JP2004144839A - Optical scanning device - Google Patents

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JP2004144839A
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Akihiro Horii
堀井 章弘
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an optical scanning device which can read fluorescent information from DNA samples or the like arranged in the form of an array at a high speed by suppressing an unevenness of detection characteristics. <P>SOLUTION: A plurality of optical scanning probes 3A, 3B and 3C incorporating an optical scanning optical system including a condenser lens in an edge part are held with a positioning holding means 4 on an XY scanning stage 5 in order to optically scan a number of sample spots which are specimens arranged in DNA array arranged on a slide glass 2. The positioning means 4 is formed of a voice coil motor roughly movable on an optical axis direction of the condenser lens system and a motion motion actuator minutely movable in a three-axis direction of each optical scanning probe. The fluorescent information can be obtained by performing positioning control maintaining a state for substantially focusing light by each optical scanning probe on the surface of the specimen, and suppressing the unevenness of the detection characteristics. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は複数の試料スポット、特に微少遺伝子スポットまたはマイクロバイオスポットからの蛍光を検出するための光走査装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、急速な遺伝子研究の発展に伴って、大量の遺伝子発現解析を短時間で実現する手段としてDNAマクロアレイ技術が登場した。
このDNAマイクロアレイは、第1の従来例としての特開2002−9639号公報中の図9に示すようにスライドグラスなどの基板1上に、遺伝子DNAを含む溶液を数nlずつ滴下し、直径数10〜100μm程度のしみ状のスポット2を形成し、このスポットを1枚の基板1上に数千〜数万点、規則正しく配列したものである。
【0003】
このようなDNAマイクロアレイ3に、検体であるRNAを蛍光で標識した後に振りかけ、洗浄し、各スポット2にレーザ光を照射して生じる蛍光を測定することで、その蛍光強度により遺伝子発現を解析することができる。
【0004】
この遺伝子発現解析での蛍光測定に使用されるのがDNAマイクロアレイリーダと呼ばれる走査型光学測定装置である。この走査型光学測定装置の構成は、一般的な共焦点レーザ顕微鏡と類似しており、レーザ光源から出射されたレーザ光を対物レンズを通してDNAマクロアレイ3上に照射し、このレーザ光の照射によって発生した蛍光を共焦点ピンホールを通して光電子倍増管(PMT)などの光電変換素子に導き、この光電変換素子により蛍光強度を電気信号に変換している。
【0005】
このときDNAマイクロアレイ3は、電動走査ステージ上に載置され、XY方向に移動される。従って、レーザ光源から出射されたレーザー光は、DNAマイクロアレイ3をXY方向に走査され、このときの光電変換素子から出力される電気信号がコンピュータなどからなる画像処理装置に送られる。この画像処理装置は、光電変換素子からの電気信号をA/D変換し、走査画像データとして取得する。
【0006】
この種の他の従来例として、特開2001−108684号公報がある。この第2の従来例ではDNAアレイを高速検出するために、マルチスポットアレイ光を用いている。
【0007】
また、第3の従来例としての特開2001−242081号公報ではDNAアレイ読み取り装置を小型化するために、CDピックアップまたは光導波路構成のピックアップの構成を用いている。
また、第4の従来例としての特開2001−238674号公報では高速で読み取るために、CD状のDNAアレイを構成している。
【0008】
【特許文献1】
特開2002−9639号公報
【0009】
【特許文献2】
特開2001−108684号公報
【0010】
【特許文献3】
特開2001−242081号公報
【0011】
【特許文献4】
特開2001−238674号公報
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
第1の従来例では単一のレーザを走査する構成であるので、高速に読み取ることができない欠点がある。
また、第2の従来例ではマルチスポットアレイ光を用いているために高速化できているが、複数のスポットが同一の光学系を用いて生成されるために、全てのスポットが正確に検体上に載るようにアライメントできないと、検出性能が大幅にばらつくことになる。また、広範囲を同時に取られるような光学系では、色収差等の収差を取りきることが困難で、位置によって性能が劣化しがちとなる。
【0013】
一般的に高さがミクロレベル以上で異なる複数の試料に対応できない。同じスライド上の試料に限られる制約がある。
【0014】
第3の従来例ではその公報中における図5で複数の光導波路を用いて複数の走査を同時にするものが示されているが、同一の基板上にあるため、全てのスポットが正確に検体上に載るようにアライメントできないと、検出性能が大幅にばらつくことになる。また、一般的に高さがミクロンレベル以上で異なる複数の試料に対応できない。同じスライド上の試料に限られる制約がある。
第4の従来例ではCDのピット状に螺旋状に高精度で試料アレイを配列をするためには特殊な装置が必要となる欠点があり、一般的なマトリックス状のDNAアレイは使用不可能になってしまう欠点がある。
【0015】
(発明の目的)
本発明は、上述した点に鑑みてなされたもので、DNA、プロテオーム、抗体、細胞等のアレイの蛍光情報を検出特性のばらつきを抑制して高速に読み取ることができる光走査装置を提供することを目的とする。
【0016】
【課題を解決するための手段】
複数の試料スポット、特に微少遺伝子スポットまたはマイクロバイオスポットからの蛍光を検出するための光走査装置であって、
前記試料スポットが基材上に配置され、
光源と、
光源からの光を被検部に対し集光出射する集光手段と、
前記集光手段によって被検部側に集光された焦点を該集光手段の光軸方向と直交する方向に2次元的に走査する光走査手段と、
前記光走査手段を複数有すると共に、
前記被検部からの戻り光を検出する光検出手段を有し、
前記光走査手段を少なくとも1自由度の自動位置決めを行う自動位置決め手段を有することにより、光走査手段を集光手段の光軸方向等に自動位置決めして試料スポットを高速に光走査して、試料スポットからの蛍光情報を検出特性のばらつきを抑制して、読み出すことができるようにしている。
【0017】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
(第1の実施の形態)
図1ないし図10は本発明の第1の実施の形態に係り、図1は第1の実施の形態の光走査装置の全体構成を示し、図2は光走査プローブの先端側の光走査光学系の構成を示し、図3は図2におけるスキャナの構成を示し、図4はプローブユニットを位置決め保持する粗動アクチュエータを示し、図5は光走査プローブの基端付近に設けた微動アクチュエータの構成を示し、図6はDNAアレイ上に配列された試料スポットによりその走査方法の様子を示し、図7は実際に光走査を行う前の3次元位置の位置決めのプロセス例を示し、図8は各光走査プローブによりそれぞれ異なるDNAアレイを走査する場合を示し、図9は図8の場合におけるDNAアレイ上に配列された試料スポットによりその走査方法の様子を示し、図10は2次元的に光走査プローブを位置決め保持して光走査を行う場合の主要部の構成を示す。
【0018】
図1に示すように本発明の第1の実施の形態の光走査装置1は、例えばスライドガラス2上の基材、後述する例えばDNAアレイ55上に配置される微少遺伝子スポット(以下、試料スポット)からの蛍光を検出するために複数配置され、微小な走査範囲(観察範囲)を詳細に光走査する光走査手段を内蔵した光走査プローブ3A、3B、3Cと、これらの光走査プローブ3A、3B、3Cを位置決め保持する位置決め保持手段4と、この位置決め保持手段4を介して取り付けられた光走査プローブ3A、3B、3Cを2次元的に粗動走査する粗動走査手段としての電動式のXY走査ステージ5と、このXY走査ステージ5を駆動するXY走査ステージ駆動装置6と、光走査プローブ3A、3B、3Cにそれぞれ接続され、光源からの光を供給すると共に、検査体側からの戻り光における蛍光成分等を検出するための検出手段をそれぞれ備えた検出ユニット7A、7B、7Cと、これら検出ユニット7A、7B、7Cと接続され、光電変換された電気信号に対して画像処理を行う画像処理手段としての例えばパーソナルコンピュータ(以下、PCと略記)8と、このPC8により画像化された光走査画像を表示するモニタ9と、光走査画像データ等を記録(保存)するデータ保持装置10とを有する。
【0019】
この光走査装置1は、例えば図4及び図5等に示すDNAアレイ55に対する蛍光情報を読み取る。この場合、2蛍光標識法を採用する。その原理は2つの異なったmRNAサンプル中での遺伝子発現の差を検出するもので、それぞれ異なる蛍光色素で標識し、DNAアレイ55上で競合的ハイブリダイゼーション(増幅)を行い、両方の蛍光を検出し、比較するものである。この場合、一般には1つ又はそれ以上の励起光を使用し、それぞれの蛍光色素の蛍光波長に対応した検出器を用いて蛍光量の比較を行う。
【0020】
このような検出動作を行うことができるように、検出ユニット7Aは、励起用の光源として複数、例えば3つの波長のレーザ光を発生できるようにArレーザ11a、He−Neレーザ11b、半導体レーザ(レーザダイオード)11cを有し、これらのレーザ光はダイクロイックミラー(或いはハーブミラー)12a、12b、12cにより合成されて集光レンズ13に入射され、この集光レンズ13で集光されて光ファイバ14aに入射される。
【0021】
光ファイバ14aに入射されたレーザ光は光カプラ15によりその一部が光ファイバ14bに導光され、この光ファイバ14bに導光された光は光コネクタ16を経て、光走査プローブ3A側の光ファイバ17aに入射される。
【0022】
この光ファイバ17aに入射された光は、その先端側に伝送される。光ファイバ17aの先端側は光走査プローブ3A内に挿通されており、その先端側には光走査光学系19が設けてある。この構成を図2に示す。
【0023】
図2に示すように光走査プローブ3Aは硬質のシース20の先端に先端部21を構成する硬質の先端枠体22が接続され、この先端枠体22内には光ファイバ17aの先端側がマイクロマシンミラーによる2次元(例えばXY)走査用スキャンミラー(スキャナともいう)23と共に、取付部材18により先端枠体22内壁に固定されている。
【0024】
そして、この光ファイバ17aの微小サイズの先端面24から出射された光は、先端枠体22の内壁面に固定された固定ミラー25で反射され、スキャナ23の可動部でさらに反射されて、対向配置され、先端枠体22の開口に取り付けられた集光レンズ系26を経て、この集光レンズ系26の光軸Oの方向に出射され、その際焦点27で集光するようにして被検体側に照射される。
この場合、スキャナ23における可動ミラーが2次元的に傾動されることにより、焦点27は光軸Oと直交する方向に2次元的に走査(移動)される。
【0025】
この焦点27からの反射光は同一の経路を逆にたどり、光ファイバ17aの先端面24に入射される。つまり、光ファイバ17aの先端面24と焦点27とは光走査光学系19、つまり固定ミラー25,スキャナ23,集光レンズ系26に関して共焦点関係ないしはこれに近い関係(近共焦点関係)となり、焦点27近傍位置の光のみが光ファイバ17aの先端面24に入射される。
