JP2004257901A

JP2004257901A - Nucleic acid detection method using scattered light

Info

Publication number: JP2004257901A
Application number: JP2003049916A
Authority: JP
Inventors: Yasuyoshi Mori; 安義森; Shiyousuu Kitao; 昌崇北尾; Makoto Suzuki; 鈴木　　誠; Hiroshi Satozono; 浩里園
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK; Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK; Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: JP4133437B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a detection method for detecting a trace of nucleic acid simply with high sensitivity irrespective of its chain length by using scattered light. <P>SOLUTION: This method for detecting nucleic acid is characterized in that a target sequence is detected by using scattered light generated when irradiation light is applied to a nucleic acid having a repeat structure that includes the target sequence and a sequence complementary thereto repeatedly once or more times on a same chain. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、散乱光を利用した核酸検出方法に関する。より詳細には、標的配列をＬＡＭＰ増幅し、得られるリピート構造を有する核酸を散乱光を利用して検出する核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、散乱光を利用して高分子やコロイドの分子量を測定する方法は公知である。例えば、大塚電子（株）製のスタティック光散乱光度計ＳＬＳ−６０００シリーズは、タンパク、核酸、ウイルス等の生体高分子や各種合成高分子の分子量測定、または高分子相分離現象解析を行うことができる。また、核酸分子を不溶化し、この不溶化した核酸分子に光を照射して、生じる散乱光から該核酸分子の大きさを分析する方法も開発されている（例えば、特許文献１等参照）。
【０００３】
しかし、核酸の場合、散乱光を用いた分析では、分子量が小さい短鎖の核酸分子では著しく感度が悪くなる。そのため、前述の方法で測定対象とされる核酸分子は十分に大きなものでなければならず、例えば、不溶化核酸分子の分析方法では、直径５０ｎｍ〜２００ｎｍ前後の核酸沈殿物が用いられている。したがって、ＰＣＲで得られるような短い核酸増幅産物は、光散乱法による検出には不向きである。
【０００４】
一方、発明者らは、ＰＣＲ法で不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の開発に成功している（例えば、特許文献２及び非特許文献１参照）。ＬＡＭＰ法では、特有のプライマーを用いることで、同一鎖上末端に互いに相補的な配列を有する増幅産物が生成する。生成した増幅産物は、相補的配列間のアニールによって形成されるループを起点とした伸長反応と、このループにアニールする別なプライマー（ループプライマー）による伸長反応によって、リピート構造（同一鎖上に互いに相補的な配列が繰り返し含まれる構造）を有する長鎖の増幅産物を生成する。発明者らは、このＬＡＭＰ法の高い増幅効率を利用して、目視（濁度）による遺伝子の検出方法等（例えば、非特許文献２参照）を報告している。しかし、この方法では、核酸増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの沈澱を検出するため、沈澱がまだ形成されていないような増幅初期段階で核酸検出を行うことはできない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平９−６８５２５２号（特許２９７３８８７号）
【特許文献２】
国際公開００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献１】
納富継宣ら（ＴｓｕｇｕｎｏｒｉＮｏｔｏｍｉｅｔａｌ．），「Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡ．」，ヌクレイックアシッドリサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．），Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２：ｅ６３，（２０００）
【非特許文献２】
森安義、長嶺憲太郎ら，「ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＬｏｏｐ−ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎｂｙＴｕｒｂｉｄｉｔｙＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＭａｇｎｅｓｉｕｍＰｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅＦｏｒｍａｔｉｏｎ．」，バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｖｏｌ．２８９，Ｎｏ．１，１５０−１５４，（２００１）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、散乱光を利用して、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出しうる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、標的配列のＬＡＭＰ増幅で得られるような、リピート構造を有する核酸は、光散乱法によって感度よく検出しうることを見出した。そして、この方法を利用すれば、微量検体を高感度に検出できるばかりか、増幅産物のリアルタイムモニタリングやＳＮＰ等の多型検出も可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１０）を提供する。
（１）標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して該標的配列を検出することを特徴とする、核酸検出方法。
（２）リピート構造を有する核酸が、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いた増幅法によって提供される、上記（１）記載の方法。
（ａ）鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（３）増幅法がＬＡＭＰ法である、上記（２）記載の方法。
（４）以下の工程を含む、核酸検出方法：
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して、上記標的配列を検出する工程。
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法において、散乱光をリアルタイムモニタリングすることを特徴とする、核酸検出方法。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法において、リピート構造を有する核酸を標的配列を特異的に切断しうる制限酵素で処理し、その処理後の核酸から生じる散乱光を処理しない場合と比較して、該標的配列の有無を判断することを特徴とする、核酸検出方法。
（７）上記（６）記載の方法を利用して標的配列上の多型を検出することを特徴とする、核酸検出方法。
（８）以下の工程を含む上記（７）記載の方法：
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸を、標的配列上の多型部位を特異的に切断しうる制限酵素で処理する工程；
３）上記制限酵素処理後の核酸に照射光をあて、生じる散乱光を制限酵素で処理しない場合と比較し、上記標的配列上に多型が存在するか否かを判断する工程。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法に利用されるキットであって、以下のｉ）〜ｉｖ）の少なくとも一つ以上を含むことを特徴とする、前記キット。
ｉ）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のインナープライマー
（ａ）鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
ｉｉ）以下の（ｃ）及び／又は（ｄ）のアウタープライマー
（ｃ）鋳型核酸鎖上の任意配列Ｆ２ｃよりも３’末端方向に任意配列Ｆ３ｃを選択したとき、該Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー
（ｄ）鋳型核酸鎖上の任意配列Ｒ２よりも５’末端方向に任意配列Ｒ３を選択したとき、該Ｒ３と同一の配列を含むプライマー
ｉｉｉ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼ
ｉｖ）要素ｉｉｉ）の基質となるヌクレオチド
（１０）さらに、以下の（ｅ）及び／又は（ｆ）のループプライマーを含む、上記（９）記載のキット。
（ｅ）インナープライマー上のＦ１ｃ及びＦ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
（ｆ）インナープライマー上のＲ１ｃ及びＲ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して該標的配列を検出することを特徴とする核酸検出方法、および該方法を利用した多型の検出方法、ならびにこれら方法のためのキットに関する。
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．用語の定義
核酸：本明細書中における「核酸」は天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。該核酸には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びＰＮＡ等の全てを含むものとする。また１本鎖核酸及び２本鎖核酸の双方を含むものとする。さらに、部分的に修飾された、あるいは全体が完全に人工的構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）という用語も、核酸に含まれる。なお、本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。
【００１１】
標的配列：本明細書中における「標的配列」又は「標的核酸」とは、検出すべき核酸配列又は核酸分子を意味する。また、標的配列とは、標的核酸の塩基配列を意味する。
【００１２】
リピート構造：本発明にかかる「リピート（反復）構造」とは、特定の配列が同一鎖上に（縦列して）繰り返し含まれる構造であるが、特に本明細書中においては、互いに相補的な２つの配列が同一鎖上に繰り返し含まれる構造を意味するものとする。このリピート構造については、次項で詳述する。
【００１３】
鋳型と相補鎖：本明細書中における「鋳型」とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。
【００１４】
鋳型核酸：本発明において「鋳型核酸」とは、本来の検出対象であって、その分子中に標的配列を含み、リピート構造を有する核酸増幅産物調製やそのためのプライマー設計の基礎となる核酸を意味する。
【００１５】
ハイブリダイズ：「ハイブリダイズ」と「アニール」とは、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく相補的塩基対結合によって２本鎖を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が同一鎖上にあっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、ハイブリダイズ、あるいはアニールである。本発明において、ハイブリダイズとアニールは、核酸が塩基対結合による２本鎖構造を構成する点で同義である。
【００１６】
２．リピート構造を有する核酸
２．１リピート構造
本発明の方法で用いられるリピート構造を有する核酸は、「標的配列とこれに相補的な配列が縦列した構造」を同一鎖上に１回又は２回以上反復して含む。
【００１７】
本発明のリピート構造を有する核酸の鎖長は、特に限定されないが、通常少なくとも１００塩基長以上、平均１０００塩基長程度が好ましい。これは、核酸の鎖長が長いほど散乱光の強度が高く、高感度な検出が可能になるためである。
【００１８】
また、前記リピート構造を有する核酸中に含まれる「標的配列とこれに相補的な配列が縦列した構造」の反復数は特に限定されないが、通常少なくとも１〜１０回程度、平均１０回以上が好ましい。該核酸中に含まれる標的配列の数が多いほど、散乱光の強度が高く、高感度な検出が可能になるためである。
【００１９】
なお、リピート構造を有する核酸は、後述するような核酸増幅反応によって提供されるものであるため、必ずしも均一ではなく、様々な鎖長、増幅率のものが含まれる。したがって、上記鎖長や反復数の好ましい数値については、「平均」という表現を用いるものとする（なお、平均は通常の相加平均を意味する）。
【００２０】
本発明のリピート構造を有する核酸中に含まれる「標的配列」は、検出対象とする核酸（ゲノム遺伝子やｍＲＮＡ）の一部であっても、全部であってもよい。含まれる領域は、検出対象とする核酸に特異的な配列を選択して用いることが好ましく、例えば、構造遺伝子ならば繰り返し配列を含まない、ｍＲＮＡ３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分、多型解析であれば当該多型近傍部位等を好適に用いることができる。
【００２１】
また「これに相補的な配列」とは、例えば、５’−ａｇｔｔｃａｔｃ−３’に対して、その相補的配列３’−ｔｃａａｇｔａｇ−５’を意味するが、これらは同一鎖上に含まれるため、後者は５’−ｇａｔｇａａｃｔ−３’として逆方向に配置される。この意味で、本発明のリピート構造はインバーテッドリピート（逆反復）ともいえる。この互いに相補的な２つの配列は少なくとも一部において、鎖内アニール（同一鎖内でアニール）することによってループ構造を形成しうる。そして、このループ形成は本発明のリピート構造を有する核酸に特異な２次（あるいは３次）構造を与える。例えば、同一鎖上の両端にループが形成されると、本発明のリピート構造を有する核酸はダンベル型構造となり、同一鎖上に多数のループが形成されれば、該リピート構造を有する核酸はカリフラワー型構造となる。本発明のリピート構造を有する核酸が、散乱光によって高感度で検出しうるのは、その長い鎖長と標的配列の高い反復数（高い増幅効率）に加えて、このような特異な構造が寄与していると考えられる。
【００２２】
２．２リピート構造を有する核酸の調製
本発明のリピート構造を有する核酸は、本来の検出対象であるゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等を鋳型核酸として用い、その少なくとも一部を標的配列として、調製することができる。調製方法は特に限定されず、化学的合成等の公知の核酸合成法や、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法等の公知の核酸増幅法を適宜選択しうるが、後述するＸ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法（例えば、ＬＡＭＰ法等）を利用すれば、効率的に調製することができる。
【００２３】
（１）Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法
Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーは、具体的には以下のようにして設計する。
（ａ）鋳型核酸鎖上の標的配列の３’側から当該鋳型核酸鎖上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）鋳型核酸鎖上の標的配列の５’側から当該鋳型核酸鎖上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
【００２４】
なお、上記プライマーは（ａ）（ｂ）をペアとして用いてもよいし、（ａ）（ｂ）どちらか一方と通常のプライマーをペアにして用いてもよい。
増幅反応は、例えば上記プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド基質及びＤＮＡ（ＲＮＡ）ポリメラーゼを用いて、通常のＰＣＲ法により達成できる。
