えるβ−アラニンの反応を抑制する活性が観測される。被検体化合物添加後の蛍光強度値の変化を用いた用量反応曲線より、ＥＣ５０値を算出した。
（２）ＦＬＩＰＲアッセイの結果からアゴニスト候補を選択する基準
アゴニスト候補を選出するための被検体化合物は、予めその濃度が１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）で希釈し、測定時に上記のアッセイバッファーで希釈して使用した。そして、それらの被検体化合物を用いて上記と同様の方法で、ヒトＴＧＲ７を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＴＧＲ７）およびヒトヒスタミンＨ１受容体発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトヒスタミンＨ１受容体を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｈ１）に対する反応開始３０秒もしくは４０秒後の蛍光強度値を測定した。さらに、１００μＭ β−アラニンのＣＨＯ−ｈＴＧＲ７に対する蛍光強度を１００％としたときの相対値を算出し、その値がＣＨＯ−ｈＴＧＲ７に対し５０もしくは１００％以上であり、かつＣＨＯ−Ｈ１に対する値が２５％以下を満たす被検体化合物をヒトＴＧＲ７特異的アゴニスト候補とした。
（３）ＦＬＩＰＲアッセイの結果からアンタゴニスト候補を選択する基準
アンタゴニスト候補を選出するための被検体化合物は、予めその濃度が１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）で希釈し、測定時に上記のアッセイバッファーで希釈して使用した。そしてそれらの被検体化合物を用いて、上述したアゴニスト活性の測定後に引き続いて、ヒトＴＧＲ７を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＴＧＲ７）およびヒトヒスタミンＨ１受容体を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｈ１）に対するアンタゴニスト活性を測定した。アンタゴニスト評価のためには反応開始２００秒後に、アゴニスト（ＣＨＯ−ｈＴＧＲ７に対しては３０μＭβ−アラニン、ＣＨＯ−Ｈ１に対しては１０ｎＭヒスタミン）を加え、反応開始２３０秒の蛍光強度値を測定した。被検体化合物がない場合のアゴニストによる蛍光強度を１００％とし、被検体化合物がある場合の蛍光強度の相対値を算出し、その値がＣＨＯ−ｈＴＧＲ７に対し５０％以下であり、かつＣＨＯ−Ｈ１に対し８０％以上を満たす被検体化合物をヒトＴＧＲ７特異的アンタゴニスト候補とした。反応開始２３０秒後の蛍光強度値の変化を用いた用量反応曲線より、ＩＣ５０値を算出した。
【０１１６】
【実施例６】ｒＣＢ７Ｔ０８４のラット後根神経節における発現解析
ｒＣＢ７Ｔ０８４の神経節での発現量を調べるために、Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（８週齢、オス）の後根神経節と脊髄のトータルＲＮＡよりｃＤＮＡを調製し、実施例３の方法に従ってＴａｑＭａｎにより定量を行った（図８）。ｒＣＢ７Ｔ０８４は後根神経節において脊髄と比較して３９０倍の高い発現が認められ、後根神経節に特異的に高発現していることが確認された。後根神経節は末梢からの全ての感覚情報の通過点であることから、ｒＣＢ７Ｔ０８４が、触覚、圧覚、温覚、冷覚、痛覚、運動感覚、深部痛などの感覚情報の伝達に関与しているものと考えられる。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明ＧＰＣＲ、その部分ペプチドまたはその塩、または本発明ＧＰＣＲもしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、精神分裂病などの中枢または（および）末梢神経機能異常に関与する疾患の予防・治療薬として有用である。
本発明ＧＰＣＲ、その部分ペプチドまたはその塩とリガンドであるβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとを用いることによって、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと本発明ＧＰＣＲ、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。
【０１１８】
【配列表】

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【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＧＲ７を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞にβ−アラニンを添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸のＣｏｕｎｔｓは細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸のＴｉｍｅ（ｓｅｃ）は測定開始後の時間経過（秒）を示す。○は１０−４Ｍ、▲は１０−５Ｍ、□は１０−６Ｍを示す。
【図２】ｒＣＢ７Ｔ０８４を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞にβ−アラニンを添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸のＣｏｕｎｔｓは細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸のＴｉｍｅ（ｓｅｃ）は測定開始後の時間経過（秒）を示す。○は１０−４Ｍ、▲は１０−５Ｍ、□は１０−６Ｍを示す。
【図３】発現ベクターのみ（インサートなし）を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞にβ−アラニンを添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸のＣｏｕｎｔｓは細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸のＴｉｍｅ（ｓｅｃ）は測定開始後の時間経過（秒）を示す。○は１０−４Ｍ、▲は１０−５Ｍ、□は１０−６Ｍを示す。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲによるＴＧＲ７ｍＲＮＡのヒトにおける組織分布図を示す。ｃｏｐｉｅｓ／ｎｇ ｍＲＮＡはｍＲＮＡ ｎｇ当たりのコピー数を示す。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲによるｒＣＢ７Ｔ０８４ｍＲＮＡのラットにおける組織分布図を示す。ｃｏｐｉｅｓ／ｎｇ ｍＲＮＡはｍＲＮＡ ｎｇ当たりのコピー数を示す。
【図６】ＴＧＲ７およびｒＣＢ７Ｔ０８４を発現させたＣＨＯ細胞における、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のβ−アラニンによる抑制作用を調べた結果を示す。ＴＧＲ７はＴＧＲ７を発現させたＣＨＯ細胞を、ｒＣＢ７Ｔ０８４はｒＣＢ７Ｔ０８４を発現させたＣＨＯ細胞を、Ｍｏｃｋはベクターのみを導入したＣＨＯ細胞を用いた時の結果を示す。Ｂａｓａｌはホルスコリンで刺激しない状態を示す。Ｆｓｋはホルスコリンを１μＭ添加した場合を示す。横軸は添加したβ−アラニンの濃度を示し、１Ｅ−０３は１．０×１０−３Ｍ、３Ｅ−０４は３．０×１０−４Ｍ、１Ｅ−０４は１．０×１０−４Ｍ、３Ｅ−０５は３．０×１０−５Ｍ、１Ｅ−０５は１．０×１０−５Ｍ、３Ｅ−０６は３．０×１０−６Ｍ、１Ｅ−０６は１．０×１０−６Ｍ、３Ｅ−０７は３．０×１０−７Ｍを示す。縦軸は細胞内ｃＡＭＰ量を示す。
【図７】ＴＧＲ７およびｒＣＢ７Ｔ０８４を発現させたＣＨＯ細胞における、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のＬ−カルノシンによる抑制作用を調べた結果を示す。ＴＧＲ７はＴＧＲ７を発現させたＣＨＯ細胞を、ｒＣＢ７Ｔ０８４はｒＣＢ７Ｔ０８４を発現させたＣＨＯ細胞を、Ｍｏｃｋはベクターのみを導入したＣＨＯ細胞を用いた時の結果を示す。Ｂａｓａｌはホルスコリンで刺激しない状態を示す。Ｆｓｋはホルスコリンを１μＭ添加した場合を示す。横軸は添加したＬ−カルノシンの濃度を示し、１Ｅ−０３は１．０×１０−３Ｍ、３Ｅ−０４は３．０×１０−４Ｍ、１Ｅ−０４は１．０×１０−４Ｍ、３Ｅ−０５は３．０×１０−５Ｍ、１Ｅ−０５は１．０×１０−５Ｍ、３Ｅ−０６は３．０×１０−６Ｍ、１Ｅ−０６は１．０×１０−６Ｍ、３Ｅ−０７は３．０×１０−７Ｍを示す。縦軸は細胞内ｃＡＭＰ量を示す。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲによるｒＣＢ７Ｔ０８４ｍＲＮＡのラット後根神経節および脊髄における発現量を示す。Ｃｏｐｉｅｓ／２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ２５ｎｇ当たりのコピー数を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the use of human and rat-derived G protein-coupled receptor proteins (TGR7 and rCB7T084).
[0002]
[Prior art]
Many physiologically active substances such as hormones and neurotransmitters regulate the functions of living organisms through specific receptor proteins present in cell membranes. Many of these receptor proteins perform intracellular signal transduction through activation of a conjugated guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as G protein), and have seven transmembrane regions. Because they have a common structure, they are collectively called G protein-coupled receptor protein (GPCR) or seven-transmembrane receptor protein (7TMR).
G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and are physiologically targeted as molecules that regulate the functions of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters and bioactive substances. Plays an important role. The receptor protein transmits a signal into a cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as activation and suppression of the cell.
To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various organisms and their specific receptor proteins, especially G protein-coupled receptor proteins, it is necessary to clarify the functions of cells and organs of various organisms. And provide a very important means for drug development closely related to their functions.
[0003]
For example, in various organs of a living body, physiological functions are regulated under the regulation by many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In particular, physiologically active substances are present at various sites in a living body, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins. There are many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the living body, and many of the structures of their receptor proteins have not yet been reported. Furthermore, it is often unknown whether subtypes exist in known receptor proteins.
It is a very important tool for drug development to clarify the relationship between a substance that regulates a complex function in a living body and its specific receptor protein. In addition, in order to efficiently screen for agonists and antagonists for receptor proteins and to develop pharmaceuticals, it is necessary to elucidate the functions of receptor protein genes expressed in vivo and to express them in an appropriate expression system. Was needed.
In recent years, as a means for analyzing a gene expressed in a living body, studies for randomly analyzing the sequence of cDNA have been actively conducted, and the fragment sequence of the cDNA obtained in this manner is expressed in an Expressed Sequence Tag (EST). ) Is registered in the database and published. However, many ESTs have only sequence information, and it is difficult to estimate their functions.
An amino acid sequence of rat-derived rCB7T084 and a DNA encoding the same have been reported (Patent Document 1). Further, an amino acid sequence of human-derived TGR7 having high homology to rCB7T084 and a DNA encoding the same have been reported (Patent Documents 2 to 7). However, the functions of these G protein-coupled receptor proteins and their physiological ligands have not been elucidated.
[0004]
[Patent Document 1]
JP-A-2000-17569
[0005]
[Patent Document 2]
WO 01/83748
[0006]
[Patent Document 3]
WO 01/66750
[0007]
[Patent Document 4]
WO 01/48188
[0008]
[Patent Document 5]
WO 01/36471
[0009]
[Patent Document 6]
WO 01/57085
[0010]
[Patent Document 7]
WO 01/70814
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, substances that inhibit the binding between a G protein-coupled receptor protein and a physiologically active substance (that is, a ligand) and substances that bind to cause the same signal transduction as a physiologically active substance (that is, a ligand) include these receptor proteins. Have been utilized as specific drugs or antagonists of the biological functions as specific antagonists or agonists. Therefore, determining a specific ligand for a G protein-coupled receptor protein is a very important means for finding agonists and antagonists that can also be targets for drug development.
However, even at present, there are a large number of so-called orphan receptor proteins, of which the function is unknown, and whose corresponding ligands have not been identified. Is eagerly awaited.
G protein-coupled receptor proteins are useful for searching for new physiologically active substances (that is, ligands), and for searching for agonists or antagonists to the receptor protein, using the signal transduction action as an index. On the other hand, even if a physiological ligand is not found, it is also possible to produce an agonist or antagonist for the receptor protein by analyzing the physiological action of the receptor protein from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor protein. It is possible. These ligands, agonists or antagonists to the receptor protein can be expected to be used as preventive / therapeutic or diagnostic agents for diseases associated with dysfunction or hyperfunction of G protein-coupled receptor proteins.
Furthermore, a decrease or increase in the function of a G protein-coupled receptor protein in a living body based on a gene mutation thereof often causes some disease. In this case, not only administration of an antagonist or agonist to the receptor protein, but also introduction of the receptor protein gene into a living body (or a specific organ) or introduction of an antisense nucleic acid to the receptor protein gene It can also be applied to treatment. In this case, the nucleotide sequence of the receptor protein is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the gene of the receptor protein is used to prevent diseases associated with dysfunction of the receptor protein. -It can also be applied to therapeutic and diagnostic agents.
The present invention relates to the determination of a ligand for an orphan G protein-coupled receptor protein whose function is unknown, and the use of the G protein-coupled receptor protein and its ligand. That is, the present invention provides a method for screening a compound (antagonist, agonist) or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and the G protein-coupled receptor protein, or a salt thereof, using the screening kit, the screening method or the screening kit. Compounds (antagonists, agonists) or salts thereof that alter the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein, and compounds thereof (antagonists and agonists) that alter the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein ) Or a compound containing a compound that changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, and the like.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted extensive studies and found that the ligand of rat-derived rCB7T084 and human-derived TGR7 is β-alanine or L-carnosine. The present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
That is, the present invention
[1] A center comprising a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial peptide thereof or a salt thereof Or a peripheral nerve function modulator,
[2] An antibody comprising a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial peptide thereof or a salt thereof. Anxiety agents, hypnotic sedatives, muscle relaxants, anesthesia enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance , Cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, trauma Preventive / therapeutic agents for sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness,
[3] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A central or peripheral nerve function modulator comprising a nucleotide,
[4] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof Nucleotide-containing anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, neurological hypertension, impending abortion, imminent preterm birth, Male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis , Spinal cerebellar degeneration, post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hypersensitivity or numbness prevention and treatment,
[5] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof A diagnostic agent for central or peripheral nerve dysfunction comprising nucleotides,
[6] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia sensitivity, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorder, incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, threatened premature labor, male containing nucleotides Infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, Spinocerebellar degeneration, trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia, numbness, ataxia, paralysis, depression, delayed arousal, memory learning disability, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, difficulty breathing or Diagnostic agent of sense paralysis,
[7] An antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A central or peripheral nerve function modulator,
[8] an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; Preventive / therapeutic agents for motor ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disability, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis,
[9] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof A central or peripheral nerve function regulator comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide or a part thereof,
[10] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof Ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disability, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, respiration containing a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide or a part thereof Prophylactic / therapeutic agents for difficulties, addictions or sensory paralysis,
[11] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between β-alanine or L-carnosine and β-alanine or L-carnosine, wherein β-alanine or L-carnosine is used.
