JP2004215657A - バイオセンサ - Google Patents

Abstract

【課題】 試料を一度供給するだけで、ＬＤＬコレステロールを正確かつ簡便に測定を行うことができるセンサおよび測定方法を提供する。
【解決手段】 コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、ペルオキシダーゼと、色素源とを、基板上に担持させることによってバイオセンサを構成する。
【選択図】図１

Description

本発明は、例えば、血液、血清および血漿などの被検試料中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）に含まれるコレステロールを定量するために用いるバイオセンサに関する。特に、本発明は、ワンステップで前記コレステロールを測定し得るバイオセンサの構造に関する。

近年、高コレステロール血症の診断を行う際に、ＬＤＬに含まれるコレステロールの濃度が重要視されている。従来、この種のＬＤＬコレステロールの定量方法は、超遠心法を用いた分画操作によって行われていた。しかし、この方法では、特殊な装置を必要とし、さらに測定に長時間を要するという問題がある。
また、超遠心を行わない定量方法として、試料中の総コレステロール、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロール、およびトリグリセリドの濃度をそれぞれ求め、Friedewaldの式からＬＤＬコレステロールの濃度を算出する方法が一般的である。しかし、この方法では、トリグリセリド値が高い被検試料を用いた場合、再現性、正確性の点で信頼性が低いという問題がある。

さらに近年、トリグリセリド値を必要としない低密度リポ蛋白中コレステロールの定量方法として、以下のような方法が提案されている。
第一に、例えば非特許文献１には、αシクロデキストリン硫酸、デキストラン硫酸、マグネシウムイオンおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリエーテル存在下において、低密度リポ蛋白中コレステロールのみを酵素によって酸化し、色素の発色度合いから低密度リポ蛋白中コレステロール濃度を定量する方法が記載されている。

上記非特許文献１記載の方法は、αシクロデキストリン硫酸、デキストラン硫酸およびマグネシウムイオンによって、被検試料中のカイロミクロン中コレステロールおよび超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中コレステロールに対する酵素の反応性を減少させ、さらに、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリエーテルによって、被検試料中の高密度リポ蛋白中コレステロールに対する酵素の反応性を減少させるものである。

第二に、例えば特許文献１においては、両性界面活性剤および、カルボキシル基またはスルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下において低密度リポ蛋白中コレステロールのみを酵素によって酸化し、色素の発色度合いから低密度リポ蛋白中コレステロール濃度を定量する方法が提案されている。
上記特許文献１記載の方法は、両性界面活性剤存在下において、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるコレステロールに対する酵素の反応性を減少させるものである。

第三に、例えば特許文献２においては、被検試料をポリカチオンによって処理することによって、低密度リポ蛋白中コレステロールのみを酵素によって酸化し、色素の発色度合いから低密度リポ蛋白中コレステロール濃度を定量する方法が提案されている。

第四に、例えば特許文献３記載の方法においては、まず、高密度リポ蛋白を多孔性のシリカによって吸着し、さらに、ポリアニオン／二価カチオンによって、カイロミクロンおよび超低密度リポ蛋白と不溶性の複合体を形成させる。この複合体を沈殿として溶液中から除去後、低密度リポ蛋白中コレステロールのみを酵素によって酸化し、色素の発色度合いから低密度リポ蛋白中コレステロール濃度を定量する。
上記第一〜第四の方法により、トリグリセリド値が高い被検試料を用いた場合においても、低密度リポ蛋白コレステロールの値を測定することができる。
Clinical Chemistry、１９９８年、第４４巻、第５２２頁 特開平１０−８４９９７号公報 米国特許第４，１８５，９６３号明細書 米国特許第５，４０１，４６６号明細書

しかし、上記第一〜第四の方法は、再現性および正確性良く測定を行うためには、いずれも、第一の試薬水溶液と第二の試薬水溶液とを用意し、一定時間に、血清試料に対して決められた量の第一の試薬水溶液と第二の試薬水溶液をそれぞれ正確に添加しなければならず、操作が煩雑であるという問題がある。

そこで、上述のような従来の問題に鑑み、本発明の目的は、試薬の添加に習熟していない患者が使用する場合であっても、２種類以上の試薬をそれぞれ別々のタイミングで被検試料に添加することを要せず、試料を一度供給するだけで、ＬＤＬコレステロールを正確かつ簡便に測定を行うことができるバイオセンサを提供することである。特に、使用者がメンテナンスをしなくても再現性および正確性良く定量することができるバイオセンサを提供することにある。

