JP2004180557A

JP2004180557A - Method and reagent for simply detecting gene deletion of human cytochrome p4502d6

Info

Publication number: JP2004180557A
Application number: JP2002349813A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Soya; 義博曽家; Masao Kitabayashi; 北林　　雅夫; Yutaka Takarada; 裕宝田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-12-02
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2004-07-02
Anticipated expiration: 2022-12-02
Also published as: JP4235881B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a part or the whole of gene deletion, especially the gene deletion of human cytochrome P4502D6 clearly and in excellent reproduciblity, and to obtain a reagent therefor. <P>SOLUTION: The method for detecting a part or the whole of gene deletion comprises using a 2-Step PCR method. In the method for detecting the gene deletion, a part or the whole of the gene deletion is continuous 1,000 or more deletions. The method is suitably used for the gene deletion of the human cytochrome P4502D6. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法および検出試薬、特にはヒトチトクローム２Ｄ６遺伝子欠損を検出する方法および検出試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明において、遺伝子欠損とは野生型の塩基配列の数個から数千個の塩基が失われた配列を有することをいう。２Ｄ６遺伝子の欠損は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（例えば、非特許文献１，非特許文献２参照）。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
一方、ＰＣＲ反応を用いて遺伝子欠損を調べる試みも報告されている（例えば、非特許文献３参照）。本方法は、ＰＣＲ反応後に電気泳動する方法であり簡便である。
またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００５】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に遺伝子欠損の同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難である為に、正確な同定をするには多大な作業が必要であった。
【０００６】
たとえば電気泳動法によれば泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。
また、ＰＣＲ法にて増幅された試料を核酸特異標識により検出する場合、標的以外の増幅も生じ結果としてノイズが高くなるため、正確な検出は困難であった。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。さらには、ＰＣＲ条件の設定が難しかったり、ノイズが多く正確性に欠けたり判別しづらい場合も多かった。
【０００７】
【非特許文献１】
ＧｒａｍおよびＢｒｓｅｎ，ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ，（１９９０），第８７〜９６頁
【非特許文献２】
Ｂａｌａｎｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第３６巻（１９８９）、第５５１〜５５４頁、
【非特許文献３】
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６（２０００）第１０７２−１０７７頁，
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく遺伝子の一部もしくは全ての欠損、特にはヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させるいわゆるＰＣＲ法を用いた遺伝子欠損の検出について鋭意検討を行った結果、変性工程に続くアニーリング工程を経ずに伸長工程を行い、これを繰り返し行うことによって、著しく標的以外の増幅を減少させることが可能となることを見出した。
【００１０】
増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。通常のＰＣＲ法は変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すのに対し、実質的に２つの温度範囲を繰り返すことによって遺伝子増幅を行う方法を２ｓｔｅｐＰＣＲ法とよぶ。
【００１１】
さらに好適には、２ＳｔｅｐＰＣＲを少なくとも２種類以上の温度条件で伸長反応を実施することにより、さらに標的以外の増幅産物を減少させることができる。本方法によって、標的核酸と２種類の特定のオリゴヌクレオチド、４種類のジデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加し、２ＳｔｅｐＰＣＲ法により増幅反応を行い、反応により生じた２本鎖オリゴヌクレオチドの量を測定することで、煩雑な検出操作を必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確なヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損を検出する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法において２ＳｔｅｐＰＣＲ法を用いることを特徴とする遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（２）遺伝子の一部もしくは全ての欠損が、連続した１０００個以上の欠損であることを特徴とする、（１）に記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（３）遺伝子の一部もしくは全ての欠損がヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（４）ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損が２Ｄ６＊５であることを特徴とする（３）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（５）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法として２ＳｔｅｐＰＣＲ法とＰＣＲ法を組合せて行うことを特徴とする（１）〜（４）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（６）２ＳｔｅｐＰＣＲ法に用いられる酵素が耐熱性ポリメラーゼであることