JP2004329045A

JP2004329045A - Carrier holder for culturing cell and method for culturing cell in high density

Info

Publication number: JP2004329045A
Application number: JP2003126269A
Authority: JP
Inventors: Yasuyuki Ishizuka; 保行石塚; Kiyoshi Azuhata; 喜芳小豆畑; Shu Nakamura; 周仲村
Original assignee: BETERU KK; Applied Cell Biotechnologies Inc; Bethel KK
Current assignee: BETERU KK; Applied Cell Biotechnologies Inc; Bethel KK
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2003-05-01
Publication date: 2004-11-25

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a device used for culturing cells in a high density, and to provide a method for culturing the cell in a high density. <P>SOLUTION: This carrier holder 1 satisfies the following conditions. A place for loading a carrier C used as a scaffold for the cultured cells is disposed. A stacked state can be kept. A carrier C disposed on the lower side can be fixed, when the carrier holders are stacked. A space S can be formed between carriers C, C, when the carrier holders are stacked. The method for culturing the cell in the high density is a method using the carrier holders 1, and can be used for regenerative medical treatments or as a bioreactor. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細胞培養用の担体保持具及び該担体保持具を用いた高密度細胞培養方法に関する。更に詳しくは、培養細胞の足場となる担体を多層化した状態で使用できるように工夫された担体保持具及び該担体保持具を利用した高密度細胞培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞培養技術をバイオリアクターとして応用し、有用タンパク質等を大量に生産する方法として、「高密度細胞培養方法」がある。
【０００３】
「高密度細胞培養方法」とは、培地を灌流させることにより、新しい培地、栄養分等を供給し、老廃物等を除去する培養方法である。この方法は、高密度で細胞を培養でき、有用タンパク質等を培養生成物として大量に生産するのに適した方法である。
【０００４】
高密度細胞培養を利用したバイオリアクターは、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックスタンパク質の生産、ハイブリドーマ等の動物細胞培養によるモノクローナル抗体等の生理活性物質の生産等に応用されている。また、再生医療では、患者自身の細胞を増殖させる手段としても有用である。
【０００５】
この高密度細胞培養に使われる培養器具としては、例えば、ホローファイバーを用いたものがある。「ホローファイバー」とは、多孔性ポリマー等でできた中空糸で、栄養物、培養生成物等に対して物質透過性を持つものをいう。中空糸外部で細胞を培養し、中空糸内部で培地等を灌流させると、中空糸内部から外部に新しい培地や栄養物等が透過したり、中空糸外部から内部に生成物や老廃物等が移入したりする。従って、栄養物や酸素等を培養細胞に供給することができるため、高密度で細胞を培養することができる。また、有用たんぱく質等を培養生成物として大量に回収したり、尿素、尿酸、過酸化脂質等の老廃物を排除したりすることもできる。ホローファイバーを用いた高密度細胞培養は、培養する動物細胞が、浮遊性細胞（液体中でそのまま浮遊して増殖できる）、付着性細胞（固体状表面に付着しないと増殖できない）のどちらの場合も応用されている。
【０００６】
また、付着性細胞の高密度細胞培養方法としては、シャーレ、フラスコ等、ガラス製やプラスチック製のものを培養容器として使用し、その中に、培養細胞が付着する担体を入れる方法がある。マイクロキャリアー（微小球形粒子）、メンブレン（膜）等が細胞増殖のための足場となる担体として利用されている。
【０００７】
ここで、特許文献１は、高密度細胞培養の一般的な技術について記載されている。特許文献２は、培養細胞が接着する担体を用いた高密度培養方法が記載されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平５−１４６２９０号公報
【特許文献２】
特開平１１−５６３５３号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の高密度細胞培養に使われる培養器具には、以下のような技術的課題があった。
【００１０】
まず、ホローファイバーを用いた高密度細胞培養は、ホローファイバー（細長い中空糸）の内側に新しい培地等を灌流させて栄養分等を供給する仕組みになっている。培養細胞は、ホローファイバーの外側で生存しており、ホローファイバーの内側から外側に透過した栄養分等に依存して生息している。このため、高密度で培養しているすべての培養細胞を同一環境に保ち、培養細胞に対して均等に新しい培地、栄養物を供給したり、ガス交換を行ったりすることが困難である。また、「ホローファイバー式培養法」は、培養中の細胞を観察したり、培地をサンプリングして培養環境をモニタリングしたりすることができない。従って、ホローファイバー式培養法は、細胞密度を飛躍的に高め、大量の細胞産生物を生産できる反面、濃度勾配や無酸素ポケットの発生、ＰＨの変化等によって、一部分の生息環境が悪化し、元気のない細胞や死細胞が混在するという問題がある。
【００１１】
高密度細胞培養で得られた細胞産生物は、薬剤、化粧品等に配合され、人体に直接利用される場合も多い。また、再生医療で、ある個体から採取した細胞又は組織を高密度培養し、その細胞産生物を、再び、同一個体に接種する場合も考えられる。このような場合、上記のように、培養環境が均一でなく、培地等の濃度勾配が生じ、元気のない細胞や死細胞が混在することは、細胞産生物を利用した製品の安全性や品質を考慮すると好ましくない。
【００１２】
また、ガラス製やプラスチック製の培養器具の表面に培養細胞を付着させて増殖を行う技術では、ガラスやプラスチックは硬質であり、物質の移動が全くできないため、ガラス製やプラスチック製の培養器具の表面で細胞が増殖する際に細胞の増殖の方向性や細胞の増殖形態が制限され、重層的な細胞増殖を達成するのが難しいので、細胞の高密度培養に適さない。
【００１３】
その他、再生医療やバイオリアクターとしての利用を考えると、簡易、安価な方法で、適当な量の培養細胞産生物を素早く生産でき、該培養細胞産生物の生産量を予測又はコントロールできる方法が必要とされる。
【００１４】
そこで、本発明は、培養細胞の足場となる担体を多層化した状態で使用できるように工夫された、積み重ね自在の担体保持具を提供し、該担体保持具を利用した高密度細胞培養方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、まず、本発明では、（１）培養細胞の足場となる担体の載置箇所が設けられている、（２）積み重ねた状態を維持できる、（３）積み重ねたときに下側に配置された担体を固定できる、（４）積み重ねたときに担体間に隙間を形成できる、という条件をすべて具備する細胞培養用の担体保持具を提供する。
【００１６】
即ち、本発明に係る担体保持具は、所定の載置箇所に培養細胞の足場となる担体を載置した状態で積み重ねることができ、この担体保持具を積み重ねたときには、上側の担体保持具が、下側の担体保持具に載置されている担体が固定され、かつ多層化されている担体間には、隙間が形成されるようになっている。
【００１７】
本発明に係る担体保持具は、高密度細胞培養に好適である。高密度細胞培養は、栄養分や酸素等が、担体に付着するすべての細胞にできるだけ均等に供給されることが必要であるので、培地を灌流させることが必要である。
【００１８】