【００２５】
さらに、前記増幅反応はポリメラーゼとして鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば、等温条件下で行うこともできる。これは、プライマーがＸ１ｃ＋Ｘ２の構造を有するため、該プライマーからの伸長生成物はＸ１ｃ＋（Ｘ２＋）Ｘ１の相補的配列（下線部）を含み、これが鎖内アニールして、合成された２本鎖核酸上に１本鎖部分を生成するためである。すなわち、２本鎖を高温で解離させなくとも、伸長生成物上には鎖内アニールによる新たな鎖置換反応の開始点が与えられる。この反応の概略は後述するＬＡＭＰ法を参照されたい。
【００２６】
なお、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）等が挙げられる。
【００２７】
（２）ＬＡＭＰ法
１）ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法の概要
前記増幅法の好適な態様として、ＬＡＭＰ法による増幅法を用いることができる。「ＬＡＭＰ法」とは本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、２種、４種或いは６種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（６５℃前後）でＤＮＡ又はＲＮＡを迅速かつ安価に増幅する方法である。ＬＡＭＰ法の概要については、文献：Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔｅｔａｌ．：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８（１２）：ｅ６３（２０００）、特許：国際公開ＷＯ００／２８０８２号、あるいは栄研化学（株）ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／）を参照されたい。
【００２８】
ＬＡＭＰ法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、ＬＡＭＰ法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、本発明で用いられるリピート構造を有する核酸を効率的に合成できる。
【００２９】
２）ＬＡＭＰ法用プライマー
ＬＡＭＰ法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
【００３０】
インナープライマーとはＬＡＭＰ法に必須のプライマーであって、鋳型ＤＮＡのそれぞれの鎖において、３’側に存在する任意配列Ｘ２ｃ、これより５’側の任意配列Ｘ１ｃを選択したとき、該Ｘ２ｃに相補的配列Ｘ２と該Ｘ１ｃと同一の配列Ｘ１ｃを３’側から５’側にこの順で含む（Ｘ１ｃ＋Ｘ２の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のＸ２は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、Ｘ１ｃは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
【００３１】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（すなわち鋳型の３’側）の任意配列Ｘ３ｃに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
【００３２】
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記Ｘ１（Ｘ１ｃ）、Ｘ２（Ｘ２ｃ）、Ｘ３（Ｘ３ｃ）の長さは５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。
【００３３】
上記インナープライマー及びアウタープライマーは、２本鎖（Ｆ及びＲ）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（Ｆ１ｃ＋Ｆ２、Ｒ１ｃ＋Ｒ２）、アウタープライマー（Ｆ３、Ｒ３）の各々２種が設計される。
【００３４】
各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列及びＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列及びＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
【００３５】
また、ループプライマーとは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはＬＡＭＰ法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。
【００３６】
３）増幅用鋳型核酸
ＬＡＭＰ法で用いられる増幅用鋳型核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、組織又は細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、及び当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の５’側及び３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは３０〜５００塩基である。
【００３７】
４）反応条件
一連の反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２あるいは（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４等が、酵素の活性維持とＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度（Ｔｍ）調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
【００３８】
５）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）インナープライマー２種、或いはさらにアウタープライマー２種、或いはさらにループプライマー２種
（ｉｉ）鎖置換型ポリメラーゼ
（ｉｉｉ）基質ヌクレオチド
【００３９】
３．核酸検出方法の具体的手順
本発明における、リピート構造を有する核酸の調製から検出までの具体的な手順は以下の工程を含む。
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ法等を用いて増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して、上記標的配列を検出する工程。
【００４０】
３．１標的配列の増幅
まず、鋳型核酸上の標的配列を増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る。
【００４１】
例えば、生物試料中の特定遺伝子の検出であれば、周知の方法に従って細胞より全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡとして増幅してリピート構造を有する核酸を調製してもよい。解析対象とする核酸量が少ない場合には、さらに前記ｃＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってｃＲＮＡとして増幅して用いてもよい。増幅方法としては、前述したＸ１ｃ＋Ｘ２の構造を有するプライマーを用いた増幅反応や、ＬＡＭＰ法を好適に用いることができる。
【００４２】
３．２散乱光による標的配列の検出
散乱光の検出のため、リピート構造を有する核酸を含む試料をセルに入れ、その一面に光源からの照射光をあてる。セルは、通常の分析に用いられるような、ガラス、石英等の透明材料からなる方形セルを用いることができる。前記セルは、静止セルでもフローセルでもよい。また、照射光の光源は特に限定されず、Ｈｅ−Ｎａレーザー光源、Ａｒレーザー光源、またはこれらを組み合わなど、散乱光検出に通常用いられるものを使用することができる。試料への光照射は、直接であってもよいし、ミラー、フィルター、集光レンズ、偏光素子あるいは光ファイバ等を通して行っても良い。
【００４３】
散乱光検出器は、光源からの光を受ける面とは別なセルの一面（側方または後方）に配置され、試料から生じる散乱光を直接、あるいは、偏光素子、集光レンズ、ピンホール、光ファイバ等を通して検出する。散乱光の検出は、微弱光を感度良く検出できる、フォトンカウンティング法を利用したシステムが好ましい。検出された光は、通常、検出器に付属したソフトを用いてリアルタイムで処理解析することができる。このような散乱光検出のための光源、検出器（フォトンカウンター等）は、既に当該技術分野で周知のものであり、市販のものを（大塚電子製、島津製作所製等）を好適に利用することができる。
【００４４】
４．散乱光検出装置
図１に、本発明の核酸検出方法のために利用しうる装置の一例を示す。この装置は、大きく、光源、反応部（試料挿入部、ホットプレート等）、検出部（散乱光検出器、カウンタメモリ等）からなり、光源と反応部、反応部と検出部はそれぞれ光ファイバＡ及びＢで連結されている。試料挿入部にはセルに入れられた試料が挿入され、光ファイバＡを通して光源からの照射光があてられる。セルは、入射光の入射および散乱光の検出を妨げないように設計したヒートブロックによって保持される。ヒートブロックは温度コントローラーによって温度制御され、セル中の反応液を所定の温度に保持することができる。なお、反応液は加熱による揮発防止のため、ミネラルオイル等を重層することが好ましい。散乱光は、入射光に対して例えば９０°方向の散乱光を光ファイバＢを通して検出、解析される。
【００４５】
上記装置は例示であって、本発明の実施には、生体高分子等の分子量測定に用いられる他の市販の光散乱光度計（大塚電子製、スタティック光散乱光度計ＳＬＳ−６０００シリーズ等）等を利用することもできる。
【００４６】
５．標的配列の核酸検出方法用キット
本発明はまた、本発明の検出方法に用いられるキットを提供する。該キットは、以下のｉ）〜ｉｖ）の少なくとも一つ以上を含む。
【００４７】
ｉ）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のインナープライマー
（ａ）鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
ｉｉ）以下の（ｃ）及び／又は（ｄ）のアウタープライマー
（ｃ）鋳型核酸鎖上の任意配列Ｆ２ｃよりも３’末端方向に任意配列Ｆ３ｃを選択したとき、該Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー
（ｄ）鋳型核酸鎖上の任意配列Ｒ２よりも５’末端方向に任意配列Ｒ３を選択したとき、該Ｒ３と同一の配列を含むプライマー
ｉｉｉ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼ
ｉｖ）要素ｉｉｉ）の基質となるヌクレオチド
上記キットは、ＬＡＭＰ増幅をより効率的に進めるために、以下の（ｅ）及び／又は（ｆ）のループプライマーをさらに含んでいてもよい。
（ｅ）インナープライマー上のＦ１ｃ及びＦ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
（ｆ）インナープライマー上のＲ１ｃ及びＲ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
【００４８】
本発明のキットには、上記必須構成要素のほか、必要に応じて融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド等）、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な他の試薬類を含んでいても良い。さらに、該キットは、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給するものであってもよい。
前記キットはまた、次項に説明する制限酵素処理の有無や、多型の検出方法のためにも用いられる。
【００４９】
６．本発明の検出方法の利用
６．１ＬＡＭＰ産物のリアルタイムモニタリング
本発明はＬＡＭＰ反応と組み合わせることによって、微量核酸の測定、特にＬＡＭＰ産物のリアルタイムモニタリングに使用できる。ＬＡＭＰ産物は、反応副産物であるピロリン酸マグネシウムによる反応液の白濁を利用して、目視により検出することも可能である（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｖｏｌ．２８９，Ｎｏ．１，１５０−１５４，（２００１））。しかしながら、合成されたＤＮＡそのものに基づく散乱光を利用した本発明の検出方法は、増幅反応副産物であるピロリン酸マグネシウムを検出する前記方法よりも信頼性が高く、迅速性にも優れている。すなわち、本発明の方法は、沈澱が生じていないＬＡＭＰ反応初期段階での微量増幅ＤＮＡ分子を高感度に検出することができる。
【００５０】
６．２制限酵素消化の検出
また、本発明の方法は、制限酵素処理の有無を電気泳動等の煩雑な操作を行うことなく、簡便に検出することができる。すなわち、標的配列に制限酵素サイトが含まれている場合、リピート構造を有するＬＡＭＰ産物ではその構造中に多数の制限酵素サイトが含まれることになる。したがって、制限酵素消化を受けると著しく分子量が減少し、これは散乱光の減少となって明確に観察される。こうした効果は、ＰＣＲ産物のような単純な増幅産物ではみられない。
【００５１】
このような制限酵素消化の有無の検出は、（１）増幅反応の特異性の検証、（２）マルチプレックスＬＡＭＰ（同一チューブ内で複数のＬＡＭＰ産物を増幅する場合）による、増幅核酸の確認のほか、次項に説明する（３）多型（ＳＮＰ等）の検出に利用できる。
【００５２】
６．３多型（ＳＮＰ等）の検出
本発明の方法を利用することにより、標的配列上の多型の検出を行うことができる。該方法は、例えば以下の工程を含む。
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸を、標的配列上の多型部位を特異的に切断しうる制限酵素で処理する工程；
３）上記制限酵素処理後の核酸に照射光をあて、生じる散乱光を制限酵素で処理しない場合と比較し、上記標的配列上に多型が存在するか否かを判断する工程。上記多型にはＳＮＰも含まれる。
【００５３】
本発明の検出方法は、散乱光を利用して、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出することができる。この方法は処理の自動化やリアルタイムモニタリングも可能であることから、生物試料中に含まれる微量な遺伝子の検出やＳＮＰを含む多型の検出等、種々の核酸の検出への応用が期待される。
【００５４】
高分子であるＤＮＡが光を散乱することは公知の事実であるが、遺伝子増幅反応を散乱光測定によって検出する方法は、これまで報告されていない。これはおそらく、散乱光測定に有利な長鎖のＤＮＡを多量に精度良く合成できる増幅法がなかったためと推測される（たとえばＰＣＲの増幅効率は、ＬＡＭＰより２桁悪く、特異性も悪い）。本発明の方法は、リピート構造というＬＡＭＰ産物の特徴を生かし、生物試料中の微量遺伝子をその鎖長にかかわらず高感度に検出できるばかりか、制限酵素反応の有無やＳＮＰ等の多型の検出にも利用できる。また、本発明によれば、核酸増幅反応の検出と、その産物の検証を一度に行う方法、あるいはそのための装置も提供される。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例１〕散乱光測定によるＬＡＭＰ反応のモニタリング
１．試験方法
（１）ＬＡＭＰ反応
ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔ；配列番号１）を鋳型に、以下のＬＡＭＰプライマーを用いて、ＬＡＭＰ反応を行った。ＬＡＭＰ反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、表１に示す反応液組成にて、６０℃、４０分反応させた。
ＰＳＡ用ＬＡＭＰプライマー：
ＦＩＰ；５’−ＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２）
ＲＩＰ；５’−ＴＧＣＴＧＧＧＴＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧ−３’（配列番号３）
Ｆ３；５’−ＴＧＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＧ−３’（配列番号４）
Ｒ３；５’−ＧＧＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧ−３’（配列番号５）
（ＦＩＰ、ＲＩＰはそれぞれＦｏｒｗａｒｄＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒ、ＲｅｖｅｒｅｓｅＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒを、Ｆ３、Ｒ３はそれぞれＦｏｒｗａｒｄＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ、ＲｅｖｅｒｓｅＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒを示す。）
【００５７】
【表１】