【0026】
なお、実際には、焦点27及びその近傍から発光された蛍光を主に検出する。尤も、反射光成分も検出し、その強度から蛍光検出を(規格化などして)比較可能に行うと共に、被検体にフォーカス(ないしはそれに近い)状態に維持して光走査を行う制御にも用いるようにしている。
【0027】
なお、本実施の形態における集光レンズ系26として色消しレンズが採用されている。つまり、上記光源の光、つまりArレーザ11a、He−Neレーザ11b、レーザダイオード11cの各波長の光及び後述する蛍光の波長に対して殆ど同一の焦点位置となるように複数のレンズを組み合わせて形成されている。
【0028】
スキャナ23は信号線28aを介し、さらにコネクタ29aを経て検出ユニット7A内部のスキャナ駆動装置30と接続され、このスキャナ駆動装置30からXY方向に走査する駆動信号を出力することにより、スキャナ23の可動ミラー部分はXY方向に傾動し、被検体側に集光される焦点27を2次元的に走査し、その戻り光により被検体の遺伝子発現の解析などをする情報を得ることができるようにしている。
以下スキャナ23の構成を図2及び図3を参照して説明する。
スキャナ23は、可動ミラーとなるジンバルミラー32と、くぼみ部33を有するグランド34によって構成されている。
【0029】
ジンバルミラー32の本体はシリコンのプレートであり、図2で示した信号線28aは実際には図3に示すように35a、35b、35c、35dからなる駆動用配線で形成され、それぞれ電極36a、36b、36c、36dに接続される。ここで、駆動用配線及び電極はミラーの役割も兼ねる。
図3中の梨地部37は開口部であり、ヒンジ部38、39を軸として中央のミラー部がX方向、Y方向に回動自在である。
【0030】
電極36a、36bと36c、36dは、それぞれ一対(2本)のX方向駆動配線35a、35bと一対(2本)のY方向駆動配線35c、35dを介して、検出ユニット7A内のスキャナ駆動装置30と電気的に接続され、それぞれX駆動信号及びY駆動信号が供給されることになる。
【0031】
上記光ファイバ17aに入射された光は検出ユニット7A内の光カプラ15でその一部が光ファイバ14c側に導光される。この光ファイバ14cに導光された光はその端面から出射され、光検出部40Aを構成する集光レンズ41により集光される。
なお、光ファイバ14dの端部は閉鎖或いはその端部からの反射が減衰するように処理されている。
【0032】
集光レンズ41により集光された光は、例えばハーフミラー42で反射光と透過光とに分割される。そして、透過光に対しては、それぞれ異なる所定の波長を検出するための複数の検出手段で検出され、反射光に対しては、被検体からの戻り光(主に反射光)を検出する反射光検出手段で検出される。
【0033】
つまり、ハーフミラー42に対向して、波長λ1の光を透過し、それ以外を反射するダイクロイックミラー43aが配置されており、このダイクロイックミラー43aを透過した光はフォトマルチプライヤ(PMTと略記)44aに入射され、光倍増で光電変換された後、A/Dコンバータ45aでアナログ信号からデジタル信号に変換されて、PC8に入力される。
【0034】
また、ダイクロイックミラー43aの反射光路側には、波長λ2の光を反射し、それ以外を透過するダイクロイックミラー43bが配置されており、このダイクロイックミラー43bで反射された光はPMT44bに入射され、光倍増で光電変換された後、A/Dコンバータ45bでデジタル信号に変換されて、PC8に入力される。
【0035】
また、ダイクロイックミラー43bの透過光路側には、波長λ3の光を反射し、それ以外を透過するダイクロイックミラー43cが配置されており、このダイクロイックミラー43cで反射された光はPMT44cに入射され、光倍増で光電変換された後、A/Dコンバータ45cでデジタル信号に変換されて、PC8に入力される。
【0036】
一方、ハーフミラー42で反射された光は光検出器(PDと略記)46で受光され、光電変換された後、A/Dコンバータ45dでアナログ信号からデジタル信号に変換されて、PC8に入力される。
【0037】
PC8では、A/Dコンバータ45dで変換された(光検出器46からの)信号の強度により、A/Dコンバータ45a〜45cを介して検出される各波長λ1〜λ3の信号強度を規格化等して検出する。
なお、他の光走査プローブ3B及び3Cも光走査プローブ3Aと同じ構造であり、また検出ユニット7B及び7Cも検出ユニット7Aと同じ構造である。
【0038】
上記光走査プローブ3A、3B及び3Cからなるプローブユニット3は図4に示すように、その後端が位置決め保持手段4を介してXY走査ステージ5に取り付けられており、このXY走査ステージ5により光走査プローブ3A、3B及び3C全体、即ちプローブユニット3毎、X方向及びY方向に移動(走査)される。
【0039】
後述するように、各光走査プローブ3I(I=A,B,C)によるX及びY方向の走査範囲は狭いので、それを補うために広範囲に移動できるXY走査ステージ5によりプローブユニット3をX方向及びY方向に移動し、所定の検査範囲をカバーできるようにしている。
【0040】
この場合、各光走査プローブ3Iは、その基端付近がそれぞれ微動位置決め手段としての微動アクチュエータ51I(図4では51Aのみ示している)が形成され、その微動アクチュエータ51Iの基端がさらに一体化されたZ方向の粗動位置決め手段としての例えばボイスコイルモータ52を介してXY走査ステージ5の例えばYステーズ部5bに取り付けられている。
【0041】
このYステージ部5bは、ガイド棒53に沿ってX方向に移動自在のXステージ部5aにおける底面に保持され、Yステージ部5bはXステージ部5aにおける底面に設けられた図示しないガイド溝に嵌合し、Y方向に移動自在に保持されている。
これらXステージ部5a及びYステージ部5bは図示しないモータにより、それぞれX方向及びY方向に移動される。また、各モータは図1のXY走査ステージ駆動装置6からの駆動信号で駆動される。
【0042】
プローブユニット3に対向して、配置されるスライドガラス2上には、検査体を形成した基材としての例えばDNAアレイ55が配置され、このDNAアレイ55における全ての試料スポット65(図6参照)にXY走査ステージ5による2次元(XY)粗移動走査と、プローブユニット3による2次元(XY)光走査との組合わせで励起光を照射し、その際の蛍光検出を行うことができるようにしている。
【0043】
なお、図4では各光走査プローブ3Iによる走査で観察可能となる観察範囲57i(i=a〜c)を模式的に示している。
各光走査プローブ3Iにより試料スポット65を光走査する場合、その試料スポット65に照射される光をその試料面に焦点が形成されるフォーカス状態に近い状態に保持することが必要となり、そのために本実施の形態では上述のように微動アクチュエータ51I及びボイスコイルモータ52による位置決め保持手段4が設けてある。
【0044】
この場合、(光走査光学系19を形成する集光レンズ系26の)光軸方向となるZ軸方向の概略の位置決めは共通のボイスコイルモータ52により光走査プローブ3A〜3C全体に対して行い、個々の光走査プローブ3A〜3CのZ方向の正確な位置決めは微動アクチュエータ51A〜51Cでそれぞれ独立して行えるようにして、高精度の位置決めができるようになっている。
【0045】
図5は光走査プローブ3Aの基端(後端)に設けた微動アクチュエータ51Aの構造を示し、図5(A)はY方向から見た場合、図5(B)はX方向から見た場合の微動アクチュエータ51Aを示す。なお、他の微動アクチュエータ51B、51Cは微動アクチュエータ51Aと同じ構成である。
【0046】
この微動アクチュエータ51Aは、光走査プローブ3Aの基端の長手方向にY及びX方向走査用の板状バイモルフ圧電素子61及び62がそれぞれY及びX方向に対向するように2枚配置され、それぞれY及びX方向に変位可能にしている。
【0047】
また、X方向走査用の板状バイモルフ圧電素子62の後端にはZ方向走査用の積層構造の積層化圧電素子63が取り付けてあり、Z方向に伸縮変位自在にしている。この積層化圧電素子63の後端はボイスコイルモータ52の可動部、例えば永久磁石に取り付けられ、この永久磁石の周囲の固定部となるボイスコイルはYステージ部5bに取り付けられている。
【0048】
このボイスコイルモータ52及び微動アクチュエータ51Aは、例えばPC8に接続され、PC8からボイスコイルモータ52及び微動アクチュエータ51Aの動作を制御できるようにしている。
【0049】
例えばPC8に設けられたキーボード等から移動操作の入力を行うことにより、その入力された値だけ、ボイスコイルモータ52によるZ方向の保持位置を移動調整したり、微動アクチュエータ51Aに対しても光走査プローブ3Aの基端位置をX、Y、Z方向に移動し、位置決め位置を3次元的に微調整ができるようにしている。
【0050】
さらに、PC8は光検出器46による出力信号から輝度レベルが最大となる状態に積層化圧電素子63の保持位置を調整する。
例えば、図4に示すように光走査プローブ3A〜3Cを取り付け、PC8はスライドガラス2上に配置されたDNAアレイ55における適宜の代表点で微動アクチュエータ51Aの積層化圧電素子63をZ方向に変位させるように駆動信号を印加し、その際に光検出器46による出力信号からその輝度レベル(つまり反射光成分)を検出し、その輝度レベルが最も高くなる位置の駆動信号の振幅値を内部の記憶手段等に保持する。
【0051】
そして、実際にDNAアレイ55を光走査する場合には、代表点での記憶情報(つまり駆動信号の振幅値)を補間する等して積層化圧電素子63のZ方向の保持位置を制御し、ほぼフォーカス状態でDNAアレイ55を光走査を維持できるようにしている。
【0052】
また、本実施の形態では、各光走査プローブ3Iをそれぞれ独立して、微動アクチュエータ51Iで3軸方向に微調整可能に保持しているので、各光走査プローブ3Iの先端側の光走査光学系19と観察対象となるDNAアレイ55とを光走査により光学情報を読みとれるような適切な状態に設定できるようにしている。
【0053】
例えば、光走査プローブ3Aはそれに内蔵された各光走査光学系19による光がその光軸O方向で被検体の表面で殆どフォーカスするように自動的に位置決めするように制御される。他の光走査プローブ3B、3Cでも同様である。
【0054】
図6はDNAアレイ55に形成された試料スポット65の2次元的な配列を示し、これらの試料スポット65は、例えば太い実線で示す観察範囲57aは光走査プローブ3Aで、観察範囲57bは光走査プローブ3Aに隣接する光走査プローブ3Bで読み取られる。
また、この観察範囲57bの右側に隣接する図示しない観察範囲(57cとする)は光走査プローブ3Cで読み取られるようになる。
【0055】
そして、観察範囲57a、57b、57cが3つの光走査プローブ3A〜3Cでそれぞれ読み取られる。その後、XY走査ステージ5により、光走査プローブ3A〜3C全体が例えば縦方向(図6の例えば下側)に少し移動、例えば矢印で示す移動量Y1だけ移動されて同様に3つの光走査プローブ3A〜3Cでそれぞれの観察範囲が読み取られる。図6では光プローブ3Aが移動量Y1だけ移動されることにより観察範囲57aも移動し符号57a′となることを点線で示している。
【0056】
このようにして縦方向に少しづつ移動され縦方向における試料スポット65全体が読み取られると、XY走査ステージ5により、初期位置まで戻された後、光走査プローブ3A〜3C全体が横(水平)方向に少し移動、例えば矢印で示す移動量X1だけ移動されて同様に3つの光走査プローブ3A〜3Cでそれぞれ観察範囲が読み取られ、その後、下向に少し移動されて3つの光走査プローブ3A〜3Cでそれぞれ観察範囲が読み取られる。このようにしてにして、3つの光走査プローブ3A〜3Cにより全ての試料スポット65が光走査される。
【0057】
この場合、観察範囲57i内の各試料スポット65からの戻り光は検出ユニット7I内に導光され、光検出器46と、PMT44a〜44cで受光される。PMT44a〜44cの前にはそれぞれ波長λ1〜λ3の各波長成分のみが入射されるように選択的波長分離手段(となるダイクロイックミラー43a〜43c)で分離抽出できるようにしているので、所望とする蛍光を検出することができる。
【0058】
PMT44a〜44cで光電変換されると共に倍増された信号はA/D変換されてPC8に入力され、光検出器46で光電変換され、A/D変換された信号との比から、検出されて蛍光強度が規格化等されて検出される。
【0059】
そして、検出された蛍光強度のデータはPC8内のハードディスク等の記憶装置に保存されると共に、メモリに格納され、適宜のデータ量をモニタ9で表示したり、データ保持装置10に保持(保存)することもできるようにしている。
【0060】
なお、図6に示すように観察範囲57aと57a′とは周辺部の一部が重なるように移動量Y1を設定しているので、粗動の際の小さなバラツキをカバーすることができる。また、水平方向の移動量X1でも同様である。