本発明に係る担体保持具は、培養細胞の足場となる担体を固定できるので、培地を灌流させても、担体が流されて移動することがない。また、担体保持具を、担体間に隙間を形成して積み重ねるため、培地を灌流させると、栄養分や酸素等が、多層化された担体に付着するすべての細胞にほぼ均等に供給することができる。
【００１９】
担体保持具の載置箇所に貫通孔を形成しておくと、培地の流れがよりスムーズになる。灌流させた培地は、より隅々まで交換されやすくなり、担体に付着するすべての細胞に、栄養分や酸素等がより行きわたり易くなる。
【００２０】
また、担体保持具の外縁部に爪部を形成して、この爪部を下側に配置された担体保持具の外縁部所定箇所に係止することによって、積み重ねた状態を維持することができる。例えば、爪部を下側に配置された担体保持具の外縁部所定箇所に向けてはめ込み、所定角度回し込んだときに係止されるようにすることによって、担体保持具同士が外れないように工夫することもできる。
【００２１】
また、本発明では、担体保持具の裏面所定箇所には、下方へ突き出る突起部を形成しておき、該突起部が下側に配置される担体（下側の担体保持具に載置された担体）に当接することによって、該担体を固定することができるように工夫した。
【００２２】
さらに、本発明では、細胞培養は、無菌的に作業を行わなければならないため、担体保持具を培養容器内に設置する場合、該担体保持具を直接で手で触れる作業は完全に排除する必要がある。そこで、本発明に係る担体設置具に、ピンセット挿入用の孔を予め設けておくことによって、ピンセットで担体設置具を把持して積み重ねたり、取り外したりできるように工夫した。
【００２３】
次に、本発明では、培養容器内において、上記構成の担体保持具を積み重ねて設置し、隙間が形成された状態で多層化された各担体上において細胞培養を行う高密度細胞培養方法を提供する。
【００２４】
この方法では、担体保持具の載置箇所に培養細胞の足場となる担体を載置した状態で、担体保持具を複数積み重ねる。各担体を多層的に配置することにより、高密度に細胞を培養することができる。
【００２５】
各担体は、上側の担体保持具によって固定されているので、培地を灌流させても、担体が流されることはない。また、積み重ねた担体間には隙間が形成されるように設置されている。従って、培地を灌流することにより、栄養分や酸素等は、培養容器内の隅々まで行きわたり、培養環境の均一な状態に保ちながら、高密度に細胞を培養することができる。
【００２６】
また、培養細胞の足場となる担体として、多孔膜を用いることができる。多孔膜は、培養細胞の強固な足場を形成するので、細胞が付着し、増殖する。また、多孔膜は、物質透過性を備えるので、栄養分等がより隅々まで行きわたり、細胞の増殖を活発にする。その他、多孔膜は、プラスチック製器具等と比べて、表面が凸凹しているため、細胞増殖の方向性の制限が緩和され、細胞が重層化し易くなる。
【００２７】
さらに、ガス透過性を備える培養容器に、積み重ねた担体保持具を収容して、高密度に細胞を培養することにより、細胞への酸素の供給が促進され、培養細胞によるタンパク質の生産性が向上する。従って、ガス透過性を備える培養容器を用いて、上記の高密度細胞培養を行うことによって、この方法のバイオリアクターとしての性能を向上させ、目的のタンパク質の生産性を上げることができる。
【００２８】
以上のように、本発明に係る細胞培養用の担体保持具及び高密度細胞培養方法によれば、高密度細胞培養を簡易に、かつ安全確実に実施できるようになるという技術的意義を有する。
【００２９】
【発明を実施するための形態】
本発明に、好適な実施形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、本発明は、下記の実施形態に限定されない。
【００３０】
まず、図１は、本発明に係る担体保持具の外観斜視図、図２（Ａ）は、同担体保持具の上方視平面図、図２（Ｂ）は、同担体保持具の下方視（裏面方向から見た）平面図である。
【００３１】
図示された担体保持具１は、培養細胞の足場となる「担体」を多層化して用いるために使用される細胞培養用の器具であって、（１）培養細胞の足場となる担体の載置箇所２が設けられていて、（２）該担体保持具１を積み重ねた状態を維持でき、（３）積み重ねたときに、下側に配置された担体（下側の担体保持具１に載置された担体）を固定でき、（４）積み重ねたときに多層化される担体間に隙間を形成できる、このような（１）〜（４）の条件をすべて備えることを特徴としている。なお、担体保持具１の材質は、特に限定されないが、一般的には、プラスチック製のものが、簡易、軽量、安価で好適である。
【００３２】
図１等に例示されている担体保持具１の上面部位には、符号２で示された担体載置箇所が形成されている。この担体載置箇所２は、培養細胞の足場となる所定形状（例えば、円形）の担体の全体が収まる広さを備える平坦な箇所であればよい。
【００３３】
担体保持具１を、とりわけ高密度細胞培養に用いる場合には、培地がより灌流し易い形状にさらに工夫する必要がある。例えば、担体載置箇所２は、図示されているように、担体を載せるのに必要充分な程度のフレーム（枠体）２１構造により形成し、このフレーム２１以外の部分は、できるだけ広い面積の貫通孔２２とすることによって、培地の灌流がより円滑に行われるようにして、細胞の増殖に必要な栄養分等を、担体の隅々まで行きわたらせることができるようにするとよい。
【００３４】
担体載置箇所２に貫通孔２２が多数形成されるフレーム構造は、特に、担体に、物質透過性のある多孔膜を用いる場合に有効である。この多孔膜は、培養細胞の足場として機能するとともに、栄養分、老廃物、酸素等を透過する機能を持つので、培地Ｍの灌流がより円滑に行われ、栄養分等を隅々まで行きわたらせることができたり、細胞の増殖に不要な老廃物を担体近辺に滞留させないようにもできたりするからである。
【００３５】
次に、図１等において、符号３で示されている爪部は、複数の担体保持具１を積み重ねる場合において、下側に配置される担体保持具１の所定箇所に係止し、積み重ね状態を維持できるようにするという役割を果たす。担体保持具１の爪部３，３，３，３は、上方視略円形の担体保持具１の外縁部６の計４箇所において、下方側に所定長突起し、その下端は半径方向内側に向けて、側方視略日本語カタカナ「レ」の字状に屈曲する形状の爪先３１を備えている。
【００３６】
符号４で示された孔部は、本実施形態では、計４箇所設けられている爪部３にそれぞれの箇所に上方に開口するように形成されている。この孔部４の孔の大きさは、図示しないピンセットの先が挿入可能なサイズとされている。ピンセットの一対の先を、例えば、直径線上に配置されている孔部４，４を選択してその中に挿入して把持すれば、担体保持具１を直接手で触らなくても取り扱うことができるようになる。
【００３７】
細胞培養に使用する器具は、無菌的に取り扱う必要があるので、担体保持具１に対してピンセットで扱うための孔部４を予め設けるように工夫しておくことによって、この担体保持具１は細胞培養用途により適したものとなる。なお、孔部４の形成箇所は、爪部３に限定されるものでなく、ピンセットで把持し易すければ、担体保持具１のいずれの箇所であってもよい。
【００３８】
続いて、符号５で示された突起部は、担体保持具１の外縁部６やフレーム２１の裏面の所定箇所に突設された部位であり、本実施形態では、所定間隔で計１３箇所設けられている（図２（Ｂ）参照）。
【００３９】
これらの突起部５は、下方側に配置された多孔膜等の担体（下方の担体保持具１に載置された担体）に当接し、この担体を下方側に押し付けて、（下方の）担体保持具１に固定する役割を果たす。従って、突起部５は、少なくとも、下方の担体に当接して固定できるだけの長さが必要であり、また担体を押圧し易い形状を採用するのが望ましい。
【００４０】
次に、担体保持具１の外縁部６に形成されている直線状外縁部７は、上方視略円形の外縁部６に所定間隔で計４箇所、具体的には、上方側の担体保持具１の各爪部３の位置と一致する位置である計４箇所に形成されている。
【００４１】
この直線状外縁部７は、上方側担体保持具１の各爪部３の嵌め込み位置として機能する。この直線状外縁部７に嵌め込まれてきた各爪部３は、外縁部６に対していまだ係止されていない状態にあり、この状態で上方に担体保持具１を持ち上げると、簡単に取り外すことができる。
【００４２】
ここで、図３、図４に基づいて、担体保持具１，１の係止固定方法について詳説する。
【００４３】
図３は、二枚の担体保持具１，１の間に担体Ｃを介装させて使用する様子を示す図であって、同図（Ａ）はその分解斜視図、同図（Ｂ）は二枚の担体保持具１，１に担体Ｃが介装されて固定されている状態を示す外観斜視図である。図４は、二枚の担体保持具１，１を係止固定状態とする作業の様子を、順を追って説明する図であり、同図（Ａ）は嵌め込む前の状態を表す側方視図、同図（Ｂ）は嵌め込んだ直後の状態を表す側方視図、同図（Ｃ）は回し込んで係止状態になったときの様子を表す側方視図である。なお、図４では、担体Ｃは省略し、図示していない。
【００４４】