本発明は、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、低密度リポ蛋白に対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、ペルオキシダーゼと、色素源とが担体に乾燥担持されていることを特徴とするバイオセンサに関する。

前記バイオセンサは前記基板上に担体を有し、前記担体が、濾紙、ガラスフィルタ、メンブレンフィルタまたはセルロース繊維であるのが好ましい。
また、前記バイオセンサにおいては、前記コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、前記試薬と、前記ペルオキシダーゼと、前記色素源とが、凍結乾燥、高温乾燥、温風乾燥または自然乾燥により、前記担体に担持されているのが好ましい。

また、本発明のバイオセンサにおいては、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、低密度リポ蛋白に対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、ペルオキシダーゼと、色素源とが、試薬乾燥体として含まれていてもよい。この試薬乾燥体とは、試薬などを含む溶液を滴下、乾燥させて得られる固形体をいう。

本発明のバイオセンサにおいては、この固形の試薬乾燥体を複数設け、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、低密度リポ蛋白に対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、ペルオキシダーゼと、色素源とを、適宜組み合わせて含ませることができる。試薬乾燥体の形状としては、例えばペレット状、ディスク状、立方体状、直方体状、板状など、適宜選択することができる。

前記試薬は、前記コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、前記色素源とから分離して担持されているのが好ましい。
前記バイオセンサは、さらに流路を有し、前記流路の上流側に前記試薬が設けられ、前記流路の下流側に前記コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、前記ペルオキシダーゼと、前記色素源とが設けられているのが好ましい。

前記試薬は界面活性剤であるのが好ましい。
前記界面活性剤はノニオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤であるのが好ましい。
また、前記ノニオン系界面活性剤はノニオン系ポリマーであるのが好ましい。

前記バイオセンサは、さらにαシクロデキストリン硫酸を含むのが好ましい。さらに、前記バイオセンサは、デキストラン硫酸を含むのが好ましい。
また、前記バイオセンサは、ｐＨ緩衝剤を含むのが好ましい。
さらに、前記バイオセンサは、二価の金属塩を含むのが好ましい。前記二価金属塩はマグネシウム塩、カルシウム塩またはマンガン塩であるのが好ましい。

また、前記バイオセンサは、リポ蛋白リパーゼを含むのが好ましい。
また、前記バイオセンサは、試料から特定の成分を分離するフィルタを含むのが好ましい。
また、前記試料が前記フィルタ内を通過する向きが、重力方向に対して平行、垂直または斜めであることが好ましい。

さらに本発明は、前記バイオセンサと、第一の光源とを具備することを特徴とするテストシステムにも関する。
このテストシステムは、さらに第二の光源を具備するのが好ましい。
前記第一の光源および前記第二の光源のいずれによっても、試料の検知を行うことができる。また、前記第二の光源からの情報によって、前記第一の光源からの情報を補正することもできる。

本発明に係るバイオセンサを用いれば、試料を一度供給することで、ＬＤＬ中のコレステロールを再現性および正確性よく定量することができる。また、本発明に係るバイオセンサを用いた定量方法は、煩雑な操作を必要としないため、病院や臨床検査室などの専門機関以外におけるＬＤＬコレステロール測定キットに適している。

すなわち、本発明に係るバイオセンサを用いれば、試薬の添加に習熟していない患者が使用する場合であっても、２種類以上の試薬類をそれぞれ別々のタイミングで被検試料に添加することをせず、被検試料を一度供給するだけで、ＬＤＬコレステロールを正確かつ簡便に測定を行うことができる。

さらに、本発明に係るバイオセンサにおいては、試薬は乾燥されているので、特にコレステロールオキシダーゼやペルオキシダーゼなどの酵素を含む試薬層の水分が十分除去され、保存時にも劣化しないという利点を有し、メンテナンスの必要がないというメリットを有する。

上述のような目的を達成するため、本発明は、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、ペルオキシダーゼと、色素源とを含み、これらがいずれも基材上に担持されていることを特徴とする乾式テストストリップからなるバイオセンサを提供する。

