JP4235881B2

JP4235881B2 - Simple detection method and reagent for detection of human cytochrome P4502D6 gene deficiency

Info

Publication number: JP4235881B2
Application number: JP2002349813A
Authority: JP
Inventors: 義博曽家; 北林　　雅夫; 裕宝田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-12-02
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2022-12-02
Also published as: JP2004180557A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法および検出試薬、特にはヒトチトクローム2D6遺伝子欠損を検出する方法および検出試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明において、遺伝子欠損とは野生型の塩基配列の数個から数千個の塩基が失われた配列を有することをいう。2D6遺伝子の欠損は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（例えば、非特許文献１，非特許文献２参照）。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
一方、PCR反応を用いて遺伝子欠損を調べる試みも報告されている（例えば、非特許文献３参照）。本方法は、PCR反応後に電気泳動する方法であり簡便である。
またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００５】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に遺伝子欠損の同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難である為に、正確な同定をするには多大な作業が必要であった。
【０００６】
たとえば電気泳動法によれば泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。
また、ＰＣＲ法にて増幅された試料を核酸特異標識により検出する場合、標的以外の増幅も生じ結果としてノイズが高くなるため、正確な検出は困難であった。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。さらには、ＰＣＲ条件の設定が難しかったり、ノイズが多く正確性に欠けたり判別しづらい場合も多かった。
【０００７】
【非特許文献１】
GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, (1990), 第８７〜９６頁
【非特許文献２】
Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻(1989)、第５５１〜５５４頁、
【非特許文献３】
Clin. Chem.46(2000) 第1072-1077頁,
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく遺伝子の一部もしくは全ての欠損、特にはヒトチトクロームＰ４５０２D6遺伝子欠損を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させるいわゆるＰＣＲ法を用いた遺伝子欠損の検出について鋭意検討を行った結果、変性工程に続くアニーリング工程を経ずに伸長工程を行い、これを繰り返し行うことによって、著しく標的以外の増幅を減少させることが可能となることを見出した。
【００１０】
増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。通常のＰＣＲ法は変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すのに対し、実質的に２つの温度範囲を繰り返すことによって遺伝子増幅を行う方法を２stepPCR法とよぶ。
【００１１】
さらに好適には、２ＳｔｅｐＰＣＲを少なくとも２種類以上の温度条件で伸長反応を実施することにより、さらに標的以外の増幅産物を減少させることができる。本方法によって、標的核酸と２種類の特定のオリゴヌクレオチド、４種類のジデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加し、２ＳｔｅｐＰＣＲ法により増幅反応を行い、反応により生じた２本鎖オリゴヌクレオチドの量を測定することで、煩雑な検出操作を必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確なヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損を検出する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法において２StepPCR法を用いることを特徴とする遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（２）遺伝子の一部もしくは全ての欠損が、連続した１０００個以上の欠損であることを特徴とする、（１）に記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（３）遺伝子の一部もしくは全ての欠損がヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（４）ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損が２Ｄ６*５であることを特徴とする（３）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（５）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法として２StepPCR法とPCR法を組合せて行うことを特徴とする（１）〜（４）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（６）２StepPCR法に用いられる酵素が耐熱性ポリメラーゼであることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（７）耐熱性ポリメラーゼがα型ポリメラーゼであることを特徴とする（６）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法。
（８）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法として２StepPCR法を用いることを特徴とする遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（９）遺伝子の一部もしくは全ての欠損が、連続した１０００個以上の欠損であることを特徴とする、（８）に記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１０）遺伝子の一部もしくは全ての欠損がヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損であることを特徴とする（９）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１１）ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損が２D6*5であることを特徴とする（１０）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１２）遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法として２StepPCR法とPCR法を組合せて行うことを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１３）２StepPCR法に用いられる酵素が耐熱性ポリメラーゼであることを特徴とする（８）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