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（７）耐熱性ポリメラーゼがα型ポリメラーゼであることを特徴とする（６）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（８）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法として２ＳｔｅｐＰＣＲ法を用いることを特徴とする遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（９）遺伝子の一部もしくは全ての欠損が、連続した１０００個以上の欠損であることを特徴とする、（８）に記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１０）遺伝子の一部もしくは全ての欠損がヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損であることを特徴とする（９）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１１）ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損が２Ｄ６＊５であることを特徴とする（１０）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１２）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法として２ＳｔｅｐＰＣＲ法とＰＣＲ法を組合せて行うことを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１３）２ＳｔｅｐＰＣＲ法に用いられる酵素が耐熱性ポリメラーゼであることを特徴とする（８）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１４）耐熱性ポリメラーゼがα型ポリメラーゼであることを特徴とする（１３）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法である。なお、本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。遺伝子欠損とは、野生型核酸のうち少なくとも数個から数千個のヌクレオチドが失われた核酸のことである。このような遺伝子欠損により遺伝子の活性が失われていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査し、被験者の有する遺伝子の欠損、特にはヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損を検出する方法である。なお、試料中に含まれる目的の遺伝子を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う遺伝子多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。
【００１４】
また、本発明において対象となる遺伝子の欠損長さは特に限定されるものではないが、好ましくは連続して２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上、より好ましくは１０００塩基以上、さらに好ましくは２０００塩基以上のものであることが望ましい。なお、遺伝子欠損長さの上限は、特に限定するものではないが、５０００００塩基以下であることが現実的な面で望ましい。
また、フォワード側プライマーとリバース側プライマーで挟まれた増幅部分の長さは、特に限定されるものではないが、好ましくは１０００塩基以上、より好ましくは２０００塩基以上、さらに好ましくは３０００塩基以上、特に好ましくは５０００塩基以上であることが望ましい。
上限は増幅が可能であれば問題なく、特に限定するものではないが現実的な面で５０００００塩基以下であることが望ましい。
【００１５】
本発明において、オリゴヌクレオチドを作用させる反応とは一般的に、一本鎖に変性した標的核酸に野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドおよび／または欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。また好適には一本鎖に変性させる段階と標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチドを伸長させる段階から構成される２段階反応が繰り返されることが含まれる。
【００１６】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、１３以上さらには１６塩基以上が好ましく、また、３５塩基以下、さらには３０塩基以下が好ましい。
【００１７】
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、オリゴヌクレオチドを作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００１８】
該伸長反応は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、オリゴヌクレオチドを作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。
【００１９】
遺伝子欠損の検出のためのプライマーは、野生型遺伝子検出用の場合は、フォワード側、リバース側のいずれか（通常はフォワード側）の配列を欠損部分の一部に相補的になるようにし、他方を非欠損部分に相補的になるように設定する。また、変異型遺伝子検出用の場合はフォワード側、リバース側のプライマーを欠損部分を挟むように、非欠損部分に相補的になるように設定する。
【００２０】
しかしながら、ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損、とくに２Ｄ６＊５の遺伝子欠損においては、数千もの遺伝子配列部分が抜け落ちており、さらには、抜け落ちている部分は一定ではない。
【００２１】
このことから通常プライマーは、安全を見て、抜け落ちる部分の境界部から、離れた位置に設定する。
また、抜け落ちる部分には、他の部分に非常に相同性の高い配列部分があり、正確に目的部分にハイブリダイズさせるためにも、プライマーの設定に制約があった。
このような制約のもとで設定されたプライマーは、フォワード−リバース間隔が長く、４０ｋｂｐ近くにもなることがあった。
【００２２】
その影響か、従来の、変性・アニーリング・伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すＰＣＲ法では、ＰＣＲ条件の取り方が非常に難しかったり、ＰＣＲ反応が出来たとしても、生成物に目的物以外の増幅物が多く、検出時が不明確になったりするものであった。
【００２３】
しかし、２ＳｔｅｐＰＣＲ法を採用することにより、従来の３工程からなるサイクルを繰り返すＰＣＲ法と比較して非常に純度の高いＰＣＲ生成物が得られることが分かり、ＰＣＲ条件の設定の許容度が広がる、正確な判定が可能となるといった大きなメリットが得られることが分かった。また、増幅に必要な時間も短縮することができ、臨床用途などで短時間で検出が必要となる場合にも大きなメリットがあることが分かった。
【００２４】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、欠損型では反応が起きない。逆に、欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が欠損型であれば反応が起きるが、野生型であれば鋳型核酸が長すぎるため反応は起こらない。
【００２５】
従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか欠損型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、欠損型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と欠損型遺伝子が共に存在するから野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００２６】
