【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養細胞を観察する培養細胞観察装に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞培養は、研究や検査目的のみならず、再生医療や免疫治療など治療分野でも重要になっている。特に、治療を目的とした細胞培養においては、目的となる細胞が、目的となる構造（配列）で、他の細胞や菌とのコンタミネーションなしに培養されていることの確認や、また個人個人の細胞によって栄養状態など環境を調整するための、培養状態のモニタとして培養中の顕微鏡観察が有効である。
【０００３】
例えば、特開平５−１８４３５１号公報には、多層の細胞培養エンベロープ（カセット）を用いることで、高密度で高収量の細胞を培養可能な細胞培養装置が提案されている。
【０００４】
また、特開２００２−１５３２６０号公報には、細胞を長期培養しながら顕微鏡で観察する観察装置が提案されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平５−１８４３５１号公報
【０００６】
【特許文献２】
特開２００２−１５３２６０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開２００２−１５３２６０号公報の装置では培養しながら、顕微鏡観察し、培養条件を変更することが可能であるが、観察のため、培養装置自身をステージで移動する必要があった。培養条件が移動により変わる恐れがあること、培養装置に可動に対応した機構が必要という問題点がある。
【０００８】
また、特開２００２−１５３２６０号公報の装置では培養しながら、顕微鏡観察し、培養条件を変更することが可能であるが、特開平５−１８４３５１号公報のような高密度・高収量の系には用いることができない。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、培養装置を移動せずに、細胞を培養しながら培養細胞を観察することのできる培養細胞観察装置を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の培養細胞観察装置は、少なくとも１枚の平面の透明窓を有する細胞培養容器に対して前記透明窓に対向して設けられた高倍率観察手段が設けられた観察プローブと、前記高倍率観察手段を前記透明窓に対して平行に２次元的に移動する移動手段とを具備して構成される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について述べる。
【００１２】
図１ないし図９は本発明の第１の実施の形態に係わり、図１は細胞培養観察装置の構成を示す構成図、図２は図１の光走査プローブと培養カセットを示す図、図３は図１の光走査プローブの先端側の光走査光学系の構成を示す図、図４は図３におけるスキャナの構成を示す図、図５は図１の光走査プローブを位置決め保持する粗動アクチュエータを示す図、図６は図１の光走査プローブの基端付近に設けた微動アクチュエータの構成を示す第１の図、図７は図１の光走査プローブの基端付近に設けた微動アクチュエータの構成を示す第２の図、図８は図１の光走査プローブの作用を示す図、図９は図１の細胞培養観察装置の変形例を示す図である。
【００１３】
図１に示すように、光走査装置からなる本発明の第１の実施の形態の細胞培養観察装置１は、培養カセット２内で培養された培養細胞からの蛍光を検出するために培養カセット２を挟むように対峙して配置され、微小な走査範囲（観察範囲）を詳細に光走査する光走査手段を内蔵した光走査プローブ３Ａ、３Ｂと、これらの光走査プローブ３Ａ、３Ｂを位置決め保持する位置決め保持手段４と、この位置決め保持手段４を介して取り付けられた光走査プローブ３Ａ、３Ｂを２次元的に粗動走査する粗動走査手段としての電動式のＸＹ走査ステージ５と、このＸＹ走査ステージ５を駆動するＸＹ走査ステージ駆動装置６と、光走査プローブ３Ａ、３Ｂにそれぞれ接続され、光源からの光を供給すると共に、検査体側からの戻り光における蛍光成分等を検出するための検出手段をそれぞれ備えた検出ユニット７Ａ、７Ｂと、これら検出ユニット７Ａ、７Ｂと接続され、光電変換された電気信号に対して画像処理を行う画像処理手段としての例えばパーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと略記）８と、このＰＣ８により画像化された光走査画像を表示するモニタ９と、光走査画像データ等を記録（保存）するデータ保持装置１０とを有する。
【００１４】
検出ユニット７Ａは、励起用の光源として複数、例えば３つの波長のレーザ光を発生できるようにＡｒレーザ１１ａ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ１１ｂ、半導体レーザ（レーザダイオード）１１ｃを有し、これらのレーザ光はダイクロイックミラー（或いはハーフミラー）１２ａ、１２ｂ、１２ｃにより合成されて集光レンズ１３に入射され、この集光レンズ１３で集光されて光ファイバ１４ａに入射される。
【００１５】
光ファイバ１４ａに入射されたレーザ光は光カプラ１５によりその一部が光ファイバ１４ｂに導光され、この光ファイバ１４ｂに導光された光は光コネクタ１６を経て、光走査プローブ３Ａ側の光ファイバ１７ａに入射され、光ファイバ１７ａに入射された光は、その先端側に伝送される。
【００１６】
図２に示すように、光ファイバ１７ａの先端側は光走査プローブ３Ａ内に挿通されており、その先端側には光走査光学系１９が設けてあり、光走査光学系１９により培養液２ｃが満たされた、上下面が平行な透明窓部２ａ，２ｂとなっている培養カセット２内の培養された培養細胞２０に、光ファイバ１７ａに入射された光が透明窓部２ａを介して照射される。
【００１７】
図３に示すように、光走査プローブ３Ａの先端内に設けられた光走査光学系１９では、光ファイバ１７ａの先端側がマイクロマシンミラーによる２次元（例えばＸＹ）走査用スキャンミラー（スキャナともいう）２３と共に、取付部材１８により先端内壁に固定されている。
【００１８】
そして、この光ファイバ１７ａの微小サイズの先端面２４から出射された光は、スキャナ２３の可動部で反射されて、先端側面の開口に取り付けられた集光レンズ系２６を経て、この集光レンズ系２６の光軸の方向に出射され、その際焦点２７で集光するようにして培養細胞２０側に照射される。
この場合、スキャナ２３における可動ミラーが２次元的に傾動されることにより、焦点２７は集光レンズ系２６の光軸Ｏと直交する方向に２次元的に走査（移動）される。
【００１９】
この焦点２７からの反射光は同一の経路を逆にたどり、光ファイバ１７ａの先端面２４に入射される。つまり、光ファイバ１７ａの先端面２４と焦点２７とは光走査光学系１９、つまりスキャナ２３，集光レンズ系２６に関して共焦点関係ないしはこれに近い関係（近共焦点関係）となり、焦点２７近傍位置の光のみが光ファイバ１７ａの先端面２４に入射される。
【００２０】
なお、実際には、焦点２７及びその近傍から発光された蛍光を主に検出する。尤も、反射光成分も検出し、その強度から蛍光検出を（規格化などして）比較可能に行うと共に、被検体にフォーカス（ないしはそれに近い）状態に維持して光走査を行う制御にも用いるようにしている。
【００２１】
なお、本実施の形態における集光レンズ系２６として色消しレンズが採用されている。つまり、上記光源の光、つまりＡｒレーザ１１ａ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ１１ｂ、レーザダイオード１１ｃの各波長の光及び後述する蛍光の波長に対して殆ど同一の焦点位置となるように複数のレンズを組み合わせて形成されている。
【００２２】
スキャナ２３は信号線２８ａを介し、さらにコネクタ２９ａを経て検出ユニット７Ａ内部のスキャナ駆動装置３０（図１参照）と接続され、このスキャナ駆動装置３０からＸＹ方向に走査する駆動信号を出力することにより、スキャナ２３の可動ミラー部分はＸＹ方向に傾動し、培養細胞２０側に集光される焦点２７を２次元的に走査し、その戻り光により培養細胞２０の培養状態等の情報を得ることができるようにしている。