[12] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property between β-alanine or L-carnosine and β-alanine or L-carnosine, the kit comprising:
[13] The amino acid sequence represented by β-alanine or L-carnosine and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which can be obtained using the screening method according to [11] or the screening kit according to [12]. A compound or a salt thereof that changes the binding property to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as
[14] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A method for screening an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising using a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine or L-carnosine,
[15] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A screening kit for an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising a compound or a salt thereof that alters the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine or L-carnosine,
[16] Binding of β-alanine or L-carnosine to a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a salt thereof A medicament comprising a compound or a salt thereof that changes the sex,
[17] the medicament of the above-mentioned [16], which is a central or peripheral nerve function regulator;
[18] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine, characterized by using β-alanine,
[19] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine, which comprises β-alanine,
[20] The same as or substantially the same as β-alanine and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which can be obtained by using the screening method according to [18] or the screening kit according to [19]. A compound or a salt thereof that changes the binding property to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, which contains the same amino acid sequence;
[21] (1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A method for screening for an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising using a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine,
[22] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) A screening kit for an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine;
[23] Alters the binding property of β-alanine to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a salt thereof. A pharmaceutical comprising a compound or a salt thereof,
[24] the medicament of the above-mentioned [16], which is a central or peripheral nerve function regulator;
[25] an anxiolytic agent comprising an agonist for a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a salt thereof, Hypnotic sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, neurological hypertension, imminent miscarriage, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular Disorders, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorders, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, trauma sequelae, surgery Preventive / therapeutic agent for sequelae, pain, hyperesthesia or numbness,
[26] Ataxia comprising an antagonist to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a salt thereof Prophylactic / therapeutic agent for paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis,
[27] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof A method for screening a compound or a salt thereof, which has an action of changing the expression level of the G protein-coupled receptor protein and regulating central or peripheral nerve function, comprising using a nucleotide,
[28] A polyprotein containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof A screening kit for a compound or a salt thereof, comprising a nucleotide, which changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein and has an effect of regulating central or peripheral nerve function;
[29] The same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which can be obtained by using the screening method according to [27] or the screening kit according to [28]. A compound or a salt thereof having an action of changing the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the amino acid sequence of
[30] A compound that changes the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a compound thereof A central or peripheral nerve function modulator comprising a salt,
[31] A compound that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a compound thereof Salt-containing anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent preterm birth, Male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis , Spinal cerebellar degeneration, post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hypersensitivity or numbness prevention and treatment,
[32] A compound that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a compound thereof A prophylactic or therapeutic agent for ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis comprising salt,
[33] In the case where the test compound is contacted with a cell containing a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A method for screening for an agonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises measuring the activity of suppressing intracellular cAMP production,
[34] A G-protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 containing β-alanine or L-carnosine. Signal transduction enhancer,
[35] the agent of the above-mentioned [34], which is a central or peripheral nerve function regulator;
[36] anxiolytics, hypnotic sedatives, muscle relaxants, anesthesia enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, Autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cerebellum The agent according to the above [34], which is a preventive / therapeutic agent for degeneration, trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness,
[37] Enhancement of the signal transduction effect of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 containing β-alanine Agent,
[38] the agent of the above-mentioned [37], which is a central or peripheral nerve function regulator;
[39] anxiolytics, hypnotic sedatives, muscle relaxants, anesthesia enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, impending abortion, premature labor, male infertility, Autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cerebellum The agent according to the above-mentioned [37], which is an agent for preventing or treating degeneration, after-effect of trauma, after-effect of surgery, pain, hyperesthesia or numbness,
[40] A G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 against a mammal, or a partial peptide thereof Or a salt thereof, (2) a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Or a G protein-coupled receptor protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or an agonist thereof. Anti-anxiety method, hypnotic sedation method, muscle relaxation method, anesthesia enhancement characterized by administering an effective amount Law or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, premature labor, male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral palsy, spastic spinal cord Paralysis, spinal vascular disorders, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness Prevention and treatment methods,
[41] Gamma protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 against a mammal, or a partial peptide thereof Or an antibody against a salt thereof, (2) encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide containing the polynucleotide or a part thereof, or (3) identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. An antagonist of a G protein-coupled receptor protein having the same amino acid sequence or a salt thereof Motor function ataxia, characterized by administering an effective amount, paralysis, depression, wakefulness delay, memory and learning disorders, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, addiction or prevention and treatment method for numbness,
[42] anxiolytics, hypnotic sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, Autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cerebellum (1) The same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 for producing a prophylactic / therapeutic agent for degeneration, trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness A G protein-coupled receptor protein containing the same amino acid sequence, a partial peptide thereof or a salt thereof; (2) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; contains A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof, or (3) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Use of an agonist for a G protein-coupled receptor protein containing the same,
[43] (1) for manufacturing a preventive / therapeutic agent for ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis An antibody against a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, {circle around (2)} SEQ ID NO: A base complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 A polynucleotide comprising the sequence or a part thereof, or (3) an amino acid represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Use of an antagonist to a G protein-coupled receptor protein containing the acid sequence the same or substantially the same amino acid sequence,
[44] containing an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; Diagnostic agent for central or peripheral nerve dysfunction, and
[45] containing an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; Become anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia sensitivity, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disease, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance Disease, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, Provide diagnostic agents for post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hyperesthesia, numbness, ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disability, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea or sensory paralysis Do
[0013]
Further, the present invention provides
[46] (i) a G protein-coupled receptor protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as the present invention) (Sometimes abbreviated as GPCR) when the partial peptide or a salt thereof is contacted with β-alanine or L-carnosine, and (ii) the GPCR of the present invention, the partial peptide or a salt thereof, and β-alanine or The screening method of the above-mentioned [11], wherein a comparison is made with the case where L-carnosine and a test compound are brought into contact with each other;
[47] (i) a case where labeled β-alanine or L-carnosine is brought into contact with the GPCR of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof; and (ii) a labeled β-alanine or L-carnosine and a test compound. The present invention is characterized in that the amount of labeled β-alanine or L-carnosine bound to the GPCR of the present invention, its partial peptide or its salt when the present invention is brought into contact with the inventive GPCR, its partial peptide or its salt is measured and compared. The screening method of the above-mentioned [11],
[48] (i) When the labeled β-alanine or L-carnosine is brought into contact with the cells containing the GPCR of the present invention, and (ii) When labeled β-alanine or L-carnosine and the test compound are combined with the GPCR of the present invention. The screening method of the above-mentioned [11], wherein the amount of labeled β-alanine or L-carnosine bound to the cells when the cells are brought into contact with the cells is measured and compared;
[49] (i) a case where labeled β-alanine or L-carnosine is brought into contact with the membrane fraction of a cell containing the GPCR of the present invention, and (ii) a case where labeled β-alanine or L-carnosine and a test compound are used. The method of measuring the amount of labeled β-alanine or L-carnosine bound to the membrane fraction of the cell when the cell is contacted with the membrane fraction of the cell containing the GPCR of the present invention, and comparing the measured amounts. 11] a screening method,
[50] (i) culturing a transformant obtained by transforming a labeled β-alanine or L-carnosine with a recombinant vector containing a DNA containing a DNA encoding the GPCR of the present invention; And (ii) contacting a labeled β-alanine or L-carnosine and a test compound with the GPCR of the present invention expressed on the cell membrane of the transgenic product. The screening method of the above-mentioned [11], wherein the amount of labeled β-alanine or L-carnosine binding to the GPCR of the present invention is measured and compared;
[51] (i) When the compound that activates the GPCR of the present invention is contacted with a cell containing the GPCR of the present invention, and (ii) The compound that activates the GPCR of the present invention and the test compound contain the GPCR of the present invention. The screening method of the above-mentioned [11], wherein the cell stimulating activity mediated by the GPCR of the present invention when the cell is brought into contact is measured and compared.
[52] Expression of the compound that activates the GPCR of the present invention on the cell membrane of the transformant by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA containing the DNA encoding the GPCR of the present invention Cell stimulating activity mediated by the GPCR of the present invention when the GPCR of the present invention is brought into contact with the GPCR of the present invention, and when the compound that activates the GPCR of the present invention and a test compound are brought into contact with the GPCR of the present invention expressed in the cell membrane of the transformant. Is measured and compared, the screening method of the above [11],
[53] the screening method of the above-mentioned [51] or [52], wherein the compound that activates the GPCR of the present invention is β-alanine or L-carnosine;
[54] The screening kit of the above-mentioned [12], which comprises a cell containing the GPCR of the present invention or a membrane fraction thereof,
[55] A cultivation of a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA containing a DNA encoding the GPCR of the present invention, comprising the GPCR of the present invention expressed in the cell membrane of the transformant. The screening kit of the above [12],
[56] a central or peripheral nerve function modulator comprising a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Or anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthetic sensitivity, convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disease, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance Disease, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, Prevention / treatment of trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia, numbness, motor ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea or sensory paralysis Is How to ensure that binding to Scepter protein or a salt thereof,
[57] a central or peripheral nerve function modulator comprising a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Or anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthetic sensitivity, convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disease, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance Disease, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, Trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, method of confirming that a preventive or therapeutic drug for hyperesthesia or numbness is an agonist for the receptor protein or a salt thereof,
[58] a central or peripheral nerve function modulator, which comprises using a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a salt thereof; Or a drug for preventing or treating ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis is an antagonist to the receptor protein or a salt thereof. How to make sure they are, and
[59] The above-mentioned [characterized in that, when each drug is brought into contact with the receptor protein, its partial peptide or its salt, the amount of each drug bound to the receptor protein, its partial peptide or its salt is measured. 56] to [58].
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The G protein-coupled receptor protein used in the present invention is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
The GPCR of the present invention can be used, for example, in any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, pancreatic β cell, human or mammal (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey)). Bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells , Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or these Progenitor cells, stem cells or cancer cells, etc.) or cells of the blood cell lineage, or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, nucleus pulposus, basal cerebrum) , Hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas , Kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate It may be a protein derived from testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, or the like, or may be a synthetic protein.
[0015]
Examples of the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 include, for example, about 85% or more, preferably 90% or more, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. %, More preferably about 95% or more homology.
The protein of the present invention having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 includes, for example, a protein substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Preferred are proteins having substantially the same amino acid sequence and having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction action. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal information transmission activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
The activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction activity can be measured according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.
[0016]
In addition, the GPCR of the present invention includes: a) one or two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; More preferably, an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids are deleted, b) one or more (preferably 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence to which about 1, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5) amino acids have been added; c) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids have been substituted with another amino acid; Such as proteins containing d) amino acid sequence comprising a combination thereof may be used.
[0017]
In the present specification, the GPCR of the present invention has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end in accordance with the convention of peptide designation. The GPCR of the present invention including rCB7T084 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has a carboxyl group (-COOH) and a carboxylate (-COO) − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR).
Here, R in the ester is, for example, C, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. 1-6 Alkyl groups such as C, cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 Cycloalkyl groups such as phenyl, α-naphthyl and the like; 6-12 Aryl groups, for example phenyl-C such as benzyl, phenethyl, etc. 1-2 An alkyl group or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as an alkyl group 7-14 In addition to aralkyl groups, pivaloyloxymethyl groups commonly used as oral esters are used.
When the GPCR of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the present GPCR. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the GPCR of the present invention, in the above-described protein, the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a formyl group, acetyl or the like). 2-6 C such as alkanoyl group 1-6 Acyl group), a glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc. are suitable protecting groups (for example, formyl group, C 2-6 C such as alkanoyl group 1-6 (Eg, an acyl group), or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
Specific examples of the GPCR of the present invention include, for example, rat-derived rCB7T084 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and human-derived TGR7 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. The former is a known protein described in JP-A-2000-175691, and the latter is a known protein described in WO 01/66750, WO 01/48188, WO 01/36471, WO 01/57085, and WO 01/70814.
[0018]
The partial peptide of the GPCR of the present invention (hereinafter may be simply abbreviated as a partial peptide) may be any peptide as long as it has the partial amino acid sequence of the GPCR of the present invention described above. Among the protein molecules of the GPCR of the invention, those that are exposed outside the cell membrane and have substantially the same receptor binding activity as the GPCR of the invention are used.
Specifically, the partial peptide of the GPCR of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 is analyzed to be an extracellular region (hydrophilic site) in hydrophobicity plot analysis. It is a peptide containing the part shown. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
The number of amino acids in the partial peptide of the present invention is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more among the constituent amino acid sequences of the above-described receptor protein of the present invention. .
A substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with these amino acid sequences.
Here, “substantially the same receptor activity” has the same meaning as described above. "Substantially the same receptor activity" can be measured in the same manner as described above.
[0019]
Further, the partial peptide of the present invention has one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acid One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the sequence may be substituted with another amino acid.
