【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚に形成された凹部（例えば、傷、シワ、事故等により陥没した箇所）を充填材料を皮下注入することにより修復する技術に関する。より詳細には、係る技術で用いられる充填材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、生体の皮膚に何等かの理由で凹部（傷、シワ、事故による陥没等）が発生した場合に、当該凹部が形成される以前の状態に復元或いは修復することは、医療分野、特に美容を主目的とする施術（シワの線を取る、事故等で凹んだ箇所の修復）では、非常に意義がある。
【０００３】
その様な施術を行うために、人工皮膚（例えば、特許文献１）を用いて行うことが考えられる。
しかし、生体に人工皮膚の様な人造物を取り込むことは、拒絶反応を惹起する可能性があり、好ましくはない。
また、人工皮膚や皮膚移植等の手法は、熱傷等で広範囲に皮膚が損傷された場合にそれを補填するのが目的であり、皮膚が持つ外界からの防御隔離機能、細菌感染や水分の維持、局所免疫等が欠損した場合に対処するものである。従って、シワや事故等による凹部の様に、皮膚の下の弾性繊維に欠損が生じた場合に対処することを本来的にはターゲットとしてはいない。
【０００４】
これに対して、近年、皮膚の凹部の修復を目的とする生体（患者）の皮膚の細胞を培養し、培養された皮膚細胞を上述した様な凹部に充填して、当該凹部を周辺と同一のレベルまで盛り上げて修復する技術（いわゆる「再移植」）が行われている。
係る技術であれば、再移植後に拒絶反応の問題が発生せず、皮膚下方の弾性繊維の欠損に対処するのに好都合である。
【０００５】
ここで、皮膚の細胞、特に繊維芽細胞は、生長のために「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）を必要とする。換言すれば、係る立体的な構造を提供せずに、繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入しても、注入された繊維芽細胞は十分に生長しない。
【０００６】
しかし、従来の最移植技術では、係る「足場」については全く考慮されておらず、従って、皮膚の細胞（特に繊維芽細胞）を患者（生体）内に注入しても、十分に生長せず、上述した様な凹部の修復の効果が十分に得られない、という問題があった。
或いは、凹部が修復しても、注入された細胞が生長せずに死滅してしまう可能性も存在した。
【０００７】
この様な問題を生じない様な皮下注入用の充填材料が望まれているが、現状では、その様な充填材料は未だに提案されていない。
【０００８】
【特許文献】
特開２００１−１０４３４６号
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり、拒絶反応を生じることが無く、しかも、注入された繊維芽細胞の生長が良好となるような皮下注入用の充填材料の提供を目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の皮下注入用の充填材料は、生体（例えば患者）から切除した皮膚片から培養した繊維芽細胞（３１）と、繊維芽細胞生長のための立体的な構造（マトリックス：「足場」）を提供する基材（３４）とを組成物として包含することを特徴としている（請求項１）。
ここで、前記繊維芽細胞と前記基材との比率が１：４〜４：１であるのが好ましい（請求項４）。
【００１１】
上述した様な構成を具備する本発明の充填材料によれば、組成物である繊維芽細胞は、生体（例えば患者）から切除した皮膚片から培養したものであるため、拒絶反応の心配が無い。
そして、組成物として包含されている基材が繊維芽細胞生長のための立体的な構造（マトリックス：「足場」）を提供するので、充填材料中の組成物である繊維芽細胞は、生体（患者）内に再移植された際に、順調に生長し、弾性繊維であるコラーゲンを産生する。
注入された繊維芽細胞自体が寿命が来たとしても、分裂して新しく別の繊維芽細胞を再生する。従って、再移植された修復箇所が変形すること無く、再移植箇所周辺のその他の部位と同一レベルの状態を維持することが出来る。
【００１２】
ここで、前記基材として、Ｈｅｓｐａｎｄｅｒ（ヘスパンダー：商品名：杏林製薬株式会社の製品）／Ｄｅｘｔｒａｎ（デキストラン：商品名：大塚製薬株式会社の製品）、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、フィブリン（Ｆｉｂｒｉｎ）、多血小板血漿（ＰＲＰ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ）、ＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙ Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：カルボキシ・メチル・セルロース）の何れかから選択されることが好ましい（請求項２）。
【００１３】
本発明の実施に際して、前記繊維芽細胞は、ケーシング（例えばガラスや合成樹脂製の市販のシャーレ：２０）の内部に培地（哺乳類細胞培養基本培地２４：例えばＤＭＥＭ）を充填し、係る培地には、培養しようとする皮膚細胞を有する生体から採取した血液（自己血２６）が加えられている（培地と、生体から採取した血液とが混合されている）培養装置で培養された繊維芽細胞を用いることが好ましい（請求項３）。
培地としては市販の哺乳類細胞培養基本培地が適用できる。
【００１４】
係る構成を採用すれば、従来の培地には添加することが不可能であった血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が、培養装置内に提供されるので、再生力が旺盛な繊維芽細胞は、極めて良く生長し、増殖する。
そして、培養しようとする皮膚細胞（繊維芽細胞）を有する生体から採取した血液（自己血）を培地に加えているので、他の生体の血液や他の動物（牛等）の血液経由で感染する可能性は、完全に排除される。
なお、培地（２４）に対する血液（自己血２６）の比率は、４％〜５０％であるのが好ましい。培地（２４）に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が少な過ぎると、血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が不足してしまう。一方、培地（２４）に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が多すぎる場合には、相対的に培地（２４）の量が少なくなり、培地中に含まれる皮膚細胞の培養に必要な幾つかの栄養素、例えばアミノ酸や糖質等の液体栄養素、が不足してしまう。
係る理由により、培地（２４）に対する血液（自己血２６）の上述した比率（４％〜５０％）が好ましい。
【００１５】
ここで、前記培養装置は、温度が約３７℃で且つ約５％の二酸化炭素を含有する雰囲気に載置されるのが好ましい。生体内の環境に近い雰囲気下で培養されるので、繊維芽細胞の増殖する条件が整うからである。
【００１６】
さらに、前記培養装置のケーシング（シャーレ２０）の底部には、高分子材料（例えば、フィブリン）製のシートが敷き詰められていることが好ましい（請求項４）。
繊維芽細胞が増殖して、培地の下方に伸長しても、高分子材料性のシート（例えばフィブリンシート）を貫通して、ケーシング（シャーレ２０）底部に付着することはないので、培養した細胞は、培養装置から極めて容易に回収されるからである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
上述した様に、皮膚に生じた凹部を充填する施術（美容目的の施術：例えば、シワの線を取る、事故等で凹んだ箇所の修復）を行うに際しては、拒絶反応等の不都合が生じないため、係る施術を行う患者自身の皮膚の細胞で当該凹部を充填することが望ましい。
係る見地より、当該施術を行う患者の皮膚の細胞を培養する必要がある。
【００１９】
皮膚の細胞を培養するに際して、図１で示す様に、当該施術を行う患者の耳Ｙの後ろの部分（耳Ｙと髪の毛の生え際Ｈとの間：図１では符号１２で示す）から３ｍｍ四方の皮膚片（図１では符号１０で示す）を採取或いは切除する。
当該皮膚片１０は、真皮層を含む様に採取（或いは切除）される。後述する様に、真皮層から培養により遊走する繊維芽細胞を単離するためである。
【００２０】
ここで、当該皮膚片１０を採取する箇所として「耳Ｙの後ろの部分」（１２）としたのは、通常、紫外線の影響を受けない箇所であるため、繊維芽細胞を含む皮膚の細胞の状態が良好に保たれている箇所だからである。それと同時に、皮膚片を採取した跡（傷）が目立たない部分だからである。
換言すれば、紫外線の影響を受けず、繊維芽細胞を含む皮膚の細胞の状態が良好に保たれている箇所であって、皮膚片を採取した跡（傷）が目立たない部分であれば、耳Ｙの後ろの部分以外の箇所から、３ｍｍ四方の皮膚片１０を採取しても良い。
【００２１】
ここで、余りに多量の皮膚を採取してしまうと、採取した跡が患者に残存してしまう可能性がある。また、上述した耳Ｙの後ろの部分からは、あまりに大きな皮膚片を採取することは不可能である。従って、採取する皮膚片１０の面積を必要以上に大きくすることは出来ない。
一方、皮膚片にある程度の大きさが無いと、後述する前処理を行って培養を行う際に、十分な量の繊維芽細胞が確保出来なくなる可能性がある。
以上の理由により、採取するべき皮膚片１０を「３ｍｍ四方」とした。しかしながら、上述の理由に基き、大き過ぎず且つ小さ過ぎない範囲であれば、採取するべき皮膚片のサイズは「３ｍｍ四方」に限定するものではない。
【００２２】
次に、採取（切除）した皮膚片１０を、図２で示す様な手順にて、前処理を行う。
先ず、採取された皮膚片１０を洗浄液（ＲＩＮＳＥ液）２０ｍｌ中で２回洗浄する（図２：ステップＳ１）。
皮膚片１０に付着した異物、特に外皮に付着した異物を洗浄して除去するためである。
このＲＩＮＳＥ液は、皮膚片が乾燥して細胞が死滅してしまうのを防止するために添加されている。但し、ＲＩＮＳＥ液の量が多過ぎると、処理するべき皮膚片がＲＩＮＳＥ液に沈んでしまい、処理が難しくなる。係る見地により、「６０ｍｍのディシュ」に対して「３ｍｌ」というＲＩＮＳＥ液の量を設定した。
なお、処理作業が短時間であれば、生理食塩水を代用することが可能であるが、長時間に亘る作業の際には、栄養素を包含するＲＩＮＳＥ液の使用が好適である。
【００２３】
ここで洗浄液（ＲＩＮＳＥ液）は、皮膚片の洗浄のために調整された液体であり、浸透圧とミネラル組成が、採取された皮膚片の細胞と合致する様に調整されている。
当該ＲＩＮＳＥ液をケース・バイ・ケースで調整することが出来るが、市販品を用いることも可能である。
【００２４】
ステップＳ１において、ＲＩＮＳＥ液の量「２０ｍｌ」は、採取された皮膚片１０に付着した異物を洗浄除去するのに必要且つ十分な量として例示された量である。余り少な過ぎると皮膚片１０を十分に洗浄することが出来なくなる。但し、余りに使用量を増加すると、洗浄の対象である皮膚片１０が３ｍｍ四方という微小なサイズであるため、不経済である。
但し、皮膚片１０を十分に洗浄して付着物を除去することが出来て、しかも、不経済とならない程度の量であれば、ＲＩＮＳＥ液の量は２０ｍｌに限定されるものではない。
【００２５】