以下スキャナ２３の構成を図３及び図４を参照して説明する。
スキャナ２３は、可動ミラーとなるジンバルミラー３２と、くぼみ部３３を有するグランド３４によって構成されている。
【００２３】
ジンバルミラー３２の本体はシリコンのプレートであり、図３で示した信号線２８ａは、実際には図４に示すように、符号３５ａ、３５ｂ、３５ｃ、３５ｄで示される駆動用配線で形成され、それぞれ電極３６ａ、３６ｂ、３６ｃ、３６ｄに接続される。ここで、駆動用配線及び電極はミラーの役割も兼ねる。
図４中の梨地部３７は開口部であり、ヒンジ部３８、３９を軸として中央のミラー部がＸ方向、Ｙ方向に回動自在である。
【００２４】
電極３６ａ、３６ｂと３６ｃ、３６ｄは、それぞれ一対（２本）のＸ方向駆動配線３５ａ、３５ｂと一対（２本）のＹ方向駆動配線３５ｃ、３５ｄを介して、検出ユニット７Ａ内のスキャナ駆動装置３０と電気的に接続され、それぞれＸ駆動信号及びＹ駆動信号が供給されることになる。
【００２５】
図１に戻り、上記光ファイバ１７ａに入射された光は検出ユニット７Ａ内の光カプラ１５でその一部が光ファイバ１４ｃ側に導光される。この光ファイバ１４ｃに導光された光はその端面から出射され、光検出部４０Ａを構成する集光レンズ４１により集光される。
なお、光ファイバ１４ｄの端部は閉鎖或いはその端部からの反射が減衰するように処理されている。
【００２６】
集光レンズ４１により集光された光は、例えばハーフミラー４２で反射光と透過光とに分割される。そして、透過光に対しては、それぞれ異なる所定の波長を検出するための複数の検出手段で検出され、反射光に対しては、培養細胞２０からの戻り光（主に反射光）を検出する反射光検出手段で検出される。
【００２７】
つまり、ハーフミラー４２に対向して、波長λ１の光を透過し、それ以外を反射するダイクロイックミラー４３ａが配置されており、このダイクロイックミラー４３ａを透過した光はフォトマルチプライヤ（ＰＭＴと略記）４４ａに入射され、光倍増で光電変換された後、Ａ／Ｄコンバータ４５ａでアナログ信号からデジタル信号に変換されて、ＰＣ８に入力される。
【００２８】
また、ダイクロイックミラー４３ａの反射光路側には、波長λ２の光を反射し、それ以外を透過するダイクロイックミラー４３ｂが配置されており、このダイクロイックミラー４３ｂで反射された光はＰＭＴ４４ｂに入射され、光倍増で光電変換された後、Ａ／Ｄコンバータ４５ｂでデジタル信号に変換されて、ＰＣ８に入力される。
【００２９】
また、ダイクロイックミラー４３ｂの透過光路側には、波長λ３の光を反射し、それ以外を透過するダイクロイックミラー４３ｃが配置されており、このダイクロイックミラー４３ｃで反射された光はＰＭＴ４４ｃに入射され、光倍増で光電変換された後、Ａ／Ｄコンバータ４５ｃでデジタル信号に変換されて、ＰＣ８に入力される。
【００３０】
一方、ハーフミラー４２で反射された光は光検出器（ＰＤと略記）４６で受光され、光電変換された後、Ａ／Ｄコンバータ４５ｄでアナログ信号からデジタル信号に変換されて、ＰＣ８に入力される。
【００３１】
ＰＣ８では、Ａ／Ｄコンバータ４５ｄで変換された（ＰＤ４６からの）信号の強度により、Ａ／Ｄコンバータ４５ａ〜４５ｃを介して検出される各波長λ１〜λ３の信号強度を規格化等して検出する。
なお、他の光走査プローブ３Ｂは光走査プローブ３Ａと同じ構造であり、また検出ユニット７Ｂも検出ユニット７Ａと同じ構造である。
【００３２】
上記光走査プローブ３Ａ及び３Ｂからなるプローブユニット３は、図５に示すように、その後端が位置決め保持手段４を介して、Ｘ軸方向に走査するＸ軸走査装置５２Ａ及びＹ軸方向に走査するＹ軸走査装置５２ＢからなるＸＹ走査ステージ５に取り付けられており、このＸＹ走査ステージ５により光走査プローブ３Ａ及び３Ｂ全体、即ちプローブユニット３毎、Ｘ方向及びＹ方向に移動（走査）される。
【００３３】
なお、各光走査プローブ３Ｉ（Ｉ＝Ａ，Ｂ）によるＸ及びＹ方向の走査範囲は狭いので、それを補うために広範囲に移動できるＸＹ走査ステージ５によりプローブユニット３をＸ方向及びＹ方向に移動し、所定の検査範囲をカバーできるようにしている。
【００３４】
図６及び図７は光走査プローブ３Ａの基端（後端）に設けた位置決め保持手段４を構成する微動アクチュエータ５１Ａの構造を示し、図６はＺ方向から見た場合、図７はＸ方向から見た場合の微動アクチュエータ５１Ａを示す。
【００３５】
この微動アクチュエータ５１Ａは、光走査プローブ３Ａの基端の長手方向にＺ及びＸ方向走査用の板状バイモルフ圧電素子６１及び６２がそれぞれＺ及びＸ方向に対向するように２枚配置され、それぞれＺ及びＸ方向に変位可能にしている。
【００３６】
また、Ｘ方向走査用の板状バイモルフ圧電素子６２の後端にはＹ方向走査用の積層構造の積層化圧電素子６３が取り付けてあり、Ｙ方向に伸縮変位自在にしている。
【００３７】
この微動アクチュエータ５１Ａは、例えばＰＣ８に接続され、ＰＣ８から微動アクチュエータ５１Ａの動作を制御できるようにしている。
【００３８】
したがって、例えばＰＣ８に設けられたキーボード等から移動操作の入力を行うことにより、その入力された値だけ、板状バイモルフ圧電素子６１及び６２、積層化圧電素子６３とにより、微動アクチュエータ５１Ａに対して光走査プローブ３Ａの基端位置をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動し、位置決め位置を３次元的に微調整ができるようにしている。
【００３９】
本実施の形態では、各光走査プローブ３Ｉ（Ｉ＝Ａ，Ｂ）をそれぞれ独立して、微動アクチュエータ５１Ｉで３軸方向に微調整可能に保持しているので、各光走査プローブ３Ｉの先端側の光走査光学系１９と観察対象となる培養細胞２０とを光走査により光学情報を読みとれるような適切な状態に設定できるようにしている。
【００４０】
例えば、光走査プローブ３Ａはそれに内蔵された各光走査光学系１９による光がその光軸Ｏ方向で被検体の表面で殆どフォーカスするように自動的に位置決めするように制御される。他の光走査プローブ３Ｂでも同様である。
【００４１】
このように構成された本実施の形態では、ＸＹ走査ステージ５によりプローブユニット３をＸ方向及びＹ方向に粗移動した後、板状バイモルフ圧電素子６２及び積層化圧電素子６３によりプローブユニット３の先端をＸ方向及びＹ方向に微移動させて位置決めし、さらに図８に示すように、板状バイモルフ圧電素子６１により焦点２７のＺ（深さ）方向の位置決めを行い、スキャナ２３によりＸＹ方向にスキャンして培養細胞２０を光走査により観察する。
【００４２】
したがって、本実施の形態では、培養カセット２を何ら移動することなく、安定した培養環境を維持した状態で、細胞を培養しながら培養細胞を観察することができる。
【００４３】
なお、本実施の形態では、培養細胞２０に光を照射することで培養細胞２０をトラップすることが可能となり、図８に示したように、板状バイモルフ圧電素子６２及び積層化圧電素子６３によりプローブユニット３の先端をＸ方向及びＹ方向に微移動させ、さらに板状バイモルフ圧電素子６１により焦点２７のＺ（深さ）方向に微移動させることで、所望の培養細胞２０を光トラップし、ＸＹ走査ステージ５、板状バイモルフ圧電素子６１、板状バイモルフ圧電素子６２及び積層化圧電素子６３により、培養細胞２０を所望の位置に移動させる光ピンセットとしての作用を有することができる。水平方向への細胞の移動をスキャナ２３を用いて行うことも当然可能である。
【００４４】
また、本実施の形態では、１対の光走査プローブ３Ａ、３Ｂを用いて、培養細胞２０を光走査により観察するとしたが、これに限らず、複数対の光走査プローブ、例えば図９に示すように３対の光走査プローブ３Ａ（１）、３Ｂ（１）、光走査プローブ３Ａ（２）、３Ｂ（２）、光走査プローブ３Ａ（３）、３Ｂ（３）を用い、これら３対のプローブユニット３（１）〜（３）において、上記説明したように、ＸＹ走査ステージ５によりプローブユニット３（１）〜（３）をＸ方向及びＹ方向に粗移動した後、板状バイモルフ圧電素子６２及び積層化圧電素子６３によりプローブユニット３（１）〜（３）それぞれの先端をＸ方向及びＹ方向に微移動させて位置決めし、さらに板状バイモルフ圧電素子６１により焦点２７のＺ（深さ）方向の位置決めを行い、スキャナ２３によりＸＹ方向にスキャンして培養細胞２０を光走査により観察するようにしてもよい。
