JP2004203747A - Therapeutic agent comprising osteoclastogenesis inhibitory factor - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a therapeutic agent comprising an osteoclastogenesis inhibitory factor having excellent retentivity in blood. <P>SOLUTION: A prophylactic or a therapeutic agent for bone dysbolism comprises one or two or more substances [osteoclastogenesis inhibitory factor substances (OCIF substances)] selected from the group consisting of the OCIF, its analogs and a mutant thereof and one or two or more substances (polysaccharide substances) selected from the group consisting of polysaccharides and derivatives thereof as active ingredients. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

（１１）
ヘパリン吸着力が０．７以下であることを特徴とする、（１０）に記載の予防又は治療剤、
（１２）
ヘパリン吸着力が０．６以下であることを特徴とする、（１１）に記載の予防又は治療剤、
（１３）
下記［ｘ］を下記［ｙ］で除算することにより得られる免疫学的検出率が０．５乃至１．２であることを特徴とする、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載の予防又は治療剤：
［ｘ］ＯＣＩＦ物質に特異的に結合する抗体を使用する酵素免疫アッセイ（enzyme immunoassay）により、ＯＣＩＦ物質を標準物質として測定される、被検資料中に含まれるＯＣＩＦ物質の分子数；
［ｙ］（ｉ）ウシ血清アルブミンを標準物質としてロウリー（Lowry）法により測定されるタンパク質量及び（ｉｉ）ＯＣＩＦ物質の分子量に基づいて算出される、被検試料中に含まれるＯＣＩＦ物質の分子数、
（１４）
酵素免疫アッセイが、ハイブリドーマＯＩ−１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２０）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−１９又はハイブリドーマＯＩ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２１）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−２６が固相化された抗体として、ハイブリドーマＯＩ−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１９）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４がパーオキシダーゼにより酵素標識された移動相中の抗体としてそれぞれ使用されるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）である、（１３）に記載の予防又は治療剤、
（１５）
免疫学的検出率が０．６乃至１．１であることを特徴とする、（１３）又は（１４）に記載の予防又は治療剤、
（１６）
免疫学的検出率が０．７乃至１．１であることを特徴とする、（１５）に記載の予防又は治療剤、
（１７）
下記工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory factor：ＯＣＩＦ）、その類縁体及びその変異体からなる群から選択される１又は２以上の物質（ＯＣＩＦ物質）、及び、多糖又はその誘導体からなる群から選択される１又は２以上の物質（多糖物質）からなる複合体を調製する方法により得られる該複合体を有効成分として含有する骨代謝異常症の予防又は治療剤：
［ｉ］ＯＣＩＦ物質を多糖物質と接触させる工程；
［ｉｉ］ｐＨ９．５乃至１２の条件下において保温する工程；
［ｉｉｉ］遊離の多糖物質を除去する工程、
（１８）
工程［ｉｉ］にて、ｐＨ１０乃至１１の条件下において保温することを特徴とする、（１７）に記載の予防又は治療剤、
（１９）
工程［ｉｉｉ］にて、ゲル濾過により遊離の多糖物質を除去することを特徴とする、（１７）又は（１８）に記載の予防又は治療剤、及び、
（２０）
骨代謝異常症が、一次性骨粗鬆症、内分泌骨粗鬆症、パジェット病、固形腫瘍に起因する高カルシウム血症、多発性骨髄腫、特発性高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、消化器疾患に伴う骨減少症、慢性関節リウマチ、慢性関節リウマチによる骨減少症、慢性関節リウマチによる骨及び関節破壊、ムチランス型リウマチ、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移、腎性骨異栄養症及び骨減少症からなる群から選択される一つである、（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の予防又は治療剤、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体は、ＷＯ９６／２６２１７号公報若しくはＷＯ９７／２３６１４号公報に記載された方法により、動物の組織、動物の体液若しくは動物細胞の培養液等からタンパク質として抽出精製された天然型として、又はＯＣＩＦ、その類縁体若しくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換された動物細胞や大腸菌等の宿主細胞が生産する遺伝子組換え型として、取得することができる。
【００１１】
本発明のＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体の起源は特に限定されないが、好適にはヒト、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物又はニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ等の鳥類由来であり、より好適にはヒトである。
【００１２】
また、本発明のＯＣＩＦ及びその類縁体は、一本鎖のポリペプチドとして生産されるが、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約６００００又は約１２００００であり（ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、好適には、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量約１２００００の２量体である。
【００１３】
さらに、本発明におけるＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体は、シグナルペプチドを含む前駆体型ポリペプチド及びその成熟体の両方を包含する。シグナルペプチドを含む前駆体ＯＣＩＦのうち好適なものは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の全長すなわちアミノ酸番号第−２１番乃至第３８０番からなるヒト前駆体ＯＣＩＦである。シグナルペプチドを含まない成熟体ＯＣＩＦのうち好適なものは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号第１番乃至第３８０番からなるヒト成熟体ＯＣＩＦである。これらのうち、ヒト成熟体ＯＣＩＦがより好適である。
【００１４】
また、成熟型ＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体を宿主細胞（特に、大腸菌のような原核細胞）内において組換タンパク質として発現させる場合、そのような成熟体のアミノ末端にメチオニンを付加することができる（ＷＯ９７／２３６１４）。メチオニンが付加された成熟型ＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体は、成熟型ＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端にＡＴＧ（ＡＵＧ）配列からなるトリプレット・ヌクレオチドを付加せしめたヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、得られた組換発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換すれば、該形質転換宿主細胞の培養物より常法に従って精製単離することができる。加えて、アミノ末端にメチオニンを有する成熟体ＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体には、該メチオニンに隣接する位置であり且つ該メチオニンよりカルボキシ末端側に１つ又は２つ以上のアミノ酸が挿入されてもいてもよい。
【００１５】
本発明において、ＯＣＩＦ類縁体とは、ヒトＯＣＩＦｃＤＮＡをプローブとする、ストリンジェントな条件（６０乃至７０℃、６×ＳＳＣ）下におけるハイブリダイゼーションにより、動物細胞、体液又は組織由来のｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされ得るｃＤＮＡにコードされたタンパク質であり、そのようなＯＣＩＦ類縁体としてＯＣＩＦ２、ＯＣＩＦ３、ＯＣＩＦ４、ＯＣＩＦ５（いずれも、ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、ヒト以外の動物由来のＯＣＩＦ等を例示することができる。そのようなＯＣＩＦ類縁体は、該ＯＣＩＦ類縁体をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞の培養物から、当業者に周知の方法に従って抽出、精製及び／又は単離することができる（ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）。本発明における好適なＯＣＩＦ類縁体は、ＯＣＩＦの有する生物活性の少なくとも一部を検出され得る程度に保持している。
【００１６】
本発明において、ＯＣＩＦ変異体とは、ヒトＯＣＩＦと１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され且つＯＣＩＦ活性の少なくとも一部を検出され得る程度に保持しているタンパク質を意味する。そのようなＯＣＩＦ変異体は、ＯＣＩＦ又はその類縁体をコードするヌクレオチドに、ＰＣＲ法、遺伝子組換え法、又は、制限酵素等のエキソ型ヌクレアーゼ若しくはエンド型ヌクレア−ゼを用いた切断法により、１又は２以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入を行い、次いで得られたヌクレオチド変異体を挿入した発現ベクターで動物細胞又は大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、次いで該宿主細胞の発現するタンパク質画分から常法に従って精製することにより、得ることができる。
【００１７】
また、ヒトＯＣＩＦのアミノ酸配列のカルボキシ末端から相当部分を欠失させた、短鎖型ＯＣＩＦにもＯＣＩＦ本来の生物活性を保持している分子が知られている（ＷＯ９６／２６２１７号公報及びＷＯ９７／２３６１４号公報参照）。本発明のＯＣＩＦ変異体には、ＯＣＩＦ活性の少なくとも一部を有する短鎖型ＯＣＩＦも包含される。
【００１８】
さらに、ＯＣＩＦは免疫グロブリンのＦｃドメイン等との融合タンパク質としても活性を保持している例が知られており（ＷＯ９７／２３６１４号公報参照）、本発明のＯＣＩＦ変異体にはそのようなＯＣＩＦの融合タンパク質も包含される（ＷＯ９７／２３６１４号公報、ＷＯ２００１／１７５４３号公報及びＷＯ２００１／１８２０３号公報参照）。
【００１９】
また、ＯＣＩＦは水溶性ポリマー（ポリエチレングルコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共ポリマー、カルビキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール）等の化学修飾を受けることによりその生物活性が改善されることが知られており、本発明のＯＣＩＦ変異体はそのような化学修飾ＯＣＩＦをも包含する。ＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体上の１個所又は２箇所以上において化学修飾を受けてもいてもよい。化学修飾ＯＣＩＦ又はその変異体としては、ポリエチレングリコールが結合したＯＣＩＦ又はその変異体（誘導体）を例示することができる（ＷＯ９７／２３６１４号公報参照）。
【００２０】
このような本発明のＯＣＩＦ変異体としては、ＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ１、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ２、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＬ、ＯＣＩＦ−ＣＣ、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ、ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ、ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔ（以上、ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８５］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８０］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ１９５、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ２０２、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ２７７、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ３１９、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ４００、ｍｕＯＰＧ［２２−１８５］、ｍｕＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｕＯＰＧ［２２−２００］、ｍｕＯＰＧ［２２−２１２］、ｍｕＯＰＧ［２２−２９３］、ｍｕＯＰＧ［２２−３５５］、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ Ｐ２６Ａ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−ＦｃＹ２８Ｆ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］、ｈｕＯＰＧ［２７−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２９−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［３２−４０１］−Ｆｃ、ＭｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］、ＭｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］５ｋＰＥＧ、ＭｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］２０ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ 、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ５ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ２０ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ３１ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ５７ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ １２ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ２０ｋ 分岐ＰＥＧ、ｈｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ８ｋ ＰＥＧ ダイマー、ｈｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ジスルフィド架橋（以上、ＷＯ９７／２３６１４号公報参照）、ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣ、ＯＰＧ［２２−２０１］−ＦｃΔＣ、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０、ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］（ＷＯ２００１／１７５４３号公報参照）、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣ、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０、ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｅｔＦｃΔｃ−ＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｅｔＦｃΔＣ−２２−１９４、ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔｃ ｍｅｔＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｅｔＯＰＧ［２２−２０１］、ＯＰＧ［２２−２９３］、ＯＰＧ［２２−４０１］、ｍｅｔＦｃΔｃ−２２−１９４（ＷＯ２００１／１８２０３号公報参照）等を例示することができ、好適には、ＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ１、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ２、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＬ、ＯＣＩＦ−ＣＣ、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ、ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ、ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔ、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８５］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８０］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ１９５、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ２０２、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ３１９、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ４００、ｕＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｕＯＰＧ［２２−２００］、ｍｕＯＰＧ［２２−２１２］、ｍｕＯＰＧ［２２−２９３］、ｍｕＯＰＧ［２２−３５５］、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ Ｐ２６Ａ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ Ｙ２８Ｆ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］、ｈｕＯＰＧ［２７−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２９−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［３２−４０１］−Ｆｃ、ＭｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］５ｋ ＰＥＧ、ＭｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］２０ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ５ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ２０ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ３１ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ５７ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ １２ｋ ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ２０ｋ 分岐ＰＥＧ、ｈｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ８ｋ ＰＥＧ ダイマー、ｈｕＯＰＧ ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ ジスルフィド架橋、ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣ、ＯＰＧ［２２−２０１］−ＦｃΔＣ、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０、ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣ、ＯＰＧ［１−１９４］−ＦｃＧ_１０、ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｅｔＦｃΔｃ−ＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｅｔＦｃΔＣ−２２−１９４、ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔｃ ｍｅｔＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｅｔＯＰＧ［２２−２０１］、ＯＰＧ［２２−２９３］、ＯＰＧ［２２−４０１］、ｍｅｔＦｃΔｃ−２２−１９４等を例示することができる。
【００２１】
本発明のＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体は翻訳後修飾を受けていてもよく、例えば糖鎖が付加していてもよい。糖鎖が付加したＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体としては、動物細胞が生産する組換え型ＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体、動物組織等から単離された天然型のＯＣＩＦ又はその類縁体を例示することができる。糖鎖が付加した組換型ＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体の生産に適した動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター・オヴァリー（Chinese Hamster Ovary：以下、「ＣＨＯ」という。）、ＣＯＳ細胞等の哺乳動物細胞を例示することができる（Yasuda, H., et al., Endocrinology, 139,1329-1337(1998)）。ちなみに、糖鎖が付加していない、遺伝子組換え型のＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体の生産に適した細胞としては、大腸菌等の原核細胞等を例示することができる。
【００２２】
本発明において、多糖とは、単糖がグリコシド結合することにより生じる重合体（グルカン）であり、好適には構成単糖が２種類以上からなるヘテロ多糖（ヘテログリカン）である。本発明において、多糖誘導体とは、多糖の有する化学構造の一部が他の分子で置換された物質を指し、好適には多糖のエステルであり、より好適には多糖の硫酸エステルである。天然型の多糖としてはデキストラン等を、天然型の多糖誘導体としてはヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、ペクチン、ヘパリン等の酸性多糖をそれぞれ例示することができ、合成型の多糖誘導体としてはデキストラン硫酸（dextran sulfate：ＤＳ）等の酸性多糖を例示することができ、より一層好適な多糖誘導体はデキストラン硫酸である。
【００２３】
本発明において、多糖又はその誘導体はその塩をも包含する。最も好適なデキストラン硫酸の塩は、デキストラン硫酸ナトリウムである。デキストラン硫酸ナトリウムとしては、デキストラン硫酸ナトリウムイオウ５（名糖産業（株）製）、デキストラン硫酸ナトリウム５０００、デキストラン硫酸ナトリウム１００００（ともに、和光純薬（株）製）等を例示することができる。本発明においては、これらデキストラン硫酸の塩もデキストラン硫酸の意味に包含される。
【００２４】
デキストラン硫酸の分子量は次のようにして算出される；
１）デキストランの分子量の測定
デキストランの極限粘度（極限粘度の測定法は、第十三改正、日本薬局方 解説書、廣川書店刊（1998）、デキストラン４０の項参照）より、下記の佐藤の式により算出することができる（第十三改正、日本薬局方 解説書、廣川書店刊（1998）、デキストラン４０の項参照）。
極限粘度＝９．００×１０^−４×分子量^０．５０
２）イオウ含量の測定
日本薬局方（第十四改正、じほう刊（2001）、デキストラン硫酸イオウ５の項参照）記載の方法によりデキストラン硫酸上のイオウ含量を重量％として測定した。
【００２５】
デキストランの構成単位であるグルコースの分子量は本来１８０であるが、デキストラン分子中ではグルコースどうしがα−１，６結合しているため、デキストラン分子中のグルコースの実質的な分子量は１８０から水１分子分の分子量を差し引いた値、すなわち１６２である。
【００２６】
デキストラン硫酸においては、上述のようなデキストラン分子中のグルコースの有する水素１原子がＳＯ_３Ｎａ（１グラム当量１０３）に置換されるているので、イオウの置換度（以下、単に「置換度」という。）は下記式により表される。
イオウ含量（重量％）＝｛32×置換度÷（162＋102×置換度）｝×100
３）デキストラン硫酸の分子量の算出
上述の通りデキストランの構成単位であるグルコースの実質的な分子量は１６２であるので、下記式によりデキストラン硫酸の分子量を算出することができる。
分子量＝デキストランの分子量×（162＋102×置換度）÷162
デキストラン硫酸は一定の分子量分布を有していることが知られており、本発明においては、デキストラン硫酸の平均分子量をもってその分子量に代える。
【００２７】
本発明において好適に使用されるデキストラン硫酸ナトリウムイオウ５（名糖産業（株）製）の、上記２）に従って算出されたイオウ置換度（平均値±標準偏差）は約０．３２±０．０１（ｎ＝７）であり、上記１）乃至３）に従って算出された分子量（平均値±標準偏差）は約１９５０±７０（ｎ＝７）である。同じく好適なデキストラン硫酸であるデキストラン硫酸ナトリウム５０００（和光純薬（株）製）は分子量約５０００であり、同じくデキストラン硫酸ナトリウム１００００（和光純薬（株）製）は分子量約１００００である。
【００２８】
本発明において使用される多糖物質の平均分子量は、特に限定されるものではないが、好適な多糖物質である、デキストラン硫酸の平均分子量は通常１５００乃至１２０００の範囲であり、より好適には１８００乃至６０００である。
【００２９】
本発明の多糖物質は、そのまま使用してもよいが、精製、分画したものを使用してもよい。
【００３０】
なお、本発明において、多糖物質は、細胞内又は生体内において翻訳後修飾としてＯＣＩＦ物質に内在性に付加される各種糖鎖を包含しない。
【００３１】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体におけるＯＣＩＦ物質と多糖物質の分子比は、ＯＣＩＦ物質あるいは多糖物質の種類、該複合体を調製する際の条件等に依存するものであり、特に限定されるものではない。本発明の好適な態様であるＯＣＩＦ物質及びデキストラン硫酸からなる複合体における、ＯＣＩＦ物質とデキストラン硫酸の分子比は、通常、本発明のＯＣＩＦ物質：多糖物質＝１：１乃至１：１０であり、好適には１：１乃至１：８であり、より好適には１：１乃至１：５であり、より一層好適には１：１．１乃至１：４．５である。
【００３２】
上述の通り、ＯＣＩＦは２量体を形成することが知られており（ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、ＯＣＩＦ物質は、ホモ又はヘテロ２量体や、単量体３つ以上からなるホモ又はヘテロ多量体であり得るが（ＵＳ６３６９０２７号公報等参照）、本発明における当該分子比は、ＯＣＩＦ物質単量体（モノマー）１分子当たりの多糖物質の分子数として計算される。
【００３３】
本発明の複合体中のＯＣＩＦ物質に結合している多糖物質の分子数は、好適には次のようにして算出され得る。すなわち、フェノール硫酸法（本発明の他の個所に詳述）により、被検試料中の中性糖、あるいは複合体化していないＯＣＩＦ物質原体を含む対照試料中の中性糖を測定する。次いで、被検試料中の中性糖量から対照試料中の中性糖量を差し引くことにより、被検試料中のＯＣＩＦ物質に結合した多糖物質量を算出する。得られた数値を下記［ｉ］又は［ｉｉ］に供する。
［ｉ］得られた数値を多糖物質の平均分子量で除算することにより、被検試料中のＯＣＩＦ物質に結合した多糖物質の（総）分子数を算出する。
［ｉｉ］得られた数値を該複合体中のタンパク質量（ｍｇ）で除算し、得られた数値（すなわち、ＯＣＩＦ物質１ｍｇあたりの多糖物質の量）から、ＯＣＩＦ物質の分子量及び多糖物質の平均分子量に基づいて、ＯＣＩＦ物質１分子あたりの多糖物質の分子数を算出する。
【００３４】
本発明の複合体中に存在するＯＣＩＦ物質の分子数は、複合体形成していない、遊離のＯＣＩＦ物質原体を標準物質とする免疫学的なアッセイ（酵素免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡなど）により好適に決定され得る（本発明の他の個所に詳述）。
【００３５】
本発明において、「分子数」とは「分子の数」又は「モル数（mole）」を意味する。
【００３６】
本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を水溶液中にて保温すること等により得ることができる。両者を水溶液中で保温する場合、ＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体の水溶液中の濃度範囲は、上限が０．１乃至０．５ｍＭ、下限が０．００１乃至０．０５ｍＭであり、好適には０．０１乃至０．２ｍＭ、より好適には０．０５乃至０．１ｍＭである。ＯＣＩＦの場合、水溶液の濃度範囲の上限は１０乃至５０ｍｇ／ｍｌ、下限は０．１乃至５ｍｇ／ｍｌであり、好適な範囲は１乃至２０ｍｇ／ｍｌ、より好適な範囲は５乃至１０ｍｇ／ｍｌである。
【００３７】
多糖又はその誘導体の該水溶液中の濃度範囲は、上限が０．１乃至０．５Ｍ、下限が０．００００５乃至０．０５Ｍであり、好適には０．００５乃至０．２５Ｍ、より好適には０．０５乃至０．１Ｍである。デキストラン硫酸ナトリウムイオウ５（ＤＳ５）の場合、水溶液中の濃度範囲は上限が２００ｍｇ／ｍｌ乃至１０００ｍｇ／ｍｌ、下限が０．１乃至１００ｍｇ／ｍｌであり、好適な範囲は１０乃至５００ｍｇ／ｍｌ、より好適な範囲は１００乃至２００ｍｇ／ｍｌである。
【００３８】
該水溶液のｐＨは、上限がｐＨ１１乃至１２、下限がｐＨ９．５乃至１０であり、好適な範囲はｐＨ１０乃至１１である。該水溶液を保温する温度は、上限が１０乃至５０℃、下限が０乃至４℃であり、好適な範囲は４乃至３７℃であり、より好適な範囲は４乃至１０℃である。
【００３９】
本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は、ＯＣＩＦ物及び多糖物質が、共有結合（例えば、シッフ塩基形成）、イオン結合、配位結合等の化学的結合、及び／又は、疎水性的相互作用、水素結合、静電的相互作用、親和性結合等の非化学的結合により互いに結合したものである。
【００４０】
該複合体は、遊離の多糖物質を含有していない。
【００４１】
遊離の多糖又はその誘導体を除去する方法としては、通常、精製、単離及び分画の操作に適用される手段であれば特に限定されるものではないが、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過（分子ふるい）クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ−、結晶化、塩析、限外濾過等を挙げることができ、好適にはゲル濾過クロマトグラフィー（以下、単に「ゲル濾過」という。）、限外濾過等を挙げることができる。
【００４２】
前記ゲル濾過におけるカラムや移動相などの諸条件は、ＯＣＩＦ物質を含有する画分から遊離の多糖物質を分離することが可能な限りにおいて特に限定を受けるものではなく、ＯＣＩＦ物質の分子量及び種類、多糖物質の分子量及び種類、該複合体の分子量などを考慮して適宜選択され得る。
【００４３】
また、本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は、等電点の測定、糖含量の測定、抗体による定量等により、原料であるＯＣＩＦ物質と区別することができる。
【００４４】
等電点は等電点電気泳動により常法に従って測定することができる。ＯＣＩＦは塩基性タンパク質でありその等電点はｐＨ９付近に観測されるが、デキストラン硫酸の如き多糖物質が結合すると等電点が低下するので、ＯＣＩＦ物質とＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体を区別することが可能である。
【００４５】
糖含量はフェノール硫酸法による中性糖の定量法を用いて好適に測定することができる。多糖物質が結合したＯＣＩＦの糖含量は元のＯＣＩＦの糖含量に比して増加するので、ＯＣＩＦ物質とＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体を区別することが可能である。
【００４６】
本発明の多糖物質と特異的に結合する抗体を用い、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体中に含有される多糖物質の量を測定することにより、ＯＣＩＦ物質とＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体を区別することができる。
【００４７】
ＯＣＩＦ物質、及び、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は、従来公知のタンパク質測定法によりタンパク質量として測定され得る。そのようなタンパク質測定法には、ロウリー法（Lowry,O.H., et al., Protein Measurementwith the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 143, p265-275(1951)）、銀染色法、紫外吸収（λ２８０ｎｍ）測定法、ＢＣＡ法等が含まれ、好適にはロウリー法である。
【００４８】
また、ＯＣＩＦ物質、及び、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は、ＯＣＩＦ物質と特異的に結合する抗体を用いた各種の免疫学的なアッセイにより検出又は測定され得る。免疫学的なアッセイに適した抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＯＩ−１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２０）の生産する抗体ＯＩ−１９、ハイブリドーマＯＩ−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１９）の生産する抗体ＯＩ−４、ハイブリドーマＯＩ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２１）の生産する抗体ＯＩ−２６等を例示することができる（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照）。ハイブリドーマＯＩ−１９又はＯＩ−４の生産する抗体はＯＣＩＦ単量体（モノマー）体及び２量体（ホモダイマー）と結合し、ハイブリドーマＯＩ−２６の生産する抗体はＯＣＩＦ２量体（ホモダイマー）と特異的に結合する。このような抗体を用いて当業者に周知の方法により免疫学的なアッセイを行うことができる（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照）。免疫学的なアッセイとしては、酵素免疫アッセイ（enzyme immunoassay：以下、「ＥＩＡ」という。）、放射能免疫アッセイ（radio imunoassay）、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）、サンドイッチＥＩＡ等を例示することができ、好適にはＥＬＩＳＡを挙げることができる。本発明の好適なＥＬＩＳＡにおいては、抗体ＯＩ−１９又は抗体ＯＩ−２６が固相化された抗体として、抗体ＯＩ−４が酵素標識された移動相中の抗体としてそれぞれ使用される。本発明において酵素標識に用いられる好適な酵素はパーオキシダーゼ（peroxidase：以下、「ＰＯＤ」という。）である。
【００４９】
なお、抗体ＯＩ−４を生産するハイブリドーマＯＩ−４は、平成９年１０月１６日に、日本国茨城県つくば市東町１−１−３の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、日本国茨城県つくば市東町１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）へＯＩ−４として国内寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４７３を付与された後、平成１０年７月１３日に国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１９を付与された。
【００５０】
抗体ＯＩ−１９を生産するハイブリドーマＯＩ−１９は、平成９年１０月１６日に、日本国茨城県つくば市東町１−１−３の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、日本国茨城県つくば市東町１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）へＯＩ−１９として国内寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４７４を付与された後、平成１０年７月１３日に国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２０を付与された。
【００５１】
抗体ＯＩ−２６を生産するハイブリドーマＯＩ−２６は、平成９年１０月１６日に、日本国茨城県つくば市東町１−１−３の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、日本国茨城県つくば市東町１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）へＯＩ−２６として国内寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４７５を付与された後、平成１０年７月１３日に国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２１を付与された。
【００５２】
また、本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体を、ヘパリン親和性に基づいて更に特徴付けることが可能である。
【００５３】
ヘパリンは、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸、から成る多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチル及びＯ−硫酸置換体であり、ムコ多糖の中では硫酸基を最も多く含有する。ヘパリンはヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来するものであれば特に限定されないが、好適にはブタ腸粘膜由来のヘパリンである。ヘパリン親和性の測定にはヘパリンが固相化された担体を用いることができ、そのような担体としてブタ腸粘膜由来のヘパリンが固相化されたアガロースゲルビーズ等を好適に示すことができる。また、そのような担体が充填されたカラムはヘパリン親和性の測定により好適であり、最適にはＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ、ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｈｅｐａｒｉｎ、 Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）である。該カラムには、ブタ腸粘膜由来のヘパリンが固相化されたアガロースゲルビーズが約２乃至１０ｍｇ／ｍｌゲルの密度で充填されている。また、該カラムはｐＨ５乃至１０において通常用いられる緩衝液に対して安定であり、該カラムに吸着させたタンパク質は塩化ナトリウム、塩化カリウム又は硫酸アンモニウムを用いた１．５乃至２Ｍまでの連続的あるいは段階的なグラジエント溶離により回収され得る（Hakansson, S., et al., Protein Sci., 10, 2138-2139,(2001)：Tan, M., et al., Carcinogenesis, 22, 295-300, (2001)：Peterson, C. B., at al., J. Biol. Chem., 260, 610-615, (1985)：Garke,G.,et al., J. Chromatogr. B, 737, 25-38, (2000)参照）。
【００５４】
ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体のヘパリン親和性は、タンパク質の糖又はその誘導体に対する親和性を測定する従来公知の方法により測定され得るが、好適には、温和な条件下又は過酷な条件下でヘパリン又はヘパリンが固相化された担体に結合するか又は結合しない該複合体の量を測定してそれらを比較することにより行うことができる。温和な条件とは、通常タンパク質のカラムクロマトグラフィーにおいて温和と解釈される条件であれば特に限定されないが、例えば、イオン強度が相対的に低い条件等である。過酷な条件とは、通常タンパク質のカラムクロマトグラフィーにおいて過酷と解釈される条件であれば特に限定されないが、例えば、イオン強度が相対的に高い条件等である。イオン強度は強酸塩により調整され、好適には塩化ナトリウムにより調整される。
【００５５】
ヘパリンが固相化された担体が充填されたカラムを用いる場合、例えば、該カラムを予め温和なイオン強度が相対的に低い緩衝液で平衡化し、次いでＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体をイオン強度が相対的に低い緩衝液に溶解せしめて該カラムへ添加し、次いで非吸着画分（画分Ａ）を回収する。次いで該カラムへイオン強度が相対的に低い緩衝液を添加して溶出画分（画分Ｂ）を回収する。次いでイオン強度が相対的に高い緩衝液を該カラムへ添加して溶出画分（画分Ｃ）を回収することができる。本発明においては、画分Ａ、Ｂ及びＣに中に含まれるＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の量をそれぞれ測定し、次いで３つの値（それぞれ（ａ）、（ｂ）、（ｃ））を合計した値で（ｃ）を除算することにより得られる値を「ヘパリン吸着力」という。例えば、次の工程によりヘパリン吸着力を好適に算出することが可能である：
［ａ］０．１乃至０．８Ｍの塩化ナトリウムを含有する低イオン強度の緩衝液で、ヘパリンが固相化された担体が充填されたカラムを平衡化する工程；
［ｂ］［ａ］記載の緩衝液に被検試料を溶解せしめたものを前記カラムへ添加し、次いで溶出画分Ａを回収する工程；
［ｃ］［ａ］記載の緩衝液で前記カラムを洗浄し、溶出画分Ｂを回収する工程；［ｄ］１乃至２Ｍの塩化ナトリウムを含有する高イオン強度の緩衝液で前記カラムを洗浄し、溶出画分Ｃを回収する工程；
［ｅ］溶出画分Ａ乃至Ｃ中に存在するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の量（それぞれ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）という）を、該ＯＣＩＦ物質に特異的に結合する抗体を用いた酵素免疫アッセイ（enzyme immunoassay：ＥＩＡ）により測定する工程；
［ｆ］下記式により、ヘパリン吸着力を算出する工程。