【００５８】
（２）散乱光測定
浜松ホトニクス株式会社が、図１に示すような散乱光検出装置を作製した。前項で調整したＬＡＭＰ反応液の散乱光をこの装置を用いて測定した。光源としては、５０ワットの白色キセノンランプを用い、直径１ｍｍφの光ファイバーＡを通して、全ての波長の光をサンプルに照射した。サンプル用セルとしては、３ｍｍ×３ｍｍ角の方形セル（石英製）を用いた。セルは、入射光の入射および散乱光の検出を妨げないように設計したヒートブロックによって保持されるが、このヒートブロックを加熱することで、セル中の反応液を所定の温度に保持することができる。なお、反応液には、揮発防止のためにミネラルオイルを重層した。検出は、入射光に対して９０°方向の散乱光を、光ファイバＢを通して高感度光電子増倍管を用いてフォトンカウンティング法で検出した。
【００５９】
〔実施例２〕散乱光の由来確認
１．試験方法
観察されている散乱光が、ピロリン酸マグネシウムの沈澱に由来するのか、ＬＡＭＰ産物（長鎖ＤＮＡ分子）に由来するのかを次のようにして確認した。
【００６０】
耐熱性Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｐｐａｓｅ）をＬＡＭＰ反応液に共存させておくと、ピロリン酸マグネシウムの沈殿が生成しないことがわかっている。そこで、Ｐｐａｓｅ（２０ｍＵＴｔｈＰｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ；Ｒｏｃｈｅ社製）共存下で、実施例１と同様にＬＡＭＰ反応を行い、実施例１の結果と比較した。結果を図２に示す。
【００６１】
２．試験結果
Ｐｐａｓｅ無添加の場合、反応開始後約１０分から１５分の間で穏やかな散乱光増加がみられ、約１７分（図中矢印）から爆発的な散乱光の増加がみられた。Ｐｐａｓｅを添加した場合、約１０分から１５分の間の穏やかな散乱光増加はみられたが、１７分からの爆発的な散乱光増加は観察されなかった。したがって、１７分からの爆発的な散乱光増加は、ピロリン酸マグネシウムの沈殿生成に由来しており、約１０分からみられる穏やかな散乱光増加は、長鎖ＤＮＡ（ＬＡＭＰ産物）に由来していると考えられた。この結果から、ピロリン酸マグネシウムからの散乱光を検出するよりも、ＬＡＭＰ反応によって合成された長鎖ＤＮＡからの散乱光を検出する方が、迅速性に優れていることが確認された。
【００６２】
〔実施例３〕散乱光測定によるＬＡＭＰ産物の制限酵素消化反応のモニタリング
１．試験方法
増幅したＤＮＡを制限酵素処理することによって、その増幅反応の特異性を検証することが広く行われている。そこで、ＬＡＭＰ反応液にＬＡＭＰ産物を認識しない制限酵素：ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製；認識配列ＧＡＡＴＴＣ）、又はＬＡＭＰ産物を認識する制限酵素：Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製；認識配列ＧＡＴＣ）をそれぞれ同一ユニット数（５０Ｕ／ｔｕｂｅ）添加し、散乱光の変化をみた。なお、配列表の配列番号１に示されるＰＳＡの塩基配列中、ヌクレオチド番号２２８から２３１のＧＡＴＣ配列部分が、Ｓａｕ３ＡＩ認識部位にあたる。
【００６３】
また、酵素消化の有無を直接確認するため、各制限酵素反応後のサンプルについて、アガロースゲル電気泳動分析を行った。
【００６４】
２．試験結果
図３に示すように、ＥｃｏＲＩを添加しても、散乱光強度はほとんど変化しなかったが（散乱光強度の低下：３％）、Ｓａｕ３ＡＩを添加すると、散乱光強度が著しく減少した（散乱光強度の低下：３０％）。このことは、合成されたＤＮＡがＳａｕ３ＡＩによって消化され、断片化したために散乱効率が低下したためであり、ＬＡＭＰ反応液で観測される散乱光強度の増加がＬＡＭＰ反応によって合成された長鎖ＤＮＡによるものであることを示す。
【００６５】
図４に示すように、電気泳動の結果、ＥｃｏＲＩ処理後のサンプルの泳動パターン（レーン２）は、制限酵素未処理のＬＡＭＰ産物の泳動パターン（レーン１）と一致し、Ｓａｕ３ＡＩ処理後のサンプルの泳動パターン（レーン３）には、分解されたＤＮＡ由来のバンド（図中矢印）が観察された。これにより、Ｓａｕ３ＡＩ処理による散乱光強度の低下は、Ｓａｕ３ＡＩによって長鎖ＤＮＡが断片化したためであることが証明された。
【００６６】
通常、制限酵素反応の有無はアガロース電気泳動という煩雑な操作によって調べられているが、本発明の方法を用いれば、散乱光測定によって増幅産物の制限酵素消化の有無を簡単にチューブ内で検出することができる。ＬＡＭＰ産物は、リピート構造を持つ長鎖ＤＮＡであるため、一本のＤＮＡの中に多数の制限酵素サイトを有している。そのため、制限酵素処理による分子量低下が著しく、散乱光強度の減少度も大きい。つまり、ＬＡＭＰ産物は、ＰＣＲ産物のような単純なＤＮＡよりも高感度に、酵素消化の有無を検出することができると考えられる。
【００６７】
〔実施例４〕散乱光測定によるＰＣＲ産物とＬＡＭＰ産物の検出結果の比較
１．試験方法
同一の標的配列について、そのＬＡＭＰ産物とＰＣＲ産物間で、散乱光測定による検出結果を比較した。ＬＡＭＰ反応は実施例１と同様の方法で実施し、ＰＣＲ反応はＬＡＭＰプライマーのアウタープライマーをプライマーとして用い、以下に示す反応液組成（表２）と反応条件で、一般的なプロトコールにしたがって実施した。
【００６８】
【表２】