【００４５】
図１０ないし図１４は本発明の第２の実施の形態に係わり、図１０は光走査プローブと培養カセットを示す図、図１１は図１０の光走査プローブの作用を示す第１の図、図１２は図１０の光走査プローブの作用を示す第２の図、図１３は図１０の光走査プローブの作用を示す第３の図、図１４は図１０の光走査プローブの作用を示す第４の図である。
【００４６】
第２の実施の形態は、第１の実施の形態とほとんど同じであるので、異なる点のみ説明し、同一の構成には同じ符号をつけ説明は省略する。
【００４７】
本実施の形態では、図１０に示すように、培養カセット２がＺ方向に多層に配置されて培養細胞２０が培養される際に、各培養カセット２の培養状態を観察可能とした実施の形態である。そのため本実施の形態では、ＸＹ走査ステージ５の代わりにＸＹＺ走査ステージ５ａを設け、ＸＹＺ走査ステージ５ａをＸ軸方向に走査するＸ軸走査装置５２Ａ、Ｙ軸方向に走査するＹ軸走査装置５２Ｂ及びＺ軸方向に走査するＺ軸走査装置５２Ｃより構成している。その他の構成は第１の実施の形態と同じである。
【００４８】
本実施の形態では、例えば図１１に示す層の培養カセット２を光走査プローブ３Ａ、３Ｂにより観察した後、他の層の培養カセット２に移動して観察を継続する。
【００４９】
具体的には、図１２に示すようにＹ軸走査装置５２Ｂにより光走査プローブ３Ａ、３Ｂを培養カセット２が配置されている領域から抜き出し、図１３に示すようにＺ軸走査装置５２Ｃにより培養カセット２の層のピッチ分だけＺ軸方向に移動させ、ぞの後図１４に示すようにＹ軸走査装置５２Ｂにより光走査プローブ３Ａ、３Ｂを培養カセット２が配置されている領域に挿入する。これにより光走査プローブ３Ａ、３Ｂを所望の層に移動させ、観察を継続する。
【００５０】
このように本実施の形態では、第１の実施の形態の効果に加え、多層に配置した培養カセット２に対しても観察が可能となり、取り扱いが簡単で高収量である培養環境にあっても、細胞の状態をモニタすることができる。
【００５１】
図１５は本発明の第３の実施の形態に係る光走査装置の主要部の構成を示す図である。
【００５２】
第１の実施の形態では、複数の光走査プローブ毎に励起用光源を用意していたが、本実施の形態の光走査装置１Ｂでは、図１５に示すように、共通となる１組の励起用光源のみを用いた構成にしている。
【００５３】
つまり、１組の励起用光源７０の光は集光レンズ１３により光ファイバ７１ａに入射され、その光は光カプラ７２ａにより、光ファイバ７１ｂ及び７１ｃにそれぞれ導光される。なお、１組の励起用光源７０は図１のＡｒレーザ１１ａ、Ｈｅ−Ｈｅレーザ１１ｂ、レーザダイオード１１ｃとダイクロイックミラー１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、及び集光レンズ１３からなる。
【００５４】
また、光ファイバ７１ｂに導光された光は、光カプラ７２ｂにより光ファイバ７１ｄ及び７１ｅにそれぞれ導光される。また、光ファイバ７１ｃに導光された光も光カプラ７２ｃにより２本の光ファイバ７１ｆ、７１ｇに導光されるようになる。
【００５５】
光ファイバ７１ｄに導光された光は、光カプラ７２ｄにより光ファイバ７１ｈ及び７１ｉにそれぞれ導光され、光ファイバ７１ｈに導光された光は光コネクタ１６ａを経て光走査プローブ３Ａの光ファイバ１７ａに導光される。なお、光ファイバ１７ｉの端部は閉鎖されている。
【００５６】
また、同様に、光ファイバ７１ｅに導光された光は、光カプラ７２ｅにより光ファイバ７１ｊ及び７１ｋにそれぞれ導光され、光ファイバ７１ｊに導光された光は光コネクタ１６ｂを経て光走査プローブ３Ｂの光ファイバ１７ｂに導光される。なお、光ファイバ１７ｋの端部は閉鎖されている。
【００５７】
また、光ファイバ７１ｆに導光された光は、光カプラ７２ｆにより光ファイバ７１ｌ及び７１ｍにそれぞれ導光され、光ファイバ７１ｌに導光された光は光コネクタ１６ｃを経て光走査プローブ３Ｃの光ファイバ１７ｃに導光される。なお、光ファイバ１７ｍの端部は閉鎖されている。
また、同様に、光ファイバ７１ｇに導光された光側も同様の構成になっている。
【００５８】
上記光走査プローブ３Ａによる被検体側からの戻り光は光ファイバ７１ｈを経て光カプラ７２ｄに入射され、その一部が光ファイバ７１ｏに導光され、光検出部４０Ａに入射される。
また、光走査プローブ３Ｂによる被検体側からの戻り光は光ファイバ７１ｊを経て光カプラ７２ｅに入射され、その一部が光ファイバ７１ｐに導光され、光検出部４０Ｂに入射される。
【００５９】
また、光走査プローブ３Ｃによる被検体側からの戻り光は光ファイバ７１ｌを経て光カプラ７２ｆに入射され、その一部が光ファイバ７１ｑに導光され、光検出部４０Ｃに入射される。
なお、光走査プローブ３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、…にはそれぞれ信号線２８ｉが延出され、それぞれスキャナ駆動装置３０に接続されるが、図１０では簡単化のため、省略している。
【００６０】
その他の構成は第１の実施の形態と同様である。本実施の形態による作用（動作）は光源７０を共通化したことを除いて第１の実施の形態とほぼ同様の作用となる。
本実施の形態によれば、１組の光源７０で済むため、低コスト化できる。
【００６１】
図１６ないし図１８は本発明の第４の実施の形態に係わり、図１６は光検出プローブの構成を示す図、図１７は図１６の光検出プローブの第１の変形例の構成を示す図、図１８は図１６の光検出プローブの第２の変形例の構成を示す図である。
【００６２】
本実施の形態は上記の光走査を行って培養細胞２０を観察するのではなく、光学顕微鏡的に培養細胞２０を観察する実施の形態である。
【００６３】
そこで、本実施の形態では、図１６に示すように、例えば培養カセット２の下端面より培養細胞２０に照明光を照射する光照射プローブ１０３Ｂと、照明光が照射された培養細胞２０からの観察光を受光する光検出プローブ１０３Ａとから構成される。
【００６４】
光照射プローブ１０３Ｂは、先端に光源となるＬＥＤ１１０を有し、ミラー１１１及びレンズ１１２を介してＬＥＤ１１０からの照明光を培養細胞２０に照射するようになっている。
【００６５】
また、光検出プローブ１０３Ａは、レンズ１１３及びミラー１１４を介してＣＣＤ１１５を有する撮像装置１１６で培養細胞２０の像を撮像するようになっている。
【００６６】
なお、ＬＥＤ１１０及び撮像装置１１６は、図示しないカメラコントロールユニットに接続され、発光制御及び撮像信号処理が行われ、図示しないモニタに培養細胞２０の観察像を表示することができるようになっている。
【００６７】
このように本実施の形態では、光学顕微鏡的に培養細胞２０を観察することができる。
【００６８】
なお、１つの光学プローブで光学顕微鏡的に培養細胞２０を観察することも可能であって、図１７に示すように、先端側面に対物レンズ２１３を備え、その周囲にリング状に形成されたＬＥＤ２１１を設け、さらに内部に対物レンズ２１３からの観察光をミラー２１２を介して撮像するＣＣＤ２１０を有する撮像装置２１４を備えた光学プローブ２０３Ａを用いて光学顕微鏡的に培養細胞２０を観察するようにしてもよい。
【００６９】
この図１７の構成の光学プローブ２０３Ａでは、ＬＥＤ２１１を発光させて培養細胞２０を照明し、その戻り光を撮像装置２１４により観察する。撮像装置２１４には例えば赤外カットフィルタ２１５が設けられている。
【００７０】
また、１つの光学プローブで光学顕微鏡的に培養細胞２０を観察する変形例として、図１８に示すように、先端側面に対物レンズ２１３を備え、内部にＬＥＤ２１１及びダイクロイックミラー（或いはハーフミラー）２１６及び撮像装置２１４を備えた光学プローブ３０３Ａを用いて光学顕微鏡的に培養細胞２０を観察するようにしてもよい。
【００７１】
なお、図１７及び図１８においては、培養細胞２０を蛍光色素で染色することで、ＬＥＤ２１１から励起光を発光させ、培養細胞２０からの蛍光を観察するようにしてもよく、この場合撮像装置２１４には赤外カットフィルタのかわりに励起光カットフィルタが設けられる。