前記工程［ｅ］における複合体の量の測定方法は、該ＯＣＩＦ物質に特異的に結合する抗体を用いたＥＩＡであれば得に限定されないが、例えば、ハイブリドーマＯＩ−１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２０）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−１９又はハイブリドーマＯＩ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２１）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−２６が固相化された抗体として、ハイブリドーマＯＩ−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１９）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４がパーオキシダーゼで酵素標識された移動相中の抗体としてそれぞれ使用されるＥＬＩＳＡを例示することができる。当該ＥＬＩＳＡはＯＣＩＦ物質がＯＣＩＦである場合に好適であり、ＯＣＩＦ物質がヒト成熟体ＯＣＩＦ（すなわち、配列表の配列番号１のアミノ酸番号第＋１番乃至第３８０番からなるポリペプチド）である場合により好適である。
【００５６】
このような方法、とりわけ好適なＥＬＩＳＡにより測定されるＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体のヘパリン吸着力は、通常０．７以下であり、好適には０．６以下であり、より好適には０．５以下である。なお、ヘパリン吸着力は、ヘパリンが固相化された担体の種類や測定条件に依存して変化し得る。
【００５７】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体を、ＯＣＩＦ物質と特異的に結合する抗体を用いて測定される免疫学的検出率に基づいて更に特徴付けることができる。本発明において、免疫学的検出率とは、ＯＣＩＦ物質に特異的に結合する抗体を使用する酵素免疫アッセイ（enzyme immnoassay：ＥＩＡ）により、該ＯＣＩＦ物質を標準物質として測定される、被検資料中に含まれる該ＯＣＩＦ物質の分子数（Ｘ）を、（ｉ）ウシ血清アルブミンを標準物質としてロウリー（Lowry）法により測定されるタンパク質量及び（ｉｉ）該ＯＣＩＦ物質の分子量に基づいて算出される、被検試料中に含まれる該ＯＣＩＦ物質の分子数（Ｙ）で除算することにより得られる数値（Ｘ÷Ｙ）を意味する。
【００５８】
タンパク質量の測定とそれに基づいてＯＣＩＦ物質の分子数を算出する方法は特に限定されないが、例えば、ロウリー法に基づいて下記［１］乃至［４］工程を経て好適に行うことができる：
［１］２０乃至６０μｇ／ｍｌ濃度のウシ血清アルブミンを標準物質として検量線を作成する工程；
［２］タンパク質濃度が２０乃至６０μｇ／ｍｌとなるよう希釈した被検試料のタンパク質濃度を測定する工程；
［３］前記工程［２］で測定されたタンパク質濃度及び前記工程［１］で作成された検量線より、被検試料中に含有される該ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体のタンパク質量を算出する工程；
［４］前記工程［３］で算出されたタンパク質量及び該ＯＣＩＦ物質の分子量より被検試料中に含まれる該ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の分子数を算出する工程。
【００５９】
免疫学的検出率の測定に適用される酵素免疫アッセイは特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマＯＩ−１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２０）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−１９又はハイブリドーマＯＩ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２１）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−２６が固相化された抗体として、ハイブリドーマＯＩ−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１９）により生産される抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４がパーオキシダーゼにより酵素標識された移動相中の抗体としてそれぞれ使用されるＥＬＩＳＡ（enxyme-linked immnosorbent assay）により下記工程［１］乃至［３］を経て好適に行うことができる：
［１］既知濃度の単離されたＯＣＩＦ物質を用いて検量線を測定する工程；
［２］被検試料を前記ＥＬＩＳＡに供する工程；
［３］前記工程［２］の測定値及び前記工程［１］で作成された検量線より、被検試料中に含まれる該ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体のタンパク質量を算出する工程；
［４］前記工程［３］で算出されたタンパク質量及び該ＯＣＩＦ物質の分子量より被検試料中に含まれる該ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の分子数を算出する工程。
【００６０】
なお、前記ＥＬＩＳＡの工程［３］において算出されるタンパク質量を、前記ロウリー法に基づく工程［３］において算出されるタンパク質量で除算することによっても、同じく免疫学的検出率をも算出し得る（実施例７参照）。
【００６１】
当該ＥＬＩＳＡは、ＯＣＩＦ物質がＯＣＩＦである場合により好適であり、ＯＣＩＦがヒト成熟体ＯＣＩＦ（すなわち、配列表の配列番号１のアミノ酸番号第＋１番乃至第３８０番からなるポリペプチド）である場合により一層好適である。
【００６２】
このようにして算出される、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の免疫学的検出率は通常０．５乃至１．２であり、好適には０．６乃至１．１以上であり、より好適には０．７乃至１．１以上である。なお、該免疫学的検出率は、タンパク質量の測定方法、ＥＩＡの種類、ＥＩＡに適用されるモノクローナル抗体等に依存して変化し得る。
【００６３】
本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体における、ＯＣＩＦ物質と多糖物質の結合は安定であり、例えば、一度ゲルろ過することにより得られた該複合体画分（Ｉ）を再度ゲルろ過に供し、次いで該複合体含有画分（ＩＩ）を回収し、次いで画分（Ｉ）又は（ＩＩ）のタンパク質含量及び糖含量を測定することによりその安定性を確認することができる。画分（Ｉ）又は（ＩＩ）は必要に応じて限外ろ過膜等を用いて濃縮することができる。また、画分（ＩＩ）を再度のゲルろ過に供して該複合体画分（ＩＩＩ）を得、同様に結合安定性を確認することが可能である。タンパク質含量の好適な測定法は前記ロウリー法であり、糖含量の好適な測定法は前記フェノール硫酸法である。
【００６４】
さらに、本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は血中滞留性に優れる。該複合体の血中滞留性は、それらの血中又は血清濃度の増減により確認することができる。該複合体の血中又は血清濃度は、例えば、ヒト又はヒト以外の動物の血管内に該複合体を投与し、一定時間経過後、該動物より血液又は血清を採取し、次いで前述の如き、該ＯＣＩＦ物質に特異的に結合する抗体を用いた酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）により測定することができる。
【００６５】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は、ＯＣＩＦを適用し得る疾患（ＷＯ９６／２６２１７号公報、ＷＯ９７／２３６１４号公報等参照）、すなわち骨代謝異常症と総称される疾患群の予防又は治療に有効である。
【００６６】
本発明において、骨代謝異常症とは、実質的な骨量の減少を特徴とするあらゆる疾患であり、骨代謝異常症を治療するかあるいは予防するためには骨吸収又は骨吸収速度を抑制する必要がある。そのような本発明の骨代謝異常症には、一次性骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発性若年性骨粗鬆症）、内分泌骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症）、性機能低下に伴う骨粗鬆症（下垂体機能低下症、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群及びＴｕｒｎｅｒ症候群）、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症（骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケス症及びライリー−デイ症候群）、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による骨減少症、パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性病巣、固形腫瘍（乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等）に起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病）、特発性高カルシウム血症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬物（メトトレキセート及びシクロスポリンＡ等の免疫抑制剤、ヘパリン及び抗てんかん薬）投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、消化器疾患（小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性胆汁性肝硬変及び肝硬変）に伴う骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、ムチランス型リウマチ、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移（骨溶解性転移）、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨減少症等が包含される。また、本発明における骨代謝異常症は、前記固形腫瘍、癌の骨転移（骨溶解性転移）又は血液学的悪性疾患による悪液質をも包含する（特開２０００−１７８２００号公報参照）。
【００６７】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体を有効成分として含有する医薬組成物は、ヒト又はヒト以外の動物に対し、経口又は非経口により安全に投与され得る。医薬としての投与形態は、疾患の種類、疾患の程度、症状、年齢、性別、体重等に応じて適宜選択することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤は経口投与され、注射剤は単独で若しくはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与されるか又は単独で筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与され、貼付剤は経皮投与され、点鼻剤は経鼻投与され、粘膜適用剤は経粘膜投与若しくは口腔内投与され、坐剤は直腸内投与される。これらの製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、ゲル化剤、界面活性剤、コーティング剤等、医薬の製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００６８】
錠剤の形態に成形するには、担体として当該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を挙げることができる。また、錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
【００６９】
丸剤の形態に成形するには、担体として当該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体としては、例えば、ブドウ糖、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等を挙げることができる。
【００７０】
坐剤の形態に成形するには、担体として当該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体としては、例えば、ポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。
【００７１】
注射剤として調製される場合には、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であることが好ましい。これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するには、希釈剤として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、血液との等張性を保つのに十分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、可溶化剤等を添加してもよい。注射剤は凍結乾燥品であってもよい。
【００７２】
また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の医薬等を含有せしめてもよい。
【００７３】
また、本発明の医薬組成物中に含まれるＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の量は、特に限定されるものではないが、通常０．１乃至７０重量％であり、好適には１乃至３０重量％である。
【００７４】
このような本発明の医薬組成物は、骨代謝異常症の予防又は治療剤として好適に使用され得る。また、本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体は、このような骨代謝異常症の予防又は治療用の医薬組成物を製造するために使用され得る。
【００７５】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の投与量は、症状、年齢、体重、投与形態、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり、投与量の上限が３０乃至１０００ｍｇ、下限が０．００１乃至０．０３ｍｇであり、好適な範囲は０．０３乃至３０ｍｇである。また、１日あたりの投与量の上限は１乃至２０ｍｇ／ｋｇ、下限は０．０１乃至０．５μｇ／ｋｇ、好適な範囲は０．５μｇ／ｋｇ乃至１ｍｇ／ｋｇである。
【００７６】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体の投与回数は、投与形態、剤形等に依存するが、数日に１回、１日１回、又は１日数回である。
【００７７】
本発明は、上述の如き投与経路、投与形態、投与量及び／又は投与回数で、本発明の提供する複合体をヒト又はヒト以外の動物へ投与されることを特徴とする、骨代謝異常症の予防又は治療方法をも提供する。
【００７８】
【実施例】
以下に、実施例及び試験例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸からなる複合体の調製（Ｉ）
１ａ）ＯＣＩＦの調製
ヒト組換型ＯＣＩＦ（２量体）はＷＯ９６／２６２１７号公報の実施例に従って取得した。
【００７９】
すなわち、まず、ＷＯ９６／２６２１７号公報の実施例１１において得られた形質転換大腸菌ｐＢＫ／０１Ｆ１０（日本国茨城県つくば市東１丁目の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在の、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に国際寄託されＦＥＲＭ ＢＰ−５２６７を付与された。）より、シグナルペプチドを含むヒトＯＣＩＦのコード配列を含有するプラスミドベクターｐＢＫＯＣＩＦを取得した。次いで、ＷＯ９６／２６２１７号公報の実施例１４記載の方法に従って、ｐＢＫＯＣＩＦを制限酵素Ｓａｌ１及びＥｃｏＲ５で消化した後、ＯＣＩＦをコードする断片を回収し精製し、次いで平滑末端化した。得られた断片を予め平滑末端化した発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Molecular and Cellular Biology, 8, p466-472(1998)）へ挿入し、得られた組換発現ベクターで大腸菌株ＤＨ５α（GIBCO BRL）を形質転換し、所望の形質転換株ｐＳＲαＯＣＩＦを得た。
【００８０】
エレクトロポレーション法により、ＣＨＯデヒドロ葉酸還元酵素（dehydrofolate reductase：以下、「ｄｈｆｒ」という。）欠損株（以下、「ＣＨＯｄｈｆｒ−」という。）を前記ｐＳＲαＯＣＩＦ及びｐＢＡｄＤＳＶ（ｄｈｆｒ発現ベクター：ＷＯ９２／０１０５３号公報参照）で共トランスフェクション（co-transfection）し、次いでｄｈｆｒ発現株を選抜した。さらに、ＯＣＩＦを高発現している株を選抜した結果、ＯＣＩＦ高生産クローンが得られた。該クローンを培養し、ＣＨＡＰＳを０．１％濃度に添加した後フィルターでろ過し、ヘパリン・セファロースＦＦカラム（ファルマシア・バイオテク社製）クロマトグラフィー、次いでブルー５ＰＷカラム（トーソー（株）製）クロマトグラフィーに供した。所望のヒトＯＣＩＦを含む画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果、非還元条件下においては分子量約６００００及び分子量約１２００００のバンドのみが検出された（ＷＯ９６／２６２１７号公報の実施例１４参照）。
【００８１】
得られたヒトＯＣＩＦ１００μｇに、１００分の１容量の２５％トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid：以下「ＴＦＡ」という。）を添加した後、０．１％ＴＦＡを含む３０％アセトニトリルで平衡化した逆相カラムＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（直径２．０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ：ワイエムシー（株）製）に添加し、３０％乃至５５％のアセトニトリル直線的濃度勾配を５０分間かけて作製し、０．１ｍｌ／分の流速で溶出させ、２つのピーク画分をそれぞれ別個に分取した。、非還元条件下におけるをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約１２００００のバンドのみが検出される画分を、組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）画分として、以下の実施例に供した（ＷＯ９６／２６２１７号公報の実施例１７及び１８参照）。
１ｂ）ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸からなる複合体の調製
１ａ）で得られた組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へ、１．５、２、５、６．５、１０、１２．５、２０又は５０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解せしめた。この水溶液に、デキストラン硫酸ナトリウムイオウ５（名糖産業（株）製：以下、「ＤＳ５」という。）を、終濃度４０、１００、１３０、１５０、２００、４００、５００、５１０、又は１０００ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１０、１０．５又は１１に調整した。得られた水溶液を、４、７、２５又は３７℃にて、１、３、６、１８、２４、４８、７２、９６、１４４、１６８又は２８８時間保温した。
【００８２】
保温後の水溶液４ｍｌを、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）で予め平衡化したゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（カラム内径１６ｍｍ×長さ６０ｃｍ：排除限界分子量１３０万：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）へ添加し、該緩衝液により流速２ｍｌ／ｍｉｎで溶出させた。紫外分光光度計を用いてλ２８０ｎｍの吸収をモニターし、保持時間約２８乃至３６分の溶出液を分取した。組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）と結合していない遊離のＤＳ５は保持時間約５０乃至７０分に溶出された。上記ゲル濾過は室温にて行った。
【００８３】
得られた組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）及びＤＳ５からなる複合体（以下、「ＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体」という。）を含有する画分を−６０℃にて凍結保存した。
【００８４】
なお、本実施例に記載された各処方の反応条件を下記の表１にまとめた。
【００８５】
【表１】