【００６９】

【００７０】
２．試験結果
ＰＣＲ反応液では、バックグランド（蒸留水）に対する散乱光増加はほとんど観察されなかった。この結果から、増幅領域が同じ場合、リピート（インバーテッドリピート）構造の長鎖ＤＮＡを多量に合成するＬＡＭＰ反応のほうがＰＣＲ反応よりも散乱光検出に適していることが確認された。ＰＣＲ産物を効率よく散乱光で検出するためには、今回より長い領域を多量に増幅する必要があるが、それは一般的に非常に困難である。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、散乱光を利用して、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出することができる。また、この方法は処理の自動化やリアルタイムモニタリングも可能であることから、生物試料中に含まれる微量な遺伝子の検出やＳＮＰを含む多型の検出等、種々の核酸の検出への応用が期待される。
【００７２】
【配列表】

【００７３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号５−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法に使用するための散乱光検出器を示す図である。
【図２】図２は、光散乱法によるＬＡＭＰ産物（ＰＳＡ）のリアルタイム検出結果を示すグラフである。図中、上の曲線はＰＰａｓｅ無添加（ピロリン酸マグネシウム生成）、下の曲線はＰＰａｓｅ添加（ピロリン酸マグネシウム生成せず）の結果を示す。また、矢印は、ピロリン酸マグネシウム沈澱の検出開始点を示す。
【図３】図３は、ＬＡＭＰ産物の散乱光強度に及ぼす制限酵素処理の影響を示すグラフである。図中、上の曲線はＥｃｏＲＩ（ＰＳＡを認識しない酵素）、下の曲線はＳａｕ３ＡＩ（ＰＳＡを認識する酵素）による結果を示す。
【図４】図４は、制限酵素処理後の反応液の３％アガロース電気泳動結果を示す。図中左より、Ｍ：１００ｂｐラダー、１：制限酵素未処理ＬＡＭＰ反応液（ＰＳＡ）、２：ＥｃｏＲＩ処理後、３：Ｓａｕ３ＡＩ処理後。また、矢印はＳａｕ３ＡＩ反応産物のバンドを示す。
【図５】図５は、散乱光検出におけるＬＡＭＰ法とＰＣＲ法を比較した結果を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a nucleic acid detection method using scattered light. More specifically, the present invention relates to a nucleic acid detection method for amplifying a target sequence by LAMP and detecting a resulting nucleic acid having a repeat structure using scattered light.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, a method of measuring the molecular weight of a polymer or colloid using scattered light is known. For example, the SLS-6000 series static light scattering photometer manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd. is capable of measuring the molecular weight of biopolymers such as proteins, nucleic acids, viruses, and various synthetic polymers, or analyzing the polymer phase separation phenomenon. it can. Also, a method has been developed in which a nucleic acid molecule is insolubilized, the nucleic acid molecule thus insolubilized is irradiated with light, and the size of the nucleic acid molecule is analyzed from the scattered light generated (for example, see Patent Document 1).
[0003]
However, in the case of nucleic acids, in the analysis using scattered light, the sensitivity of a short-chain nucleic acid molecule having a small molecular weight is significantly lowered. Therefore, the nucleic acid molecule to be measured by the above-described method must be sufficiently large. For example, in a method for analyzing an insolubilized nucleic acid molecule, a nucleic acid precipitate having a diameter of about 50 nm to 200 nm is used. Therefore, short nucleic acid amplification products obtained by PCR are not suitable for detection by the light scattering method.
[0004]
On the other hand, the present inventors have succeeded in developing a new nucleic acid amplification method that does not require complicated temperature control that is indispensable in the PCR method: LAMP method (Loop-mediated isotherm amplification) (for example, Patent Document 2 and Non-Patent Document 1). In the LAMP method, an amplification product having sequences complementary to each other on the same chain end is generated by using a unique primer. The generated amplification product is subjected to an elongation reaction starting from a loop formed by annealing between complementary sequences and an elongation reaction using another primer (loop primer) that anneals to this loop, thereby forming a repeat structure (the one on the same strand). (A structure in which a complementary sequence is repeatedly contained). The present inventors have reported a method for detecting a gene by visual observation (turbidity) using the high amplification efficiency of the LAMP method (for example, see Non-Patent Document 2). However, according to this method, since the precipitate of magnesium pyrophosphate, which is a by-product of the nucleic acid amplification reaction, is detected, the nucleic acid cannot be detected at an early stage of amplification where a precipitate has not yet been formed.
[0005]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-688252 (Japanese Patent No. 2973887)
[Patent Document 2]
WO 00/28082 pamphlet
[Non-patent document 1]
Tsutsunori Notomi et al., "Loop-mediated isotherm amplification of DNA.", Nucleic Acids Res., Vol. 28, No. 12: e63, (2000)
[Non-patent document 2]
Yoshi Moriyasu, Kentaro Nagamine et al., "Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation.", Biochemical and Biophysical Research Communications (Biochemical and Biophysical Research Communications), Vol. 289, no. 1, 150-154, (2001)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a nucleic acid detection method capable of detecting a trace amount of a target to be detected with high sensitivity and simple regardless of its chain length by using scattered light.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have found that a nucleic acid having a repeat structure, which can be obtained by LAMP amplification of a target sequence, can be detected with high sensitivity by a light scattering method. The present inventors have found that this method not only enables detection of a trace amount of sample with high sensitivity, but also enables real-time monitoring of amplification products and detection of polymorphisms such as SNPs, and thus completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention provides the following (1) to (10).
(1) Irradiation light is applied to a nucleic acid having a repeat structure containing a target sequence and a sequence complementary thereto one or more times repeatedly on the same strand, and the target sequence is ligated using scattered light generated. A method for detecting a nucleic acid, comprising detecting the nucleic acid.
(2) The method according to (1) above, wherein the nucleic acid having a repeat structure is provided by an amplification method using the following primers (a) and / or (b).
(A) When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are sequentially selected from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the sequence is the same as the F1c. And a primer comprising, in this order, the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
(B) When the third optional sequence R1 and the fourth optional sequence R2 are selected in order from the 5 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5 ′ end on the template nucleic acid, the sequence is complementary to the R1. That contains the target sequence R1c and the same sequence R2 as the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order
(3) The method according to (2) above, wherein the amplification method is a LAMP method.
(4) A nucleic acid detection method comprising the following steps:
1) LAMP-amplifying a target sequence on a template nucleic acid to obtain a nucleic acid having a repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeatedly on the same strand once or twice or more;
2) a step of irradiating the nucleic acid having the repeat structure with irradiation light and detecting the target sequence by using the generated scattered light.
(5) The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the scattered light is monitored in real time.
(6) In the method according to any one of the above (1) to (5), a nucleic acid having a repeat structure is treated with a restriction enzyme capable of specifically cleaving a target sequence, and is generated from the nucleic acid after the treatment. A method for detecting a nucleic acid, comprising determining the presence or absence of the target sequence as compared with a case where scattered light is not processed.
(7) A method for detecting a nucleic acid, comprising detecting a polymorphism on a target sequence using the method according to (6).
(8) The method according to the above (7), comprising the following steps:
1) LAMP-amplifying a target sequence on a template nucleic acid to obtain a nucleic acid having a repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeatedly on the same strand once or twice or more;
2) treating the nucleic acid having the repeat structure with a restriction enzyme capable of specifically cleaving a polymorphic site on the target sequence;
3) a step of irradiating the nucleic acid after the treatment with the restriction enzyme with irradiation light and comparing the resulting scattered light with a case in which the nucleic acid is not treated with the restriction enzyme to determine whether a polymorphism exists on the target sequence.
(9) A kit used in the method according to any one of (1) to (8), wherein the kit comprises at least one of the following i) to iv): kit.
i) Inner primer of the following (a) and / or (b)
(A) When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are sequentially selected from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the sequence is the same as the F1c. And a primer comprising, in this order, the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
(B) When the third optional sequence R1 and the fourth optional sequence R2 are selected in order from the 5 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5 ′ end on the template nucleic acid, the sequence is complementary to the R1. That contains the target sequence R1c and the same sequence R2 as the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order
ii) Outer primer of the following (c) and / or (d)
(C) a primer comprising a sequence F3 complementary to the F3c when an arbitrary sequence F3c is selected in the 3 ′ terminal direction from the arbitrary sequence F2c on the template nucleic acid chain
(D) When an arbitrary sequence R3 is selected in the direction of the 5 ′ end from the arbitrary sequence R2 on the template nucleic acid strand, a primer containing the same sequence as the R3
iii) DNA polymerase catalyzing a strand displacement type complementary strand synthesis reaction
iv) nucleotides that serve as substrates for element iii)
(10) The kit according to (9), further comprising a loop primer of the following (e) and / or (f):
(E) a primer containing a sequence complementary to any sequence between F1c and F2 on the inner primer
(F) a primer containing a sequence complementary to any sequence between R1c and R2 on the inner primer
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention provides a method for irradiating a nucleic acid having a repeat structure containing a target sequence and a sequence complementary thereto on the same strand once or twice or more to a nucleic acid having a repeat structure, and utilizing the scattered light to generate the target sequence. The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid, characterized by detecting a nucleic acid, a method for detecting a polymorphism using the method, and a kit for these methods.
[0010]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Definition of terms
Nucleic acid: As used herein, "nucleic acid" may be natural or artificially synthesized. The nucleic acid includes all of DNA, cDNA, RNA, cRNA, PNA and the like. In addition, it includes both single-stranded nucleic acids and double-stranded nucleic acids. Furthermore, nucleotide derivatives that are partially modified or wholly entirely composed of artificial structures are included in the nucleic acids of the present invention as long as they can form base pairing. In addition, the term gene (nucleic acid that carries a specific function or information related to life) is also included in nucleic acid. In the present invention, the number of constituent bases of the nucleic acid is not limited.
[0011]
Target sequence: As used herein, "target sequence" or "target nucleic acid" refers to a nucleic acid sequence or nucleic acid molecule to be detected. In addition, the target sequence means a base sequence of the target nucleic acid.
[0012]
Repeat structure: The “repeat (repeated) structure” according to the present invention is a structure in which a specific sequence is repeatedly contained (in tandem) on the same strand, and particularly in the present specification, is complementary to each other. It shall mean a structure in which two sequences are repeatedly contained on the same chain. This repeat structure will be described in detail in the next section.
[0013]
Template and complementary strand: "Template" in the present specification means a nucleic acid on the side that serves as a template for complementary strand synthesis. A “complementary strand” having a base sequence complementary to a template has a meaning as a strand corresponding to the template, but the relationship between the two is merely relative.
[0014]
Template nucleic acid: In the present invention, the term "template nucleic acid" means a nucleic acid which is the original target of detection and contains a target sequence in its molecule, and serves as a basis for preparing a nucleic acid amplification product having a repeat structure and designing primers therefor. I do.
[0015]
Hybridization: "Hybridize" and "anneal" mean that the nucleic acid forms a duplex through complementary base pairing based on the Watson-Crick model. Therefore, even if the nucleic acid strands forming the base pairing are on the same strand, hybridization or annealing is performed if the complementary base sequence in the molecule forms a base pairing. In the present invention, hybridization and annealing are synonymous in that a nucleic acid forms a double-stranded structure by base pairing.