【００７２】
［付記］
（付記項１） 前記観察プローブは、前記透明窓に略平行に設けられた、細長い棒状でその一部に前記高倍率観察手段が設けられて構成される
ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞観察装置。
【００７３】
（付記項２） 前記移動手段手段の移動平面に直交した方向に前記高倍率観察手段を移動させる直交方向移動手段を有する
ことを特徴とする付記項１に記載の培養細胞観察装置。
【００７４】
（付記項３）前記移動手段が、粗動手段と微動手段よりなり、前記粗動手段及び前記直交方向移動手段により前記観察プローブを複数の細胞培養容器間を移動可能にする
ことを特徴とする付記項２に記載の培養細胞観察装置。
【００７５】
（付記項４）前記透明窓が前記細胞培養容器に対向して設けられ、前記観察プローブが前記透明窓のそれぞれの観察面から観察可能な位置に配置される
ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞観察装置。
【００７６】
（付記項５）前記高倍率観察手段の観察の深さ方向の位置が、前記透明窓の前記細胞培養容器内側の位置に略一致する
ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞観察装置。
【００７７】
（付記項６）前記移動手段が、前記透明窓と前記高倍率観察手段との距離を可変する距離可変手段を有する
ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞観察装置。
【００７８】
（付記項７）前記距離可変手段は、前記高倍率観察手段の観察の深さ方向の位置を、前記透明窓の前記細胞培養容器内側の位置に略一致するように制御する
ことを特徴とする付記項６に記載の培養細胞観察装置。
【００７９】
（付記項８）前記細胞培養容器内の試料からの反射光が最大になる位置に光走査手段を駆動する自動位置決め手段を備えた
ことを特徴とする付記項７に記載の培養細胞観察装置。
【００８０】
（付記項９） 前記観察プローブを複数有する
ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞観察装置。
【００８１】
（付記項１０）複数の前記観察プローブが少なくとも１自由度の独立した自動位置決め手段を有する
ことを特徴とする付記項９に記載の培養細胞観察装置。
【００８２】
（付記項１１）複数の前記観察プローブが単一の透明窓を観察する
ことを特徴とする付記項９に記載の培養細胞観察装置。
【００８３】
（付記項１２）複数の前記観察プローブがそれぞれ独立した透明窓を観察する
ことを特徴とする付記項９に記載の培養細胞観察装置。
【００８４】
（付記項１３）複数の前記観察プローブの透明窓上の位置を同時に可変させる粗動位置決め手段を有する
ことを特徴とする付記項９に記載の培養細胞観察装置。
【００８５】
（付記項１４）前記高倍率観察手段が、
光源と、
前記光源からの光を被検部に対し集光出射する集光手段と、
前記集光手段によって前記被検部側に集光された焦点を前記集光手段の光軸方向と直交する方向に２次元的に走査する光走査手段と、
前記被検部からの戻り光を検出する光検出手段を有する
ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞観察装置。
【００８６】
（付記項１５）前記光走査手段はマイクロマシンミラーを有する
ことを特徴とする付記項１４に記載の培養細胞観察装置。
【００８７】
（付記項１６）前記光源からの光を前記集光手段に導くための光ファイバと、
前記被検部からの戻り光を前記光源からの光路と分離する分離手段と、
前記分離手段で分離された光を検出する前記光検出手段を有し、
前記光ファイバと前記集光手段とが共焦点または近共焦点である
ことを特徴とする付記項１４に記載の培養細胞観察装置。
【００８８】
（付記項１７）光源光を導光した光ファイバを光カプラにより分岐して複数の光走査手段に導く
ことを特徴とする付記項１６に記載の培養細胞観察装置。
【００８９】
（付記項１８）前記被検体からの戻り光を波長により分割する複数の波長選択手段と、複数の光検出手段とを有する
ことを特徴とする付記項１４に記載の培養細胞観察装置。
【００９０】
（付記項１９）前記戻り光の一部を直接検出する反射光検出手段を有する
ことを特徴とする付記項１８に記載の培養細胞観察装置。
【００９１】
（付記項２０）高倍率観察手段は高倍率拡大光学系と２次元の撮像手段と、光源を有する
ことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞観察装置。
【００９２】
（付記項２１）前記光源はＬＥＤである
ことを特徴とする付記項２０に記載の培養細胞観察装置。
【００９３】
（付記項２２）前記光源の光は光ファイバーにより導光される
ことを特徴とする付記項２０に記載の培養細胞観察装置。
【００９４】
（付記項２３）前記撮像手段と被観察体の間に、光源光の波長をカットするフィルター手段を設ける
ことを特徴とする付記項２０に記載の培養細胞観察装置。
【００９５】
（付記項２４）前記フィルター手段が、対物レンズと撮像手段の間に設けられたダイクロイックミラーである
ことを特徴とする付記項２３に記載の培養細胞観察装置。
【００９６】
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変えない範囲において、種々の変更、改変等が可能である。
【００９７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、培養装置を移動せずに、細胞を培養しながら培養細胞を観察することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る細胞培養観察装置の構成を示す構成図
【図２】図１の光走査プローブと培養カセットを示す図
【図３】図１の光走査プローブの先端側の光走査光学系の構成を示す図
【図４】図３におけるスキャナの構成を示す図
【図５】図１の光走査プローブを位置決め保持する粗動アクチュエータを示す図
【図６】図１の光走査プローブの基端付近に設けた微動アクチュエータの構成を示す第１の図
【図７】図１の光走査プローブの基端付近に設けた微動アクチュエータの構成を示す第２の図
【図８】図１の光走査プローブの作用を示す図
【図９】図１の細胞培養観察装置の変形例を示す図
【図１０】本発明の第２の実施の形態に係る光走査プローブと培養カセットを示す図
【図１１】図１０の光走査プローブの作用を示す第１の図
【図１２】図１０の光走査プローブの作用を示す第２の図
【図１３】図１０の光走査プローブの作用を示す第３の図
【図１４】図１０の光走査プローブの作用を示す第４の図
【図１５】本発明の第３の実施の形態に係る光走査装置の主要部の構成を示す図
【図１６】本発明の第４の実施の形態に係る光検出プローブの構成を示す図
【図１７】図１６の光検出プローブの第１の変形例の構成を示す図
【図１８】図１６の光検出プローブの第２の変形例の構成を示す図
【符号の説明】
１…光走査装置
２…培養カセット
３…プローブユニット
３Ａ、３Ｂ…光走査プローブ
４…位置決め保持手段
５…ＸＹ走査ステージ
６…ＸＹ走査ステージ駆動装置
７Ａ、７Ｂ…検出ユニット
８…ＰＣ
９…モニタ
１０…データ保持装置
１１ａ…Ａｒレーザ
１２ａ〜１２ｃ…ダイクロイックミラー
１４ａ〜１４ｄ…光ファイバ
１７ａ…光ファイバ
１９…光走査光学系
２０…培養細胞
２３…スキャナ（スキャンミラー）
２７…焦点
３０…スキャナ駆動装置
４０…光検出部
４２…ハーフミラー
４３ａ〜４３ｃ…ダイクロイックミラー
４４ａ〜４４ｃ…ＰＭＴ
４５ａ〜４５ｄ…Ａ／Ｄコンバータ
４６…光検出器（ＰＤ）[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cultured cell observation device for observing cultured cells.