【0061】
また、水平方向において、一部を重なるようにすることにより、隣接する光走査プローブ3Aと3B、3Bと3Cとで同じ部分の蛍光検出を行うので、それらの特性のばらつきを補正することもできる。つまり、隣接する光走査プローブ3Aと3B、3Bと3Cとでその検出ユニット7Iを含めた特性のばらつきを補正し、特性のばらつきを補正した高精度の検出を行うこともできる。
上述により本実施の構成と共に動作も説明したが、図7を参照して本実施の形態の位置決めの動作を説明する。
【0062】
最初にステップS1に示すようにプローブユニット3の後端側を位置決め保持手段4を介してXY走査ステージ5に取り付ける。
また、ステップS2に示すように被検体側をセットする。具体的には、スライドガラス2にDNAアレイ55をセットする。
【0063】
そして、次のステップS3として、プローブユニット3を取り付けたXY走査ステージ5と被検体側との3次元的な位置決め調整を行う。この位置決め調整としては、例えばマニュアルで被検体に対してプローブユニット3の先端面の3次元位置を所定の位置付近に設定する。例えば図6において、光走査プローブ3Aが光走査する初期位置(図6でP0で示す)付近に設定すると共に、この位置P0に焦点が合うフォーカス状態となるような距離付近に設定する。
【0064】
次にPC8に接続された図示しないキーボード等から、フォーカス調整指示入力を行い、この入力によりPC8はフォーカス自動調整の位置決め動作を開始する。具体的には、PC8はボイスコイルモータ52に駆動信号を送り、ボイスコイルモータ52の可動部を移動させ、光走査プローブ3Aにより光検出器46を介して検出した輝度レベルをモニタする。そして、その値が最大となる位置をフォーカス状態であるとしてその位置で位置決めするよう、Z方向の調整を行い、さらにXY走査ステージ5により初期位置に光が当たるように位置決めする。
【0065】
この調整により、他の光走査プローブ3B及び3Cもフォーカス状態に近い状態に設定され、またそれぞれ初期位置に近い位置に設定される。従って、他の光走査プローブ3B及び3Cは各微動アクチュエータ51B、51Cによる微調整により位置決めができる。
【0066】
このため、例えば光走査プローブ3Bにおいて、さらに微動アクチュエータ51Bを駆動し、フォーカス状態となるようにZ方向の位置決め調整と、観察範囲57bの初期位置に光が当たるように位置決めする。また、光走査プローブ3Cに対しても微動アクチュエータ51Cによりフォーカス状態で光が当たるようにZ方向の位置決めを行い、また観察範囲57cの初期位置に光が当たるようにする。
【0067】
このようにして、3つの光走査プローブ3A〜3Cの3次元的な位置決めが行われる。
上述のように各光走査プローブ3Iは少なくとも微動アクチュエータ51Iによりそれぞれ独立して3自由度で調整可能に保持しているので、それぞれを初期位置等にフォーカス状態で光が当たるように位置決めすることができる。
【0068】
次のステップS4として、各観察範囲における適宜に設定した代表点に移動設定し、各代表点でフォーカスする状態となる時の積層化圧電素子63の駆動電圧データを取得し、それぞれ記憶する。
【0069】
この場合の代表点として、例えば各観察範囲内で数点程、設定し、各代表点でフォーカスする状態での駆動電圧データを取得し、それらの代表点以外の部分では補間した駆動電圧データを用いてほぼフォーカス状態にする。このため、代表点間の駆動電圧データの値の差が大きい場合には、代表点の数を増すようにしても良い。 そして、記憶した駆動電圧データを走査する間の位置に応じて補間する等して、ステップS5に示すフォーカス用駆動データを生成する。
【0070】
そして、ステップS6に示すように初期位置から実際に、DNAアレイ55の試料スポット65を光走査する場合、このフォーカス用駆動データによりフォーカス制御を行う。
【0071】
つまり、フォーカス用駆動データにより積層化圧電素子63を駆動し、各光走査プローブ3Iにより照射された光が試料スポット65で殆どフォーカスする状態を維持するように自動制御し、その際の蛍光をそれぞれ検出ユニット7Aの光検出部40Iで検出することにより、遺伝子情報を得ることができるようになる。
【0072】
このように本実施の形態では、試料スポット65に殆どフォーカス状態で集光できるようにフォーカス制御(Z軸方向の位置決め)を開ループで行うようにするが、後述するようにフォーカス制御を閉ループで行うようにしても良い。
【0073】
このように、本実施の形態では複数の光走査プローブ3Iを用いてそれぞれで同時に光走査を行うことができるようにしているので、所望とする蛍光強度を高速に検出することができる。
【0074】
この場合、上述したように各光走査プローブ3Iにおける長手方向、つまり集光レンズ26の光軸方向(試料スポット65側に対向する距離方向)の位置決めをそれぞれ独立して制御できるようにしているので、それぞれの光学系を殆どフォーカス状態に設定して試料スポット65を光走査でき、検出特性のばらつきを抑制して検出でき、またフォーカスミス、つまりデフォーカスに伴う検出漏れを防止することができる。
【0075】
また、本実施の形態では、励起光源として複数の波長の光を発生して、試料スポット65に照射できるようにしているので、検出したい蛍光波長を効率良く励起することができ、検出の際のS/Nを向上できる。
【0076】
なお、上述の説明ではスライドガラス2上に1枚のDNAアレイ55を配置して3つ光走査プローブ3A〜3Cで光走査して蛍光を検出する場合を説明したが、図8で模式的に示すように例えば3枚の各カバーガラス2にそれぞれDNAアレイ55A、55B、55Cを配置して3つ光走査プローブ3A〜3Cでそれぞれを光走査して蛍光を検出するようにしても良い。
この場合、DNAアレイ55A、55B、55Cの試料スポット65を光走査する様子は図9のようになる。
【0077】
この場合においても、本実施の形態では3つ光走査プローブ3A〜3Cをそれぞれ独立して位置決め保持できるようにしているので、図5の場合とほど同様にDNAアレイ55A、55B、55Cの試料スポット65を殆どフォーカス状態で光走査して、蛍光検出することができる。
【0078】
また、上述の説明では3つの光走査プローブ3A〜3Cの場合で説明したが、図10に示すように2次元的に複数の光走査プローブ3A〜3D、…を用いて形成したプローブユニット3を粗動位置決め手段としてのボイスコイルモータ52を介してXY走査ステージ5に取り付けるようにしても良い。なお、図10では1枚のDNAアレイ55を光走査するように示しているが、図8に示したように複数のDNAアレイ55A、55B、55C、…のようにしても対応できる。
【0079】
このように本実施の形態によれば、複数の光走査プローブ3A〜3C等により被検体を走査するようにしているので、高速に蛍光情報を得ることができると共に、各光走査プローブの光走査光学系による被検体への集光状態をフォーカスするようにそれぞれ独立して自動制御するようにしているので検出特性のばらつきを防止或いは抑制できる。
【0080】
なお、上述の説明では、フォーカス制御を開ループで行うようにしているが、閉ループで行うようにしても良い。例えば、光検出器46で検出される光量が最大となるように光電変換した信号を前に検出した信号レベルと比較し、その差分の信号で微動アクチュエータ51Iの積層化圧電素子63の駆動を制御するようにし、その場合、最初にフォーカス状態に設定して行う。
【0081】
また、試料スポット65以外の部分ではこのように閉ループでフォーカス制御を行い、試料スポット65部分ではその直前のフォーカス制御状態のままとなるように制御(例えばサンプルホールドした状態でのフォーカス制御)とするようにしても良い。
【0082】
つまり、試料スポット65以外のDNAアレイ55の表面は均一な面にできるので、この部分では閉プールのフォーカス制御を行い、試料スポット65の部分ではその表面の光学特性(反射特性)により反射光量が(DNAアレイ55の表面の場合から)変化することが考えられるので、試料スポット65の部分ではその直前おけるフォーカス制御状態のまま(つまりホールドされた制御状態のまま)で行うようにしても良い。
【0083】
このように部分的な閉ループでフォーカス制御を行うためにDNAアレイ55の表面部分を試料スポット65と識別しやすくすると良い。例えば反射光を検出する光検出器46側に、DNAアレイ55の表面色に合わせた波長を識別できるように2波長の光を選択的に受光するように2つの光検出器を設けるようにしても良い。そして、2つの光検出器の出力信号で、閉ループでのフォーカス制御とホールドしたフォーカス制御を切り替えるようにしても良い。
【0084】
なお、上述の説明では試料スポット65としてDNA、RNAの検出・定量等を行うDNAアレイ55の場合で説明したが、これに留まらず、抗体−抗原反応を蛍光により検出する抗体アレイ、抗体−抗原反応、酵素−基質、レセプター−リガンド、タンパク質−DNA等の特異的な分子認識メカニズムを利用したプロテイン・バイオアレイチップのアレイにも適用することができる。
【0085】
(第2の実施の形態)
次に本発明の第2の実施の形態を説明する。図11は本発明の第2の実施の形態の光走査装置1Bの主要部の構成を示す。第1の実施の形態では、光走査プローブ3A〜3C毎に励起用光源を用意していたが、この光走査装置1Bでは共通となる1組の励起用光源のみを用いた構成にしている。
【0086】
つまり、1組の励起用光源70の光は集光レンズ13により光ファイバ71aに入射され、その光は光カプラ72aにより、光ファイバ71b及び71cにそれぞれ導光される。なお、1組の励起用光源70は図1のArレーザ11a、He−Heレーザ11b、レーザダイオード11cとダイクロイックミラー12a、12b、12c、及び集光レンズ13からなる。
【0087】
また、光ファイバ71bに導光された光は、光カプラ72bにより光ファイバ71d及び71eにそれぞれ導光される。また、光ファイバ71cに導光された光も光カプラ72cにより2本の光ファイバ71f、71gに導光されるようになる。
【0088】
光ファイバ71dに導光された光は、光カプラ72dにより光ファイバ71h及び71iにそれぞれ導光され、光ファイバ71hに導光された光は光コネクタ16aを経て光走査プローブ3Aの光ファイバ17aに導光される。なお、光ファイバ17iの端部は閉鎖されている。
【0089】
また、同様に、光ファイバ71eに導光された光は、光カプラ72eにより光ファイバ71j及び71kにそれぞれ導光され、光ファイバ71jに導光された光は光コネクタ16bを経て光走査プローブ3Bの光ファイバ17bに導光される。なお、光ファイバ17kの端部は閉鎖されている。
【0090】
また、光ファイバ71fに導光された光は、光カプラ72fにより光ファイバ71l及び71mにそれぞれ導光され、光ファイバ71lに導光された光は光コネクタ16cを経て光走査プローブ3Cの光ファイバ17cに導光される。なお、光ファイバ17mの端部は閉鎖されている。
また、同様に、光ファイバ71gに導光された光側も同様の構成になっている。
【0091】
上記光走査プローブ3Aによる被検体側からの戻り光は光ファイバ71hを経て光カプラ72dに入射され、その一部が光ファイバ71oに導光され、光検出部40Aに入射される。
また、光走査プローブ3Bによる被検体側からの戻り光は光ファイバ71jを経て光カプラ72eに入射され、その一部が光ファイバ71pに導光され、光検出部40Bに入射される。
【0092】
また、光走査プローブ3Cによる被検体側からの戻り光は光ファイバ71lを経て光カプラ72fに入射され、その一部が光ファイバ71qに導光され、光検出部40Cに入射される。
なお、光走査プローブ3A、3B、3C、…にはそれぞれ信号線28iが延出され、それぞれスキャナ駆動装置30に接続されるが、図11では簡単化のため、省略している。
【0093】
その他の構成は第1の実施の形態と同様である。本実施の形態による作用(動作)は光源70を共通化したことを除いて第1の実施の形態とほぼ同様の作用となる。
本実施の形態によれば、1組の光源70で済むため、低コスト化できる。
【0094】
また、光走査プローブ3A等の光走査光学系19として、図2に示したように固定ミラー25,スキャナ23,集光レンズ系26で構成できるが、第1或いは本実施の形態において、例えば図12及び図13に示すような光走査光学ユニット75を採用しても良い。
【0095】
図12及び図13に示す光走査光学ユニット75は光ファイバ17aの先端と共に集光レンズ系26をその光軸と直交する方向に2次元的に走査する構成にしたものであり、固定ミラー25を不要としている。
図12に示すように光走査プローブ3Aはアウタシース76の先端部に、光走査光学ユニット75を内蔵した光学枠78をその内側に固定して、先端部21が形成されている。
【0096】
また、光走査光学ユニット75を内蔵した光学枠78の先端面には、先端カバーホルダ77を介してカバーガラス88が取り付けられ、光学枠78の先端開口を水密的に封止している。
光走査光学ユニット75は、光学枠78に固定されたベース79を有し、ベース79は、容易に動かないように、レンズ枠84や集光する集光レンズ系26よりも重量が重く設定されている。