（１４）耐熱性ポリメラーゼがα型ポリメラーゼであることを特徴とする（１３）記載の遺伝子の一部もしくは全ての欠損の検出試薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、遺伝子の一部もしくは全ての欠損を検出する方法である。なお、本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。遺伝子欠損とは、野生型核酸のうち少なくとも数個から数千個のヌクレオチドが失われた核酸のことである。このような遺伝子欠損により遺伝子の活性が失われていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査し、被験者の有する遺伝子の欠損、特にはヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損を検出する方法である。なお、試料中に含まれる目的の遺伝子を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う遺伝子多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。
【００１４】
また、本発明において対象となる遺伝子の欠損長さは特に限定されるものではないが、好ましくは連続して２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上、より好ましくは１０００塩基以上、さらに好ましくは２０００塩基以上のものであることが望ましい。なお、遺伝子欠損長さの上限は、特に限定するものではないが、５０００００塩基以下であることが現実的な面で望ましい。
また、フォワード側プライマーとリバース側プライマーで挟まれた増幅部分の長さは、特に限定されるものではないが、好ましくは１０００塩基以上、より好ましくは2０００塩基以上、さらに好ましくは３０００塩基以上、特に好ましくは５０００塩基以上であることが望ましい。
上限は増幅が可能であれば問題なく、特に限定するものではないが現実的な面で５０００００塩基以下であることが望ましい。
【００１５】
本発明において、オリゴヌクレオチドを作用させる反応とは一般的に、一本鎖に変性した標的核酸に野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドおよび/または欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。また好適には一本鎖に変性させる段階と標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチドを伸長させる段階から構成される２段階反応が繰り返されることが含まれる。
【００１６】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、１３以上さらには１６塩基以上が好ましく、また、３５塩基以下、さらには３０塩基以下が好ましい。
【００１７】
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、オリゴヌクレオチドを作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００１８】
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、１９８９)に記載の方法に従って行うことができる。本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、オリゴヌクレオチドを作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。
【００１９】
遺伝子欠損の検出のためのプライマーは、野生型遺伝子検出用の場合は、フォワード側、リバース側のいずれか（通常はフォワード側）の配列を欠損部分の一部に相補的になるようにし、他方を非欠損部分に相補的になるように設定する。また、変異型遺伝子検出用の場合はフォワード側、リバース側のプライマーを欠損部分を挟むように、非欠損部分に相補的になるように設定する。
【００２０】
しかしながら、ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子欠損、とくに２D6*5の遺伝子欠損においては、数千もの遺伝子配列部分が抜け落ちており、さらには、抜け落ちている部分は一定ではない。
【００２１】
このことから通常プライマーは、安全を見て、抜け落ちる部分の境界部から、離れた位置に設定する。
また、抜け落ちる部分には、他の部分に非常に相同性の高い配列部分があり、正確に目的部分にハイブリダイズさせるためにも、プライマーの設定に制約があった。
このような制約のもとで設定されたプライマーは、フォワード−リバース間隔が長く、４０ｋｂｐ近くにもなることがあった。
【００２２】
その影響か、従来の、変性・アニーリング・伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すＰＣＲ法では、ＰＣＲ条件の取り方が非常に難しかったり、ＰＣＲ反応が出来たとしても、生成物に目的物以外の増幅物が多く、検出時が不明確になったりするものであった。
【００２３】
しかし、２ＳｔｅｐＰＣＲ法を採用することにより、従来の３工程からなるサイクルを繰り返すＰＣＲ法と比較して非常に純度の高いＰＣＲ生成物が得られることが分かり、ＰＣＲ条件の設定の許容度が広がる、正確な判定が可能となるといった大きなメリットが得られることが分かった。また、増幅に必要な時間も短縮することができ、臨床用途などで短時間で検出が必要となる場合にも大きなメリットがあることが分かった。
【００２４】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、欠損型では反応が起きない。逆に、欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が欠損型であれば反応が起きるが、野生型であれば鋳型核酸が長すぎるため反応は起こらない。
【００２５】
従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか欠損型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、欠損型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と欠損型遺伝子が共に存在するから野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００２６】
本発明の方法により、野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドであっても変異型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドであっても同一の条件下でもＰＣＲ増幅を行うことができ、両方を同時に同条件下でＰＣＲ増幅させることができる。
【００２７】
