【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養真皮シートの製造方法および培養真皮シートに関する。詳しくは、女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、得られた活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含まれた培養真皮シートを製造する方法および培養真皮シートに関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
近年、培養表皮細胞を用いる皮膚組織の再生治療が行われているが、真皮に達する深い創傷に対する治療では、皮弁術と呼ばれる手術が採られている。
【０００３】
しかしながら、皮弁術では、形成外科的に高度な処置技術を必要とし、被験者には大きな手術創、深い麻酔を必要とする。皮弁を採取した部位は、皮膚組織の欠損が生じるため、その欠損部位の皮膚組織の再建も必要となる。また、皮弁術は全身状態の良好な者や、体力的な問題の少ない者に適用されることが好ましいなどの制約もある。
【０００４】
一方、最近、コラーゲンスポンジ等の人工真皮が開発され、真皮様の線維脂肪組織の再生治療に用いられている。しかしながら、このようなコラーゲンスポンジ等は、感染に対する耐性が大きくなく、また、人工材料のみでは、修復速度などの修復能力に限界があるという問題があった。
【０００５】
このため、コラーゲンスポンジ等に、細胞を組み込むことにより、再生能力を向上させる試みがなされている。たとえば、真皮の再生処置のための細胞として、線維芽細胞を用いた方法が提供されている。このような線維芽細胞は、同種細胞では免疫的な問題があるため、自家の線維芽細胞を採取することが必要となることが多いが、この場合、自家の組織を損傷させる場合があり、また、組織からの細胞の単離には長時間の酵素処理あるいはフィルター処理など煩雑な手続きを要するという問題があった。さらに、線維芽細胞は線維組織を再生することはできるが、皮下組織に含まれる線維組織以外の組織、たとえば、脂肪組織、血管組織などの再生には不向きであるというという問題があり、真皮の再生には適していない。
【０００６】
このため、細胞として、骨髄細胞を用いる方法が提供されている。骨髄細胞の場合、骨髄穿針で細胞浮遊液の状態で細胞の採取が可能であり、線維芽細胞のような複雑な採取方法を採る必要がない。さらに、骨髄細胞には、線維芽細胞、脂肪細胞、幹細胞など各種の細胞を含み、線維、脂肪、血管組織の再生に優れるという利点もあった。本願発明者らは、既に、培養骨髄細胞が皮膚損傷の再生を促進することを見出している（たとえば、非特許文献１および非特許文献２参照。）。しかしながら、骨髄細胞の培養には長期間を要し、その間被験者は、たとえば皮膚欠損の状態で、感染の危険に曝される場合があるなどの問題があった。また、被験者が高齢等の場合、骨髄細胞の数が少ない上に、細胞活性が低く培養増殖能力が低い場合があり、細胞培養に更なる時間を要するという問題があった。
【０００７】
一方、人工真皮の足場となるコラーゲンスポンジは気孔率や気孔径の大きさが小さく、細胞浮遊液を速やかにコラーゲンスポンジの内部に浸透させることが困難な場合があるという問題があった。
すなわち、コラーゲンスポンジに培養骨髄細胞浮遊液を含浸させる際、細胞浮遊液は、コラーゲンスポンジのごく表層にしか含浸されず、含浸されるのは培養骨髄細胞浮遊液の水分であり、培養細胞自体はコラーゲンスポンジの表層付近で目詰まりし、コラーゲンスポンジ全体に浸透しにくいという問題があった。
【０００８】
このため、短期間で細胞の増殖を可能とするとともに、短期間で真皮再生が可能な培養真皮シートおよびその製造方法の出現が望まれていた。さらに、高活性な細胞による単時間での培養を一層効率的に行うため、培養細胞を組み込みやすい構造を有する培養真皮シートおよびその製造方法の出現が望まれていた。
【非特許文献１】
奈良医学雑誌、ＶＯＬ５０第５０巻第６号、１９９９年１２月３１日、ｐ．５４３〜５５０
【非特許文献２】
ＥｘｐｅｒｔＮｕｒｓｅ ＶＯＬ１８ Ｎｏ．９、２００２年７月、ｐ．１８〜２１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような背景技術に基づきなされたものであって、短期間で細胞活性の高い細胞培養が可能で、確実かつ短期間で真皮の再生が可能な培養真皮シートを提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、女性ホルモン様物質の存在下に、間葉系幹細胞を培養することにより、短期間で間葉系幹細胞の増殖をすることが可能で、このように女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含まれた培養真皮シートが、高い真皮再生能力を有し、確実かつ短期間に真皮の再生が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の概要は以下のとおりである。
【００１２】
本発明に係る培養真皮シートの製造方法は、培養液および女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、該培養により得られる活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させて、人工皮膚代替材料中に活性化間葉系幹細胞が含まれた培養真皮シートを得ることを特徴としている。
【００１３】
前記培養真皮シートの製造方法は、培養液および女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養した後、
該培養により得られる活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に含浸させることが好ましい。
【００１４】
前記培養真皮シートの製造方法は、培養液、女性ホルモン様物質および間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を、人工皮膚代替材料に含浸させた後、
該間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中で培養することが好ましい。
【００１５】
前記女性ホルモン様物質は、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステンおよびエヌライボールからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１６】
前記人工皮膚代替材料は、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１７】
前記人工皮膚代替材料は、その表面に切込みを有することが好ましい。
【００１８】
前記培養真皮シートの製造方法は、遠心力により活性化間葉系細胞を人工皮膚代替材料に含浸させることができる。
【００１９】
前記培養真皮シートの製造方法は、遠心力により間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料に含浸させることができる。
【００２０】
本発明に係る培養真皮シートは、女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞と、人工皮膚代替材料とを含むことを特徴としている。
【００２１】
前記女性ホルモン様物質は、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステンおよびエヌライボールからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００２２】
前記人工皮膚代替材料は、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【発明の実施の形態】
本発明に係る培養真皮シートは、女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞と、人工皮膚代替材料とを含む。以下、女性ホルモン様物質、間葉系幹細胞、人工皮膚代替材料について説明する。