[0002]
[Prior art]
Cell culture has become important not only for research and testing purposes, but also for therapeutic fields such as regenerative medicine and immunotherapy. In particular, in cell culture for therapeutic purposes, it is necessary to confirm that the target cells are cultured in the target structure (array) without contamination with other cells or bacteria, Microscopic observation during culturing is effective as a monitor of the culturing state to adjust the environment such as the nutritional state by the cells.
[0003]
For example, JP-A-5-184351 proposes a cell culture device capable of culturing cells at high density and high yield by using a multilayer cell culture envelope (cassette).
[0004]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-153260 proposes an observation device for observing a cell with a microscope while culturing the cell for a long period of time.
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-5-184351
[0006]
[Patent Document 2]
JP 2002-153260 A
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the apparatus disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-153260, it is possible to perform microscopic observation and change the culturing conditions while culturing, but the culturing apparatus itself needs to be moved on a stage for observation. There are problems that the culture conditions may be changed by the movement and that the culture device needs a mechanism that can move.
[0008]
In the apparatus disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-153260, it is possible to change the culture conditions by microscopic observation while culturing. Cannot be used.
[0009]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a cultured cell observation device that allows observation of cultured cells while culturing cells without moving the culture device.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The culture cell observation device of the present invention comprises: an observation probe provided with a high-magnification observation means provided opposite to the transparent window with respect to a cell culture vessel having at least one flat transparent window; Moving means for moving the observation means two-dimensionally in parallel with the transparent window.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0012]
1 to 9 relate to a first embodiment of the present invention, FIG. 1 is a configuration diagram showing a configuration of a cell culture observation device, FIG. 2 is a diagram showing an optical scanning probe and a culture cassette of FIG. FIG. 4 is a diagram showing a configuration of an optical scanning optical system on the distal end side of the optical scanning probe in FIG. 1, FIG. 4 is a diagram showing a configuration of a scanner in FIG. 3, and FIG. FIG. 6 is a first view showing a configuration of a fine movement actuator provided near the base end of the optical scanning probe of FIG. 1, and FIG. 7 is a view of a fine movement actuator provided near the base end of the optical scanning probe of FIG. FIG. 8 is a second diagram showing the configuration, FIG. 8 is a diagram showing the operation of the optical scanning probe of FIG. 1, and FIG.
[0013]
As shown in FIG. 1, a cell culture observation device 1 according to a first embodiment of the present invention, which includes an optical scanning device, includes a culture cassette 2 for detecting fluorescence from cultured cells cultured in the culture cassette 2. And optical scanning probes 3A and 3B incorporating optical scanning means for optically scanning a minute scanning range (observation range) in detail, and positioning and holding these optical scanning probes 3A and 3B. Positioning and holding means 4, an electrically operated XY scanning stage 5 as coarse movement scanning means for two-dimensionally coarsely scanning the optical scanning probes 3A and 3B attached via the positioning and holding means 4, and XY scanning An XY scanning stage driving device 6 that drives the stage 5 and optical scanning probes 3A and 3B are connected to supply light from a light source and to generate fluorescence from return light from the test object side. Detecting units 7A and 7B each provided with a detecting unit for detecting an electric signal and the like, and a personal computer as an image processing unit connected to these detecting units 7A and 7B and performing image processing on the photoelectrically converted electric signal (Hereinafter, abbreviated as PC) 8, a monitor 9 for displaying an optical scanning image formed by the PC 8, and a data holding device 10 for recording (saving) optical scanning image data and the like.
[0014]
The detection unit 7A has an Ar laser 11a, a He-Ne laser 11b, and a semiconductor laser (laser diode) 11c so as to generate a plurality of, for example, three wavelengths of laser light as a light source for excitation. The light is synthesized by the dichroic mirrors (or half mirrors) 12a, 12b, and 12c, is incident on the condenser lens 13, is condensed by the condenser lens 13, and is incident on the optical fiber 14a.
[0015]
A part of the laser light incident on the optical fiber 14a is guided by the optical coupler 15 to the optical fiber 14b, and the light guided to the optical fiber 14b passes through the optical connector 16 and is transmitted to the optical scanning probe 3A. Light incident on the fiber 17a and incident on the optical fiber 17a is transmitted to the distal end side.
[0016]
As shown in FIG. 2, the distal end side of the optical fiber 17a is inserted into the optical scanning probe 3A, and the optical scanning optical system 19 is provided at the distal end side. The light incident on the optical fiber 17a is applied to the filled cultured cells 20 in the culture cassette 2 having the filled transparent windows 2a and 2b whose upper and lower surfaces are parallel through the transparent window 2a. You.
[0017]
As shown in FIG. 3, in the optical scanning optical system 19 provided inside the distal end of the optical scanning probe 3A, the distal end side of the optical fiber 17a is a two-dimensional (for example, XY) scanning scan mirror (also referred to as a scanner) 23 using a micromachine mirror. At the same time, it is fixed to the inner wall of the distal end by the mounting member 18.
[0018]
The light emitted from the microscopic tip surface 24 of the optical fiber 17a is reflected by the movable part of the scanner 23, passes through the condenser lens system 26 attached to the opening on the tip side surface, and passes through this condenser lens. The light is emitted in the direction of the optical axis of the system 26, and is irradiated on the cultured cell 20 side so as to be focused at the focal point 27.
In this case, the movable mirror in the scanner 23 is two-dimensionally tilted, so that the focal point 27 is two-dimensionally scanned (moved) in a direction orthogonal to the optical axis O of the condenser lens system 26.
[0019]
The reflected light from the focal point 27 follows the same path in reverse, and is incident on the distal end face 24 of the optical fiber 17a. In other words, the distal end face 24 and the focal point 27 of the optical fiber 17a have a confocal relation or a relation close thereto (near confocal relation) with respect to the optical scanning optical system 19, that is, the scanner 23 and the condenser lens system 26, and the position near the focal point 27 Is incident on the distal end face 24 of the optical fiber 17a.
[0020]
Note that, in actuality, the fluorescent light emitted from the focal point 27 and the vicinity thereof is mainly detected. Of course, the reflected light component is also detected, and the intensity of the reflected light is detected so that the fluorescence can be detected (by normalization or the like) in a comparable manner, and also used for controlling the optical scanning while maintaining the focus on (or close to) the subject. Like that.
[0021]
Note that an achromatic lens is employed as the condenser lens system 26 in the present embodiment. That is, a plurality of lenses are combined so as to have almost the same focal position with respect to the light of the light source, that is, the light of each wavelength of the Ar laser 11a, the He-Ne laser 11b, and the laser diode 11c and the wavelength of the fluorescence described later. Is formed.
[0022]
The scanner 23 is connected to a scanner driving device 30 (see FIG. 1) in the detection unit 7A via a signal line 28a and a connector 29a, and outputs a driving signal for scanning in the XY directions from the scanner driving device 30. The movable mirror portion of the scanner 23 tilts in the X and Y directions, two-dimensionally scans the focal point 27 focused on the cultured cell 20 side, and obtains information such as the culture state of the cultured cell 20 by the returned light. I can do it.