また、オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出する方法とは、特定の塩基配列を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型遺伝子検出用オリゴヌクレオチドと及び１種又は２種の欠損型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、2本鎖核酸特異的結合物質と反応させることによって前記増幅反応により生じたオリゴヌクレオチド量を検出できる。
【００２８】
さらに、上記検出方法としては、標識したオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子欠損の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
【００２９】
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、³²Ｐ、³⁵Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
【００３０】
また、核酸特異標識を用いることも可能である。核酸特異標識としては様々なものが挙げられるが、２本鎖核酸特異標識が好ましく、具体的には、アクリジン染料、例えばアクリジン・オレンジ、フェナンスリジン、エチジウム、アントラサイクリン、アドリアマイシン、フェナジン、フロクマリン、フェノチアジン、キノリンおよびこれらの誘導体、エチレンブロマイド、SYBR GreenＩなどが挙げられる。
【００３１】
該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５' 部位である。野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を添加して、１つの反応槽で検出ができる。
【００３２】
二本鎖形成反応に用いられる酵素は核酸を増幅させる作用があれば特に限定されるものではないが、Taq、TTh、Pfu、KOD等のDNAポリメラーゼが用いられる。これらDNAポリメラーゼは野生株由来の他に一部が組換えられたもの、あるいは欠失、化学的、生物的に修飾されたものも含まれる。好適にはα型ポリメラーゼの使用が好ましい。
【００３３】
また、本発明の２stepＰＣＲ法により、従来のＰＣＲで用いられていた反応を促進させたり副反応を抑制する添加剤を添加することなく、比較的長い範囲の遺伝子欠損を正確に検出することができるが、添加剤を加えても良い。添加剤を加えることにより、さらに適正なＰＣＲ条件が広くとれたり、反応の促進、副反応の抑制が可能である。
添加剤の例としては、クエン酸、イソクエン酸、フマル酸、コハク酸、シュウ酸、マレイン酸、無水マレイン酸、ギ酸、酢酸などの多価カルボン酸類またはその塩類、プロピオン酸、オレイン酸、オクタン酸、リノール酸、リノレン酸等の有機酸類またはその塩類、DMSO等の有機溶媒、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンに代表されるベタインや４級アミン類が挙げられるが、これらに限定されることなく検出を阻害するものでなければ用いることができる。
【００３４】
キット
本発明において、キットとしては、野生型遺伝子用オリゴヌクレオチド及び／又は欠損型遺伝子検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むヒトチトクローム2D6遺伝子欠損検出用試薬キットを含むものである。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。さらに、反応を促進させたり副反応を抑制する添加剤を実質的に添加することなくキットとしても良いし、添加剤を加えていてもかまわない。
【００３５】
キットとしては、包装形式は特に制限を加えるものではないが、反応容器内にそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、塩類など、試料以外の増幅に必要なものがすべて溶解された状態か、もしくは一定量の水を加えるのみで後は試料を加えるだけの反応液となる状態であることが好ましい。オリゴヌクレオチドやリバースプライマーは別包装されているものであっても良い。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１ CYP2D6遺伝子欠損の検出
（１） CYP2D6 遺伝子の野生型および欠損型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜4に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜2と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシアバイオテク（株）等）に依頼した。
オリゴ１、2を組み合わせて野生型遺伝子検出用のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ2、3を組合せて変異型検出用のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ1、2、3は必要により標識して使用される。
（２） CYP2D6 遺伝子欠損の解析
▲１▼ DNAポリメラーゼを用いた増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトチトクロームＰ４５０CYP2D6遺伝子欠損を解析した。
【００３８】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
KOD DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ１および/または2 5 pmol
オリゴ3および/または2 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgSO₄ 1.5 μl
KOD DNAポリメラーゼ 1Ｕ
抽出DNA溶液 100 ng
【００３９】
増幅条件
95℃・5分
98℃・10秒、X℃・3分30秒（5サイクル）Xを72→70
98℃・10秒、69℃・3分30秒（25サイクル）
68℃・2分。
【００４０】
▲２▼ 核酸特異的結合物質による検出
▲１▼の増幅反応液3μｌを5000倍に希釈されたSyberGreenＩ（Molecular Probe製）の溶液100μlに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約5分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
FL（試料の蛍光強度）＝FLb-FLs （式１）
FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度
FLｓ：各試料の蛍光強度
【００４１】
【表１】

【００４２】
上記のように、オリゴヌクレオチドを用いて、塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応物質を核酸特異的結合物質を用いて測定することで、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。
【００４３】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られた。
【配列表】

【００４４】

【００４５】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method and a detection reagent for detecting a partial or complete deletion of a gene present in a sample, and particularly to a method and a detection reagent for detecting a human cytochrome 2D6 gene deletion.