１ｃ）天然型ヒトＯＣＩＦの調製
ＷＯ９６／２６２１７号公報の実施例１乃至４に記載の方法に従って、ヒト胎児肺繊維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ１８６）より天然型（非組換型）ヒトＯＣＩＦを得ることが可能である。また、１ａ）記載の逆相カラムクロマトグラフィーにより、天然型ヒトＯＣＩＦ（２量体）を取得することができる。
実施例２．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸からなる複合体の調製（ＩＩ）
実施例１ａ）において得られた組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へ、５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解せしめた。この水溶液に、分子量５０００のデキストラン硫酸ナトリウム（和光純薬（株）製：以下、「ＤＳ５０００」という。）を、終濃度１５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１０．５に調整した。得られた水溶液を４℃にて２４時間保温した。
【００８６】
保温後の水溶液４ｍｌを、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）で予め平衡化したゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（カラム内径１６ｍｍ×長さ６０ｃｍ：排除限界分子量１３０万：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）へ添加し、該緩衝液により流速２ｍｌ／ｍｉｎで溶出させた。紫外分光高度計を用いてλ２８０ｎｍの吸収をモニターし、保持時間約２８乃至３６分の溶出液を分取した。組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）と結合していない遊離のＤＳ５０００は保持時間約４０乃至６５分に溶出された。上記ゲル濾過は室温にて行った。
【００８７】
得られた組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）及びＤＳ５０００の複合体（以下、「ＯＣＩＦ／ＤＳ５０００複合体」という。）を含有する画分を−６０℃にて凍結保存した。
【００８８】
なお、本実施例に記載された処方の反応条件を下記の表２にまとめた。
【００８９】
【表２】

参考例１．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸ナトリウムからなる組成物の調製
実施例１において得られた組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）を、０．１５Ｍ濃度の塩化ナトリウム及び０．０１％のポリソルベート８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へ、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解せしめた。この水溶液に、実施例２記載のＤＳ５０００（和光純薬（株）製）又は分子量１００００のデキストラン硫酸ナトリウムであるＤＳ１００００（和光純薬（株）製：以下、「ＤＳ１００００」という。）を、終濃度１又は４ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ７に調整した。得られた水溶液を４℃にて２４時間保温した。
【００９０】
得られた組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）及びＤＳ５０００又はＤＳ１００００からなる組成物は速やかに下記試験例１へ供した。
なお、本参考例に記載された各参考処方の反応条件を下記の表３にまとめた。
【００９１】
【表３】

実施例３．等電点の測定
実施例１において得られた組換え型ヒトＯＣＩＦ（２量体）及び実施例１記載で得られたＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体（処方２２）を、等電点電気泳動ゲルＩＥＦ ＰＡＧＥ ｍｉｎｉ（ｐＨ範囲３乃至１０：岩城硝子（株）製）に添加し、ＩＥＦ ｐＨ３−７ ｂｕｆｆｅｒ ｋｉｔ（Technical Frontier Co．製）を泳動用緩衝液として次の電圧を印加することにより電気泳動を行った：１００Ｖにて１時間、次いで２００Ｖにて１時間、次いで５００Ｖにて３０分間。電気泳動終了後、ゲルをクマシーブルー染色した。
【００９２】
その結果、ＯＣＩＦの等電点は約ｐＩ９であり、一方ＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体（処方２２）の等電点は約ｐＩ６．５であった。
実施例４．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸からなる複合体におけるＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の分子比の算出
本実施例において用いられた抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体は、ＷＯ９９／１５６９１号公報記載の方法により作製された。すなわち、精製したモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを抗原として、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫した後、同マウスを解剖して摘出した脾臓から分離した脾臓細胞をマウスミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３−ＡＧ８．６５３と細胞融合させた。得られたハイブリドーマのうち、抗ヒトＯＣＩＦ抗体を産生しているものをＯＣＩＦを固相化した酵素免疫測定法により選択した。更に限外希釈法によるクローニングを３〜５回繰り返すことにより安定な抗体生産ハイブリドーマを樹立した。これら抗体生産ハイブリドーマをそれぞれ培養し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に移植した。２週間後、蓄積した腹水を採取し、プロテインＡカラム（ファルマシア社）を用いたクロマトグラフィーによる精製を行うことにより、モノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識するＯＩ−１９抗体あるいはＯＩ−４抗体、またホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識するＯＩ−２６抗体を得て、以下の実験に用いた。
１）パーオキシダーゼで標識した抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４原液の調製
当該抗体の酵素標識は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ（ピアース社製）を用い、該キットのプロトコルＩＩに従って行った。
【００９３】
ＷＯ９９／１５６９１号公報に記載の方法に従って精製された抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４（ハイブリドーマＯＩ−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１９）により生産される。）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈したもの１ｍｌに、上記キットに添付されたＮ−スクシニミジル Ｓ−アセチルチオアセテートを、ジメチルフォルムアミドにて使用直前に１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したもの４μｌを添加し、室温にて３０分間保温した。ここに、予め５ｍｇのヒドロキルアミン塩酸塩を上記キットに添付されたＭａｌｅｉｍｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ１００μｌへ使用直前に溶解した溶液２０μｌを添加した後、室温にて２時間保温した。当該反応液を、予め３０ｍｌのＭａｌｅｉｍｉｄｅ ＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒで平衡化した、上記キットに添付されたポリアクリルアミド脱塩カラム（容積１０ｍｌ）へ付し、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒで溶出し、０．５ｍｌずつ分取した。当該抗体を含む７乃至１０番目の画分を合併した。ここに、上記キットに添付されたＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ５ｍｇを５００μｌの蒸留水に溶解したもの１００μｌを添加し、室温にて１時間保温した後、等容のグリセロールを添加し、−２０℃にて保存した。
【００９４】
最終的に得られた溶液を、パーオキシダーゼで標識した抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４（以下、「ＰＯＤ−ＯＩ−４」という。）の原液とした。２）ＯＣＩＦの定量
実施例１及び２に記載の各処方におけるＯＣＩＦ量を、抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００９５】
９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ：ＮＵＮＣ社製）上の各ウェルに、ＷＯ９９／１５６９１号公報に記載の方法に従って得られた抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−２６（ハイブリドーマＯＩ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２１）により生産される。）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液へ５μｇ／ｍｌとなるように溶解せしめたもの１００μｌを分注し、シールして４℃にて１晩静置した。
【００９６】
０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μｌで、各ウェルを３回洗浄した。
【００９７】
希釈緩衝液（組成：０．２ＭＴｒｉｓ−塩酸、４０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本製薬（株）より購入）、０．１％ポリソルベート２０：ｐＨ７．４）２０μｌを各ウェルヘ添加し、室温にて２０分間保温した・
被検試料を希釈緩衝液を用いて適宜希釈した。検量線作成のための標準溶液には既知濃度のＯＣＩＦを含有する希釈緩衝液を、対照には希釈緩衝液を、それぞれ用いた。各被検試料５０μｌを各ウェルへ分注した。
【００９８】
各ウェルに、１）で得られたＰＯＤ−ＯＩ−４の原液を［０．２ＭＴｒｉｓ−塩酸、４０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本製薬（株）より購入）、０．１％ポリソルベート２０（ｐＨ７．４）］で１５００倍希釈したもの５０μｌを添加し、室温にて２時間静置した。
【００９９】
反応後、０．１％ポリソルベート２０を含有するｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（以下、「ＰＢＳ」という。：ｐＨ７．４）２５０μｌで、各ウェルを４回洗浄した。
【０１００】
０．１Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸水素２ナトリウムを混合し、基質溶解液とした（ｐＨ４．５）。
【０１０１】
ＯＰＤ錠（和光純薬（株）製）１３ｍｇに基質溶解液３２．５ｍｌ及び過酸化水素水６．５μｌを加えて溶解することにより得られた基質液１００μｌを各ウェルへ添加し、アルミホイルで遮光し室温にて１５分間静置した。
【０１０２】
硫酸５０ｍｌに精製水２５０ｍｌを混合することにより得られた反応停止液５０μｌを各ウェルへ添加した。
【０１０３】
攪拌振とう器（タイターミキサーＭＢ−１：Ｊａｐａｎ Ｔｒｉｋａ社製）を用いて穏やかに攪拌した後、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ ＦＬＵＯＲ：ＴＥＣＡＮ社製）を用いて波長λ４９０ｎｍにおける試料溶液の吸光度を測定した。
【０１０４】
標準溶液を用いて作成した検量線より、被検試料中のＯＣＩＦ含有量を算出した。
３）デキストラン硫酸の定量
実施例１及び２に記載の各処方におけるデキストラン硫酸量を、フェノール硫酸法により中性糖として測定した。
【０１０５】
１０乃至６０μｇ／ｍｌ範囲の既知濃度のＤＳ５（名糖産業（株）製）又はＤＳ５０００（和光純薬（株）製）を希釈溶液（組成：０．０１Ｍクエン酸、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０水溶液：ｐＨ６．０）に溶解し標準溶液とした。標準溶液、試料溶液及び希釈溶液各０．２ｍｌを試験管へ分注した。
【０１０６】
該試験管へ５０ｍｇ／ｍｌフェノール水溶液０．２ｍｌを分注し、速やかに攪拌した。
【０１０７】
６０℃の水浴中で２０秒間保温した後、濃硫酸１．０ｍｌを添加して速やかに攪拌した。
【０１０８】
室温にて１０分間静置した後再度攪拌し、室温にて２０分間静置した。
【０１０９】
分光光度計（ＵＶ−２４０：島津製作所（株）製）を用い、波長λ４９０ｎｍにおける各ウェルの吸光度をそれぞれ測定した。
【０１１０】
ヒトＯＣＩＦはそれ自体に糖鎖が結合している。そこで、上記測定で得られたＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体中の中性糖含量の値から、同様に測定した原料のＯＣＩＦの中性糖含量の値を差し引くことにより、ＯＣＩＦに結合したデキストラン硫酸の量を算出した。
４）ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体におけるＯＣＩＦ並びにデキストラン硫酸の分子比の算出
上記３）で得られた各処方におけるデキストラン硫酸の量を上記２）で得られた各処方におけるＯＣＩＦの含有量で除算することにより、ＯＣＩＦ１ｍｇに結合しているデキストラン硫酸の量を算出した。
【０１１１】
次いで、ヒトＯＣＩＦ単量体を分子量６００００、ＤＳ５を分子量１９５０、ＤＳ５０００を分子量５０００、ＤＳ１００００を分子量１００００として、各処方におけるＯＣＩＦ単量体とデキストラン硫酸の分子比を、ＯＣＩＦ単量体１分子当たりのデキストラン硫酸の分子数として算出した。
【０１１２】
結果を下記表４に示す。
【０１１３】
【表４】

実施例５．ＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体の結合安定性
ＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体のゲル濾過による分離とそれに続く濃縮を繰り返した後、実施例４の３）に記載の方法に準じて該複合体中のデキストラン硫酸の量を測定した。
１）保温
ＷＯ９６／２６２１７号公報に記載の方法に従って得られた組換型ヒトＯＣＩＦ（２量体）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へ、５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解せしめた。この水溶液にＤＳ５を終濃度１５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１０．５に調整した。得られた水溶液を４℃にて７日間保温した。
２）ゲルろ過（１回目）
保温後の水溶液を実施例１に記載の方法でゲルろ過した。保持時間約２８乃至３６分の溶出液を分取した。ＯＣＩＦと結合していないＤＳ５は保持時間約５０乃至７０分に溶出された。溶出液中のタンパク質量を実施例７の１）に記載のロウリー（Ｌｏｗｒｙ）法により、また溶出液の糖含量を実施例４の３）に記載のフェノール硫酸法によりそれぞれ測定した。
３）ゲルろ過（２回目）
２）で回収された溶出液を、セントリプレップ（ＹＭ−３０、３０，０００ＭＷカットオフ：アミコン社製）２本に分け、遠心分離装置（ｈｉｍａｃＣＴ６０：日立製作所（株）製）を用いて２０００ｒｐｍにて２０分間遠心操作を行った。セントリプレップのろ過膜にてろ過されなかった分画を回収した。回収された溶液を２）に記載の方法で再度ゲルろ過し、保持時間約２８乃至３６分の溶出液を分取した。溶出液のタンパク質濃度及び糖含量を２）に記載の方法によりそれぞれ測定した。
４）ゲルろ過（３回目）
３）で回収された溶出液を、セントリプレップ（ＹＭ−３０、３０，０００ＭＷカットオフ：アミコン社製）２本に分け、遠心分離装置（ｈｉｍａｃＣＴ６０：日立製作所（株）製）を用いて２０００ｒｐｍにて２０分間遠心操作を行った。セントリプレップのろ過膜にてろ過されなかった分画を回収した。回収された溶液を前記２）に記載の方法で再度ゲルろ過し、保持時間約２８乃至３６分の溶出液を分取した。溶出液のタンパク質濃度及び糖含量を前記２）に記載の方法によりそれぞれ測定した。
【０１１４】
結果を下表５に示す。
【０１１５】
【表５】