洗浄後、ＲＩＮＳＥ液３ｍｌの入った内径６０ｍｍのディシュに、洗浄により付着物が除去された皮膚片１０を移動する（ステップＳ２）。
【００２６】
そして、手術用のメス等を用いて、洗浄された皮膚片１０を、直径１ｍｍ程度の細片に切断する（ステップＳ３）。
皮膚片を細切後、ＲＩＮＳＥ液と共に細切された皮膚片を他の容器（例えば、容量５０ｍｌのｓｅｒｕｍ ｔｕｂｅ）に移し、１０ｍｌピペットでピペッティングする（ステップＳ４）。
【００２７】
そして、遠心分離機（図示せず）で、１０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行う（ステップＳ５）。当該遠心分離が終了したならば、上清を捨てて、新しいＲＩＮＳＥ液１０ｍｌを入れて（ステップＳ６）、再度、遠心分離機にかけて、１０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行う（ステップＳ７）。
【００２８】
ステップＳ５〜Ｓ７で示す工程は、ステップＳ３で手術用メスにより細断された皮膚片を回収するために行われる。
細断された皮膚片は、ＲＩＮＳＥ液中に点在しているので、そのままでは回収が困難である。しかし、テップＳ５〜Ｓ７で示す工程で遠心分離を行えば、細断された皮膚片はＲＩＮＳＥ液その他から分離され、極めて容易に回収される。
【００２９】
ここで、３ｍｍ四方の皮膚片１０を洗浄後、直ちに培地で培養せずに、直径１ｍｍ程度の細片に細断して回収するのは、３ｍｍ四方の皮膚片１０を培地上に設置して培養する場合に比較して、直径１ｍｍ程度の皮膚細片を（後述する様に）培地上に分散させる方が真皮層の細胞における自由度が大きく、繊維芽細胞が遊走する可能性が高くなるからである。
【００３０】
ステップＳ７の遠心分離が終了したならば、ＲＩＮＳＥ液３ｍｌを細胞を含むペレットに添加し（ステップＳ８）、細胞培養用のシャーレに細胞を含むペレットとＲＩＮＳＥ液の全量を移す（ステップＳ９）。細胞培養用のシャーレについては、詳細に後述する。
これで、前処理が完了する。
【００３１】
ステップＳ９が行われて前処理が完了したならば、温度３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で２日以上静置し、その後、２週間以上、シャーレ内の細胞を無菌培養する（ステップＳ１０）。ここで、ステップＳ１０は既に細胞を培養する段階であり、前処理とは言い得ない。その意味で、図２において、ステップＳ１０には括弧を付するのみで、四角い枠で囲まれているステップＳ１〜Ｓ９とは明確に異なって表現されている。
【００３２】
ここで、回収された皮膚細片が移された細胞培養用のシャーレ（培養装置）について、図３を参照して説明する。
断面図として表現されている図３において、全体を符号２０で示すシャーレ２０の底部には、高分子材料（例えばフィブリン、コラーゲン、多血小板血漿、ＣＭＣ等）２２から成る層が形成されており、高分子材料２２の層上に皮膚細片３０が載置されている。
そして、細胞培養用の培地（哺乳類細胞培養基本培地：以下、本明細書では、単に、「培地」と記載する）２４と、図１で示す工程で皮膚片１０を採取した患者自身の血液（自己血）２６とが分離不能に混合された混合物２５が、皮膚細片３０が載置されている高分子材料２２の層から上方の領域に充填されている。自己血２６はヘパリン採血した血清成分だけなので、凝固することは無い。
ここで、培地２４と自己血２６とを混合するに際して、培地２４に対する自己血２６の比率は、４％〜５０％である。
なお、図３において、符号２７は、遊走している繊維芽細胞を示す。
【００３３】
そして、温度が３７℃、５％ＣＯ２という雰囲気（図２のステップＳ１０に関連して説明）下で２日以上静置し、その後、２週間以上、シャーレ内の細胞を無菌培養する。その結果、皮膚細片３０の真皮層から繊維芽細胞が遊走する。
２日以上静置するのは、繊維芽細胞が遊離して足場を固めて落ち着くようにするためであり、「２週間」という期間は、繊維芽細胞の培養に最低限必要である。係る培養期間の最中は、最低でも１週間に２回、好ましくは毎日、上記混合物２５を新鮮なものに交換する。
ここで、増殖するのは繊維芽細胞のみである。表皮細胞や真皮成分が仮に混入していても、この条件下で生存し且つ増殖するだけの活性は持たない。従って、繊維芽細胞のみが培養、増殖する。
【００３４】
繊維芽細胞は増殖能力が高く、各臓器の実質細胞の間に介在する間質組織を構成し、紡錘型をしており、間葉系由来の（将来的に間質細胞となる）細胞であり、主にコラーゲンたんぱく質を産出する。
【００３５】
繊維芽細胞は分化して繊維細胞になるが、通常、繊維芽細胞及び繊維細胞は混在しており、何れもコラーゲン繊維を作り、分泌する。
繊維芽細胞の生体内での機能としては、間質組織の修復や維持であり、そして、傷や炎症の修復過程では旺盛に増殖し、コラーゲンやプロテオグリカン等の弾性繊維を作り出して、修復や生態の防衛反応に応答する。
そして、繊維芽細胞は、それが生存すれば、その場に留まってコラーゲンの供給源となるものである。
係る性質は、上述した施術、すなわち皮膚に生じた凹部を充填する施術（美容目的の施術：例えば、シワの線を取る、事故等で凹んだ箇所の修復）に好都合である。
【００３６】
ここで、培地２４は、皮膚細胞の培養に必要な幾つかの栄養素を含んでいる。具体的には、アミノ酸や糖質等の液体栄養素を包含する。
しかし、従来の培地２４には、血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）は、包含されていない。
そのため、自己血２６が充填されているのである。
換言すれば、培地２４、自己血２６の何れか一方のみでは、皮膚細胞（繊維芽細胞）の培養に必要な条件は充足しない。
【００３７】
培地２４としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：インビトロジェン株式会社発売：市販品）を使用した。
ここで、表１に、使用可能な培地ＤＭＥＭの組成を示す。
表１
【００３８】
但し、グルコースの量、アミノ酸（特にグルタミン酸）の量、ビタミン、ミネラル等、培地の組成が繊維芽細胞の条件に合致していれば、ＤＭＥＭ以外の培地、例えばＭＥＭ（インビトロジェン株式会社発売：市販品）、ＲＰＭ１１６４０（インビトロジェン株式会社発売：市販品）、ＨＡＮＫＳ（インビトロジェン株式会社発売：市販品）等を使用することも可能である。
【００３９】
発明者は、図示の実施形態に加えて、培地（ＤＭＥＭ）のみで培養した場合と、自己血のみで培養した場合についても、実験した。
係る実験の結果と、図３で示す様に培地２４に自己血２６を加えて繊維芽細胞を培養した場合とを比較して、以下の表１で示す。
表２
【００４０】
表２から明らかな様に、培地２４に自己血２６を加えた（図３参照）場合における繊維芽細胞の培養結果が極めて良好であるのに対して、培地２４のみ、或いは自己血２６のみでは、繊維芽細胞の培養は失敗している。
【００４１】
自己血２６を用いることにより、培養される皮膚細細片を構成する細胞が、拒絶反応等を起こすという不都合を防止することが出来る。また、増殖した繊維芽細胞が、血液を媒介とする各種感染症等の各種病気（或いは、その病原体）に感染してしまうことも防止できる。
さらに、自己血２６を用いる結果として、従来の牛の血清を用いて培養する手法とは異なり、いわゆる「狂牛病」（ＢＳＥ）感染の恐れが皆無となる。
【００４２】
自己血２６の量は、１０ｍｌで十分であることが、発明者の過去における実験結果より分かっている。自己血２６の量は、１０ｍｌ以下でも良い場合があるが、繊維芽細胞の培養中に、たんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が不足する事態を未然に防止するため、１０ｍｌの自己血２６を用いる。
【００４３】
図２のステップＳ１０を参照して上述した様に、図３で示す様なシャーレ２０は、温度３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下（人間の生体内の環境と類似した雰囲気）で２日以上静置し、その後、約２週間、無菌培養される。
無菌培養されている間に、皮膚細片３０の繊維芽細胞が分裂し増殖して、真皮層から遊走する。
【００４４】
ここで、繊維芽細胞が分裂、増殖すると、下方に延びて（いわゆる「脚を伸ばした」状態）、シャーレ２０の底部まで到達する。そして、さらに分裂、増殖すると、培養された繊維芽細胞をシャーレ２０から回収する際に、当該培養された繊維芽細胞が、シャーレ２０の底部に付着して、そこから外れなくなってしまう。そして、係る事態が生じて培養した繊維芽細胞が回収できなくなった場合や、シャーレ２０の底部に付着した繊維芽細胞を無理に外した際に繊維芽細胞を破壊してしまった場合には、長時間をかけて培養した繊維芽細胞を有効利用することが出来なくなってしまう。
そのため、従来は係る事態になった場合は、酵素（トリプシン、リガーゼ）を用いて、培養された繊維芽細胞をシャーレの底部から剥がしていた。しかし、前記酵素を用いた処理を行うために、多大な労力を費やさなければならなかった。
【００４５】
これに対して、図示の実施形態では、図３で示す様に、シャーレ２０の底部には高分子材料（例えばフィブリンシート）２２から成る層が形成されている。増殖した繊維芽細胞が下方に生長して、高分子材料（例えばフィブリンシート）２２から成る層の上に付着する。下方に生長した繊維芽細胞が高分子材料２２の層を貫通することは殆ど無い。
従って、図３で示す容器において、増殖して下方へ生長した繊維芽細胞がシャーレ２０の底部に付着することによる不都合は防止される。
【００４６】
その結果、増殖した繊維芽細胞はシャーレ２０から容易に剥離して、回収することが出来る。
表３に、シャーレ２０の底部にフィブリンシート２２を敷き詰めた場合における（増殖した）繊維芽細胞の回収結果と、シャーレ２０に直接培地２４を充填し、フィブリンシート２２を敷き詰めなかった場合における回収結果とを、比較して示す。
【００４７】
表３において、「回収率」は、繊維芽細胞を培養したシャーレを、フィブリンシートを敷き詰めたものとフィブリンシートを有していないものとを、それぞれ２０個用意して、肉眼で判別できる範囲で培養した繊維芽細胞を回収できたシャーレの個数を、全シャーレ数（２０個）に対する百分率で表現したものである。
同様に、「潰れた細胞の比率」は、繊維芽細胞が底壁や側壁に付着して剥離、回収できなかったシャーレの個数を、全シャーレ数（２０個）に対する百分率で表現している。
表３
表３から明らかな様に、フィブリンシートを有している方が、細胞を潰さずに回収することが出来る。
【００４８】
次に、高分子材料２２から成る層を、いわゆる「フィブリンシート」で形成する態様について、説明する。
図３において、シャーレ２０の底部にフィブリンシート２２（高分子材料）の層を作成するには、自己血から採取したフィブリンをシャーレ２０の底へ膜状に敷き詰め、フィブリンシートとして作成するのである。
【００４９】
具体的には、１０ｍｌの自己血を凝固させ、凝固した自己血を遠心分離によって回収する。ここで、「１０ｍｌ」という数値は、必要且つ十分と思われる数値として例示したものであり、限定的な意味は有さない。
回収された（凝固した）自己血を注射器の中に入れ、注射針から押し出すことにより物理的に破砕する。
その状態で、シャーレの底に敷き詰めれば、シャーレの底部にフィブリンシート２２の層が形成される。
【００５０】