まず、図３（Ａ）の一点鎖線矢印Ｘ，Ｘに示されているように、上方側の担体保持具１の各爪部３を下方の担体保持具１の上記直線状外縁部７と一致する位置に合わせ、その後、下方側の担体保持具１に向けて嵌め込み、それに続いて、各爪部３を（上方の担体保持具１を）直線状外縁部８へ向けて回し込むようにする。
【００４５】
ここで、図２をもう一度参照すると、直線状外縁部８−８間の半径方向の距離Ｄは、直線状外縁部７−７間の半径方向の距離ｄ（図２参照）よりも長く設計されている（即ち、Ｄ＞ｄ）。また、前記距離Ｄは、直径線上に配置されて対向する爪部３，３の先端部３２−３２間の距離Ｌ（図２参照）よりもやや長くなるように設計されている。
【００４６】
このため、各直線状外縁部８の位置に、上方の担体保持具１の各爪部３が同時に移動してきたときには、担体保持具１を、単純に上方に持ち上げて外そうとしても、爪部３（の先端部３２）が、下方の担体保持具１の外縁部６に係止されているので、取り外れない状態となる。このような構成によって、担体保持具１，１は、係止固定状態を維持できるので（図３（Ｂ）参照）、多数枚の担体保持具１を重ね上げていくことが容易かつ確実にできる。
【００４７】
なお、各直線状外縁部８の（回し込み方向の）終端部位置に形成された各突出部９は、爪部３が必要以上に回し込まれないように規制するためのストッパーとして機能する。
【００４８】
図４は、二枚の担体保持具１，１を係止固定状態とする作業の様子を、順を追って説明する側方視図である。なお、図４では、担体Ｃは省略し、図示していない。
【００４９】
まず、図４（Ａ）には、二枚の担体保持具１，１を嵌め込む前の状態が表されている。上方の担体保持具１を下方側の担体保持具１に向けて（矢印Ｙ方向）嵌め込む。この嵌め込み作業（重ね合わせ作業）は、上方の担体保持具１に設けられた計４つの爪部３，３，３，３が、下方の担体保持具１に設けられた計４箇所の直線状外縁部７，７，７，７に一致する位置を選定して行う。
【００５０】
次に、図４（Ｂ）には、二枚の担体保持具１，１が重ね合わされた直後の状態が表されている。この状態では、上方の担体保持具１の爪部３，３，３，３が下方の担体保持具１の直線状外縁部７，７，７，７に留まっているので、上方の担体保持具１を持ち上げると簡単に取り外せる状態となっている。即ち、上方側の担体保持具１は、下方側の担体保持具１にいまだ係止されていない状態となっている。
【００５１】
続いて図４（Ｃ）は、上方側の担体保持具１が図４（Ｂ）の矢印Ｚ方向に所定角度だけ回し込まれて係止状態となったときの様子が表されている。即ち、上方の担体保持具１の爪部３，３，３，３は、下方側の担体保持具１の各直線状外縁部８に移動して、下方の担体保持具１の外縁部６に係止された状態となっている。
【００５２】
図５は、上方の担体保持具１が下方側の担体保持具１に係止されたときの爪部３周辺の拡大図である。この図５に示されているように、係止状態では、上方の担体保持具１の爪部３の爪先３１が、下方側の担体保持具１の外縁部１１（の裏面）に係止されている。このとき、下方側の担体保持具１に載置されている担体Ｃの上面Ｃ１に対して、上方の担体保持具１の突起部５の先端部５１が当接し、前記担体Ｃを固定する。なお、突起部５の先端部５１の形状は、尖った形状ではなく、担体Ｃを固定し易いという理由から、先端部が球面やある程度の平坦面を備える形状であることが望ましい。
【００５３】
担体Ｃの上方領域には隙間Ｓが確保されており、この隙間Ｓを培地が自由に灌流できるので、細胞の増殖に必要な栄養分等を、担体Ｃの隅々まで行きわたらせることができる。このように、本発明に係る担体保持具１を重ねて使用すると、担体Ｃ，Ｃ間に隙間Ｓを形成した状態で、担体Ｃを多層化していくことができる。
【００５４】
次に、図６は、細胞培養用容器の中に、本発明に係る担体保持具１を所定枚数積み重ねて設置し、培地Ｍを入れた状態を示す側方視模式図である。
【００５５】
符号１０で示された細胞培養用容器（以下「培養容器」という。）は、積み重ねられた担体保持具１，１・・・が収容できるものであれば、形状、大きさ、容積等は特に限定されない。但し、上記したように、担体保持具１をピンセットで操作する際の利便を考慮すると、培養容器１０は、例えば、図６に示された培養容器のように、上方に向けてより末広がりながら開口する形状のものが使用しやすい。
【００５６】
培養容器１０の中に、担体保持具１を積み重ねて、担体Ｃ，Ｃ間に隙間Ｓを形成した状態で設置し、それぞれの担体Ｃ，Ｃ・・・に細胞を付着させて高密度細胞培養を行うことができる。この構成では、担体Ｃ，Ｃ間に隙間Ｓが形成されているので、培地Ｍを灌流させると、各担体Ｃ上の培養細胞に均等に栄養分等を供給することができる。この結果、効率的な細胞培養が可能になる。なお、培養細胞産生物は、例えば、灌流した培地Ｍを回収し、老廃物等をろ過等して除去することにより、得ることができる。
【００５７】
なお、栄養分の供給は、灌流する培地Ｍに添加する等により行うことができる。また、酸素の供給は、一定量の酸素を培地Ｍに溶存させて灌流したり、培養容器１０の上部にガス透過性の蓋（フィルター）１１を取り付けてガス交換性を高めたりする等の方法により行うことができる。
【００５８】
担体Ｃとしては、培養細胞の足場となるものであって、担体保持具１で固定できるものであればどのようなものでもよい。例えば、担体Ｃに多孔膜を利用することができる。なお、多孔膜とは、貫通した細孔のある膜をいう。
【００５９】
この多孔膜の細孔の直径は、栄養物や老廃物等の物質が透過性できるが、培養細胞の足場としての機能を有している程度の大きさであれば特に限定されないが、０．１〜１μｍ程度が好ましい。多孔膜の材質も、特に限定されないが、親水性のもの、特に、親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポリビニリデンジフロライド等が、最も好適である。
【００６０】
多孔膜は、培養細胞の足場として好適に利用できる。多孔膜は、多くの孔が形成されているので、表面が凸凹している。従って、培養細胞が付着しやすい。また、前記のとおり、表面に凸凹があるため、細胞の増殖の方向性の制限を緩和し、培養細胞は、比較的自由に、重層的に増殖することができる。
【００６１】
また、多孔膜は、物質透過性を有するという機能も持つ。例えば、培養細胞に供給する栄養分、酸素等や、培養細胞からの生産物、老廃物等は、多孔膜を透過する。高密度細胞培養を行う場合に、多孔膜を利用すると、この多孔膜の物質透過性により、培地Ｍはよりスムーズに灌流し、各担体Ｃ上の培養細胞に均等に栄養分、酸素等を供給したり、老廃物等を排除したりすることができる。
【００６２】
従って、担体Ｃとして多孔膜を利用することにより、培養細胞の生育環境を隅々まで均一に保つことができ、より安全性や品質の面で有利な高密度細胞培養を行うことができる。
【００６３】
ここで、培養容器１０の材質は、細胞培養に適するものであれば採用可能である。例えば、ポリプロピレン等のような一般的なプラスチック製の容器を利用できる。しかし、培養容器１０は、ポリカーボネート、ポリメチルペンテンのようなガス透過性を備える材質のものが好適である。
【００６４】
ガス透過性を備える培養容器１０を用いて高密度細胞培養を行うと、培養容器１０を透過した酸素等が供給されるので、有用タンパク質の生産性が向上する。なお、ポリメチルペンテンのほうがポリカーボネートよりもガス交換性（気体透過性）が大きく、高密度細胞培養による有用タンパク質の生産性も高い。
【００６５】
【実施例】
本発明による担体保持具を用いた高密度細胞培養方法の効果を検証するため、以下の実験を行った。なお、以下の実験には、担体として、多孔膜のメンブレンフィルター（ＭＦ）を採用したが、これに限定するものではない。
【００６６】＜実験１＞
多孔膜を多層化した場合の細胞培養の効果を検証する「実験１」を行った。
【００６７】
（実験１に関連する比較例１及び実施例１〜４）。
まず、ＭＦ上に細胞を付着させるために、直径６０ｍｍのディッシュに直径４７ｍｍのＭＦ（ＭＦ−Ａ又はＭＦ−Ｂ）を白色ワセリンで固定し、ヒト初代線維芽細胞を播種し（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）、３７℃のインキュベーターで培養した。ＭＦには予め直径１ｍｍの穴を十字に１ｃｍ間隔で９個作っておき、この穴にまで細胞が増殖したら、ＭＦ上の細胞はコンフルエントとした。この細胞が接着したＭＦを新しい直径６０ｍｍのディッシュにワセリンで直接固定したものを「比較例１」とした。
【００６８】
また、本発明の担体保持具にＭＦを１枚ずつ固定して、培養用容器に入れた。担体保持具を２枚積み重ねて、その間にＭＦを１枚固定したものを「実施例１」とし、担体保持具を３枚積み重ねたもの（ＭＦ２枚）を「実施例２」、担体保持具を６枚積み重ねたもの（ＭＦ５枚）を「実施例３」、担体保持具を７枚積み重ねたもの（ＭＦ６枚）を「実施例４」とした。比較例１並びに実施例１〜４を各々１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養し、１週間後に洗浄して無血清培地に交換した。その後１０日目に培養上清中の蛋白質量を測定した。測定結果を以下の「表１」に示す。
【００６９】
【表１】