[0002]
[Prior art]
In the present invention, gene deficiency means having a sequence in which several to several thousand bases of the wild type base sequence are lost. The deficiency of 2D6 gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism, and is also known as a cause of individual differences such as basal metabolism known as constitution. Elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical research (see, for example, Non-Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 2).
[0003]
As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences, but requires a great deal of effort to prepare template nucleic acids, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, analysis of nucleic acid sequences, etc. And time is needed. Further, labor can be saved by using a recent automatic sequencer, but there is a problem that an expensive apparatus is required.
[0004]
On the other hand, an attempt to examine a gene defect using a PCR reaction has also been reported (for example, see Non-Patent Document 3). This method is a method of electrophoresis after the PCR reaction and is convenient.
Other methods include Southern blotting, in which amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected using a labeled probe, sandwich hybridization in which detection probe is acted on after capturing with a supplementary probe immobilized on an individual carrier. Laws have been developed.
[0005]
It seems that the amplified nucleic acid is detected by the method as described above, and the genetic defect can be easily identified, but in practice, the operation is complicated and it is difficult to quantify the detected value. A great deal of work was required for accurate identification.
[0006]
For example, according to electrophoresis, it is difficult to accurately quantify the amount of nucleic acid from an electrophoretic image.
In addition, when a sample amplified by the PCR method is detected with a nucleic acid-specific label, amplification other than the target occurs, resulting in high noise, and accurate detection is difficult. Further, Southern blotting and sandwich hybridization require a hybridization reaction with a probe, and the conditions must be strictly adjusted. Furthermore, a process for removing excess probes is required, and the operation is very complicated. Furthermore, there are many cases where it is difficult to set PCR conditions, or there is a lot of noise and the accuracy is low.
[0007]
[Non-Patent Document 1]
Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, (1990), pp. 87-96 [Non-Patent Document 2]
Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 36 (1989), 551-554,
[Non-Patent Document 3]
Clin. Chem. 46 (2000) 1072-1077,
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and to provide a method and reagent for detecting a part or all of a gene defect, particularly a human cytochrome P4502D6 gene defect, clearly and reproducibly. Is to provide.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above circumstances, the present inventors repeat a cycle comprising three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase. As a result of intensive studies on the detection of gene defects using a so-called PCR method that exponentially amplifies the region of the sample nucleic acid sandwiched between the pair of oligonucleotides, the annealing step subsequent to the denaturation step was not performed. It has been found that by performing an extension step and repeating this, amplification other than the target can be significantly reduced.
[0010]
Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. While a normal PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension, a method of performing gene amplification by substantially repeating two temperature ranges is called a two-step PCR method.
[0011]
More preferably, by performing an extension reaction of 2Step PCR under at least two kinds of temperature conditions, amplification products other than the target can be further reduced. By this method, a target nucleic acid, two types of specific oligonucleotides, four types of dideoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) are added, an amplification reaction is performed by the 2Step PCR method, and a double-stranded oligonucleotide generated by the reaction By measuring the amount of the protein, it was possible to easily obtain numerical data without requiring a complicated detection operation. Therefore, a method for detecting a clear human cytochrome P4502D6 gene deficiency was found and the present invention was completed. .
[0012]
That is, the present invention has the following configuration.
(1) A method for detecting a partial or complete deletion of a gene, which comprises using a 2Step PCR method in a method for detecting a partial or complete deletion of a gene.
(2) The method for detecting a partial or complete deletion of the gene according to (1), wherein the partial or complete deletion of the gene is 1000 or more consecutive deletions.
(3) The method for detecting a partial or complete deletion of the gene according to (1), wherein the partial or complete deletion of the gene is a human cytochrome P4502D6 gene deletion.
(4) The method for detecting a partial or complete deletion of the gene according to (3), wherein the human cytochrome P4502D6 gene deletion is 2D6 * 5.
(5) A method for detecting a partial or complete deletion of a gene according to any one of (1) to (4), wherein a 2Step PCR method and a PCR method are combined to detect a partial or complete deletion of a gene. Method.
(6) The method for detecting a partial or complete deletion of the gene according to any one of (1) to (5), wherein the enzyme used in the 2Step PCR method is a thermostable polymerase.
(7) The method for detecting a partial or complete deletion of a gene according to (6), wherein the thermostable polymerase is an α-type polymerase.