この様な手法でフィブリンシート２２を形成する場合、フィブリンシート作成のために凝固させる自己血の量は、実験的に、１０ｍｌで十分なことが判明している。すなわち、皮膚片を採取した患者の自己血は、前述した培養用に必要な１０ｍｌと合わせて、合計で２０ｍｌが採血される。
なお、培地２４と共に培養に用いられる自己血２６（図３）については、凝固させない様に「ヘパリン採血」を行う。
【００５１】
次に、フィブリンシート作成の他の形態を説明する。
皮膚片を採取した患者の血液を採決し、採血後２〜３時間経過して凝固が始まった段階で、遠心分離にかける。採血された血液の凝固した塊（凝固塊）が下方に沈降したならば、上方にある凝固していない成分を培地（例えば、一般的なアミノ酸等の栄養培地）上に撒く。
【００５２】
前記「凝固していない成分」は、大部分が血清であり、血漿、その他少量の白血球、血小板、赤血球をふくんでおり、血清中には未だに凝固していない成分（フィブリンを含む）が、必要且つ十分な量だけ残存している。
従って、前記「凝固していない成分」を培地上に撒けば、前記「凝固していない成分」に包含されているフィブリンの残存量が培地上で徐々に凝固して、薄い膜、すなわちフィブリンシートが形成されるのである。
そして、この様に形成されたフィブリンシートを、図３で示す様に、シャーレ２０の底部に敷き詰めれば良いのである。
【００５３】
（皮膚細片３０の）繊維芽細胞の培養は、細胞数が１０００万個程度から１億個程度に増殖するまで行われる。しかし、増殖した細胞数は、培養期間を決定するための厳密な条件ではない。細胞数のオーダーが一桁違っても、容量的には殆ど変化がないからである。
なお、培養当初は、繊維芽細胞は数１００個程度であり、この数１００個の繊維芽細胞が遊離して、上述した細胞数になるまで十分に増殖してから、生体（皮膚片を採取した患者）に戻される。
【００５４】
すなわち、培養或いは増殖された繊維芽細胞は、図３で示す様なシャーレ２０から、患者の傷やシワ、事故等で凹んだ箇所の皮下に注入される。注入された繊維芽細胞は、注入された箇所で生長し、コラーゲンを産生して、患者の傷やシワ、その他の凹んだ箇所を修復する。
【００５５】
ここで、繊維芽細胞が生長するためには、患者（生体）内に注入された後においても、「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）を必要とする。換言すれば、係る立体的な構造を提供せずに、繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入しても、注入された繊維芽細胞は十分に生長せず、コラーゲン産生量も少なくなってしまう。
【００５６】
そのため、培養された繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入する以前に、繊維芽細胞生育のための立体的な構造（マトリックス）を提供するための基材と混合する。
使用する基材は次の通りである。
（１） Ｈｅｓｐａｎｄｅｒ（商品名：杏林製薬株式会社の製品）／Ｄｅｘｔｒａｎ（商品名：大塚製薬株式会社の製品）
（２） コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）或いはヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
（３） フィブリン（Ｆｉｂｒｉｎ）
（４） ＰＲＰ（多血小板血漿：Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ）
（５） ＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙ Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）
【００５７】
上記（１）の「Ｈｅｓｐａｎｄｅｒ／Ｄｅｘｔｒａｎ」は、浸透圧が血液と同等以上に設定されているもので、代用血漿として市販されている。使用の際には、繊維芽細胞生育のための栄養素として市販のアミノ酸製剤、例えばモリプロン（ｍｏｒｉｐｒｏｎ：商品名：味の素フォルマ株式会社の製品）、ハイプレアミン（Ｈｙ―ｐｌｅａｍｉｎ：商品名：扶桑薬品工業株式会社の製品）等を混合して使用することが好ましい。
【００５８】
上記（２）のコラーゲン或いはヒアルロン酸は、シワへの注入に用いられている一般的な注入剤である。繊維芽細胞が増殖しなくても、一次的に抗シワ効果が得られるという利点を有する。
従来技術で用いられているものは動物由来であるため、感染症、その他の病原体による汚染を防止する十分な処理が必須であった。これに対して、本発明においても繊維芽細胞がコラーゲンを産生するが、患者自身の繊維芽細胞を患者自身の血液（自己血）で培養しており、そのようにして増殖した繊維芽細胞が産生したコラーゲンであるため、「感染症、その他の病原体による汚染」の恐れが無い。
【００５９】
上記（３）のフィブリン、特に患者の自己血から生成したフィブリンは、基材として最適である。
【００６０】
上記（４）のＰＲＰは、自己血中に含まれる血小板及び血小板由来の成長因子を多量に含む血漿である。
血小板が産生する増殖因子により、繊維芽細胞の分裂、増殖が助長されるので、ＰＲＰを基材とすれば、注入材自体が繊維芽細胞の増殖に良好な環境を提供することが出来る、という利点を有している。
【００６１】
なお、上記項目（５）のＣＭＣは、例えば豊胸術で用いられる素材である。生体との馴染みが良いというメリットを有する。
【００６２】
次に、上述した様に培養された繊維芽細胞と、上述の基材とを用いて、生体に再移植する場合について、図４〜図９を参照して説明する。
上述した基材を培養された繊維芽細胞と混合するに際して、図４で示す様に、シャーレ２０内で培養された繊維芽細胞３１を、ピペットや注射器等の器具４０で吸引する。その際に、図３で示す様に、シャーレ２０の底部にはフィブリンシートが敷き詰められているので、繊維芽細胞３０はシャーレの底部に付着すること無く、シャーレ２０から容易に剥離して、器具４０内に吸引される。
【００６３】
器具４０に吸引された繊維芽細胞は、図５で示す様に、試験管等の振とう用容器４２内に移される。容器４２には、さらに、上述した基材３４が、ピペットや注射器等の器具４４により、投入される。
繊維芽細胞と基材との比率は、１：４〜４：１程度まで可能であり、例えば１：１で混合することが出来る。但し、これは基材の種類やその他の条件により変動する。例えば、ヒアルロン酸の様に粘調な基材の混合量は、少なくて済む。
【００６４】
ここで、図４で示す段階において、培養された繊維芽細胞３０と共に、シャーレ３０底部に敷き詰められたフィブリンシート（図３の符号２２：図４では図示せず）も器具４０で吸引される場合には、基材３４を容器４４へ新たに投入する必要はない。
フィブリンシートを構成するフィブリン自体が、（上述した様に）基材として極めて有効に作用するため、器具４０で吸引されたフィブリンシートを繊維芽細胞３０と共に容器４４へ投入すれば足りるからである。
【００６５】
繊維芽細胞３０及び基材３４（フィブリンシートの場合を含む）が投入された後、容器４２は、図６で示す様に、人手ＨＨにより振とうされる。
ここで、振とう機等の機械を使用しないのは、機械による振とうでは、繊維芽細胞が潰れてしまうおそれが存在するためである。勿論、細胞が潰れない程度の低速の振とうが可能であり、衛生面での配慮が十分に為され、且つ、人手ＨＨで行うよりも労力が低減できるのであれば、機械による振とうを行っても良い。
【００６６】
図６で示す工程により振とうされた基材（或いはマトリックス）及び繊維芽細胞、換言すれば繊維芽細胞と基材との混合物は、充填材料５０として、注射器４６に吸入される（図７）。
そして図８で示す様に、繊維芽細胞と基材との混合物である充填材料５０は、生体の皮膚Ｓ上に生じた凹部５５（例えば、傷、シワ、事故による欠損部等）の下方の領域（皮下部分）へ注入される。
【００６７】
充填材料５０を皮下注入した結果、皮膚Ｓ上の凹部（図９において、点線で示す凹部５５Ｂ）は、図９において符号５５Ａで示す様に、皮膚Ｓ上のその他の部位と同一レベルまで盛り上がり、修復される。
充填材料５０の組成物として皮下に注入された繊維芽細胞は、基材が存在するため、注入された箇所でも順調に成長し、弾性繊維であるコラーゲンを産生する。そのため、注入された繊維芽細胞自体が寿命を迎えたとしても、分裂して別の繊維芽細胞を再生し、コラーゲンの産生が継続される。そして、修復箇所５５Ａは皮膚Ｓ上のその他の部位と同一レベルの状態を維持する。
【００６８】
ここで、図７〜図９で示す生体への再移植は、培養された繊維芽細胞をシャーレ２０から取り出して（或いは回収して：図４の工程）から所定の時間内（６時間以内）に、好ましくは混合した直後に、注射器４６により、生体の所定箇所（きず、シワ、凹部、その他）の皮下へ注入され、充填される（図８）。
シャーレ２０（の培地２４）から回収された状態の繊維芽細胞は、（自己血を加えた培地２４上とは異なり）必要な栄養素が供給されている状態でなくなるため、培地２４から回収すると細胞活性が衰えてしまう。したがって、生体内に戻された繊維芽細胞が十分に成育して機能するためには、培地２４から回収された後、生体内に戻されるまでの時間が短ければ短い程、好都合である。
【００６９】
発明者等の実験によれば、自己血２６を加えた培地２４で培養された繊維芽細胞は、培地から回収された後、６時間以上経過すると、生体内に戻された後に成長するのに必要な細胞活性が失われた。
【００７０】
但し、基材としてフィブリンやＰＲＰを使用する場合には、係る基材は細胞が増殖するための好条件を提供することが出来るため、細胞活性の劣化を減衰して、培地から繊維芽細胞を回収した後、生体内に戻すまでの臨界時間を長くすることが可能である。
係る臨界時間に関する実験結果を表４で示す。
【００７１】
表４は、繊維芽細胞が培地から回収後、必要な活性を失うまでの時間を比較して示している。
表４
【００７２】
表４で示す実験結果から明らかな様に、基材としてコラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン或いはＰＲＰを用いれば、繊維芽細胞を培地から回収後、必要な活性を失うまでの時間を長期化することが出来る。
従って、培地から回収された繊維芽細胞の保存も容易となる。
【００７３】
培地から回収された繊維芽細胞と基材との混合物は、冷凍保存することが可能である。すなわち、培養された繊維芽細胞、自己血から得られた細胞保存用の血清、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド：Ｄｉｍｅｔｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、フィブリンシート（基材）とを混合し、液体窒素により急速冷凍すれば、その状態で冷凍保存が可能となる。
【００７４】
自己血から得られた細胞保存用の血清は、血清に「非働化」という操作を加えることにより得られる。「非働化」という操作は、血清を例えば５５℃で３０分加熱する操作であり、係る操作により、細胞増殖を抑制する因子（例えばＴＧＦ−ｂｅｔａ等）を不活性化して、血清中の成分を栄養素としての利用効率を高めることが出来る。
冷凍保存に際しては、保存用の血清１０％、培地、ＤＭＳＯ１０％の保存液中に増殖した繊維芽細胞を入れて、１分間に１℃ずつ冷やして、最終的には液体窒素中に保存するのである。
【００７５】