前記バイオセンサは、さらに担体を有し、前記コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、前記試薬と、前記ペルオキシダーゼと、前記色素源とが、前記担体上または前記担体内に乾燥担持されているのが好ましい。
前記担体は、濾紙、ガラスフィルタ、メンブランフィルタ、セルロース繊維からなる群から選択されることが好ましい。なお、試薬を乾燥担持する目的で用いた担体が、血球を分離する役割を担ってもよい。なお、さらにメッシュを設けてもよい。この担体は基板上に保持させる。

ここで、本発明に係るバイオセンサにおけるＬＤＬコレステロールの測定原理を説明する。例えば、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）および超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）を含む試料を、本発明に係るバイオセンサ中に導入すると、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬によってＬＤＬのみが可溶化される。その後、ＬＤＬ中のコレステロールがコレステロールエステラーゼと反応してコレステロールを生じ、このコレステロールがコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと反応してコレステノンおよび過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を生じる。

ついで、この過酸化水素が、ペルオキシダーゼの存在下で、例えば４−アミノアンチピリンおよびＨＤＡＯＳなどと反応してキノン色素を生じる。そして、このキノン色素の吸収極大（５８３ｎｍ）を測定することにより、前記試料中のＬＤＬコレステロールを定量することができるのである。

前記色素源としては、４−アミノアンチピリン、フェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸、［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）などが挙げられる。
また、トリンダー試薬である、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）をさらに添加してもよい。トリンダー試薬のなかでは、試料中の他の成分から影響を受けにくいという点で、ＨＤＡＯＳが好ましい。また、光を化学的に発生する発色源として、ルミノールまたはイソルミノールなどを用いることもできる。

また、前記担体を保持させる基板の材料としては、ある程度の剛性を有するものであれば特に制限はない。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドもしくは飽和ポリエステルなどの熱可塑性樹脂、または尿素樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂もしくは不飽和ポリエステル樹脂などの熱硬化性樹脂などが挙げられる。

乾燥担持の方法は、従来からの方法、例えば凍結乾燥、高温乾燥、温風乾燥または自然乾燥であればよい。試薬の保存安定性に優れるという理由からは凍結乾燥が好ましく、乾燥時間が短いという理由からは高温乾燥または温風乾燥が好ましい。

前記ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬は、前記コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、前記ペルオキシダーゼ、および前記色素源から分離して設けるのが好ましい。これは、バイオセンサを保管中に、前記試薬が前記コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼに対して影響を与えないという理由によるものである。

さらに、本発明に係るバイオセンサにおいては、例えば前記基板に流路を設け、前記流路の上流側に前記ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬を配置し、前記流路の下流側に前記コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、前記ペルオキシダーゼ、および前記色素源を配置するのが好ましい。これは、血液または血漿などの試料に対して、前記試薬を十分に作用させた後に、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼによる酵素反応を行うことで、ＬＤＬに対してより高い選択性を発揮することができるという理由によるものである。

ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬は、界面活性剤であることが好ましい。前記界面活性剤は、ノニオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤であることが好ましい。また、ノニオン系界面活性剤はノニオン系ポリマーであることが好ましい。
なお、ノニオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルなどが好ましく、ノニオン系ポリマーとしては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体が好ましい。
また、アニオン系界面活性剤としてはラウリル硫酸ナトリウムなどが好ましい。

さらに、本発明に係るバイオセンサにはαシクロデキストリン硫酸を含めるのが好ましい。この場合、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と同様にガラスフィルタなどの担体に含ませればよい。なお、αシクロデキストリン硫酸以外に、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリンや、αシクロデキストリン硫酸、βシクロデキストリン硫酸、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン誘導体を用いてもよい。さらにデキストラン硫酸を添加してもよい。

さらに、本発明に係るバイオセンサには、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬による作用、およびコレステロールオキシダーゼなどの酵素反応をより効果的に進めるために、ｐＨ緩衝剤を添加してもよい。この場合、コレステロールオキシダーゼなどの酵素と同様にガラスフィルタなどの担体に含ませればよい。ｐＨ緩衝剤としては、フタル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）など挙げられる。また、グッド緩衝剤である、２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）も、ｐＨを中性付近に調整することができるので好ましい。

さらに、本発明に係るバイオセンサには、ＬＤＬの選択性を向上するために、二価の金属塩を添加してもよい。この場合、コレステロールオキシダーゼなどの酵素と同様にガラスフィルタなどの担体に含ませればよい。ここで、二価の金属塩としてはマグネシウム塩、カルシウム塩またはマンガン塩などが好ましい。このなかで、ＬＤＬへの選択性を向上する目的でマグネシウム塩が好ましい。さらにリポ蛋白リパーゼを含ませてもよい。