【００２３】
間葉系幹細胞
本発明に係る培養真皮シートを形成するために用いる細胞は、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞は、骨髄細胞、末梢血の幹細胞などに含まれる。このような間葉系幹細胞は、皮膚皮下組織に分化可能である。
【００２４】
間葉系幹細胞は、自己由来、同種異系由来または異種由来のものを用いることができる。これらのうちでは同種異系由来および異種由来の間葉系幹細胞は、免疫反応および感染性合併症の可能性を有する場合があり、培養真皮シートをヒトなどに適用する場合、自己由来の間葉系幹細胞を用いることが好ましい。このような間葉系幹細胞は、胚あるいは生後からのものを用いることができる。培養真皮シートをヒトに適用する場合は、ヒト由来の間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
【００２５】
本発明では、間葉系幹細胞を含有する骨髄細胞あるいは末梢血の幹細胞をそのまま用いてもよいし、間葉系幹細胞を骨髄などから分離して用いてもよい。
【００２６】
このような間葉系幹細胞を含む骨髄細胞等は、生体から採取により入手することができる。たとえば、間葉系幹細胞を含む骨髄細胞は、部分麻酔下で腸骨から骨髄液を採取することにより入手できる。
【００２７】
このような間葉系幹細胞は、後述する女性ホルモン様物質を添加して培養することにより、細胞増殖能や分化能が向上した活性化間葉系幹細胞とすることができる。またこのような活性化間葉系幹細胞は、真皮への分化誘導に優れ、確実かつ短期間で真皮の再生を可能とする。
【００２８】
女性ホルモン様物質
本発明で用いられる女性ホルモン様物質は、女性ホルモン様活性を示す物質であれば限定されない。女性ホルモン様活性を示す物質とは、卵巣や胎盤から分泌され、雌特有の生殖機能を維持するため必要なホルモンを意味する。
【００２９】
このような女性ホルモン様物質としては、たとえば、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステン、エヌライボールなどが挙げられ、これらのうちの少なくとも１種を用いることが好ましい。
これらは、公知の方法により合成することができる。また、市販のものを用いることもできる。
【００３０】
これらのうちでは、エストロゲンを好ましく用いることができる。エストロゲンとしては、エストロン、エストラジオール、エストリオールなどが挙げられ、これらのうちでは、エストリオールを好ましく用いることができる。
【００３１】
このような女性ホルモン様物質を添加して、間葉系幹細胞を培養すると、間葉系幹細胞の増殖が活性化されるので、たとえば、高齢者の細胞など、増殖活性の低い細胞であっても、充分な細胞増殖をさせることができる。女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料に含浸された培養真皮シートは、真皮への分化誘導が促進されて真皮の再生速度が向上し、従来の人工真皮と比較して創傷治癒能力が向上している。このような培養真皮シートが生体に移植された場合、短期間で確実に損傷した皮膚組織を作製することが可能である。
【００３２】
なおこれまで、女性ホルモンが血管内皮細胞を活性化して血管の形成を促進するということが知られているが（文献：Ｅｎｄｏｃｌｉｎｏｌｏｇｙ ２００２，１４３：３７８５−３７９５）、真皮再生のための間葉系幹細胞にこのような女性ホルモン様物質を添加して培養することにより、間葉系幹細胞の増殖が活性化されるとともに、真皮細胞への増殖、分化が促進され、真皮の再生速度が向上することはこれまで知られていない。
【００３３】
このような女性ホルモン様物質の使用量は、間葉系幹細胞の培養に用いる培養液に対して、好ましくは１０−６モル／リットル〜１０−８モル／リットル、さらに好ましくは１０−７モル／リットル〜１０−８モル／リットルの範囲にあることが望ましい。
このような量の女性ホルモン様物質を添加して間葉系幹細胞の培養を行うと、細胞の増殖速度を著しく向上（たとえば約２倍強）させることができるとともに、得られる活性化間葉系幹細胞は、真皮細胞への分化誘導が促進されて、真皮細胞の再生速度が向上している。
【００３４】
また、特に、女性ホルモン様物質の添加により、細胞膜の酵素であるアルカリフォスファターゼが高い活性を示す（たとえば女性ホルモン様物質を添加しない場合と比較して２〜３倍のアルカリフォスファターゼ活性を示す）ことが、本願発明者らの研究により明らかとなっており、細胞膜形成速度の向上が間葉系幹細胞の増殖活性の向上および真皮細胞への分化誘導促進に寄与しているものと推測される。
【００３５】
人工皮膚代替材料
本発明で用いられる人工皮膚代替材料は、本発明に係る培養真皮シートを生体に適用した場合に、生体の免疫機能によって拒絶されず、生体適合性に優れた材質であることが好ましい。また、生体吸収性あるいは性分解性の材料であれば適用後に異物として取り除く必要がなく、人工皮膚代替材料として適用可能である。人工皮膚代替材料は、間葉系幹細胞或いは活性化間葉系幹細胞が増殖して皮膚皮下組織を形成するための足場としても機能し得るものである。
【００３６】
このような人工皮膚代替材料としては、たとえば、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどの生体由来材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの合成高分子材料などが挙げられる。
これらは１種単独でまたは複数を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
これらのうちではコラーゲン、アテロコラーゲンを好ましく用いることができ、コラーゲンを用いることがより好ましい。コラーゲンまたはアテロコラーゲンとしては、動物由来、魚由来のものが好ましく、哺乳類由来のものがより好ましい。コラーゲンとしてはＩ型コラーゲンまたはＩＩＩ型コラーゲンを用いることが好ましい。
このようなコラーゲンは、市販のものまたは動物、魚から抽出して得ることができる。アテロコラーゲンは、常法により、コラーゲンから主たる抗原性部位であるテロペプチド領域を酵素等を用いて除去して得ることができる。
【００３８】
人工皮膚代替材料の形態は特に限定されず、フィルム状、ゲル状、スポンジ状のいずれも用いることができる。これらのうちでは、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に浸透して含浸しやすいように、スポンジ状の形態であることが好ましい。
【００３９】
なお、本明細書において、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含浸するとは、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞が、人工皮膚代替材料の組織中あるいは構造中の間隙に入り込んで、組織中あるいは構造中に保持させることを意味している。
【００４０】
したがって、本発明で用いられる人工皮膚代替材料としては、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンスポンジなどを用いることが好ましい。
【００４１】
このようなコラーゲンスポンジあるいはアテロコラーゲンスポンジの孔径は、好ましくは１０μｍ〜１０００μｍ、さらに好ましくは１００μｍ〜５００μｍの範囲にあることが望ましい。
【００４２】
スポンジの孔径が上記範囲にあると、間葉系幹細胞をより容易にスポンジの内部に浸透して含浸させることができる。
人工皮膚代替材料の厚さは、適用される真皮の部位などにより異なり限定されないが、たとえば、好ましくは１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲にあることが望ましい。
【００４３】