(8) A reagent for detecting a partial or complete deletion of a gene, wherein the 2Step PCR method is used as a method for detecting a partial or complete deletion of a gene.
(9) The detection reagent for part or all of the gene according to (8), wherein a part or all of the gene defect is 1000 or more consecutive defects.
(10) The detection reagent for part or all of the gene according to (9), wherein a part or all of the gene defect is a human cytochrome P4502D6 gene defect.
(11) The detection reagent for part or all of the gene according to (10), wherein the human cytochrome P4502D6 gene deficiency is 2D6 * 5.
(12) As a method for detecting a partial or complete deletion of a gene, a combination of the 2Step PCR method and the PCR method is performed. Detection reagent.
(13) The detection reagent for part or all of the gene according to any one of (8) to (12), wherein the enzyme used in the 2Step PCR method is a thermostable polymerase.
(14) The reagent for detecting a partial or complete deletion of a gene according to (13), wherein the thermostable polymerase is an α-type polymerase.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The present invention is a method for detecting partial or complete deletion of a gene. In the present invention, the nucleic acid sequence may be simply referred to as a nucleic acid. A gene defect is a nucleic acid in which at least several to several thousand nucleotides are lost among wild-type nucleic acids. It has been elucidated that the gene activity is lost due to such a gene defect, and the method of the present invention examines whether or not the nucleic acid in the sample has such an expected mutation, This is a method for detecting a gene deficiency possessed by a subject, particularly a human cytochrome P4502D6 gene deficiency. The chromosome or fragment thereof containing the target gene contained in the sample is not particularly limited as long as it is a target nucleic acid including a gene polymorphic site that bears information on the target gene.
[0014]
In addition, the deletion length of the target gene in the present invention is not particularly limited, but is preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, more preferably 1000 bases or more, and still more preferably 2000 continuously. It is desirable that it is more than a base. The upper limit of the gene deletion length is not particularly limited, but it is desirable in practical terms to be 500000 bases or less.
The length of the amplified portion sandwiched between the forward primer and the reverse primer is not particularly limited, but is preferably 1000 bases or more, more preferably 2000 bases or more, and even more preferably 3000 bases or more, Preferably it is 5000 bases or more.
The upper limit is not particularly limited as long as amplification is possible, and is not particularly limited.
[0015]
In the present invention, the reaction that causes an oligonucleotide to act is generally a target nucleic acid denatured into a single strand, a wild type gene detection oligonucleotide and / or a deletion type gene detection oligonucleotide, a reverse oligonucleotide, It includes a reaction in which a deoxynucleoside triphosphate (dNTP) and a DNA polymerase are allowed to act to cause an oligonucleotide extension reaction using a target nucleic acid as a template to synthesize a complementary strand of a nucleic acid sequence. In addition, preferably, a two-step reaction composed of a step of denaturing into a single strand and a step of extending an oligonucleotide using the target nucleic acid as a template is repeated.
[0016]
The length of the oligonucleotide in the present invention is preferably 13 or more, more preferably 16 bases or more, and preferably 35 bases or less, more preferably 30 bases or less.
[0017]
In the present invention, the oligonucleotide extension method can basically be performed using a conventional method. Usually, a target nucleic acid is obtained by allowing an oligonucleotide to act on a chromosome or a fragment thereof containing a specific nucleotide polymorphism site denatured into a single strand together with four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) and a DNA polymerase. An oligonucleotide extends as a template.
[0018]
The extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989). In the present invention, a method for amplifying a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and usually a specific nucleotide polymorphism denatured into a single strand. By using an oligonucleotide together with four types of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase, and reverse primer on a chromosome containing the site or a fragment thereof, the target nucleic acid is used as a template for the forward oligonucleotide and reverse oligonucleotide. Amplified between.
[0019]
For detection of a gene defect, the wild-type gene detection primer is designed so that either the forward side or reverse side (usually the forward side) sequence is complementary to a part of the defective part. Is set to be complementary to the non-deficient part. In the case of mutant gene detection, the forward and reverse primers are set so as to be complementary to the non-deficient part so as to sandwich the defective part.
[0020]
However, in the human cytochrome P4502D6 gene deficiency, particularly 2D6 * 5 gene deficiency, thousands of gene sequence portions are missing, and the missing portions are not constant.
[0021]
For this reason, the normal primer is set at a position away from the boundary of the falling-off portion in view of safety.