さらに本発明に係るバイオセンサには、前記担体を構成するフィルタなどに加えて、第二のフィルタを含め、当該第二のフィルタに試料中の血球を分離させてもよい。前記フィルタとしては、ガラスフィルタ、濾紙、メンブランフィルタ、メッシュまたは綿などが挙げられる。

前記バイオセンサは、第一の光源と組み合わせることによって、テストシステムを構成する。当該テストシステムは、さらに第二の光源を具備してもよい。この場合、前記第二の光源からの情報によって、前記第一の光源からの情報を補正することができ好ましい。また、前記第一の光源または前記第二の光源によって試料検知を行うことができる。
被検試料としては、いずれの体液であってもいいが、例えば血液、血漿、血清または間質液などを用いることができる。
つぎに、本発明に係るバイオセンサの構造の好ましい例について、図面を参照しながら説明する。

実施の形態１
図１は、本発明の第一の実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。このバイオセンサは、貫通した２つの穴９および１９を有する基板１、透明シート２、試薬乾燥体３、スリット４ａを有するスペーサー４、血液から血球成分を濾過するフィルタ７、ならびに空気孔６を有するカバー５で構成される。

空気孔６は、スペーサー４のスリット４ａの左側の端部に位置し、スリット４ａの右半分にはフィルタ７が設けられている。試薬乾燥体３が、透明シート２上に設けられるが、組立後はスリット４ａ内に位置することになる。また、試薬乾燥体３は穴９の上部に位置し、穴１９はフィルタ７に対向する位置にある。そして、基板１は透明シート２、スペーサー４およびカバー５よりも右側において長く、試料を点着させる試料供給部８を形成している。

このような図１に示す構造を有するバイオセンサを用いる場合、血液などの試料を、試料供給部８付近に滴下する。供給した血液は、フィルタ７内を水平方向に移動する際に、血球成分が濾過される。濾過された血液は、空気孔６の付近まで到達して、試薬乾燥体３を溶解する。このとき、フィルタ７内に存在する、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、試薬乾燥体３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＨＤＡＯＳが作用して発色する。このときの発色の度合いは、測定部である穴９を通して、発光ダイオードなどによる光を基板１の下部より照射したとき、反射光を光ダイオードで検出することで測定する。

以上の方法によって、血液を一度供給するだけで、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップ測定することができる。本実施の形態のバイオセンサによれば、試薬を一定のタイミングで、別々に添加するという煩雑な操作の必要がなく、再現性および正確性良く定量することができる。ここで、試薬は乾燥されているので、特にコレステロールオキシダーゼなどやペルオキシダーゼなどを含む試薬層の水分が十分除去され、長期間保存した際にも劣化しないという利点を有し、メンテナンスの必要がない。

なお、発光ダイオードと光ダイオードによる測光によって試料の導入の検知、または試料の種類の検知を行ってもよい。なお、第二の光源を用いて穴１９から光を測定することで試料検知を行ってもよい。さらに、第二の光源を用いた光の測定による情報から、発光ダイオードと光ダイオードを用いた光の測定による情報を補正してもよい。

実施の形態２
つぎに、図２は、本実施の第二の実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。このバイオセンサは、貫通した穴２９を有する基板１１、透明シート１２、試薬乾燥体１３、スリット１４ａを有するスペーサー１４、血液から血球成分を濾過するフィルタ１７、空気孔１６を有するカバー１５、フィルタ１７の高さに合わせて高さを調節できるスペーサー２４、およびすり鉢状の試料供給部１８を有するカバー２５で構成される。

空気孔１６は、スペーサー１４のスリット１４ａの左側の端部に位置し、スリット１４ａの右半分にはフィルタ１７を収容しうる開口部１４ｂが設けられている。試薬乾燥体１３が、透明シート１２上に設けられるが、組立後はスリット１４ａ内に位置することになる。また、試薬乾燥体１３は穴２９の上部に位置する。

そして、基板１１の右側においては、フィルタ１７を保持し、当該フィルタ１７はスペーサー１４の開口部１４ｂおよびカバー１５の開口部１６ｂにはめ込まれる。そして、カバー１５の開口部１６ｂの上には、スペーサー２４およびカバー２５が設置され、試料供給部１８から試料を導入することができる。