なお、ＤＭＳＯに代えて、グリセリン（ｇｒｙｃｅｒｉｎ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ）や、ＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙ Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａｒｃｈ）を使用することも可能である。
【００７６】
足場となる基材と混合されて生体内の所定箇所に注入された後、繊維芽細胞は順調に生育して、増殖すると共に、コラーゲンを産生して、傷やシワ、怪我で生じた凹部等の内部空間を充填し、係る傷、シワ、凹部が出来る以前の（生体の）状態に修復するのである。
【００７７】
図３の符号２２で示す高分子シート（例えばフィブリンシート）を使用しない場合には、遊走してきた繊維芽細胞は、培地と自己血との混合物中に沈み込んで、シャーレ２０の底部に張り付き、足場を固めながら生育する。
所定の培養期間が経過したならば、シャーレ２０から培地と自己血との混合物中を吸引して廃棄し、繊維芽細胞が乾燥しないうちに直ちにＲＩＮＳＥ液で洗浄して、酵素トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ：商品名「トリプシンレコンビナント」としてＲｏｃｈｅ社が製造、販売）を、直径が１０ｃｍのシャーレ２０であれば２５ｍｇ程度添加し、１０℃〜３７℃で１０〜２０分保温すれば、当該酵素の作用により、繊維芽細胞はシャーレ２０の底部から剥離する。
なお、トリプシンは長時間作用させると細胞毒性が出てくるので、必要最小限に使用する。例えば、シャーレの底部から繊維芽細胞を剥がすタイミングについては、温度や時間をパラメータとせずに、顕微鏡で観察しながら、繊維芽細胞が丸くなったならば、シャーレの底部から剥離する。
【００７８】
剥離した繊維芽細胞をピペットでトリプシンごと吸引して回収し、遠心分離機で８００ｒｐｍで５分間回転する。遠心分離機にかければ、繊維芽細胞は沈降するので、トリプシンとは分離される。沈降した繊維芽細胞を回収して、新たな培地に溶いで均等に拡散させる（混濁：約５〜１０ｍｌ）。新たに培地で混濁された繊維芽細胞は、例えば１０枚の別のシャーレへ撒くことによって、相対的な濃度を調整し、増殖した細胞を回収すれば、１０倍に増殖させることが出来る。
以下、回収、遠心分離、混濁、複数の別のシャーレで培養、という上記手順を繰り返して、所定数の繊維芽細胞を得る。
【００７９】
図４〜図９を参照して上述した実施形態において、高分子シート２２上で培養された細胞が、回収する際に注射器の針を通らず、回収が困難となってしまう場合が存在する。上述した様に、トリプシンを用いれば回収することは可能であるが、出来る限りトリプシンは使用したくないという要請が存在する。
係る場合に対処するには、例えば、高分子シート２２を、低温感受性ポリマーにすれば良い。以下、図１０〜図１２を参照して、低温感受性ポリマーを高分子シート２２にした場合について、説明する。
【００８０】
図３で示す様な状態で培養した結果、図１０で示す様に高分子シート２２の表面全域に亘って繊維芽細胞２７が増殖したのであれば、シャーレ２０が配置されている雰囲気温度を３７℃から３２℃まで降温する。
雰囲気温度を３２℃まで降温すると、低温感受性ポリマーの特性に基いて、図１１で示す様に、繊維芽細胞２７のシート２２に対する付着状態が解除され、培養された繊維芽細胞は、培地と自己血の混合物２５（液相）中を浮上する。
図１１では、シート２２から剥離して浮上した繊維芽細胞は符号２７Ａで示されている。
【００８１】
そして、図１２で示す様に、増殖した繊維芽細胞の全量が低温感受性ポリマーのシート２２から剥離して浮上したならば（符号「２７Ａ」で示す繊維芽細胞）、ピペットのような大径の器具６４により、浮上した繊維芽細胞２７Ａを回収すればよい。
【００８２】
培養された繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入する以前に、繊維芽細胞生育のための立体的な構造（マトリックス）を提供するための基材と混合するが、繊維芽細胞と上述した基材との比率は、１：４〜４：１程度まで可能である旨を上述したが、係る比率は、表５で示す結果から得られた。
表５では、繊維芽細胞と上述した基材との比率を、繊維芽細胞と基材との混合物に対する繊維芽細胞の百分率で示し、係る百分率を５％毎に、１０％（繊維芽細胞と上述した基材との比率が１：９）から９０％（繊維芽細胞と上述した基材との比率が９：１）の範囲で実験を行った。そして、３５％〜６５％の結果については、何れも「良好」であるため、表５では省略してある。
なお、移植後に再生箇所が他の領域と同一のレベルを維持することが出来た場合が「良好」、肉眼で判別できる程度の凹みが発生した場合を「不良」と判定している。
表５
【００８３】
このように、繊維芽細胞と基材との比率が１：４（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が２０％）〜４：１（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が８０％）程度であるのは、次の理由によるものと推測される。
すなわち、繊維芽細胞の比率が８０％よりも多いと、相対的に基材の量が少なすぎて、繊維芽細胞が生長するために必要な「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）が不十分となり、生体内に注入された繊維芽細胞は十分に生長せず、コラーゲン産生量も少なくなってしまう。一方、繊維芽細胞の比率が２０％未満であると、そもそも繊維芽細胞の絶対量が少ない為、コラーゲン産生量も少なくなってしまう。
そのため、上述した繊維芽細胞と基材との比率が１：４（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が２０％）〜４：１（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が８０％）が好ましいのである。
なお、表５では示されていないが、繊維芽細胞と基材との割合が１：１（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が５０％）の場合は、特に良好な結果を示した。
【００８４】
図３に関する上述した説明において、培養装置１０に収容される細胞培養用の培地２４と自己血２６との混合物は、培地２４に対する自己血２６の比率は、４％〜５０％である旨を述べたが、係る比率は、表５で示す実験結果から求められた。
表６で示す実験では、培地２４に対する自己血２６の比率を１％毎に、２％から５２％の範囲で実験を行った。そして、７％〜４８％の結果については、何れも「良好」であるため、表５では省略してある。
なお、移植に必要な量だけ培養が出来た場合が「良好」、必要量が得られなかった場合を「不良」と判定している。
表６
【００８５】
表６から明らかな様に、培地２４に対する自己血２６の比率が４％未満であるか、或いは５０％より大きいと、繊維芽細胞の培養は上手くいかなかった。その理由は、以下の様に推察される。
すなわち、培地２４に対する自己血２６の比率が４％未満であると、培地２４に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が少な過ぎて、血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が不足してしまう。一方、培地２４に対する自己血２６の比率が５０％より大きいと、培地２４に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が多すぎて、相対的に培地２４の量が少なくなり、培地中に含まれる皮膚細胞の培養に必要な幾つかの栄養素、例えばアミノ酸や糖質等の液体栄養素、が不足してしまう。
そのため、培地２４に対する自己血２６の比率は、４％〜５０％が好適なのである。
【００８６】
図示の実施形態はあくまでも例示であり、本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではない。
【００８７】
【発明の効果】
上述した本発明の作用効果を以下に列挙する。
（１） 「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）を組成分として包含しているので、他の組成分である繊維芽細胞は、培養容器から剥離して生体内に戻されても順調に生長し、コラーゲンを産生する。
（２） 培養しようとする繊維芽細胞を有する生体の血液（自己血）を市販の培地に加えて充填材料の組成物である繊維芽細胞を培養すれば、必要な栄養素やアミノ酸、浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が存在する環境下で、繊維芽細胞を順調に培養することが出来る。それと共に、自己血を用いるため、例えば他の生体の血液を媒介とする各種感染症や病原体が、充填材料を介して伝播してしまうことが、確実に防止出来る。
（３） 繊維芽細胞を培養しようとする培養容器の底部に高分子（フィブリン）のシートを敷き詰めておけば、培養された繊維芽細胞が培養容器の底部に付着して、剥離しなくなることが防止され、培養された繊維芽細胞の歩留まりが向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】皮膚片採取の態様を説明する図。
【図２】培養前の処理手順を説明する工程図。
【図３】培養装置の要部を説明する断面図。
【図４】培養装置から繊維芽細胞を回収する態様を示す斜視図。
【図５】繊維芽細胞と基材とを混合する工程を示す図。
【図６】繊維芽細胞と基材とを混合する工程であって、図５に後続する工程を示す図。
【図７】充填材料を注射に吸引する状態を示す図。
【図８】充填材料を皮下注入する状態を示す図。
【図９】皮下注入された後の充填材料を示す図。
【図１０】増殖した繊維芽細胞を回収する態様を示す図。
【図１１】図１０で示す繊維芽細胞を回収する態様であって、図１０とは別の段階を示す図。
【図１２】図１０、図１１で示す繊維芽細胞を回収する態様であって、図１０、図１１とは別の段階を示す図。
【符号の説明】
１０・・・培養装置
２０・・・シャーレ
２２・・・高分子材料（フィブリンシート）
２４・・・培地
２５・・・培地と自己血との混合物
２６・・・自己血
３０・・・皮膚細片
３１・・・繊維芽細胞
４０，４４・・・器具（ピペット）
４２・・・振とう用容器
４６・・・注射器
ＨＨ・・・人手
５０・・・充填材料
Ｓ・・・皮膚
５５，５５Ｂ・・・凹部
５５Ａ・・・修復箇所[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a technique for repairing a concave portion formed in the skin (for example, a portion depressed due to a wound, wrinkle, accident, or the like) by subcutaneously injecting a filling material. More particularly, it relates to a filling material used in such a technique.