In the partial peptide of the present invention, the C-terminus has a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO) − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR). When the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Further, similarly to the above-described GPCR of the present invention, the partial peptide of the present invention includes those in which the amino group of the methionine residue at the N-terminus is protected with a protecting group, and Gln formed by cleavage of the N-terminal side in vivo. Pyroglutamine-oxidized products, those in which the substituents on the side chains of the amino acids in the molecule are protected with an appropriate protecting group, and so-called glycopeptides such as so-called glycopeptides having a sugar chain bonded thereto are also included.
Examples of the salt of the GPCR of the present invention or a partial peptide thereof include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
[0020]
The GPCR of the present invention or a salt thereof can be produced from the aforementioned human or mammalian cells or tissues by a method for purifying a receptor protein known per se, or a transformant containing a DNA encoding the GPCR of the present invention described later. It can also be produced by culturing the body. Further, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described later or according thereto.
When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
[0021]
For the synthesis of the GPCR of the present invention, its partial peptide, its salt or its amide, a commercially available resin for protein synthesis can be used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or its amide.
Regarding the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is previously activated as a symmetric acid anhydride or a HOBt ester or a HOOBt ester. After that, it can be added to the resin.
[0022]
The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about −20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When a sufficient condensation cannot be obtained by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
[0023]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, tert-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, tertiary butoxy It can be protected by carbonylhydrazide, tritylhydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. As a group suitable for this esterification, for example, a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, and a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tert-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0024]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, meta-cresol, para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4- It is effective to add a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0025]
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is extended to a desired chain length on the amino group side, and A protein from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed and a protein from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminal has been removed, and these proteins are mixed in the above-mentioned mixed solvent. To condense. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. The crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
In order to obtain an ester of a protein, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, an ester of the desired protein is obtained in the same manner as the amide of the protein be able to.
[0026]
The partial peptide of the GPCR of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the GPCR of the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the GPCR of the present invention with the remaining portion, and removing the protecting group when the product has a protecting group. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following a) to e).
a) M. Bodanszky and M.A. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) b) Schroeder and Luebke, The Peptide (The Peptide, Academic Year, 65 years)
c) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
d) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
e) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten
After the reaction, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
[0027]
The polynucleotide encoding the GPCR of the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the GPCR of the present invention. The polynucleotide is a DNA encoding the GPCR of the present invention, RNA such as mRNA, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the polynucleotide encoding the GPCR of the present invention, the mRNA of the GPCR of the present invention is quantified, for example, by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto. be able to.
The DNA encoding the GPCR of the present invention may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be directly performed by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues. Specifically, as the DNA encoding the GPCR of the present invention, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or the base represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 A DNA encoding a receptor protein having a base sequence that hybridizes with the sequence under high stringent conditions and having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) as the GPCR of the present invention. Any of them may be used.
Examples of the DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 include, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. And more preferably a DNA containing a base sequence having about 95% or more homology.
[0028]
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding rat-derived rCB7T084 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the like is used.
As the DNA encoding human-derived TGR7 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the like is used.
The polynucleotide comprising a part of the base sequence of the DNA encoding the GPCR of the present invention or a part of the base sequence complementary to the DNA includes the following DNAs encoding the partial peptide of the present invention. The term is used to include not only RNA but also RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the GPCR gene of the present invention is cloned or determined in the nucleotide sequence information of the DNA encoding the GPCR of the present invention. Can be designed and synthesized based on Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize to the RNA of the GPCR gene of the present invention and inhibit the synthesis or function of the RNA, or can interact with the GPCR-related RNA of the present invention. The expression of the invention GPCR gene can be regulated and controlled. A polynucleotide complementary to a selected sequence of a GPCR-related RNA of the present invention, and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the GPCR-related RNA of the present invention, can express the GPCR gene of the present invention in vivo and in vitro. It is useful for regulation and control, and is useful for treatment or diagnosis of diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5′-end hairpin loop, 5′-end 6-base pair repeat, 5′-end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation initiation codon, 3′-end untranslated region of the GPCR gene of the present invention, The 3′-end palindrome region and the 3′-end hairpin loop can be selected as preferred target regions, but any region within the GPCR gene of the present invention can be selected as a target.
[0029]
The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that is complementary to at least a part of the target region and can hybridize can be said to be “antisense” with the target. Antisense polynucleotides include polydeoxyribonucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polyribonucleotides containing D-ribose, and other types of polynuclei that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Other polymers with nucleotides or non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymers are found in DNA or RNA Base pairs and nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxic , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides) having side chain groups, interacting compounds (for example, acridine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
[0030]
The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
A number of such modifications are known in the art, and Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; T. Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of an antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a G protein-coupled receptor protein. it can. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
[0031]
The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the above-described cells / tissues, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using an mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues.
Specifically, the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or (2) ) Having a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 under high stringency conditions, and having substantially the same activity as the GPCR of the present invention (eg, ligand binding activity, signal For example, a DNA having a partial base sequence of a DNA encoding a receptor protein having an information transfer function or the like is used.
The DNA capable of hybridizing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 includes, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more, of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. More preferably, DNA containing a base sequence having about 95% or more homology is used.
[0032]
As a means for cloning a DNA that completely encodes the GPCR of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, sometimes abbreviated as the GPCR of the present invention), a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the GPCR of the present invention is used. Or amplified by a PCR method, or selected by hybridization with a DNA incorporated into an appropriate vector and labeled with a DNA fragment or a synthetic DNA encoding a part or the entire region of the GPCR of the present invention. . Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
[0033]
Conversion of the DNA base sequence can be performed by PCR or a known kit, for example, Mutan. TM -Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM Using -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) or the like, it can be carried out according to a method known per se such as the ODA-LA PCR method, the Gapped Duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The cloned DNA encoding the GPCR of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or may be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The expression vector of the GPCR of the present invention can be obtained, for example, by (A) cutting out a DNA fragment of interest from the DNA encoding the GPCR of the present invention, and (B) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. Can be manufactured.
[0034]
Examples of the vector include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Among them, it is preferable to use the CMV promoter, SRα promoter and the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λP L When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an SPO1 promoter, an SPO2 promoter, a penP promoter, and the like are preferable. When the host is a yeast, a PHO5 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
[0035]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. Examples of the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r Neomycin resistance gene (hereinafter Neo). r G418 resistance). In particular, CHO (dhfr − ) When the dhfr gene is used as a selection marker using cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. When the host is a genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
Using the vector containing the DNA encoding the GPCR of the present invention thus constructed, a transformant can be produced.
[0036]
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12 DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular Biology)]. 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics (Ge) netics), Vol. 39, 440 (1954)].
Examples of Bacillus spp. Include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. )] Is used.
Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R − , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris and the like.
[0037]
When the virus is AcNPV, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and Hig derived from Trichoplusia ni egg. TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used. When the virus is BmNPV, a cell line derived from silkworm (Bombyx mori N; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL, et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used. .
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter CHO (dhfr). − ) Cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, human HEK293 cells, and the like.
[0038]
In order to transform Escherichia sp., For example, Procesings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 ( 1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences of Science -The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, Vol. 52, 456 (1973).
Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the GPCR of the present invention is obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and among them, a carbon source necessary for growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.As a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
[0039]
Examples of a medium for culturing Escherichia include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics]. , 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3β-indolyl acrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, K. et al. L. Procurings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and 0.5% casamino acid. SD medium containing [Bitter, G .; A. Processing of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and / or agitation are added as necessary.
[0040]
When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium is immobilized as Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). For example, those to which an additive such as 10% bovine serum or the like is appropriately added are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium. [Proceding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950) [Proceding of the Society for the Biological Medicine] ], Such as is used. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
As described above, the GPCR of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
[0041]
The GPCR of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
When the GPCR of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culture, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thawed. After disrupting the cells or cells, a method of obtaining a crude extract of the GPCR of the present invention by centrifugation or filtration is used as appropriate. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. TM And the like. When the GPCR of the present invention is secreted into the culture solution, after the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the GPCR of the present invention contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be carried out by appropriately combining separation and purification methods known per se. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography And a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing.
[0042]
When the thus obtained GPCR of the present invention is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto. The compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
The GPCR of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
The activity of the GPCR of the present invention thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
[0043]
The antibody against the GPCR of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the GPCR of the present invention.
An antibody against the GPCR of the present invention can be produced by using the GPCR of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
[0044]
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The GPCR of the present invention is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual having an antibody titer was selected from a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Incubation at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes allows efficient cell fusion.
[0045]
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which the antigen of the receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactively. A method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A labeled with a substance or enzyme, A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a receptor protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. .
The selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
[0046]
(B) Purification of monoclonal antibody
Monoclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which an antibody alone is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. Can be performed according to
[0047]
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (the GPCR antigen of the present invention) and a carrier protein is formed, a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and an antibody containing the GPCR of the present invention is collected from the immunized animal. Then, the antibody can be produced by separating and purifying the antibody.
Regarding a complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a mammal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten should be such that the antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by crosslinking the carrier. Any kind may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 20 with respect to 1 hapten. Preferably, a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
[0048]
The ligand of the GPCR of the present invention is β-alanine or L-carnosine. L-carnosine is obtained by binding histidine to β-alanine. β-alanine is similar in structure to the inhibitory neurotransmitters glycine and GABA. The GPCR of the present invention is specifically expressed in the cerebellum, dorsal root ganglion, bladder, testis, uterus and the like. Therefore, the GPCR of the present invention is considered to be involved in the regulation of neurotransmission in the central and peripheral nervous systems.
Therefore, a DNA encoding the GPCR of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention), an antibody against the GPCR of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and an anti-DNA against the DNA of the present invention may be used. Sense DNA (hereinafter sometimes abbreviated as antisense DNA of the present invention) has the following uses.
[0049]
(1) A preventive / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the GPCR of the present invention
The GPCRs of the invention are believed to be involved in central or / and peripheral nerve function. Therefore, a) the GPCR of the present invention or b) DNA encoding the GPCR of the present invention can be used as a central or peripheral nervous function regulator or a disease associated with dysfunction of the GPCR of the present invention, in particular, central or peripheral dysfunction. It can be used as a medicament such as an agent for preventing or treating related diseases.
For example, when the GPCR of the present invention is reduced in a living body and there is a patient who cannot expect the physiological action of the ligand β-alanine or L-carnosine (deficiency of the GPCR of the present invention), a) the GPCR of the present invention Is administered to the patient to supplement the amount of the GPCR, b) (a) administering the DNA encoding the GPCR of the present invention to the patient and expressing the same, or (b) adding the GPCR of the present invention to target cells. After inserting and expressing the DNA encoding the GPCR, the amount of the GPCR in the body of the patient can be increased by, for example, transplanting the cells into the patient, and the effect of the ligand can be sufficiently exerted. That is, the DNA encoding the GPCR of the present invention is useful as a safe and low-toxicity agent for preventing / treating a disease associated with dysfunction of the GPCR, particularly a disease associated with central or (and) peripheral dysfunction of peripheral nerves.
Specifically, the GPCR of the present invention or the DNA of the present invention includes, for example, an anxiolytic, a hypnotic sedative, a muscle relaxant, an anesthetic enhancer, an anticonvulsant, an antidependant, an antischizophrenic, an antiepileptic. As a preventive or remedy for central nervous system dysfunction such as drugs, antipsychotics, or related to peripheral nerve dysfunction such as incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, premature labor, male infertility, and autonomic imbalance It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases and the like. Further, the GPCR of the present invention or the DNA of the present invention may be used for cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis, and amyotrophic Diseases such as lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma (spinal cord injury, head trauma), sequelae after surgery (other cerebral diseases including brain and spinal cord tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, numbness, etc. It can be used as a prophylactic / therapeutic drug.
In addition, β-alanine or L-carnosine is used as a signal transduction potentiator of the GPCR of the present invention, a central or peripheral nerve function regulator, etc., in relation to diseases associated with the dysfunction of the GPCR of the present invention, in particular, central or peripheral nerve function. It can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with an abnormality. Specifically, β-alanine or L-carnosine is an anxiolytic, a hypnotic sedative, a muscle relaxant, an anesthetic enhancer, an anticonvulsant, an antidependant, an antischizophrenic, an antiepileptic, As a preventive or remedy for diseases of central nervous system dysfunction such as drugs for psychosomatic disorders, or prevention of diseases related to abnormalities in peripheral nerve functions such as incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, premature labor, male infertility, and autonomic imbalance -It can be used as a therapeutic agent. In addition, β-alanine or L-carnosine may be used for cerebrovascular disorders, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorders, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis, amyotrophic side Diseases such as chordosclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma (spinal cord injury, head trauma), sequelae after surgery (other cerebral disorders including brain and spinal cord tumors, and other myelopathies), pain, hyperesthesia, and numbness It can be used as a prophylactic / therapeutic agent.
When the GPCR of the present invention is used as the above medicine, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when the DNA of the present invention is used as the above medicine, the DNA of the present invention may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a routine procedure. can do. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
For example, a) the GPCR of the present invention or b) the DNA of the present invention may be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, or the like, if necessary, or water or other pharmaceutical agents. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with an acceptable liquid, or an injection such as a suspension. For example, a) the GPCR of the present invention or b) the DNA of the present invention together with known physiologically recognized carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, for the generally accepted formulation practice. It can be manufactured by mixing in the required unit dosage form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
[0050]
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0051]
The above-mentioned medicines include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, (Eg, polyethylene glycol), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the GPCR of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for example, in a schizophrenic patient (with a body weight of 60 kg), the daily dose is It is about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. For example, usually in the form of injection, for example, schizophrenic patients (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
The dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in a schizophrenic patient (with a body weight of 60 kg), the daily dose is generally one day. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. For example, usually in the form of injection, for example, schizophrenic patients (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0052]
(2) Gene diagnostic agent
The DNA and the antisense DNA of the present invention can be used as probes to obtain the GPCR of the present invention or a part thereof in a human or mammal (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.). Abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding a peptide can be detected, and thus, for example, gene diagnosis such as damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA Useful as an agent.