本発明で用いる人工皮膚代替材料は、長方形、楕円状等疾患の部位に対応して各種のシート状の形状を採ることができるが、表面と裏面とを有する該シート状の人工皮膚代替材料の片側の表面に切込みを有することが好ましい。切込みは、たとえば、平行に一方向のみに設けられていてもよいし、平行でなくてもよい。また、たとえば、ほぼ平行な切込みが、縦と横に直交するように設けることもできる。平行に切込みを入れる場合、その間隔はたとえば、好ましくは１ｍｍ〜５ｍｍ間隔、より好ましくは２ｍｍ〜３ｍｍ間隔で設けることができる。碁盤目状に切込みを入れる場合、縦と横の切り込み間隔は同じ間隔であってもよいし、異なる間隔であってもよい。図１は、人工皮膚代替材料１の片側面に碁盤目状の切込み２を入れた模式図である。この例では、切込み２は、縦と横がほぼ等間隔に、平行に設けられている。
【００４４】
このような切り込みは人工皮膚代替材料の片側の表面に設けられていることが望ましい。
切り込みの深さは人工皮膚代替材料の厚さにより異なり特に限定されないが、好ましくは厚みの９０以上１００％未満、より好ましくは厚みの９５〜９９％の深さとすることが望ましい。
【００４５】
このような切込みを人工皮膚代替材料の片側面に設けることにより、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞が含まれる細胞浮遊液と人工皮膚代替材料との接触面積が増大し、人工皮膚代替材料に短時間で、しかも深部にまで、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞を含浸させることができる。
【００４６】
本発明で用いる人工皮膚代替材料は、その片側面の全部又は一部がシリコーン膜で被覆されていてもよい。シリコーン膜を有する培養真皮シートは、疾患への適用の際は、外層がシリコーン膜となるよう疾患部位に貼り付けられる。シリコーン膜があると、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞の分化増殖がより安定的に進行する。切込みを入れる場合は、切込みを入れた面と反対側の表面にシリコーン膜を被覆することが望ましい。シリコーン膜の厚さは限定されないが、たとえば、１００μｍ〜５００μｍ程度であればよい。
【００４７】
図２に示すように、切込みを入れない人工皮膚代替材料１を用いる場合は、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞４が含まれる細胞浮遊液３が人工皮膚代替材料１の表面６のみから浸透するしかないが、図３に示すとおり、切込み２を入れることで、細胞浮遊液３と人工皮膚代替材料１との接触が増大し、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料の深部にまで含浸させることができる。
【００４８】
培養真皮シートの製造方法
本発明に係る培養真皮シートは、培養液と女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、この培養により得られる活性化間葉系幹細胞を、人工皮膚代替材料中に含浸させることにより得ることができる。
【００４９】
女性ホルモン様物質による間葉系幹細胞の活性化は、間葉系幹細胞の増殖や分化を誘導することが可能な任意に時期に行うことができる。
【００５０】
具体的には、（ｉ）人工皮膚代替材料に間葉系幹細胞を接着させる前に、あらかじめ女性ホルモン様物質を添加した培養液で間葉系幹細胞を培養（初期培養という）し、この後、得られた活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に含浸させることができる。
【００５１】
また、（ｉｉ）女性ホルモン様物質を添加した培養液を用いて人工皮膚代替材料中で間葉系幹細胞を直接培養することにより、活性化間葉系幹細胞を得るとともに、該培養による細胞の増殖を通じて、活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させることもできる。この場合は、初期培養を実施しなくてもよい。
【００５２】
これらのうちでは、初期培養を要しないで、人工皮膚代替材料中で間葉系幹細胞を培養する際に、女性ホルモン様物質を添加する、前記（ｉｉ）の方法を用いることが好ましい。
【００５３】
前記培養液としては、液体状のものに加え、ゲル状の培地を用いることもできる。公知のものを用いることができ特に限定されず、たとえば、ＭＥＭ（イーグルの最小必須培地）、牛胎児血清やヒト結成などを用いることができる。なお、本明細書では、このような培養液と間葉系幹細胞を含むものを細胞浮遊液という。また培養液と活性化間葉系幹細胞とを含むものを活性化細胞浮遊液をいう。これらの浮遊液は、女性ホルモン様物質などを含むことができる。
【００５４】
このような細胞浮遊液中の間葉系幹細胞の培養期間中の細胞密度は特に限定されないが、好ましくは１×１０２〜１×１０７個／ｍｌ、さらに好ましくは好ましくは１×１０５〜１×１０６個／ｍｌ程度であればよい。
【００５５】
また活性化細胞浮遊液中の活性化間葉系幹細胞の培養期間中の細胞密度は特に限定されないが、好ましくは１×１０２〜１×１０７個／ｍｌ、さらに好ましくは好ましくは１×１０５〜１×１０６個／ｍｌ程度であればよい。
【００５６】
培養は公知の方法により行うことができ限定されない。たとえば前記（ｉ）の方法による場合は、培養液に細胞、女性ホルモン様物質を添加して、好ましくは常温（３７℃）程度、湿度８０％〜１００％程度の範囲で、３〜７％二酸化炭素濃度の雰囲気下で、好ましくは１〜３週間の期間培養することができる。得られた活性化間葉系幹細胞は、通常培養フラスコなどに付着しているので、必要に応じトリプシン処理してフラスコ等から剥がし、活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を、人工皮膚代替材料に滴下して、活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させる。これにより、活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含浸した培養真皮シートを得ることができる。
【００５７】
また、たとえば、（ｉｉ）の方法による場合は、培養液、女性ホルモン様物質および細胞を含む細胞浮遊液を、人工皮膚代替材料に添加して、好ましくは常温（３７℃）程度、湿度８０％〜１００％程度の範囲で、３〜７％二酸化炭素濃度の雰囲気下で、好ましくは１〜３週間の期間、人工皮膚代替材料中で細胞を培養する。これにより、女性ホルモン様物質により活性化された活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含浸した培養真皮シートを得ることができる。
【００５８】
培養真皮シート中の活性化間葉系幹細胞の存在密度は特に限定されないが、好ましくは１×１０２〜１×１０７個／ｍｌ、さらに好ましくは好ましくは１×１０５〜１×１０６個／ｍｌ程度であればよい。
【００５９】
また本発明では、前記（ｉ）の方法による場合、活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に滴下した後、これらに遠心力をかけて、前記活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中により深くかつ効率的に含浸させることができる。遠心力は、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液が滴下された人工皮膚代替材を遠心器等にかけて付与することができる。遠心力の大きさは好ましくは０を超え９００×ｇ以下であることが望ましい。力の大きさが上記範囲を超えると、活性化間葉系幹細胞に損傷を与える場合がある。
【００６０】