表５に示す通り、本実施例において製造されたＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体中のＯＣＩＦ及びＳ５の結合は、本実施例の条件下において安定であることが示された。
実施例６．ＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体のヘパリン吸着力
１）ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸からなる複合体のヘパリンカラムへの吸着
以下のカラム操作は全て４ｍｌ／ｍｉｎの流速で行った。
【０１１６】
ヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ、Ｌｏｔ．２８９２１２，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を、０．７Ｍ濃度の塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム・カリウム緩衝液（ｐＨ７．０：以下、「リン緩衝液」という。）５ｍｌで予め平衡化した。次いで、実施例１に記載の処方６乃至８、処方２２、２４、２５及び２７のいずれか一つを、タンパク質濃度（実施例７の１）に記載の方法により測定）が０．１ｍｇ／ｍｌとなるように前記リン酸緩衝液を用いて希釈し、前記カラムへ添加した後、溶出液［Ａ］１ｍｌを分取した。次いで、前記カラムにリン酸緩衝液５ｍｌを添加し、溶出液［Ｂ］５ｍｌを分取した。次いで、前記カラムに２．０Ｍ濃度の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液４ｍｌを添加し、溶出液［Ｃ］４ｍｌを分取した。
２）ヘパリンカラム溶出液中のＯＣＩＦの定量
９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ：ＮＵＮＣ社製）上の各ウェルへ、抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体 ＯＩ−１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２０）を０．１Ｍ濃度の炭酸水素ナトリウム水（ｐＨ９．６）へ１０μｇ／ｍｌとなるように溶解せしめたもの１００μｌを分注し、次いでシールした後４℃にて一晩保温した。抗体溶液をデカントにより除去し、各ウェルに３００μｌのブロッキング緩衝液（５０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ：大日本製薬（株）より購入）を添加し、室温にて２時間保温した。ＳＥＲＡ ＷＡＳＨＥＲ（Ｂｉｏ Ｔｅｃ社製、ＭＷ−９６Ｒ）を用いて、０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００μｌで各ウェルを３回洗浄した。
【０１１７】
１）で得られた溶出液［Ａ］、［Ｂ］又は［Ｃ］を、希釈緩衝液（組成：０．２ＭＴｒｉｓ−塩酸、４０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ、１０μｇ／ｍｌ濃度のマウス免疫グロブリンＧ、０．１％ポリソルベート２０（ｐＨ７．４）を用いて適宜希釈して１２０μｌとし、等容の精製水を添加して混合した。対照として、既知濃度のＯＣＩＦ２量体溶液を希釈緩衝液で適宜希釈して１２０μｌとし、等容に精製水を加えて混合した。
【０１１８】
このようにして得られた被検試料のうち１００μｌを各ウェルに添加し、攪拌振盪器（マイクロプレートミキサーＮＳ−Ｐ：井内盛栄堂（株）製）を用いて、穏やかに振盪しつつ室温にて２時間保温した。次いで、ＳＥＲＡ ＷＡＳＨＥＲを用いて、０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００μｌで各ウェルを６回洗浄した。次いで、実施例４の１）で得られたＰＯＤ−ＯＩ−４の原液を抗体希釈液（組成：０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸、２５％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ：大日本製薬（株）より購入、１０μｇ／ｍｌマウス免疫グロブリンＧ、０．１％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４）で１００００倍希釈したもの１００μｌを添加し、前記攪拌振盪器を用いて穏やかに振盪しつつ、室温にて２時間保温した。次いで、ＳＥＲＡ ＷＡＳＨＥＲを用いて、０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００μｌで各ウェルを６回洗浄した。
【０１１９】
各ウェルに基質溶液（ＴＭＢ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅａｇｅｎｔ：Ｓｃｙｔｅｋ社製）１００μｌを添加し、前記攪拌振盪器を用い穏やかに振盪しつつ、室温にて１０乃至１５分間保温した。各ウェルに反応停止液（ＴＭＢ ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ：Ｓｃｙｔｅｋ社製）１００μｌを添加した。
【０１２０】
攪拌振盪器を用い、約１分間て穏やかに振盪した後、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ ＴＨＥＲＭＯ：ＴＥＣＡＮ社製）を用いて波長λ４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定した。濃度既知のＯＣＩＦ溶液を用いて作成した検量線から、ヘパリンカラム溶出液中のＯＣＩＦ濃度を算出した。
【０１２１】
１）で得られた溶出液［Ａ］、［Ｂ］及び［Ｃ］中に含まれるＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体の量で溶出液［Ｃ］中に含まれるＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体の量を除算することにより得られた数値を、ヘパリン吸着力として表６にまとめた。
【０１２２】
対照として、実施例１において取得されたＯＣＩＦ原体についても同様の測定を行い、ヘパリン吸着力を算出した。
【０１２３】
【表６】
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処方名 ヘパリン吸着力
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
処方６ ０．４５１
処方７ ０．１８３
処方８ ０．１５３
処方２２ ０．２６４
処方２４ ０．０７２
処方２５ ０．６１１
処方２７ ０．１４１
ＯＣＩＦ ０．９９８
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実施例７．ＯＣＩＦ及びＤＳ５からなる複合体の免疫学的検出率の算出
１）タンパク質量の測定
実施例１に記載の処方６乃至８、処方２２、２４、２５及び２７のいずれか一つを、タンパク質濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌとなるよう前記リン酸緩衝液を用いて希釈し、ロウリー法に準じてタンパク質量を測定した。
【０１２４】
硫酸銅（ＩＩ）五水和物（和光純薬工業（株）製）０．２ｇを水へ溶解せしめ、終容積５０ｍｌとした。酒石酸ナトリウム二水和物（和光純薬工業（株）製）０．４ｇを水へ溶解せしめ、終容積５０ｍｌとした。炭酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）２０ｇを水に溶解せしめ、終容積１００ｍｌとした。
【０１２５】
０．４ｇ／ｄｌ硫酸銅溶液、０．８ｇ／ｄｌ酒石酸ナトリウム溶液及び炭酸ナトリウム溶液を、１：１：２の容積比率で使用直前に混合した。（以下、「Ａ液」という。）
ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク（株）製）１０ｇを水へ溶解せしめ、終容積２００ｍｌとした（以下、「Ｂ液」という。）。
【０１２６】
水酸化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）３．２ｇを使用直前に水へ溶解せしめ、終容積１００ｍｌとした（以下、Ｃ液という。）
Ａ液、Ｂ液およびＣ液を、１：２：１の容積比率で使用直前に混合した。
【０１２７】
フォーリン・チオカルトフェノール試薬（和光純薬工業（株）製）および水を、１：５の容積比率で使用直前に混合した。
【０１２８】
クエン酸三ナトリウム二水和物（和光純薬工業（株）製）２．７６ｇ、クエン酸一水和物（和光純薬工業（株）製）０．１３ｇ、塩化ナトリウム１７．５ｇ及びポリソルベート８０ ０．１ｇを水へ溶解せしめ、終容積１Ｌとした（ｐＨ６．９、以下、「希釈液」という。
【０１２９】
希釈液９．５ｍｌを、タンパク質定量用ウシ血清アルブミン標準溶液（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：以下「ＢＳＡ」という。：ピアース社製）の２ｍｇ／ｍｌ水溶液５００μｌへ加えた（以下、１００μｇ／ｍｌ標準溶液）。希釈液３．５ｍｌ、３ｍｌ、２．５ｍｌ又は２ｍｌを、１００μｇ／ｍｌ標準溶液１．５ｍｌ、２ｍｌ、２．５ｍｌ又は、３ｍｌへそれぞれ加えた（以下、３０μｇ／ｍｌ標準溶、４０μｇ／ｍｌ標準溶、５０μｇ／ｍｌ標準溶、６０μｇ／ｍｌ標準溶液）。希釈液３ｍｌを、６０μｇ／ｍｌ標準溶液１．５ｍｌへ加えた（以下、２０μｇ／ｍｌ標準溶液）。
【０１３０】
被検試料は、タンパク質濃度として約４０μｇ／ｍｌとなるよう、希釈液で適宜希釈した。
【０１３１】
標準溶液（２０μｇ／ｍｌ標準溶液、３０μｇ／ｍｌ標準溶液、４０μｇ／ｍｌ標準溶液、５０μｇ／ｍｌ標準溶液、又は、６０μｇ／ｍｌ標準溶液）、希釈された被検試料（ｎ＝３）および対照（希釈液）各１ｍｌを試験管に採取し、アルカリ性銅試液１ｍｌを加えて直ちに混合した。室温で正確に１０分間放置したのち、希フォーリン・チオカルトフェノール試液０．５ｍｌを加えて直ちに混合した。室温にて３０分間放置したのち、水を対照とし、ブランク、標準溶液および試料溶液の波長７５０ｎｍにおける吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を層長１０ｍｍの石英セルを用いて、紫外可視分光光度計（Ｌａｍｂｄａ２０：パーキンエルマー社製）により測定した。標準溶液を用いて作製した検量線より、被検試料中のタンパク質量をＢＳＡ換算値として算出した。
２）ＥＬＩＳＡによる免疫学的測定
実施例１に記載の処方６乃至８、処方２２、２４、２５及び２７のいずれか一つを、タンパク質濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌとなるよう前記リン酸緩衝液を用いて希釈し、実施例６に記載のＥＬＩＳＡ法によりタンパク質量をそれぞれ測定した。
３）免疫学的検出率の算出
２）においてＥＬＩＳＡにより測定されたタンパク質量を、１）においてロウリー法により測定されたタンパク質量で除算した値を、免疫学的検出率として表７にまとめた。
【０１３２】
対照として、実施例１において取得されたＯＣＩＦ原体についても同様の測定を行い、免疫学的検出率を算出した。
【０１３３】
なお、２）においてＥＬＩＳＡにより測定されたタンパク質量をＯＣＩＦの分子量で除算することにより得られるＯＣＩＦ物質の分子数を、１）においてロウリー法により測定されたタンパク質量をＯＣＩＦの分子量で除算することにより得られるＯＣＩＦの分子数で除算することにより、同じく免疫学的検出率を算出することができる。
【０１３４】
結果を表７にまとめた。
【０１３５】
【表７】

試験例１．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸からなる複合体の血中滞留性
１）実験動物への注射剤の投与と採血
ウィスター系雌性ラット５週齢（体重約１００ｇ）を１晩絶食させた。
【０１３６】
実施例１に記載の処方１乃至４０、実施例２に記載の処方４１並びに参考例１に記載の参考処方１及び２のいずれか一つを、０．０１％ポリソルベート８０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）で適宜希釈して注射剤とし、２ｍｌ／体重ｋｇとなるようにラット尾静脈内に単回投与した。投与後６時間経過した時点でラット心臓より採血した。
２）血清の分画とＯＣＩＦの定量
血液を室温にて３０分静置することにより凝固させた後、直径１０ｃｍローターを使用した１４０００ｒｐｍ３分間の遠心分離により血清を上清として得た。
３）血清中のＯＣＩＦの定量
９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ：ＮＵＮＣ社製）上の各ウェルに、抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体 ＯＩ−１９（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照参照：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４２０）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液へ１０μｇ／ｍｌとなるように溶解せしめたもの１００μを分注し、シールして４℃にて１晩静置した。次いで、抗体溶液をデカントにより除去し、各ウェルに３００μｌのブロッキング緩衝液（５０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ：大日本製薬（株）より購入）を添加し、室温２時間静置した。次いで、０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００μｌで、各ウェルを３回洗浄した。次いで、被検血清２０μｌに、精製水１００μｌ及び希釈緩衝液（組成：０．２ＭＴｒｉｓ−塩酸、４０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ：大日本製薬（株）より購入）、１０μｇ／ｍｌマウスイイムノグロブリンＧ、０．１％ポリソルベート２０：ｐＨ７．４）１２０μｌを添加、混合した。対照として、２０μｌの蒸留水に、水１００μｌ及び既知濃度のＯＣＩＦ２量体を含有する希釈緩衝液１２０μｌを添加して混合した。これらの被検試料１００μｌを各ウェルに添加し、室温にて２時間保温した。次いで、０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００μｌで、各ウェルを６回洗浄した。次いで、各ウェルに、実施例４の１）で得られたＰＯＤ−ＯＩ−４の原液を［０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸、２５％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本製薬（株）より購入）、１０μｇ／ｍｌマウスイムノグロブリンＧ、０．１％ポリソルベート２０（ｐＨ７．４）］で１０００倍希釈したもの１００μｌを添加し、室温にて２時間保温した。次いで、０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００μｌで、各ウェルを６回洗浄した。次いで、各ウェルに、基質溶液（ＴＭＢ ｓｏｌｕｂｌｅｒｅａｇｅｎｔ：Ｓｃｙｔｅｋ社製）１００μｌを添加し、室温にて１０乃至１５分間保温した。次いで、各ウェルに反応停止液（ＴＭＢ ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ：Ｓｃｙｔｅｋ社製）１００μｌを添加した。攪拌振とう器（マイクロプレートミキサーＮＳ−Ｐ：井内盛栄堂（株）製）を用いて穏やかに攪拌した後、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ ＴＨＥＲＭＯ：ＴＥＣＡＮ社製）を用いて波長λ４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定した。
【０１３７】
標準溶液を用いて作成した検量線より、被検血清中のＯＣＩＦ濃度を算出した。
【０１３８】
１）で調製した各注射剤中のＯＣＩＦ濃度を、血清の場合と同様に測定することにより、単位体重当たりのＯＣＩＦの投与量（ｍｇ／ｋｇ）として算出した。
４）各処方の血中滞留性
前記２）で得られた血清中のＯＣＩＦ及びＤＳからなる複合体の量を、前記３）記載の方法に従って測定した。
【０１３９】
結果を表８にまとめた。
【０１４０】
【表８】

表８に示す通り、０．５ｍｇ／体重ｋｇを投与した場合の、投与後６時間の血清中濃度は、従来公知の参考処方１と比較して、２．２乃至１１．７倍高かった。
【０１４１】
【発明の効果】
本発明の提供する、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質からなる複合体を含有する骨代謝異常症の予防又は治療剤は、血中滞留性に優れ、骨粗鬆症、高カルシウム血症、癌の骨転移、慢性関節リウマチ等のリウマチによる骨減少、ステロイド投与による骨減少、多発性骨髄腫、腎臓疾患に伴う減少又は高カルシウム血症、腎性骨異栄養症、変形性関節症等の予防又は治療に有用である。
【０１４２】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to at least one or more selected from the group consisting of an osteoclastogenesis inhibitory factor (hereinafter referred to as “OCIF”: WO96 / 26217), an analog thereof and a mutant thereof. A substance (hereinafter, referred to as “OCIF substance”) and a complex composed of one or more substances selected from the group consisting of polysaccharides and derivatives thereof (hereinafter, referred to as “polysaccharide substances”) are contained as active ingredients. The complex (hereinafter, referred to as "the dextran sulfate or a salt thereof") in which a preventive or therapeutic agent for bone metabolism disorder, an OCIF substance and a polysaccharide substance are bound at a molecular ratio of 1: 1 to 1:10, and A complex comprising an OCIF substance and dextran sulfate ”) as an active ingredient, a prophylactic or therapeutic agent for bone metabolism disorders, an OCIF substance and a polysaccharide substance. And a complex comprising an OCIF substance and a polysaccharide substance obtained by a method for producing a complex comprising an OCIF substance and a polysaccharide substance, which is then kept at pH 9.5 to 12 and then removing free polysaccharide substances. And / or a prophylactic or therapeutic agent for bone metabolism disorders containing as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Bone retains about 99% of calcium in vivo and plays an important role in maintaining blood calcium homeostasis by bone formation and bone resorption. When osteoclasts, which play a major role in the process of bone resorption, are abnormally formed or activated, bone resorption is promoted and blood calcium concentration increases, resulting in hypercalcemia. It is known that when cancer spreads to bone, the secretion of cytokines becomes abnormal and hypercalcemia is exhibited. In this process, promotion of bone resorption by osteoclasts also results in an increase in blood calcium concentration. (Non-Patent Document 1) The prognosis of cancer patients with cancerous hypercalcemia is generally poor.
[0003]
In rheumatoid arthritis such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis, abnormal formation or activation of osteoclasts is known as one of the main causes of consent symptoms seen in bones and joints. (Non-Patent Document 2) Rheumatoid arthritis such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis cause severe pain and bring a significant disadvantage to patients' lives.
[0004]
In addition, when the balance between bone resorption and bone formation continuously declines toward the bone resorption side due to decreased female hormone secretion and aging after menopause, bone density decreases and osteoporosis develops. It is osteoclasts that are responsible for bone resorption. Elderly patients who are at high risk of osteoporosis have a high possibility of becoming bedridden when a fracture occurs, which is a social issue. (Non-Patent Document 3)
Conventionally, hormone replacement therapy such as estrogen, and therapeutic agents such as bisphosphonates and calcitonins that suppress the activity of osteoclasts have been used for these conditions. (Non-Patent Document 4) However, hormones increase the risk of carcinogenesis, and may cause side effects such as induction of endometriosis and abnormal bleeding from the genitals. (Non-Patent Document 5) Bisphosphonates are known to accumulate in bone because they easily bind to calcium, but some researchers have doubts about how much bone strength is improved. However, the risk of kidney damage has also been reported. (Non-Patent Document 6) Calcitonins have a transient increase in bone density, and rebound due to drug withdrawal or due to the expression of immunogenicity or antigenicity in the human body of general calcitonin derived from non-human animals and the appearance of antibodies Decreased efficacy has been pointed out. (Non-Patent Document 7) Bone resorption, which is a cause of increased blood calcium concentration, is carried out by osteoclasts, but none of these existing drugs has the action of suppressing the formation of osteoclasts, It is not enough to provide a fundamental treatment for blood and bone metabolism disorders.
[0005]
OCIF is known as an endogenous protein that inhibits osteoclast precursor cells from differentiating into osteoclasts and inhibiting bone resorption activity by mature osteoclasts (Patent Document 1). OCIF is also known as an alias for osteoprotegerin (osteoprotegerin: hereinafter, referred to as “OPG”: Patent Document 2). If OCIF can suppress the formation of osteoclasts itself and the bone resorption activity by mature osteoclasts, which are the main players in bone resorption, it will be possible to fundamentally treat the above-mentioned diseases caused by bone resorption. Expected. However, OCIF is a basic protein having an isoelectric point near 9, and is rapidly eliminated from circulating blood.
[0006]
Patent Literature 3 discloses a method of improving OCIF blood retention and increasing its efficacy by mixing OCIF with a polysaccharide or a derivative thereof.
[0007]
[Patent Document 1]
WO 96/26217 pamphlet
[Patent Document 2]
WO 97/23614 pamphlet
[Patent Document 3]
WO 00/24416 pamphlet
[Non-patent document 1]
Body (Jean-Jacques Body) "Cancer Supplements (CANCER Supplement), 2000, vol. 88, pp. 3054-3058
[Non-patent document 2]
E. Romas, et al., "Bone", 2002, Volume 30, p. 340-346
[Non-Patent Document 3]
Brunel Fautrel and Francis Guillemin, "Current Opinion in Rheumatology", 2002, Vol. 14, p. 121-126
[Non-patent document 4]
Mohammad M. Iqbal and Tanveer Sobhan, Missouri Medicine, 2002, Vol. 99, p. 19-23
[Non-Patent Document 5]
Joyce Penrose White and Judith S. Schilling, Clinical Excellence for Nurse Practitioners, 2000, Volume 4, p.277-285.
[Non-Patent Document 6]
Jonathan R. Green, et al., "Pharmacology and Toxicology", 1997, Vol. 80, p. 225-230
[Non-Patent Document 7]
S. L. Porcel, et al., "Allergologia et Immunopathologia", 2000, vol. 28, p. 243-245
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have conducted intensive studies to further improve the blood retention of OCIF, a substance useful as a prophylactic or therapeutic agent for bone metabolic disorders, and found that dextran sulfate, a derivative of OCIF and a polysaccharide, was treated under alkaline conditions. The blood retention of the complex of OCIF and dextran sulfate, a derivative of polysaccharide, obtained by the following treatment is significantly improved as compared with that of the conventionally known composition comprising OCIF and dextran sulfate. I found that.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1)
One or more substances (OCIF substances) selected from the group consisting of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF), analogs and variants thereof, and a group consisting of polysaccharides and derivatives thereof A preventive or therapeutic agent for bone metabolic disorders, comprising as an active ingredient a complex comprising one or more substances (polysaccharide substances)
(2)
The prophylactic or therapeutic agent according to (1), wherein the OCIF substance is a human mature OCIF monomer and / or dimer;
(3)
The prophylactic or therapeutic agent according to (2), wherein the mature human OCIF comprises amino acids +1 to 380 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(4)
Any one of (1) to (3), wherein the OCIF substance and the polysaccharide substance are bound at a molecular ratio of 1: 1 to 1:10, and the polysaccharide substance is dextran sulfate or a salt thereof. Prophylactic or therapeutic agent according to
(5)
The preventive or therapeutic agent according to (4), wherein the dextran sulfate has an average molecular weight of 1200 to 20,000.
(6)
The preventive or therapeutic agent according to (5), wherein dextran sulfate has an average molecular weight of 1800 to 6000.
(7)
Any one of (4) to (6), wherein the OCIF substance and the polysaccharide substance are bound at a molecular ratio of 1: 1 to 1: 8, and the polysaccharide substance is dextran sulfate or a salt thereof. Prophylactic or therapeutic agent according to
(8)
The preventive or therapeutic agent according to (7), wherein the OCIF substance and the polysaccharide substance are bound at a molecular ratio of 1: 1 to 1: 5, and the polysaccharide substance is dextran sulfate or a salt thereof.
(9)
The prophylactic or therapeutic agent according to any one of (1) to (8), wherein the heparin-adsorbing power is lower than that of a free OCIF substance not forming a complex with a polysaccharide substance.
(10)
The prophylactic or therapeutic agent according to (9), wherein the heparin adsorption force is measured by the following steps [a] to [f]:
[A] equilibrating a column packed with a carrier having immobilized heparin with a low ionic strength buffer containing 0.1 to 0.8 M sodium chloride;
[B] a step of adding a test sample dissolved in the buffer described in [a] to the column, and then collecting an eluted fraction A;
[C] washing the column with the buffer described in [a] and collecting the eluted fraction B; [d] washing the column with a high ionic strength buffer containing 1 to 2 M sodium chloride Recovering the eluted fraction C;
[E] The amount of the complex consisting of the OCIF substance and the polysaccharide substance (each referred to as (a), (b), (c)) present in the elution fractions A to C specifically binds to the OCIF substance Measuring by an enzyme immunoassay using an antibody;
[F] calculating a heparin adsorption force by the following formula;