本発明の方法により、野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドであっても変異型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドであっても同一の条件下でもＰＣＲ増幅を行うことができ、両方を同時に同条件下でＰＣＲ増幅させることができる。
【００２７】
また、オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出する方法とは、特定の塩基配列を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドと及び１種又は２種の欠損型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、２本鎖核酸特異的結合物質と反応させることによって前記増幅反応により生じたオリゴヌクレオチド量を検出できる。
【００２８】
さらに、上記検出方法としては、標識したオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子欠損の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
【００２９】
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、^３２Ｐ、^３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
【００３０】
また、核酸特異標識を用いることも可能である。核酸特異標識としては様々なものが挙げられるが、２本鎖核酸特異標識が好ましく、具体的には、アクリジン染料、例えばアクリジン・オレンジ、フェナンスリジン、エチジウム、アントラサイクリン、アドリアマイシン、フェナジン、フロクマリン、フェノチアジン、キノリンおよびこれらの誘導体、エチレンブロマイド、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩなどが挙げられる。
【００３１】
該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５’ 部位である。
野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を添加して、１つの反応槽で検出ができる。
【００３２】
二本鎖形成反応に用いられる酵素は核酸を増幅させる作用があれば特に限定されるものではないが、Ｔａｑ、ＴＴｈ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ等のＤＮＡポリメラーゼが用いられる。これらＤＮＡポリメラーゼは野生株由来の他に一部が組換えられたもの、あるいは欠失、化学的、生物的に修飾されたものも含まれる。好適にはα型ポリメラーゼの使用が好ましい。
【００３３】
また、本発明の２ｓｔｅｐＰＣＲ法により、従来のＰＣＲで用いられていた反応を促進させたり副反応を抑制する添加剤を添加することなく、比較的長い範囲の遺伝子欠損を正確に検出することができるが、添加剤を加えても良い。添加剤を加えることにより、さらに適正なＰＣＲ条件が広くとれたり、反応の促進、副反応の抑制が可能である。
添加剤の例としては、クエン酸、イソクエン酸、フマル酸、コハク酸、シュウ酸、マレイン酸、無水マレイン酸、ギ酸、酢酸などの多価カルボン酸類またはその塩類、プロピオン酸、オレイン酸、オクタン酸、リノール酸、リノレン酸等の有機酸類またはその塩類、ＤＭＳＯ等の有機溶媒、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンに代表されるベタインや４級アミン類が挙げられるが、これらに限定されることなく検出を阻害するものでなければ用いることができる。
【００３４】
キット
本発明において、キットとしては、野生型遺伝子用オリゴヌクレオチド及び／又は欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むヒトチトクローム２Ｄ６遺伝子欠損検出用試薬キットを含むものである。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。さらに、反応を促進させたり副反応を抑制する添加剤を実質的に添加することなくキットとしても良いし、添加剤を加えていてもかまわない。
【００３５】
キットとしては、包装形式は特に制限を加えるものではないが、反応容器内にそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、塩類など、試料以外の増幅に必要なものがすべて溶解された状態か、もしくは一定量の水を加えるのみで後は試料を加えるだけの反応液となる状態であることが好ましい。オリゴヌクレオチドやリバースプライマーは別包装されているものであっても良い。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子欠損の検出
（１）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の野生型および欠損型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜２と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴＫＫ、アマシャムファルマシアバイオテク（株）等）に依頼した。
オリゴ１、２を組み合わせて野生型遺伝子検出用のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ２、３を組合せて変異型検出用のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ１、２、３は必要により標識して使用される。
（２）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子欠損の解析
▲１▼ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトチトクロームＰ４５０ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子欠損を解析した。
【００３８】
試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１および／または２５ｐｍｏｌ
オリゴ３および／または２５ｐｍｏｌ
×１０緩衝液２．５ μｌ
２ｍＭｄＮＴＰ２．５ μｌ
２５ｍＭＭｇＳＯ_４１．５ μｌ
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ１Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ
【００３９】
増幅条件
９５℃・５分
９８℃・１０秒、Ｘ℃・３分３０秒（５サイクル）Ｘを７２→７０
９８℃・１０秒、６９℃・３分３０秒（２５サイクル）
６８℃・２分。
【００４０】
▲２▼ 核酸特異的結合物質による検出
▲１▼の増幅反応液３μｌを５０００倍に希釈されたＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ製）の溶液１００μｌに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約５分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
ＦＬ（試料の蛍光強度）＝ＦＬｂ−ＦＬｓ（式１）
ＦＬｂ：ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（試料が未添加）の蛍光強度
ＦＬｓ：各試料の蛍光強度
【００４１】
【表１】