また本発明では、前記（ｉｉ）の方法による場合、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に滴下した後、これらに遠心力をかけて、前記間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中により深くかつ効率的に含浸させることができる。遠心力は、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液が滴下された人工皮膚代替材を遠心器等にかけて付与することができる。力の大きさは好ましくは０を超え９００×ｇ以下であることが望ましい。力の大きさが上記範囲を超えると、間葉系幹細胞に損傷を与える場合がある。
【００６１】
培養真皮シートの製造方法として、より具体的な例として、たとえば図４（（ｉ）の方法の一例）に示すように、たとえば間葉系幹細胞を含む骨髄細胞を用いる場合、まず、骨髄液７を採取し、培養フラスコ８に移し、たとえば女性ホルモン様物質、骨髄細胞を加えたＭＥＭ系培地９などで、一定期間培養する。次に、培養液をトリプシン処理して、間葉系幹細胞又は活性化間葉系幹細胞を培養フラスコ８から剥がして、細胞浮遊液１０を作成し、これを注射器１１へ封入する。次に、必要に応じて切込みを入れた人工皮膚代替材料１２に細胞浮遊液１０を滴下（切込みがある場合は切込みが存在する面に滴下）し、さらに、必要に応じ、これを遠心分離機にかけて、間葉系幹細胞又は活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料の深部にまで含浸させることにより、本発明に係る培養真皮シートを得ることができる。
【００６２】
得られた培養真皮シートは、そのまま臨床に使用することができる。臨床に使用するまでに時間がある場合は、好ましくは０℃〜−１９６℃、さらに好ましくは−２０℃〜−５０℃で保存すればよい。低温で保存した場合には、室温に戻してから臨床に使用ればよい。
【００６３】
【発明の効果】
本発明に係る培養真皮シートの製造方法は、間葉系幹細胞を女性ホルモン様物質の存在下に培養するので、細胞増殖能が向上している。また、細胞の分化誘導能、細胞の再生速度が向上している。さらに、人工皮膚代替材料に切込みを入れることで、間葉系幹細胞或いは活性化間葉系幹細胞との接触面積が増大し、人工皮膚代替材料に、短時間で深部にまで間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞を含浸させることができる。本発明に係る培養真皮シートの製造方法または真皮培養シートによれば、体力的に課題のある患者などにも容易に適用可能で、適用部位によっては入院を不用とせず、外来通院のみでの治癒も期待できる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、これらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００６５】
【比較例１】
図７に示すように、９１歳女性脳梗塞の寝たきりの臀部にじょく創を有する患者に、本人の骨盤から骨髄液を採取し、採取した骨髄液をＴ７５フラスコで、標準培地（牛胎児血清、抗生剤を含むＭＥＭ）にて培養した。
【００６６】
当初の細胞密度は、数百個程度であった（Ｔ７５フラスコの使用培地は約１０ｍｌ）。３週間培養したが、肉眼で確認したところ細胞は充分に増殖していなかった。その後培養後の培養液をトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商品名）、ナカライ株式会社製）で処理し、遠心分離機により細胞を溶液中に沈殿させたが、わずかの細胞しか肉眼で確認できなかった。
【００６７】
培養した細胞を含む細胞浮遊液を、厚さ３ｍｍ、直径約３ｃｍのコラーゲンスポンジ（ペルナック（商品名）、グンゼ株式会社製）に、図５に示すように注射器で滴下してコラーゲンスポンジ中に含ませた。表面に細胞浮遊液が滴状になり、しみ込みが不十分であった。この細胞浮遊液を含んだコラーゲンスポンジを患者に移植した。移植後１週間で肉芽細胞の形成が軽度見られ、さらに皮膚移植を追加したが、移植皮膚片は生体に生着せず、図８に示すように移植して約２ヶ月後においても創部を治癒させることができなかった。
【００６８】
【実施例１】
比較例１の図８の状態にある９１歳女性脳梗塞の寝たきりの臀部にじょく創を有する患者に、本人の骨盤から骨髄液を採取し、採取した骨髄液をＴ７５フラスコで、標準培地（牛胎児血清、抗生剤を含むＭＥＭ）に添加するとともに、エストリオール（ｅｓｔｒｉｏｌ（商品名）、ナカライ株式会社製）を培地の量に対して１００ｎモル／リットル添加した。当初の細胞密度は、数百個／フラスコ程度であった。
【００６９】
３週間培養し、トリプシン処理したところ、細胞数は約１×１０６個得られ、肉眼で見ても充分量の細胞が得られた。
【００７０】
図６に示すように、厚さ３ｍｍ、直径約１０ｃｍのコラーゲンスポンジ（ペルナック（商品名）、グンゼ株式会社製）に、５ｍｍ間隔で、碁盤目状に、厚さ９９％程度の深さの切込みを入れ、切込みを入れた側に、培養した細胞を含む細胞浮遊液を含ませた。細胞浮遊液は速やかにコラーゲンスポンジ全体に広がった。
【００７１】
この培養真皮シートを、患者に移植した。移植後１週間で肉芽細胞の形成がかなり観察され、さらに皮膚移植を追加したところ、移植皮膚片も生着した。図９に示すように、移植して約２ヶ月後、肉芽組織および皮膚が再生され、じょく創はほぼ治癒したことが確認された。
【００７２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、切込みのない人工皮膚代替材料に、切込みをいれたことを示す模式図の一例である。
【図２】図２は、切込みのない人工皮膚代替材料に間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を滴下した際の断面図を示す模式図である。
【図３】図３は、切込みを有する人工皮膚代替材料に間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を滴下した際の断面図を示す模式図である。
【図４】図４は、培養真皮シートの製造方法の一例を示す模式図である。
【図５】図５は、コラーゲンスポンジに、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を滴下する例を示す写真である。
【図６】図６は、切込みを有するコラーゲンスポンジの一例を示す写真である。
【図７】図７は、治療前の患者のじょく創部の一例を示す写真である。
【図８】図８は、女性ホルモン様物質を添加していない状態で間葉系幹細胞を培養して得られる細胞浮遊液および切込みのないコラーゲンスポンジを用いた場合の治癒の状態の一例を示す写真である。
【図９】図９は、女性ホルモン様物質を添加して間葉系幹細胞を培養して得られる細胞浮遊液および切込みを有するコラーゲンスポンジを用いた場合の治癒の状態の一例を示す写真である。
【符号の説明】
１ 人工皮膚代替材料
２ 切込み
３ 細胞浮遊液および／または活性化細胞浮遊液
４ 間葉系幹細胞および／または活性化間葉系幹細胞
５ シリコンシート
６ 人工皮膚代替材料の表面
７ 骨髄液
８ 培養フラスコ
９ ＭＥＭ培地
１０ 活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液
１１ 注射器
１２ 活性化間葉系幹細胞を含む人工皮膚代替材料[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a cultured dermis sheet and a cultured dermis sheet. More specifically, the present invention relates to a method for producing a cultured dermal sheet in which mesenchymal stem cells are cultured in the presence of a female hormone-like substance, and the obtained activated mesenchymal stem cells are contained in an artificial skin substitute material, and a cultured dermal sheet. .