(11)
The preventive or therapeutic agent according to (10), wherein the heparin adsorption force is 0.7 or less.
(12)
The prophylactic or therapeutic agent according to (11), wherein the heparin adsorption force is 0.6 or less,
(13)
(1) to (12), wherein an immunological detection rate obtained by dividing the following [x] by the following [y] is 0.5 to 1.2. The described prophylactic or therapeutic agent:
[X] the number of molecules of the OCIF substance contained in the test sample, which is measured using an OCIF substance as a standard substance by an enzyme immunoassay using an antibody that specifically binds to the OCIF substance;
[Y] (i) the molecule of the OCIF substance contained in the test sample, which is calculated based on the protein amount measured by the Lowry method using bovine serum albumin as a standard substance and (ii) the molecular weight of the OCIF substance number,
(14)
Enzyme immunoassay was performed using anti-human OCIF monoclonal antibody OI-19 produced by hybridoma OI-19 (FERM BP-6420) or anti-human OCIF monoclonal antibody OI-26 produced by hybridoma OI-26 (FERM BP-6421). ELISA using an anti-human OCIF monoclonal antibody OI-4 produced by hybridoma OI-4 (FERM BP-6419) as an antibody in a mobile phase enzyme-labeled with peroxidase (Enzyme-linked immunosorbent assay), the prophylactic or therapeutic agent according to (13),
(15)
The prophylactic or therapeutic agent according to (13) or (14), wherein the immunological detection rate is 0.6 to 1.1.
(16)
The preventive or therapeutic agent according to (15), wherein the immunological detection rate is 0.7 to 1.1.
(17)
One or more substances selected from the group consisting of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF), analogs and mutants thereof, comprising the following steps [i] to [iii] ( Bone metabolism disorder containing, as an active ingredient, a complex obtained by a method for preparing a complex comprising one or two or more substances (polysaccharide substances) selected from the group consisting of OCIF substances) and polysaccharides or derivatives thereof Preventive or therapeutic agent for sickness
[I] contacting the OCIF substance with the polysaccharide substance;
[Ii] a step of keeping the temperature under a condition of pH 9.5 to 12;
[Iii] a step of removing free polysaccharide substances,
(18)
The prophylactic or therapeutic agent according to (17), wherein the temperature is kept at pH 10 to 11 in step [ii].
(19)
In the step [iii], the prophylactic or therapeutic agent according to (17) or (18), wherein a free polysaccharide substance is removed by gel filtration; and
(20)
Bone metabolism disorders include primary osteoporosis, endocrine osteoporosis, Paget's disease, hypercalcemia due to solid tumors, multiple myeloma, idiopathic hypercalcemia, osteopenia due to steroid administration, renal dysfunction Osteopenia associated with the disease, surgery, osteopenia associated with digestive disorders, rheumatoid arthritis, osteopenia due to rheumatoid arthritis, bone and joint destruction due to rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, periodontal disease The prophylactic or therapeutic agent according to any one of (1) to (19), which is one selected from the group consisting of bone loss, bone metastasis of cancer, renal osteodystrophy and osteopenia.
About.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The OCIF of the present invention, an analog thereof or a mutant thereof is extracted as a protein from animal tissue, animal body fluid, animal cell culture, or the like by the method described in WO96 / 26217 or WO97 / 23614. Obtained as a purified natural form or as a genetically modified form produced by a host cell such as an animal cell or Escherichia coli transformed with a vector containing a polynucleotide encoding OCIF, an analog thereof or a mutant thereof. be able to.
[0011]
Although the origin of the OCIF of the present invention, its analogs and its mutants is not particularly limited, preferably, mammals such as humans, rats, mice, rabbits, dogs, cats, cows, pigs, sheep, goats and the like, chickens and geese And birds such as turkeys, and more preferably humans.
[0012]
The OCIF of the present invention and its analogs are produced as single-chain polypeptides, and the molecular weight by SDS-PAGE under non-reducing conditions is about 60,000 or about 120,000 (see WO96 / 26217). Preferably, it is a dimer having a molecular weight of about 120,000 by SDS-PAGE under non-reducing conditions.
[0013]
Furthermore, OCIF, its analogs or its variants in the present invention include both precursor polypeptides including a signal peptide and mature forms thereof. A preferred precursor OCIF containing a signal peptide is the human precursor OCIF consisting of the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, that is, amino acids -21 to 380. A preferred mature OCIF containing no signal peptide is a mature human OCIF consisting of amino acids 1 to 380 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Of these, human mature OCIF is more preferred.
[0014]
When the mature OCIF, its analog or its mutant is expressed as a recombinant protein in a host cell (in particular, a prokaryotic cell such as Escherichia coli), methionine is added to the amino terminus of such a mature product. (WO 97/23614). A mature OCIF, an analog thereof or a mutant thereof to which methionine is added is a triplet nucleotide comprising an ATG (AUG) sequence at the 5′-end of a polynucleotide encoding the mature OCIF, an analog thereof or a mutant thereof. Is inserted into an appropriate expression vector, and an appropriate host cell is transformed with the obtained recombinant expression vector, and purified and isolated from a culture of the transformed host cell according to a conventional method. it can. In addition, in the mature OCIF having an amino-terminal methionine, an analog thereof or a mutant thereof, one or more amino acids are inserted at a position adjacent to the methionine and closer to the carboxy-terminal side than the methionine. It may be.
[0015]
In the present invention, the OCIF analog is cloned from a cDNA library derived from animal cells, body fluids or tissues by hybridization under stringent conditions (60 to 70 ° C., 6 × SSC) using human OCIF cDNA as a probe. Examples of such OCIF analogs include OCIF2, OCIF3, OCIF4, and OCIF5 (all refer to WO96 / 26217), and OCIF derived from animals other than humans. it can. Such OCIF analogs may be extracted, purified and / or isolated from cultures of host cells transformed with an expression vector containing a cDNA encoding the OCIF analogs, according to methods well known to those skilled in the art. (See WO 96/26217). Preferred OCIF analogs in the present invention retain at least a portion of the biological activity of OCIF to the extent that it can be detected.
[0016]
In the present invention, the OCIF mutant means a protein in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted, and which retains at least a part of the OCIF activity to the extent that human OCIF can be detected. . Such an OCIF mutant can be obtained by adding PCR to a nucleotide encoding OCIF or an analog thereof by a PCR method, a gene recombination method, or a cleavage method using an exonuclease such as a restriction enzyme or an endonuclease. Alternatively, substitution, deletion, addition and / or insertion of two or more nucleotides is performed, and then an animal cell or a host cell such as Escherichia coli is transformed with the expression vector into which the obtained nucleotide variant has been inserted. It can be obtained by purifying from the expressed protein fraction according to a conventional method.
[0017]
In addition, a molecule in which a substantial portion is deleted from the carboxy terminus of the amino acid sequence of human OCIF and which retains the original biological activity of OCIF is also known for short-chain OCIF (WO96 / 26217 and WO97 / WO97 / 26217). No. 23614). The OCIF mutant of the present invention also includes a short-chain OCIF having at least a part of the OCIF activity.
[0018]
Furthermore, it is known that OCIF retains its activity also as a fusion protein with an immunoglobulin Fc domain or the like (see WO97 / 23614), and the OCIF mutant of the present invention includes such an OCIF mutant. Fusion proteins are also included (see WO 97/23614, WO 2001/17543 and WO 2001/18203).
[0019]
It is known that the biological activity of OCIF can be improved by subjecting it to chemical modification of water-soluble polymers (polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, polyvinyl alcohol) and the like. The OCIF variants of the invention also include such chemically modified OCIF. One or more sites on OCIF, its analogs or its variants may be chemically modified. Examples of the chemically modified OCIF or a variant thereof include OCIF bound to polyethylene glycol or a variant (derivative) thereof (see WO 97/23614).
[0020]
Such OCIF mutants of the present invention include OCIF-C19S, OCIF-C20S, OCIF-C21S, OCIF-C22S, OCIF-C23S, OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, and OCIF-D. DDD1, OCIF-DDD2, OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4, OCIF-CCR3, OCIF-CBst, OCIF-CSph, OCIF-CBsp, OCIF-CPst (above, WO96 / No. 26217), muOPG [22-401] -Fc, muOPG [22-194] -Fc, muOPG [22-185] -Fc, muOPG [22-180] -Fc, muOPG [22-401], muOP [22-401] C195, muOPG [22-401] C202, muOPG [22-401] C277, muOPG [22-401] C319, muOPG [22-401] C400, muOPG [22-185], muOPG [22-] 194], muOPG [22-200], muOPG [22-212], muOPG [22-293], muOPG [22-355], huOPG [22-401] -Fc, huOPG [22-201] -Fc, huOPG. [22-401] -Fc P26A, huOPG [22-401] -FcY28F, huOPG [22-401], huOPG [27-401] -Fc, huOPG [29-401] -Fc, huOPG [32-401]- Fc, MuOPG met [22-194], MuOP met [22-194] 5kPEG, MuOPG met [22-194] 20k PEG, HuOPG met [22-194] P25A, HuOPG met [22-194] P25A 5k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 20k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 31k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 57k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 12k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 20k branched PEG, huOPG met [22-194] ] P25A 8k PEG dimer, huOPG met [22-194] P25A disulfide bridge (refer to WO97 / 23614), OPG [22-194 -Fc, OPG [22-201] -Fc, OPG [22-194] -FcΔC, OPG [22-201] -FcΔC, OPG [22-194] -FcG₁₀, MetFcΔC-OPG [22-194] (see WO 2001/17543), OPG [22-194] -FcΔC, OPG [22-194] -FcG₁₀, FcΔC-OPG [22-194], metFcΔc-OPG [22-194], metFcΔC-22-194, OPG [22-194] -Fc, OPG [22-194] -FcΔc metOPG [22-194], metOPG [22-201], OPG [22-293], OPG [22-401], metFcΔc-22-194 (see WO 2001/18203) and the like, and preferably, OCIF-C19S, OCIF -C20S, OCIF-C21S, OCIF-C22S, OCIF-C23S, OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1, OCIF-DDD2, OCIF-CL, OCIF-CD, OCIF-CDD , OCIF-CDD1, CIF-CCR4, OCIF-CCR3, OCIF-CBst, OCIF-CSph, OCIF-CBsp, OCIF-CPst, muOPG [22-401] -Fc, muOPG [22-194] -Fc, muOPG [22-185] -Fc , MuOPG [22-180] -Fc, muOPG [22-401] C195, muOPG [22-401] C202, muOPG [22-401] C319, muOPG [22-401] C400, uOPG [22-194], muOPG [22-200], muOPG [22-212], muOPG [22-293], muOPG [22-355], huOPG [22-401] -Fc, huOPG [22-201] -Fc, huOPG [22-401] ] -Fc P26A, huOPG [22- 401] -Fc Y28F, huOPG [22-401], huOPG [27-401] -Fc, huOPG [29-401] -Fc, huOPG [32-401] -Fc, MuOPG met [22-194] 5k PEG, MuOPG met [22-194] 20k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 5k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 20k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 31k PEG, HuOPG met [22-194]. P25A 57k PEG, HuOPG met [22-194] P25A 12k PEG, HuOPG met [22-194] P25A20k Branched PEG, huOPG met [22-194] P25A 8k PEG dimer, h uOPG met [22-194] P25A disulfide bridge, OPG [22-194] -Fc, OPG [22-201] -Fc, OPG [22-194] -FcΔC, OPG [22-201] -FcΔC, OPG [22 -194] -FcG₁₀, MetFcΔC-OPG [22-194], OPG [22-194] -FcΔC, OPG [1-194] -FcG₁₀, FcΔC-OPG [22-194], metFcΔc-OPG [22-194], metFcΔC-22-194, OPG [22-194] -Fc, OPG [22-194] -FcΔc metOPG [22-194], metOPG [22-201], OPG [22-293], OPG [22-401], metFcΔc-22-194, and the like.
[0021]
The OCIF of the present invention, an analog thereof or a mutant thereof may be post-translationally modified, for example, may have a sugar chain added thereto. As the OCIF to which a sugar chain is added, its analog or its mutant, a recombinant OCIF produced by animal cells, its analog or its mutant, a natural OCIF isolated from animal tissue or the like, or its analog The body can be exemplified. Animal cells suitable for the production of recombinant OCIF to which a sugar chain has been added, analogs thereof, and mutants thereof include Chinese Hamster Ovary (hereinafter referred to as “CHO”), COS cells, and the like. Mammalian cells can be exemplified (Yasuda, H., et al., Endocrinology, 139, 1329-1337 (1998)). Incidentally, prokaryotic cells such as Escherichia coli and the like can be exemplified as cells suitable for production of recombinant OCIF having no sugar chain added thereto, analogs thereof, and mutants thereof.
[0022]
In the present invention, the polysaccharide is a polymer (glucan) generated by the monosaccharide being glycosidically bonded, and is preferably a heteropolysaccharide (heteroglycan) composed of two or more kinds of constituent monosaccharides. In the present invention, a polysaccharide derivative refers to a substance in which a part of the chemical structure of a polysaccharide is substituted with another molecule, and is preferably a polysaccharide ester, and more preferably a polysaccharide sulfate ester. Examples of natural polysaccharides include dextran and the like, and examples of natural polysaccharide derivatives include acidic polysaccharides such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, carrageenan, pectin, and heparin. Examples of the polysaccharide derivative of the type include acidic polysaccharides such as dextran sulfate (DS), and a more preferred polysaccharide derivative is dextran sulfate.
[0023]
In the present invention, the polysaccharide or a derivative thereof also includes a salt thereof. The most preferred salt of dextran sulfate is dextran sulfate sodium. Examples of dextran sulfate sodium include dextran sulfate sodium 5 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.), dextran sodium sulfate 5000, and dextran sodium sulfate 10000 (both manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). In the present invention, these dextran sulfate salts are also included in the meaning of dextran sulfate.
[0024]
The molecular weight of dextran sulfate is calculated as follows:
1) Measurement of molecular weight of dextran
From the intrinsic viscosity of dextran (the method of measuring the intrinsic viscosity can be calculated by the following Sato's formula from the 13th revision, Japanese Pharmacopoeia Manual, published by Hirokawa Shoten (1998), Dextran 40) ( 13th revision, Japanese Pharmacopoeia commentary book, published by Hirokawa Shoten (1998), Dextran 40).
Intrinsic viscosity = 9.00 × 10^-4× molecular weight^0.50
2) Measurement of sulfur content
The sulfur content on dextran sulfate was measured as a percentage by weight according to the method described in the Japanese Pharmacopoeia (14th revision, published by Jiho (2001), section on Sulfate Dextran Sulfate 5).
[0025]
The molecular weight of glucose, which is a constituent unit of dextran, is originally 180, but in a dextran molecule, since the glucose is α-1,6 bonded, the substantial molecular weight of glucose in the dextran molecule is 180 to 1 molecule of water. It is the value obtained by subtracting the molecular weight of the minute, that is, 162.
[0026]
In dextran sulfate, one hydrogen atom of glucose in the dextran molecule as described above is replaced with SO.₃Since it is substituted by Na (1 gram equivalent 103), the degree of substitution of sulfur (hereinafter, simply referred to as “degree of substitution”) is represented by the following equation.
Sulfur content (% by weight) = {32 x degree of substitution} (162 + 102 x degree of substitution) x 100
3) Calculation of molecular weight of dextran sulfate
As described above, since the substantial molecular weight of glucose which is a constituent unit of dextran is 162, the molecular weight of dextran sulfate can be calculated by the following equation.
Molecular weight = molecular weight of dextran × (162 + 102 × degree of substitution) ÷ 162
It is known that dextran sulfate has a certain molecular weight distribution, and in the present invention, the average molecular weight of dextran sulfate is substituted for the molecular weight.
[0027]
The sulfur substitution degree (mean ± standard deviation) of dextran sulfate sodium sulfur 5 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) preferably used in the present invention, calculated according to the above 2) is about 0.32 ± 0.01. (N = 7), and the molecular weight (mean ± standard deviation) calculated according to the above 1) to 3) is about 1950 ± 70 (n = 7). Dextran sodium sulfate 5000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is also a suitable dextran sulfate, has a molecular weight of about 5,000, and sodium dextran sulfate 10,000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) also has a molecular weight of about 10,000.
[0028]
The average molecular weight of the polysaccharide substance used in the present invention is not particularly limited, but the average molecular weight of dextran sulfate, which is a suitable polysaccharide substance, is usually in the range of 1500 to 12000, more preferably 1800 to 12,000. 6000.
[0029]
The polysaccharide substance of the present invention may be used as it is, or may be purified and fractionated.
[0030]
In the present invention, the polysaccharide substance does not include various sugar chains that are endogenously added to the OCIF substance as post-translational modifications in cells or in vivo.
[0031]
The molecular ratio of the OCIF substance and the polysaccharide substance in the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance provided by the present invention depends on the type of the OCIF substance or the polysaccharide substance, conditions for preparing the complex, and the like. There is no particular limitation. The molecular ratio of the OCIF substance to the dextran sulfate in the complex comprising the OCIF substance and dextran sulfate which is a preferred embodiment of the present invention is usually from 1: 1 to 1:10 for the OCIF substance: polysaccharide substance of the present invention; It is preferably from 1: 1 to 1: 8, more preferably from 1: 1 to 1: 5, and even more preferably from 1: 1.1 to 1: 4.5.
[0032]
As described above, OCIF is known to form a dimer (see WO 96/26217), and the OCIF substance may be a homo- or hetero-dimer, or a homo- or hetero-dimer comprising three or more monomers. Although it may be a multimer (see US Pat. No. 6,369,027), the molecular ratio in the present invention is calculated as the number of molecules of the polysaccharide substance per one molecule of the OCIF substance monomer.
[0033]
The number of molecules of the polysaccharide substance bound to the OCIF substance in the complex of the present invention can be preferably calculated as follows. That is, neutral sugar in a test sample or neutral sugar in a control sample containing an uncomplexed OCIF substance is measured by the phenol-sulfuric acid method (described in detail elsewhere in the present invention). Next, the amount of polysaccharide substance bound to the OCIF substance in the test sample is calculated by subtracting the amount of neutral sugar in the control sample from the amount of neutral sugar in the test sample. The obtained numerical value is used for the following [i] or [ii].
[I] By dividing the obtained numerical value by the average molecular weight of the polysaccharide substance, the (total) number of molecules of the polysaccharide substance bound to the OCIF substance in the test sample is calculated.
[Ii] The obtained numerical value is divided by the amount of protein (mg) in the complex, and the obtained numerical value (ie, the amount of the polysaccharide substance per 1 mg of the OCIF substance) is used to calculate the molecular weight of the OCIF substance and the average of the polysaccharide substance. The number of molecules of the polysaccharide substance per one molecule of the OCIF substance is calculated based on the molecular weight.
[0034]
The number of molecules of the OCIF substance present in the complex of the present invention is preferably determined by an immunological assay (enzyme immunoassay, ELISA, or the like) using a free uncomplexed OCIF substance as a standard substance. Can be determined (detailed elsewhere in the present invention).
[0035]
In the present invention, “number of molecules” means “number of molecules” or “mole number”.
[0036]
The complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance of the present invention can be obtained by, for example, keeping the OCIF substance and the polysaccharide substance in an aqueous solution. When both are incubated in an aqueous solution, the concentration range of OCIF, its analogs and its mutants in the aqueous solution is such that the upper limit is 0.1 to 0.5 mM and the lower limit is 0.001 to 0.05 mM. Is 0.01 to 0.2 mM, more preferably 0.05 to 0.1 mM. In the case of OCIF, the upper limit of the concentration range of the aqueous solution is 10 to 50 mg / ml, the lower limit is 0.1 to 5 mg / ml, the preferred range is 1 to 20 mg / ml, and the more preferred range is 5 to 10 mg / ml. is there.
[0037]
The concentration range of the polysaccharide or its derivative in the aqueous solution has an upper limit of 0.1 to 0.5 M and a lower limit of 0.00005 to 0.05 M, preferably 0.005 to 0.25 M, more preferably 0.05 to 0.1M. In the case of dextran sodium sulfate 5 (DS5), the concentration range in the aqueous solution has an upper limit of 200 mg / ml to 1000 mg / ml, a lower limit of 0.1 to 100 mg / ml, and a preferred range is 10 to 500 mg / ml. The preferred range is 100 to 200 mg / ml.
[0038]
The upper limit of the pH of the aqueous solution is pH 11 to 12, the lower limit is pH 9.5 to 10, and the preferable range is pH 10 to 11. The temperature at which the aqueous solution is kept warm has an upper limit of 10 to 50 ° C and a lower limit of 0 to 4 ° C, a preferable range is 4 to 37 ° C, and a more preferable range is 4 to 10 ° C.
[0039]
The complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance according to the present invention is characterized in that the OCIF substance and the polysaccharide substance form a chemical bond such as a covalent bond (for example, formation of a Schiff base), an ionic bond, a coordination bond, and / or a hydrophobic bond. Non-chemical bonds such as interaction, hydrogen bond, electrostatic interaction, and affinity bond.
[0040]
The conjugate does not contain free polysaccharide material.
[0041]
The method for removing the free polysaccharide or a derivative thereof is not particularly limited as long as it is a means generally applied to the operations of purification, isolation and fractionation. Examples thereof include ion exchange chromatography and adsorption chromatography. Chromatography, partition chromatography, gel filtration (molecular sieve) chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, crystallization, salting out, ultrafiltration, etc., and preferably gel filtration chromatography (hereinafter simply referred to as "Gel filtration"), ultrafiltration and the like.
[0042]
Various conditions such as a column and a mobile phase in the gel filtration are not particularly limited as long as a free polysaccharide substance can be separated from a fraction containing an OCIF substance. It can be appropriately selected in consideration of the molecular weight and type of the substance, the molecular weight of the complex, and the like.
[0043]
Further, the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance of the present invention can be distinguished from the OCIF substance as a raw material by measuring the isoelectric point, measuring the sugar content, quantifying with an antibody, and the like.
[0044]
The isoelectric point can be measured by isoelectric focusing according to a conventional method. OCIF is a basic protein, and its isoelectric point is observed around pH 9. However, when a polysaccharide substance such as dextran sulfate binds, the isoelectric point is lowered. Therefore, a complex composed of the OCIF substance, the OCIF substance, and the polysaccharide substance is formed. It is possible to distinguish.
[0045]
The sugar content can be suitably measured by using a neutral sugar quantitative method by the phenol sulfate method. Since the sugar content of the OCIF to which the polysaccharide substance is bound increases compared to the sugar content of the original OCIF, it is possible to distinguish the OCIF substance from the complex composed of the OCIF substance and the polysaccharide substance.
[0046]
By measuring the amount of the polysaccharide substance contained in the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance using the antibody that specifically binds to the polysaccharide substance of the present invention, the complex comprising the OCIF substance and the OCIF substance and the polysaccharide substance is measured. The body can be distinguished.
[0047]
The OCIF substance and the complex composed of the OCIF substance and the polysaccharide substance can be measured as a protein amount by a conventionally known protein measurement method. Such protein measurement methods include the Lowry method (Lowry, OH, et al., Protein Measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 143, p265-275 (1951)), silver staining method, ultraviolet absorption (Λ280 nm) measurement method, BCA method, etc., and preferably the Lowry method.
[0048]
Further, the OCIF substance and the complex composed of the OCIF substance and the polysaccharide substance can be detected or measured by various immunological assays using an antibody that specifically binds to the OCIF substance. Anti-human OCIF monoclonal antibodies suitable for immunological assays include antibody OI-19 produced by hybridoma OI-19 (FERM BP-6420) and antibody OI- produced by hybridoma OI-4 (FERM BP-6419). 4, antibodies OI-26 produced by hybridoma OI-26 (FERM BP-6421) and the like can be exemplified (see WO 99/15691). The antibody produced by hybridoma OI-19 or OI-4 binds to OCIF monomer (monomer) and dimer (homodimer), and the antibody produced by hybridoma OI-26 is specific to OCIF dimer (homodimer). To join. Using such an antibody, an immunological assay can be performed by a method well known to those skilled in the art (see WO 99/15691). Examples of the immunological assay include an enzyme immunoassay (enzyme immunoassay: hereinafter, referred to as “EIA”), a radioimmunoassay (radio imunoassay), an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), and a sandwich EIA. And preferably ELISA. In the preferred ELISA of the present invention, the antibody OI-19 or the antibody OI-26 is used as an immobilized antibody, and the antibody OI-4 is used as an antibody in an enzyme-labeled mobile phase. A preferred enzyme used for enzyme labeling in the present invention is peroxidase (hereinafter referred to as “POD”).
[0049]
The hybridoma OI-4 that produces the antibody OI-4 was purchased on October 16, 1997 by 1-1-3 Higashi-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan. Currently, it has been domestically deposited as OI-4 with 1-1-1 Higashi-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, under the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), and given accession number FERM P-16473. Later, it was transferred to the International Depositary on July 13, 1998, and given the accession number FERM BP-6419.
[0050]
Hybridoma OI-19, which produces antibody OI-19, was established on October 16, 1997, at 1-1-3 Higashi-cho, Tsukuba, Ibaraki, Japan, by the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, After the domestic deposit as OI-19 to 1-1-1 Higashi-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), and the accession number FERM P-16474, Transferred to the International Depositary on July 13, 1998, and assigned the accession number FERM BP-6420.
[0051]
Hybridoma OI-26, which produces antibody OI-26, was established on October 16, 1997 at 1-1-3 Higashi-cho, Tsukuba, Ibaraki, Japan by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of Japan (currently, After 1-1-1 Higashicho, Tsukuba, Ibaraki, Japan, it was deposited domestically as OI-26 with the 6th Independent Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), and given a deposit number FERM P-16475. Transferred to the International Depositary on July 13, 1998, and assigned the accession number FERM BP-6421.
[0052]
Further, the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance of the present invention can be further characterized based on heparin affinity.
[0053]
Heparin is a N-sulfate, N-acetyl and O-sulfate substitution product of a polysaccharide composed of D-glucosamine, D-glucuronic acid and L-iduronic acid, and contains most sulfate groups among mucopolysaccharides. Heparin is not particularly limited as long as it is derived from humans or mammals other than humans, but is preferably heparin derived from porcine intestinal mucosa. For the measurement of affinity for heparin, a carrier on which heparin is immobilized can be used, and agarose gel beads on which heparin derived from porcine intestinal mucosa is immobilized can be suitably used as such a carrier. A column packed with such a carrier is more suitable for measurement of affinity for heparin, and most preferably, HiTrap Heparin HP Column, HiPrep 16/10 Heparin, Heparin Sepharose (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). The column is packed with agarose gel beads on which heparin derived from porcine intestinal mucosa is immobilized at a density of about 2 to 10 mg / ml gel. Further, the column is stable to a buffer usually used at pH 5 to 10, and the protein adsorbed on the column is continuously or stepwise up to 1.5 to 2 M using sodium chloride, potassium chloride or ammonium sulfate. (Hakansson, S., et al., Protein Sci., 10, 2138-2139, (2001): Tan, M., et al., Carcinogenesis, 22, 295-300, ( 2001): Peterson, CB, at al., J. Biol. Chem., 260, 610-615, (1985): Garke, G., et al., J. Chromatogr. B, 737, 25-38, ( 2000)).
[0054]
The heparin affinity of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance can be measured by a conventionally known method for measuring the affinity of a protein for a sugar or a derivative thereof, but preferably under mild or harsh conditions. The amount of the complex bound to or not bound to heparin or the carrier on which heparin has been immobilized can be measured and compared. Mild conditions are not particularly limited as long as they are generally interpreted as mild in protein column chromatography, and include, for example, conditions with relatively low ionic strength. The harsh conditions are not particularly limited as long as they are conditions that are usually interpreted as harsh in column chromatography of proteins, and include, for example, conditions with relatively high ionic strength. The ionic strength is adjusted with a strong acid salt, preferably with sodium chloride.
[0055]
When a column packed with a carrier having heparin immobilized thereon is used, for example, the column is equilibrated with a buffer having a relatively low ionic strength in advance, and then the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance is ionized. After dissolving in a buffer having a relatively low strength and adding to the column, the non-adsorbed fraction (fraction A) is recovered. Next, a buffer having a relatively low ionic strength is added to the column to collect an eluted fraction (fraction B). Next, a buffer having a relatively high ionic strength is added to the column, and the eluted fraction (fraction C) can be collected. In the present invention, the amounts of the complex consisting of the OCIF substance and the polysaccharide substance contained in the fractions A, B and C are measured respectively, and then the three values ((a), (b) and (c), respectively) are measured. ) Is obtained by dividing (c) by the sum of the values obtained by adding heparin. For example, heparin adsorption power can be suitably calculated by the following steps:
[A] equilibrating a column filled with a carrier having immobilized heparin with a low ionic strength buffer containing 0.1 to 0.8 M sodium chloride;
[B] a step of adding a test sample dissolved in the buffer described in [a] to the column, and then collecting an eluted fraction A;
[C] washing the column with the buffer described in [a] and collecting the eluted fraction B; [d] washing the column with a high ionic strength buffer containing 1 to 2 M sodium chloride Recovering the eluted fraction C;
[E] The amount of the complex consisting of the OCIF substance and the polysaccharide substance (each referred to as (a), (b), (c)) present in the elution fractions A to C specifically binds to the OCIF substance Measuring by an enzyme immunoassay (EIA) using an antibody;
[F] A step of calculating heparin adsorption power by the following equation.