【００４２】
上記のように、オリゴヌクレオチドを用いて、塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応物質を核酸特異的結合物質を用いて測定することで、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。
【００４３】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られた。
【配列表】

【００４４】

【００４５】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method and a detection reagent for detecting a part or all of a gene deficiency present in a sample, and more particularly to a method and a detection reagent for detecting a human cytochrome 2D6 gene deficiency.
[0002]
[Prior art]
In the present invention, gene deletion refers to having a sequence in which several to thousands of bases have been lost from a wild-type base sequence. Deficiency of the 2D6 gene plays an important role in drug metabolism as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures, and is also known as a cause of individual differences such as basal metabolism known as a constitution. The elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical studies (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
[0003]
As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, there is, for example, a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Although the nucleic acid sequencing method can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in a nucleic acid sequence, it requires a great deal of effort to prepare a template nucleic acid, perform a DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, and analyze a nucleic acid sequence. And need time. In addition, although labor saving can be achieved by using a recent automatic sequencer, there is a problem that an expensive apparatus is required.
[0004]
On the other hand, attempts to examine gene deficiency using a PCR reaction have been reported (for example, see Non-Patent Document 3). This method is a method of performing electrophoresis after a PCR reaction, and is simple.
In another mode, the amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected by using a labeled probe.Southern blotting is used, and the detection is performed by using a detection probe after capturing with a supplementary probe immobilized on a solid carrier. Laws and the like have been developed.
[0005]
It seems that the amplified nucleic acid is detected by the method as described above, and the gene deletion can be easily identified.However, in practice, the operation is complicated and it is difficult to quantify the detected value. Extensive work was required for accurate identification.
[0006]
For example, according to electrophoresis, it is difficult to accurately quantify the amount of nucleic acid from an electrophoretic image.
In addition, when a sample amplified by the PCR method is detected by a nucleic acid-specific label, amplification other than the target occurs, and as a result, noise increases, so that accurate detection has been difficult. In the Southern blot method and the sandwich hybridization method, a hybridization reaction with a probe is required, and the conditions must be strictly adjusted. Furthermore, a step of removing excess probe is required, and the operation is very complicated. Furthermore, setting of PCR conditions was difficult, and there were many cases where there was much noise and the accuracy was poor or it was difficult to determine.
[0007]
[Non-patent document 1]
Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, (1990), pp. 87-96 [Non-Patent Document 2]
Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 36 (1989), 551-554,
[Non-Patent Document 3]
Clin. Chem. 46 (2000) pp. 1072-1077,
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method and a reagent capable of clearly and reproducibly detecting a part or all of a gene deficiency, particularly a human cytochrome P4502D6 gene deficiency, by solving the above problems. To provide.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above circumstances, the present inventors repeat a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a thermostable DNA polymerase. By doing so, as a result of intensive studies on the detection of gene deletion using a so-called PCR method that exponentially amplifies the region of the sample nucleic acid sandwiched between the pair of oligonucleotides, without passing through the annealing step following the denaturation step It has been found that by performing an extension step and repeating this step, it is possible to significantly reduce non-target amplification.
[0010]
Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. While a normal PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension, a method of performing gene amplification by substantially repeating two temperature ranges is called a two-step PCR method.
[0011]
More preferably, by performing an extension reaction in 2 Step PCR under at least two or more kinds of temperature conditions, amplification products other than the target can be further reduced. According to this method, a target nucleic acid, two kinds of specific oligonucleotides, and four kinds of dideoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) are added, an amplification reaction is performed by a 2Step PCR method, and a double-stranded oligonucleotide generated by the reaction is added. By measuring the amount of, it was possible to obtain easily quantified data without the need for a complicated detection operation, and thus to find a method for detecting a clear human cytochrome P4502D6 gene deficiency, thereby completing the present invention. .
[0012]
That is, the present invention has the following configuration.
(1) A method for detecting a part or all of a gene deficiency, which comprises using the 2Step PCR method in a method for detecting a part or all of a gene deficiency.