The above-described genetic diagnosis using the DNA or the antisense DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processing). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1986), pp. 86--2770, etc., in the Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. be able to.
For example, when a decrease in the expression of the GPCR of the present invention is detected by Northern hybridization, for example, it is possible that the subject is suffering from a dysfunction of the GPCR of the present invention, particularly a disease associated with a central or (and) peripheral dysfunction of the peripheral nerve. It can be diagnosed to be high or likely to be affected in the future.
When overexpression of the GPCR of the present invention is detected by Northern hybridization, for example, it is possible that the subject is suffering from a disease caused by overexpression of the GPCR of the present invention, particularly, a central or (and) peripheral nerve dysfunction. It can be diagnosed to be high or likely to be affected in the future.
Diseases associated with the dysfunction of the GPCR of the present invention include, for example, central nervous function such as anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia resistance, convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders and the like. Abnormal disease or incontinence, neurological hypertension, imminent miscarriage, imminent preterm birth, male infertility, peripheral nerve dysfunction such as autonomic imbalance, and cerebrovascular disorder, cerebral (child) paralysis, spastic spinal palsy, spinal cord blood vessels Disorders, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma (spinal cord injury, head trauma), sequelae of the operation (brain and spinal cord) Other cerebral disorders including tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, numbness and the like.
Examples of the disease caused by overexpression of the GPCR of the present invention include ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis. Is mentioned.
[0053]
(3) A medicine containing a compound that changes the expression level of the GPCR of the present invention
By using the DNA of the present invention as a probe, it can be used for screening a compound that changes the expression level of the GPCR of the present invention.
That is, the present invention includes, for example, the present invention contained in (i) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant or the like. A method for screening a compound that changes the expression level of a GPCR of the present invention by measuring the mRNA level of the GPCR is provided.
[0054]
The measurement of the mRNA amount of the GPCR of the present invention is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained.
The mRNA of the GPCR of the present invention contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from the cells and the like by a usual method and using, for example, a technique such as TaqManPCR, and can be quantified by a method known per se. It can also be analyzed by performing a blot.
(Ii) A transformant expressing the GPCR of the present invention is prepared according to the above method, and the mRNA of the GPCR of the present invention contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.
[0055]
Screening for a compound that changes the expression level of the GPCR of the present invention comprises:
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or at the same time as the drug or physical stress. After a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) after administration, the amount of the mRNA of the GPCR of the present invention contained in the cells is determined. It can be performed by quantification and analysis,
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) Days after), the amount of mRNA of the GPCR of the present invention contained in the transformant can be quantified and analyzed.
[0056]
The compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is a compound having an effect of changing the expression level of the GPCR of the present invention, and specifically, (a) increasing the expression level of the GPCR of the present invention. The cell stimulating activity through the GPCR of the present invention (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. And (b) a compound that reduces the expression level of the GPCR of the present invention to thereby reduce the cell stimulating activity.
Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
The ligand of the GPCR of the present invention is β-alanine or L-carnosine as described above. Therefore, the compound that alters the expression level of the GPCR of the present invention obtained by the above-mentioned screening method may be a central or peripheral nerve function regulating agent or a disease associated with dysfunction of the GPCR of the present invention, in particular, central or peripheral dysfunction of the peripheral nerve. Can be used as a prophylactic / therapeutic agent.
Specifically, a compound that increases the expression level of the GPCR of the present invention and enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the GPCR of the present invention.
The compound that reduces the expression level of the GPCR of the present invention and attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by excessive expression of the CPCR of the present invention.
Diseases associated with the dysfunction of the GPCR of the present invention include, for example, central nervous function such as anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia resistance, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, etc. Abnormal disease or incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, imminent premature birth, male infertility, peripheral nerve dysfunction such as autonomic imbalance, as well as cerebrovascular disorders, cerebral (pediatric) paralysis, spastic spinal palsy, spinal cord blood vessels Disorders, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma (spinal cord injury, head trauma), sequelae of the operation (brain and spinal cord) Other cerebral disorders including tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, numbness and the like.
Diseases caused by overexpression of the GPCR of the present invention include, for example, ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis, etc. Is mentioned.
[0057]
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0058]
In addition, the above medicines include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, (Eg, polyethylene glycol), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, the target organ, the condition, the administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in a schizophrenic patient (with a body weight of 60 kg), one day is generally used. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. For example, in the case of injection, it is usually used, for example, in schizophrenia patients (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0059]
(4) Quantitative method and diagnostic method for ligand for GPCR of the present invention
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the GPCR of the present invention, it can be used for quantification of the GPCR in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and the labeled GPCR of the present invention competitively, and measuring the ratio of the labeled GPCR of the present invention bound to the antibody. A method for quantifying the GPCR in a test solution, and
(Ii) After reacting a test solution with the antibody of the present invention immobilized on a carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or continuously, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. A method for quantifying the GPCR of the present invention in a test solution is provided.
[0060]
In the quantitative method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the GPCR of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the GPCR.
In addition, the GPCR of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the GPCR, and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, and the F (ab ') 2 , Fab ′ or Fab fraction may be used.
The method for quantifying the GPCR of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen in the test solution (eg, the amount of the GPCR of the present invention). Any method may be used as long as it is a method for measuring the amount of γ by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
[0061]
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] is used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
For the insolubilization of the antigen or the antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a GPCR or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the GPCR of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In addition, in the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
[0062]
In the method for measuring the GPCR of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the GPCR of the present invention binds. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the GPCR of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably C For example, an antibody that recognizes an N-terminal other than the end is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble sediment produced as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. The measurement system of the GPCR of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Third Edition), 3rd edition (Medical Shoin, Showa) 62)), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), ibid., Vol. 84 (Immunochemical Technologies (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Technologies (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all published by Academic Press) can be referred to.
As described above, the GPCR of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
[0063]
Furthermore, when a decrease in the concentration of the GPCR of the present invention is detected by quantifying the concentration of the GPCR of the present invention using the antibody of the present invention, for example, dysfunction of the GPCR, in particular, central or (and) peripheral nerve function It can be diagnosed that the patient is likely to have a disease associated with the abnormality or is likely to suffer in the future.
Further, when an increase in the concentration of the GPCR of the present invention is detected, for example, it is diagnosed that there is a high possibility of suffering from a disease caused by overexpression of the GPCR, or that there is a high possibility of suffering from the disease in the future. Can be.
Diseases associated with the dysfunction of the GPCR of the present invention include, for example, central nervous function such as anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia resistance, convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders and the like. Abnormal disease or incontinence, neurological hypertension, imminent miscarriage, imminent preterm birth, male infertility, peripheral nerve dysfunction such as autonomic imbalance, and cerebrovascular disorder, cerebral (child) paralysis, spastic spinal palsy, spinal cord blood vessels Disorders, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma (spinal cord injury, head trauma), sequelae of the operation (brain and spinal cord) Other cerebral disorders including tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, numbness and the like.
Examples of the disease caused by overexpression of the GPCR of the present invention include ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis. Is mentioned.
[0064]
(5) Screening method of agonist for GPCR of the present invention
Since β-alanine or L-carnosine binds to the GPCR of the present invention, suppression of intracellular cAMP production is observed. Therefore, the GPCR of the present invention uses the intracellular signal as an indicator to express β- or L-carnosine for the GPCR of the present invention. It is useful as a reagent for searching or determining other agonists (including natural ligands).
That is, the present invention provides a method for determining an agonist for the GPCR of the present invention, which comprises measuring the activity of suppressing the intracellular cAMP production via the GPCR of the present invention when a test compound is brought into contact with a cell containing the GPCR of the present invention. Provide a method. Test compounds include known ligands (eg, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP (eg, PACAP27, PACAP38), secretin, Glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Related Polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide) ), Leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline Chemokine superfamily (eg, CXC chemokine subfamily such as IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, GCP-2, PF4, IP-10, Mig, PBSF / SDF-1; MCAF / MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, HCC-1, MIP-3α / LARC, MIP-3β / ELC, I-309, TARC , MIPF-1, MIPF-2 / eotaxin-2, MDC, DC-CK1 / PARC, CC chemokine subfamily such as SLC; C chemokine subfamily such as lymphotoactin; CX3C chemokine subfamily such as fractionalkine, etc.), endothelin, entero Gust Histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine 1-phosphate, etc.), as well as, for example, humans or mammals (eg, mice, rats, pigs, Tissue extracts of bovine, ovine, monkey, etc.), cell culture supernatants, low molecular weight synthetic compounds and the like are used. For example, the tissue extract, the cell culture supernatant and the like are added to the GPCR of the present invention, and fractionated while measuring the cell stimulating activity and the like, and finally a single ligand can be obtained.
[0065]
Specifically, the method for determining an agonist of the present invention comprises constructing an expression system for the recombinant GPCR of the present invention, and using a receptor binding assay system using the expression system to allow intracellular cAMP mediated by the GPCR of the present invention. This is a method for determining a compound having a production inhibitory activity or a salt thereof.
More specifically, the present invention provides the following determination method.
(1) a method for determining an agonist for the GPCR of the present invention, which comprises measuring the activity of suppressing intracellular cAMP production when a test compound is brought into contact with a cell containing the GPCR of the present invention, and
(2) Measuring the activity of inhibiting the intracellular cAMP production via the GPCR of the present invention when the test compound is brought into contact with the GPCR of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the GPCR DNA of the present invention. A method for determining an agonist for the GPCR of the present invention is provided.
In particular, it is preferable to perform the above test after confirming that the test compound binds to the GPCR of the present invention.
[0066]
When cells containing the GPCR of the present invention are used in the method of determining an agonist of the present invention, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
The membrane fraction of the cell containing the GPCR of the present invention refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by crushing cells and then by a known method. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, or ejecting the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed GPCR of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
[0067]
The amount of the GPCR of the present invention in cells containing the GPCR of the present invention or in the cell membrane fraction thereof is 10 per cell. 3 -10 8 Preferably a molecule 5 -10 7 Preferably it is a molecule. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
In order to carry out the agonist determination method of the present invention, the intracellular cAMP production inhibitory activity mediated by the GPCR of the present invention can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the GPCR of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before determining the agonist, replace with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, extract the cells or collect the supernatant, The quantified product is quantified according to each method. When production of a substance (for example, cAMP or the like) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like.
The kit for determining an agonist of the present invention contains a cell containing the GPCR of the present invention or a cell membrane fraction thereof.
Since the agonist for the GPCR of the present invention determined in this way binds to the GPCR of the present invention and regulates its physiological function, it prevents or prevents diseases related to the function of the central or peripheral nervous system function or the GPCR of the present invention. It can be used as a therapeutic agent. Specifically, anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, threatened premature labor, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as infertility and autonomic imbalance. Further, the agonist for the GPCR of the present invention may be a cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis Prevention of illness, spinocerebellar degeneration, trauma sequelae (spinal cord injury, head trauma), postoperative sequelae (other cerebral disorders including brain and spinal cord tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, numbness, etc. It can be used as a therapeutic agent and the like.
[00068]
(6) A screening method for compounds (agonists, antagonists, etc.) that alter the binding between the GPCR of the present invention and a ligand, and a medicament containing a compound that alters the binding between the GPCR of the present invention and a ligand
By using the GPCR of the present invention or constructing a recombinant GPCR expression system and using a receptor binding assay system using the expression system, β-alanine or L-carnosine as a ligand and the GPCR of the present invention can be used. (Eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be efficiently screened.
Such compounds include (a) compounds having a cell stimulating activity via the GPCR of the present invention (so-called agonists for the GPCR of the present invention), and (b) compounds having no cell stimulating activity (so-called compounds against the GPCR of the present invention). Antagonists), (c) a compound that enhances the binding force between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, or (d) a compound that decreases the binding force between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention. Is included.
That is, the present invention relates to (i) a case where the present GPCR is brought into contact with β-alanine or L-carnosine and (ii) a case where the present GPCR is brought into contact with β-alanine or L-carnosine and a test compound. And a method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, wherein the method comprises comparing with β-alanine or L-carnosine.
The screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of β-alanine or L-carnosine binding to the GPCR of the present invention, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared. And
Cell stimulating activity includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Among them, cAMP production inhibitory activity is preferred.
[0069]
More specifically, the present invention provides
a) The labeled β-alanine or L-carnosine was contacted with the GPCR of the present invention, and the labeled β-alanine or L-carnosine and the test compound were contacted with the GPCR of the present invention. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between β-alanine or L-carnosine and the GPCR, comprising measuring and comparing the amount of alanine or L-carnosine bound to the GPCR;
b) When a labeled β-alanine or L-carnosine is brought into contact with a cell containing the GPCR of the present invention or a membrane fraction of the cell, a labeled β-alanine or L-carnosine and a test compound are compared with the GPCR of the present invention. Is characterized by measuring the amount of labeled β-alanine or L-carnosine bound to the cell or the membrane fraction when contacted with the cell or the membrane fraction of the cell, and comparing -A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding between alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention,
c) When the labeled β-alanine or L-carnosine is brought into contact with the GPCR of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, -Binding of labeled β-alanine or L-carnosine to carnosine and a test compound to the GPCR when the transformant containing the DNA of the present invention is contacted with the GPCR of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA of the present invention A method of measuring the amount and comparing the compound or the salt thereof, which changes the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR,
[0070]
d) A compound that activates the GPCR of the present invention (eg, β-alanine or L-carnosine) is contacted with a cell containing the GPCR of the present invention. Screening of a compound or a salt thereof that changes the binding property between a ligand and the GPCR, wherein the cell stimulating activity mediated by the GPCR of the present invention is measured and compared when the cell is brought into contact with a cell containing the GPCR of the present invention. Method, and
e) A compound that activates the GPCR of the present invention (eg, β-alanine or L-carnosine) was brought into contact with the GPCR of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. A cell mediated by a receptor protein when the compound activating the GPCR of the present invention and the test compound are brought into contact with the GPCR of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, which comprises measuring and comparing the stimulatory activities.