このような図２に示す構造を有するバイオセンサを用いる場合、血液などの試料を、試料供給部１８に滴下する。試料供給部１８は、すり鉢状であるため、試料の円滑な供給に役立つ。供給した血液は、フィルタ１７内を垂直方向に移動する際に、血球成分が濾過される。このとき、フィルタ１７内に存在する試薬類によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用する。

濾過された血液は、バイオセンサ内を空気孔１６の付近まで水平に移動して、試薬乾燥体１３を溶解する。このとき、フィルタ１７内に存在する、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、試薬乾燥体１３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＨＤＡＯＳが作用して、実施の形態１と同様に発色する。

以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができる。そして、本実施の形態のバイオセンサによれば、試薬を一定のタイミングで、別々に添加する必要がなく、メンテナンスの必要がない。さらに、血液などの試料は、重力を利用してフィルタ内を垂直に移動するため、測定時間が短縮されるという利点がある。

実施の形態３
つぎに、図３は、本発明の第３の実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。このバイオセンサは、貫通した穴３４ａを有するスペーサー３４、透明シート３２、試薬乾燥体４３、フィルタ４７、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬乾燥体３３、および血液から血球成分を濾過するフィルタ３７で構成される。
このバイオセンサは基板を有さず、透明シート３２の上に設けられたスペーサー３４の穴３４ａの内部に、試薬乾燥体４３、フィルタ４７、試薬乾燥体３３およびフィルタ３７を順に積層して収容する。

このような図３に示す構造を有するバイオセンサを用いる場合、血液などの試料を、フィルタ３７に滴下する。供給した血液は、フィルタ３７またはフィルタ４７を垂直方向に移動する際に、血球成分が濾過される。このとき、試薬乾燥体３３によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用する。血液などの試料は、重力を利用して、フィルタ内を垂直に移動するため、測定時間が短縮されるという利点がある。

以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができる。本実施の形態のバイオセンサによれば、試薬を一定のタイミングで、別々に添加する必要がなく、メンテナンスの必要がない。

また、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼなどがフィルタ４７を介して分離されているので、試料が、まずＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬の作用を受けることができる。

さらに、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼなどの作用を受けるまでに、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬の作用を十分受けることができて好ましい。なお、リポ蛋白リパーゼを添加することで、より精度の向上、測定時間の短縮を望めるという利点がある。

実施の形態４
つぎに、図４は、本発明の第４の実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。このバイオセンサは、貫通した穴５９を有する基板５１、透明シート５２、２つのスペーサー５４、試薬乾燥体５３、血液から血球成分を濾過するフィルタ５７、ならびにメッシュ６０で構成される。

基板５１の中央部分には貫通した穴５９が設けられ、その両側に２つのスペーサー５４が設けられている。そして、穴５９の上には、透明シート５２、試薬乾燥体５３およびフィルタ５７が順に積層され、一番上にメッシュ６０が配置される。このメッシュ６０は、基板５１と同じ寸法を有する。

このような図４に示す構造を有するバイオセンサを用いる場合、血液などの試料を、メッシュ６０上から滴下する。メッシュは血液などの試料を均一に広げて、気泡が発生するのを防ぐ役割を担う。供給した血液は、フィルタ５７内を垂直方向に移動する際に、血球成分が濾過される。このとき、フィルタ５７内に存在する試薬によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用する。

その後、試料が試薬乾燥体５３まで到達すると、試薬乾燥体５３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＤＡＯＳが作用して、実施の形態１と同様に発色する。以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができる。本実施の形態のバイオセンサによれば、試薬を一定のタイミングで、別々に添加する必要がなく、メンテナンスの必要がない。

実施の形態５
つぎに、図５は、本発明の第５の実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。このバイオセンサは、傾斜した開口部７０ａを有する容器７０、試薬乾燥体６３、血液から血球成分を濾過するフィルタ６７、およびメッシュ６０で構成される。
容器７０内を貫通する傾斜した開口部には、試薬乾燥体６３およびフィルタ６７がはめ込まれ、フィルタ６７の上端面は容器７０の上端部の高さに位置し、メッシュ６０が配置される。