【0097】
このベース79には光ファイバ17aの先端部付近が固定されている。また、図13に示すようにベース79の両側には、薄板80の後端が接着されている。薄板80には、厚み方向に分極された圧電素子74が接着されている。圧電素子74には、この圧電素子74を駆動するための信号線28aが接続されている。この信号線28aは、光走査プローブ3Aの内部を通つて、図1のコネクタ29aを介してスキャナ駆動装置30に接続される。
【0098】
薄板80の先端部は中継部材81に固定されている。この中継部材81には2枚の後端には平行な薄板82a,82bが固定されている。薄板82a,82bには圧電素子83a,83bが接着されている。
薄板82a,82bの先端にはレンズ枠84が固定され、このレンズ枠84には集光レンズ系26と光ファイバ17aの先端部を固定的に保持するフェルール86が固定されている。
【0099】
なお、光ファイバ17aは、フェルール86に固定された後、その先端面24がフェルール86と一体的に研磨され、さらに反射防止膜が設けられる。また、圧電素子83a,83bは、信号線28aを介して、上記スキャナ駆動装置30に接続される。
【0100】
また、本実施の形態では小型の変位センサ86がレンズ枠84に接着固定されており、信号線28aを介してスキャナ駆動装置30に接続されている。そして、変位センサ86は、例えばスキャナのX方向の走査位置を、モニタ9における表示画像の左端を基準とし、最も遠い位置、すなわち表示画像の右端における位置のときに最大となるような電圧を出力して、スキャナ駆動装置30における駆動信号発生装置による駆動信号の振幅を調整する。
このような構造にして、プローブ3Aの先端部21を密封した構造にし、光走査により焦点27を光軸Oと直交する方向に2次元的に走査することができるようにしている。
【0101】
なお、上述の光走査手段は圧電素子を用いて2次元走査を行うようにしているが、第1の実施の形態に採用したジンバルミラー構造の場合においても、ジンバルミラー構造におけるグランドの中央に孔を設けて光ファイバ17aの先端部を固定することにより、固定ミラー25を採用しないで、第1の実施の形態あるいは第2の実施の形態で説明したのと殆ど同様に光を2次元的に走査する構造にすることができる。この内容は特開2001−076696号公報中の図16〜図19に開示されている。
【0102】
(第3の実施の形態)
次に本発明の第3の実施の形態を説明する。本実施の形態は、マイクロバイオスポットを試料スポットとして蛍光検出を行うものであり、標本化した多数の組織切片を高速に光走査して、所望とする情報を得る装置である。
より具体的には1枚のスライドに数百の組織切片を載せた組織標本アレイを用意し、多数の標本について一度に組織免疫染色など機能特異的な染色を行えるものである。同じ標本からほとんど同一のスライドを多数得ることができるために、様々な染色を多数の標本について行うことができる。
【0103】
図14は第3の実施の形態における光プローブユニット周辺部の構成を示す。図14は図10において、DNAアレイ55の代わりに、組織標本アレイ91が配置され、この組織標本アレイ91に配置された組織切片92を光走査し、それぞれからの蛍光を検出して、その蛍光に付与或いは関連付けた情報を得ることができるようにしている。なお、図14では観察範囲を57a、57b等を簡単化して同じ符号57で示している。
この場合の組織標本アレイ91の製造方法及び蛍光標識化する方法を図15により説明する。
【0104】
図15(A)は標本化する微小内径の複数本のパイプ93を示し、図15(B)に示すように調べたいと思う組織94A及び94Bに対して複数本のパイプ93を打ち込む等して、各パイプ93内に適宜の厚みのある円筒状組織を内包したパイプA1,A2,A3とB1,B2,B3を作る。また、図示しない他の組織などからの同様なパイプを作る。
【0105】
そして、図15(C)に示すように、これらのパイプA1,A2,A3,…を図示しない接着剤等で束ねた状態で固定し、その後、切断機等で薄くスライスして組織切片92Aや92B(図14では単に符号92で代表)が配列された多数の組織標本アレイ91を作る(用意する)ことができる。
【0106】
そして、このように用意した組織標本アレイ91において、例えばp53タンパク質蛍光免疫染色した図15(D)に示す組織標本アレイ91Aをカバーガラス2に載置し、図14に示すように光走査することにより、各組織切片92に対するp53タンパク質蛍光免疫情報を得ることができる。
【0107】
また、図15(E)に示すようにK−ras遺伝子発現を検出するようFISH(Fluorescence insituhybridization)法による処理した組織標本アレイ91Bをカバーガラス2に載置し、第1或いは第2の実施の形態で説明した光走査装置で光走査することにより、対応する情報を得ることができる。
【0108】
以上では、細胞切片92に対する組織標本アレイ91の場合で説明したが図16に示すように細胞培養容器96の場合に適用しても良い。
【0109】
図16に示すように細胞培養容器96に微小なセル97を12次元的に配置し、各セル97で培養した細胞に蛍光標本化して、第1或いは第2の実施の形態で説明した光走査装置で光走査することにより、蛍光標本化に関連させた情報を得ることもできる。
【0110】
なお、上述の説明では、プローブユニット3側をXY走査ステージ5に取り付けて、プローブユニット3側を粗動させるようにしているが、DNAアレイ55が配置された被検体側をXY走査ステージ5により粗動させるようにしても良い。
【0111】
例えば、図6において、プローブユニット3側で観察範囲57a、57b、57cを走査した後、XY走査ステージ5によりプローブユニット3側を図6の下側に移動量Y1移動する代わりに、DNAアレイ55が配置されたスライドガラス2側を図6の上方向に移動量Y1だけ移動するように移動制御しても良いことは明らかである。
【0112】
なお、図4等に示す光走査プローブ3Iとしてそのシースの長さを短くした或いは図2の先端部21の基端付近をその光走査プローブの後端としたものでも良い。この場合には、図4或いは図5では3軸方向の微小(高精細)位置決めを行う微動アクチュエータ51Iを光走査プローブ3Iの後端に設けているが、先端側付近(例えば先端部の基端付近)に設けたものとなる。
なお、上述した実施の形態等を部分的等で組み合わせて構成される実施の形態等も本発明に属する。
【0113】
[付記]
1.複数の試料スポット、特に微少遺伝子スポットまたはマイクロバイオスポットからの蛍光を検出するための光走査装置であって、
前記試料スポットが基材上に配置され、
光源と、
光源からの光を被検部に対し集光出射する集光手段と、
前記集光手段によって被検部側に集光された焦点を該集光手段の光軸方向と直交する方向に2次元的に走査する光走査手段と、
前記被検部からの戻り光を検出する光検出手段を有し、
前記光走査手段を複数有すると共に、
前記光走査手段を少なくとも1自由度の自動位置決めを行う自動位置決め手段を有することを特徴とする光走査装置。
【0114】
1.1.付記1において、1自由度が光軸方向に移動するもの。
1.1.1.付記1.1において、自動位置決め手段は集光された焦点と試料面を略一致させるもの。
1.1.1.1.付記1.1.1において、試料からの反射光が最大になる位置に自動位置決め手段により光走査手段を駆動するもの。
【0115】
1.1.1.2.付記1.1.1において、光軸方向に垂直な方向に移動する微動位置決め手段を有する。
1.2.付記1において、複数の光走査手段が少なくとも1自由度のそれぞれ独立した自動位置決め手段を有する。
1.3.付記1において、複数の光走査手段が単一の基材上の試料スポットを読み取るもの。
1.4.付記1において、複数の光走査手段がそれぞれ独立した基材上の試料スポットを読み取るもの。
【0116】
1.5.付記1において、複数の光走査手段の試料面上の位置を同時に可変させる粗動位置決め手段を有するもの。
1.6.付記1において、光走査手段がマイクロマシンミラーを有するもの。
1.7.付記1において、
前記光源からの光を前記集光手段に導くための光ファイバを有し、
前記被検部からの戻り光を光源からの光路と分離する分離手段を有し、前記分離手段で分離された光を前記光検出手段で検出し、
前記光ファイバと前記集光手段が、共焦点または近共焦点(near confocal)である。
【0117】
1.7.1.付記1.7において、光源光を導光した光ファイバを光カプラにより分岐して複数の光走査手段に導くもの。
1.8.付記1.において、
前記被検体からの戻り光を波長により分割する複数の波長選択手段と、複数の光走査手段を有する。
1.8.1.付記1.8において、戻り光の一部を直接検出する反射光検出手段を有する。
【0118】
1.9.付記1において、
試料スポットが基材上の定められた位置に配置された蛍光プローブである。
1.9.1.付記1.9において、蛍光プローブがDNAプローブである。
1.9.2.付記1.9において、蛍光プローブが抗体プローブである。
1.9.3.付記1.9において、蛍光プローブがプロテインプローブである。
1.10.付記1において、試料スポットが基材上の定められた位置に配置された組織切片である。
【0119】
1.11.付記1において、試料スポットが基材上の定められた位置に配置された細胞の集合である。
1.11.1.付記1.11において、基材に定められた位置に細胞を配置するためのセルを有する。
【0120】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、光走査手段を少なくとも1自由度の自動位置決めを行う自動位置決め手段を設けているので、光走査手段を集光手段の光軸方向等に自動位置決めして試料スポットを高速に光走査することにより、試料スポットからの蛍光情報を検出特性のばらつきを抑制して、読み出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第1の実施の形態の光走査装置の全体構成図。
【図2】光走査プローブの先端側の光走査光学系の構成を示す縦断面図。
【図3】図2におけるスキャナの構成を示す正面図。
【図4】プローブユニットを位置決め保持する粗動アクチュエータ等を示す図。
【図5】光走査プローブの基端付近に設けた微動アクチュエータの構成を示す図。
【図6】DNAアレイ上に配列された試料スポットによりその走査方法の様子を示す説明図。
【図7】実際に光走査を行う前の3次元位置の位置決めのプロセス例を示すフローチャ−ト図。
【図8】各光走査プローブによりそれぞれ異なるDNAアレイを走査する場合の様子を示す図。
【図9】図8の場合におけるDNAアレイ上に配列された試料スポットによりその走査方法の様子を示す図。
【図10】2次元的に光走査プローブを位置決め保持して光走査を行う場合の主要部を示す斜視図。
【図11】本発明の第2の実施の形態の光走査装置における主要部の構成図。
【図12】光走査プローブの先端側の構成を示す縦断面図。
【図13】図12における光走査光学ユニットを示す斜視図。
【図14】本発明の第3の実施の形態におけるプローブユニット周辺部を示す斜視図。
【図15】多数の組織標本アレイを用意する製造方法の説明図。
【図16】培養した多数の細胞セルを配置した細胞培養容器を示す斜視図。
【符号の説明】
1…光走査装置
2…スライドガラス
3…プローブユニット
3A〜3C…光走査プローブ
4…位置決め保持手段
5…XY走査ステージ
6…XY走査ステージ駆動装置
7A〜7C…検出ユニット
8…PC
9…モニタ
10…データ保持装置
11a…Arレーザ
12a〜12c…ダイクロイックミラー
14a〜14d…光ファイバ
17a…光ファイバ
19…光走査光学系
21…先端部
23…スキャナ(スキャンミラー)
27…焦点
30…スキャナ駆動装置
40…光検出部
42…ハーフミラー
43a〜43c…ダイクロイックミラー
44a〜44c…PMT
45a〜45d…A/Dコンバータ
46…光検出器(PD)
51A…微動アクチュエータ
52…ボイスコイルモータ
55…DNAアレイ
61、62…バイモルフ圧電素子
63…積層化圧電素子
65…試料スポット
57a〜57c…観察範囲
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an optical scanning device for detecting fluorescence from a plurality of sample spots, particularly, microgene spots or microbio spots.
[0002]
[Prior art]
In recent years, with rapid development of genetic research, DNA macroarray technology has emerged as a means for realizing a large amount of gene expression analysis in a short time.