Further, as the ligand, a compound that changes the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention or a salt thereof can be used instead of β-alanine or L-carnosine. The compound or a salt thereof that changes the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention is subjected to the below-described screening method of the present invention using β-alanine or L-carnosine as a ligand, for example. Can be obtained by: In the following screening methods, the term “β-alanine or L-carnosine” is used, including a compound or a salt thereof that alters the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention.
[0071]
The specific description of the screening method of the present invention is as follows.
First, the GPCR of the present invention used in the screening method of the present invention may be any GPCR containing the above-described GPCR of the present invention. Minutes are preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, human-derived TGR7 and the like, which are expressed in large amounts using recombinants, are suitable for screening.
[0072]
The above-mentioned method is used for producing the GPCR of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells. A complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. In order to introduce a DNA fragment encoding the GPCR of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment is required to be expressed by a nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to a baculovirus using an insect as a host. ), It is preferable to incorporate the promoter into the downstream of the polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like. The quantity and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P .; Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
Therefore, in the screening method of the present invention, the GPCR of the present invention may be a GPCR of the present invention purified according to a method known per se, or a cell containing the GPCR may be used. The membrane fraction of cells containing the GPCR may be used.
[0073]
When cells containing the GPCR of the present invention are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
The cell containing the GPCR of the present invention refers to a host cell that has expressed the GPCR, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, or squirting the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed GPCR of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of the GPCR in the cell or membrane fraction containing the GPCR of the present invention is 10 per cell. 3 -10 8 Preferably a molecule 5 -10 7 Preferably it is a molecule. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
[0074]
In order to carry out the above a) to c) for screening for a compound that alters the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, for example, an appropriate GPCR fraction of the present invention and a labeled β -Alanine or L-carnosine is required.
The GPCR fraction of the present invention is preferably a natural GPCR fraction of the present invention or a recombinant GPCR fraction having an activity equivalent thereto. Here, “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
As the labeled β-alanine or L-carnosine, labeled β-alanine or L-carnosine, or labeled β-alanine analog or labeled L-carnosine is used. For example, [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like, β-alanine or L-carnosine, or the like is used.
Specifically, in order to screen for a compound that alters the binding between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, first, cells containing the GPCR of the present invention or a membrane fraction of the cells are suitable for screening. The GPCR sample is prepared by suspending the sample in a buffer. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer. . Further, in order to reduce non-specific binding, CHAPS, Tween-80 are used. TM Surfactants such as (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, a protease inhibitor such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor protein or ligand by the protease. A fixed amount (5000 to 500000 cpm) of labeled β-alanine or L-carnosine is added to 0.01 to 10 ml of the receptor protein solution, and 10 -4 -10 -10 M test compounds are allowed to coexist. A reaction tube to which a large excess of unlabeled β-alanine or L-carnosine is added to determine the non-specific binding amount (NSB) is also prepared. The reaction is carried out at about 0-50 ° C, preferably about 4-37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist (B 0 ) Minus the amount of non-specific binding (NSB) (B 0 -NSB) as 100%, a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
[0075]
In order to carry out the above methods d) to e) for screening for a compound that alters the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, for example, cell stimulating activity mediated by the GPCR of the present invention (for example, Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Activity, particularly the activity of inhibiting intracellular cAMP production) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
Specifically, first, cells containing the GPCR of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, the cells were exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that does not show toxicity to cells, and a test compound was added and incubated for a certain period of time. The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring the cell stimulating activity, cells expressing an appropriate GPCR of the present invention are required. As the cells expressing the GPCR of the present invention, a cell line having the natural GPCR of the present invention, a cell line expressing the above-mentioned recombinant GPCR, and the like are desirable.
As the test compound, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like are used, and even if these compounds are novel compounds, Or a known compound.
As the test compound, a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of the GPCR of the present invention and the position of the ligand binding pocket is preferably used. The atomic coordinates of the active site and the position of the ligand binding pocket of the GPCR of the present invention can be measured by a known method or a method analogous thereto.
Whether the compound that alters the binding between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention is an agonist or an antagonist can be confirmed using the above-described method for screening an agonist for the GPCR of the present invention.
[0076]
A screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention may be a membrane of a GPCR of the present invention, a cell containing the GPCR of the present invention, or a membrane of a cell containing the GPCR of the present invention. And those containing fractions.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagent
a) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C., or may be prepared at use.
b) GPCR preparation of the present invention
CHO cells expressing the GPCR of the present invention were placed in a 12-well plate at 5 × 10 5 5 Passage at 37 ° C, 5% CO 2 , Cultured at 95% air for 2 days.
c) labeled β-alanine or L-carnosine
Commercially available [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like, β-alanine or L-carnosine
The aqueous solution is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer before use.
d) β-alanine or L-carnosine standard solution
β-alanine or L-carnosine is dissolved to a concentration of 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at −20 ° C.
[0077]
2. Measurement method
a) The CHO cells expressing the GPCR of the present invention cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
b) 10 -3 -10 -10 After adding 5 μl of the M test compound solution, 5 μl of labeled β-alanine or L-carnosine is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 10 -3 Add 5 μl of M β-alanine or L-carnosine.
c) Remove the reaction solution and wash three times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
d) Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B-NSB) / (B 0 −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample was added
NSB: Non-specific Binding (Non-specific binding amount)
B 0 : Maximum binding amount
[0078]
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, and specifically, (A) a compound having a cell stimulating activity via a G protein-coupled receptor protein (a so-called agonist for the GPCR of the present invention); (b) a compound having no cell stimulating activity (a so-called antagonist to the GPCR of the present invention); C) a compound that enhances the binding strength between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, or (d) a compound that decreases the binding strength between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention.
Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is useful as a central or peripheral nerve function modulator.
Since the agonist for the GPCR of the present invention has the same action as the biological activity of β-alanine or L-carnosine, which is a ligand for the GPCR of the present invention, depending on the biological activity of β-alanine or L-carnosine, It is useful as a safe and low toxic drug.
Since the antagonist to the GPCR of the present invention can suppress the biological activity of β-alanine or L-carnosine which is a ligand for the GPCR of the present invention, it is safe to suppress the biological activity of β-alanine or L-carnosine. It is useful as a low toxic drug.
Since the compound that enhances the binding strength between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention can enhance the physiological activity of β-alanine or L-carnosine that is a ligand for the GPCR of the present invention, β-alanine Alternatively, it is useful as a safe and low toxic drug depending on the physiological activity of L-carnosine.
Since the compound that decreases the binding force between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention can reduce the physiological activity of β-alanine or L-carnosine that is a ligand for the GPCR of the present invention, β-alanine Alternatively, it is useful as a safe and low toxic drug for suppressing the physiological activity of L-carnosine.
Specifically, (1) an agonist for the GPCR of the present invention or (2) a compound that enhances the binding force between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention obtained using the screening method or the screening kit of the present invention Or a salt thereof, for example, an anxiolytic, hypnotic, sedative, muscle relaxant, anesthetic enhancer, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorder, incontinence, neurological hypertension, imminent abortion, imminent premature birth It is useful as a preventive / therapeutic agent for diseases such as male infertility and autonomic imbalance. Furthermore, (1) an agonist for the GPCR of the present invention or (2) a compound or a salt thereof that enhances the binding strength between the GPCR of the present invention and β-alanine or L-carnosine obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention. Include cerebrovascular disease, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disease, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, To be used as a preventive or remedy for post-traumatic sequelae (spinal cord injury, head trauma), post-operative sequelae (other cerebral diseases including brain and spinal cord tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, numbness, etc. Can be.
A compound or a salt thereof, which is obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention for (1) an antagonist to the GPCR of the present invention or (2) a binding force between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, For example, it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis.
[0079]
When the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0080]
The above-mentioned medicines include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, (Eg, polyethylene glycol), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
For example, the dosage of the agonist for the GPCR of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, generally, for example, in a schizophrenic patient (with a body weight of 60 kg), About 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. For example, usually in the form of injection, for example, schizophrenic patients (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0081]
(6) Elucidation of the mechanism of action of various drugs
By using the GPCR of the present invention, it can be confirmed whether or not various drugs exert pharmacological effects via the GPCR of the present invention.
That is, the present invention
(1) A central or peripheral nerve function modulator or an anxiety disorder, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia sensitivity, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, characterized by using the GPCR of the present invention. Psychosomatic disease, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament Ossification, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hyperesthesia, numbness, ataxia, paralysis, depression, delayed arousal, memory Learning disability, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea or a method of confirming that a preventive or therapeutic agent for sensory paralysis binds to the receptor protein or a salt thereof,
(2) a central or peripheral nerve function modulator, or anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthetic sensitivity, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, Psychosomatic disease, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament Ossification, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hypersensitivity or numbness preventive / therapeutic agent is an agonist for the receptor protein or a salt thereof. How to make sure that
(3) A central or peripheral nerve function modulator or ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, respiration characterized by using the GPCR of the present invention. A method for confirming that a prophylactic / therapeutic agent for difficulty, dependence or sensory paralysis is an antagonist to the receptor protein or a salt thereof,
(4) The screening method according to any one of (1) to (3), wherein the amount of binding between each drug and the GPCR of the present invention is measured when each drug is brought into contact with the GPCR of the present invention.
This confirmation method can be carried out by using the above-mentioned drug instead of the test compound in the above-mentioned method for screening a compound that changes the binding property between the ligand and the GPCR of the present invention.
Further, the kit for a confirmation method of the present invention is a kit for screening a compound that changes the binding property between the ligand and the GPCR of the present invention, which contains the above drug in place of the test compound.
As described above, by using the confirmation method of the present invention, it is possible to confirm that various drugs that are commercially available or are under development exert a pharmacological effect through the GPCR of the present invention.
[0082]
(7) A medicine containing a compound that changes the amount of the GPCR of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the GPCR of the present invention, it can be used for screening for a compound that changes the amount of the GPCR of the present invention in a cell membrane.
That is, the present invention, for example,
(I) a) the blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) the tissue or cells isolated from the organ, etc., and then the cell membrane fraction is isolated, and the GPCR of the present invention contained in the cell membrane fraction A method for screening a compound that changes the amount of the GPCR of the present invention in a cell membrane by quantifying
(Ii) After disrupting a transformant or the like that expresses the GPCR of the present invention, the cell membrane fraction is isolated, and the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane is changed by quantifying the GPCR of the present invention contained in the cell membrane fraction. Compound screening method,
(Iii) a) the blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or a cell isolated from the organ, and then use the immunostaining method to obtain the receptor on the cell surface. Provided is a method for screening a compound that changes the amount of the GPCR of the present invention in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the protein.
(Iv) Transformants expressing the GPCR of the present invention are sectioned, and the degree of staining of the receptor protein on the cell surface is quantified by using an immunostaining method, whereby the protein on the cell membrane is quantified. And a method for screening a compound that changes the amount of the GPCR of the present invention in a cell membrane by confirming the following.
[0083]
The quantification of the GPCR of the present invention contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hepes buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is destroyed. Activator (eg, Triton X100 TM , Tween 20 TM And the like, and further using a method such as centrifugation, filtration, or column fractionation to obtain a cell membrane fraction.
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, or squirting the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed GPCR of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The GPCR of the present invention contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se.
(Ii) A transformant expressing the GPCR of the present invention is prepared according to the above method, and the GPCR of the present invention contained in the cell membrane fraction can be quantified.
[0084]
Screening for a compound that alters the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane can be performed by (i) a predetermined time (30 minutes to 24 hours before administration of a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal, Preferably 30 minutes to 12 hours before, more preferably 1 hour to 6 hours before, or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours). The test compound is administered at the same time as the drug or physical stress, and after a lapse of a predetermined time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours). Time), by quantifying the amount of the GPCR of the invention in the cell membrane,
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) Days later) by quantifying the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane.
The GPCR of the present invention contained in the cell membrane fraction is specifically confirmed as follows.
(Iii) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention. By quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface, the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane can be quantitatively or qualitatively confirmed by confirming the protein on the cell membrane.
(Iv) The same can be confirmed by using a transformant expressing the GPCR of the present invention or the like and performing the same procedure.
[0085]
The compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is a compound having an effect of changing the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane, and specifically, (a) increasing the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane And (b) a compound that reduces the cell stimulating activity by decreasing the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane.
Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
The compound or its salt obtained by using the screening method of the present invention is useful as a central or peripheral nerve function regulator.
A compound that enhances the cell stimulating activity by increasing the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane is useful as a safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the GPCR of the present invention.
A compound that reduces the cell stimulating activity by reducing the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane is useful as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for diseases caused by overexpression of the GPCR of the present invention.