[0002]
[Prior art]
For example, when a concave portion (scratch, wrinkle, depression due to an accident, etc.) is generated on the skin of a living body for any reason, it is possible to restore or restore the state before the concave portion is formed. The main purpose of the treatment (reducing wrinkled lines and repairing the recessed parts due to accidents, etc.) is very significant.
[0003]
In order to perform such treatment, it is conceivable to use artificial skin (for example, Patent Document 1).
However, it is not preferable to incorporate an artificial product such as artificial skin into a living body because it may cause rejection.
In addition, artificial skin and skin grafting methods are intended to compensate for extensive skin damage caused by burns, etc., and the skin has a protective isolation function from the outside world, maintaining bacterial infection and moisture. To deal with cases where local immunity is deficient. Therefore, it is not originally intended to deal with a case where a defect occurs in the elastic fiber under the skin, such as a concave portion due to wrinkles or an accident.
[0004]
On the other hand, in recent years, cells of the skin of a living body (patient) aiming at repairing the concave portion of the skin are cultured, the cultured skin cells are filled into the concave portion as described above, and the concave portion is the same as the periphery The technology to revive up to the level of so-called restoration (so-called “re-implantation”) is being carried out.
Such a technique is advantageous in addressing the loss of elastic fibers below the skin without the problem of rejection after re-implantation.
[0005]
Here, skin cells, particularly fibroblasts, require a three-dimensional structure (matrix) that becomes a “scaffold” for growth. In other words, even if only fibroblasts are injected into a patient (living body) without providing such a three-dimensional structure, the injected fibroblasts do not grow sufficiently.
[0006]
However, in the conventional most transplantation technique, such “scaffolding” is not considered at all, and therefore, even if skin cells (particularly fibroblasts) are injected into a patient (living body), they do not grow sufficiently. There is a problem that the effect of repairing the recess as described above cannot be obtained sufficiently.
Or, even if the recess was repaired, there was a possibility that the injected cells would die without growing.
[0007]
A filling material for subcutaneous injection that does not cause such a problem is desired, but at present, such a filling material has not been proposed yet.
[0008]
[Patent Literature]
JP 2001-104346 A
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been proposed in view of the above-mentioned problems of the prior art, and is a filling material for subcutaneous injection that does not cause rejection and has good growth of injected fibroblasts. The purpose is to provide.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The filling material for subcutaneous injection of the present invention comprises fibroblasts (31) cultured from a skin piece excised from a living body (for example, a patient) and a three-dimensional structure (matrix: “scaffold”) for fibroblast growth. And a base material (34) that provides the composition (claim 1).
Here, it is preferable that the ratio of the fibroblast and the base material is 1: 4 to 4: 1.
[0011]
According to the filling material of the present invention having the above-described configuration, the fibroblast as the composition is cultured from a skin piece excised from a living body (for example, a patient), and thus there is no fear of rejection. .
And since the substrate included as a composition provides a three-dimensional structure (matrix: “scaffold”) for fibroblast growth, the fibroblasts, which are the compositions in the filling material, When it is reimplanted in the patient), it grows smoothly and produces collagen, which is an elastic fiber.
Even if the injected fibroblasts themselves reach the end of their lives, they divide and regenerate new fibroblasts. Therefore, it is possible to maintain the same level as the other sites around the reimplantation site without deforming the reimplanted repair site.
[0012]
Here, as the base material, Hespander (Hespander: trade name: product of Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd.) / Dextran (Dextran: trade name: product of Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), collagen (Collagen), hyaluronic acid (Hyaluronic acid), It is preferably selected from any of fibrin, platelet-rich plasma (PRP), and CMC (Carboxy Methyl Cellulose) (Claim 2).
[0013]
In carrying out the present invention, the fibroblasts are filled with a medium (mammalian cell culture basic medium 24: for example DMEM) in a casing (for example, a commercially available petri dish made of glass or synthetic resin: 20). The fibroblasts cultured in a culture apparatus in which blood (autologous blood 26) collected from a living body having skin cells to be cultured is added (medium and blood collected from the living body are mixed) It is preferable to use (Claim 3).
A commercially available basic culture medium for mammalian cell culture can be used as the medium.
[0014]
If such a structure is adopted, proteins contained in blood that could not be added to conventional media and components (albumin) necessary to maintain the osmotic pressure of blood and culture medium are cultured. As provided in the device, fibroblasts with strong regenerative power grow and proliferate very well.
Since blood (autologous blood) collected from the living body having the skin cells (fibroblasts) to be cultured is added to the culture medium, it is transmitted via blood from other living bodies or blood from other animals (such as cattle). The possibility to do is completely eliminated.
The ratio of blood (autologous blood 26) to the medium (24) is preferably 4% to 50%. If the amount of blood (autologous blood 26) collected from the living body with respect to the medium (24) is too small, proteins contained in the blood and components (albumin) necessary for maintaining the osmotic pressure of the blood and the culture solution are insufficient. Resulting in. On the other hand, when the amount of blood (autologous blood 26) collected from the living body with respect to the medium (24) is too large, the amount of the medium (24) is relatively small, which is necessary for culturing skin cells contained in the medium. Some nutrients, such as liquid nutrients such as amino acids and sugars.
For this reason, the above-described ratio (4% to 50%) of blood (autologous blood 26) to the culture medium (24) is preferable.
[0015]
Here, the culture apparatus is preferably placed in an atmosphere having a temperature of about 37 ° C. and containing about 5% carbon dioxide. This is because the cells are cultured in an atmosphere close to the environment in the living body, so that the conditions for growing fibroblasts are established.
[0016]
Furthermore, it is preferable that a sheet made of a polymer material (for example, fibrin) is spread on the bottom of the casing (the petri dish 20) of the culture apparatus (claim 4).
Even if the fibroblasts proliferate and extend below the culture medium, they do not penetrate the polymer material sheet (for example, fibrin sheet) and adhere to the bottom of the casing (petri dish 20). This is because it is very easily recovered from the culture apparatus.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings.
[0018]
As described above, there is no inconvenience such as rejection when performing a treatment for filling a concave portion generated in the skin (cosmetic treatment: for example, removing a wrinkle line or repairing a concave portion caused by an accident). Therefore, it is desirable to fill the recess with cells of the patient's own skin performing the treatment.
From such a viewpoint, it is necessary to culture cells of the skin of the patient performing the treatment.
[0019]
When culturing skin cells, as shown in FIG. 1, 3 mm square from the rear part of the patient's ear Y (between the ear Y and the hairline H of the hair: indicated by reference numeral 12 in FIG. 1). A piece of skin (indicated by reference numeral 10 in FIG. 1) is collected or excised.
The skin piece 10 is collected (or excised) so as to include the dermis layer. As will be described later, this is to isolate fibroblasts that migrate from the dermis layer by culture.
[0020]
Here, since the portion where the skin piece 10 is collected is “the portion behind the ear Y” (12), it is usually a portion that is not affected by ultraviolet rays. This is because the state is kept in good condition. At the same time, the traces (scratches) from which the skin pieces were collected are inconspicuous.
In other words, it is a place where the state of the cells of the skin containing fibroblasts is not affected by ultraviolet rays, and if the trace (scratch) of collecting the skin piece is inconspicuous, A 3 mm square skin piece 10 may be collected from a place other than the part behind the ear Y.
[0021]
Here, if an excessive amount of skin is collected, the collected trace may remain in the patient. In addition, it is impossible to collect an excessively large skin piece from the portion behind the ear Y described above. Therefore, the area of the collected skin piece 10 cannot be increased more than necessary.
On the other hand, if the skin pieces are not of a certain size, there is a possibility that a sufficient amount of fibroblasts cannot be secured when culturing is carried out by carrying out pretreatment described later.
For the above reason, the skin piece 10 to be collected was set to “3 mm square”. However, based on the above reasons, the size of the skin piece to be collected is not limited to “3 mm square” as long as it is not too large and not too small.
[0022]
Next, the collected (removed) skin piece 10 is pretreated by the procedure as shown in FIG.
First, the collected skin piece 10 is washed twice in 20 ml of a washing solution (RINSE solution) (FIG. 2: step S1).
This is because the foreign matter adhering to the skin piece 10, particularly the foreign matter adhering to the outer skin, is washed away.
This RINSE solution is added to prevent the skin pieces from drying and the cells from being killed. However, if the amount of the RINSE solution is too large, the skin piece to be processed sinks into the RINSE solution, and the processing becomes difficult. From this standpoint, the amount of the RINSE solution of “3 ml” was set for “60 mm dish”.
If the treatment operation is short, physiological saline can be used instead. However, in the case of a long operation, it is preferable to use a RINSE solution containing nutrients.
[0023]
Here, the cleaning liquid (RINSE liquid) is a liquid adjusted for cleaning the skin piece, and the osmotic pressure and the mineral composition are adjusted to match the cells of the collected skin piece.
The RINSE solution can be adjusted on a case-by-case basis, but commercially available products can also be used.