The method for measuring the amount of the complex in the step [e] is not particularly limited as long as it is an EIA using an antibody that specifically binds to the OCIF substance. For example, hybridoma OI-19 (FERM BP-6420) -Human OCIF monoclonal antibody OI-19 (FERM BP-6421) or anti-human OCIF monoclonal antibody OI-26 produced by Hybridoma O.I. BP-6419) can be exemplified as an ELISA in which the anti-human OCIF monoclonal antibody OI-4 produced by peroxidase is used as an antibody in a mobile phase that is enzyme-labeled with peroxidase. The ELISA is suitable when the OCIF substance is OCIF, and in some cases, when the OCIF substance is a mature human OCIF (ie, a polypeptide consisting of amino acid Nos. +1 to 380 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). It is suitable.
[0056]
The heparin-adsorbing power of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance measured by such a method, particularly preferably ELISA, is usually 0.7 or less, preferably 0.6 or less, more preferably 0.5 or less. It should be noted that the heparin adsorption force can vary depending on the type of the carrier on which heparin is immobilized and the measurement conditions.
[0057]
The complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance provided by the present invention can be further characterized based on the immunological detection rate measured using an antibody that specifically binds to the OCIF substance. In the present invention, the immunological detection rate refers to an immunological detection rate in a test material, which is measured by an enzyme immunoassay (enzyme immunoassay: EIA) using an antibody that specifically binds to an OCIF substance, using the OCIF substance as a standard substance. Is calculated based on (i) the amount of protein measured by the Lowry method using bovine serum albumin as a standard substance, and (ii) the molecular weight of the OCIF substance. , The numerical value (X ÷ Y) obtained by dividing by the number of molecules (Y) of the OCIF substance contained in the test sample.
[0058]
The method for measuring the amount of protein and calculating the number of molecules of the OCIF substance based on the protein amount is not particularly limited, and can be suitably performed, for example, through the following steps [1] to [4] based on the Lowry method:
[1] a step of preparing a calibration curve using bovine serum albumin at a concentration of 20 to 60 μg / ml as a standard substance;
[2] a step of measuring the protein concentration of the test sample diluted to a protein concentration of 20 to 60 μg / ml;
[3] From the protein concentration measured in the step [2] and the calibration curve prepared in the step [1], determine the protein amount of the complex composed of the OCIF substance and the polysaccharide substance contained in the test sample. Calculating;
[4] a step of calculating the number of molecules of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance contained in the test sample from the protein amount calculated in the step [3] and the molecular weight of the OCIF substance.
[0059]
The enzyme immunoassay applied to the measurement of the immunological detection rate is not particularly limited. For example, an anti-human OCIF monoclonal antibody OI-19 or hybridoma OI-26 produced by hybridoma OI-19 (FERM BP-6420) is used. As an antibody on which the anti-human OCIF monoclonal antibody OI-26 produced by FERM BP-6421) has been immobilized, anti-human OCIF monoclonal antibody OI-4 produced by hybridoma OI-4 (FERM BP-6419) has been purified. An ELISA (enxyme-linked immunosorbent assay) used as an antibody in a mobile phase enzyme-labeled with oxidase can be suitably performed through the following steps [1] to [3]:
[1] measuring a calibration curve using a known concentration of the isolated OCIF substance;
[2] a step of subjecting the test sample to the ELISA;
[3] a step of calculating the protein amount of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance contained in the test sample from the measured value in the step [2] and the calibration curve prepared in the step [1];
[4] a step of calculating the number of molecules of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance contained in the test sample from the protein amount calculated in the step [3] and the molecular weight of the OCIF substance.
[0060]
The immunological detection rate can also be calculated by dividing the amount of protein calculated in step [3] of the ELISA by the amount of protein calculated in step [3] based on the Lowry method. (See Example 7).
[0061]
The ELISA is more preferable when the OCIF substance is OCIF, and more preferably when OCIF is a mature human OCIF (that is, a polypeptide consisting of amino acid numbers +1 to 380 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). More preferred.
[0062]
The immunological detection rate of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance thus calculated is usually 0.5 to 1.2, preferably 0.6 to 1.1 or more. Preferably it is 0.7 to 1.1 or more. The immunological detection rate can vary depending on the method of measuring the amount of protein, the type of EIA, the monoclonal antibody applied to EIA, and the like.
[0063]
In the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance of the present invention, the binding between the OCIF substance and the polysaccharide substance is stable. For example, the complex fraction (I) obtained by gel filtration once is subjected to gel filtration again. Then, the complex-containing fraction (II) is recovered, and then the stability can be confirmed by measuring the protein content and the sugar content of the fraction (I) or (II). Fraction (I) or (II) can be concentrated using an ultrafiltration membrane or the like, if necessary. The fraction (II) can be subjected to another gel filtration to obtain the complex fraction (III), and the binding stability can be similarly confirmed. The preferred method for measuring the protein content is the Lowry method, and the preferred method for measuring the sugar content is the phenol-sulfuric acid method.
[0064]
Furthermore, the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance of the present invention is excellent in blood retention. The blood retention of the complexes can be confirmed by increasing or decreasing their blood or serum concentrations. The concentration of the complex in blood or serum can be determined, for example, by administering the complex into the blood vessel of a human or non-human animal, and after a certain period of time, collecting blood or serum from the animal, and then, as described above, It can be measured by an enzyme immunoassay (ELISA or the like) using an antibody that specifically binds to the OCIF substance.
[0065]
The complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance provided by the present invention is a disease to which OCIF can be applied (see WO96 / 26217, WO97 / 23614, etc.), that is, a disease group generally referred to as bone metabolism disorder. It is effective for prevention or treatment.
[0066]
In the present invention, bone metabolism disorder is any disease characterized by substantial bone loss, and suppresses bone resorption or bone resorption rate to treat or prevent bone metabolism disorder. There is a need. Such abnormal bone metabolism of the present invention includes primary osteoporosis (senile osteoporosis, postmenopausal osteoporosis and idiopathic juvenile osteoporosis), endocrine osteoporosis (hyperthyroidism, hyperparathyroidism, Cushing's syndrome and terminal disease) Hypertrophy), osteoporosis with hypogonadism (hypopituitarism, Klinefilter syndrome and Turner syndrome), hereditary and congenital forms of osteoporosis (osteodysplasia, homocystinuria, menkes disease and Riley-Day syndrome), Osteopenia due to gravity load reduction or limb fixation or immobilization, Paget's disease, osteomyelitis, infectious lesions due to bone loss, hypercalcemia due to solid tumors (breast cancer, lung cancer, kidney cancer, prostate cancer, etc.) Hematological malignancies (multiple myeloma, lymphoma and leukemia), idiopathic hypercalcemia, hyperthyroidism or renal machinery Hypercalcemia due to insufficiency, osteopenia due to steroid administration, osteopenia due to administration of other drugs (immunosuppressants such as methotrexate and cyclosporin A, heparin and antiepileptic drugs), and renal dysfunction Osteopenia, surgery, osteopenia associated with digestive disorders (small bowel disorder, large bowel disorder, chronic hepatitis, gastrectomy, primary biliary cirrhosis and cirrhosis), osteopenia due to various rheumatism such as rheumatoid arthritis, chronic Bone destruction and joint destruction by various rheumatisms such as rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, periodontal bone loss, bone metastasis of cancer (osteolytic metastasis), traumatic injury, Goshe disease, sickle cell anemia Osteonecrosis or bone cell death associated with systemic lupus erythematosus or non-traumatic injury, osteodystrophy such as renal osteodystrophy, hypoalkaline phosphatase, bone associated with diabetes Small diseases, osteopenia accompanying nutritional disorder or eating disorders, other osteopenia, and the like. The bone metabolism disorder in the present invention also includes cachexia due to the solid tumor, bone metastasis of cancer (osteolytic metastasis) or hematological malignancy (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-178200).
[0067]
The pharmaceutical composition containing the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance provided by the present invention as an active ingredient can be safely orally or parenterally administered to a human or a non-human animal. The dosage form as a medicament can be appropriately selected according to the type of disease, degree of disease, symptoms, age, sex, body weight, and the like. For example, tablets, capsules, powders, granules, syrups are orally administered, injections are administered alone or mixed with a normal replenisher such as glucose, amino acids, or intravenously, or intramuscularly alone, It is administered subcutaneously, intradermally, or intraperitoneally, patches are transdermally administered, nasal drops are intranasally administered, mucosal application is transmucosal or oral administration, and suppositories are rectal. . These preparations can be prepared according to the usual methods, such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, coloring agents, pH buffers, preservatives, gelling agents, It can be formulated using known auxiliary agents usually used in the field of pharmaceutical preparations such as an active agent and a coating agent.
[0068]
For molding into a tablet form, a wide variety of carriers known in the art can be used. Such carriers include, for example, excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, etc .; water, ethanol, propanol, simple syrup, dextrose, Binders such as starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone; dried starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters Disintegrators such as sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose, disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil; absorption promoters such as quaternary ammonium bases and sodium lauryl sulfate; Lees Humectants like; may be mentioned purification talc, stearates, boric acid powder, a lubricant such as polyethylene glycol; starch, lactose, kaolin, bentonite, adsorbent such as colloidal silicic acid. The tablet can be a tablet coated with a usual coating as necessary, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, a multilayer tablet, and the like.
[0069]
For molding into a pill form, a wide variety of carriers known in the art can be used. Such carriers include, for example, excipients such as glucose, lactose, cocoa butter, starch, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc; binders such as gum arabic, powdered tragacanth, gelatin, ethanol; disintegration such as laminaran agar Agents and the like.
[0070]
For molding into a suppository, a wide variety of carriers known in the art can be used. Examples of such carriers include polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, esters of higher alcohols, gelatin, and semi-synthetic glycerides.
[0071]
When prepared as an injection, the solutions and suspensions are preferably sterile and isotonic with blood. For forming into these solutions, emulsions and suspensions, those known in the art can be widely used as diluents, for example, water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol. And polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. In this case, a sufficient amount of salt, glucose, glycerin and the like to keep isotonicity with blood may be included in the pharmaceutical preparation, and a usual solubilizing agent, a buffer, a soothing agent, You may add a pH adjuster, a stabilizer, a solubilizing agent, etc. The injection may be a lyophilized product.
[0072]
Further, a coloring agent, a preservative, a flavor, a flavoring agent, a sweetening agent, other medicines and the like may be added as necessary.
[0073]
The amount of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but is usually 0.1 to 70% by weight, and preferably 1 to 70% by weight. 30% by weight.
[0074]
Such a pharmaceutical composition of the present invention can be suitably used as an agent for preventing or treating bone metabolism disorders. In addition, the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance provided by the present invention can be used for producing a pharmaceutical composition for preventing or treating such a bone metabolism disorder.
[0075]
The dose of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance provided by the present invention depends on symptoms, age, body weight, dosage form, dosage form, and the like. To 1000 mg, with a lower limit of 0.001 to 0.03 mg, and a preferred range is 0.03 to 30 mg. The upper limit of the daily dose is 1 to 20 mg / kg, the lower limit is 0.01 to 0.5 μg / kg, and the preferable range is 0.5 μg / kg to 1 mg / kg.
[0076]
The number of administrations of the complex comprising the OCIF substance and the polysaccharide substance provided by the present invention is once every several days, once a day, or several times a day, depending on the administration form, dosage form and the like.
[0077]
The present invention relates to a bone metabolic disorder characterized in that the complex provided by the present invention is administered to a human or a non-human animal by the administration route, administration form, dose and / or administration frequency as described above. The present invention also provides a method for preventing or treating the disease.
[0078]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited thereto.
Embodiment 1 FIG. Preparation of complex consisting of OCIF and dextran sulfate (I)
1a) Preparation of OCIF
Human recombinant OCIF (dimer) was obtained according to the examples in WO96 / 26217.
[0079]
That is, first, transformed Escherichia coli pBK / 01F10 obtained in Example 11 of WO96 / 26217 (1st east of Tsukuba, Ibaraki, Japan, Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan) FERM BP-5267 was deposited internationally with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) and a plasmid vector pBKOCIF containing the coding sequence of human OCIF containing a signal peptide was obtained. Then, according to the method described in Example 14 of WO96 / 26217, pBKOCIF was digested with restriction enzymes Sal1 and EcoR5, and then a fragment encoding OCIF was recovered and purified, and then blunt-ended. The obtained fragment was inserted into an expression vector pcDL-SRα296 (Molecular and Cellular Biology, 8, p466-472 (1998)) which had been blunt-ended in advance, and Escherichia coli strain DH5α (GIBCO BRL) was transformed with the obtained recombinant expression vector. After transformation, a desired transformant pSRαOCIF was obtained.
[0080]
CHO dehydrofolate reductase (hereinafter, referred to as “dhfr”)-deficient strain (hereinafter, referred to as “CHOdhfr-”) was purified by electroporation using the pSRαOCIF and pBAdDSV (dhfr expression vectors: WO92 / 01053). Co-transfection), and then a dhfr-expressing strain was selected. Furthermore, as a result of selecting a strain that highly expresses OCIF, a clone highly producing OCIF was obtained. The clone is cultured, and after adding CHAPS to a concentration of 0.1%, the mixture is filtered and filtered with heparin-Sepharose FF column (manufactured by Pharmacia Biotech), followed by chromatography on blue 5PW column (manufactured by Toso Corporation). Was served. The fraction containing the desired human OCIF was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, only bands having a molecular weight of about 60,000 and a molecular weight of about 120,000 were detected under non-reducing conditions (see Examples in WO96 / 26217). 14).
[0081]
To 100 μg of the obtained human OCIF, 1/100 volume of 25% trifluoroacetic acid (hereinafter referred to as “TFA”) was added, and then the reverse phase was equilibrated with 30% acetonitrile containing 0.1% TFA. The column was added to PROTEIN-RP (2.0 mm in diameter × 250 mm in length: manufactured by YMC Corporation), and a linear concentration gradient of 30% to 55% of acetonitrile was prepared over 50 minutes, and 0.1 ml / min. Elution was performed at a flow rate, and two peak fractions were separately collected. The fraction in which only a band having a molecular weight of about 120,000 was detected in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions was used as a recombinant human OCIF (dimer) fraction in the following Examples. (See Examples 17 and 18 of WO96 / 26217).
1b) Preparation of a complex consisting of OCIF and dextran sulfate
The recombinant human OCIF (dimer) obtained in 1a) was added to a 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M sodium chloride at 1.5, 2, 5, 6.5. , 10, 12.5, 20 or 50 mg / ml. Dextran sodium sulfate 5 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd .; hereinafter, referred to as “DS5”) was added to this aqueous solution at a final concentration of 40, 100, 130, 150, 200, 400, 500, 510, or 1000 mg / ml. And adjusted to pH 10, 10.5 or 11 by adding sodium hydroxide. The resulting aqueous solution was kept at 4, 7, 25 or 37 ° C. for 1, 3, 6, 18, 24, 48, 72, 96, 144, 168 or 288 hours.
[0082]
200 pg of gel filtration column Superdex (column inner diameter 16 mm x length 60 cm: exclusion limit molecular weight 1.3 million: Amersham Pharmacia) 4 ml of the aqueous solution after incubation was pre-equilibrated with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6) containing 0.3 M sodium chloride. Biotech) and eluted with the buffer at a flow rate of 2 ml / min. The absorption at λ 280 nm was monitored using an ultraviolet spectrophotometer, and an eluate having a retention time of about 28 to 36 minutes was collected. Free DS5 not bound to recombinant human OCIF (dimer) eluted at a retention time of about 50-70 minutes. The gel filtration was performed at room temperature.
[0083]
The obtained fraction containing the complex of recombinant human OCIF (dimer) and DS5 (hereinafter, referred to as “complex of OCIF and DS5”) was frozen and stored at −60 ° C.
[0084]
In addition, the reaction conditions of each formulation described in this example are summarized in Table 1 below.
[0085]
[Table 1]