As shown in FIG. 9 in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-9639 as a first conventional example, a solution containing gene DNA is dropped on a substrate 1 such as a slide glass by several nl each to obtain a DNA microarray. Spot-like spots 2 of about 10 to 100 μm are formed, and these spots are regularly arranged on a single substrate 1 at several thousands to tens of thousands of points.
[0003]
After labeling RNA, which is a specimen, with fluorescence on such a DNA microarray 3 and sprinkling it, washing it, and irradiating each spot 2 with laser light, the fluorescence generated is measured, and gene expression is analyzed based on the fluorescence intensity. be able to.
[0004]
A scanning optical measurement device called a DNA microarray reader is used for the fluorescence measurement in the gene expression analysis. The configuration of this scanning optical measurement device is similar to a general confocal laser microscope, and irradiates a laser beam emitted from a laser light source onto the DNA macro array 3 through an objective lens. The generated fluorescence is guided to a photoelectric conversion element such as a photomultiplier tube (PMT) through a confocal pinhole, and the fluorescence intensity is converted into an electric signal by the photoelectric conversion element.
[0005]
At this time, the DNA microarray 3 is placed on the electric scanning stage and moved in the X and Y directions. Accordingly, the laser light emitted from the laser light source scans the DNA microarray 3 in the X and Y directions, and the electric signal output from the photoelectric conversion element at this time is sent to an image processing device such as a computer. This image processing device performs A / D conversion of an electric signal from a photoelectric conversion element and acquires the signal as scanned image data.
[0006]
As another conventional example of this kind, there is JP-A-2001-108684. In this second conventional example, a multi-spot array light is used to detect a DNA array at high speed.
[0007]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-242081 as a third conventional example uses a CD pickup or a pickup having an optical waveguide configuration in order to reduce the size of a DNA array reader.
Also, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-238677 as a fourth conventional example, a CD-shaped DNA array is configured for high-speed reading.
[0008]
[Patent Document 1]
JP-A-2002-9639
[0009]
[Patent Document 2]
JP 2001-108684 A
[0010]
[Patent Document 3]
JP 2001-242081 A
[0011]
[Patent Document 4]
JP 2001-238677 A
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
In the first conventional example, since a single laser is used for scanning, there is a disadvantage that high-speed reading cannot be performed.
In the second conventional example, the speed can be increased because the multi-spot array light is used. However, since a plurality of spots are generated by using the same optical system, all the spots are accurately positioned on the specimen. If the alignment cannot be carried out as described above, the detection performance will vary greatly. Further, in an optical system that can simultaneously cover a wide range, it is difficult to remove aberrations such as chromatic aberration, and the performance tends to deteriorate depending on the position.
[0013]
In general, it is not possible to handle a plurality of samples whose heights are higher than the micro level and differ. There is a restriction limited to samples on the same slide.
[0014]
In the third conventional example, FIG. 5 in the publication discloses that a plurality of scans are simultaneously performed using a plurality of optical waveguides. However, all spots are accurately positioned on the specimen because they are on the same substrate. If the alignment cannot be carried out as described above, the detection performance will vary greatly. Further, in general, it is not possible to cope with a plurality of samples having different heights on the order of microns or more. There is a restriction limited to samples on the same slide.
The fourth conventional example has a drawback that a special device is required for arranging a sample array with high precision in a spiral shape like a pit of a CD, so that a general matrix DNA array cannot be used. There is a disadvantage that it becomes.
[0015]
(Object of the invention)
The present invention has been made in view of the above points, and provides an optical scanning device capable of reading fluorescence information of an array of DNAs, proteomes, antibodies, cells, and the like at high speed while suppressing variations in detection characteristics. With the goal.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
An optical scanning device for detecting fluorescence from a plurality of sample spots, particularly microgene spots or microbio spots,
The sample spot is disposed on a substrate,
A light source,
Light-collecting means for condensing and emitting light from the light source to the test portion,
An optical scanning unit that two-dimensionally scans a focal point condensed on the part to be measured by the condensing unit in a direction orthogonal to an optical axis direction of the condensing unit;
Having a plurality of the light scanning means;
Having light detection means for detecting return light from the test portion,
The optical scanning means has automatic positioning means for performing automatic positioning of at least one degree of freedom, thereby automatically positioning the light scanning means in the optical axis direction of the condensing means and optically scanning the sample spot at a high speed. Fluorescence information from the spot can be read out while suppressing variation in detection characteristics.
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
(First Embodiment)
1 to 10 relate to a first embodiment of the present invention. FIG. 1 shows an overall configuration of an optical scanning device according to the first embodiment, and FIG. 2 shows optical scanning optics on the distal end side of an optical scanning probe. 3 shows the configuration of the scanner in FIG. 2, FIG. 4 shows a coarse actuator for positioning and holding the probe unit, and FIG. 5 shows the configuration of a fine actuator provided near the base end of the optical scanning probe. FIG. 6 shows a state of a scanning method using sample spots arranged on a DNA array, FIG. 7 shows an example of a process of positioning a three-dimensional position before actually performing optical scanning, and FIG. FIG. 9 shows a case in which different DNA arrays are scanned by an optical scanning probe, FIG. 9 shows a state of the scanning method using sample spots arranged on the DNA array in the case of FIG. 8, and FIG. And positioning and holding the scanning probe showing a configuration of a main part of the case of performing optical scanning.
[0018]
As shown in FIG. 1, an optical scanning device 1 according to the first embodiment of the present invention includes, for example, a substrate on a slide glass 2 and a small gene spot (hereinafter referred to as a sample spot) disposed on, for example, a DNA array 55 described later. ), Optical scanning probes 3A, 3B, and 3C each including a built-in optical scanning unit for optically scanning a minute scanning range (observation range) in detail, and these optical scanning probes 3A, Positioning and holding means 4 for positioning and holding the 3B and 3C, and an electric motor as coarse movement scanning means for two-dimensionally coarsely scanning the optical scanning probes 3A, 3B and 3C attached via the positioning and holding means 4. An XY scanning stage 5, an XY scanning stage driving device 6 for driving the XY scanning stage 5, and optical scanning probes 3A, 3B, and 3C are connected to supply light from a light source. At the same time, detection units 7A, 7B, and 7C each having a detection unit for detecting a fluorescent component and the like in the return light from the test object side, and are connected to these detection units 7A, 7B, and 7C, and For example, a personal computer (hereinafter abbreviated as PC) 8 as image processing means for performing image processing on a signal, a monitor 9 for displaying an optical scanning image formed by the PC 8, and recording optical scanning image data and the like. (Storage).
[0019]
The optical scanning device 1 reads fluorescence information for the DNA array 55 shown in, for example, FIGS. In this case, a two-fluorescent labeling method is employed. The principle is to detect the difference in gene expression between two different mRNA samples, each of which is labeled with a different fluorescent dye and competitively hybridized (amplified) on the DNA array 55 to detect both fluorescence. And compare. In this case, one or more excitation lights are generally used, and the amounts of fluorescence are compared using detectors corresponding to the fluorescence wavelengths of the respective fluorescent dyes.
[0020]
In order to perform such a detection operation, the detection unit 7A includes an Ar laser 11a, a He-Ne laser 11b, and a semiconductor laser (laser laser) so that a plurality of, for example, three wavelengths of laser light can be generated as excitation light sources. These laser beams are combined by dichroic mirrors (or herb mirrors) 12a, 12b, and 12c, are incident on a condenser lens 13, and are condensed by the condenser lens 13 to form an optical fiber 14a. Is incident on.
[0021]
A part of the laser light incident on the optical fiber 14a is guided by the optical coupler 15 to the optical fiber 14b, and the light guided to the optical fiber 14b passes through the optical connector 16 and is transmitted to the optical scanning probe 3A. The light enters the fiber 17a.
[0022]
The light incident on the optical fiber 17a is transmitted to the distal end side. The distal end of the optical fiber 17a is inserted into the optical scanning probe 3A, and an optical scanning optical system 19 is provided at the distal end. This configuration is shown in FIG.
[0023]
As shown in FIG. 2, the optical scanning probe 3A has a rigid distal end frame 22 constituting a distal end portion 21 connected to the distal end of a rigid sheath 20, and the distal end side of the optical fiber 17a has a micromachine mirror inside the distal end frame 22. Together with a scan mirror (also referred to as a scanner) 23 for two-dimensional (for example, XY) scanning by the mounting member 18 on the inner wall of the end frame 22.
[0024]
The light emitted from the very small distal end face 24 of the optical fiber 17a is reflected by a fixed mirror 25 fixed to the inner wall surface of the distal end frame 22, further reflected by the movable portion of the scanner 23, and The light is emitted in the direction of the optical axis O of the condenser lens system 26 through the condenser lens system 26 which is disposed and attached to the opening of the end frame 22, and is condensed at the focal point 27 at this time. Irradiated on the side.
In this case, the movable mirror in the scanner 23 is two-dimensionally tilted, so that the focal point 27 is two-dimensionally scanned (moved) in a direction orthogonal to the optical axis O.
[0025]
The reflected light from the focal point 27 follows the same path in reverse, and is incident on the distal end face 24 of the optical fiber 17a. That is, the distal end face 24 and the focal point 27 of the optical fiber 17a have a confocal relationship or a relationship close thereto (near confocal relationship) with respect to the optical scanning optical system 19, that is, the fixed mirror 25, the scanner 23, and the condenser lens system 26. Only light near the focal point 27 is incident on the distal end surface 24 of the optical fiber 17a.
[0026]
Note that, in actuality, the fluorescent light emitted from the focal point 27 and the vicinity thereof is mainly detected. Of course, the reflected light component is also detected, and the intensity of the reflected light is detected so that the fluorescence can be detected (by normalization or the like) in a comparable manner, and also used for controlling the optical scanning while maintaining the focus on (or close to) the subject. Like that.
[0027]
Note that an achromatic lens is employed as the condenser lens system 26 in the present embodiment. That is, a plurality of lenses are combined so as to have almost the same focal position with respect to the light of the light source, that is, the light of each wavelength of the Ar laser 11a, the He-Ne laser 11b, and the laser diode 11c and the wavelength of the fluorescence described later. Is formed.
[0028]
The scanner 23 is connected to a scanner driving device 30 inside the detection unit 7A via a signal line 28a and further via a connector 29a, and outputs a driving signal for scanning in the X and Y directions from the scanner driving device 30 to move the scanner 23. The mirror part tilts in the X and Y directions, two-dimensionally scans the focal point 27 focused on the subject side, and obtains information for analyzing gene expression of the subject by the returned light. I have.
Hereinafter, the configuration of the scanner 23 will be described with reference to FIGS.
The scanner 23 includes a gimbal mirror 32 serving as a movable mirror and a ground 34 having a concave portion 33.
[0029]
The main body of the gimbal mirror 32 is a silicon plate, and the signal line 28a shown in FIG. 2 is actually formed by driving wirings 35a, 35b, 35c, and 35d as shown in FIG. 36b, 36c, and 36d. Here, the driving wiring and the electrode also serve as a mirror.
A satin portion 37 in FIG. 3 is an opening, and a central mirror portion is rotatable in X and Y directions around hinge portions 38 and 39.
[0030]
The electrodes 36a, 36b and 36c, 36d are respectively connected to the scanner driving device in the detection unit 7A via a pair (two) of X-direction driving wires 35a, 35b and a pair (two) of Y-direction driving wires 35c, 35d. 30 are electrically connected to each other, and an X drive signal and a Y drive signal are supplied, respectively.
[0031]
A part of the light incident on the optical fiber 17a is guided to the optical fiber 14c by the optical coupler 15 in the detection unit 7A. The light guided to the optical fiber 14c is emitted from the end face, and is condensed by the condensing lens 41 constituting the light detection unit 40A.
The end of the optical fiber 14d is closed or treated so that reflection from the end is attenuated.
[0032]
The light condensed by the condenser lens 41 is split into, for example, reflected light and transmitted light by a half mirror 42. Then, the transmitted light is detected by a plurality of detecting means for detecting different predetermined wavelengths, and the reflected light is reflected by the return light (mainly reflected light) which detects return light from the subject. It is detected by the light detecting means.