In addition, the missing part has a sequence part having very high homology with the other part, and the setting of the primer is restricted in order to accurately hybridize to the target part.
The primer set under such a restriction has a long forward-reverse interval and may be close to 40 kbp.
[0022]
In the conventional PCR method in which the cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension is repeated, it is very difficult to adopt the PCR conditions or the PCR reaction can be performed. There were many amplification products, and the detection time was unclear.
[0023]
However, by adopting the 2Step PCR method, it can be seen that a PCR product having a very high purity can be obtained as compared with the conventional PCR method in which a cycle consisting of three steps is repeated, and the tolerance for setting PCR conditions is increased. It was found that there is a great merit that accurate judgment is possible. In addition, the time required for amplification can be shortened, and it has been found that there is a great merit even when detection is required in a short time for clinical use.
[0024]
In the method using the nucleic acid amplification method as described above, when the sample nucleic acid is extended or amplified using the oligonucleotide for detecting the wild type gene, the reaction occurs if the sample nucleic acid is wild type, but the deletion type Then there is no reaction. Conversely, when a sample nucleic acid is extended or amplified using a defective gene detection oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is defective, but if the sample nucleic acid is wild type, the reaction is caused by the template nucleic acid being too long. Does not happen.
[0025]
Therefore, divide one sample into two parts, one using a wild type gene detection oligonucleotide and the other using a deletion type gene detection oligonucleotide. It is possible to clearly know whether the sample nucleic acid is a wild type or a defective type. In particular, humans and other higher organisms have one gene each derived from the father and one from the mother for each type of gene. According to this method, the sample gene is a wild-type homologue. It is also possible to distinguish whether it is a defective homozygous or both heterozygous. That is, in the case of heterogeneity, both a wild type gene and a defective gene exist, and therefore a reaction occurs both when a wild type gene detecting oligonucleotide is used and when a defective gene detecting oligonucleotide is used.
[0026]
According to the method of the present invention, it is possible to perform PCR amplification under the same conditions for both wild type and mutant gene detection oligonucleotides. Can be made.
[0027]
The method for detecting whether or not an oligonucleotide has reacted is that a nucleic acid sample containing a chromosome or fragment containing a specific base sequence is added to a certain amount of a wild-type gene detection oligonucleotide and one or two kinds of oligonucleotides. After performing the reaction using a defective detection oligonucleotide (corresponding to the forward primer) simultaneously or separately, and reacting with a double-stranded nucleic acid-specific binding substance, the amount of oligonucleotide generated by the amplification reaction is determined. It can be detected.
[0028]
Furthermore, a labeled oligonucleotide can be used as the detection method.
For example, the detection is performed by labeling each oligonucleotide in advance with an enzyme, biotin, fluorescent substance, hapten, antigen, antibody, radioactive substance, luminophore, etc., and then reacting with the labeled oligonucleotide after extension or amplification reaction. By detecting this, it is possible to detect a gene defect. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase.
Examples of the fluorescent material include FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, and Cy5.
[0029]
Examples of haptens include biotin and digoxigenin. Examples of radioactive substances include ³² P and ³⁵ S. Examples of the luminophore include ruthenium.
[0030]
It is also possible to use a nucleic acid specific label. Various nucleic acid-specific labels can be mentioned, but double-stranded nucleic acid-specific labels are preferable. Specifically, acridine dyes such as acridine orange, phenanthridine, ethidium, anthracycline, adriamycin, phenazine, furocoumarin, Examples include phenothiazine, quinoline and derivatives thereof, ethylene bromide, SYBR Green I and the like.
[0031]
The label may be bound to any position of the oligonucleotide as long as it does not affect the extension reaction of the oligonucleotide. A 5 ′ site is preferred. When different labels are used for the wild-type detection oligonucleotide and the mutation-type detection oligonucleotide, both the wild-type detection oligonucleotide and the mutation-type detection oligonucleotide are added to one sample, and one reaction Detection is possible in the tank.
[0032]
The enzyme used for the double-strand formation reaction is not particularly limited as long as it has an action of amplifying nucleic acid, but DNA polymerases such as Taq, TTh, Pfu, and KOD are used. These DNA polymerases include those derived from wild strains, partially recombined, and those that have been deleted, chemically or biologically modified. The use of α-type polymerase is preferred.