(2) The method for detecting a part or all of the gene deletion according to (1), wherein part or all deletions of the gene are consecutive 1000 or more deletions.
(3) The method according to (1), wherein the deletion of a part or all of the gene is a human cytochrome P4502D6 gene deletion.
(4) The method for detecting a partial or complete deletion of the gene according to (3), wherein the deletion of the human cytochrome P4502D6 gene is 2D6 * 5.
(5) Detecting a part or all of the deficiency of the gene according to (1) to (4), wherein the method for detecting part or all of the deficiency of the gene is performed by combining 2Step PCR and PCR. Method.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the enzyme used in the 2Step PCR method is a thermostable polymerase.
(7) The method according to (6), wherein the thermostable polymerase is an α-type polymerase.
(8) A reagent for detecting a part or all of a gene deficiency, wherein a 2Step PCR method is used as a method for detecting a part or all of a gene deficiency.
(9) The reagent for detecting a part or all of the deletion of the gene according to (8), wherein the deletion of part or all of the gene is continuous 1000 or more deletions.
(10) The reagent according to (9), wherein a part or all of the gene deficiency is a human cytochrome P4502D6 gene deficiency.
(11) The reagent according to (10), wherein the deletion of the human cytochrome P4502D6 gene is 2D6 * 5.
(12) The method for detecting a partial or total deletion of a gene according to any one of claims 8 to 11, wherein the method is a combination of the 2Step PCR method and the PCR method as a method for detecting partial or total deletion of the gene. Detection reagent.
(13) The reagent according to any one of (8) to (12), wherein the enzyme used in the 2Step PCR method is a thermostable polymerase.
(14) The reagent according to (13), wherein the thermostable polymerase is an α-type polymerase.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The present invention is a method for detecting partial or complete deletion of a gene. In the present invention, a nucleic acid sequence may be simply referred to as a nucleic acid. Genetic deficiency is a nucleic acid in which at least several to thousands of nucleotides have been lost in a wild-type nucleic acid. It has been elucidated that the activity of the gene has been lost due to such gene deficiency, and the method of the present invention examines whether the nucleic acid in the sample has such a predicted mutation, This is a method for detecting a gene deficiency in a subject, in particular, a human cytochrome P4502D6 gene deficiency. The chromosome containing the target gene or a fragment thereof contained in the sample is not particularly limited as long as it is a target nucleic acid containing a gene polymorphism site that carries information on the target gene.
[0014]
In addition, the length of deletion of the gene of interest in the present invention is not particularly limited, but is preferably continuously 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, more preferably 1000 bases or more, and still more preferably 2000 bases or more. Desirably, it is more than a base. The upper limit of the gene deletion length is not particularly limited, but is preferably 500,000 bases or less in terms of practicality.
The length of the amplified portion sandwiched between the forward primer and the reverse primer is not particularly limited, but is preferably 1,000 bases or more, more preferably 2000 bases or more, and still more preferably 3000 bases or more, particularly Preferably, the number of bases is 5,000 or more.
The upper limit is not a problem as long as amplification is possible, and is not particularly limited, but is preferably not more than 500,000 bases in practical terms.
[0015]
In the present invention, generally, the reaction of causing an oligonucleotide to act on a target nucleic acid that has been denatured into a single strand, an oligonucleotide for detecting a wild-type gene and / or an oligonucleotide for detecting a defective gene, a reverse oligonucleotide, By reacting deoxynucleoside triphosphate (dNTP) with a DNA polymerase, an oligonucleotide elongation reaction using a target nucleic acid as a template occurs, and the reaction involves the synthesis of a complementary strand of a nucleic acid sequence. Also preferably, a two-step reaction consisting of a step of denaturing into a single strand and a step of elongating an oligonucleotide using a target nucleic acid as a template is repeated.
[0016]
The length of the oligonucleotide in the present invention is preferably 13 or more, more preferably 16 or more bases, and is preferably 35 or less, more preferably 30 or less.
[0017]
In the present invention, the method for extending an oligonucleotide can be basically performed using a conventional method. Usually, a target nucleic acid is formed by allowing an oligonucleotide to act on a chromosome containing a specific nucleotide polymorphism site denatured into a single strand or a fragment thereof together with four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) and a DNA polymerase. The oligonucleotide is extended as a template.
[0018]
The extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989). In the present invention, a method for amplifying a chromosome or a fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and is usually a specific nucleotide polymorphism modified into a single strand. The oligonucleotide is allowed to act on the chromosome containing the site or a fragment thereof together with four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), a DNA polymerase, and a reverse primer, whereby the forward oligonucleotide and the reverse oligonucleotide are synthesized using the target nucleic acid as a template. Amplified between.