Hereinafter, the configuration of the scanner 23 will be described with reference to FIGS.
The scanner 23 includes a gimbal mirror 32 serving as a movable mirror and a ground 34 having a concave portion 33.
[0023]
The main body of the gimbal mirror 32 is a silicon plate, and the signal line 28a shown in FIG. 3 is actually formed by drive wires indicated by reference numerals 35a, 35b, 35c, and 35d as shown in FIG. They are connected to the electrodes 36a, 36b, 36c, 36d, respectively. Here, the driving wiring and the electrode also serve as a mirror.
The satin portion 37 in FIG. 4 is an opening, and the central mirror portion is rotatable in the X and Y directions about hinges 38 and 39 as axes.
[0024]
The electrodes 36a, 36b and 36c, 36d are respectively connected to the scanner driving device in the detection unit 7A via a pair (two) of X-direction driving wires 35a, 35b and a pair (two) of Y-direction driving wires 35c, 35d. 30 are electrically connected to each other, and an X drive signal and a Y drive signal are supplied, respectively.
[0025]
Returning to FIG. 1, part of the light incident on the optical fiber 17a is guided to the optical fiber 14c by the optical coupler 15 in the detection unit 7A. The light guided to the optical fiber 14c is emitted from the end face, and is condensed by the condensing lens 41 constituting the light detection unit 40A.
The end of the optical fiber 14d is closed or treated so that reflection from the end is attenuated.
[0026]
The light condensed by the condenser lens 41 is split into, for example, reflected light and transmitted light by a half mirror 42. The transmitted light is detected by a plurality of detecting means for detecting different predetermined wavelengths, and the reflected light is detected by returning light (mainly reflected light) from the cultured cells 20. It is detected by the reflected light detecting means.
[0027]
That is, a dichroic mirror 43a that transmits light of the wavelength λ1 and reflects the other light is disposed opposite the half mirror 42, and the light transmitted through the dichroic mirror 43a is a photomultiplier (abbreviated PMT) 44a. After being photoelectrically converted by optical doubling, the signal is converted from an analog signal to a digital signal by the A / D converter 45a and input to the PC 8.
[0028]
A dichroic mirror 43b that reflects light of the wavelength λ2 and transmits the other light is disposed on the reflection optical path side of the dichroic mirror 43a, and the light reflected by the dichroic mirror 43b is incident on the PMT 44b. After being photoelectrically converted by doubling, the signal is converted into a digital signal by the A / D converter 45b and input to the PC8.
[0029]
A dichroic mirror 43c that reflects light of wavelength λ3 and transmits the other light is disposed on the transmitted light path side of the dichroic mirror 43b. The light reflected by the dichroic mirror 43c is incident on the PMT 44c, After being photoelectrically converted by doubling, the signal is converted into a digital signal by an A / D converter 45c and input to the PC 8.
[0030]
On the other hand, the light reflected by the half mirror 42 is received by a photodetector (abbreviated as PD) 46, photoelectrically converted, and then converted from an analog signal to a digital signal by an A / D converter 45 d and input to the PC 8. You.
[0031]
In the PC 8, the signal intensity of each of the wavelengths λ1 to λ3 detected via the A / D converters 45a to 45c is standardized and detected based on the intensity of the signal (from the PD 46) converted by the A / D converter 45d. I do.
The other optical scanning probe 3B has the same structure as the optical scanning probe 3A, and the detecting unit 7B has the same structure as the detecting unit 7A.
[0032]
As shown in FIG. 5, the probe unit 3 composed of the optical scanning probes 3A and 3B has an X-axis scanning device 52A that scans in the X-axis direction via the positioning and holding means 4 at the rear end, and scans in the Y-axis direction. The optical scanning probes 3A and 3B are moved (scanned) in the X direction and the Y direction by the XY scanning stage 5 as a whole, that is, the entire probe unit 3 by the XY scanning stage 5.
[0033]
Since the scanning range in the X and Y directions by each optical scanning probe 3I (I = A, B) is narrow, the probe unit 3 is moved in the X and Y directions by the XY scanning stage 5 which can be moved over a wide range in order to compensate for this. It moves to cover a predetermined inspection range.
[0034]
FIGS. 6 and 7 show the structure of the fine movement actuator 51A constituting the positioning and holding means 4 provided at the base end (rear end) of the optical scanning probe 3A. FIG. 6 is viewed from the Z direction, and FIG. 5A shows a fine movement actuator 51A as viewed from above.
[0035]
The fine movement actuator 51A is disposed in such a manner that two plate-shaped bimorph piezoelectric elements 61 and 62 for scanning in the Z and X directions are opposed to each other in the Z and X directions in the longitudinal direction of the base end of the optical scanning probe 3A. And in the X direction.
[0036]
Further, a laminated piezoelectric element 63 having a laminated structure for scanning in the Y direction is attached to the rear end of the plate-shaped bimorph piezoelectric element 62 for scanning in the X direction, and is capable of expanding and contracting in the Y direction.
[0037]
The fine movement actuator 51A is connected to, for example, the PC 8 so that the operation of the fine movement actuator 51A can be controlled from the PC 8.
[0038]
Therefore, for example, when a movement operation is input from a keyboard or the like provided in the PC 8, only the input value is applied to the fine actuator 51 A by the plate-like bimorph piezoelectric elements 61 and 62 and the laminated piezoelectric element 63. The base position of the optical scanning probe 3A is moved in the X, Y, and Z directions, so that the positioning position can be finely adjusted three-dimensionally.
[0039]
In the present embodiment, each optical scanning probe 3I (I = A, B) is independently held so as to be finely adjustable in three axial directions by the fine movement actuator 51I. The optical scanning optical system 19 and the cultured cells 20 to be observed can be set to an appropriate state in which optical information can be read by optical scanning.
[0040]
For example, the optical scanning probe 3A is controlled so as to be automatically positioned so that light from each of the optical scanning optical systems 19 incorporated therein substantially focuses on the surface of the subject in the optical axis O direction. The same applies to the other optical scanning probes 3B.
[0041]
In the present embodiment thus configured, after the probe unit 3 is roughly moved in the X and Y directions by the XY scanning stage 5, the tip of the probe unit 3 is moved by the plate-shaped bimorph piezoelectric element 62 and the laminated piezoelectric element 63. 8 is finely moved in the X direction and the Y direction for positioning, and further, as shown in FIG. 8, the plate 27 is positioned in the Z (depth) direction by the plate-like bimorph piezoelectric element 61, and the scanner 23 is scanned in the XY directions. Then, the cultured cells 20 are observed by optical scanning.
[0042]
Therefore, in the present embodiment, the cultured cells can be observed while culturing the cells while maintaining a stable culture environment without moving the culture cassette 2 at all.
[0043]
In the present embodiment, it is possible to trap the cultured cells 20 by irradiating the cultured cells 20 with light, and as shown in FIG. 8, the plate-shaped bimorph piezoelectric element 62 and the laminated piezoelectric element 63 The tip of the probe unit 3 is finely moved in the X and Y directions, and further finely moved in the Z (depth) direction of the focal point 27 by the plate-shaped bimorph piezoelectric element 61, so that the desired cultured cells 20 are optically trapped. The XY scanning stage 5, the plate-shaped bimorph piezoelectric element 61, the plate-shaped bimorph piezoelectric element 62, and the laminated piezoelectric element 63 can function as an optical tweezer for moving the cultured cell 20 to a desired position. It is of course possible to move the cells in the horizontal direction using the scanner 23.