[0033]
That is, a dichroic mirror 43a that transmits light of the wavelength λ1 and reflects the other light is disposed opposite the half mirror 42, and the light transmitted through the dichroic mirror 43a is a photomultiplier (abbreviated as PMT) 44a. After being photoelectrically converted by optical doubling, the signal is converted from an analog signal to a digital signal by the A / D converter 45a and input to the PC 8.
[0034]
A dichroic mirror 43b that reflects light of the wavelength λ2 and transmits the other light is disposed on the reflection optical path side of the dichroic mirror 43a. The light reflected by the dichroic mirror 43b is incident on the PMT 44b, After being photoelectrically converted by doubling, the signal is converted into a digital signal by the A / D converter 45b and input to the PC8.
[0035]
A dichroic mirror 43c that reflects light of wavelength λ3 and transmits the other light is disposed on the transmitted light path side of the dichroic mirror 43b. The light reflected by the dichroic mirror 43c is incident on the PMT 44c, After being photoelectrically converted by doubling, the signal is converted into a digital signal by an A / D converter 45c and input to the PC 8.
[0036]
On the other hand, the light reflected by the half mirror 42 is received by a photodetector (abbreviated as PD) 46, photoelectrically converted, and then converted from an analog signal to a digital signal by an A / D converter 45 d and input to the PC 8. You.
[0037]
In the PC 8, the signal intensity of each of the wavelengths λ1 to λ3 detected via the A / D converters 45a to 45c is standardized by the intensity of the signal (from the photodetector 46) converted by the A / D converter 45d. To detect.
The other optical scanning probes 3B and 3C have the same structure as the optical scanning probe 3A, and the detection units 7B and 7C have the same structure as the detection unit 7A.
[0038]
As shown in FIG. 4, the probe unit 3 including the optical scanning probes 3A, 3B and 3C has a rear end attached to an XY scanning stage 5 via a positioning and holding means 4, and the XY scanning stage 5 performs optical scanning. The probes 3A, 3B and 3C are moved (scanned) in the X direction and the Y direction as a whole, that is, for each probe unit 3.
[0039]
As will be described later, the scanning range in the X and Y directions by each optical scanning probe 3I (I = A, B, C) is narrow. It moves in the direction and the Y direction to cover a predetermined inspection range.
[0040]
In this case, each optical scanning probe 3I is formed with a fine movement actuator 51I (only 51A is shown in FIG. 4) as a fine movement positioning means near the base end thereof, and the base end of the fine movement actuator 51I is further integrated. The XY scanning stage 5 is attached to, for example, a Y stage portion 5b via, for example, a voice coil motor 52 as coarse movement positioning means in the Z direction.
[0041]
The Y stage portion 5b is held on the bottom surface of the X stage portion 5a movable in the X direction along the guide rod 53, and the Y stage portion 5b is fitted in a guide groove (not shown) provided on the bottom surface of the X stage portion 5a. In this case, it is held movably in the Y direction.
The X stage 5a and the Y stage 5b are moved in the X and Y directions by a motor (not shown), respectively. Each motor is driven by a driving signal from the XY scanning stage driving device 6 in FIG.
[0042]
For example, a DNA array 55 as a base material on which a test object is formed is arranged on the slide glass 2 arranged to face the probe unit 3, and all the sample spots 65 on the DNA array 55 (see FIG. 6) In this case, excitation light is irradiated by a combination of two-dimensional (XY) coarse movement scanning by the XY scanning stage 5 and two-dimensional (XY) light scanning by the probe unit 3 so that fluorescence can be detected at that time. ing.
[0043]
FIG. 4 schematically shows an observation range 57i (i = a to c) that can be observed by scanning with each optical scanning probe 3I.
When the sample spot 65 is optically scanned by each optical scanning probe 3I, it is necessary to maintain the light irradiated on the sample spot 65 in a state close to a focus state where a focus is formed on the sample surface. In the embodiment, the positioning and holding means 4 by the fine movement actuator 51I and the voice coil motor 52 is provided as described above.
[0044]
In this case, the approximate positioning in the Z-axis direction which is the optical axis direction (of the condenser lens system 26 forming the optical scanning optical system 19) is performed on the entire optical scanning probes 3A to 3C by the common voice coil motor 52. The precise positioning of the individual optical scanning probes 3A to 3C in the Z direction can be performed independently by the fine movement actuators 51A to 51C, so that high-precision positioning can be performed.
[0045]
FIG. 5 shows the structure of the fine movement actuator 51A provided at the base end (rear end) of the optical scanning probe 3A. FIG. 5 (A) shows the structure when viewed from the Y direction, and FIG. 5 (B) shows the structure when viewed from the X direction. Is shown. The other fine movement actuators 51B and 51C have the same configuration as fine movement actuator 51A.
[0046]
The fine movement actuator 51A is disposed in such a manner that two plate-shaped bimorph piezoelectric elements 61 and 62 for scanning in the Y and X directions are opposed to each other in the Y and X directions in the longitudinal direction of the base end of the optical scanning probe 3A. And in the X direction.
[0047]
Further, a laminated piezoelectric element 63 having a laminated structure for scanning in the Z direction is attached to the rear end of the plate-shaped bimorph piezoelectric element 62 for scanning in the X direction, and is capable of expanding and contracting in the Z direction. The rear end of the laminated piezoelectric element 63 is attached to a movable portion of the voice coil motor 52, for example, a permanent magnet, and a voice coil serving as a fixed portion around the permanent magnet is attached to the Y stage portion 5b.
[0048]
The voice coil motor 52 and the fine actuator 51A are connected to, for example, the PC 8 so that the PC 8 can control the operations of the voice coil motor 52 and the fine actuator 51A.
[0049]
For example, by inputting a movement operation from a keyboard or the like provided on the PC 8, the holding position in the Z direction by the voice coil motor 52 is adjusted by the input value, or the fine scanning actuator 51A is also scanned with light. The base position of the probe 3A is moved in the X, Y, and Z directions, so that the positioning position can be finely adjusted three-dimensionally.
[0050]
Further, the PC 8 adjusts the holding position of the laminated piezoelectric element 63 so that the luminance level becomes maximum based on the output signal from the photodetector 46.
For example, as shown in FIG. 4, the optical scanning probes 3A to 3C are attached, and the PC 8 displaces the laminated piezoelectric element 63 of the fine movement actuator 51A in the Z direction at an appropriate representative point in the DNA array 55 arranged on the slide glass 2. A drive signal is applied so that the luminance level (that is, the reflected light component) is detected from the output signal from the photodetector 46, and the amplitude value of the drive signal at the position where the luminance level becomes the highest is stored in the internal signal. It is stored in storage means or the like.
[0051]
When the DNA array 55 is actually optically scanned, the holding position of the laminated piezoelectric element 63 in the Z direction is controlled by, for example, interpolating the stored information (that is, the amplitude value of the drive signal) at the representative point. Optical scanning of the DNA array 55 can be maintained in a substantially focused state.
[0052]
Further, in the present embodiment, since each optical scanning probe 3I is held independently and finely adjustable in three axial directions by the fine movement actuator 51I, the optical scanning optical system on the distal end side of each optical scanning probe 3I. 19 and the DNA array 55 to be observed can be set to an appropriate state in which optical information can be read by optical scanning.
[0053]
For example, the optical scanning probe 3A is controlled so as to be automatically positioned so that light from each of the optical scanning optical systems 19 incorporated therein substantially focuses on the surface of the subject in the optical axis O direction. The same applies to the other optical scanning probes 3B and 3C.
[0054]
FIG. 6 shows a two-dimensional array of sample spots 65 formed on the DNA array 55. In these sample spots 65, for example, an observation range 57a indicated by a thick solid line is an optical scanning probe 3A, and an observation range 57b is an optical scanning probe. The light is read by the optical scanning probe 3B adjacent to the probe 3A.
An observation range (not shown) adjacent to the right side of the observation range 57b (shown as 57c) is read by the optical scanning probe 3C.
[0055]
Then, the observation ranges 57a, 57b, and 57c are read by the three optical scanning probes 3A to 3C, respectively. Thereafter, the entire optical scanning probes 3A to 3C are slightly moved, for example, in the vertical direction (for example, the lower side in FIG. 6) by the XY scanning stage 5, for example, by the moving amount Y1 indicated by the arrow, and the three optical scanning probes 3A are similarly moved. Each observation range is read at ~ 3C. In FIG. 6, the dotted line indicates that the observation range 57a is also moved by the movement of the optical probe 3A by the movement amount Y1, and becomes the reference numeral 57a '.
[0056]
When the entire sample spot 65 in the vertical direction is read by gradually moving in the vertical direction in this way, the XY scanning stage 5 returns the sample spot 65 to the initial position, and then the entire optical scanning probe 3A to 3C is moved in the horizontal (horizontal) direction , For example, is moved by a movement amount X1 indicated by an arrow, and the observation range is similarly read by each of the three optical scanning probes 3A to 3C. Thereafter, the moving range is slightly moved downward, and the three optical scanning probes 3A to 3C are moved. Are used to read the observation range. In this manner, all the sample spots 65 are optically scanned by the three optical scanning probes 3A to 3C.
[0057]
In this case, the return light from each sample spot 65 within the observation range 57i is guided into the detection unit 7I, and received by the photodetector 46 and the PMTs 44a to 44c. Before the PMTs 44a to 44c, selective wavelength separation means (dichroic mirrors 43a to 43c) can separate and extract only the respective wavelength components of the wavelengths λ1 to λ3 so that they are incident. Fluorescence can be detected.
[0058]
The signals that have been photoelectrically converted and doubled by the PMTs 44a to 44c are A / D converted and input to the PC 8, and are detected by the photodetector 46 based on the ratio with the A / D converted signals. The intensity is normalized and detected.
[0059]
The detected fluorescence intensity data is stored in a storage device such as a hard disk in the PC 8 and is also stored in the memory, and an appropriate amount of data is displayed on the monitor 9 or stored (stored) in the data storage device 10. You can also do it.
[0060]
In addition, as shown in FIG. 6, the movement range Y1 is set so that the observation ranges 57a and 57a 'partially overlap each other, so that a small variation at the time of coarse movement can be covered. The same applies to the horizontal movement amount X1.
[0061]
In addition, since the light scanning probes 3A and 3B and 3B and 3C detect fluorescence in the same part by overlapping a part in the horizontal direction, it is also possible to correct variations in their characteristics. . In other words, it is possible to correct variations in characteristics including the detection unit 7I between the adjacent optical scanning probes 3A and 3B, 3B and 3C, and perform highly accurate detection in which variations in characteristics are corrected.
Although the operation has been described above together with the configuration of the present embodiment, the positioning operation of the present embodiment will be described with reference to FIG.
[0062]
First, as shown in step S1, the rear end side of the probe unit 3 is attached to the XY scanning stage 5 via the positioning and holding means 4.
Further, the subject side is set as shown in step S2. Specifically, the DNA array 55 is set on the slide glass 2.
[0063]
Then, as the next step S3, three-dimensional positioning adjustment between the XY scanning stage 5 to which the probe unit 3 is attached and the subject side is performed. As this positioning adjustment, for example, the three-dimensional position of the distal end surface of the probe unit 3 with respect to the subject is manually set near a predetermined position. For example, in FIG. 6, it is set near an initial position (indicated by P0 in FIG. 6) where the optical scanning probe 3A performs optical scanning, and is set near a distance such that a focus state is established at the position P0.
[0064]
Next, a focus adjustment instruction is input from a keyboard or the like (not shown) connected to the PC 8, and the PC 8 starts a positioning operation for automatic focus adjustment by this input. Specifically, the PC 8 sends a drive signal to the voice coil motor 52 to move the movable part of the voice coil motor 52, and monitors the luminance level detected by the optical scanning probe 3A via the light detector 46. Then, the Z-direction adjustment is performed so that the position where the value becomes the maximum is determined as the focus state, and the position is adjusted at that position. Further, the XY scanning stage 5 performs the positioning so that light strikes the initial position.