[0019]
In the case of detecting a wild-type gene, the primer for detecting a gene deletion should be such that the sequence on either the forward side or the reverse side (usually the forward side) is complementary to a part of the defective portion, and Is set to be complementary to the non-deficient portion. In the case of mutant gene detection, the primers on the forward and reverse sides are set so as to be complementary to the non-deleted portion so as to sandwich the deleted portion.
[0020]
However, in the case of the deletion of the human cytochrome P4502D6 gene, particularly the deletion of the 2D6 * 5 gene, thousands of gene sequence portions are missing, and the missing portions are not constant.
[0021]
For this reason, the primer is usually set at a position distant from the boundary of the falling part in consideration of safety.
In addition, there are sequence portions having extremely high homology to other portions in the dropped portion, and there are restrictions on the setting of primers in order to accurately hybridize to the target portion.
Primers set under such restrictions have a long forward-reverse interval, which may be close to 40 kbp.
[0022]
Influence of this, in the conventional PCR method in which a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension is repeated, it is extremely difficult to take PCR conditions, and even if the PCR reaction can be performed, the product other than the target substance is not included in the product. There were many amplification products, and the time of detection was unclear.
[0023]
However, it has been found that by adopting the 2Step PCR method, a PCR product with extremely high purity can be obtained as compared with the conventional PCR method in which a cycle consisting of three steps is repeated, and the latitude in setting PCR conditions is increased. It has been found that a great merit that accurate judgment can be obtained is obtained. In addition, the time required for amplification can be shortened, and it has been found that there is a great merit even when detection is required in a short time for clinical use or the like.
[0024]
In the method using the nucleic acid amplification method as described above, when a sample nucleic acid is extended or amplified using an oligonucleotide for detecting a wild-type gene, a reaction occurs if the sample nucleic acid is a wild-type, but a defective Does not react. Conversely, when a sample nucleic acid is extended or amplified using an oligonucleotide for detecting a defective gene, the reaction occurs if the sample nucleic acid is defective, but if the sample nucleic acid is wild-type, the reaction occurs because the template nucleic acid is too long. Does not happen.
[0025]
Therefore, one sample was divided into two, one was reacted using the oligonucleotide for detecting the wild-type gene, and the other was reacted using the oligonucleotide for detecting the defective gene, and whether or not the reaction occurred. By examining, it is possible to clearly know whether the sample nucleic acid is a wild type or a defective type. In particular, higher organisms, including humans, have one father-derived gene and one maternal-derived gene for one type of gene. It is also possible to distinguish between a defective homo and a heterozygous form. That is, in the case of heterozygous reaction, both the wild-type gene and the defective gene are present, so that the reaction occurs both when the oligonucleotide for detecting the wild-type gene is used and when the oligonucleotide for detecting the defective gene is used.
[0026]
According to the method of the present invention, PCR amplification can be performed under the same conditions regardless of whether the oligonucleotide is a wild-type gene detection oligonucleotide or a mutant-type gene detection oligonucleotide. Can be done.
[0027]
Further, the method of detecting whether or not the oligonucleotide has reacted, a nucleic acid sample containing a chromosome or a fragment containing a specific base sequence, a certain amount of oligonucleotide for wild-type gene detection and one or two or more The reaction is carried out simultaneously or separately using a deletion type detection oligonucleotide (corresponding to a forward primer), and then reacted with a double-stranded nucleic acid-specific binding substance to reduce the amount of the oligonucleotide generated by the amplification reaction. Can be detected.
[0028]
Furthermore, as the above detection method, a labeled oligonucleotide can be used.
For example, for the detection, the respective oligonucleotides are labeled in advance with an enzyme, biotin, a fluorescent substance, a hapten, an antigen, an antibody, a radioactive substance, a luminophore, or the like, and after the extension or amplification reaction, the labeled oligonucleotides reacted. By detecting, gene deficiency can be detected. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase and the like.
Examples of the fluorescent substance include FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, and the like.
[0029]
Haptens include biotin, digoxigenin and the like. Examples of the radioactive substance include ³² P, ³⁵ S and the like. Examples of the luminophore include ruthenium.
[0030]
It is also possible to use a nucleic acid specific label. The nucleic acid-specific label includes various ones, and a double-stranded nucleic acid-specific label is preferable, and specifically, an acridine dye, for example, acridine orange, phenanthridine, ethidium, anthracycline, adriamycin, phenazine, flocoumarin, Examples include phenothiazine, quinoline and derivatives thereof, ethylene bromide, SYBR GreenI and the like.
[0031]