[0016]
2. Nucleic acid having a repeat structure
2.1 Repeat structure
The nucleic acid having a repeat structure used in the method of the present invention contains "a structure in which a target sequence and a sequence complementary thereto are arranged in tandem" repeated once or twice or more on the same strand.
[0017]
The chain length of the nucleic acid having a repeat structure of the present invention is not particularly limited, but is usually preferably at least 100 bases or more, and is preferably about 1000 bases on average. This is because the longer the chain length of the nucleic acid, the higher the intensity of the scattered light and the more sensitive the detection becomes.
[0018]
The number of repetitions of the “structure in which the target sequence and its complementary sequence are tandemly” contained in the nucleic acid having the repeat structure is not particularly limited, but is usually at least about 1 to 10 times, preferably 10 times or more on average. . This is because the greater the number of target sequences contained in the nucleic acid, the higher the intensity of scattered light and the more sensitive the detection becomes.
[0019]
Since the nucleic acid having a repeat structure is provided by a nucleic acid amplification reaction as described below, it is not necessarily uniform, and includes nucleic acids having various chain lengths and amplification rates. Therefore, the preferred numerical value of the above-mentioned chain length and the number of repetitions uses the expression “average” (the average means a normal arithmetic average).
[0020]
The “target sequence” contained in the nucleic acid having a repeat structure of the present invention may be a part or the whole of a nucleic acid (genomic gene or mRNA) to be detected. It is preferable to select and use a sequence specific to the nucleic acid to be detected. For example, a portion having a high sequence specificity existing in the mRNA 3 ′ untranslated region that does not include a repeated sequence if it is a structural gene is used. In the case of polymorphism analysis, the site near the polymorphism and the like can be suitably used.
[0021]
Further, the term "sequence complementary thereto" means, for example, a complementary sequence 3'-tcaagtag-5 'with respect to 5'-agttcatc-3', since these are contained on the same chain. , The latter being arranged in the opposite direction as 5'-gatgaact-3 '. In this sense, the repeat structure of the present invention can be said to be inverted repeat (inverse repetition). The two sequences complementary to each other can form, at least in part, a loop structure by annealing in a chain (annealing in the same chain). This loop formation gives the nucleic acid having a repeat structure of the present invention a specific secondary (or tertiary) structure. For example, when loops are formed at both ends on the same strand, the nucleic acid having the repeat structure of the present invention has a dumbbell structure, and when a large number of loops are formed on the same strand, the nucleic acid having the repeat structure is cauliflower. It becomes a mold structure. The nucleic acid having the repeat structure of the present invention can be detected with high sensitivity by scattered light because of its long chain length and high number of repetitions of the target sequence (high amplification efficiency), as well as such a unique structure. it seems to do.
[0022]
2.2 Preparation of nucleic acid having repeat structure
The nucleic acid having a repeat structure of the present invention can be prepared by using genomic DNA, mRNA, or the like, which is the original detection target, as a template nucleic acid, and using at least a part thereof as a target sequence. The preparation method is not particularly limited, and a known nucleic acid synthesis method such as chemical synthesis or a known nucleic acid amplification method such as a PCR method or an SDA method can be appropriately selected, and amplification using a primer having an X1c + X2 structure described later is used. If the method (for example, the LAMP method) is used, it can be efficiently prepared.
[0023]
(1) Amplification method using primer having X1c + X2 structure
The primer having the X1c + X2 structure is specifically designed as follows.
(A) When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are sequentially selected from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid chain toward the 3 ′ end on the template nucleic acid chain, the F1c And a primer comprising, in this order, a sequence F2 complementary to F2c from 5 ′ to 3 ′
(B) When the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2 are sequentially selected from the 5 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid chain toward the 5 ′ end on the template nucleic acid chain, Containing, in this order, a sequence R1c complementary to R2 and a sequence R2 identical to R2 from 5 ′ to 3 ′
[0024]
The above primers may be used as a pair of (a) and (b), or one of (a) and (b) may be used as a pair with a normal primer.
The amplification reaction can be achieved by a usual PCR method using, for example, the above-mentioned primer, template nucleic acid, nucleotide substrate and DNA (RNA) polymerase.
[0025]
Furthermore, the amplification reaction can be performed under isothermal conditions by using a strand displacement DNA polymerase as the polymerase. This is because the extension product from the primer has an X1c + X2 structure, X1c + (X2 +) X1 (Underlined) to anneal within the strand to produce a single-stranded portion on the synthesized double-stranded nucleic acid. That is, a new starting point for a strand displacement reaction by intrachain annealing is provided on the extension product without dissociating the duplex at a high temperature. For the outline of this reaction, refer to the LAMP method described later.
[0026]
Examples of the strand displacement DNA polymerase include Bst DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase, and E. coli. Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase (excluding exonuclease activity from Vent DNA polymerase), DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase (from DeepVent DNA polymerase) Exonuclease activity), Φ29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), KOD DNA polymerase (Toyobo) and the like.
[0027]
(2) LAMP method
1) Outline of LAMP (Loop-mediated isotherm amplification) method
As a preferred embodiment of the amplification method, an amplification method by a LAMP method can be used. The “LAMP method” is a method for amplifying nucleic acids developed by the present inventors, and includes two, four, or six specific primers including an inner primer pair or an outer primer pair and a loop primer pair. A method for rapidly and inexpensively amplifying DNA or RNA under isothermal conditions (around 65 ° C.) using a strand displacement polymerase and nucleotides as substrates. For an overview of the LAMP method, see the literature: Notomi, T et al. : Nucleic Acids Res. 28 (12): e63 (2000), Patent: International Publication WO 00/28082, or the homepage of Eiken Chemical Co., Ltd. (http://www.eiken.co.jp/).
[0028]
In the LAMP method, mutually complementary sequences are generated at the same chain end of the amplification product, and these are annealed to form a hairpin-like loop, and an elongation reaction by a polymerase starting from the loop occurs. At the same time, a strand displacement extension reaction occurs from the primer annealed in the loop, and the extension product is dissociated into a single strand. This reaction occurs repeatedly because the dissociated single strand also has a complementary sequence at the end. Thus, in the LAMP method, since the extension reaction and the amplification reaction proceed simultaneously at a plurality of positions on the same strand of the amplification product, amplification of the DNA is achieved in an exponential manner under isothermal conditions, and is used in the present invention. Nucleic acid having the desired repeat structure can be efficiently synthesized.
[0029]
2) Primer for LAMP method
In the LAMP method, specific primers called inner primers, outer primers, and loop primers are used.
[0030]
The inner primer is an essential primer for the LAMP method. In each strand of the template DNA, when an arbitrary sequence X2c present on the 3 ′ side and an arbitrary sequence X1c 5 ′ therefrom are selected, the inner primer is complementary to the X2c. A primer comprising a target sequence X2 and a sequence X1c identical to the X1c from the 3 ′ side to the 5 ′ side in this order (having a structure of X1c + X2). Functionally speaking, X2 on the inner primer is a portion that anneals specifically to the template to provide a starting point for complementary strand synthesis, and X1c is a complementary sequence for the amplification (extension) product to form a loop. give. Then, this loop becomes a starting point of new complementary strand synthesis.
[0031]
The outer primer is a primer that has a sequence complementary to the arbitrary sequence X3c outside the inner primer (that is, the 3 ′ side of the template), and can anneal to it (one for each of the primers complementary to the double strand). Each).
[0032]
In order to facilitate annealing of the primer to the template nucleic acid, the length of X1 (X1c), X2 (X2c), and X3 (X3c) is preferably 5 to 100 bases, and more preferably 10 to 50 bases.
[0033]
The inner primer and the outer primer are required for each of the double strands (F and R), and two types of each of the inner primer (F1c + F2, R1c + R2) and the outer primer (F3, R3) are designed.
[0034]
Each arbitrary sequence is preferably selected so that the amplification product obtained by the LAMP method preferentially causes intramolecular annealing rather than intermolecular annealing to form a terminal hairpin structure. For example, in order to cause intramolecular annealing to occur preferentially, in selecting an arbitrary sequence, it is important to consider the distance between the F1c and F2c sequences and the distance between the R1 and R1c sequences. . Specifically, it is preferable that both sequences are selected so as to be present at a distance of 0 to 500 bases, preferably 0 to 100 bases, most preferably 10 to 70 bases. Here, the numerical values indicate the number of bases that do not include the F1c and F2c sequences themselves and the R1 and R2 sequences themselves, respectively.
[0035]
When a complementary sequence generated on the same strand of an amplification product by the LAMP method anneals to each other to form a loop, a loop primer is a base sequence complementary to a sequence in the loop at its 3 ′ end. 2 primers (one for each complementary to the double strand). The outer primer and the loop primer are not essential primers for the LAMP method, but if they are present, the amplification (extension) reaction proceeds more efficiently.
[0036]
3) Template nucleic acid for amplification
The template nucleic acid for amplification used in the LAMP method may be DNA or RNA, and can be prepared from a biological sample such as a tissue or a cell by a known method or a chemical synthesis method. In this case, a template polynucleotide is prepared such that a sequence of an appropriate length (both side sequences) exists on both sides of a region to be amplified (called a target region). The two-sided sequence means the sequence of the region from the 5 'end of the target region to the 5' end of the polynucleotide chain, and the sequence of the region from the 3 'end of the target region to the 3' end of the polynucleotide chain. . The length of both side sequences is 10 to 1000 bases, preferably 30 to 500 bases in both the 5 'and 3' regions of the target region.
[0037]
4) Reaction conditions
A series of reactions include a buffer for giving a pH suitable for the enzyme reaction, salts necessary for maintaining and annealing the catalytic activity of the enzyme, a protective agent for the enzyme, and, if necessary, a regulator for the melting temperature (Tm). It is preferably performed in the coexistence of the above. As the buffering agent, one having a neutral to weakly alkaline buffering action such as Tris-HCl is used. The pH may be adjusted according to the DNA polymerase used. As the salts, for example, KCl, NaCl, MgCl ₂ Or (NH ₄ ) ₂ SO ₄ Etc. are appropriately added for maintaining the activity of the enzyme and adjusting the melting temperature (Tm) of the DNA. Bovine serum albumin and saccharides are used as enzyme protecting agents. As the melting temperature (Tm) regulator, betaine, proline, dimethyl sulfoxide, or formamide can be generally used.
[0038]
5) LAMP reaction