このような図５に示す構造を有するバイオセンサを用いる場合、血液などの試料を、メッシュ６０上に滴下する。メッシュは血液などの試料を均一に広げて、気泡が発生するのを防ぐ役割を担う。供給した血液は、フィルタ６７内を斜め方向に移動する際に、血球成分が濾過される。このとき、フィルタ６７内に存在する試薬によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用する。

その後、試料が試薬乾燥体６３まで到達すると、試薬乾燥体６３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＤＡＯＳが作用して、実施の形態１と同様に発色する。以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができる。

本実施の形態のバイオセンサによれば、流路が重力方向に対して斜めであるので、試料が重力を利用して速やかに濾過され、さらに濾過の様子が見やすいという利点を有する。また、試薬乾燥体６３の位置が最も手前にあるので、試料が容器７０の下部まで到達したかどうかを目視によって確認しやすい。容器７０をガラス、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどの透明材料で作製するのも好ましい。

ここで、図１に示す第一の実施の形態に係るバイオセンサに代表させて、本発明のバイオセンサを用いたテストシステムの使用方法（定量方法）について、図６に示すフローチャートを参照しながら説明する。
まず、血液などの試料を供給する（ステップ１）。光源１によって試料の導入を検知するまではホールド状態にあるが、試料の導入を検知すると（ステップ２）、つぎに光源２による検知を行う。光源２によって試料の導入が検知されないと（ステップ３）、エラーとなり、測定が中止される。

光源２によって試料の導入が検知されると（ステップ３）、光源２によって発色の度合いを測定して（ステップ４）ＬＤＬコレステロールの定量を行い、測定結果を表示する（ステップ５）。なお、必要であれば、光源１または２による補正情報（ステップ６）によって補正を行い、測定結果を表示する（ステップ５）。特に光源２を用いて補正を行う場合は、発色前後の情報に基づいて補正を行う。

なお、測定部である穴９における光の測定と、測定部である穴１９における光の測定を同時にかつ断続的に行うことで、穴１９（光源１側）から穴９（光源２側）までに試料が移動する時間を測定することができる。試料の移動時間が一定の時間を超える場合には、試料の導入に異常があると認識することで測定を終了することもできる。

また、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼなどを分離しておけば、試料が、まずＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬の作用を受けることができる。さらに、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼなどの作用を受けるまでに、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬の作用を十分受けることができて好ましい。なお、試料供給部８は、供給した試料を一定時間保持することができて好ましい。

なお、作製したバイオセンサは、空気中の水分の吸湿を避けるため、密閉して保存することが好ましい。シリカゲル、アルミナなどの吸湿剤存在下で保存するとなおよい。アルミ包装などを行えば、光を遮断することができ、試薬の劣化を抑制できて好ましい。また、試薬類の乾燥方法として、凍結乾燥を用いてもよい。凍結乾燥によれば、試薬中の水分が十分除去されるので、試薬の劣化を抑制できてよい。
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

《実施例１》
本実施例においては、図１に示すバイオセンサを作製し、血液を試料として用い、血液中のＬＤＬコレステロールを測定した。
まず、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製の基板１、ＰＥＴ製の透明シート２、およびＰＥＴ製のスペーサー４を圧着した接合体を用意した。スペーサー４のスリット４ａの右側部分に合わせて、血液から血球成分を濾過するフィルタ７を設けた。フィルタ７としてはガラスフィルタを用いた。そして、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、αシクロデキストリン硫酸、デキストラン硫酸および塩化マグネシウムを含む水溶液を、スペーサー４に組み込んだフィルタ７内に滴下して乾燥した。

つぎに、透明シート２上に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＨＤＡＯＳ、およびＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を含む水溶液を滴下して乾燥した（試薬乾燥体３）。最後に、ＰＥＴ製のカバー５を上から置き、熱圧着して本発明に係る乾式テストストリップを作製した。

血液を試料供給部８付近に滴下した。供給した血液は、フィルタ７内を水平方向に移動する際に、血球成分が濾過された。濾過された血液は、空気孔６の付近まで到達して、試薬乾燥体３を溶解した。このとき、フィルタ７内に存在する、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬類と、試薬乾燥体３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＨＤＡＯＳが作用して発色した。

このときの発色の度合いを、測定部である穴９を通して、発光ダイオードによる光を基板１の下部より照射し、反射光を光ダイオードで検出することで測定した。以上の方法によって、血液を一度供給するだけで、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップ測定することができた。