[0002]
TECHNICAL BACKGROUND OF THE INVENTION
In recent years, regenerative treatment of skin tissue using cultured epidermal cells has been performed. In the treatment of deep wounds reaching the dermis, an operation called flap surgery is employed.
[0003]
However, flap surgery requires advanced treatment techniques plastically, and requires large surgical wounds and deep anesthesia for the subject. Since the skin tissue is deficient at the site from which the flap was collected, it is necessary to reconstruct the skin tissue at the deficient site. In addition, there is a restriction that flap surgery is preferably applied to a person with a good general condition and a person with few physical problems.
[0004]
On the other hand, recently, artificial dermis such as collagen sponge has been developed and used for regeneration treatment of dermis-like fibroadipose tissue. However, such a collagen sponge and the like have a problem in that the resistance to infection is not high, and the repair ability such as a repair speed is limited only by the artificial material.
[0005]
For this reason, attempts have been made to improve the regenerative ability by incorporating cells into a collagen sponge or the like. For example, a method using fibroblasts as cells for dermal regeneration treatment has been provided. Such fibroblasts often require autologous fibroblasts to be collected due to immunological problems with allogeneic cells, in which case autologous tissue may be damaged, In addition, there is a problem in that isolation of cells from a tissue requires a complicated procedure such as a long enzymatic treatment or a filter treatment. Furthermore, although fibroblasts can regenerate fibrous tissue, there is a problem that they are not suitable for regenerating tissues other than fibrous tissue contained in subcutaneous tissue, such as adipose tissue and vascular tissue. Not suitable for playback.
[0006]
For this reason, a method using bone marrow cells as cells has been provided. In the case of bone marrow cells, cells can be collected in the form of a cell suspension with a bone marrow aspirator, and there is no need to employ a complicated collection method such as fibroblasts. Furthermore, bone marrow cells include various cells such as fibroblasts, adipocytes, and stem cells, and have the advantage of excellent regeneration of fibers, fat, and vascular tissue. The present inventors have already found that cultured bone marrow cells promote regeneration of skin damage (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2). However, culture of bone marrow cells requires a long period of time, and during that time, there is a problem that the subject may be exposed to a risk of infection, for example, in a state of skin defect. In addition, when the subject is elderly or the like, the number of bone marrow cells is small, and the cell activity may be low and the culture growth ability may be low. Therefore, there is a problem that further time is required for cell culture.
[0007]
On the other hand, a collagen sponge serving as a scaffold for the artificial dermis has a small porosity and a small pore diameter, and thus has a problem that it is sometimes difficult to quickly infiltrate the cell suspension into the collagen sponge.
That is, when the collagen sponge is impregnated with the cultured bone marrow cell suspension, the cell suspension is impregnated only on the very surface layer of the collagen sponge, and it is the water of the cultured bone marrow cell suspension that is impregnated. There has been a problem that clogging occurs near the surface layer of the collagen sponge and it is difficult to penetrate the entire collagen sponge.
[0008]
For this reason, it has been desired to develop a cultured dermis sheet and a method for producing the same, which allow cells to grow in a short period of time and regenerate the dermis in a short period. Furthermore, in order to more efficiently perform culture in a single hour with highly active cells, the emergence of a cultured dermis sheet having a structure into which cultured cells can be easily incorporated and a method for producing the same have been desired.
[Non-patent document 1]
Nara Medical Magazine, Vol. 50, No. 6, December 31, 1999, p. 543-550
[Non-patent document 2]
ExpertNurse VOL18 No. 9, July 2002, p. 18-21
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made based on the background art as described above, and provides a cultured dermis sheet capable of culturing cells having high cell activity in a short period of time and capable of regenerating the dermis in a short period of time. It is an object.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and it is possible to expand mesenchymal stem cells in a short period of time by culturing mesenchymal stem cells in the presence of a female hormone-like substance. Thus, a cultured dermal sheet containing activated mesenchymal stem cells obtained by culturing mesenchymal stem cells in the presence of a female hormone-like substance in an artificial skin substitute material has a high dermal regeneration ability The inventors have found that the dermis can be regenerated reliably and in a short time, and have completed the present invention.
[0011]
That is, the outline of the present invention is as follows.
[0012]
The method for producing a cultured dermal sheet according to the present invention comprises culturing mesenchymal stem cells in the presence of a culture solution and a female hormone-like substance, and impregnating the artificial skin substitute material with activated mesenchymal stem cells obtained by the culture. Thus, a cultured dermal sheet containing activated mesenchymal stem cells in an artificial skin substitute material is obtained.
[0013]
The method for producing the cultured dermal sheet, after culturing mesenchymal stem cells in the presence of a culture solution and a female hormone-like substance,
It is preferable to impregnate an artificial skin substitute material with an activated cell suspension containing activated mesenchymal stem cells obtained by the culture.
[0014]
The method for producing the cultured dermis sheet, after impregnating a culture suspension, a cell suspension containing a female hormone-like substance and mesenchymal stem cells with an artificial skin substitute material,
The mesenchymal stem cells are preferably cultured in an artificial skin substitute material.
[0015]
It is preferable that the female hormone-like substance is at least one selected from the group consisting of estrogen, isoflavone, genisten, and enrybole.
[0016]
The artificial skin substitute material is preferably at least one selected from the group consisting of collagen, atelocollagen, gelatin, polylactic acid and polyglycolic acid.
[0017]
The artificial skin substitute material preferably has a cut in its surface.
[0018]
In the method for producing a cultured dermis sheet, activated mesenchymal cells can be impregnated into the artificial skin substitute material by centrifugal force.
[0019]
In the method for producing a cultured dermis sheet, the mesenchymal stem cells can be impregnated into the artificial skin substitute material by centrifugal force.
[0020]
The cultured dermal sheet according to the present invention is characterized by containing activated mesenchymal stem cells obtained by culturing mesenchymal stem cells in the presence of a female hormone-like substance, and an artificial skin substitute material.
[0021]
It is preferable that the female hormone-like substance is at least one selected from the group consisting of estrogen, isoflavone, genisten, and enrybole.
[0022]
The artificial skin substitute material is preferably at least one selected from the group consisting of collagen, atelocollagen, gelatin, polylactic acid and polyglycolic acid.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The cultured dermis sheet according to the present invention includes activated mesenchymal stem cells obtained by culturing mesenchymal stem cells in the presence of a female hormone-like substance, and an artificial skin substitute material. Hereinafter, female hormone-like substances, mesenchymal stem cells, and artificial skin substitute materials will be described.