【００７０】
まず、前掲した「表１」の比較例１と実施例１の結果の比較から、本発明の担体保持具を使用したことによって、ＭＦとＭＦの間やＭＦと培養容器底面間に隙間（空間）が生まれ、タンパク質の生産性が上がることが明らかになった。この理由は、前記隙間が形成されたことによって、細胞の周囲での自由な物質（栄養、老廃物）移動やガスの供給又は交換が行われ易くなったためと考えられる。
【００７１】
次に、実施例２〜４に示したように、担体保持具を積み重ね、ＭＦを多層化した場合でも、比較例１に比べてタンパク質の高い生産性が維持されていることがわかる。即ち、ＭＦを多層化した構成も有効であることが明らかである。
【００７２】
なお、ＭＦが１枚の場合（実施例１）とＭＦが２枚の場合（実施例２）に比べて、ＭＦが５枚の場合（実施例３）やＭＦが６枚の場合（実施例４）では、約３５％程度のタンパク質生産量の差が見られる。これは、ＭＦ１枚の生産量からＭＦ６枚の生産量を３５％程度の誤差で推定できる。これは、スケールアップやタンパク質総生産量の予測計算が可能であることを示している。
【００７３】
以上のように、本発明では、担体保持具を積み重ねて、担体を多層化することによって、細胞培養を高密度で効率よく行うことが可能となる。特に、担体同士を密着させて多層化するのではなく、担体間に隙間を形成して多層化することによって、従来最も効率的と考えられていたホローファイバー式培養法の欠点を改善できる。即ち、担体保持具を積み重ねて、複数の担体を多層的に用いることにより、細胞が付着した担体の枚数に基づいてタンパク質産生量を容易に予測計算でき、スケールアップが簡単となる。
【００７４】
その他、担体保持具は簡単に取り外しができるので、容易に担体上の細胞を観察することができる。また、本発明は、培養容器の中に、担体保持具を積み重ねて設置するため、ホローファイバー式培養法と違い、細胞培養用容器の中の培地を容易にサンプリングできる。従って、細胞の生育状況や細胞環境をモニタリングすることが可能となり、細胞産生物の品質を管理することができる。
【００７５】＜実験２＞
担体保持具を収容するための培養容器の好適な材質を検討することを目的として、以下の「実験２」を実施した。
【００７６】
積み重ねた担体保持具（担体としてＭＦが間に固定されている）を収容する培養容器として３種類の材質のものを準備した。それぞれの容器の中で細胞を培養し、培養上清中のタンパク質量を測定し、細胞によるタンパク質生産におけるガス交換性（気体透過性）の有効性を検討した。
【００７７】
培養容器の材質は、ポリプロピレン（実施例５）、ポリカーボネート（実施例６）、ポリメチルペンテン（実施例７）を用いた。更に、培養上清中のタンパク質量が最大であった材質の培養容器の上部にガス交換性（気体透過性）のあるフィルターを取り付け、更にガス交換性を高めた実施例も準備した（実施例８）。なお、この容器は、蓋を回して閉める形状の機密性の高いもので、水を入れて逆さにしても水漏れはないものである。
【００７８】
実験２の方法を具体的に説明すると、ＭＦ上に細胞を接着させるために、直径６０ｍｍのディッシュに直径４７ｍｍのＭＦを白色ワセリンで固定して、ヒト初代線維芽細胞を播種し（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）、３７℃のインキュベーターで培養した。ＭＦには親水性ポリテトラフルオロエチレン又は親水性ポリビニリデンジフロライドを用いた。ＭＦには予め直径１ｍｍの穴を十字に１ｃｍ間隔で９個作っておき、この穴にまで細胞が増殖したら、ＭＦ上の細胞はコンフルエントとした。この細胞が付着し増殖したＭＦをフレームにセットして、実施例５〜８の培養容器に収容し、更に１．５ｇのマイクロキャリアーに細胞を付着させたものも入れた。１週間培養後、十分に血清培地を除去、洗浄して無血清培地に交換した。それから１４日間培養後、培養上清中の蛋白質量を測定した。測定結果を次の「表２」に示す。
【００７９】
【表２】