The label may be attached to any position of the oligonucleotide as long as it does not affect the extension reaction of the oligonucleotide. Preferably, it is a 5 'site.
When different labels were used for the wild-type detection oligonucleotide and the mutant-type detection oligonucleotide, both the wild-type detection oligonucleotide and the mutation-type detection oligonucleotide were added to one sample, and one reaction was performed. Can be detected in the tank.
[0032]
The enzyme used in the double-strand formation reaction is not particularly limited as long as it has an action of amplifying the nucleic acid, and a DNA polymerase such as Taq, TTh, Pfu, and KOD is used. These DNA polymerases include those derived from wild-type strains and partially recombined, or deleted, chemically or biologically modified. Preferably, the use of α-type polymerase is preferred.
[0033]
In addition, the two-step PCR method of the present invention can accurately detect a relatively long-range gene defect without adding an additive that promotes a reaction used in conventional PCR or suppresses a side reaction. However, an additive may be added. By adding the additive, more appropriate PCR conditions can be obtained widely, and the reaction can be promoted and side reactions can be suppressed.
Examples of additives include polycarboxylic acids or salts thereof such as citric acid, isocitric acid, fumaric acid, succinic acid, oxalic acid, maleic acid, maleic anhydride, formic acid, and acetic acid, propionic acid, oleic acid, and octanoic acid. , Organic acids such as linoleic acid and linolenic acid or salts thereof, organic solvents such as DMSO, betaines and quaternary amines represented by N, N, N-trimethylglycine, but are not limited thereto. If it does not inhibit detection, it can be used.
[0034]
Kit In the present invention, the kit includes an oligonucleotide for detecting a wild-type gene and / or an oligonucleotide for detecting a defective gene, a reverse oligonucleotide, a DNA polymerase, and four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs). It contains a reagent kit for detecting human cytochrome 2D6 gene deficiency.
Each of the oligonucleotides may be labeled in advance with an enzyme, biotin, a fluorescent substance, a hapten, an antigen, an antibody, a radioactive substance, a luminophore, or the like as described above. Furthermore, a kit may be used without substantially adding an additive that promotes the reaction or suppresses a side reaction, or an additive may be added.
[0035]
As for the kit, the packaging format is not particularly limited, but each wild-type detection oligonucleotide and / or mutant-type detection oligonucleotide, reverse primer, DNA polymerase, and four types of deoxynucleoside trisaccharides are placed in a reaction vessel. Phosphoric acid (dNTP), salts, etc., other than the sample, all necessary for amplification may be dissolved, or only a certain amount of water may be added, and then the reaction solution may be sufficient to add the sample. preferable. The oligonucleotide and the reverse primer may be separately packaged.
[0036]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0037]
Example 1 Detection of CYP2D6 gene deficiency
(1) Synthesis of oligonucleotide for detecting wild type and deletion type of CYP2D6 gene The nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 by the phosphoramidite method using DNA synthesizer 392 manufactured by PerkinElmer. (Hereinafter referred to as oligos 1-2) were synthesized. The synthesis was performed according to the manual, and deprotection of various oligonucleotides was performed overnight at 55 ° C. with aqueous ammonia. Oligonucleotide purification was carried out using an OPC column from PerkinElmer. Alternatively, a request was made to a DNA synthesis contract company (Japan Bioservice Co., Ltd., Sawasdee Co., Ltd., GENSET KK, Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.).
Oligos 1 and 2 are combined and used as an oligonucleotide for wild-type gene detection. Oligos 2 and 3 are combined and used as an oligonucleotide for mutant type detection. Oligos 1, 2, and 3 are used after being labeled as necessary.
(2) Analysis of CYP2D6 gene deficiency { circle around (1) } Amplification reaction using DNA polymerase Using a DNA solution extracted from human leukocytes by the phenol-chloroform method as a sample, adding the following reagents, and subjecting human cytochrome P450CYP2D6 to the following conditions. Gene deletion was analyzed.
[0038]
Reagents A 25 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD DNA polymerase reaction solution oligo 1 and / or 25 pmol
Oligo 3 and / or 25 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2.5 μl of 2 mM dNTP
25 mM MgSO ₄ 1.5 μl
KOD DNA polymerase 1U
Extracted DNA solution 100 ng
[0039]
Amplification conditions 95 ° C, 5 minutes 98 ° C, 10 seconds, X ° C, 3 minutes 30 seconds (5 cycles) X 72 → 70
98 ° C for 10 seconds, 69 ° C for 3 minutes and 30 seconds (25 cycles)
68 ° C for 2 minutes.
[0040]
{Circle around (2)} Detection by nucleic acid-specific binding substance 3 μl of the amplification reaction solution of (1) is added to 100 μl of a 5000-fold diluted solution of CyberGreen I (manufactured by Molecular Probe), stirred at room temperature, and then stirred at room temperature in a fluorescent plate reader (dark). (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). The time required was about 5 minutes.
From the obtained fluorescence intensity, the fluorescence intensity of the sample was calculated using the following calculation formula.
FL (fluorescence intensity of sample) = FLb−FLs (Equation 1)
FLb: Fluorescence intensity of Negative Control (no sample added) FLs: Fluorescence intensity of each sample
[Table 1]