[0023]
Mesenchymal stem cells
The cells used to form the cultured dermal sheet according to the present invention are mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells are included in bone marrow cells, peripheral blood stem cells, and the like. Such mesenchymal stem cells are capable of differentiating into skin subcutaneous tissue.
[0024]
Mesenchymal stem cells can be autologous, allogeneic or xenogenic. Of these, allogeneic and xenogeneic mesenchymal stem cells may have an immune response and the potential for infectious complications. It is preferable to use lineage stem cells. As such mesenchymal stem cells, embryonic or postnatal cells can be used. When the cultured dermis sheet is applied to humans, it is preferable to use human-derived mesenchymal stem cells.
[0025]
In the present invention, bone marrow cells containing mesenchymal stem cells or stem cells of peripheral blood may be used as they are, or mesenchymal stem cells may be separated from bone marrow and used.
[0026]
Bone marrow cells and the like containing such mesenchymal stem cells can be obtained by sampling from living organisms. For example, bone marrow cells including mesenchymal stem cells can be obtained by collecting bone marrow fluid from the iliac bone under partial anesthesia.
[0027]
Such mesenchymal stem cells can be converted into activated mesenchymal stem cells having improved cell proliferation ability and differentiation ability by culturing with the addition of a female hormone-like substance described below. In addition, such activated mesenchymal stem cells are excellent in inducing differentiation into the dermis, and can regenerate the dermis reliably and in a short period of time.
[0028]
Female hormone-like substance
The female hormone-like substance used in the present invention is not limited as long as it has a female hormone-like activity. The substance exhibiting a female hormone-like activity means a hormone secreted from the ovary or the placenta and necessary for maintaining a female-specific reproductive function.
[0029]
Examples of such a female hormone-like substance include estrogen, isoflavone, genisten, and Nuraibor, and it is preferable to use at least one of these.
These can be synthesized by a known method. Also, commercially available products can be used.
[0030]
Among them, estrogen can be preferably used. Estrones include estrone, estradiol, estriol, etc. Among them, estriol can be preferably used.
[0031]
When the mesenchymal stem cells are cultured by adding such a female hormone-like substance, the proliferation of the mesenchymal stem cells is activated. For example, even if the cells have low growth activity such as cells of the elderly, And sufficient cell growth. Cultured dermal sheets in which activated mesenchymal stem cells obtained by culturing mesenchymal stem cells in the presence of a female hormone-like substance are impregnated with an artificial skin substitute material, differentiation induction into the dermis is promoted, and dermis regeneration The speed is increased and the wound healing ability is improved compared to conventional artificial dermis. When such a cultured dermis sheet is transplanted into a living body, it is possible to reliably produce a damaged skin tissue in a short period of time.
[0032]
Although it has been known that female hormones activate vascular endothelial cells to promote the formation of blood vessels (Reference: Endoclinology 2002, 143: 3785-3795), mesenchymal stem cells for dermal regeneration are known. By adding such a female hormone-like substance to cultivation, the proliferation of mesenchymal stem cells is activated, the proliferation and differentiation into dermal cells are promoted, and the dermal regeneration rate is improved. Not known so far.
[0033]
The amount of such a female hormone-like substance is preferably 10 to 10% with respect to the culture solution used for culturing mesenchymal stem cells.-6Mol / l to 10-8Mol / l, more preferably 10-7Mol / l to 10-8Desirably, it is in the range of mol / liter.
When mesenchymal stem cells are cultured by adding such an amount of a female hormone-like substance, the growth rate of the cells can be remarkably improved (for example, about twice), and the obtained activated mesenchymal stem cells can be obtained. Stem cells are promoted to induce differentiation into dermal cells, and the regeneration rate of dermal cells is improved.
[0034]
In addition, in particular, the addition of a female hormone-like substance causes the alkaline phosphatase, which is a cell membrane enzyme, to exhibit high activity (eg, exhibits 2-3 times the alkaline phosphatase activity as compared to the case where no female hormone-like substance is added). However, it has been clarified by the study of the present inventors that it is presumed that the improvement of the cell membrane formation rate contributes to the enhancement of the proliferation activity of mesenchymal stem cells and the promotion of the induction of differentiation into dermal cells.
[0035]
Artificial skin substitute material
When the cultured dermis sheet according to the present invention is applied to a living body, the artificial skin substitute material used in the present invention is preferably a material that is not rejected by the immune function of the living body and has excellent biocompatibility. Further, if it is a bioabsorbable or sexually decomposable material, there is no need to remove it as a foreign substance after application, and it can be applied as an artificial skin substitute material. The artificial skin substitute material can also function as a scaffold for mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells to proliferate and form skin subcutaneous tissue.
[0036]
Examples of such artificial skin substitute materials include biological materials such as collagen, atelocollagen, gelatin, and fibrin, and synthetic polymer materials such as polylactic acid and polyglycolic acid.
These can be used alone or in combination of two or more.
[0037]
Among these, collagen and atelocollagen can be preferably used, and collagen is more preferably used. As the collagen or atelocollagen, those derived from animals and fish are preferable, and those derived from mammals are more preferable. As collagen, it is preferable to use type I collagen or type III collagen.
Such collagen can be obtained commercially or extracted from animals and fish. Atelocollagen can be obtained by removing the telopeptide region, which is the main antigenic site, from the collagen using an enzyme or the like by a conventional method.
[0038]
The form of the artificial skin substitute material is not particularly limited, and any of a film form, a gel form, and a sponge form can be used. Among these, it is preferable that the mesenchymal stem cells or the activated mesenchymal stem cells are in a sponge-like form so that they can easily penetrate into and impregnate the artificial skin substitute material.
[0039]
In this specification, the mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells impregnated in the artificial skin substitute material means that the mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells are in the tissue of the artificial skin substitute material or It means that it enters the gap in the structure and is retained in the tissue or structure.
[0040]
Therefore, it is preferable to use a collagen sponge or an atelocollagen sponge as the artificial skin substitute material used in the present invention.
[0041]
The pore diameter of such a collagen sponge or atelocollagen sponge is preferably in the range of 10 μm to 1000 μm, more preferably 100 μm to 500 μm.
[0042]
When the pore size of the sponge is in the above range, the mesenchymal stem cells can be more easily penetrated into and impregnated inside the sponge.
The thickness of the artificial skin substitute material varies depending on the site of the dermis to be applied and is not limited. For example, the thickness is preferably in the range of 1 mm to 10 mm.