Specifically, the compound or a salt thereof that increases the amount of the GPCR of the present invention is, for example, an anxiolytic, a hypnotic sedative, a muscle relaxant, an anesthetic enhancer, or convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as incontinence, incontinence, neurological hypertension, imminent miscarriage, imminent premature labor, male infertility, and autonomic imbalance. Furthermore, the compound or a salt thereof that increases the amount of the GPCR of the present invention may be used for cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis , Amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, post-traumatic sequelae (spinal cord injury, head trauma), post-operative sequelae (other cerebral disorders including brain and spinal cord tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as numbness.
The compound or a salt thereof that reduces the amount of the GPCR of the present invention may be, for example, ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for such diseases.
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
[0086]
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
Examples of the prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
For example, the dose of the compound or a salt thereof that increases the amount of the GPCR of the present invention in the cell membrane varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. For a sick patient (assuming a body weight of 60 kg), the dose is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. For example, usually in the form of injection, for example, schizophrenic patients (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0087]
(8) A medicine containing an antibody against the GPCR of the present invention
The neutralizing activity of the antibody against the GPCR of the present invention means an activity of inactivating a signal transduction function involving the GPCR. Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, signaling involving the GPCR, for example, cell stimulating activity via the GPCR (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Can be inactivated.
Therefore, the neutralizing antibody against the GPCR of the present invention can be used as a central or peripheral nerve function modulator or a disease caused by overexpression of the GPCR (eg, ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis.
[0088]
(9) A medicine containing the antisense DNA of the present invention
The antisense DNA of the present invention may be used for controlling central or peripheral nervous function modulators or diseases caused by overexpression of the GPCR of the present invention (eg, ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension) Diseases such as dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis).
For example, when using the antisense DNA, the antisense DNA can be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. The antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
[0089]
(10) Preparation of the DNA-introduced animal of the present invention
The present invention relates to a non-human mammal having a foreign DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as the foreign DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the foreign mutant DNA of the present invention). provide.
That is, the present invention
[1] a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
[2] the animal of [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[3] the animal of [2], wherein the rodent is a mouse or a rat, and
[4] It is to provide a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA and capable of being expressed in mammals.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by transferring a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. In addition, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) B6C3F as a system 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD etc.) is preferred.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
[0090]
The exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA and the like are used, and also include abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses the abnormal GPCR of the present invention, and for example, a DNA that expresses a GPCR that suppresses the function of the normal GPCR of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is transferred, DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto is expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.
[0091]
Examples of the expression vector of the GPCR of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as λ phage, a retrovirus such as Moloney leukemia virus, and an animal virus such as vaccinia virus or baculovirus. Is used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, but are not limited to, promoters for DNA derived from (1) viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, polio virus, etc.); ▼ Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine triphosphatase (Na, K-ATPase), neurofilament light chains, metallothionein I and IIA, Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α And β-myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, Pre Russia enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of a messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal. For example, a sequence of each DNA derived from a virus and various mammals is preferably used. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.
[0092]
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region or in the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal translation region of the GPCR of the present invention includes liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. All or a part of genomic DNA can be obtained from various genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA can be used as a raw material. The foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the normal translation region of the GPCR of the present invention obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal by confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
[0093]
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention has high expression of the normal DNA of the present invention, and eventually develops hyperactivity of the GPCR of the present invention by promoting the function of endogenous normal DNA. Can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the GPCR of the present invention and diseases associated with the GPCR of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. is there.
In addition, since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the free GPCR of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the GPCR of the present invention.
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in an ordinary breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
[0094]
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA, thereby inactivating the functionally inactive type of the GPCR of the present invention. In some cases, it can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the GPCR of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific possibility, the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention elucidates the function inhibition (dominant negative action) of the normal GPCR by the abnormal GPCR of the present invention in the inactive refractory disease of the GPCR of the present invention. Model.
In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the free GPCR of the present invention, it can be used for a therapeutic drug screening test for inactive refractory of the GPCR of the present invention. .
In addition, other possible uses of the above two kinds of DNA transgenic animals of the present invention include, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) A DNA specifically expressed or activated by the GPCR of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing the GPCR of the present invention expressed by DNA. Analysis of the relevance to the invention GPCR,
{Circle around (3)} The cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture.
(4) screening for a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in (3) above, and
{Circle around (5)} The mutant GPCR of the present invention may be isolated and purified, and its antibody may be produced.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease associated with the GPCR of the present invention, including a functionally inactive type refractory disease of the GPCR of the present invention. A more detailed pathological finding in each organ of the disease model can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-transferred animal of the present invention, cut it into small pieces, and then use a protease such as trypsin to obtain the released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to examine the specificity of the GPCR-producing cell of the present invention, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism, and its abnormalities. It is an effective research material.
Furthermore, in order to use the DNA transgenic animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the GPCR of the present invention, including the inactive refractory type of the GPCR of the present invention, the above-mentioned test method and quantification method, Can be used to provide an effective and rapid method for screening for a therapeutic agent for the disease. Further, using the transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with the GPCR of the present invention.
[0095]
(11) Knockout animal
The present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
[1] a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
[2] the embryonic stem cell according to [1], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
[3] the embryonic stem cell according to [1], which is neomycin-resistant;
[4] the embryonic stem cell according to [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[5] the embryonic stem cell of [4], wherein the rodent is a mouse;
[6] a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
[7] The DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention [6]. The non-human mammal according to the item,
[8] the non-human mammal according to [6], wherein the non-human mammal is a rodent;
[9] the non-human mammal of [8], wherein the rodent is a mouse, and
[10] A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal according to [7] and detecting the expression of a reporter gene. I will provide a.
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability, or By substantially losing the activity of the GPCR of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the GPCR of the present invention (hereinafter, may be referred to as the knockout DNA of the present invention). Refers to human mammalian embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
[0096]
Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the exon function, or insert a DNA sequence that terminates gene transcription into an intron between exons (for example, a polyA addition signal); Inability to synthesize complete messenger RNA Thus, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells PCR using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe and a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as a primer And can be obtained by selecting the knockout ES cells of the present invention.
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetic background is used. For example, to obtain ES cells in which BDF is clearly known, for example, BDF in which the number of eggs collected by C57BL / 6 mice or C57BL / 6 was improved by hybridization with DBA / 2 1 Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2) 1 ) Can also be used favorably. BDF 1 In addition to the advantage that the number of eggs collected and the eggs are robust, the mice have C57BL / 6 mice as their background. / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. In addition, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
[0097]
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. Using this method, conventionally, it has been necessary to carry out about 10 6 Since the number of ES cells is required, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient, so that the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female. In addition, by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be significantly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the normal cells (for example, chromosomes in mice) are knocked out. It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [M. J. Evans and M.E. H. Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; R. Martin Proc. Of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; C. Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], that the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is characterized by in vitro The present invention is useful in the GPCR of the present invention or the cell biological examination of the GPCR of the present invention.
[0098]
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. The determination can be made by analysis by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of a non-human mammalian stem cell. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or a blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has the mutated DNA locus of the present invention, all the tissues are artificially mutated from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual having a heterozygous expression of the GPCR of the present invention, and mating with an individual having a heterozygous expression of the GPCR of the present invention. Obtainable.
[0099]
When an egg cell is used, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method, and these transgenic non-human mammals can be obtained. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by breeding the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, the non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the GPCR of the present invention, and thus can be a model for a disease caused by inactivation of the biological activity of the GPCR of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[0100]
(11a) A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / prophylactic effect against a disease.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and tested using the change in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. Compounds can be tested for their therapeutic and prophylactic effects.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0101]
In the screening method, when the test compound is administered to a test animal, if the disease symptom of the test animal is reduced by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound is administered. It can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above diseases.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease (eg, anxiety, insomnia, excitability, muscular atrophy) caused by deficiency or damage of the GPCR of the present invention. , Anesthetic resistance, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, imminent preterm birth, male infertility, autonomic dysfunction, etc.) It can be used as a safe and low toxic therapeutic or prophylactic agent, or as a medicament such as a central or peripheral nerve function regulator. Further, compounds obtained by using the screening method include cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis, muscle atrophy Lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma (spinal cord injury, head injury), sequelae after surgery (other cerebral diseases including brain and spinal cord tumors, other myelopathies), pain, hyperesthesia, numbness, etc. It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases and the like.
Further, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the drug containing a compound that alters the binding property between the GPCR of the present invention and a ligand.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dosage of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, for example, in a schizophrenic patient (with a body weight of 60 kg), Is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. For example, usually in the form of injection, for example, schizophrenic patients (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0102]
(11b) Method for screening for a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention
The present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof. A method for screening a salt is provided.
In the above-mentioned screening method, the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the GPCR of the present invention is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the tissue which expresses the GPCR of the present invention originally has β-galactosidase instead of the GPCR of the present invention. Galactosidase is expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal). The expression state of the GPCR in the animal body can be observed. Specifically, the GPCR-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and the color may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may include a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) and a base (eg, an organic acid). And particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
[0103]
The compound of the present invention which promotes the promoter activity for DNA or a salt thereof is useful as a central or peripheral nerve function regulator.
Since the compound or its salt that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention can promote the expression of the GPCR of the present invention and promote the function of the GPCR, for example, a disease associated with dysfunction of the GPCR of the present invention It is useful as a medicament such as a prophylactic / therapeutic agent.
Since the compound or its salt that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention can inhibit the expression of the GPCR of the present invention and inhibit the function of the GPCR, for example, a disease associated with overexpression of the GPCR of the present invention, etc. It is useful as a medicament such as a prophylactic / therapeutic agent.
Diseases associated with dysfunction of the GPCR of the present invention include, for example, anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia resistance, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disease, incontinence, neurology Hypertension, imminent abortion, imminent premature birth, male infertility, autonomic dysfunction, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis Symptoms, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma (spinal cord injury, head trauma), sequelae after surgery (other cerebral disorders including brain and spinal cord tumors, other myelopathies), pain, hypersensitivity And numbness.
Examples of the disease caused by overexpression of the GPCR of the present invention include ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis. Is mentioned.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
[0104]
A drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as a drug containing a compound that alters the binding property between the GPCR of the present invention or a salt thereof and a ligand.
The preparation obtained in this way is safe and low toxic, and thus can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when a compound that promotes the promoter activity for DNA of the present invention is orally administered, generally, for example, psychotropic drugs are used. In a schizophrenic patient (with a body weight of 60 kg), the dose is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. For example, usually in the form of injection, for example, schizophrenic patients (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by the disease or to develop preventive and therapeutic drugs.
In addition, using a DNA containing the promoter region of the GPCR of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal). Then, it becomes possible to specifically synthesize the GPCR and examine the action in the living body. Furthermore, by binding an appropriate reporter gene to the promoter portion and establishing a cell line that expresses this, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the GPCR itself of the present invention can be obtained. Can be used as a search system.
[0105]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or by abbreviations commonly used in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: Cytosine
RNA: ribonucleic acid
mRNA: messenger ribonucleic acid
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
[0106]
Gly: glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: cysteine
Met: methionine
Glu: glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: lysine
Arg: Arginine
His: histidine
Phe: phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
*: Corresponds to the stop codon
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
[0107]
Further, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Tos: p-toluenesulfonyl
CHO: Formyl
Bzl: benzyl
Cl 2 Bzl: 2,6-dichlorobenzyl
Bom: benzyloxymethyl
Z: benzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butoxycarbonyl
DNP: dinitrophenol
Trt: Trityl
Bum: t-butoxymethyl
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-
1,2,3-benzotriazine
HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
[0108]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
SEQ ID NO: 1
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding rat-derived rCB7T084 of the present invention.
SEQ ID NO: 2
1 shows the amino acid sequence of rat-derived rCB7T084 of the present invention.
SEQ ID NO: 3
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding human-derived TGR7 of the present invention.
SEQ ID NO: 4
1 shows the amino acid sequence of human-derived TGR7 of the present invention.
SEQ ID NO: 5
3 shows the nucleotide sequence of a primer for TGR7 used in Example 2.
SEQ ID NO: 6
3 shows the nucleotide sequence of a primer for TGR7 used in Example 2.
SEQ ID NO: 7
7 shows the nucleotide sequence of a TGR7 probe used in Example 2.
SEQ ID NO: 8
7 shows the base sequence of a primer for rCB7T084 used in Example 2.
SEQ ID NO: 9
7 shows the base sequence of a primer for rCB7T084 used in Example 2.
SEQ ID NO: 10
7 shows the base sequence of a probe for rCB7T084 used in Example 2.
[0109]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, the genetic manipulation using Escherichia coli followed the method described in Molecular cloning (Molecular cloning).