[0024]
In step S1, the amount “20 ml” of the RINSE solution is an amount exemplified as an amount necessary and sufficient for cleaning and removing the foreign matter adhering to the collected skin piece 10. If the amount is too small, the skin piece 10 cannot be sufficiently cleaned. However, if the amount of use is increased too much, the skin piece 10 to be cleaned has a minute size of 3 mm square, which is uneconomical.
However, the amount of the RINSE solution is not limited to 20 ml as long as the skin piece 10 can be sufficiently washed to remove deposits and does not become uneconomical.
[0025]
After washing, the skin piece 10 from which the deposits have been removed by washing is moved to a dish having an inner diameter of 60 mm containing 3 ml of the RINSE solution (step S2).
[0026]
Then, the cleaned skin piece 10 is cut into strips having a diameter of about 1 mm using a surgical knife or the like (step S3).
After the skin piece is shredded, the skin piece cut together with the RINSE solution is transferred to another container (for example, a serum tube having a capacity of 50 ml) and pipetted with a 10 ml pipette (step S4).
[0027]
And it centrifuges for 5 minutes at 1000 rpm with a centrifuge (not shown) (step S5). When the centrifugation is completed, the supernatant is discarded, 10 ml of a new RINSE solution is added (step S6), and the mixture is centrifuged again at 1000 rpm for 5 minutes (step S7).
[0028]
The process shown by step S5-S7 is performed in order to collect | recover the skin piece shredded with the scalpel for operation in step S3.
The shredded skin pieces are scattered in the RINSE solution, and are difficult to collect as they are. However, if centrifugation is performed in the steps shown in Steps S5 to S7, the cut pieces of skin are separated from the RINSE solution and others and recovered very easily.
[0029]
Here, after washing the 3 mm square skin piece 10, it is not immediately cultured in the medium, but is cut into pieces having a diameter of about 1 mm and collected. The 3 mm square skin piece 10 is placed on the medium. Compared with the case of culturing, it is more likely that cells of the dermis layer are dispersed, and the possibility that fibroblasts migrate will be higher if a skin strip having a diameter of about 1 mm is dispersed on the medium (as will be described later). Because.
[0030]
When the centrifugation in step S7 is completed, 3 ml of the RINSE solution is added to the pellet containing cells (step S8), and the total amount of the pellet containing cells and the RINSE solution is transferred to a cell culture dish (step S9). The petri dish for cell culture will be described in detail later.
This completes the preprocessing.
[0031]
When step S9 is performed and the pretreatment is completed, the sample is allowed to stand for 2 days or more in an atmosphere of a temperature of 37 ° C. and 5% CO 2, and then the cells in the petri dish are aseptically cultured for 2 weeks or more (step S10) . Here, step S10 is a stage in which cells are already cultured, and cannot be said to be pretreatment. In that sense, in FIG. 2, step S10 is simply indicated by parentheses, and is clearly different from steps S1 to S9 surrounded by a square frame.
[0032]
Here, a petri dish (culture apparatus) for cell culture in which the collected skin debris has been transferred will be described with reference to FIG.
In FIG. 3, which is expressed as a cross-sectional view, a layer made of a polymer material (for example, fibrin, collagen, platelet-rich plasma, CMC, etc.) 22 is formed at the bottom of the petri dish 20 indicated as a whole by the reference numeral 20. A skin strip 30 is placed on the layer of polymeric material 22.
Then, a culture medium for cell culture (mammalian cell culture basic medium: hereinafter, simply referred to as “medium”) 24 and the blood of the patient who collected the skin piece 10 in the step shown in FIG. A mixture 25 inseparably mixed with (autologous blood) 26 is filled in an area above the layer of the polymer material 22 on which the skin strip 30 is placed. Since the autologous blood 26 is only a serum component collected from heparin, it does not clot.
Here, when the culture medium 24 and the autologous blood 26 are mixed, the ratio of the autologous blood 26 to the culture medium 24 is 4% to 50%.
In addition, in FIG. 3, the code | symbol 27 shows the fibroblast which is migrating.
[0033]
Then, it is allowed to stand for 2 days or more in an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 (explained in connection with step S10 in FIG. 2), and then the cells in the petri dish are aseptically cultured for 2 weeks or more. As a result, fibroblasts migrate from the dermis layer of the skin strip 30.
The reason for leaving still for 2 days or more is to release the fibroblasts so that the scaffolds are solidified and settled, and the period of “2 weeks” is the minimum necessary for culturing the fibroblasts. During such a culture period, the mixture 25 is replaced with a fresh one at least twice a week, preferably daily.
Here, only fibroblasts proliferate. Even if epidermal cells and dermal components are mixed, they do not have the activity to survive and proliferate under these conditions. Therefore, only fibroblasts are cultured and grown.
[0034]
Fibroblasts are highly proliferative, constitute interstitial tissue interspersed between parenchymal cells of each organ, have a spindle shape, and are cells derived from the mesenchymal system (to become stromal cells in the future) Yes, mainly produces collagen protein.
[0035]
Fibroblasts differentiate and become fibrocytes, but usually fibroblasts and fibrocytes coexist and both produce and secrete collagen fibers.
The in vivo function of fibroblasts is the repair and maintenance of interstitial tissue, and it proliferates vigorously in the process of repairing wounds and inflammation, creating elastic fibers such as collagen and proteoglycans for repair and ecology. Respond to the defense reaction.
And if it survives, the fibroblast will stay in place and become a collagen supply source.
Such a property is advantageous for the above-described treatment, that is, a treatment for filling a concave portion formed in the skin (cosmetic treatment: for example, taking a wrinkle line or repairing a concave portion caused by an accident).
[0036]
Here, the culture medium 24 contains some nutrients necessary for culturing skin cells. Specifically, liquid nutrients such as amino acids and carbohydrates are included.
However, the conventional medium 24 does not include proteins contained in blood and components (albumin) necessary for maintaining the osmotic pressure of blood or culture fluid.
Therefore, the autologous blood 26 is filled.
In other words, only one of the medium 24 and the autologous blood 26 does not satisfy the conditions necessary for culturing skin cells (fibroblasts).
[0037]
As the medium 24, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Invitrogen Co., Ltd .: commercially available product) was used.
Here, Table 1 shows the composition of the usable medium DMEM.
Table 1
[0038]
However, if the medium composition matches the fibroblast conditions, such as the amount of glucose, the amount of amino acids (particularly glutamic acid), vitamins, minerals, etc., a medium other than DMEM, for example, MEM (Invitrogen Corporation released: commercial product) ), RPM11640 (released by Invitrogen Corporation: commercially available), HANKS (released by Invitrogen Corporation: commercially available), and the like can also be used.
[0039]
In addition to the illustrated embodiment, the inventor has also experimented when cultivating only with a medium (DMEM) and when culturing only with autologous blood.
The results of this experiment are compared with the case where fibroblasts are cultured by adding autologous blood 26 to the medium 24 as shown in FIG.
Table 2
[0040]
As is clear from Table 2, the culture results of fibroblasts when the autologous blood 26 was added to the culture medium 24 (see FIG. 3) were very good, whereas the culture medium 24 alone or only the autologous blood 26 alone. The culture of fibroblasts has failed.
[0041]
By using the autologous blood 26, it is possible to prevent the disadvantage that the cells constituting the cultured skin strip cause a rejection reaction or the like. It is also possible to prevent the proliferated fibroblasts from being infected with various diseases (or pathogens thereof) such as blood-borne various infections.
Furthermore, as a result of using autologous blood 26, unlike the conventional method of culturing using bovine serum, there is no risk of so-called “mad cow disease” (BSE) infection.
[0042]
It is known from the results of experiments by the inventors in the past that the amount of autologous blood 26 is sufficient. Although the amount of autologous blood 26 may be 10 ml or less, there may be a shortage of protein and components (albumin) necessary to maintain the osmotic pressure of blood or culture medium during fibroblast culture. To prevent it, 10 ml of autologous blood 26 is used.
[0043]
As described above with reference to step S10 of FIG. 2, the petri dish 20 as shown in FIG. 3 has a temperature of 37 ° C. and an atmosphere of 5% CO 2 (an atmosphere similar to the environment in the human body) for two days or more. Allow to stand and then aseptically cultured for about 2 weeks.
During aseptic culture, the fibroblasts of skin strip 30 divide and proliferate and migrate from the dermis layer.
[0044]
Here, when the fibroblasts divide and proliferate, they extend downward (so-called “legs extended” state) and reach the bottom of the petri dish 20. If the cultured fibroblasts are further recovered from the petri dish 20 when further divided and proliferated, the cultured fibroblasts adhere to the bottom of the petri dish 20 and cannot be detached therefrom. And when such a situation occurs and the cultured fibroblasts can no longer be collected, or when the fibroblasts are destroyed when the fibroblasts attached to the bottom of the petri dish 20 are forcibly removed, The fibroblasts cultured for a long time cannot be used effectively.
Therefore, conventionally, when such a situation occurs, the cultured fibroblasts are peeled off from the bottom of the petri dish using enzymes (trypsin, ligase). However, a great amount of labor has to be spent to perform the treatment using the enzyme.
[0045]
In contrast, in the illustrated embodiment, as shown in FIG. 3, a layer made of a polymer material (for example, a fibrin sheet) 22 is formed on the bottom of the petri dish 20. Proliferated fibroblasts grow downward and adhere onto a layer of polymeric material (eg, fibrin sheet) 22. The fibroblasts grown downward hardly penetrate the layer of the polymer material 22.
Therefore, in the container shown in FIG. 3, inconvenience due to the fibroblasts that have grown and grown downward adhere to the bottom of the petri dish 20 is prevented.
[0046]
As a result, the proliferated fibroblasts can be easily detached from the petri dish 20 and collected.
Table 3 shows the result of collecting (proliferated) fibroblasts when the fibrin sheet 22 was spread on the bottom of the petri dish 20, and the result of collecting when the medium 20 was directly filled in the petri dish 20 and the fibrin sheet 22 was not spread. Are shown in comparison.
[0047]
In Table 3, the “recovery rate” is a range in which the petri dish in which the fibroblasts are cultured is prepared with 20 fibrin sheets spread and no fibrin sheets, and can be discriminated with the naked eye. The number of petri dishes from which cultured fibroblasts could be recovered is expressed as a percentage of the total number of petri dishes (20).
Similarly, “the ratio of crushed cells” expresses the number of petri dishes in which fibroblasts adhere to the bottom wall or side wall and cannot be detached or collected as a percentage of the total number of petri dishes (20).