【００８０】
前掲した「表２」の実施例５〜８では、いずれも培養上清中のタンパク質濃度は高かったが、特に実施例７のポリメチルペンテン製の円筒形容器で最大であった（３９．２μｇ／ｍｌ）。なお、別途行った材質試験の結果においてもポリメチルペンテンのガス透過性が最大であった。即ち、細胞によるタンパク質生産性は、容器のガス透過性に密接に関連している。
【００８１】
また、実施例７と実施例８を比較すると、ポリメチルペンテン製の培養容器であれば、更にガス透過性のフィルターを付けても、タンパク質濃度にあまり変化はなかった。この結果からポリメチルペンテンのようにガス透過性の高い材質で培養容器を形成すれば、ガス透過性のフィルターを用いる等してガス透過性を高める必要はないことがわかった。
【００８２】
以上の実験２から、多層化したＭＦをガス透過性の高いポリメチルペンテン製の培養容器に収容して細胞培養を行うことによって、高密度の細胞培養を実施でき、高いタンパク質生産性を確保できることがわかった。
【００８３】
【発明の効果】
本発明には、以下のような効果がある。
【００８４】
担体保持具を積み重ねて設置し、高密度細胞培養を行うことにより、自由な物質の移動（栄養物、老廃物、生産物等）やガス交換（酸素等）が可能になる。これによって、培養環境が均一になり、培地の濃度勾配や無酸素ポケットといった高密度細胞培養の問題点を解消できる。
【００８５】
前記のとおり、培養環境が均一になることによって、元気のない細胞や死細胞が混在することを極力排除することができ、安全性や品質の高い有用タンパク質を生産することができる。従って、薬剤、化粧品の生産や、再生医療に用いることができる。
【００８６】
その他、担体に多孔膜を用いることにより、細胞の増殖の方向性の制限を緩和することができ、元気のない細胞や死細胞が混在することを極力排除することができるという効果がある。
【００８７】
さらに、前記の効果に加えて、本発明は、培養中に細胞を観察したり、培地をサンプリングして培養環境をモニタリングしたりすることができるという利点がある。また、担体保持具の枚数や担体の大きさ、枚数等を変えることにより、細胞産生物の生産量を調節できる。従って、培養環境を監視することで、細胞産生物の品質を管理することができ、また、目的の細胞産生物の生産量を予測計算して、培養計画を立てることが可能となる。
【００８８】
以上のように、本発明は、より簡易、安価な方法で、必要とする量の有用タンパク質等を生産することができる「バイオリアクター」として利用できる。特に、再生医療において、個体から採取した細胞を、高密度細胞培養する際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る担体保持具（１）の外観斜視図
【図２】（Ａ）同担体保持具（１）の上方視平面図
（Ｂ）担体保持具（１）の下方視（裏面方向から見た）平面図
【図３】（Ａ）二枚の担体保持具（１，１）の間に担体（Ｃ）を介装させて使用する様子を示す分解斜視図
（Ｂ）二枚の担体保持具（１，１）に担体（Ｃ）が介装されて固定されている状態を示す外観斜視図
【図４】（Ａ）二枚の担体保持具１，１を係止固定状態とする作業の様子を、順を追って説明する図であって嵌め込む前の状態を表す側方視図
（Ｂ）嵌め込んだ直後の状態を表す側方視図
（Ｃ）回し込んで係止状態になったときの様子を表す側方視図
【図５】上方の担体保持具（１）が下方側の担体保持具（１）に係止されたときの爪部（３）周辺の拡大図
【図６】培養容器（１０）の中に、本発明に係る担体保持具１を所定枚数積み重ねて設置し、培地（Ｍ）を入れた状態を示す側方視模式図
【符号の説明】
１担体保持具
２担体載置箇所
３爪部
４ピンセット挿入用孔
５担体固定用の突起部
１０培養容器
２２担体載置箇所の貫通孔
Ｃ担体
Ｍ培地[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a carrier holder for cell culture and a high-density cell culture method using the carrier holder. More specifically, the present invention relates to a carrier holder designed so that a carrier serving as a scaffold for cultured cells can be used in a multilayered state, and a high-density cell culture method using the carrier holder.
[0002]
[Prior art]
There is a "high-density cell culture method" as a method for producing useful proteins and the like in large quantities by applying the cell culture technology as a bioreactor.
[0003]
The “high-density cell culture method” is a culture method in which a new medium, nutrients, and the like are supplied by perfusing the medium to remove wastes and the like. This method is a method suitable for culturing cells at high density and for producing useful proteins and the like in large quantities as culture products.
[0004]
Bioreactors utilizing high-density cell culture have been applied to the production of extracellular matrix proteins such as collagen and fibronectin, and the production of biologically active substances such as monoclonal antibodies by culturing animal cells such as hybridomas. In regenerative medicine, it is also useful as a means for proliferating the patient's own cells.
[0005]
As a culture device used for this high-density cell culture, for example, there is a device using hollow fibers. “Hollow fiber” refers to a hollow fiber made of a porous polymer or the like and having a substance permeability to nutrients, culture products, and the like. When cells are cultured outside the hollow fiber and a medium or the like is perfused inside the hollow fiber, a new medium or nutrients can permeate from the inside of the hollow fiber to the outside, or products or waste products can enter the inside from the outside of the hollow fiber. Or to populate. Therefore, nutrients, oxygen and the like can be supplied to the cultured cells, so that the cells can be cultured at a high density. In addition, useful proteins and the like can be recovered in large amounts as culture products, and waste products such as urea, uric acid, and lipid peroxide can be eliminated. High-density cell culture using hollow fibers is used when the animal cells to be cultured are either floating cells (which can be grown in suspension in liquid) or adherent cells (which cannot grow unless they adhere to a solid surface). Has also been applied.
[0006]
As a high-density cell culture method for adherent cells, there is a method in which a glass or plastic material such as a petri dish or a flask is used as a culture vessel, and a carrier to which the cultured cells adhere is placed therein. Microcarriers (microspherical particles), membranes (membrane), and the like are used as carriers that serve as scaffolds for cell growth.
[0007]
Here, Patent Document 1 describes a general technique of high-density cell culture. Patent Document 2 describes a high-density culture method using a carrier to which cultured cells adhere.
[0008]
[Patent Document 1]
JP-A-5-146290
[Patent Document 2]
JP-A-11-56353
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, conventional culture instruments used for high-density cell culture have the following technical problems.
[0010]
First, high-density cell culture using hollow fibers has a mechanism in which a new medium or the like is perfused inside hollow fibers (elongated hollow fibers) to supply nutrients and the like. Cultured cells survive outside the hollow fiber, and inhabit depending on nutrients that have permeated from the inside to the outside of the hollow fiber. For this reason, it is difficult to keep all the cultured cells cultured at a high density in the same environment, and to supply a fresh medium and nutrients to the cultured cells and to perform gas exchange evenly. In addition, the “hollow fiber culture method” cannot observe cells in culture or sample a medium to monitor the culture environment. Therefore, the hollow fiber culture method can dramatically increase the cell density and produce a large amount of cell products, but on the other hand, a part of the habitat deteriorates due to the concentration gradient, the generation of anoxic pocket, the change in PH, etc. There is a problem that unhealthy cells and dead cells are mixed.
[0011]
Cell products obtained by high-density cell culture are often blended into drugs, cosmetics, and the like, and are often used directly in the human body. In regenerative medicine, cells or tissues collected from an individual may be cultured at high density, and the cell product may be inoculated again to the same individual. In such a case, as described above, the culture environment is not uniform, the concentration gradient of the medium or the like is generated, and the presence of cells with no energy and dead cells is a factor in the safety and quality of products using cell products. Is not preferable in consideration of
[0012]
In addition, in the technique of growing cells by attaching cultured cells to the surface of glass or plastic culture instruments, glass and plastic are hard and cannot transfer substances at all. When cells proliferate on the surface, the direction of cell growth and the form of cell growth are limited, and it is difficult to achieve multi-layered cell growth, which is not suitable for high-density cell culture.
[0013]
In addition, in view of utilization as regenerative medicine and bioreactors, a method that can quickly produce an appropriate amount of cultured cell products by a simple and inexpensive method and predict or control the production amount of the cultured cell products is necessary. It is said.
[0014]
Therefore, the present invention provides a stackable carrier holder which is designed so that a carrier serving as a scaffold for cultured cells can be used in a multilayered state, and provides a high-density cell culture method using the carrier holder. The purpose is to provide.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, first, in the present invention, (1) a carrier mounting position serving as a scaffold for cultured cells is provided, (2) a stacked state can be maintained, and (3) when stacked. And (4) a carrier holder for cell culture, which satisfies all the conditions that a carrier disposed on the lower side can be fixed, and (4) a gap can be formed between carriers when stacked.
[0016]
That is, the carrier holder according to the present invention can be stacked in a state where a carrier serving as a scaffold for cultured cells is placed at a predetermined mounting location, and when the carrier holders are stacked, the upper carrier holder is A gap is formed between the carriers that are fixed on the lower carrier holder and are multilayered.
[0017]
The carrier holder according to the present invention is suitable for high-density cell culture. Since high-density cell culture requires that nutrients, oxygen, and the like be supplied to all cells attached to the carrier as evenly as possible, it is necessary to perfuse the medium.
[0018]
Since the carrier holding device according to the present invention can fix the carrier serving as a scaffold for cultured cells, the carrier does not flow and move even when the medium is perfused. In addition, since the carrier holders are stacked while forming a gap between the carriers, when the medium is perfused, nutrients, oxygen, and the like can be supplied almost equally to all cells attached to the multilayered carrier. .
[0019]
If a through hole is formed in the place where the carrier holder is placed, the flow of the culture medium becomes smoother. The perfused medium is more easily exchanged to every corner, so that nutrients, oxygen and the like can be more easily distributed to all cells attached to the carrier.
[0020]
Further, a claw portion is formed on the outer edge portion of the carrier holder, and the claw portion is locked to a predetermined portion of the outer edge portion of the carrier holder disposed below, so that the stacked state can be maintained. . For example, by fitting the claws toward a predetermined portion of the outer edge portion of the carrier holder disposed on the lower side, and locking the carrier holder when it is turned by a predetermined angle, the carrier holders are not separated from each other. It can be devised.
[0021]
Further, in the present invention, a projection projecting downward is formed at a predetermined position on the back surface of the carrier holder, and the projection is disposed on the lower side (the carrier placed on the lower carrier holder). The carrier was fixed so that the carrier could be fixed by contacting the carrier.
[0022]
Furthermore, in the present invention, since the cell culture must be performed aseptically, when the carrier holder is installed in the culture vessel, the operation of directly touching the carrier holder by hand must be completely eliminated. There is. Therefore, the carrier installation tool according to the present invention is provided with a hole for inserting tweezers in advance, so that the carrier installation tool can be gripped with tweezers and stacked or removed.
[0023]
Next, in the present invention, there is provided a high-density cell culture method in which carrier holders having the above-described configuration are stacked and installed in a culture container, and cell culture is performed on each of the multilayered carriers in a state where gaps are formed. I do.
[0024]
In this method, a plurality of carrier holders are stacked in a state where a carrier serving as a scaffold for cultured cells is placed at the mounting position of the carrier holder. By arranging each carrier in multiple layers, cells can be cultured at a high density.
[0025]
Since each carrier is fixed by the upper carrier holder, even if the medium is perfused, the carrier does not flow. Further, the carriers are arranged so that a gap is formed between the stacked carriers. Therefore, by perfusing the culture medium, nutrients, oxygen, and the like can reach every corner of the culture vessel, and cells can be cultured at a high density while maintaining a uniform culture environment.
[0026]
In addition, a porous membrane can be used as a carrier serving as a scaffold for cultured cells. Since the porous membrane forms a strong scaffold for cultured cells, the cells adhere and proliferate. In addition, the porous membrane has a substance permeability, so that nutrients and the like can be distributed to every corner and cell proliferation is activated. In addition, since the surface of the porous membrane is uneven as compared with a plastic instrument or the like, the limitation on the direction of cell growth is eased, and cells are easily layered.
[0027]
Furthermore, by accumulating the stacked carrier holders in a culture vessel with gas permeability and culturing the cells at high density, the supply of oxygen to the cells is promoted, and the productivity of the protein by the cultured cells is improved. I do. Therefore, by performing the above-described high-density cell culture using a culture vessel having gas permeability, the performance of this method as a bioreactor can be improved, and the productivity of the target protein can be increased.
[0028]
As described above, according to the carrier holder for cell culture and the high-density cell culture method of the present invention, there is a technical significance that high-density cell culture can be easily, safely, and securely performed.
[0029]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Preferred embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. Note that the present invention is not limited to the embodiments described below.
[0030]
First, FIG. 1 is an external perspective view of a carrier holder according to the present invention, FIG. 2A is a plan view of the carrier holder viewed from above, and FIG. FIG. 4 is a plan view (as viewed from the back side).
[0031]
The illustrated carrier holder 1 is a cell culture instrument used for forming a multilayered “carrier” serving as a scaffold for cultured cells, and (1) placing a carrier serving as a scaffold for cultured cells. The position 2 is provided, and (2) the carrier holders 1 can be maintained in a stacked state. (3) When the carriers are stacked, the carriers arranged on the lower side (placed on the lower carrier holders 1) (4) can be fixed and (4) a gap can be formed between the carriers to be multilayered when stacked. In addition, the material of the carrier holder 1 is not particularly limited, but generally, a material made of plastic is preferable because it is simple, lightweight, inexpensive.
[0032]
In the upper surface portion of the carrier holder 1 illustrated in FIG. 1 and the like, a carrier mounting portion indicated by reference numeral 2 is formed. The carrier mounting location 2 may be a flat location that has a sufficient size to accommodate the entire carrier of a predetermined shape (for example, a circle) serving as a scaffold for cultured cells.
[0033]
In particular, when the carrier holder 1 is used for high-density cell culture, it is necessary to further devise a shape in which the medium can be more easily perfused. For example, as shown in the figure, the carrier mounting portion 2 is formed by a frame (frame body) 21 structure of a necessary and sufficient degree for mounting the carrier. The holes 22 are preferably used so that the medium can be perfused more smoothly, so that nutrients and the like necessary for cell growth can be distributed to every corner of the carrier.
[0034]
The frame structure in which a large number of through holes 22 are formed in the carrier mounting location 2 is particularly effective when a porous film having material permeability is used for the carrier. The porous membrane functions as a scaffold for cultured cells and has a function of transmitting nutrients, waste products, oxygen, etc., so that the perfusion of the medium M can be performed more smoothly, and the nutrients can be distributed to every corner. This is because it is also possible to prevent waste products unnecessary for cell growth from staying near the carrier.
[0035]
Next, in FIG. 1 and the like, when the plurality of carrier holders 1 are stacked, the claw portion indicated by reference numeral 3 is locked at a predetermined position of the carrier holder 1 arranged below, and The role is to be able to maintain. The