[0043]
The artificial skin substitute material used in the present invention can take various sheet-like shapes corresponding to a diseased site such as a rectangle and an ellipse, and the sheet-like artificial skin substitute material having a front surface and a back surface. It is preferable to have a cut in one surface. The cuts may, for example, be provided in only one direction in parallel or may not be parallel. Also, for example, substantially parallel cuts can be provided so as to be orthogonal to the vertical and horizontal directions. When the cuts are made in parallel, the intervals can be provided, for example, preferably at intervals of 1 mm to 5 mm, more preferably at intervals of 2 mm to 3 mm. When the cuts are made in a grid pattern, the vertical and horizontal cut intervals may be the same or different. FIG. 1 is a schematic diagram in which a cut-like cut 2 is formed on one side of an artificial skin substitute material 1. In this example, the cuts 2 are provided in parallel at substantially equal intervals in the vertical and horizontal directions.
[0044]
Such cuts are desirably provided on one surface of the artificial skin substitute material.
The depth of the cut is different depending on the thickness of the artificial skin substitute material and is not particularly limited, but is preferably 90 to less than 100% of the thickness, more preferably 95 to 99% of the thickness.
[0045]
By providing such a cut on one side of the artificial skin substitute material, the contact area between the cell suspension containing mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells and the artificial skin substitute material increases, and the artificial skin substitute material is reduced. The material can be impregnated with the mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells in a short time and deeply.
[0046]
The artificial skin substitute material used in the present invention may have one or all of one side surface coated with a silicone film. The cultured dermis sheet having a silicone film is attached to a diseased site so that the outer layer becomes a silicone film when applied to a disease. With the silicone membrane, the differentiation and proliferation of mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells progress more stably. When making a cut, it is desirable to cover the surface opposite to the cut surface with a silicone film. The thickness of the silicone film is not limited, but may be, for example, about 100 μm to 500 μm.
[0047]
As shown in FIG. 2, when the artificial skin substitute material 1 having no cut is used, the cell suspension 3 containing the mesenchymal stem cells or the activated mesenchymal stem cells 4 contains only the surface 6 of the artificial skin substitute material 1. However, as shown in FIG. 3, the incision 2 increases the contact between the cell suspension 3 and the artificial skin substitute material 1 as shown in FIG. 3, and the mesenchymal stem cells or the activated mesenchymal stem cells are artificially formed. It can be impregnated deep into the skin replacement material.
[0048]
Method for producing cultured dermis sheet
The cultured dermis sheet according to the present invention is obtained by culturing mesenchymal stem cells in the presence of a culture solution and a female hormone-like substance, and impregnating the activated mesenchymal stem cells obtained by this culture into an artificial skin substitute material. Can be obtained by
[0049]
Activation of mesenchymal stem cells by a female hormone-like substance can be performed at any time at which proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells can be induced.
[0050]
Specifically, (i) before adhering the mesenchymal stem cells to the artificial skin substitute material, the mesenchymal stem cells are cultured in a culture solution to which a female hormone-like substance has been added in advance (referred to as an initial culture). The activated cell suspension containing the activated mesenchymal stem cells thus obtained can be impregnated into an artificial skin substitute material.
[0051]
(Ii) Activating mesenchymal stem cells are obtained by directly culturing mesenchymal stem cells in an artificial skin substitute material using a culture solution to which a female hormone-like substance is added, and the cells are grown by the culture. Activated mesenchymal stem cells can also be impregnated in artificial skin replacement materials through In this case, the initial culture does not need to be performed.
[0052]
Among them, it is preferable to use the method (ii) in which a female hormone-like substance is added when mesenchymal stem cells are cultured in an artificial skin substitute material without initial culture.
[0053]
As the culture solution, a gel medium can be used in addition to a liquid medium. Known ones can be used, and there is no particular limitation. For example, MEM (minimal essential medium of Eagle), fetal bovine serum, human serum, and the like can be used. In the present specification, a cell suspension containing such a culture solution and mesenchymal stem cells is referred to as a cell suspension. Further, those containing a culture solution and activated mesenchymal stem cells are referred to as activated cell suspensions. These suspensions can contain female hormone-like substances and the like.
[0054]
The cell density of the mesenchymal stem cells in the cell suspension during the culture period is not particularly limited, but is preferably 1 × 10 62~ 1 × 107Pcs / ml, more preferably 1 × 105~ 1 × 106The number may be about the number / ml.
[0055]
The cell density of the activated mesenchymal stem cells in the activated cell suspension during the culture period is not particularly limited, but is preferably 1 × 10 62~ 1 × 107Pcs / ml, more preferably 1 × 105~ 1 × 106The number may be about the number / ml.
[0056]
The culture can be performed by a known method, and is not limited. For example, in the case of the above method (i), cells and a female hormone-like substance are added to the culture solution, and preferably at a room temperature (37 ° C.) and a humidity of about 80% to 100%, and 3 to 7% dioxide. Culture can be performed under an atmosphere of carbon concentration, preferably for a period of 1 to 3 weeks. The obtained activated mesenchymal stem cells are usually adhered to a culture flask or the like.Thus, if necessary, trypsin treatment and peeling from the flask or the like are performed, and an activated cell suspension containing the activated mesenchymal stem cells is artificially prepared. The activated mesenchymal stem cells are impregnated into the artificial skin replacement material by dripping onto the skin replacement material. As a result, a cultured dermal sheet in which the activated mesenchymal stem cells are impregnated in the artificial skin substitute material can be obtained.
[0057]
Further, for example, in the case of the method (ii), a culture solution, a cell suspension containing a female hormone-like substance and cells are added to an artificial skin substitute material, and preferably at room temperature (37 ° C.) and a humidity of 80%. The cells are cultured in an artificial skin replacement material in an atmosphere having a carbon dioxide concentration of about 3% to about 100%, preferably for a period of 1 to 3 weeks. As a result, a cultured dermal sheet in which activated mesenchymal stem cells activated by a female hormone-like substance are impregnated in an artificial skin substitute material can be obtained.
[0058]
The density of activated mesenchymal stem cells in the cultured dermal sheet is not particularly limited, but is preferably 1 × 102~ 1 × 107Pcs / ml, more preferably 1 × 105~ 1 × 106The number may be about the number / ml.
[0059]
Further, in the present invention, in the case of the method (i), the activated cell suspension containing the activated mesenchymal stem cells is dropped on an artificial skin substitute material, and then the activated cell suspension is centrifuged to apply the activated mesenchymal stem cells. The stem cells can be deeper and more efficiently impregnated into the artificial skin substitute material. The centrifugal force can be applied by applying an artificial skin substitute, into which a cell suspension containing mesenchymal stem cells has been dropped, to a centrifuge or the like. The magnitude of the centrifugal force is preferably more than 0 and not more than 900 × g. If the magnitude of the force exceeds the above range, the activated mesenchymal stem cells may be damaged.