[0110]
Example 1 Confirmation of reactivity of β-alanine to rCB7T084 and TGR7
The CHO-K1 cell line was cultured using a Ham F-12 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (Invitrogen) unless otherwise specified. 10cm the day before transfection 2 4.5x10 per 5 Individual cells, 5% CO 2 CO adjusted to concentration 2 The cells were cultured in an incubator at 37 ° C. for 15 hours or more. Transfection was performed using Lipofectamine reagent (Invitrogen) according to the method attached to the reagent. When a 6-well plate was used for the incubator, the procedure was as follows. First, two 1.5 ml tubes were prepared, and 100 μl of Opti-MEM medium (Invitrogen) was dispensed to each tube. Next, 1 μg of the expression vector was added to one tube and 6 μl of the Lipofectamine reagent was added to the other tube, and the two were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. A transfection mixture obtained by adding 800 μl of Opti-MEM medium to this solution was added to CHO-K1 cells previously washed with Opti-MEM medium, 2 The cells were cultured in an incubator for 6 hours. The cells after the culture were rinsed using PBS (Invitrogen), peeled off using a 0.05% trypsin / EDTA solution (Invitrogen), and collected by centrifugation. The number of cells obtained was measured and 5 × 10 4 And diluted into Black walled 96-well plate (Costar) by 200 μl per well. 2 The cells were cultured overnight in an incubator. Various test samples were added to the CHO-K1 cells transiently expressing the receptor by the above transfection operation, and the change in intracellular calcium concentration at this time was measured using FLIPR (Molecular Device). In order to measure the fluctuation of intracellular calcium concentration by FLIPR, the following pretreatment was performed. First, an assay buffer was prepared for adding the fluorescent dye Fluo-3AM (DOJIN) to the cells or washing the cells immediately before performing the FLIPR assay. To a solution (hereinafter, HBSS / HEPES solution) obtained by adding 20 ml of 1 M HEPES (pH 7.4) (DOJIN) to 1000 ml of HBSS (Invitrogen), 710 mg of probenecid (Sigma) is dissolved in 5 ml of 1N NaOH, and then the HBSS / HEPES solution is further dissolved. 10 ml of a solution obtained by adding and mixing 5 ml was added, and this solution was used as an assay buffer. Next, 50 μg of Fluo-3AM was dissolved in 21 μl of DMSO (DOJIN), an equal amount of 20% pluronic acid (Molecular Device) was added and mixed, and then added to 10.6 ml of assay buffer containing 105 μl of fetal calf serum. A fluorescent dye solution was prepared. The medium of the transfected CHO-K1 cells was removed, and the fluorochrome solution was immediately dispensed at 100 μl per well. 2 The cells were cultured in an incubator for 1 hour, and the fluorescent dye was incorporated into the cells. The cells after the culture were washed with the above-mentioned assay buffer, and then set on the FLIPR. In addition, a test sample to be added to the receptor-expressing CHO-K1 cells was prepared using an assay buffer, and simultaneously set in the FLIPR. After the above pretreatment, the change in intracellular calcium concentration after addition of various test samples was measured by FLIPR. -4 M-10 -5 When M was added, it was found that CHO-K1 cells expressing rat rCB7T084 (FIG. 2) and its human form of TGR7 (FIG. 1) respond specifically (increase intracellular calcium concentration). Such a response was not observed in CHO-K1 cells transfected with only the control expression vector (FIG. 3). That is, it was revealed that the ligand of rCB7T084 and its human TGR7 was β-alanine.
[0111]
[Reference Example 1] Construction of expression vectors for rCB7T084 and TGR7
The DNA fragments encoding rCB7T084 and TGR7 were cloned according to the methods described in WO2000 / 205801 and WO2001 / 83748, respectively, and the resulting DNA fragments were introduced into the SalI and SpeI sites of the pAKKO-111 vector, and the respective expression vectors were Was built.
[0112]
Example 2 Examination of TGR7 mRNA tissue distribution in humans by RT-PCR
The cDNA used as a template was synthesized from polyA + RNA (Clontech) derived from various human tissues by the following method. Using 1 μg of RNA, a random primer was used, and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) was used as a reverse transcriptase at 42 ° C. according to the attached manual. After the reaction was completed, ethanol was precipitated and dissolved in 100 μl. RT-PCR was performed using Sequence Detection System Prism 7700 (PE Biosystems), and 5′-GGCTTTCGAATGCACAGAGGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-CGTGGAGAGCCATGCAGAG-3 ′ as primers for amplification and detection. 6) and 5 '-(Fam) -TTCTGCATCTATATCCTCCAACCTGGCGG- (Tamra) -3' (SEQ ID NO: 7) was used as TaqMan probe. The RT-PCR reaction solution was 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.05 μl of 100 μM primer solution, 0.5 μl of 5 μM TaqMan probe, and 0.1 μl of the cDNA solution prepared above. 5 μl was added, and the total reaction solution volume was adjusted to 25 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute were repeated 40 times. The TGR7 mRNA expression level in the obtained human tissues was calculated as the number of copies per 25 ng of total RNA (FIG. 4).
[0113]
Example 3 Examination of tissue distribution of rCB7T084 mRNA in rats by RT-PCR
The cDNA used as a template was synthesized from polyA + RNA derived from various rat tissues by the following method. Using 1 μg of RNA, a random primer was used, and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) was used as a reverse transcriptase at 42 ° C. according to the attached manual. After the reaction was completed, ethanol was precipitated and dissolved in 100 μl. RT-PCR was performed using Sequence Detection System Prism 7700 (PE Biosystems), and 5′-TGATGAACTTCCTGGCTTCTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) and 5′-TGTCCCCTTAGAG sequence as primers for amplification and detection were used. 9) and 5 ′-(Fam) CTGTGTTCAATTCTGGCATCCCCGACAA- (Tamra) -3 ′ (SEQ ID NO: 10) were used as TaqMan probe. The RT-PCR reaction solution was 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.05 μl of 100 μM primer solution, 0.5 μl of 5 μM TaqMan probe, and 0.1 μl of the cDNA solution prepared above. 5 μl was added, and the total reaction solution volume was adjusted to 25 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute were repeated 40 times. The expression level of rCB7T048 mRNA in the obtained rat tissues was calculated as the number of copies per 25 ng of total RNA (FIG. 5).
[0114]
Example 4 Inhibitory Effect of β-alanine and L-carnosine on the Intracellular cAMP Level Increased by Forskolin in CHO Cells Expressing TGR7 and rCB7T084
The CHO cells expressing TGR7 and rCB7T084 were washed with an assay medium (HBSS (GibcoBRL) supplemented with 0.1% bovine serum albumin and 0.2 mM IBMX), and then washed at 37 ° C and 5% CO2. 2 The cells were cultured under the conditions for 30 minutes. Β-alanine (1.0 × 10 4) at each concentration diluted in the assay medium -3 M-3.0 × 10 -7 M) and L-carnosine (1.0 × 10 -3 M-3.0 × 10 -7 M) was added, followed by 1 μM forskolin. 37 ° C, 5% CO 2 The cells were cultured under the conditions for 30 minutes. The culture supernatant was discarded, and the amount of intracellular cAMP was measured using a plate reader (ARVO sx multilabel counter, Wallac) according to the protocol of cAMP screen kit (Applied Biosystems).
As a result, as compared to CHO cells (mock) into which only the vector had been introduced, the amount of intracellular cAMP increased by the addition of forskolin, β-alanine (FIG. 6) and L-specifically, in the CHO cells into which the TGR7 and rCB7T084 genes had been introduced. A dose-dependent and specific reduction by carnosine (FIG. 7) was detected. By pursuing this activity, it was considered possible to purify the endogenous ligand.
[0115]
Example 5 Setting of Screening Method for Agonist and Antagonist to TGR7
(1) Setting of a screening method for agonists and antagonists to TGR7 using changes in intracellular calcium concentration as an index
A system for searching for an agonist and antagonist for TGR7 was set up by the following method.
CHO cell line (CHO-hTGR7) expressing human TGR7 prepared by a method known per se using the human TGR7 expression vector prepared in Reference Example 1 was 3 × 10 4 Per 100 μl of cells, and dispensed into a Black walled 96-well plate (Costar) at 100 μl per well. 2 The cells were cultured overnight in an incubator. The fluctuation of the intracellular calcium concentration was measured using FLIPR (Molecular Device). The method is described below.
50 μg of Fluo-3AM (DOJIN) was dissolved in 21 μl of DMSO (DOJIN), and an equal volume of 20% pluronic acid (Molecular Probes) was added and mixed. After that, 10.6 ml of assay buffer [HBSS] added with 105 μl of fetal bovine serum 20 ml of 1M HEPES (pH 7.4) (DOJIN) was added to (Invitrogen), 710 mg of probenecid (Sigma) was dissolved in 5 ml of 1N NaOH, and then 5 ml of the above HBSS / HEPES solution was added. Prepare. ] To prepare a fluorescent dye solution. Immediately after removing the medium from the cell plate, the fluorescent dye solution was dispensed in a volume of 100 μl per well. 2 The cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour in an incubator, and the fluorescent dye was incorporated into the cells. The cells after the culture were washed using the above-mentioned assay buffer. The test compound to be added to the cells was diluted to each concentration using an assay buffer, and dispensed to the plate. A 90 μM β-alanine solution (30 μM at the final concentration during the reaction) was dispensed to another plate for antagonist measurement, and simultaneously set on the FLIPR. After the above pretreatment, the change in intracellular calcium concentration after the addition of the test compound was measured by FLIPR to measure the agonist effect, and then the addition of β-alanine to measure the antagonist effect. When the test compound is an agonist, an increase in intracellular calcium concentration occurs. When the test compound is an antagonist, an activity of suppressing the reaction of β-alanine added later is observed. From the dose-response curve using the change in the fluorescence intensity value after the addition of the test compound, EC 50 Values were calculated.
(2) Criteria for selecting an agonist candidate from the results of the FLIPR assay
A test compound for selecting an agonist candidate was diluted with DMSO (Wako) in advance so that its concentration was 10 mM, and diluted with the above assay buffer at the time of measurement. Then, a CHO cell line expressing human TGR7 (CHO-hTGR7) and a human histamine H1 receptor expression vector prepared by a method known per se using the test compounds in the same manner as described above. The fluorescence intensity value was measured 30 seconds or 40 seconds after the start of the reaction with the CHO cell line (CHO-H1) expressing the histamine H1 receptor. Further, a relative value was calculated when the fluorescence intensity of 100 μM β-alanine with respect to CHO-hTGR7 was defined as 100%, and the value was 50 or 100% or more with respect to CHO-hTGR7, and the value with respect to CHO-H1 was 25%. % Of the test compound was determined as a candidate human TGR7-specific agonist.
(3) Criteria for selecting antagonist candidates from the results of FLIPR assay
A test compound for selecting an antagonist candidate was diluted with DMSO (Wako) so that its concentration became 10 mM, and then diluted with the above assay buffer at the time of measurement. Then, using the test compounds, after measuring the above-described agonist activity, subsequently, a CHO cell line expressing human TGR7 (CHO-hTGR7) and a CHO cell line expressing human histamine H1 receptor (CHO- The antagonist activity against H1) was measured. To evaluate the antagonist, an agonist (30 μM β-alanine for CHO-hTGR7 and 10 nM histamine for CHO-H1) was added 200 seconds after the start of the reaction, and the fluorescence intensity value at 230 seconds after the start of the reaction was measured. Assuming that the fluorescence intensity of the agonist in the absence of the analyte compound is 100%, the relative value of the fluorescence intensity in the presence of the analyte compound is calculated, and the value is 50% or less relative to CHO-hTGR7 and CHO-H1 A test compound satisfying 80% or more of the target compound was determined as a human TGR7-specific antagonist candidate. From the dose-response curve using the change in the fluorescence intensity value 230 seconds after the start of the reaction, IC 50 Values were calculated.
[0116]
Example 6 Expression analysis of rCB7T084 in rat dorsal root ganglia
In order to examine the expression level of rCB7T084 in ganglia, cDNA was prepared from the total RNA of the dorsal root ganglion and spinal cord of Wister rat (8 weeks old, male) and quantified by TaqMan according to the method of Example 3. (FIG. 8). The expression of rCB7T084 was 390 times higher in the dorsal root ganglion than in the spinal cord, confirming that the rCB7T084 was specifically highly expressed in the dorsal root ganglion. Since the dorsal root ganglion is the passage point of all sensory information from the periphery, rCB7T084 is involved in the transmission of sensory information such as tactile sensation, pressure sensation, warm sensation, cold sensation, pain sensation, kinesthetic sensation, and deep pain. It is considered that
[0117]
【The invention's effect】
The GPCR of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or a DNA encoding the GPCR of the present invention or a partial peptide thereof is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases involving central or (and) peripheral nerve dysfunction such as schizophrenia. It is.
By using the GPCR of the present invention, its partial peptide or its salt and the ligand β-alanine or L-carnosine, the binding between β-alanine or L-carnosine and the GPCR of the present invention, its partial peptide or its salt can be improved. The compound to be changed can be efficiently screened.
[0118]
[Sequence list]
Figure 2004238384
Figure 2004238384
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Figure 2004238384
Figure 2004238384
Figure 2004238384

[Brief description of the drawings]
FIG. 1. Intracellular Ca when β-alanine is added to CHO-K1 cells expressing TGR7 2+ The result of having examined the change of density is shown. Counts on the vertical axis indicates intracellular Ca 2+ The fluorescence intensity indicating the concentration and the time (sec) on the horizontal axis indicate the lapse of time (second) after the start of the measurement. ○ is 10 -4 M, ▲ is 10 -5 M and □ are 10 -6 M.
FIG. 2. Intracellular Ca when β-alanine is added to CHO-K1 cells expressing rCB7T084 2+ The result of having examined the change of density is shown. Counts on the vertical axis indicates intracellular Ca 2+ The fluorescence intensity indicating the concentration and the time (sec) on the horizontal axis indicate the lapse of time (second) after the start of the measurement. ○ is 10 -4 M, ▲ is 10 -5 M and □ are 10 -6 M.
FIG. 3. Intracellular Ca when β-alanine is added to CHO-K1 cells expressing only an expression vector (no insert). 2+ The result of having examined the change of density is shown. Counts on the vertical axis indicates intracellular Ca 2+ The fluorescence intensity indicating the concentration and the time (sec) on the horizontal axis indicate the lapse of time (second) after the start of the measurement. ○ is 10 -4 M, ▲ is 10 -5 M and □ are 10 -6 M.