claw portions

3, 3, 3, 3 of the carrier holder 1 project downward for a predetermined length at a total of four locations on the outer edge 6 of the carrier holder 1 having a substantially circular shape when viewed from above, and the lower end thereof extends radially inward. The toe 31 has a shape that bends in the shape of a substantially Japanese katakana “re” when viewed from the side.
[0036]
In the present embodiment, the holes indicated by the reference numeral 4 are formed in the claw portions 3 provided at a total of four positions so as to open upward at the respective positions. The size of the hole of the hole 4 is such that the tip of tweezers (not shown) can be inserted. If the pair of tips of the tweezers is, for example, selected and inserted into the

holes

4 and 4 arranged on the diameter line and gripped, the carrier holder 1 can be handled without directly touching it. become able to.
[0037]
Since the instruments used for cell culture must be handled aseptically, the carrier holder 1 is provided with a hole 4 for handling with tweezers in advance. It is more suitable for cell culture applications. In addition, the formation part of the hole part 4 is not limited to the claw part 3, but may be any part of the carrier holder 1 as long as it can be easily gripped with tweezers.
[0038]
Subsequently, the protrusions indicated by reference numeral 5 are portions protruding from predetermined positions on the outer edge 6 of the carrier holder 1 and the back surface of the frame 21. In the present embodiment, a total of 13 protrusions are provided at predetermined intervals. (See FIG. 2B).
[0039]
These protrusions 5 abut against a carrier (a carrier placed on the lower carrier holder 1) such as a porous membrane arranged on the lower side, and press this carrier downward to form the (lower) carrier. It plays a role of fixing to the holder 1. Therefore, the projection 5 needs to have a length at least enough to abut against and fix the lower carrier, and it is desirable to adopt a shape that can easily press the carrier.
[0040]
Next, the linear outer edge portion 7 formed on the outer edge portion 6 of the carrier holder 1 has a substantially circular outer edge portion 6 as viewed from above at predetermined intervals at a total of four locations, specifically, the upper carrier holder portion. It is formed at a total of four positions, which are positions that coincide with the positions of the respective claw portions 3.
[0041]
The linear outer edge 7 functions as a fitting position of each claw 3 of the upper carrier holder 1. Each of the claws 3 fitted into the linear outer edge portion 7 is not yet locked to the outer edge portion 6, and when the carrier holder 1 is lifted upward in this state, it can be easily removed. Can be.
[0042]
Here, a method of locking and fixing the

carrier holders

1, 1 will be described in detail with reference to FIGS.
[0043]
3A and 3B are views showing a state in which a carrier C is interposed between two

carrier holders

1 and 1 for use, and FIG. 3A is an exploded perspective view thereof, and FIG. FIG. 2 is an external perspective view showing a state in which a carrier C is interposed and fixed to two

carrier holders

1 and 1. FIGS. 4A and 4B are diagrams for explaining in sequence the operation of setting the two

carrier holders

1 and 1 in the locked and fixed state, and FIG. 4A is a side view showing the state before fitting. FIG. 1B is a side view showing a state immediately after the fitting, and FIG. 1C is a side view showing a state when it is turned into a locked state. In FIG. 4, the carrier C is omitted and not shown.
[0044]
First, as shown by dashed-dotted arrows X and X in FIG. 3A, each claw portion 3 of the upper carrier holder 1 coincides with the linear outer edge 7 of the lower carrier holder 1. Position, and then fitted toward the lower carrier holder 1, and then each claw 3 is turned toward the linear outer edge 8 (the upper carrier holder 1). .
[0045]
Here, referring again to FIG. 2, the radial distance D between the linear outer edges 8-8 is designed to be longer than the radial distance d between the linear outer edges 7-7 (see FIG. 2). (Ie, D> d). The distance D is designed to be slightly longer than the distance L (see FIG. 2) between the distal ends 32 and 32 of the

claws

3 and 3 which are arranged on the diameter line and face each other.
[0046]
For this reason, when the claws 3 of the upper carrier holder 1 are simultaneously moved to the positions of the respective linear outer edges 8, even if the carrier holder 1 is simply lifted upward to be removed, the claws 3 are not moved. 3 (the distal end portion 32) is locked to the outer edge portion 6 of the lower carrier holder 1, so that it cannot be removed. With such a configuration, the