1c) Preparation of native human OCIF
According to the methods described in Examples 1 to 4 of WO96 / 26217, natural (non-recombinant) human OCIF can be obtained from human fetal lung fibroblast IMR-90 (ATCC-CCL186). Further, natural human OCIF (dimer) can be obtained by the reverse phase column chromatography described in 1a).
Embodiment 2. FIG. Preparation of complex consisting of OCIF and dextran sulfate (II)
The recombinant human OCIF (dimer) obtained in Example 1a) was dissolved at a concentration of 5 mg / ml in a 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M sodium chloride. . In this aqueous solution, sodium dextran sulfate having a molecular weight of 5,000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; hereinafter, referred to as “DS5000”) is dissolved to a final concentration of 150 mg / ml, and sodium hydroxide is added to adjust the pH to 10. Adjusted to 5. The resulting aqueous solution was kept at 4 ° C. for 24 hours.
[0086]
200 pg of gel filtration column Superdex (column inner diameter 16 mm x length 60 cm: exclusion limit molecular weight 1.3 million: Amersham Pharmacia) 4 ml of the aqueous solution after incubation was pre-equilibrated with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6) containing 0.3 M sodium chloride. Biotech) and eluted with the buffer at a flow rate of 2 ml / min. The absorption at λ280 nm was monitored using an ultraviolet spectrophotometer, and the eluate having a retention time of about 28 to 36 minutes was collected. Free DS5000 not bound to recombinant human OCIF (dimer) eluted at a retention time of about 40-65 minutes. The gel filtration was performed at room temperature.
[0087]
The obtained fraction containing the complex of recombinant human OCIF (dimer) and DS5000 (hereinafter referred to as “OCIF / DS5000 complex”) was frozen and stored at −60 ° C.
[0088]
The reaction conditions of the formulation described in this example are summarized in Table 2 below.
[0089]
[Table 2]

Reference Example 1. Preparation of a composition consisting of OCIF and sodium dextran sulfate
The recombinant human OCIF (dimer) obtained in Example 1 was added to a 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M concentration of sodium chloride and 0.01% polysorbate 80. It was dissolved to a concentration of 0.25 mg / ml. In this aqueous solution, the final concentration was DS5000 described in Example 2 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or DS10000, a dextran sodium sulfate having a molecular weight of 10,000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; hereinafter, referred to as “DS10000”). It was dissolved to 1 or 4 mg / ml and adjusted to pH 7 by adding sodium hydroxide. The resulting aqueous solution was kept at 4 ° C. for 24 hours.
[0090]
The composition comprising the obtained recombinant human OCIF (dimer) and DS5000 or DS10000 was immediately subjected to Test Example 1 below.
In addition, the reaction conditions of each reference formulation described in this Reference Example are summarized in Table 3 below.
[0091]
[Table 3]

Embodiment 3 FIG. Measurement of isoelectric point
The recombinant human OCIF (dimer) obtained in Example 1 and the complex (formulation 22) comprising OCIF and DS5 obtained in Example 1 were combined with an isoelectric focusing gel IEF PAGE mini (pH Range 3 to 10: added to Iwaki Glass Co., Ltd.), and electrophoresed by applying the following voltage using IEF pH3-7 buffer kit (manufactured by Technical Frontier Co.) as a buffer for electrophoresis: 100 V For 1 hour, then at 200V for 1 hour, then at 500V for 30 minutes. After completion of the electrophoresis, the gel was stained with Coomassie blue.
[0092]
As a result, the isoelectric point of OCIF was about pI9, while the isoelectric point of the complex consisting of OCIF and DS5 (Formulation 22) was about pI6.5.
Embodiment 4. FIG. Calculation of the molecular ratio of OCIF and dextran sulfate in a complex consisting of OCIF and dextran sulfate
The anti-human OCIF monoclonal antibody used in this example was prepared by the method described in WO99 / 15691. That is, after immunizing Balb / c mice with the purified monomeric and homodimeric OCIF as antigens, spleen cells isolated from spleens dissected and excised from the mice were fused with mouse myeloma cells P3x63-AG8.653. Was. Among the obtained hybridomas, those producing an anti-human OCIF antibody were selected by enzyme immunoassay on which OCIF was immobilized. Furthermore, a stable antibody-producing hybridoma was established by repeating cloning by the ultradilution method 3 to 5 times. Each of these antibody-producing hybridomas was cultured and transplanted intraperitoneally into Balb / c mice. Two weeks later, the accumulated ascites is collected and purified by chromatography using a protein A column (Pharmacia) to obtain an OI-19 antibody or an OI-4 antibody which recognizes monomeric OCIF and homodimer OCIF equally. An OI-26 antibody specifically recognizing only the homodimeric OCIF was obtained and used in the following experiments.
1) Preparation of stock solution of anti-human OCIF monoclonal antibody OI-4 labeled with peroxidase
Enzyme labeling of the antibody was performed using EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit (Pierce) according to the protocol II of the kit.
[0093]
An anti-human OCIF monoclonal antibody OI-4 (produced by hybridoma OI-4 (FERM BP-6419)) purified according to the method described in WO 99/15691 was treated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.6). N-succinimidyl S-acetylthioacetate attached to the above-mentioned kit was dissolved in 1 ml diluted to 1 mg / ml with dimethylformamide so as to have a concentration of 10 mg / ml immediately before use. Was added and the mixture was kept at room temperature for 30 minutes. To this, 20 μl of a solution prepared by dissolving 5 mg of hydroxylamine hydrochloride immediately before use in 100 μl of Maleimide Conjugation Buffer attached to the kit was added, and the mixture was kept at room temperature for 2 hours. The reaction solution was applied to a polyacrylamide desalting column (volume: 10 ml) attached to the above-mentioned kit, which had been equilibrated with 30 ml of Maleimide Conjugation Buffer in advance, eluted with Maleimide Conjugation Buffer, and fractionated by 0.5 ml. The 7th to 10th fractions containing the antibody were combined. To this, 100 μl of EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase 5 mg dissolved in 500 μl of distilled water attached to the above kit was added, and the mixture was kept at room temperature for 1 hour, and then an equal volume of glycerol was added. Stored at ° C.
[0094]
The solution finally obtained was used as a stock solution of peroxidase-labeled anti-human OCIF monoclonal antibody OI-4 (hereinafter, referred to as “POD-OI-4”). 2) Quantification of OCIF
The amount of OCIF in each of the formulations described in Examples 1 and 2 was measured by an ELISA method using an anti-OCIF monoclonal antibody.
[0095]
In each well of a 96-well microtiter plate (Maxisorp: manufactured by NUNC), an anti-human OCIF monoclonal antibody OI-26 (hybridoma OI-26 (FERM BP-6421)) obtained according to the method described in WO99 / 15691. Is dissolved in a 0.1 M sodium bicarbonate solution to a concentration of 5 μg / ml, and 100 μl is dispensed, sealed, and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
[0096]
Each well was washed three times with 250 μl of PBS (pH 7.4) containing 0.1% polysorbate 20.
[0097]
20 μl of a dilution buffer (composition: 0.2 M Tris-HCl, 40% Block Ace (purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.1% polysorbate 20: pH 7.4) is added to each well, and the mixture is added to each well for 20 minutes at room temperature. Kept warm
The test sample was appropriately diluted using a dilution buffer. A dilution buffer containing a known concentration of OCIF was used as a standard solution for preparing a calibration curve, and a dilution buffer was used as a control. 50 μl of each test sample was dispensed into each well.
[0098]
In each well, the undiluted solution of POD-OI-4 obtained in 1) [0.2M Tris-HCl, 40% Block Ace (purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.1% polysorbate 20 (pH 7.4) )], And 50 μl thereof diluted 1500 times was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
[0099]
After the reaction, each well was washed four times with 250 μl of phosphate buffered saline containing 0.1% polysorbate 20 (hereinafter, referred to as “PBS”: pH 7.4).
[0100]
0.1 M citric acid and 0.2 M disodium hydrogen phosphate were mixed to prepare a substrate solution (pH 4.5).
[0101]
To 13 mg of OPD tablets (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 32.5 ml of a substrate solution and 6.5 μl of hydrogen peroxide were added and dissolved, and 100 μl of a substrate solution obtained was added to each well. The mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, protected from light.
[0102]
50 μl of a reaction stop solution obtained by mixing 250 ml of purified water with 50 ml of sulfuric acid was added to each well.
[0103]
After gentle stirring using a stirring shaker (Titer Mixer MB-1: manufactured by Japan Trika), the absorbance of the sample solution at a wavelength of 490 nm was measured using a microplate reader (SPECTRA FLUOR: manufactured by TECAN).
[0104]
The OCIF content in the test sample was calculated from a calibration curve created using the standard solution.
3) Determination of dextran sulfate
The amount of dextran sulfate in each of the formulations described in Examples 1 and 2 was measured as a neutral sugar by the phenol sulfate method.
[0105]
A diluted solution of DS5 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) or DS5000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) having a known concentration of 10 to 60 μg / ml (composition: 0.01 M citric acid, 0.3 M sodium chloride, 0.01% polysorbate 80 aqueous solution: pH 6.0) to obtain a standard solution. 0.2 ml each of the standard solution, the sample solution and the dilution solution were dispensed into test tubes.
[0106]
0.2 ml of a 50 mg / ml phenol aqueous solution was dispensed into the test tube, and the mixture was rapidly stirred.
[0107]
After keeping the temperature in a water bath at 60 ° C. for 20 seconds, 1.0 ml of concentrated sulfuric acid was added and the mixture was rapidly stirred.
[0108]
After standing at room temperature for 10 minutes, the mixture was stirred again, and left standing at room temperature for 20 minutes.
[0109]
The absorbance of each well at a wavelength of 490 nm was measured using a spectrophotometer (UV-240: manufactured by Shimadzu Corporation).
[0110]
Human OCIF has a sugar chain bound to itself. Therefore, the value of the neutral sugar content of the OCIF of the raw material similarly measured was subtracted from the value of the neutral sugar content of the complex of OCIF and dextran sulfate obtained in the above measurement, so that the dextran sulfate bound to OCIF was obtained. Was calculated.
4) Calculation of the molecular ratio of OCIF and dextran sulfate in the complex of OCIF and dextran sulfate
The amount of dextran sulfate bound to 1 mg of OCIF was calculated by dividing the amount of dextran sulfate in each formulation obtained in 3) above by the content of OCIF in each formulation obtained in 2) above.
[0111]
Then, the molecular weight of the human OCIF monomer was set to 60,000, the molecular weight of DS5 was set to 1950, the molecular weight of DS5000 was set to 5000, and the molecular weight of DS10000 was set to 10,000. It was calculated as the number of dextran sulfate molecules.
[0112]
The results are shown in Table 4 below.
[0113]
[Table 4]

Embodiment 5 FIG. Binding stability of complex consisting of OCIF and DS5
After separation of the complex comprising OCIF and DS5 by gel filtration and subsequent concentration were repeated, the amount of dextran sulfate in the complex was measured according to the method described in 3) of Example 4.
1) Keep warm
Recombinant human OCIF (dimer) obtained according to the method described in WO 96/26217 was added to 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M sodium chloride at a concentration of 5 mg / ml. It was dissolved to a concentration. DS5 was dissolved in this aqueous solution to a final concentration of 150 mg / ml, and the pH was adjusted to 10.5 by adding sodium hydroxide. The resulting aqueous solution was kept at 4 ° C. for 7 days.
2) Gel filtration (first time)
The aqueous solution after the heat retention was subjected to gel filtration by the method described in Example 1. An eluate having a retention time of about 28 to 36 minutes was collected. DS5 not bound to OCIF eluted at a retention time of about 50-70 minutes. The protein content in the eluate was measured by the Lowry method described in 1) of Example 7, and the sugar content of the eluate was measured by the phenol-sulfuric acid method described in 3) of Example 4.
3) Gel filtration (second time)
The eluate collected in 2) is divided into two centripreps (YM-30, 30,000 MW cutoff: manufactured by Amicon) and centrifuged at 2000 rpm using a centrifuge (himacCT60: manufactured by Hitachi, Ltd.). And centrifuged for 20 minutes. The fraction not filtered by the centriprep filtration membrane was collected. The recovered solution was subjected to gel filtration again by the method described in 2), and an eluate having a retention time of about 28 to 36 minutes was collected. The protein concentration and the sugar content of the eluate were measured by the method described in 2).
4) Gel filtration (3rd time)
The eluate collected in 3) is divided into two centripreps (YM-30, 30,000 MW cut-off: manufactured by Amicon) and centrifuged at 2000 rpm using a centrifuge (himacCT60: manufactured by Hitachi, Ltd.). And centrifuged for 20 minutes. The fraction not filtered through the centriprep filtration membrane was collected. The recovered solution was subjected to gel filtration again by the method described in 2) above, and an eluate having a retention time of about 28 to 36 minutes was collected. The protein concentration and sugar content of the eluate were measured by the method described in 2) above.
[0114]
The results are shown in Table 5 below.
[0115]
[Table 5]