《実施例２》
本実施例においては、図２に示すバイオセンサを作製し、血液を試料として用い、血液中のＬＤＬコレステロールを測定した。
まず、ＰＥＴ製の基板１１、ＰＥＴ製の透明シート１２、およびＰＥＴ製のスペーサー１４を接着剤によって固定して得られる接合体を用意した。透明シート１２上に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＨＤＡＯＳおよびＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を含む水溶液を滴下して乾燥した（試薬乾燥体１３）。

その上に、ＰＥＴ製のカバー１５、ＰＥＴ製のスペーサー２４、およびＰＥＴ製のカバー２５を接着剤によって固定し、血液から血球成分を濾過するフィルタ１７を、試料供給部１８から差し込んだ。最後に、フィルタ１７にはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、αシクロデキストリン硫酸、デキストラン硫酸、および塩化マグネシウムを含む水溶液を滴下して乾燥した。

血液を試料供給部１８から滴下した。試料供給部１８は、すり鉢状であるので、試料の円滑な供給に役立った。供給した血液は、フィルタ１７内を垂直方向に移動する際に、血球成分が濾過された。このとき、フィルタ１７内に存在する試薬によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用した。濾過された血液は、センサストリップ内を空気孔１６の付近まで水平に移動し、試薬乾燥体１３を溶解した。

このとき、フィルタ１７内に存在する、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、試薬乾燥体１３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＨＤＡＯＳが作用して、実施の形態１と同様に発色した。以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができた。

《実施例３》
本実施例においては、図３に示すバイオセンサを作製し、血液を試料として用い、血液中のＬＤＬコレステロールを測定した。
まず、ＰＥＴ製のスペーサー３４およびＰＥＴ製の透明シート３２を熱圧着した接合体を用意した。スペーサー３４の穴３４ａに、リポ蛋白リパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＤＡＯＳ、およびＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を含む水溶液を滴下して乾燥した（試薬乾燥体４３）。

その上に、フィルタ４７を重ねた。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、αシクロデキストリン硫酸、デキストラン硫酸、および塩化マグネシウムは、ペレット状の試薬乾燥体３３としてフィルタ４７の上に乗せた。最後にフィルタ３７を乗せて、本発明に係るバイオセンサを作製した。フィルタ３７とフィルタ４７としてはガラスフィルタを用いた。

血液をフィルタ３７に滴下した。供給した血液は、フィルタ３７またはフィルタ４７を垂直方向に移動する際に、血球成分が濾過された。このとき、試薬乾燥体４３によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用した。血液は、重力を利用して、フィルタ内を垂直に移動するため、測定時間が短縮されるという利点があった。以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができた。

また、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼなどの酵素がフィルタ４７を介して分離されているので、試料が、まずＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬の作用を受けることができた。さらに、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼなどの酵素の作用を受けるまでに、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせる試薬の作用を十分受けることができた。

《実施例４》
本実施例においては、図４に示すバイオセンサを作製し、血液を試料として用い、血液中のＬＤＬコレステロールを測定した。
まず、ＰＥＴ製の基板５１、ＰＥＴ製の透明シート５２、ＰＥＴ製のスペーサー５４を接着剤によって固定した接合体を用意した。透明シート５２上に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＤＡＯＳ、およびＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を含む水溶液を滴下して乾燥した（試薬乾燥体５３）。

つぎに、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、αシクロデキストリン硫酸、デキストラン硫酸、および塩化マグネシウムを含む水溶液を滴下して乾燥したフィルタ５７を、試薬乾燥体５３上に乗せた。最後に、メッシュ６０を接着剤で固定して、本発明に係るバイオセンサを作製した。

血液をメッシュ６０から滴下した。メッシュは血液を均一に広げて、気泡が発生するのを防ぐ役割を担った。供給した血液は、フィルタ５７内を垂直方向に移動する際に、血球成分が濾過された。このとき、フィルタ５７内に存在する試薬によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用した。その後、試薬乾燥体５３まで到達すると、試薬乾燥体５３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＤＡＯＳが作用して、実施の形態１と同様に発色した。以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができた。

《実施例５》
本実施例においては、図５に示すバイオセンサを作製し、血液を試料として用い、血液中のＬＤＬコレステロールを測定した。
まず、斜めに開口部の開いた容器７０の底にコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＤＡＯＳ、およびＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を含む水溶液を滴下して乾燥した（試薬乾燥体６３）。