carrier holders

1 and 1 can maintain the locked and fixed state (see FIG. 3B), so that a large number of carrier holders 1 can be easily and reliably stacked. .
[0047]
In addition, each protrusion 9 formed at the end position (in the turning direction) of each linear outer edge 8 functions as a stopper for restricting the claw 3 from being turned more than necessary.
[0048]
FIG. 4 is a side view for explaining step by step the operation in which the two

carrier holders

1 and 1 are locked and fixed. In FIG. 4, the carrier C is omitted and not shown.
[0049]
First, FIG. 4A shows a state before the two

carrier holders

1 and 1 are fitted. The upper carrier holder 1 is fitted toward the lower carrier holder 1 (arrow Y direction). In this fitting operation (overlapping operation), a total of four

claw portions

3, 3, 3, 3 provided on the upper carrier holder 1 are combined with a total of four linear portions provided on the lower carrier holder 1. The position corresponding to the outer edge portions 7, 7, 7, 7 is selected and performed.
[0050]
Next, FIG. 4B shows a state immediately after the two

carrier holders

1 and 1 are overlaid. In this state, the

claw portions

3, 3, 3, 3 of the upper carrier holder 1 stay at the linear outer edges 7, 7, 7, 7 of the lower carrier holder 1, so that the upper carrier holder 1 can be easily removed by lifting it. That is, the upper carrier holder 1 is not yet locked to the lower carrier holder 1.
[0051]
Subsequently, FIG. 4C shows a state in which the upper carrier holder 1 is turned by a predetermined angle in the arrow Z direction in FIG. That is, the

claws

3, 3, 3, 3 of the upper carrier holder 1 move to the respective linear outer edges 8 of the lower carrier holder 1, and move to the outer edges 6 of the lower carrier holder 1. It is in a locked state.
[0052]
FIG. 5 is an enlarged view of the vicinity of the claw portion 3 when the upper carrier holder 1 is locked to the lower carrier holder 1. As shown in FIG. 5, in the locked state, the toe 31 of the claw portion 3 of the upper carrier holder 1 is locked to (the back surface of) the outer edge 11 of the lower carrier holder 1. ing. At this time, the tip 51 of the projection 5 of the upper carrier holder 1 abuts against the upper surface C1 of the carrier C placed on the lower carrier holder 1, and fixes the carrier C. Note that the shape of the tip 51 of the protrusion 5 is not sharp, but is desirably a shape having a spherical surface or a certain flat surface because the carrier C is easily fixed.
[0053]
A gap S is secured in the upper region of the carrier C, and the medium can freely perfuse the gap S, so that nutrients and the like necessary for cell growth can be spread to every corner of the carrier C. As described above, when the carrier holders 1 according to the present invention are used in an overlapping manner, the carriers C can be multilayered in a state where the gaps S are formed between the carriers C.
[0054]
Next, FIG. 6 is a schematic side view showing a state in which a predetermined number of the carrier holders 1 according to the present invention are stacked and installed in a cell culture container, and a medium M is placed.
[0055]
The shape, size, volume, and the like of the cell culture container (hereinafter, referred to as “culture container”) indicated by reference numeral 10 are particularly limited as long as the

stacked carrier holders

1, 1,. Not limited. However, as described above, in consideration of the convenience of operating the carrier holder 1 with tweezers, the culture vessel 10 is opened upwardly and divergently upward, as in the culture vessel shown in FIG. 6, for example. The shape is easy to use.
[0056]
The carrier holder 1 is stacked in the culture vessel 10 and placed in a state where a gap S is formed between the carriers C, C, and cells are attached to the respective carriers C, C,. It can be performed. In this configuration, since the gap S is formed between the carriers C, nutrients and the like can be evenly supplied to the cultured cells on each carrier C when the medium M is perfused. As a result, efficient cell culture becomes possible. The cultured cell product can be obtained, for example, by collecting the perfused medium M and removing wastes and the like by filtration or the like.
[0057]
The nutrient can be supplied by adding it to the medium M to be perfused. The oxygen is supplied by dissolving a certain amount of oxygen in the culture medium M and performing perfusion, or by attaching a gas-permeable lid (filter) 11 on the upper portion of the culture vessel 10 to enhance gas exchangeability. Can be performed.
[0058]
The carrier C is a scaffold for cultured cells, and any carrier can be used as long as it can be fixed by the carrier holder 1. For example, a porous membrane can be used for the carrier C. In addition, the porous film refers to a film having a penetrated pore.
[0059]
The diameter of the pores of the porous membrane is not particularly limited, as long as it is permeable to substances such as nutrients and waste products, but is large enough to function as a scaffold for cultured cells. About 1 to 1 μm is preferable. The material of the porous membrane is also not particularly limited, but hydrophilic ones, especially hydrophilic polytetrafluoroethylene, hydrophilic polyvinylidene difluoride, etc. are most preferable.
[0060]
The porous membrane can be suitably used as a scaffold for cultured cells. Since the porous membrane has many holes, the surface is uneven. Therefore, the cultured cells are easily attached. Further, as described above, since the surface is uneven, the restriction on the direction of cell growth is relaxed, and the cultured cells can be relatively freely multi-layered.
[0061]
The porous membrane also has a function of having a substance permeability. For example, nutrients, oxygen, and the like supplied to the cultured cells, products from the cultured cells, waste products, and the like pass through the porous membrane. In the case of performing high-density cell culture, if a porous membrane is used, the medium M perfuses more smoothly due to the material permeability of the porous membrane, and supplies nutrients, oxygen, and the like to the cultured cells on each carrier C evenly. And waste products and the like can be eliminated.
[0062]
Therefore, by using a porous membrane as the carrier C, the growth environment of the cultured cells can be kept uniform throughout, and high-density cell culture more advantageous in terms of safety and quality can be performed.
[0063]
Here, the material of the culture vessel 10 can be adopted as long as it is suitable for cell culture. For example, a general plastic container such as polypropylene can be used. However, the culture vessel 10 is preferably made of a material having gas permeability such as polycarbonate and polymethylpentene.
[0064]
When high-density cell culture is performed using the culture container 10 having gas permeability, oxygen and the like that have passed through the culture container 10 are supplied, so that the productivity of useful proteins is improved. In addition, polymethylpentene has higher gas exchangeability (gas permeability) than polycarbonate and higher productivity of useful proteins by high-density cell culture.
[0065]
【Example】
The following experiments were performed to verify the effect of the high-density cell culture method using the carrier holder according to the present invention. In the following experiments, a porous membrane filter (MF) was used as a carrier, but the present invention is not limited to this.
<Experiment 1>
"Experiment 1" was performed to verify the effect of cell culture when the porous membrane was multilayered.
[0067]
(Comparative Example 1 and Examples 1-4 related to Experiment 1).
First, in order to attach cells to the MF, MF (MF-A or MF-B) having a diameter of 47 mm was fixed to a dish having a diameter of 60 mm with white petrolatum, and human primary fibroblasts were seeded (containing 10% FBS). (DMEM medium) and a 37 ° C. incubator. In the MF, nine holes each having a diameter of 1 mm were previously formed in a cross at intervals of 1 cm, and when the cells proliferated to the holes, the cells on the MF were confluent. "Comparative Example 1" was obtained by directly fixing the MF to which the cells had adhered to a new dish having a diameter of 60 mm with vaseline.
[0068]
Further, MFs were fixed one by one to the carrier holder of the present invention and placed in a culture vessel. Two carrier holders were stacked, and one MF was fixed between them, as "Example 1". Three carrier holders (two MFs) were stacked as "Example 2". A stack of 6 sheets (5 MFs) was referred to as “Example 3”, and a stack of 7 carrier holders (6 MFs) was referred to as “Example 4”. Comparative Example 1 and Examples 1 to 4 were each cultured in a DMEM medium containing 10% FBS, washed one week later, and replaced with a serum-free medium. On the 10th day thereafter, the amount of protein in the culture supernatant was measured. The measurement results are shown in Table 1 below.
[0069]
[Table 1]