[0060]
According to the present invention, in the case of the method (ii), a cell suspension containing mesenchymal stem cells is dropped on an artificial skin substitute material, and then centrifugal force is applied thereto to replace the mesenchymal stem cells with the artificial skin substitute. The material can be impregnated deeper and more efficiently. The centrifugal force can be applied by applying an artificial skin substitute, into which a cell suspension containing mesenchymal stem cells has been dropped, to a centrifuge or the like. The magnitude of the force is preferably more than 0 and not more than 900 × g. If the magnitude of the force exceeds the above range, the mesenchymal stem cells may be damaged.
[0061]
As a more specific example of a method for producing a cultured dermal sheet, for example, as shown in FIG. 4 (an example of the method of (i)), when bone marrow cells containing mesenchymal stem cells are used, first, bone marrow fluid 7 Is collected, transferred to a culture flask 8, and cultured for a certain period of time in, for example, a MEM medium 9 containing a female hormone-like substance and bone marrow cells. Next, the culture solution is trypsinized, and the mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells are peeled off from the culture flask 8 to prepare a cell suspension 10, which is sealed in a syringe 11. Next, the cell suspension 10 is dropped on the artificial skin substitute material 12 which has been cut as necessary (if there is a cut, it is dropped on the surface where the cut exists), and if necessary, this is centrifuged. To impregnate the mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells deep into the artificial skin substitute material to obtain the cultured dermal sheet according to the present invention.
[0062]
The obtained cultured dermis sheet can be used clinically as it is. If there is a time before clinical use, it may be stored preferably at 0 ° C to -196 ° C, more preferably at -20 ° C to -50 ° C. When stored at a low temperature, the temperature may be returned to room temperature before clinical use.
[0063]
【The invention's effect】
In the method for producing a cultured dermis sheet according to the present invention, the mesenchymal stem cells are cultured in the presence of a female hormone-like substance, so that the cell proliferation ability is improved. In addition, the ability to induce cell differentiation and the rate of cell regeneration are improved. Furthermore, by making a cut in the artificial skin substitute material, the contact area with the mesenchymal stem cells or activated mesenchymal stem cells is increased, and the artificial skin substitute material is mesenchymal stem cell or active Adapted mesenchymal stem cells can be impregnated. According to the method for producing a cultured dermal sheet or the cultured dermal sheet according to the present invention, it can be easily applied to a patient having a physical problem, etc. Can also be expected.
[0064]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0065]
[Comparative Example 1]
As shown in FIG. 7, in a 91-year-old female patient with a cerebral infarction with a bed-bound buttocks, bone marrow fluid was collected from the pelvis of the subject, and the collected bone marrow fluid was used in a T75 flask in a standard medium (bovine fetus). (MEM containing serum and antibiotics).
[0066]
The initial cell density was about several hundred cells (T75 flask used medium was about 10 ml). After culturing for 3 weeks, the cells were not sufficiently grown when visually observed. Thereafter, the culture solution after culturing was treated with trypsin (Trypsin Solution (trade name), manufactured by Nakarai Co., Ltd.), and cells were precipitated in the solution by a centrifuge, but only a few cells could be visually confirmed.
[0067]
The cell suspension containing the cultured cells was dropped into a collagen sponge having a thickness of 3 mm and a diameter of about 3 cm (Pernac (trade name), manufactured by Gunze Co., Ltd.) using a syringe as shown in FIG. I didn't. The cell suspension became droplets on the surface, and the permeation was insufficient. A collagen sponge containing the cell suspension was implanted into a patient. One week after transplantation, formation of granulation cells was mildly observed, and skin transplantation was further added, but the transplanted skin piece did not survive in the living body, and the wound was healed even about 2 months after transplantation as shown in FIG. I couldn't let it.
[0068]
Embodiment 1
The bone marrow fluid was collected from the pelvis of a 91-year-old female patient with cerebral infarction with a bedridden buttocks in the state of FIG. 8 of Comparative Example 1, and the collected bone marrow fluid was used in a T75 flask in a standard medium. (MEM containing bovine fetal serum and antibiotics) and 100 nmol / liter of estriol (trade name, manufactured by Nakarai Co., Ltd.) based on the amount of the medium. The initial cell density was about several hundred cells / flask.
[0069]
After culturing for 3 weeks and trypsinizing, the number of cells was about 1 × 106Individual cells were obtained, and a sufficient amount of cells was obtained by visual inspection.
[0070]
As shown in FIG. 6, a notch having a depth of about 99% in a grid pattern at intervals of 5 mm in a collagen sponge (Pernac (trade name), manufactured by Gunze Co., Ltd.) having a thickness of 3 mm and a diameter of about 10 cm. And the cell suspension containing the cultured cells was included on the cut side. The cell suspension quickly spread throughout the collagen sponge.
[0071]
This cultured dermis sheet was transplanted into a patient. One week after transplantation, formation of granulation cells was considerably observed, and when a skin transplant was further added, a graft skin piece survived. As shown in FIG. 9, about two months after transplantation, granulation tissue and skin were regenerated, and it was confirmed that the wound was almost healed.
[0072]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an example of a schematic view showing that a cut is made in an artificial skin substitute material without a cut.
FIG. 2 is a schematic diagram showing a cross-sectional view when a cell suspension containing mesenchymal stem cells is dropped on an artificial skin substitute material having no cut.
FIG. 3 is a schematic diagram showing a cross-sectional view when a cell suspension containing mesenchymal stem cells is dropped on an artificial skin substitute material having a cut.
FIG. 4 is a schematic view showing an example of a method for producing a cultured dermis sheet.
FIG. 5 is a photograph showing an example in which a cell suspension containing mesenchymal stem cells is dropped on a collagen sponge.
FIG. 6 is a photograph showing an example of a collagen sponge having a cut.
FIG. 7 is a photograph showing an example of a perforated wound of a patient before treatment.
FIG. 8 shows an example of a state of healing when a cell suspension obtained by culturing mesenchymal stem cells without adding a female hormone-like substance and a collagen sponge without cuts are used. It is a photograph.
FIG. 9 is a photograph showing an example of a cell suspension obtained by culturing mesenchymal stem cells by adding a female hormone-like substance and a healing state in the case of using a collagen sponge having a notch. .
[Explanation of symbols]
1 Artificial skin substitute material
2 Cut
3 Cell suspension and / or activated cell suspension
4 Mesenchymal stem cells and / or activated mesenchymal stem cells
5 Silicon sheet
6 Surface of artificial skin substitute material
7 Bone marrow fluid
8 Culture flask
9 MEM medium
10 Activated cell suspension containing activated mesenchymal stem cells
11 syringe
12 Artificial skin substitute material containing activated mesenchymal stem cells