In the reaction in the LAMP method, the following components (i), (ii), and (iii) are added to a template nucleic acid, and the inner primer forms a stable base pair bond to a complementary sequence on the template nucleic acid. The process proceeds by incubating at a temperature at which the strand displacement polymerase can maintain the enzyme activity. The incubation temperature is from 50 to 75C, preferably from 55 to 70C, and the incubation time is from 1 minute to 10 hours, preferably from 5 minutes to 4 hours.
(I) 2 inner primers, or 2 outer primers, or 2 loop primers
(Ii) strand displacement polymerase
(Iii) substrate nucleotide
[0039]
3. Specific procedure of nucleic acid detection method
In the present invention, a specific procedure from preparation of a nucleic acid having a repeat structure to detection thereof includes the following steps.
1) A target sequence on a template nucleic acid is amplified by the LAMP method or the like, and a nucleic acid having a repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeated once or twice or more on the same strand is obtained. Obtaining step;
2) a step of irradiating the nucleic acid having the repeat structure with irradiation light and detecting the target sequence by using the generated scattered light.
[0040]
3.1 Amplification of target sequence
First, a target sequence on a template nucleic acid is amplified, and a nucleic acid having a repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeated once or twice or more on the same strand is obtained.
[0041]
For example, in the case of detecting a specific gene in a biological sample, total RNA or mRNA may be prepared from cells according to a well-known method, and the mRNA may be amplified as cDNA by reverse transcription to prepare a nucleic acid having a repeat structure. . When the amount of the nucleic acid to be analyzed is small, the cDNA may be further amplified as cRNA using T7 RNA polymerase before use. As the amplification method, an amplification reaction using the above-described primer having the structure of X1c + X2, and the LAMP method can be suitably used.
[0042]
3.2 Detection of target sequence by scattered light
In order to detect scattered light, a sample containing a nucleic acid having a repeat structure is put into a cell, and irradiation light from a light source is applied to one surface of the cell. As the cell, a square cell made of a transparent material such as glass or quartz, which is used for ordinary analysis, can be used. The cell may be a stationary cell or a flow cell. The light source of the irradiation light is not particularly limited, and a light source usually used for scattered light detection, such as a He—Na laser light source, an Ar laser light source, or a combination thereof can be used. Irradiation of the sample with light may be performed directly, or may be performed through a mirror, a filter, a condenser lens, a polarizing element, an optical fiber, or the like.
[0043]
The scattered light detector is arranged on one surface (side or rear) of the cell different from the surface receiving the light from the light source, and directly detects the scattered light generated from the sample or a polarizing element, a condensing lens, a pinhole, It is detected through an optical fiber or the like. For the detection of scattered light, a system that can detect weak light with high sensitivity and that uses a photon counting method is preferable. The detected light can usually be processed and analyzed in real time using software attached to the detector. Light sources and detectors (such as photon counters) for detecting such scattered light are already well known in the art, and commercially available ones (manufactured by Otsuka Electronics, Shimadzu, etc.) are preferably used. be able to.
[0044]
4. Scattered light detector
FIG. 1 shows an example of an apparatus that can be used for the nucleic acid detection method of the present invention. This device is composed of a light source, a reaction part (sample insertion part, hot plate, etc.) and a detection part (scattered light detector, counter memory, etc.). The light source and the reaction part, and the reaction part and the detection part are optical fiber A, respectively. And B. The sample inserted in the cell is inserted into the sample insertion section, and irradiation light from a light source is applied through the optical fiber A. The cell is held by a heat block designed to not interfere with the incidence of incident light and the detection of scattered light. The temperature of the heat block is controlled by a temperature controller, and the reaction solution in the cell can be maintained at a predetermined temperature. Note that the reaction solution is preferably layered with mineral oil or the like to prevent volatilization due to heating. The scattered light is detected and analyzed through the optical fiber B, for example, scattered light in the direction of 90 ° with respect to the incident light.
[0045]
The above-described apparatus is an example, and other commercially available light scattering photometers (Otsuka Electronics, static light scattering photometer SLS-6000 series, etc.) used for measuring the molecular weight of biopolymers and the like are used in the practice of the present invention. Can also be used.
[0046]
5. Kit for nucleic acid detection method of target sequence
The present invention also provides a kit used for the detection method of the present invention. The kit includes at least one of the following i) to iv).
[0047]
i) Inner primer of the following (a) and / or (b)
(A) When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are sequentially selected from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the sequence is the same as the F1c. And a primer comprising, in this order, the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
(B) When the third optional sequence R1 and the fourth optional sequence R2 are selected in order from the 5 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5 ′ end on the template nucleic acid, the sequence is complementary to the R1. That contains the target sequence R1c and the same sequence R2 as the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order
ii) Outer primer of the following (c) and / or (d)
(C) a primer comprising a sequence F3 complementary to the F3c when an arbitrary sequence F3c is selected in the 3 ′ terminal direction from the arbitrary sequence F2c on the template nucleic acid chain
(D) When an arbitrary sequence R3 is selected in the direction of the 5 ′ end from the arbitrary sequence R2 on the template nucleic acid strand, a primer containing the same sequence as the R3
iii) DNA polymerase catalyzing a strand displacement type complementary strand synthesis reaction
iv) nucleotides that serve as substrates for element iii)
The kit may further include the following loop primer (e) and / or (f) in order to promote LAMP amplification more efficiently.
(E) a primer containing a sequence complementary to any sequence between F1c and F2 on the inner primer
(F) a primer containing a sequence complementary to any sequence between R1c and R2 on the inner primer
[0048]
The kit of the present invention includes, in addition to the above-mentioned essential components, a melting temperature regulator (for example, betaine, trimethylamine N-oxide, etc.), a buffer which gives suitable conditions for the enzymatic reaction, and a synthesis reaction product, if necessary. It may contain other reagents necessary for detection. Further, the kit may supply reagents necessary for one reaction in a state of being dispensed into a reaction container.
The kit is also used for the presence or absence of a restriction enzyme treatment described in the next section and for a method for detecting a polymorphism.
[0049]
6. Use of the detection method of the present invention
6.1 Real-time monitoring of LAMP products
The present invention can be used for measurement of a small amount of nucleic acid, in particular, real-time monitoring of a LAMP product by combining with the LAMP reaction. The LAMP product can also be visually detected by utilizing the turbidity of the reaction solution by magnesium pyrophosphate as a reaction by-product (Biochemical and Biophysical Research Communications), Vol. 289, no. 1, 150-154, (2001)). However, the detection method of the present invention using scattered light based on the synthesized DNA itself is more reliable and more rapid than the above method of detecting magnesium pyrophosphate which is an amplification reaction by-product. That is, the method of the present invention can detect with high sensitivity a small amount of amplified DNA molecules in the early stage of the LAMP reaction in which no precipitation occurs.
[0050]
6.2 Detection of restriction enzyme digestion
Further, the method of the present invention can easily detect the presence or absence of restriction enzyme treatment without performing complicated operations such as electrophoresis. That is, when a restriction enzyme site is contained in the target sequence, a LAMP product having a repeat structure contains a large number of restriction enzyme sites in the structure. Therefore, when subjected to restriction enzyme digestion, the molecular weight is significantly reduced, which is clearly observed as a decrease in scattered light. These effects are not seen with simple amplification products such as PCR products.
[0051]
Detection of the presence or absence of such restriction enzyme digestion includes (1) verification of the amplification reaction specificity, and (2) confirmation of the amplified nucleic acid by multiplex LAMP (when a plurality of LAMP products are amplified in the same tube). In addition, it can be used for detecting (3) polymorphisms (such as SNPs) described in the next section.
[0052]
6.3 Detection of polymorphism (SNP, etc.)
By utilizing the method of the present invention, detection of a polymorphism on a target sequence can be performed. The method includes, for example, the following steps.
1) LAMP-amplifying a target sequence on a template nucleic acid to obtain a nucleic acid having a repeat structure containing the target sequence and its complementary sequence repeated once or twice or more on the same strand;
2) treating the nucleic acid having the repeat structure with a restriction enzyme capable of specifically cleaving a polymorphic site on the target sequence;
3) a step of irradiating the nucleic acid after the treatment with the restriction enzyme with irradiation light and comparing the resulting scattered light with a case in which the nucleic acid is not treated with the restriction enzyme to determine whether a polymorphism exists on the target sequence. The polymorphism also includes SNP.
[0053]
ADVANTAGE OF THE INVENTION The detection method of this invention can detect a trace detection target highly sensitively and easily regardless of the chain length using scattered light. Since this method is also capable of automating processing and real-time monitoring, it is expected to be applied to detection of various nucleic acids, such as detection of trace genes contained in biological samples and detection of polymorphisms including SNPs.
[0054]
It is a known fact that DNA as a macromolecule scatters light, but a method for detecting a gene amplification reaction by scattered light measurement has not been reported so far. This is presumably because there was no amplification method capable of synthesizing a large amount of long-chain DNA that is advantageous for scattered light measurement with high accuracy (for example, the amplification efficiency of PCR is two orders of magnitude lower than LAMP and the specificity is lower). The method of the present invention makes use of the characteristic of a LAMP product called a repeat structure to detect a trace gene in a biological sample with high sensitivity regardless of its chain length, and also detects the presence or absence of a restriction enzyme reaction and the detection of polymorphism such as SNP. Also available. Further, according to the present invention, there is also provided a method for detecting a nucleic acid amplification reaction and verifying the product at once, or an apparatus therefor.
[0055]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0056]
[Example 1] Monitoring of LAMP reaction by scattered light measurement
1. Test method
(1) LAMP reaction
LAMP reaction was performed using PSA (prostate-specific antigen cDNA fragment; SEQ ID NO: 1) as a template and the following LAMP primers. In the LAMP reaction, the reaction was performed at 60 ° C. for 40 minutes using the reaction solution composition shown in Table 1 without performing thermal denaturation of the template nucleic acid.
LAMP primer for PSA:
FIP; 5'-TGTTCCTGGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGGCGGTGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 2)
RIP; 5'-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGAACCTGAAATACCTGGCCTG-3 '(SEQ ID NO: 3)
F3; 5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3 '(SEQ ID NO: 4)
R3; 5'-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3 '(SEQ ID NO: 5)
(FIP and RIP indicate Forward Inner Primer and Reverse Inner Primer, respectively, and F3 and R3 respectively indicate Forward Inner Primer and Reverse Outer Primer.)
[0057]
[Table 1]