[0044]
In the present embodiment, the cultured cells 20 are observed by optical scanning using the pair of optical scanning probes 3A and 3B. However, the present invention is not limited to this, and a plurality of pairs of optical scanning probes, for example, as shown in FIG. As described above, three pairs of optical scanning probes 3A (1) and 3B (1), optical scanning probes 3A (2) and 3B (2), and optical scanning probes 3A (3) and 3B (3) are used. In the probe units 3 (1) to 3 (3), as described above, after the probe units 3 (1) to 3 (3) are roughly moved in the X and Y directions by the XY scanning stage 5, the plate-like bimorph piezoelectric element The tip of each of the probe units 3 (1) to (3) is finely moved in the X direction and the Y direction by the 62 and the laminated piezoelectric element 63 for positioning. ) Direction Performed Me-decided, the cultured cells 20 are scanned in the XY directions may be observed by optical scanning by the scanner 23.
[0045]
10 to 14 relate to the second embodiment of the present invention, FIG. 10 is a diagram showing an optical scanning probe and a culture cassette, and FIG. 11 is a first diagram showing the operation of the optical scanning probe of FIG. 12 is a second diagram illustrating the operation of the optical scanning probe of FIG. 10, FIG. 13 is a third diagram illustrating the operation of the optical scanning probe of FIG. 10, and FIG. 14 is a fourth diagram illustrating the operation of the optical scanning probe of FIG. FIG.
[0046]
Since the second embodiment is almost the same as the first embodiment, only different points will be described, and the same components will be denoted by the same reference numerals and description thereof will be omitted.
[0047]
In the present embodiment, as shown in FIG. 10, when the culture cells 20 are cultured by arranging the culture cassettes 2 in multiple layers in the Z direction, the culture state of each culture cassette 2 can be observed. It is. Therefore, in the present embodiment, an XYZ scanning stage 5a is provided instead of the XY scanning stage 5, an X-axis scanning device 52A that scans the XYZ scanning stage 5a in the X-axis direction, a Y-axis scanning device 52B that scans in the Y-axis direction, and It comprises a Z-axis scanning device 52C that scans in the Z-axis direction. Other configurations are the same as those of the first embodiment.
[0048]
In the present embodiment, for example, after observing the culture cassette 2 of the layer shown in FIG. 11 with the optical scanning probes 3A and 3B, the observation cassette is moved to the culture cassette 2 of another layer and observation is continued.
[0049]
Specifically, as shown in FIG. 12, the optical scanning probes 3A and 3B are extracted from the area where the culture cassette 2 is arranged by the Y-axis scanning device 52B, and the culture cassette is extracted by the Z-axis scanning device 52C as shown in FIG. Then, the optical scanning probes 3A and 3B are inserted into the region where the culture cassette 2 is arranged by the Y-axis scanning device 52B as shown in FIG. Thereby, the optical scanning probes 3A and 3B are moved to a desired layer, and observation is continued.
[0050]
As described above, in the present embodiment, in addition to the effects of the first embodiment, observation can be performed on the culture cassettes 2 arranged in multiple layers, and even in a culture environment that is easy to handle and has high yield. , The condition of the cells can be monitored.
[0051]
FIG. 15 is a diagram showing a configuration of a main part of an optical scanning device according to the third embodiment of the present invention.
[0052]
In the first embodiment, an excitation light source is prepared for each of the plurality of optical scanning probes. However, in the optical scanning device 1B of the present embodiment, as shown in FIG. It is configured to use only the light source.
[0053]
That is, the light of one set of excitation light sources 70 is incident on the optical fiber 71a by the condenser lens 13, and the light is guided to the optical fibers 71b and 71c by the optical coupler 72a. One set of excitation light sources 70 includes the Ar laser 11a, the He-He laser 11b, the laser diode 11c, the dichroic mirrors 12a, 12b, 12c, and the condenser lens 13 shown in FIG.
[0054]
The light guided to the optical fiber 71b is guided to the optical fibers 71d and 71e by the optical coupler 72b. Further, the light guided to the optical fiber 71c is also guided to the two optical fibers 71f and 71g by the optical coupler 72c.
[0055]
The light guided to the optical fiber 71d is guided to the optical fibers 71h and 71i by the optical coupler 72d, respectively, and the light guided to the optical fiber 71h passes through the optical connector 16a to the optical fiber 17a of the optical scanning probe 3A. Light is guided. The end of the optical fiber 17i is closed.
[0056]
Similarly, the light guided to the optical fiber 71e is guided to the optical fibers 71j and 71k by the optical coupler 72e, and the light guided to the optical fiber 71j is transmitted to the optical scanning probe 3B via the optical connector 16b. Is guided to the optical fiber 17b. The end of the optical fiber 17k is closed.
[0057]
The light guided to the optical fiber 71f is guided by the optical coupler 72f to the optical fibers 71l and 71m, respectively, and the light guided to the optical fiber 71l passes through the optical connector 16c and is connected to the optical fiber of the optical scanning probe 3C. The light is guided to 17c. The end of the optical fiber 17m is closed.
Similarly, the light side guided to the optical fiber 71g has the same configuration.
[0058]
The return light from the subject side by the optical scanning probe 3A is incident on the optical coupler 72d via the optical fiber 71h, a part of which is guided to the optical fiber 71o, and is incident on the photodetector 40A.
The return light from the subject side by the optical scanning probe 3B is incident on the optical coupler 72e via the optical fiber 71j, and a part thereof is guided to the optical fiber 71p and is incident on the photodetector 40B.
[0059]
The return light from the subject side by the optical scanning probe 3C enters the optical coupler 72f via the optical fiber 71l, a part of which is guided to the optical fiber 71q, and enters the photodetector 40C.
Each of the optical scanning probes 3A, 3B, 3C,... Has a signal line 28i extending therefrom and connected to the scanner driving device 30, but is omitted in FIG. 10 for simplicity.
[0060]
Other configurations are the same as those of the first embodiment. The operation (operation) according to the present embodiment is almost the same as that of the first embodiment except that the light source 70 is shared.
According to the present embodiment, the cost can be reduced because only one set of the light sources 70 is required.
[0061]
16 to 18 relate to the fourth embodiment of the present invention, FIG. 16 is a diagram showing a configuration of a light detection probe, and FIG. 17 is a diagram showing a configuration of a first modification of the light detection probe of FIG. FIG. 18 is a diagram showing a configuration of a second modification of the light detection probe of FIG.
[0062]
The present embodiment is an embodiment in which the cultured cells 20 are observed with an optical microscope instead of observing the cultured cells 20 by performing the above-described optical scanning.
[0063]
Therefore, in the present embodiment, as shown in FIG. 16, for example, a light irradiation probe 103B for irradiating the cultured cells 20 with illumination light from the lower end surface of the culture cassette 2 and observation from the cultured cells 20 irradiated with illumination light And a light detection probe 103A for receiving light.
[0064]
The light irradiation probe 103B has an LED 110 serving as a light source at the tip, and irradiates the cultured cells 20 with illumination light from the LED 110 via a mirror 111 and a lens 112.
[0065]
Further, the light detection probe 103A captures an image of the cultured cells 20 by an imaging device 116 having a CCD 115 via a lens 113 and a mirror 114.
[0066]
Note that the LED 110 and the imaging device 116 are connected to a camera control unit (not shown) so that light emission control and image signal processing are performed, and an observation image of the cultured cells 20 can be displayed on a monitor (not shown).
[0067]
Thus, in the present embodiment, the cultured cells 20 can be observed with an optical microscope.
[0068]
It is also possible to observe the cultured cells 20 under an optical microscope with a single optical probe. As shown in FIG. 17, an objective lens 213 is provided on the tip side surface, and a ring-shaped LED 211 is formed around the objective lens 213. And the observation of the cultured cells 20 by an optical microscope using an optical probe 203A having an imaging device 214 having a CCD 210 for imaging the observation light from the objective lens 213 via a mirror 212 inside. Good.
[0069]
In the optical probe 203A having the configuration shown in FIG. 17, the cultured cells 20 are illuminated by emitting the LED 211, and the returned light is observed by the imaging device 214. The imaging device 214 is provided with, for example, an infrared cut filter 215.