Table 3
As is clear from Table 3, cells with fibrin sheets can be recovered without crushing the cells.
[0048]
Next, an embodiment in which the layer made of the polymer material 22 is formed of a so-called “fibrin sheet” will be described.
In FIG. 3, in order to create a layer of the fibrin sheet 22 (polymer material) on the bottom of the petri dish 20, fibrin collected from the autologous blood is spread on the bottom of the petri dish 20 to form a fibrin sheet.
[0049]
Specifically, 10 ml of autologous blood is coagulated, and the coagulated autologous blood is collected by centrifugation. Here, the numerical value of “10 ml” is illustrated as a numerical value that seems necessary and sufficient, and has no limiting meaning.
The collected (coagulated) autologous blood is placed into a syringe and physically broken by pushing it out of the needle.
If the bottom of the petri dish is spread in that state, the fibrin sheet 22 layer is formed on the bottom of the petri dish.
[0050]
When the fibrin sheet 22 is formed by such a method, it has been experimentally found that 10 ml is sufficient as the amount of autologous blood to be coagulated for producing the fibrin sheet. That is, the patient's autologous blood collected from the skin piece is collected in a total of 20 ml together with the 10 ml necessary for the culture described above.
In addition, about the autologous blood 26 (FIG. 3) used for culture | cultivation with the culture medium 24, "heparin blood collection" is performed so that it may not coagulate.
[0051]
Next, another form of fibrin sheet creation will be described.
The blood of the patient from whom the skin piece has been collected is voted and centrifuged at the stage where clotting has started 2 to 3 hours after blood collection. If the coagulated clot (coagulated clot) of collected blood settles downward, the upper non-coagulated component is spread on a medium (for example, a nutrient medium such as a general amino acid).
[0052]
The “non-coagulated component” is mostly serum and contains plasma, other small amounts of white blood cells, platelets, and red blood cells, and components that have not yet coagulated (including fibrin) are necessary in the serum. And a sufficient amount remains.
Accordingly, if the “non-coagulated component” is spread on the medium, the remaining amount of fibrin contained in the “non-coagulated component” gradually solidifies on the medium, and a thin film, ie, a fibrin sheet. Is formed.
Then, the fibrin sheet formed in this way may be spread on the bottom of the petri dish 20 as shown in FIG.
[0053]
The fibroblasts (of the skin strip 30) are cultured until the number of cells grows from about 10 million to about 100 million. However, the number of cells grown is not a strict condition for determining the culture period. This is because even if the order of the number of cells is an order of magnitude, there is almost no change in capacity.
At the beginning of the culture, the number of fibroblasts is about several hundreds. The hundreds of fibroblasts are released and sufficiently proliferated until the above-mentioned number of cells is reached. Patient).
[0054]
In other words, the cultured or proliferated fibroblasts are injected subcutaneously from a petri dish 20 as shown in FIG. 3 into a portion recessed due to a patient's wound, wrinkle, accident, or the like. The injected fibroblasts grow at the injected site, produce collagen, and repair wounds, wrinkles, and other indentations in the patient.
[0055]
Here, in order for fibroblasts to grow, a three-dimensional structure (matrix) that becomes a “scaffold” even after being injected into a patient (living body) is required. In other words, even if only fibroblasts are injected into a patient (living body) without providing such a three-dimensional structure, the injected fibroblasts do not grow sufficiently and the amount of collagen production is reduced. End up.
[0056]
Therefore, before injecting only cultured fibroblasts into a patient (living body), it is mixed with a base material for providing a three-dimensional structure (matrix) for fibroblast growth.
The base material to be used is as follows.
(1) Hespander (trade name: product of Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd.) / Dextran (trade name: product of Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)
(2) Collagen or hyaluronic acid
(3) Fibrin
(4) PRP (platelet rich plasma: Platelet Rich Plasma)
(5) CMC (Carboxy Methyl Cellulose)
[0057]
“Hespaner / Dextran” in (1) above has an osmotic pressure set equal to or higher than that of blood, and is commercially available as a substitute plasma. In use, commercially available amino acid preparations as nutrients for fibroblast growth, such as molypron (trade name: product of Ajinomoto Forma Co., Ltd.), hypreamine (trade name: Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.) It is preferable to use a mixture of company products).
[0058]
Collagen or hyaluronic acid of (2) above is a general injection used for injection into wrinkles. Even if fibroblasts do not grow, there is an advantage that an anti-wrinkle effect can be obtained primarily.
Since what is used in the prior art is derived from animals, sufficient treatment to prevent infection and other pathogen contamination was essential. In contrast, in the present invention, fibroblasts produce collagen, but the patient's own fibroblasts are cultured in the patient's own blood (autologous blood), and the fibroblasts so proliferated are Because it is produced collagen, there is no fear of “contamination by infectious diseases or other pathogens”.
[0059]
Fibrin (3) above, particularly fibrin produced from the patient's autologous blood, is optimal as a substrate.
[0060]
The PRP of (4) is plasma containing a large amount of platelets contained in autologous blood and platelet-derived growth factors.
The growth factor produced by platelets promotes fibroblast division and proliferation. Therefore, if PRP is used as a base material, the injection material itself can provide a favorable environment for fibroblast proliferation. Has advantages.
[0061]
The CMC of item (5) is a material used in breast augmentation, for example. It has the advantage of being familiar with the living body.
[0062]
Next, a case where re-implantation into a living body using the fibroblasts cultured as described above and the above-described base material will be described with reference to FIGS.
When mixing the above-mentioned base material with the cultured fibroblasts, as shown in FIG. 4, the fibroblasts 31 cultured in the petri dish 20 are sucked with an instrument 40 such as a pipette or a syringe. At that time, as shown in FIG. 3, since the fibrin sheet is spread on the bottom of the petri dish 20, the fibroblasts 30 are easily detached from the petri dish 20 without adhering to the bottom of the petri dish. 40 is aspirated.
[0063]
The fibroblasts sucked into the instrument 40 are transferred into a shaking container 42 such as a test tube as shown in FIG. Further, the base material 34 described above is put into the container 42 by an instrument 44 such as a pipette or a syringe.
The ratio between the fibroblast and the substrate can be up to about 1: 4 to 4: 1. For example, the ratio can be 1: 1. However, this will vary depending on the type of substrate and other conditions. For example, the mixing amount of a viscous base material such as hyaluronic acid may be small.
[0064]
Here, in the stage shown in FIG. 4, the fibrin sheet (reference numeral 22 in FIG. 3: not shown in FIG. 4) spread on the bottom of the petri dish 30 is also sucked by the instrument 40 together with the cultured fibroblasts 30. Therefore, it is not necessary to newly introduce the base material 34 into the container 44.
This is because the fibrin itself constituting the fibrin sheet acts extremely effectively as a substrate (as described above), and therefore it is sufficient to put the fibrin sheet sucked by the instrument 40 into the container 44 together with the fibroblasts 30.
[0065]
After the fibroblasts 30 and the base material 34 (including the case of the fibrin sheet) are charged, the container 42 is shaken by human hand HH as shown in FIG.
Here, the reason why a machine such as a shaker is not used is that there is a possibility that fibroblasts may be crushed when shaken by a machine. Of course, if shaking is possible at such a low speed that the cells are not crushed, sufficient consideration is given to hygiene, and if labor can be reduced compared to manual HH, then shaking by machine is performed. May be.
[0066]
The base material (or matrix) and fibroblasts shaken by the process shown in FIG. 6, in other words, the mixture of fibroblasts and base material is inhaled into the syringe 46 as the filling material 50 (FIG. 7). .
As shown in FIG. 8, the filling material 50, which is a mixture of fibroblasts and a base material, is below the concave portion 55 (for example, a wound, a wrinkle, a defective portion due to an accident, etc.) generated on the skin S of the living body. Injection into the area (subcutaneous part).
[0067]
As a result of the subcutaneous injection of the filling material 50, the concave portion on the skin S (the concave portion 55B indicated by a dotted line in FIG. 9) rises to the same level as other portions on the skin S, as indicated by reference numeral 55A in FIG. It will be repaired.
Since the fibroblasts injected subcutaneously as a composition of the filling material 50 have a base material, the fibroblasts grow smoothly even at the injected site and produce collagen which is an elastic fiber. Therefore, even if the injected fibroblast itself reaches the end of its life, it divides and regenerates another fibroblast, and collagen production continues. Then, the repaired portion 55A maintains the same level as other portions on the skin S.
[0068]
Here, in the reimplantation into the living body shown in FIGS. 7 to 9, the cultured fibroblasts are taken out from the petri dish 20 (or collected: in the step of FIG. 4) within a predetermined time (within 6 hours). Preferably, immediately after mixing, the syringe 46 is injected subcutaneously into a predetermined portion (scratches, wrinkles, recesses, etc.) of the living body and filled (FIG. 8).
The fibroblasts in the state recovered from the petri dish 20 (of the medium 24) are not in a state where necessary nutrients are supplied (unlike the medium 24 added with autologous blood). Activity declines. Therefore, in order for the fibroblasts returned to the living body to sufficiently grow and function, the shorter the time it takes for the fibroblasts to be recovered from the medium 24 and returned to the living body, the more advantageous.
[0069]
According to the inventors' experiments, fibroblasts cultured in the medium 24 with the addition of autologous blood 26 grow after being recovered from the medium and then returned to the living body after 6 hours. Necessary cellular activity was lost.
[0070]
However, when fibrin or PRP is used as a base material, the base material can provide favorable conditions for cell growth, so that the deterioration of cell activity is attenuated and fibroblasts are removed from the medium. It is possible to lengthen the critical time until it is recovered after being collected.
Table 4 shows the experimental results regarding the critical time.
[0071]
Table 4 shows a comparison of the time taken for the fibroblasts to lose their required activity after recovery from the medium.
Table 4
[0072]
As is apparent from the experimental results shown in Table 4, if collagen, hyaluronic acid, fibrin or PRP is used as the base material, it is possible to prolong the time until the necessary activity is lost after the fibroblasts are recovered from the medium. I can do it.
Therefore, it becomes easy to preserve fibroblasts collected from the medium.
[0073]
The mixture of fibroblasts and substrate recovered from the medium can be stored frozen. That is, if cultured fibroblasts, serum for cell preservation obtained from autologous blood, DMSO (dimethyl sulfoxide), fibrin sheet (base material) are mixed and rapidly frozen with liquid nitrogen, It can be stored frozen in the state.