つぎに、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、αシクロデキストリン硫酸、デキストラン硫酸、および塩化マグネシウムを含む水溶液を滴下して乾燥したフィルタ６７を、試薬６３乾燥体上に乗せた。最後に、メッシュ６０を接着剤で容器７０に固定して、本発明に係るバイオセンサを作製した。

血液をメッシュ６０から滴下した。メッシュは血液を均一に広げて、気泡が発生するのを防ぐ役割を担った。供給した血液は、フィルタ６７内を斜め方向に移動する際に、血球成分が濾過された。このとき、フィルタ６７内に存在する試薬によって、ＬＤＬに対して選択的に酵素反応を行わせるよう作用した。その後、試薬乾燥体６３まで到達すると、試薬乾燥体６３中のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ＤＡＯＳが作用して、実施の形態１と同様に発色した。以上の方法によって、血液中のＬＤＬコレステロールをワンステップで測定することができた。

本発明に係るバイオセンサは、血液、血清および血漿などの試料中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）に含まれるコレステロールを簡易に定量することができるため、一般家庭や病院などにおける高コレステロール血症の診断に好適に用いることができる。

本発明の第一の実施の形態に係る乾式テストストリップの分解斜視図である。 本発明の第二の実施の形態に係る乾式テストストリップの分解斜視図である。 本発明の第三の実施の形態に係る乾式テストストリップの分解斜視図である。 本発明の第四の実施の形態に係る乾式テストストリップの分解斜視図である。 本発明の第五の実施の形態に係る乾式テストストリップの分解斜視図である。 本発明に係る乾式テストストリップを含むテストシステムを用いた測定のフローチャートである。

符号の説明

１、１１、５１ 基板
２、１２、３２、５２ 透明シート
３、１３、３３、４３、５３、６３ 試薬乾燥体
４、１４、２４、３４、５４ スペーサー
５、１５、２５ カバー
６、１６ 空気孔
７、１７、３７、４７、５７、６７ フィルタ
８、１８ 試料供給部
９、１９、２９、５９ 穴
６０ メッシュ
７０ 容器

Claims (18)

1. コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、低密度リポ蛋白に対して選択的に酵素反応を行わせる試薬と、ペルオキシダーゼと、色素源とが基板上に担持されていることを特徴とするバイオセンサ。
2. 前記基板上に担体を有し、前記担体が、濾紙、ガラスフィルタ、メンブランフィルタまたはセルロース繊維であることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
3. 前記コレステロールエステラーゼと、前記コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、前記試薬と、前記ペルオキシダーゼと、前記色素源とが、凍結乾燥、高温乾燥、温風乾燥または自然乾燥により、前記担体に担持されていることを特徴とする請求項２記載のバイオセンサ。
4. 前記試薬が、前記コレステロールエステラーゼと、前記コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、前記色素源とから分離して担持されていることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
5. さらに流路を有し、前記流路の上流側に前記試薬が設けられ、前記流路の下流側に前記コレステロールエステラーゼと、前記コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、前記ペルオキシダーゼと、前記色素源とが設けられていることを特徴とする請求項４記載のバイオセンサ。
6. 前記試薬が界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオセンサ。
7. 前記界面活性剤が、ノニオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項６記載のバイオセンサ。
8. 前記ノニオン系界面活性剤がノニオン系ポリマーであることを特徴とする請求項７記載のバイオセンサ。
9. さらにαシクロデキストリン硫酸を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のバイオセンサ。
10. さらにデキストラン硫酸を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のバイオセンサ。
11. さらにｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオセンサ。
12. さらに二価の金属塩を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のバイオセンサ。
13. 前記二価金属塩がマグネシウム塩、カルシウム塩またはマンガン塩であることを特徴とする請求項１２記載のバイオセンサ。
14. さらにリポ蛋白リパーゼを含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のバイオセンサ。
15. さらに試料から特定の成分を分離するフィルタを含むことを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のバイオセンサ。
16. 前記試料が前記フィルタ内を通過する向きが、重力方向に対して平行、垂直または斜めであることを特徴とする請求項１５記載のバイオセンサ。
17. 請求項１〜１６のいずれかに記載のバイオセンサと、第一の光源とを具備することを特徴とするテストシステム。
18. さらに第二の光源を具備することを特徴とする請求項１７記載のテストシステム。

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