[0058]
(2) Scattered light measurement
Hamamatsu Photonics Co., Ltd. produced a scattered light detection device as shown in FIG. The scattered light of the LAMP reaction solution prepared in the preceding section was measured using this apparatus. As a light source, a 50-watt white xenon lamp was used, and the sample was irradiated with light of all wavelengths through an optical fiber A having a diameter of 1 mmφ. A 3 mm × 3 mm square cell (made of quartz) was used as a sample cell. The cell is held by a heat block designed so as not to hinder the detection of the incident light and the scattered light.By heating the heat block, the reaction solution in the cell can be maintained at a predetermined temperature. it can. The reaction solution was overlaid with mineral oil to prevent volatilization. For detection, scattered light in the direction of 90 ° with respect to the incident light was detected by a photon counting method using a high-sensitivity photomultiplier through the optical fiber B.
[0059]
[Example 2] Confirmation of origin of scattered light
1. Test method
Whether the observed scattered light was derived from precipitation of magnesium pyrophosphate or a LAMP product (long chain DNA molecule) was confirmed as follows.
[0060]
It has been found that precipitation of magnesium pyrophosphate does not occur when heat-resistant Pyrophosphatase (Ppase) is allowed to coexist in the LAMP reaction solution. Therefore, a LAMP reaction was performed in the same manner as in Example 1 in the presence of Ppase (20 mU Tth Pyrophosphatase, thermostable; manufactured by Roche) and compared with the results of Example 1. FIG. 2 shows the results.
[0061]
2. Test results
In the case where no Ppase was added, a modest increase in scattered light was observed between about 10 minutes and 15 minutes after the start of the reaction, and an explosive increase in scattered light was observed from about 17 minutes (arrow in the figure). When Ppase was added, there was a modest increase in scattered light between about 10 and 15 minutes, but no explosive increase in scattered light from 17 minutes. Therefore, the explosive increase in scattered light from 17 minutes is attributed to the precipitation of magnesium pyrophosphate, and the mild increase in scattered light observed from about 10 minutes is attributed to long-chain DNA (LAMP product). it was thought. From these results, it was confirmed that detecting the scattered light from the long-chain DNA synthesized by the LAMP reaction was more rapid than detecting the scattered light from the magnesium pyrophosphate.
[0062]
[Example 3] Monitoring of restriction enzyme digestion reaction of LAMP product by scattered light measurement
1. Test method
It is widely practiced to examine the specificity of the amplification reaction by treating the amplified DNA with a restriction enzyme. Therefore, in the LAMP reaction mixture, a restriction enzyme that does not recognize the LAMP product: EcoRI (manufactured by Takara Shuzo; recognition sequence GAATTC) or a restriction enzyme that recognizes the LAMP product: Sau3AI (manufactured by Takara Shuzo; recognition sequence GATC) has the same number of units (each). 50 U / tube), and the change in scattered light was observed. In addition, in the base sequence of PSA shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the GATC sequence portion from nucleotides 228 to 231 corresponds to the Sau3AI recognition site.
[0063]
In addition, in order to directly confirm the presence or absence of enzyme digestion, agarose gel electrophoresis analysis was performed on the sample after each restriction enzyme reaction.
[0064]
2. Test results
As shown in FIG. 3, the scattered light intensity hardly changed when EcoRI was added (decrease in scattered light intensity: 3%), but when Sau3AI was added, the scattered light intensity was significantly reduced (scattered light intensity). Strength reduction: 30%). This is because the synthesized DNA was digested by Sau3AI and fragmented, and the scattering efficiency was reduced. The increase in the scattered light intensity observed in the LAMP reaction solution was due to the long-chain DNA synthesized by the LAMP reaction. It is shown that.
[0065]
As shown in FIG. 4, as a result of the electrophoresis, the electrophoresis pattern of the sample after EcoRI treatment (lane 2) coincided with the electrophoresis pattern of the LAMP product without restriction enzyme treatment (lane 1). In the electrophoresis pattern (lane 3), a band (arrow in the figure) derived from the degraded DNA was observed. This proved that the decrease in the scattered light intensity due to the Sau3AI treatment was due to fragmentation of the long-chain DNA by the Sau3AI.
[0066]
Usually, the presence or absence of a restriction enzyme reaction is examined by a complicated procedure called agarose electrophoresis, but using the method of the present invention, the presence or absence of restriction enzyme digestion of an amplification product can be easily detected in a tube by scattered light measurement. be able to. Since the LAMP product is a long chain DNA having a repeat structure, it has many restriction enzyme sites in one piece of DNA. Therefore, the molecular weight is significantly reduced by the restriction enzyme treatment, and the scattered light intensity is greatly reduced. That is, it is considered that the LAMP product can detect the presence or absence of enzyme digestion with higher sensitivity than simple DNA such as a PCR product.
[0067]
[Example 4] Comparison of PCR product and LAMP product detection results by scattered light measurement
1. Test method
With respect to the same target sequence, the detection results of the LAMP product and the PCR product were compared by the scattered light measurement. The LAMP reaction was carried out in the same manner as in Example 1, and the PCR reaction was carried out using the outer primer of the LAMP primer as a primer and the following reaction solution composition (Table 2) and reaction conditions according to a general protocol. .
[0068]
[Table 2]