As shown in Table 5, the binding of OCIF and S5 in the complex consisting of OCIF and DS5 produced in this example was shown to be stable under the conditions of this example.
Embodiment 6 FIG. Heparin adsorption power of complex consisting of OCIF and DS5
1) Adsorption of a complex consisting of OCIF and dextran sulfate onto a heparin column
The following column operations were all performed at a flow rate of 4 ml / min.
[0116]
A heparin column (HiTrap Heparin HP column, Lot. 289212, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was passed through a 10 mM sodium-potassium-potassium-phosphate buffer (pH 7.0: hereinafter referred to as “phosphorus buffer”) containing 0.7 M sodium chloride. It was pre-equilibrated with 5 ml. Next, any one of Formulations 6 to 8, Formulations 22, 24, 25, and 27 described in Example 1 was measured to have a protein concentration (measured by the method described in Example 7-1) of 0.1 mg / ml. After diluting with the above-mentioned phosphate buffer and adding to the column, 1 ml of the eluate [A] was fractionated. Next, 5 ml of phosphate buffer was added to the column, and 5 ml of eluate [B] was collected. Then, 4 ml of a phosphate buffer containing 2.0 M sodium chloride was added to the column, and 4 ml of the eluate [C] was collected.
2) Determination of OCIF in the eluate of heparin column
Anti-human OCIF monoclonal antibody OI-19 (FERM BP-6420) was added to each well of a 96-well microtiter plate (Maxisorp: manufactured by NUNC) at a concentration of 10 μg / 0.1 M in 0.1 M aqueous sodium hydrogen carbonate (pH 9.6). After dissolving 100 μl of the solution dissolved in a volume of 100 ml, the mixture was sealed and kept at 4 ° C. overnight. The antibody solution was removed by decantation, and 300 μl of a blocking buffer (50% Block Ace: purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to each well, followed by incubation at room temperature for 2 hours. Each well was washed three times with 300 μl of PBS (pH 7.4) containing 0.1% polysorbate 20 using SERA WASHER (manufactured by BioTec, MW-96R).
[0117]
The eluate [A], [B] or [C] obtained in 1) was diluted with a dilution buffer (composition: 0.2 M Tris-HCl, 40% Block Ace, mouse immunoglobulin G at a concentration of 10 µg / ml, 0.1 µg / ml). The mixture was appropriately diluted to 120 μl with 1% polysorbate 20 (pH 7.4), mixed with an equal volume of purified water, and, as a control, an OCIF dimer solution having a known concentration was appropriately diluted with a dilution buffer. The volume was adjusted to 120 μl, and purified water was added to an equal volume and mixed.
[0118]
100 μl of the test sample thus obtained was added to each well, and the mixture was gently shaken at room temperature with a stirring shaker (Microplate Mixer NS-P: manufactured by Iuchi Seieido Co., Ltd.). For 2 hours. Each well was then washed six times with 300 μl of PBS (pH 7.4) containing 0.1% polysorbate 20 using SERA WASHER. Next, the stock solution of POD-OI-4 obtained in 1) of Example 4 was diluted with an antibody diluent (composition: 0.2 M Tris-HCl, 25% Block Ace: purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and 10 μg / ml. 100 μl of a 10000-fold dilution with mouse immunoglobulin G, 0.1% polysorbate 20, pH 7.4) was added, and the mixture was kept at room temperature for 2 hours while gently shaking using the above-mentioned shaker. Each well was then washed six times with 300 μl of PBS (pH 7.4) containing 0.1% polysorbate 20 using SERA WASHER.
[0119]
100 μl of a substrate solution (TMB soluble reagent: manufactured by Scytek) was added to each well, and the mixture was kept at room temperature for 10 to 15 minutes while gently shaking using the above-mentioned stirring shaker. 100 μl of a reaction stop solution (TMB stop buffer: manufactured by Scytek) was added to each well.
[0120]
After gently shaking for about 1 minute using a stirring shaker, the absorbance of each well at a wavelength of λ450 nm was measured using a microplate reader (SPECTRA THERMO: manufactured by TECAN). The OCIF concentration in the eluate of the heparin column was calculated from a calibration curve prepared using an OCIF solution with a known concentration.
[0121]
The amount of the complex consisting of OCIF and DS5 contained in eluate [C] contained in eluate [A], [B] and [C] obtained in 1) The values obtained by dividing the amounts are summarized in Table 6 as heparin adsorption power.
[0122]
As a control, the same measurement was performed for the OCIF drug substance obtained in Example 1, and the heparin adsorption power was calculated.
[0123]
[Table 6]
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Prescription name Heparin adsorption power
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Formula 6 0.451
Formula 7 0.183
Prescription 8 0.153
Prescription 22 0.264
Prescription 24 0.072
Formula 25 0.611
Prescription 27 0.141
OCIF 0.998
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Embodiment 7 FIG. Calculation of the immunological detection rate of the complex consisting of OCIF and DS5
1) Measurement of protein amount
Any one of Formulations 6 to 8, Formulations 22, 24, 25, and 27 described in Example 1 was diluted with the phosphate buffer to a protein concentration of about 0.1 mg / mL, The amount of protein was measured according to the method.
[0124]
0.2 g of copper (II) sulfate pentahydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in water to a final volume of 50 ml. 0.4 g of sodium tartrate dihydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in water to a final volume of 50 ml. 20 g of sodium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in water to make a final volume of 100 ml.
[0125]
The 0.4 g / dl copper sulfate solution, the 0.8 g / dl sodium tartrate solution and the sodium carbonate solution were mixed immediately before use in a volume ratio of 1: 1: 2. (Hereinafter, referred to as “solution A”)
10 g of sodium lauryl sulfate (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was dissolved in water to a final volume of 200 ml (hereinafter, referred to as "solution B").
[0126]
Just before use, 3.2 g of sodium hydroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in water to make a final volume of 100 ml (hereinafter referred to as solution C).
Solution A, Solution B and Solution C were mixed immediately before use in a volume ratio of 1: 2: 1.
[0127]
The Folin thiocartophenol reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and water were mixed at a volume ratio of 1: 5 immediately before use.
[0128]
2.76 g of trisodium citrate dihydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.13 g of citric acid monohydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 17.5 g of sodium chloride, and polysorbate 80 0.1 g was dissolved in water to make a final volume of 1 L (pH 6.9, hereinafter referred to as "diluent").
[0129]
9.5 ml of the diluted solution was added to 500 μl of a 2 mg / ml aqueous solution of a bovine serum albumin standard solution for protein quantification (hereinafter referred to as “BSA”: Pierce) (hereinafter, 100 μg / ml standard solution). 3.5 ml, 3 ml, 2.5 ml or 2 ml of the diluent was added to 1.5 ml, 2 ml, 2.5 ml or 3 ml of the 100 μg / ml standard solution, respectively (hereinafter referred to as 30 μg / ml standard solution and 40 μg / ml standard solution). , 50 μg / ml standard solution, 60 μg / ml standard solution). 3 ml of the diluent was added to 1.5 ml of the 60 μg / ml standard solution (hereinafter, 20 μg / ml standard solution).
[0130]
The test sample was appropriately diluted with a diluent such that the protein concentration was about 40 μg / ml.
[0131]
Standard solutions (20 μg / ml standard solution, 30 μg / ml standard solution, 40 μg / ml standard solution, 50 μg / ml standard solution, or 60 μg / ml standard solution), diluted test sample (n = 3) and control ( (Diluent) 1 ml each was collected in a test tube, and 1 ml of alkaline copper test solution was added and mixed immediately. After standing at room temperature for exactly 10 minutes, 0.5 ml of diluted Folin / Ciocaltophenol TS was added and mixed immediately. After leaving at room temperature for 30 minutes, the absorbance (absorbance) of the blank, the standard solution and the sample solution at a wavelength of 750 nm was measured using a quartz cell having a layer length of 10 mm, with water as a control, using a quartz cell having a layer length of 10 mm (Lambda20: Perkin Elmer). Manufactured by the company). From the calibration curve prepared using the standard solution, the amount of protein in the test sample was calculated as a BSA-converted value.
2) Immunological measurement by ELISA
Any one of Formulations 6 to 8, Formulations 22, 24, 25, and 27 described in Example 1 was diluted with the phosphate buffer so that the protein concentration was about 0.1 mg / mL. The amounts of proteins were measured by the ELISA method described in Example 6.
3) Calculation of immunological detection rate
The value obtained by dividing the amount of protein measured by ELISA in 2) by the amount of protein measured by Lowry method in 1) is summarized in Table 7 as an immunological detection rate.
[0132]
As a control, the same measurement was performed for the OCIF drug substance obtained in Example 1, and the immunological detection rate was calculated.
[0133]
The number of molecules of the OCIF substance obtained by dividing the amount of protein measured by ELISA in 2) by the molecular weight of OCIF is obtained by dividing the amount of protein measured by the Lowry method in 1) by the molecular weight of OCIF. By dividing by the number of molecules of OCIF obtained, the immunological detection rate can be similarly calculated.
[0134]
The results are summarized in Table 7.
[0135]
[Table 7]

Test Example 1 Blood retention of a complex consisting of OCIF and dextran sulfate
1) Administration of injections to experimental animals and blood sampling
Five-week-old female Wistar rats (body weight about 100 g) were fasted overnight.
[0136]
Formulations 1 to 40 described in Example 1 and Formulation 41 described in Example 2 and any one of Reference Formulations 1 and 2 described in Reference Example 1 were added to PBS containing 0.01% polysorbate 80 (pH 7). The solution was appropriately diluted in .4) to give an injection, which was then administered once into the rat tail vein at 2 ml / kg body weight. Six hours after the administration, blood was collected from the rat heart.
2) Fractionation of serum and quantification of OCIF
After coagulation by allowing the blood to stand at room temperature for 30 minutes, serum was obtained as a supernatant by centrifugation at 14000 rpm for 3 minutes using a rotor having a diameter of 10 cm.
3) Quantification of OCIF in serum
To each well of a 96-well microtiter plate (Maxisorp: manufactured by NUNC), 10 μg of anti-human OCIF monoclonal antibody OI-19 (refer to WO99 / 15691: see FERM BP-6420) is added to a 0.1 M sodium hydrogen carbonate solution. The solution was dissolved in 100 μl / ml and 100 μl was dispensed, sealed, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Next, the antibody solution was removed by decantation, and 300 μl of a blocking buffer (50% Block Ace: purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to each well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Each well was then washed three times with 300 μl of PBS containing 0.1% polysorbate 20 (pH 7.4). Next, 100 μl of purified water and a dilution buffer (composition: 0.2 M Tris-HCl, 40% Block Ace: purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 20 μl of test serum, 10 μg / ml mouse immunoglobulin G, 0. 120% of 1% polysorbate 20: pH 7.4) was added and mixed. As a control, 100 μl of water and 120 μl of a dilution buffer containing a known concentration of OCIF dimer were added to 20 μl of distilled water and mixed. 100 µl of each of these test samples was added to each well and kept at room temperature for 2 hours. Each well was then washed six times with 300 μl of PBS containing 0.1% polysorbate 20 (pH 7.4). Next, the undiluted solution of POD-OI-4 obtained in 1) of Example 4 was added to each well [0.2 M Tris-HCl, 25% Block Ace (purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 μg / ml. Mouse immunoglobulin G, 0.1% polysorbate 20 (pH 7.4)], and the mixture was kept at room temperature for 2 hours. Each well was then washed six times with 300 μl of PBS containing 0.1% polysorbate 20 (pH 7.4). Next, 100 μl of a substrate solution (TMB soluble reagent: manufactured by Scytek) was added to each well, and the mixture was kept at room temperature for 10 to 15 minutes. Next, 100 μl of a reaction stop solution (TMB stop buffer: manufactured by Scytek) was added to each well. After gently stirring using a stirring shaker (Microplate Mixer NS-P: manufactured by Inuchi Seieido Co., Ltd.), absorbance of each well at a wavelength of λ450 nm was measured using a microplate reader (SPECTRA THERMO: manufactured by TECAN). Was measured.
[0137]
From the calibration curve prepared using the standard solution, the OCIF concentration in the test serum was calculated.
[0138]
The OCIF concentration in each injection prepared in 1) was measured in the same manner as in the case of serum, and was calculated as the dose of OCIF per unit body weight (mg / kg).
4) Retention in blood of each prescription
The amount of the complex consisting of OCIF and DS in the serum obtained in 2) was measured according to the method described in 3).
[0139]
The results are summarized in Table 8.
[0140]
[Table 8]

As shown in Table 8, when 0.5 mg / kg of body weight was administered, the serum concentration 6 hours after administration was 2.2 to 11.7 times higher than that of Reference Formulation 1 known in the art.
[0141]
【The invention's effect】
The preventive or therapeutic agent for bone metabolism disorders comprising a complex comprising an OCIF substance and a polysaccharide substance provided by the present invention has excellent blood retention, osteoporosis, hypercalcemia, bone metastasis of cancer, chronic joint It is useful for the prevention or treatment of bone loss due to rheumatism such as rheumatism, bone loss due to steroid administration, multiple myeloma, reduction associated with kidney disease or hypercalcemia, renal osteodystrophy, osteoarthritis, etc. .
[0142]
[Sequence list]

Claims (20)

One or more substances (OCIF substances) selected from the group consisting of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF), analogs and variants thereof, and a group consisting of polysaccharides and derivatives thereof An agent for preventing or treating bone metabolism disorders, comprising as an active ingredient a complex comprising one or more substances (polysaccharide substances). The preventive or therapeutic agent according to claim 1, wherein the OCIF substance is a human mature OCIF monomer and / or dimer. The prophylactic or therapeutic agent according to claim 2, wherein the mature human OCIF comprises amino acids +1 to 380 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. 4. The method according to claim 1, wherein the OCIF substance and the polysaccharide substance are bound at a molecular ratio of 1: 1 to 1:10, and the polysaccharide substance is dextran sulfate or a salt thereof. The prophylactic or therapeutic agent according to the above. The prophylactic or therapeutic agent according to claim 4, wherein the average molecular weight of dextran sulfate is 1200 to 20,000. The preventive or therapeutic agent according to claim 5, wherein the average molecular weight of dextran sulfate is 1800 to 6000. 7. The method according to claim 4, wherein the OCIF substance and the polysaccharide substance are bound at a molecular ratio of 1: 1 to 1: 8, and the polysaccharide substance is dextran sulfate or a salt thereof. The prophylactic or therapeutic agent according to the above. The preventive or therapeutic agent according to claim 7, wherein the OCIF substance and the polysaccharide substance are bound at a molecular ratio of 1: 1 to 1: 5, and the polysaccharide substance is dextran sulfate or a salt thereof. The preventive or therapeutic agent according to any one of claims 1 to 8, wherein the heparin-adsorbing power is lower than that of a free OCIF substance not forming a complex with a polysaccharide substance. The prophylactic or therapeutic agent according to claim 9, wherein the heparin adsorption power is measured by the following steps [a] to [f]:
[A] equilibrating a column packed with a carrier having immobilized heparin with a low ionic strength buffer containing 0.1 to 0.8 M sodium chloride;
[B] a step of adding a test sample dissolved in the buffer described in [a] to the column, and then collecting an eluted fraction A;
[C] washing the column with the buffer described in [a] and collecting the eluted fraction B; [d] washing the column with a high ionic strength buffer containing 1 to 2 M sodium chloride Recovering the eluted fraction C;
[E] The amount of the complex consisting of the OCIF substance and the polysaccharide substance (each referred to as (a), (b), (c)) present in the elution fractions A to C specifically binds to the OCIF substance Measuring by an enzyme immunoassay using an antibody;
[F] A step of calculating heparin adsorption power by the following equation.

The preventive or therapeutic agent according to claim 10, wherein the heparin adsorption power is 0.7 or less. The preventive or therapeutic agent according to claim 11, wherein the heparin adsorption power is 0.6 or less. 13. The immunological detection rate obtained by dividing the following [x] by the following [y] is 0.5 to 1.2, wherein the immunological detection rate is 0.5 to 1.2. Prophylactic or therapeutic agent:
[X] the number of molecules of the OCIF substance contained in the test sample, which is measured using an OCIF substance as a standard substance by an enzyme immunoassay using an antibody that specifically binds to the OCIF substance;
[Y] (i) the molecule of the OCIF substance contained in the test sample, which is calculated based on the amount of protein measured by the Lowry method using bovine serum albumin as a standard substance and (ii) the molecular weight of the OCIF substance number. An enzyme immunoassay was performed using anti-human OCIF monoclonal antibody OI-19 produced by hybridoma OI-19 (FERM BP-6420) or anti-human OCIF monoclonal antibody OI-26 produced by hybridoma OI-26 (FERM BP-6421). ELISA using an anti-human OCIF monoclonal antibody OI-4 produced by hybridoma OI-4 (FERM BP-6419) as a solid phase-immobilized antibody in a mobile phase enzyme-labeled with peroxidase The preventive or therapeutic agent according to claim 13, which is an (enzyme-linked immunosorbent assay). The preventive or therapeutic agent according to claim 13 or 14, wherein the immunological detection rate is 0.6 to 1.1. 16. The prophylactic or therapeutic agent according to claim 15, wherein the immunological detection rate is 0.7 to 1.1. One or more substances selected from the group consisting of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF), analogs and mutants thereof, comprising the following steps [i] to [iii] ( Bone metabolism disorder containing, as an active ingredient, a complex obtained by a method for preparing a complex comprising one or two or more substances (polysaccharide substances) selected from the group consisting of OCIF substances) and polysaccharides or derivatives thereof Preventive or therapeutic agent for sickness:
[I] contacting the OCIF substance with the polysaccharide substance;
[Ii] a step of keeping the temperature under a condition of pH 9.5 to 12;
[Iii] A step of removing free polysaccharide substances. 18. The prophylactic or therapeutic agent according to claim 17, wherein in step [ii], the temperature is kept under a condition of pH 10 to 11. 19. The prophylactic or therapeutic agent according to claim 17 or 18, wherein the free polysaccharide substance is removed by gel filtration in the step [iii]. Bone metabolism disorders include primary osteoporosis, endocrine osteoporosis, Paget's disease, hypercalcemia due to solid tumors, multiple myeloma, idiopathic hypercalcemia, osteopenia due to steroid administration, renal dysfunction Osteopenia associated with the disease, surgery, osteopenia associated with digestive disorders, rheumatoid arthritis, osteopenia due to rheumatoid arthritis, bone and joint destruction due to rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, periodontal disease 20. The prophylactic or therapeutic agent according to any one of claims 1 to 19, which is one selected from the group consisting of bone loss, bone metastasis of cancer, renal osteodystrophy and osteopenia.