FIG. 4 shows a tissue distribution map of TGR7 mRNA in humans by RT-PCR. copies / ng mRNA indicates the number of copies per ng of mRNA.
FIG. 5 shows a tissue distribution map of rCB7T084 mRNA in rats by RT-PCR. copies / ng mRNA indicates the number of copies per ng of mRNA.
FIG. 6 shows the results of examining the inhibitory effect of β-alanine on the amount of intracellular cAMP increased by the addition of forskolin in CHO cells expressing TGR7 and rCB7T084. TGR7 shows the results when using CHO cells expressing TGR7, rCB7T084 shows the results using CHO cells expressing rCB7T084, and Mock shows the results when using CHO cells into which only the vector was introduced. Basal shows no stimulation with forskolin. Fsk shows the case where 1 μM of forskolin was added. The horizontal axis indicates the concentration of β-alanine added, and 1E-03 indicates 1.0 × 10 -3 M × 3E-04 is 3.0 × 10 -4 M, 1E-04 is 1.0 × 10 -4 M, 3E-05: 3.0 × 10 -5 M, 1E-05 is 1.0 × 10 -5 M, 3E-06 is 3.0 × 10 -6 M, 1E-06 is 1.0 × 10 -6 M, 3E-07 is 3.0 × 10 -7 M. The vertical axis indicates the amount of intracellular cAMP.
FIG. 7 shows the results of examining the inhibitory effect of L-carnosine on the amount of intracellular cAMP increased by the addition of forskolin in CHO cells expressing TGR7 and rCB7T084. TGR7 shows the results when using CHO cells expressing TGR7, rCB7T084 shows the results using CHO cells expressing rCB7T084, and Mock shows the results when using CHO cells into which only the vector was introduced. Basal shows no stimulation with forskolin. Fsk shows the case where 1 μM of forskolin was added. The horizontal axis shows the concentration of added L-carnosine, and 1E-03 is 1.0 × 10 -3 M × 3E-04 is 3.0 × 10 -4 M, 1E-04 is 1.0 × 10 -4 M, 3E-05: 3.0 × 10 -5 M, 1E-05 is 1.0 × 10 -5 M, 3E-06 is 3.0 × 10 -6 M, 1E-06 is 1.0 × 10 -6 M, 3E-07 is 3.0 × 10 -7 M. The vertical axis indicates the amount of intracellular cAMP.
FIG. 8 shows the expression levels of rCB7T084 mRNA in rat dorsal root ganglia and spinal cord by RT-PCR. Copies / 25ng total RNA indicates the number of copies per 25ng of total RNA.

Claims (45)

配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤。Central or peripheral nerve comprising a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof or a salt thereof Function regulator. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤。An anti-anxiety agent comprising a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; Hypnotic sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, neurological hypertension, imminent miscarriage, imminent premature birth, male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular Disorders, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorders, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, trauma sequelae, surgery Agent for preventing or treating sequelae, pain, hyperesthesia or numbness. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤。Contains a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a partial peptide thereof A central or peripheral nerve function regulator. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤。Contains a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a partial peptide thereof Anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthesia enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, impending abortion, imminent premature birth, male infertility, Autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cerebellum Agent for preventing or treating degeneration, post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる中枢または末梢神経機能異常の診断剤。Contains a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a partial peptide thereof A diagnostic agent for central or peripheral nerve dysfunction. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏、しびれ、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難または感覚麻痺の診断剤。Contains a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a partial peptide thereof Anxiety, insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia sensitivity, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorder, incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, imminent premature birth, male infertility, autonomy Ataxia, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration Symptoms, trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia, numbness, motor ataxia, paralysis, depression, delayed arousal, memory learning disability, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea or sensation Of diagnostic agents. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤。A center comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; Peripheral nerve function regulator. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤。Motor function comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial peptide thereof or a salt thereof An agent for preventing or treating ataxia, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤。Complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial peptide thereof Central or peripheral nerve function modulator comprising a polynucleotide comprising a basic nucleotide sequence or a part thereof. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤。Complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial peptide thereof Dysfunction, paralysis, depression, delayed arousal, memory learning disorder, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence comprising a polynucleotide comprising a basic nucleotide sequence or a part thereof For the prevention or treatment of sickness or sensory palsy. （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンまたはＬ−カルノシンを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, and (2) β-alanine Alternatively, a method of screening for a compound or a salt thereof that alters the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine or L-carnosine, wherein L-carnosine is used. （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンまたはＬ−カルノシンを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, and (2) β-alanine Alternatively, a kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and β-alanine or L-carnosine, which comprises L-carnosine. 請求項１１記載のスクリーニング方法または請求項１２記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、β−アラニンまたはＬ−カルノシンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。An amino acid sequence identical to or substantially identical to β-alanine or L-carnosine and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which can be obtained by using the screening method according to claim 11 or the screening kit according to claim 12. Or a salt thereof, which alters the binding to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, which contains the same amino acid sequence as described above. （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, and (2) the receptor protein Alternatively, a method for screening for an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising using a compound or a salt thereof that changes the binding property between the salt and β-alanine or L-carnosine. （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンまたはＬ−カルノシンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, and (2) the receptor protein Alternatively, a kit for screening an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising a compound or a salt thereof that alters the binding property between the salt and β-alanine or L-carnosine. β−アラニンまたはＬ−カルノシンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。Alters the binding of β-alanine or L-carnosine to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a salt thereof A medicament comprising a compound or a salt thereof. 中枢または末梢神経機能調節剤である請求項１６記載の医薬。17. The medicament according to claim 16, which is a central or peripheral nerve function regulator. （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, and (2) β-alanine A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding between β-alanine and said receptor protein or a salt thereof, characterized by using （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）β−アラニンを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, and (2) β-alanine A screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between β-alanine and the receptor protein or a salt thereof, comprising: 請求項１８記載のスクリーニング方法または請求項１９記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、β−アラニンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。An amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which can be obtained by using the screening method according to claim 18 or the screening kit according to claim 19. A compound or a salt thereof that alters the binding property to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing a sequence. （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。(1) a G protein-coupled receptor protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) the receptor protein Alternatively, a method for screening for an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises using a compound or a salt thereof that changes the binding property between the salt and β-alanine. （１）配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とβ−アラニンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, its partial peptide or a salt thereof, and (2) the receptor protein Alternatively, a kit for screening an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising a compound or a salt thereof that alters the binding property between the salt and β-alanine. β−アラニンと配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。A compound that changes the binding property of β-alanine to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a compound thereof A medicament comprising a salt. 中枢または末梢神経機能調節剤である請求項１６記載の医薬。17. The medicament according to claim 16, which is a central or peripheral nerve function regulator. 配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤。An anxiolytic agent and a sedative-hypnotic agent comprising an agonist for a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a salt thereof. , Muscle relaxants, anesthetic enhancers or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, imminent preterm birth, male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (Child) Paralysis, spastic spinal palsy, spinal vascular disorders, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, trauma sequelae, post-operative sequelae, An agent for preventing or treating pain, hyperesthesia or numbness. 配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤。Ataxia, paralysis, comprising an antagonist to a G protein-coupled receptor protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a salt thereof; An agent for preventing or treating depression, delayed arousal, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、中枢または末梢神経機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial peptide thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof, which has an effect of changing the expression level of the G protein-coupled receptor protein and regulating central or peripheral nerve function. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる、当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、中枢または末梢神経機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。Contains a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a partial peptide thereof A screening kit for a compound or a salt thereof having an action of changing the expression level of the G protein-coupled receptor protein and regulating central or peripheral nerve function. 請求項２７記載のスクリーニング方法または請求項２８記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、中枢または末梢神経機能を調節する作用を有する化合物またはその塩。An amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which can be obtained by using the screening method according to claim 27 or the screening kit according to claim 28. Or a salt thereof, which has an effect of changing the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof to regulate central or peripheral nerve function. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる中枢または末梢神経機能調節剤。Contains a compound that changes the expression level of a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof, or a salt thereof A central or peripheral nerve function regulator. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤。Contains a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthesia enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, impending abortion, imminent premature birth, male infertility, Autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cerebellum Agent for preventing or treating degeneration, post-traumatic sequelae, post-operative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤。Contains a compound or a salt thereof that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 An agent for preventing or treating motor dysfunction, paralysis, depression, arousal delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis. 試験化合物を配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストのスクリーニング方法。Intracellular cAMP when a test compound is brought into contact with a cell containing a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as that of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. A method for screening an agonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises measuring the production inhibitory activity. β−アラニンまたはＬ−カルノシンを含有してなる配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達作用増強剤。Signal transduction action of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 containing β-alanine or L-carnosine Enhancer. 中枢または末梢神経機能調節剤である請求項３４記載の剤。35. The agent according to claim 34, which is a central or peripheral nerve function regulator. 抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤である請求項３４記載の剤。Anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, premature labor, male infertility, autonomic imbalance Disease, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, 35. The agent according to claim 34, which is a prophylactic / therapeutic agent for trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness. β−アラニンを含有してなる配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達作用増強剤。A signal-enhancing agent for a G protein-coupled receptor protein having β-alanine and having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. 中枢または末梢神経機能調節剤である請求項３７記載の剤。38. The agent according to claim 37, which is a central or peripheral nerve function regulator. 抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤である請求項３７記載の剤。Anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, premature labor, male infertility, autonomic imbalance Disease, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, The agent according to claim 37, which is an agent for preventing or treating trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness. 哺乳動物に対して、▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする抗不安方法、催眠鎮静方法、筋弛緩方法、麻酔増強方法、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療方法。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof with respect to a mammal; (2) a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial peptide thereof; The effective amount of an agonist for the polynucleotide, or (3) a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Administration method, anxiolytic method, hypnotic sedation method, muscle relaxation method, anesthesia enhancement method, Convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, premature labor, male infertility, autonomic imbalance, cerebrovascular disorder, cerebral palsy, spastic spinal palsy, Prevention of spinal vascular disorders, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, sequelae of trauma, sequelae after surgery, pain, hypersensitivity or numbness Method of treatment. 哺乳動物に対して、▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療方法。(1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof with respect to a mammal; (2) a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; A polynucleotide comprising a base sequence complementary to the contained polynucleotide or a part thereof, or (3) an amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 An effective amount of an antagonist to a G protein-coupled receptor protein containing a sequence or a salt thereof Motor function ataxia, characterized in that Azukasuru, paralysis, depression, wakefulness delay, memory and learning disorders, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, addiction or prevention and treatment methods numbness. 抗不安剤、催眠鎮静剤、筋弛緩剤、麻酔増強剤、または痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏もしくはしびれの予防・治療剤を製造するための▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストの使用。Anxiolytics, hypnotics, sedatives, muscle relaxants, anesthetic enhancers, or convulsions, addiction, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorders, incontinence, nervous hypertension, imminent abortion, premature labor, male infertility, autonomic imbalance Disease, cerebrovascular disorder, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorder, cervical spondylosis, ossification of the posterior longitudinal ligament, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, (1) An amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 for producing a prophylactic / therapeutic agent for trauma sequelae, postoperative sequelae, pain, hyperesthesia or numbness G protein-coupled receptor protein containing a sequence, a partial peptide thereof or a salt thereof, (2) a G protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 protein A polynucleotide containing a polynucleotide encoding the receptor-type receptor protein or a partial peptide thereof, or (3) containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Use of an agonist for a G protein-coupled receptor protein. 運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難、依存症または感覚麻痺の予防・治療剤を製造するための▲１▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、▲２▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニストの使用。(1) SEQ ID NO: for manufacturing a preventive / therapeutic agent for ataxia, paralysis, depression, awakening delay, memory learning disorder, hypotension, dysuria, bladder hypertrophy, dyspnea, dependence or sensory paralysis An antibody against a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as that represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof or a salt thereof, {circle around (2)} SEQ ID NO: 2 or sequence A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 4, or A polynucleotide comprising a portion thereof, or (3) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Use of an antagonist to the same or substantially the G protein-coupled receptor protein containing the same amino acid sequence. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる中枢または末梢神経機能異常の診断剤。A center comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; Diagnostic agent for peripheral nerve dysfunction. 配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる不安症、不眠症、興奮症、筋萎縮症、麻酔感受性、痙攣、依存症、精神分裂病、てんかん、心身症、失禁症、神経性高血圧、切迫流産、切迫早産、男性不妊、自律神経失調症、脳血管障害、脳性（小児）麻痺、痙性脊髄麻痺、脊髄血管障害、頸部脊椎症、後縦靭帯骨化症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、外傷後遺症、術後後遺症、疼痛、知覚過敏、しびれ、運動機能失調症、麻痺、うつ病、覚醒遅延、記憶学習障害、低血圧、排尿困難、膀胱肥大、呼吸困難または感覚麻痺の診断剤。Anxiety comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a partial peptide thereof, or a salt thereof , Insomnia, irritability, muscular atrophy, anesthesia sensitivity, convulsions, dependence, schizophrenia, epilepsy, psychosomatic disorder, incontinence, nervous hypertension, imminent miscarriage, imminent premature labor, male infertility, autonomic imbalance, brain Vascular disorders, cerebral (pediatric) palsy, spastic spinal palsy, spinal vascular disorders, cervical spondylosis, posterior longitudinal ligament ossification, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, traumatic sequelae, Diagnostic agent for postoperative sequelae, pain, hyperesthesia, numbness, ataxia, paralysis, depression, delayed arousal, memory learning disability, hypotension, difficulty urinating, bladder hypertrophy, dyspnea or sensory paralysis.
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