[0065]
By this adjustment, the other optical scanning probes 3B and 3C are set to a state close to the focus state, and are set to positions close to the initial positions, respectively. Therefore, the other optical scanning probes 3B and 3C can be positioned by fine adjustment by the fine movement actuators 51B and 51C.
[0066]
For this reason, for example, in the optical scanning probe 3B, the fine movement actuator 51B is further driven to adjust the positioning in the Z direction so as to be in the focus state and to position the light so as to impinge on the initial position of the observation range 57b. Further, the fine scanning actuator 51C also performs positioning in the Z direction so that light is applied in the focused state to the optical scanning probe 3C, and also allows light to be applied to the initial position of the observation range 57c.
[0067]
Thus, three-dimensional positioning of the three optical scanning probes 3A to 3C is performed.
As described above, each optical scanning probe 3I is independently held by at least the fine movement actuator 51I so as to be adjustable with three degrees of freedom. Therefore, it is possible to position each of the optical scanning probes 3I so that the light strikes the initial position or the like in a focused state. it can.
[0068]
In the next step S4, the driving voltage data of the laminated piezoelectric element 63 at the time of moving to the appropriately set representative point in each observation range and focusing on each representative point is acquired and stored.
[0069]
As representative points in this case, for example, several points are set in each observation range, drive voltage data in a state where each representative point is in focus is obtained, and interpolated drive voltage data is obtained in a portion other than those representative points. To make it almost in focus. Therefore, when the difference in the value of the drive voltage data between the representative points is large, the number of the representative points may be increased. Then, the drive data for focusing shown in step S5 is generated by, for example, interpolating the stored drive voltage data according to the position during scanning.
[0070]
Then, when the sample spot 65 of the DNA array 55 is actually optically scanned from the initial position as shown in step S6, focus control is performed using the focus driving data.
[0071]
That is, the laminated piezoelectric element 63 is driven by the driving data for focusing, and the light irradiated by each optical scanning probe 3I is automatically controlled so as to keep almost the state of being focused on the sample spot 65. Gene information can be obtained by detecting with the light detection unit 40I of the detection unit 7A.
[0072]
As described above, in the present embodiment, focus control (positioning in the Z-axis direction) is performed in an open loop so that light can be focused on the sample spot 65 almost in a focused state. However, focus control is performed in a closed loop as described later. It may be performed.
[0073]
As described above, in the present embodiment, a plurality of optical scanning probes 3I can be used to simultaneously perform optical scanning, respectively, so that a desired fluorescence intensity can be detected at high speed.
[0074]
In this case, as described above, the positioning in the longitudinal direction of each optical scanning probe 3I, that is, the optical axis direction of the condenser lens 26 (distance direction facing the sample spot 65 side) can be controlled independently. By setting each of the optical systems almost in the focused state, the sample spot 65 can be optically scanned, the variation in the detection characteristics can be suppressed, and detection can be performed. Further, a focus error, that is, a detection omission due to defocus can be prevented.
[0075]
Further, in the present embodiment, light of a plurality of wavelengths is generated as an excitation light source so as to be able to irradiate the sample spot 65, so that the fluorescence wavelength to be detected can be efficiently excited, S / N can be improved.
[0076]
In the above description, the case where one DNA array 55 is arranged on the slide glass 2 and three optical scanning probes 3A to 3C perform optical scanning to detect fluorescence has been described. As shown, for example, DNA arrays 55A, 55B, and 55C may be arranged on each of the three cover glasses 2, and three optical scanning probes 3A to 3C may perform optical scanning to detect fluorescence.
In this case, the manner in which the sample spots 65 of the DNA arrays 55A, 55B, and 55C are optically scanned is as shown in FIG.
[0077]
Also in this case, in the present embodiment, the three optical scanning probes 3A to 3C can be positioned and held independently of each other, so that the sample spots of the DNA arrays 55A, 55B, and 55C are similar to the case of FIG. 65 can be optically scanned in a focused state to detect fluorescence.
[0078]
In the above description, three optical scanning probes 3A to 3C have been described. However, as shown in FIG. 10, a probe unit 3 formed two-dimensionally using a plurality of optical scanning probes 3A to 3D,. It may be attached to the XY scanning stage 5 via a voice coil motor 52 as a coarse movement positioning means. In FIG. 10, one DNA array 55 is shown to be optically scanned, but a plurality of DNA arrays 55A, 55B, 55C,... As shown in FIG.
[0079]
As described above, according to the present embodiment, the subject is scanned by the plurality of optical scanning probes 3A to 3C and the like, so that fluorescence information can be obtained at high speed and the optical scanning of each optical scanning probe can be performed. Since automatic control is performed independently and independently so as to focus the state of focusing on the object by the optical system, variations in detection characteristics can be prevented or suppressed.
[0080]
In the above description, the focus control is performed in an open loop, but may be performed in a closed loop. For example, a signal that has been photoelectrically converted so that the amount of light detected by the photodetector 46 is maximized is compared with a previously detected signal level, and the signal of the difference controls the driving of the laminated piezoelectric element 63 of the fine actuator 51I. In such a case, the focus state is set first.
[0081]
Further, focus control is performed in a closed loop in a portion other than the sample spot 65 in this way, and control is performed so that the focus control state immediately before the sample spot 65 is maintained (for example, focus control in a sample-hold state). You may do it.
[0082]
That is, since the surface of the DNA array 55 other than the sample spot 65 can be made uniform, the focus of the closed pool is controlled in this portion, and the amount of reflected light is controlled by the optical characteristics (reflection characteristics) of the surface in the sample spot 65 portion. Since it may change (from the case of the surface of the DNA array 55), the sample spot 65 may be performed in the focus control state immediately before (that is, in the held control state).
[0083]
In order to perform focus control in a partially closed loop as described above, it is preferable that the surface portion of the DNA array 55 be easily distinguished from the sample spot 65. For example, two photodetectors are provided on the side of the photodetector 46 for detecting the reflected light so as to selectively receive two wavelengths of light so that a wavelength matched to the surface color of the DNA array 55 can be identified. Is also good. Then, the output signals of the two photodetectors may be used to switch between the focus control in the closed loop and the held focus control.
[0084]
In the above description, the DNA array 55 for detecting and quantifying DNA and RNA is described as the sample spot 65. However, the present invention is not limited thereto, and an antibody array for detecting an antibody-antigen reaction by fluorescence, an antibody-antigen The present invention can be applied to an array of a protein bioarray chip utilizing a specific molecular recognition mechanism such as a reaction, an enzyme-substrate, a receptor-ligand, and a protein-DNA.
[0085]
(Second embodiment)
Next, a second embodiment of the present invention will be described. FIG. 11 shows a configuration of a main part of an optical scanning device 1B according to a second embodiment of the present invention. In the first embodiment, an excitation light source is prepared for each of the optical scanning probes 3A to 3C. However, the optical scanning device 1B is configured to use only a common set of excitation light sources.
[0086]
That is, the light of one set of excitation light sources 70 is incident on the optical fiber 71a by the condenser lens 13, and the light is guided to the optical fibers 71b and 71c by the optical coupler 72a. One set of excitation light sources 70 includes the Ar laser 11a, the He-He laser 11b, the laser diode 11c, the dichroic mirrors 12a, 12b, 12c, and the condenser lens 13 shown in FIG.
[0087]
The light guided to the optical fiber 71b is guided to the optical fibers 71d and 71e by the optical coupler 72b. Further, the light guided to the optical fiber 71c is also guided to the two optical fibers 71f and 71g by the optical coupler 72c.
[0088]
The light guided to the optical fiber 71d is guided by the optical coupler 72d to the optical fibers 71h and 71i, respectively, and the light guided to the optical fiber 71h passes through the optical connector 16a to the optical fiber 17a of the optical scanning probe 3A. Light is guided. The end of the optical fiber 17i is closed.
[0089]
Similarly, the light guided to the optical fiber 71e is guided to the optical fibers 71j and 71k by the optical coupler 72e, and the light guided to the optical fiber 71j is transmitted to the optical scanning probe 3B via the optical connector 16b. Is guided to the optical fiber 17b. The end of the optical fiber 17k is closed.
[0090]
The light guided to the optical fiber 71f is guided by the optical coupler 72f to the optical fibers 71l and 71m, respectively, and the light guided to the optical fiber 71l passes through the optical connector 16c and is connected to the optical fiber of the optical scanning probe 3C. The light is guided to 17c. The end of the optical fiber 17m is closed.
Similarly, the light side guided to the optical fiber 71g has the same configuration.
[0091]
The return light from the subject side by the optical scanning probe 3A is incident on the optical coupler 72d via the optical fiber 71h, a part of which is guided to the optical fiber 71o, and is incident on the photodetector 40A.
Also, the return light from the subject side by the optical scanning probe 3B is incident on the optical coupler 72e via the optical fiber 71j, and a part thereof is guided to the optical fiber 71p and is incident on the photodetector 40B.
[0092]
The return light from the subject side by the optical scanning probe 3C enters the optical coupler 72f via the optical fiber 71l, a part of which is guided to the optical fiber 71q, and enters the photodetector 40C.
Each of the optical scanning probes 3A, 3B, 3C,... Has a signal line 28i extending therefrom and connected to the scanner driving device 30, but is omitted in FIG. 11 for simplicity.
[0093]
Other configurations are the same as those of the first embodiment. The operation (operation) according to the present embodiment is almost the same as that of the first embodiment except that the light source 70 is shared.
According to the present embodiment, the cost can be reduced because only one set of the light sources 70 is required.
[0094]
Further, as shown in FIG. 2, the optical scanning optical system 19 such as the optical scanning probe 3A can be composed of the fixed mirror 25, the scanner 23, and the condenser lens system 26. In the first or the present embodiment, for example, FIG. An optical scanning optical unit 75 as shown in FIGS. 12 and 13 may be employed.
[0095]
The optical scanning optical unit 75 shown in FIGS. 12 and 13 is configured to two-dimensionally scan the condenser lens system 26 in a direction orthogonal to the optical axis thereof together with the tip of the optical fiber 17a. It is unnecessary.
As shown in FIG. 12, the optical scanning probe 3A has a distal end 21 formed by fixing an optical frame 78 having a built-in optical scanning optical unit 75 inside the outer sheath 76 at the distal end thereof.
[0096]
In addition, a cover glass 88 is attached to a distal end surface of the optical frame 78 in which the optical scanning optical unit 75 is built via a distal end cover holder 77, and the distal end opening of the optical frame 78 is sealed in a watertight manner.
The optical scanning optical unit 75 has a base 79 fixed to an optical frame 78. The base 79 is set to be heavier than the lens frame 84 and the condensing lens system 26 for condensing so as not to move easily. ing.
[0097]
The vicinity of the tip of the optical fiber 17a is fixed to the base 79. As shown in FIG. 13, the rear end of the thin plate 80 is adhered to both sides of the base 79. The piezoelectric element 74 polarized in the thickness direction is bonded to the thin plate 80. A signal line 28 a for driving the piezoelectric element 74 is connected to the piezoelectric element 74. This signal line 28a passes through the inside of the optical scanning probe 3A and is connected to the scanner driving device 30 via the connector 29a in FIG.
[0098]
The tip of the thin plate 80 is fixed to the relay member 81. Parallel thin plates 82a and 82b are fixed to the rear ends of the relay member 81. Piezoelectric elements 83a and 83b are bonded to the thin plates 82a and 82b.
A lens frame 84 is fixed to the distal ends of the thin plates 82a and 82b, and a ferrule 86 that fixedly holds the condenser lens system 26 and the distal end of the optical fiber 17a is fixed to the lens frame 84.
[0099]
After the optical fiber 17a is fixed to the ferrule 86, the distal end surface 24 is polished integrally with the ferrule 86, and an antireflection film is further provided. Further, the piezoelectric elements 83a and 83b are connected to the scanner driving device 30 via a signal line 28a.