[0042]
As described above, a base polymorphism-specific amplification reaction is performed using an oligonucleotide, and the genotype is easily and rapidly determined by measuring the amplification reaction substance using a nucleic acid-specific binding substance. I was able to.
[0043]
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a method for clearly and easily detecting a gene polymorphism in a sample nucleic acid. The method of the present invention does not require complicated operations as in the conventional methods, so that quick and easy reproducible results were obtained.
[Sequence list]

[0044]

[0045]

Claims

A method for detecting a part or all deletion of a gene, which comprises using a 2Step PCR method in the method for detecting a part or all deletion of a gene.

2. The method according to claim 1, wherein the deletion of some or all of the genes is 1000 or more consecutive deletions.

2. The method according to claim 1, wherein part or all of the gene deficiency is a human cytochrome P4502D6 gene deficiency.

4. The method according to claim 3, wherein the deletion of the human cytochrome P4502D6 gene is 2D6 * 5.

5. The method according to claim 1, wherein a combination of 2Step PCR and PCR is used as a method for detecting a part or all of the gene deficiency.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the enzyme used in the 2Step PCR method is a thermostable polymerase.

7. The method according to claim 6, wherein the thermostable polymerase is an α-type polymerase.

A reagent for detecting a part or all of a gene deficiency, wherein 2Step PCR is used as a method for detecting a part or all of a gene deficiency.

The reagent according to claim 8, wherein the deletion of a part or all of the gene is 1000 or more consecutive deletions.

9. The reagent according to claim 8, wherein the deletion of a part or all of the gene is a human cytochrome P4502D6 gene deletion.

The reagent according to claim 10, wherein the human cytochrome P4502D6 gene deficiency is 2D6 * 5.

The reagent for detecting partial or total deletion of a gene according to any one of claims 8 to 11, wherein the method for detecting partial or total deletion of the gene is performed by a combination of 2Step PCR and PCR.

The reagent according to any one of claims 8 to 12, wherein the enzyme used in the 2Step PCR method is a thermostable polymerase.

14. The reagent according to claim 13, wherein the thermostable polymerase is an α-type polymerase.