[0074]
A serum for cell storage obtained from autologous blood is obtained by subjecting the serum to an operation of “inactivation”. The operation of “inactivation” is an operation of heating the serum at, for example, 55 ° C. for 30 minutes. By such an operation, a factor that suppresses cell growth (eg, TGF-beta) is inactivated, and components in the serum are removed. Utilization efficiency as a nutrient can be increased.
When cryopreserving, fibroblasts grown in a stock solution of 10% serum, medium, and DMSO 10% are stored, cooled at 1 ° C. per minute, and finally stored in liquid nitrogen. is there.
[0075]
In place of DMSO, glycerin (glycerin) or HES (Hydroxy Ethyl Star) may be used.
[0076]
After being mixed with a base material to be used as a scaffold and injected into a given part of the living body, the fibroblasts grow smoothly and proliferate, and produce collagen, resulting in a wound, wrinkle, indentation caused by injury, etc. The internal space is filled, and the wound (wrinkles) and recesses are restored to the previous (biological) state.
[0077]
When the polymer sheet (for example, fibrin sheet) indicated by reference numeral 22 in FIG. 3 is not used, the migrating fibroblasts sink into the mixture of the culture medium and autologous blood and stick to the bottom of the petri dish 20, Grows while solidifying the scaffold.
When a predetermined culture period has elapsed, the mixture of the culture medium and autologous blood is aspirated from the petri dish 20 and discarded, and immediately washed with RINSE solution before the fibroblasts are dried, trypsin (trypsin: commodity) The name “trypsin recombinant” manufactured and sold by Roche) is about 25 mg in a petri dish 20 having a diameter of 10 cm, and kept at 10 ° C. to 37 ° C. for 10 to 20 minutes. The fibroblasts are detached from the bottom of the petri dish 20.
Trypsin should be used as much as possible because it will cause cytotoxicity if it is applied for a long time. For example, regarding the timing of peeling the fibroblasts from the bottom of the petri dish, the fibroblasts are peeled off from the bottom of the petri dish if the fibroblasts become round while observing with a microscope without using temperature and time as parameters.
[0078]
The exfoliated fibroblasts are collected by aspiration with a pipette together with trypsin, and rotated for 5 minutes at 800 rpm in a centrifuge. If the centrifuge is applied, the fibroblasts settle and are separated from trypsin. The settled fibroblasts are collected, dissolved in a new medium, and evenly diffused (turbidity: about 5 to 10 ml). The fibroblasts newly turbid in the medium can be proliferated 10 times by adjusting the relative concentration by, for example, going to 10 different petri dishes and collecting the proliferated cells.
Thereafter, the above procedure of recovery, centrifugation, turbidity, and culture in a plurality of different petri dishes is repeated to obtain a predetermined number of fibroblasts.
[0079]
In the embodiment described above with reference to FIGS. 4 to 9, there is a case where the cells cultured on the polymer sheet 22 do not pass through the needle of the syringe when being collected and are difficult to collect. As described above, it is possible to recover using trypsin, but there is a request that trypsin should not be used as much as possible.
In order to deal with such a case, for example, the polymer sheet 22 may be a low-temperature sensitive polymer. Hereinafter, with reference to FIGS. 10 to 12, the case where the low-temperature sensitive polymer is the polymer sheet 22 will be described.
[0080]
As a result of culturing in the state as shown in FIG. 3, if the fibroblasts 27 have grown over the entire surface of the polymer sheet 22 as shown in FIG. The temperature is decreased from 32 ° C to 32 ° C.
When the ambient temperature is lowered to 32 ° C., the attached state of the fibroblasts 27 to the sheet 22 is released as shown in FIG. 11 based on the characteristics of the low-temperature sensitive polymer. Ascend in the blood mixture 25 (liquid phase).
In FIG. 11, the fibroblasts that have separated from the sheet 22 and floated are indicated by reference numeral 27 </ b> A.
[0081]
Then, as shown in FIG. 12, if the entire amount of the proliferated fibroblasts peeled off from the low-temperature sensitive polymer sheet 22 (fibroblasts indicated by reference numeral “27A”), a large diameter such as a pipette. The floated fibroblasts 27A may be collected by the instrument 64.
[0082]
Before injecting only the cultured fibroblasts into the patient (living body), it is mixed with a substrate to provide a three-dimensional structure (matrix) for fibroblast growth. As described above, the ratio with respect to the base material can be up to about 1: 4 to 4: 1. The ratio was obtained from the results shown in Table 5.
In Table 5, the ratio of fibroblasts to the substrate described above is shown as a percentage of fibroblasts relative to the mixture of fibroblasts and substrate, and the percentage is shown as 10% (fibroblasts and The experiment was performed in the range of the above-mentioned base material ratio of 1: 9) to 90% (the ratio of fibroblasts to the above-mentioned base material is 9: 1). The results of 35% to 65% are all “good” and are omitted in Table 5.
In addition, it is determined that “good” is obtained when the reproduction position can be maintained at the same level as other regions after transplantation, and “bad” when a dent that can be discriminated with the naked eye is generated.
Table 5
[0083]
Thus, the ratio of fibroblasts to substrate is 1: 4 (the ratio of fibroblasts in the mixture of fibroblasts and substrate is 20%) to 4: 1 (of fibroblasts to substrate. The reason why the ratio of fibroblasts in the mixture is about 80%) is presumed to be as follows.
That is, when the ratio of fibroblasts is more than 80%, the amount of the base material is relatively small, and a three-dimensional structure (matrix) that becomes a “scaffold” necessary for fibroblast growth. ) Is insufficient, and the fibroblasts injected into the living body do not grow sufficiently and the amount of collagen produced decreases. On the other hand, if the ratio of fibroblasts is less than 20%, the absolute amount of fibroblasts is small in the first place, so that the amount of collagen produced is also reduced.
Therefore, the ratio of the above-mentioned fibroblasts to the substrate is 1: 4 (the ratio of fibroblasts in the mixture of fibroblasts and the substrate is 20%) to 4: 1 (of fibroblasts to the substrate) A ratio of fibroblasts in the mixture of 80%) is preferred.
Although not shown in Table 5, it is particularly good when the ratio of fibroblasts to substrate is 1: 1 (the ratio of fibroblasts in the mixture of fibroblasts and substrate is 50%). Showed a good result.
[0084]
In the above description regarding FIG. 3, it is stated that the ratio of the autologous blood 26 to the culture medium 24 is 4% to 50% in the mixture of the cell culture medium 24 and the autologous blood 26 accommodated in the culture apparatus 10. However, the ratio was determined from the experimental results shown in Table 5.
In the experiment shown in Table 6, the ratio of the autologous blood 26 to the medium 24 was 1% to 2% to 52%. The results of 7% to 48% are all “good” and are omitted in Table 5.
It is determined that “good” is obtained when the amount necessary for transplantation can be cultured, and “bad” when the necessary amount is not obtained.
Table 6
[0085]
As is apparent from Table 6, fibroblast culture was not successful when the ratio of autologous blood 26 to medium 24 was less than 4% or greater than 50%. The reason is guessed as follows.
That is, when the ratio of the autologous blood 26 to the culture medium 24 is less than 4%, the amount of blood (autologous blood 26) collected from the living body with respect to the culture medium 24 is too small, and proteins contained in the blood, blood, or culture medium The component (albumin) necessary to maintain the osmotic pressure is insufficient. On the other hand, if the ratio of the autologous blood 26 to the culture medium 24 is greater than 50%, the amount of blood (autologous blood 26) collected from the living body with respect to the culture medium 24 is too large, and the amount of the culture medium 24 becomes relatively small. Some nutrients necessary for culturing skin cells, such as liquid nutrients such as amino acids and carbohydrates, are insufficient.
Therefore, the ratio of the autologous blood 26 to the culture medium 24 is preferably 4% to 50%.
[0086]
The illustrated embodiment is merely an example, and is not intended to limit the technical scope of the present invention.
[0087]
【The invention's effect】
The effects of the present invention described above are listed below.
(1) Since a three-dimensional structure (matrix) that serves as a “scaffold” is included as a component, fibroblasts of other components are detached from the culture vessel and returned to the living body. Grows well and produces collagen.
(2) By adding the biological blood (autologous blood) containing the fibroblasts to be cultured to a commercial medium and culturing the fibroblasts, which are the composition of the filling material, the necessary nutrients, amino acids, and osmotic pressure can be obtained. Fibroblasts can be cultivated smoothly in an environment where a component (albumin) necessary for maintenance is present. At the same time, since autologous blood is used, it is possible to reliably prevent, for example, various infectious diseases and pathogens mediated by blood of other living bodies from being transmitted through the filling material.
(3) If a polymer (fibrin) sheet is spread on the bottom of a culture vessel in which fibroblasts are to be cultured, the cultured fibroblasts may adhere to the bottom of the culture vessel and not peel off. And the yield of cultured fibroblasts is improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram for explaining a mode of collecting skin pieces.
FIG. 2 is a process diagram illustrating a processing procedure before culturing.
FIG. 3 is a cross-sectional view illustrating a main part of the culture apparatus.
FIG. 4 is a perspective view showing a mode in which fibroblasts are collected from the culture apparatus.
FIG. 5 is a diagram showing a process of mixing fibroblasts and a substrate.
6 is a view showing a step of mixing fibroblasts and a base material and subsequent to FIG. 5. FIG.
FIG. 7 is a view showing a state in which a filling material is sucked into an injection.
FIG. 8 is a diagram showing a state in which a filling material is injected subcutaneously.
FIG. 9 shows the filling material after being injected subcutaneously.
FIG. 10 is a view showing a mode in which proliferated fibroblasts are collected.
FIG. 11 is a view showing a stage different from FIG. 10 in a mode of collecting the fibroblasts shown in FIG. 10;
FIG. 12 is a view showing a stage different from FIG. 10 and FIG. 11 in a mode of collecting the fibroblasts shown in FIG. 10 and FIG.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Culture apparatus 20 ... Petri dish 22 ... Polymer material (fibrin sheet)
24 ... medium 25 ... mixture of medium and autologous blood 26 ... autologous blood 30 ... skin debris 31 ... fibroblasts 40, 44 ... instrument (pipette)
42 ... Shaking container 46 ... Syringe HH ... Manual 50 ... Filling material S ... Skin 55, 55B ... Recess 55A ... Repair location