[0100]
Further, in the present embodiment, a small displacement sensor 86 is adhesively fixed to the lens frame 84, and is connected to the scanner driving device 30 via the signal line 28a. Then, the displacement sensor 86 outputs, for example, a voltage that maximizes the scanning position in the X direction of the scanner at the farthest position, that is, the position at the right end of the display image, based on the left end of the display image on the monitor 9. Then, the amplitude of the drive signal by the drive signal generator in the scanner drive device 30 is adjusted.
With such a structure, the distal end portion 21 of the probe 3A is sealed, so that the focal point 27 can be two-dimensionally scanned in a direction orthogonal to the optical axis O by optical scanning.
[0101]
Although the above-described optical scanning means performs two-dimensional scanning using a piezoelectric element, even in the case of the gimbal mirror structure employed in the first embodiment, a hole is provided at the center of the ground in the gimbal mirror structure. Is provided to fix the distal end of the optical fiber 17a, so that the light is two-dimensionally transmitted almost in the same manner as described in the first or second embodiment without using the fixed mirror 25. A scanning structure can be used. This content is disclosed in FIGS. 16 to 19 in JP-A-2001-076696.
[0102]
(Third embodiment)
Next, a third embodiment of the present invention will be described. In the present embodiment, fluorescence detection is performed using a microbio spot as a sample spot, and is an apparatus for obtaining desired information by optically scanning a large number of sampled tissue sections at high speed.
More specifically, a tissue specimen array in which hundreds of tissue sections are mounted on one slide is prepared, and function-specific staining such as tissue immunostaining can be performed on many specimens at once. Since a large number of almost identical slides can be obtained from the same specimen, various stainings can be performed on many specimens.
[0103]
FIG. 14 shows the configuration of the peripheral portion of the optical probe unit according to the third embodiment. In FIG. 14, a tissue sample array 91 is arranged in place of the DNA array 55 in FIG. 10, and a tissue section 92 arranged in the tissue sample array 91 is optically scanned to detect fluorescence from each of them, and the fluorescence is detected. The information added or associated with the information can be obtained. In FIG. 14, observation ranges 57a, 57b and the like are indicated by the same reference numeral 57 in a simplified manner.
The method for manufacturing the tissue specimen array 91 and the method for fluorescent labeling in this case will be described with reference to FIG.
[0104]
FIG. 15A shows a plurality of small-diameter pipes 93 to be sampled, and as shown in FIG. 15B, a plurality of pipes 93 are driven into the tissues 94A and 94B to be examined. Then, pipes A1, A2, A3 and B1, B2, B3 each containing a cylindrical structure having an appropriate thickness in each pipe 93 are formed. In addition, a similar pipe from another organization (not shown) is formed.
[0105]
Then, as shown in FIG. 15 (C), these pipes A1, A2, A3,... Are fixed in a state of being bundled with an adhesive (not shown) or the like, and then sliced thinly with a cutting machine or the like, and the tissue section 92A or A large number of tissue specimen arrays 91 in which 92B (represented simply by reference numeral 92 in FIG. 14) are arranged can be prepared (prepared).
[0106]
Then, in the tissue specimen array 91 prepared in this way, for example, the tissue specimen array 91A shown in FIG. 15 (D) which has been subjected to fluorescent immunostaining of p53 protein is placed on the cover glass 2 and optically scanned as shown in FIG. Thus, p53 protein fluorescent immunological information for each tissue section 92 can be obtained.
[0107]
Further, as shown in FIG. 15 (E), a tissue specimen array 91B processed by FISH (Fluorescence in situ hybridization) so as to detect K-ras gene expression is placed on the cover glass 2, and the first or second embodiment is performed. The corresponding information can be obtained by performing optical scanning with the optical scanning device described in the embodiment.
[0108]
In the above, the case of the tissue specimen array 91 for the cell section 92 has been described, but the present invention may be applied to the case of a cell culture container 96 as shown in FIG.
[0109]
As shown in FIG. 16, minute cells 97 are arranged in a cell culture vessel 96 in a 12-dimensional manner, and fluorescence sampling is performed on the cells cultured in each cell 97, and the optical scanning described in the first or second embodiment is performed. Optical scanning with the device can also provide information related to fluorescence sampling.
[0110]
In the above description, the probe unit 3 side is attached to the XY scanning stage 5 and the probe unit 3 side is roughly moved, but the subject side on which the DNA array 55 is arranged is moved by the XY scanning stage 5. You may make it coarsely move.
[0111]
For example, in FIG. 6, after scanning the observation ranges 57 a, 57 b, and 57 c on the probe unit 3 side, instead of moving the probe unit 3 by the XY scanning stage 5 to the lower side in FIG. It is apparent that the movement control may be performed such that the slide glass 2 side on which is disposed is moved upward by the movement amount Y1 in FIG.
[0112]
Note that the optical scanning probe 3I shown in FIG. 4 or the like may have a shorter sheath length or a portion near the base end of the distal end portion 21 in FIG. 2 may be the rear end of the optical scanning probe. In this case, in FIG. 4 or FIG. 5, the fine movement actuator 51I for performing minute (high-definition) positioning in three axial directions is provided at the rear end of the optical scanning probe 3I, but near the front end side (for example, the base end of the front end portion). (Nearby).
Note that embodiments and the like configured by partially combining the above-described embodiments and the like also belong to the present invention.
[0113]
[Appendix]
1. An optical scanning device for detecting fluorescence from a plurality of sample spots, particularly microgene spots or microbio spots,
The sample spot is disposed on a substrate,
A light source,
Light-collecting means for condensing and emitting light from the light source to the test portion,
An optical scanning unit that two-dimensionally scans a focal point condensed on the part to be measured by the condensing unit in a direction orthogonal to an optical axis direction of the condensing unit;
Having light detection means for detecting return light from the test portion,
Having a plurality of the light scanning means;
An optical scanning device, comprising: an automatic positioning unit that performs automatic positioning of the optical scanning unit with at least one degree of freedom.
[0114]
1.1. In Appendix 1, one degree of freedom moves in the optical axis direction.
1.1.1. In Appendix 1.1, the automatic positioning means makes the focused focal point substantially coincide with the sample surface.
1.1.1.1. Appendix 1.1.1, wherein the optical scanning means is driven by the automatic positioning means at a position where the reflected light from the sample is maximized.
[0115]
1.1.1.2. In the supplementary note 1.1.1, there is provided a fine movement positioning means which moves in a direction perpendicular to the optical axis direction.
1.2. In Supplementary Note 1, the plurality of optical scanning units have independent automatic positioning units each having at least one degree of freedom.
1.3. In Appendix 1, a plurality of optical scanning means reads a sample spot on a single substrate.
1.4. In Appendix 1, a plurality of optical scanning means respectively read sample spots on independent substrates.
[0116]
1.5. 2. The apparatus according to claim 1, further comprising a coarse positioning means for simultaneously changing positions of the plurality of optical scanning means on the sample surface.
1.6. Appendix 1, wherein the optical scanning means has a micromachine mirror.
1.7. In Appendix 1,
Having an optical fiber for guiding the light from the light source to the light collecting means,
It has a separation unit that separates the return light from the test section from the optical path from the light source, and detects the light separated by the separation unit with the light detection unit,
The optical fiber and the light collecting means are confocal or near confocal.
[0117]
1.7.1. In addition 1.7, the optical fiber which guided the light source light is branched by an optical coupler and guided to a plurality of optical scanning means.
1.8. Appendix 1 At
The apparatus has a plurality of wavelength selecting means for dividing return light from the subject by wavelength, and a plurality of optical scanning means.
1.8.1. Appendix 1.8, there is provided a reflected light detecting means for directly detecting a part of the return light.
[0118]
1.9. In Appendix 1,
This is a fluorescent probe in which a sample spot is arranged at a predetermined position on a substrate.
1.9.1. In Supplementary Note 1.9, the fluorescent probe is a DNA probe.
1.9.2. In Supplementary Note 1.9, the fluorescent probe is an antibody probe.
1.9.3. In Supplementary Note 1.9, the fluorescent probe is a protein probe.
1.10. In Supplementary Note 1, the sample spot is a tissue section arranged at a predetermined position on the substrate.
[0119]
1.11. In Supplementary Note 1, the sample spot is a set of cells arranged at a predetermined position on the substrate.
1.11.1. In Supplementary Note 1.11, there is a cell for arranging cells at a position defined on the base material.
[0120]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, since the optical scanning means is provided with the automatic positioning means for performing the automatic positioning of at least one degree of freedom, the optical scanning means is automatically positioned in the optical axis direction of the condensing means or the like. By optically scanning the sample spot at high speed, it is possible to read out the fluorescence information from the sample spot while suppressing variations in detection characteristics.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an overall configuration diagram of an optical scanning device according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a longitudinal sectional view showing a configuration of an optical scanning optical system on the distal end side of the optical scanning probe.
FIG. 3 is a front view showing the configuration of the scanner in FIG. 2;
FIG. 4 is a view showing a coarse actuator and the like for positioning and holding a probe unit.
FIG. 5 is a diagram showing a configuration of a fine movement actuator provided near a base end of the optical scanning probe.
FIG. 6 is an explanatory diagram showing a state of a scanning method using sample spots arranged on a DNA array.
FIG. 7 is a flowchart showing an example of a process of positioning a three-dimensional position before actually performing optical scanning.
FIG. 8 is a view showing a state in which different optical arrays are scanned by different optical scanning probes.
FIG. 9 is a view showing a scanning method using sample spots arranged on a DNA array in the case of FIG. 8;
FIG. 10 is a perspective view showing a main part when optical scanning is performed by positioning and holding the optical scanning probe two-dimensionally.
FIG. 11 is a configuration diagram of a main part in an optical scanning device according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 12 is a vertical cross-sectional view showing the configuration on the distal end side of the optical scanning probe.
FIG. 13 is a perspective view showing the optical scanning optical unit in FIG. 12;
FIG. 14 is a perspective view showing a peripheral portion of a probe unit according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 15 is an explanatory diagram of a manufacturing method for preparing a large number of tissue specimen arrays.
FIG. 16 is a perspective view showing a cell culture container in which a number of cultured cell cells are arranged.
[Explanation of symbols]
1. Optical scanning device
2 ... Slide glass
3. Probe unit
3A-3C: Optical scanning probe
4 positioning means
5 XY scanning stage
6. XY scanning stage driving device
7A to 7C ... Detection unit
8 ... PC
9 Monitor
10. Data holding device
11a ... Ar laser
12a-12c ... Dichroic mirror
14a-14d: Optical fiber
17a ... Optical fiber
19 ... Optical scanning optical system
21 ... Tip
23 ... Scanner (scan mirror)
27 ... Focus
30 ... Scanner driving device
40 ... light detection section
42 ... Half mirror
43a-43c ... Dichroic mirror
44a-44c ... PMT
45a-45d ... A / D converter
46 Photodetector (PD)
51A ... fine movement actuator
52 Voice coil motor
55 ... DNA array
61, 62 ... bimorph piezoelectric element
63… Laminated piezoelectric element
65 ... Sample spot
57a-57c ... observation range

Claims (1)

複数の試料スポット、特に微少遺伝子スポットまたはマイクロバイオスポットからの蛍光を検出するための光走査装置であって、
前記試料スポットが基材上に配置され、
光源と、
光源からの光を被検部に対し集光出射する集光手段と、
前記集光手段によって被検部側に集光された焦点を該集光手段の光軸方向と直交する方向に2次元的に走査する光走査手段と、
前記光走査手段を複数有すると共に、
前記被検部からの戻り光を検出する光検出手段を有し、
前記光走査手段を少なくとも1自由度の自動位置決めを行う自動位置決め手段を有することを特徴とする光走査装置。
An optical scanning device for detecting fluorescence from a plurality of sample spots, particularly microgene spots or microbio spots,
The sample spot is disposed on a substrate,
A light source,
Light-collecting means for condensing and emitting light from the light source to the test portion,
An optical scanning unit that two-dimensionally scans a focal point condensed on the part to be measured by the condensing unit in a direction orthogonal to an optical axis direction of the condensing unit;
Having a plurality of the light scanning means;
Having light detection means for detecting return light from the test portion,
An optical scanning device, comprising: an automatic positioning unit that performs automatic positioning of the optical scanning unit with at least one degree of freedom.
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