[0070]
First, from the comparison of the results of Comparative Example 1 and Example 1 in Table 1 described above, by using the carrier holder of the present invention, a gap (space) between MF and MF or between MF and the bottom of the culture vessel was obtained. ) Was born, and it became clear that protein productivity increased. It is considered that the reason for this is that the formation of the gap facilitated the free movement of substances (nutrition and wastes) and the supply or exchange of gas around the cells.
[0071]
Next, as shown in Examples 2 to 4, it can be seen that even when carrier holders are stacked and MFs are multilayered, higher protein productivity is maintained as compared with Comparative Example 1. That is, it is clear that a configuration in which the MF is multilayered is also effective.
[0072]
In addition, when the number of MFs is five (Example 3) and when the number of MFs is six (Example 3), the number of MFs is one (Example 1) and the number of MFs is two (Example 2). In 4), a difference in protein production of about 35% is observed. This means that the production amount of six MFs can be estimated from the production amount of one MF with an error of about 35%. This indicates that scale-up and prediction calculation of total protein production are possible.
[0073]
As described above, according to the present invention, cell culture can be performed at high density and efficiently by stacking carrier holders and forming a multilayered carrier. In particular, by forming gaps between carriers and forming multilayers, instead of bringing carriers into close contact with each other to form a multilayer, the drawbacks of the hollow fiber type culture method, which has been conventionally considered to be the most efficient, can be improved. That is, by stacking the carrier holders and using a plurality of carriers in a multilayered manner, it is possible to easily predict and calculate the amount of protein production based on the number of carriers to which cells are attached, and to simplify scale-up.
[0074]
In addition, since the carrier holder can be easily removed, cells on the carrier can be easily observed. Further, according to the present invention, since the carrier holders are stacked and placed in the culture vessel, the medium in the cell culture vessel can be easily sampled, unlike the hollow fiber culture method. Therefore, it is possible to monitor the growth state and the cell environment of the cells, and control the quality of the cell products.
<Experiment 2>
The following “Experiment 2” was performed for the purpose of examining a suitable material of the culture vessel for accommodating the carrier holder.
[0076]
Three types of materials were prepared as culture vessels for accommodating the stacked carrier holders (with MF fixed as carriers). The cells were cultured in each container, the amount of protein in the culture supernatant was measured, and the effectiveness of gas exchange (gas permeability) in protein production by the cells was examined.
[0077]
As the material of the culture vessel, polypropylene (Example 5), polycarbonate (Example 6), and polymethylpentene (Example 7) were used. Further, an example in which a gas-exchangeable (gas-permeable) filter was attached to the upper portion of a culture vessel made of a material having the largest amount of protein in the culture supernatant to further enhance gas exchange was also prepared (Example). 8). This container has a highly confidential shape in which the lid is turned to close, and there is no water leakage even if water is put in the container and the container is turned upside down.
[0078]
To specifically explain the method of Experiment 2, in order to adhere cells to the MF, MF having a diameter of 47 mm was fixed to a dish having a diameter of 60 mm with white petrolatum, and human primary fibroblasts were seeded (10% FBS). Containing DMEM medium) in a 37 ° C. incubator. For MF, hydrophilic polytetrafluoroethylene or hydrophilic polyvinylidene difluoride was used. In the MF, nine holes each having a diameter of 1 mm were previously formed in a cross at intervals of 1 cm, and when the cells proliferated to the holes, the cells on the MF were confluent. The MF on which the cells adhered and proliferated was set on a frame, housed in the culture containers of Examples 5 to 8, and further, 1.5 g of a microcarrier to which the cells were adhered was also placed. After culturing for one week, the serum medium was sufficiently removed, washed, and replaced with a serum-free medium. After 14 days of culture, the amount of protein in the culture supernatant was measured. The measurement results are shown in the following “Table 2”.
[0079]
[Table 2]

[0080]
In Examples 5 to 8 of Table 2 described above, the protein concentration in the culture supernatant was high in all cases, but the maximum was particularly high in the polymethylpentene cylindrical container of Example 7 (39.2 µg). / Ml). In addition, the gas permeability of polymethylpentene was the highest in the result of the material test separately performed. That is, protein productivity by cells is closely related to the gas permeability of the container.
[0081]
In addition, comparing Example 7 and Example 8, the protein concentration was not significantly changed even if a gas-permeable filter was attached to the culture vessel made of polymethylpentene. From this result, it was found that if the culture vessel was formed of a material having high gas permeability such as polymethylpentene, it was not necessary to increase the gas permeability by using a gas-permeable filter or the like.
[0082]
From the above Experiment 2, it can be seen that high-density cell culture can be performed and high protein productivity can be ensured by storing the multilayered MF in a culture vessel made of polymethylpentene having high gas permeability and performing cell culture. I understood.
[0083]
【The invention's effect】
The present invention has the following effects.
[0084]
By stacking and installing carrier holders and performing high-density cell culture, free transfer of substances (nutrients, waste products, products, etc.) and gas exchange (oxygen, etc.) become possible. As a result, the culture environment becomes uniform, and the problems of high-density cell culture such as a concentration gradient of the medium and anoxic pockets can be solved.
[0085]
As described above, by making the culture environment uniform, it is possible to eliminate as much as possible cells that are not healthy or dead cells, and to produce useful proteins with high safety and high quality. Therefore, it can be used for production of medicines and cosmetics, and regenerative medicine.
[0086]
In addition, the use of a porous membrane as a carrier has the effect of reducing the restriction on the direction of cell growth, and the effect of minimizing the presence of unhealthy cells and dead cells.
[0087]
Furthermore, in addition to the above-mentioned effects, the present invention has the advantage that cells can be observed during culture, and the culture environment can be monitored by sampling the medium. Further, by changing the number of carrier holders, the size and the number of carriers, and the like, the production amount of the cell product can be adjusted. Therefore, by monitoring the culture environment, the quality of the cell product can be controlled, and the production plan of the target cell product can be predicted and calculated to make a culture plan.
[0088]
As described above, the present invention can be used as a “bioreactor” capable of producing a required amount of a useful protein or the like by a simpler and cheaper method. Particularly, in regenerative medicine, it is useful for culturing cells collected from an individual at a high density.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an external perspective view of a carrier holder (1) according to the present invention.
FIG. 2A is a plan view of the carrier holder (1) as viewed from above.
(B) Plan view of the carrier holder (1) viewed from below (as viewed from the back side).
FIG. 3A is an exploded perspective view showing a state in which a carrier (C) is interposed between two carrier holders (1, 1) for use.
(B) An external perspective view showing a state in which a carrier (C) is interposed and fixed to two carrier holders (1, 1).
FIG. 4 (A) is a side view showing a state in which two

carrier holders

1 and 1 are locked and fixed in a step-by-step manner, showing a state before fitting.
(B) Side view showing the state immediately after fitting
(C) A side view showing the state when it is turned into the locked state.
FIG. 5 is an enlarged view of the vicinity of the claw (3) when the upper carrier holder (1) is locked by the lower carrier holder (1).
FIG. 6 is a schematic side view showing a state in which a predetermined number of carrier holders 1 according to the present invention are stacked and set in a culture vessel (10), and a medium (M) is placed therein.
[Explanation of symbols]
1 carrier holder
2 Placement of carrier
3 claws
4 Tweezer insertion hole
5 Projection for fixing carrier
10 Culture vessels
22 Carrier mounting hole
C carrier
M medium

Claims

A carrier holder for cell culture, which satisfies all of the following conditions (1) to (4).
(1) A place where a carrier to be a scaffold for cultured cells is placed is provided.
(2) The stacked state can be maintained.
(3) When stacked, the carriers arranged on the lower side can be fixed.
(4) A gap can be formed between the carriers when they are stacked.

The carrier holder for cell culture according to claim 1, wherein a through hole is formed in the placement location.

The cell according to claim 1, wherein a claw portion is formed at an outer edge portion, and the claw portion is retained at a predetermined position on an outer edge portion of the carrier holder disposed below, whereby the stacked state can be maintained. Carrier holder for culture.

2. The carrier holder for cell culture according to claim 1, wherein a projection projecting downward is formed at a predetermined position on the back surface, and the carrier is fixed by contacting the projection with a lower carrier. .

2. The carrier holder for cell culture according to claim 1, wherein a hole for inserting tweezers is formed and can be gripped with tweezers.

A high-density cell, wherein the carrier holder for cell culture according to claim 1 is stacked and installed in a culture vessel, and cell culture is performed on each of the multilayered carriers in a state where a gap is formed. Culture method.

The method according to claim 6, wherein the carrier is a porous membrane.

The high-density cell culture method according to claim 6, wherein the culture container has gas permeability.