[0070]
As a modified example of observing the cultured cells 20 under an optical microscope with one optical probe, as shown in FIG. 18, an objective lens 213 is provided on the tip side surface, and an LED 211 and a dichroic mirror (or half mirror) 216 are provided inside. The cultured cells 20 may be observed with an optical microscope using the optical probe 303A including the imaging device 214.
[0071]
17 and 18, the cultured cells 20 may be dyed with a fluorescent dye so that the excitation light is emitted from the LED 211 and the fluorescence from the cultured cells 20 is observed. In this case, the imaging device 214 Is provided with an excitation light cut filter instead of the infrared cut filter.
[0072]
[Appendix]
(Additional Item 1) The observation probe is an elongated rod provided substantially parallel to the transparent window, and is configured such that the high-magnification observation means is provided in a part thereof.
The cultured cell observation device according to claim 1, wherein:
[0073]
(Additional Item 2) There is an orthogonal direction moving means for moving the high-magnification observation means in a direction orthogonal to a moving plane of the moving means means.
Item 2. The cultured cell observation device according to additional item 1, wherein
[0074]
(Additional Item 3) The moving means comprises a coarse moving means and a fine moving means, and the observation probe can be moved between a plurality of cell culture vessels by the coarse moving means and the orthogonal direction moving means.
Item 3. The cultured cell observation device according to additional item 2, characterized in that:
[0075]
(Additional Item 4) The transparent window is provided to face the cell culture vessel, and the observation probe is arranged at a position observable from each observation surface of the transparent window.
The cultured cell observation device according to claim 1, wherein:
[0076]
(Additional Item 5) The position in the depth direction of observation by the high-magnification observation means substantially coincides with the position of the transparent window inside the cell culture container.
The cultured cell observation device according to claim 1, wherein:
[0077]
(Additional Item 6) The moving means has a distance varying means for varying a distance between the transparent window and the high magnification observation means.
The cultured cell observation device according to claim 1, wherein:
[0078]
(Additional Item 7) The distance varying means controls the position of the high-magnification observation means in the observation depth direction so as to substantially coincide with the position of the transparent window inside the cell culture container.
Item 7. The cultured cell observation device according to additional item 6, characterized in that:
[0079]
(Additional Item 8) An automatic positioning means for driving the light scanning means at a position where the reflected light from the sample in the cell culture container is maximized.
Item 8. The cultured cell observation device according to additional item 7, characterized in that:
[0080]
(Additional Item 9) A plurality of the observation probes are provided.
The cultured cell observation device according to claim 1, wherein:
[0081]
(Additional Item 10) The plurality of observation probes have independent automatic positioning means having at least one degree of freedom.
Item 10. The cultured cell observation device according to Item 9, wherein
[0082]
(Additional Item 11) A plurality of the observation probes observe a single transparent window.
Item 10. The cultured cell observation device according to Item 9, wherein
[0083]
(Additional Item 12) The plurality of observation probes observe independent transparent windows respectively.
Item 10. The cultured cell observation device according to Item 9, wherein
[0084]
(Additional Item 13) A coarse movement positioning means for simultaneously changing the positions of the plurality of observation probes on the transparent window is provided.
Item 10. The cultured cell observation device according to Item 9, wherein
[0085]
(Additional Item 14) The high-magnification observation means is:
A light source,
Light collecting means for condensing and emitting light from the light source to a test portion,
An optical scanning unit that two-dimensionally scans a focal point focused on the object side by the focusing unit in a direction orthogonal to an optical axis direction of the focusing unit;
Having a light detecting means for detecting return light from the test portion
The cultured cell observation device according to claim 1, wherein:
[0086]
(Additional Item 15) The light scanning means has a micromachine mirror
Item 15. The cultured cell observation device according to additional item 14, wherein:
[0087]
(Additional Item 16) An optical fiber for guiding light from the light source to the light collecting means,
Separating means for separating the return light from the test portion from the optical path from the light source,
Having the light detection means for detecting the light separated by the separation means,
The optical fiber and the light condensing unit are confocal or near confocal
Item 15. The cultured cell observation device according to additional item 14, wherein:
[0088]
(Additional Item 17) The optical fiber that guided the light source light is branched by an optical coupler and guided to a plurality of optical scanning units.
Item 18. The cultured cell observation device according to additional item 16, wherein:
[0089]
(Additional Item 18) A plurality of wavelength selecting means for dividing return light from the subject by wavelength and a plurality of light detecting means are provided.
Item 15. The cultured cell observation device according to additional item 14, wherein:
[0090]
(Additional Item 19) A reflected light detecting means for directly detecting a part of the return light is provided.
Item 19. The cultured cell observation device according to additional item 18, characterized in that:
[0091]
(Supplementary Note 20) The high-magnification observation unit has a high-magnification optical system, a two-dimensional imaging unit, and a light source.
The cultured cell observation device according to claim 1, wherein:
[0092]
(Additional Item 21) The light source is an LED
21. The cultured cell observation device according to claim 20, wherein
[0093]
(Additional Item 22) The light of the light source is guided by an optical fiber.
21. The cultured cell observation device according to claim 20, wherein
[0094]
(Additional Item 23) Filter means for cutting the wavelength of the light source light is provided between the imaging means and the object to be observed.
21. The cultured cell observation device according to claim 20, wherein
[0095]
(Additional Item 24) The filter means is a dichroic mirror provided between the objective lens and the imaging means.
Item 24. The cultured cell observation device according to Item 23, wherein
[0096]
The present invention is not limited to the above-described embodiment, and various changes and modifications can be made without departing from the spirit of the present invention.
[0097]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, there is an effect that the cultured cells can be observed while culturing the cells without moving the culture apparatus.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a configuration diagram showing a configuration of a cell culture observation device according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing an optical scanning probe and a culture cassette of FIG. 1;
FIG. 3 is a diagram showing a configuration of an optical scanning optical system on the distal end side of the optical scanning probe of FIG. 1;
FIG. 4 is a diagram showing a configuration of a scanner in FIG. 3;
FIG. 5 is a view showing a coarse actuator for positioning and holding the optical scanning probe of FIG. 1;
FIG. 6 is a first diagram showing a configuration of a fine movement actuator provided near a base end of the optical scanning probe of FIG. 1;
FIG. 7 is a second diagram showing the configuration of the fine movement actuator provided near the base end of the optical scanning probe of FIG. 1;
FIG. 8 is a view showing the operation of the optical scanning probe of FIG. 1;
FIG. 9 is a diagram showing a modification of the cell culture observation device of FIG. 1;
FIG. 10 is a diagram showing an optical scanning probe and a culture cassette according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a first view showing the operation of the optical scanning probe of FIG. 10;
FIG. 12 is a second diagram illustrating the operation of the optical scanning probe of FIG. 10;
FIG. 13 is a third diagram showing the operation of the optical scanning probe of FIG. 10;
FIG. 14 is a fourth diagram illustrating the operation of the optical scanning probe of FIG. 10;
FIG. 15 is a diagram showing a configuration of a main part of an optical scanning device according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 16 is a diagram showing a configuration of a light detection probe according to a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 17 is a diagram showing a configuration of a first modified example of the light detection probe of FIG. 16;
FIG. 18 is a diagram showing a configuration of a second modified example of the light detection probe of FIG.
[Explanation of symbols]
1. Optical scanning device
2. Culture cassette
3. Probe unit
3A, 3B ... Optical scanning probe
4 positioning means
5 XY scanning stage
6. XY scanning stage driving device
7A, 7B ... Detection unit
8 ... PC
9 Monitor
10. Data holding device
11a ... Ar laser
12a-12c ... Dichroic mirror
14a-14d: Optical fiber
17a ... Optical fiber
19 ... Optical scanning optical system
20 ... cultured cells
23 ... Scanner (scan mirror)
27 ... Focus
30 ... Scanner driving device
40 ... light detection unit
42 ... Half mirror
43a-43c ... Dichroic mirror
44a-44c ... PMT
45a-45d ... A / D converter
46 Photodetector (PD)