[0069]

[0070]
2. Test results
In the PCR reaction solution, almost no increase in scattered light with respect to the background (distilled water) was observed. From this result, it was confirmed that when the amplification region was the same, the LAMP reaction for synthesizing a large amount of long-chain DNA having a repeat (inverted repeat) structure was more suitable for detecting scattered light than the PCR reaction. In order to efficiently detect a PCR product with scattered light, it is necessary to amplify a longer region than this time in large quantities, but this is generally very difficult.
[0071]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a small amount of a detection target can be detected highly sensitively and simply using scattered light regardless of its chain length. In addition, since this method can also automate processing and real-time monitoring, it is expected to be applied to detection of various nucleic acids, such as detection of trace genes contained in biological samples and detection of polymorphisms including SNPs. You.
[0072]
[Sequence list]

[0073]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 2—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 3—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 4—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 5—Description of Artificial Sequence: Primer
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a scattered light detector for use in the method of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing a real-time detection result of a LAMP product (PSA) by a light scattering method. In the figure, the upper curve shows the results when PPase was not added (magnesium pyrophosphate was generated), and the lower curve shows the results when PPase was added (magnesium pyrophosphate was not generated). The arrow indicates the detection start point of the magnesium pyrophosphate precipitation.
FIG. 3 is a graph showing the effect of a restriction enzyme treatment on the scattered light intensity of a LAMP product. In the figure, the upper curve shows the results with EcoRI (an enzyme that does not recognize PSA), and the lower curve shows the results with Sau3AI (an enzyme that recognizes PSA).
FIG. 4 shows the results of 3% agarose electrophoresis of a reaction solution after restriction enzyme treatment. From the left in the figure, M: 100 bp ladder, 1: LAMP reaction solution without restriction enzyme treatment (PSA), 2: After EcoRI treatment, 3: After Sau3AI treatment. Arrows indicate bands of Sau3AI reaction products.
FIG. 5 is a graph showing the results of comparison between the LAMP method and the PCR method in scattered light detection.

Claims

Irradiating a nucleic acid having a repeat structure containing a target sequence and a sequence complementary thereto one or more times on the same strand with a repeat structure, and detecting the target sequence by utilizing scattered light generated A method for detecting a nucleic acid, comprising:

The method according to claim 1, wherein the nucleic acid having a repeat structure is provided by an amplification method using the following primers (a) and / or (b).
(A) When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are sequentially selected from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the sequence is the same as the F1c. And a primer (b) comprising, in this order, the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side, from the 5 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5 ′ end on the template nucleic acid. When the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2 are selected in order, a primer containing a sequence R1c complementary to the R1 and a sequence R2 identical to the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order

3. The method according to claim 2, wherein the amplification method is a LAMP method.

A nucleic acid detection method comprising the following steps:
1) LAMP-amplifying a target sequence on a template nucleic acid to obtain a nucleic acid having a repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeatedly on the same strand once or twice or more;
2) a step of irradiating the nucleic acid having the repeat structure with irradiation light and detecting the target sequence by using the generated scattered light.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the scattered light is monitored in real time.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the nucleic acid having a repeat structure is treated with a restriction enzyme capable of specifically cleaving a target sequence, and scattered light generated from the treated nucleic acid is not treated. A method for detecting a nucleic acid, comprising determining the presence or absence of the target sequence as compared to

A method for detecting a nucleic acid, comprising detecting a polymorphism on a target sequence using the method according to claim 6.

The method of claim 7, comprising the following steps:
1) LAMP-amplifying a target sequence on a template nucleic acid to obtain a nucleic acid having a repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeatedly on the same strand once or twice or more;
2) treating the nucleic acid having the repeat structure with a restriction enzyme capable of specifically cleaving a polymorphic site on the target sequence;
3) a step of irradiating the nucleic acid after the treatment with the restriction enzyme with irradiation light and comparing the resulting scattered light with a case in which the nucleic acid is not treated with the restriction enzyme to determine whether a polymorphism exists on the target sequence.

A kit used in the method according to any one of claims 1 to 8, wherein the kit comprises at least one of the following i) to iv).
i) Inner primer of the following (a) and / or (b) (a) The first arbitrary sequence F1c in order from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid And when the second arbitrary sequence F2c is selected, a primer comprising the same sequence as the F1c and the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order (b) a target sequence on the template nucleic acid From the 5 'side toward the 5' end on the template nucleic acid, when the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2 are selected in order, the sequence R1c complementary to the R1 and the same as the R2 A primer containing the sequence R2 in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side ii) an outer primer of the following (c) and / or (d): (c) 3 ′ terminal direction from the arbitrary sequence F2c on the template nucleic acid strand When an arbitrary sequence F3c is selected, a sequence F3 complementary to the F3c is selected. Primer containing (d) When an arbitrary sequence R3 is selected in the direction of the 5 'end from the arbitrary sequence R2 on the template nucleic acid strand, a primer containing the same sequence as the R3 iii) catalyzes a strand displacement type complementary strand synthesis reaction DNA polymerase iv) nucleotide as a substrate for element iii)

The kit according to claim 9, further comprising the following loop primer (e) and / or (f).
(E) A primer containing a sequence complementary to any sequence between F1c and F2 on the inner primer (f) A primer containing a sequence complementary to any sequence between R1c and R2 on the inner primer