[0033]
In addition, the 2-step PCR method of the present invention can accurately detect a relatively long range of gene defects without adding an additive that promotes the reaction used in conventional PCR or suppresses side reactions. However, an additive may be added. By adding an additive, more appropriate PCR conditions can be obtained, reaction can be promoted, and side reactions can be suppressed.
Examples of additives include citric acid, isocitric acid, fumaric acid, succinic acid, oxalic acid, maleic acid, maleic anhydride, formic acid, acetic acid and other polyvalent carboxylic acids or salts thereof, propionic acid, oleic acid, octanoic acid , Organic acids such as linoleic acid and linolenic acid or salts thereof, organic solvents such as DMSO, betaines typified by N, N, N-trimethylglycine, and quaternary amines, but are not limited thereto. Any substance that does not inhibit detection can be used.
[0034]
Kit In the present invention, the kit includes a wild type gene oligonucleotide and / or a defective gene detection oligonucleotide, a reverse oligonucleotide, a DNA polymerase, and four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs). A reagent kit for detecting a human cytochrome 2D6 gene deficiency is included.
Each oligonucleotide may be labeled in advance with an enzyme, biotin, fluorescent substance, hapten, antigen, antibody, radioactive substance, luminophore or the like as described above. Furthermore, it is good also as a kit, without adding the additive which accelerates | stimulates reaction or suppresses a side reaction, and it does not matter even if the additive is added.
[0035]
The packaging format of the kit is not particularly limited, but each wild-type detection oligonucleotide and / or mutant detection oligonucleotide, reverse primer, DNA polymerase, four types of deoxynucleosides are contained in a reaction container. It may be in a state in which everything necessary for amplification other than the sample, such as phosphoric acid (dNTP) and salts, is dissolved, or a reaction solution in which only a sample is added after a certain amount of water is added. preferable. Oligonucleotides and reverse primers may be separately packaged.
[0036]
【Example】
Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0037]
Example 1 Detection of CYP2D6 gene deficiency
(1) Synthesis of oligonucleotide for detecting wild type and defective type of CYP2D6 gene The nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 by the phosphoramidite method using Perkin Elmer DNA synthesizer type 392 Were synthesized (hereinafter referred to as oligos 1-2). The synthesis was carried out according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out overnight with ammonia water at 55 ° C. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, we commissioned DNA synthesis contractors (Nippon Bioservice Co., Ltd., Sawaddy Co., Ltd., GENSET KK, Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.).
Oligo 1 and 2 are combined and used as an oligonucleotide for wild-type gene detection. A combination of oligos 2 and 3 is used as an oligonucleotide for detecting mutants. Oligos 1, 2, and 3 are used after being labeled if necessary.
(2) Analysis of CYP2D6 gene deficiency (1) Amplification reaction using DNA polymerase Using a DNA solution extracted from human leukocytes by the phenol / chloroform method as a sample, the following reagents were added, and human cytochrome P450CYP2D6 under the following conditions: Gene deletion was analyzed.
[0038]
Reagents A 25 [mu] l solution containing the following reagents was prepared.
KOD DNA polymerase reaction oligo 1 and / or 25 pmol
Oligo 3 and / or 25 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgSO ₄ 1.5 μl
KOD DNA polymerase 1U
Extracted DNA solution 100 ng
[0039]
Amplification conditions
95 ℃, 5 minutes
98 ° C · 10 seconds, X ° C · 3 minutes 30 seconds (5 cycles) X → 72 → 70
98 degrees Celsius, 10 seconds, 69 degrees Celsius, 3 minutes 30 seconds (25 cycles)
68 ℃ for 2 minutes.
[0040]
(2) Detection with a nucleic acid-specific binding substance Add 3 μl of the amplification reaction solution of (1) to 100 μl of a solution of SyberGreen I (Molecular Probe) diluted 5000 times, stir at room temperature, and then in a dark room with a fluorescent plate reader ( The amount of fluorescence intensity was measured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. The time required was about 5 minutes.
From the obtained fluorescence intensity, the amount of fluorescence intensity of the sample was calculated using the following calculation formula.
FL (fluorescence intensity of sample) = FLb-FLs (Formula 1)
FLb: Negative Control (no sample added) fluorescence intensity
FLs: fluorescence intensity of each sample
[Table 1]

[0042]
As described above, a nucleotide polymorphism-specific amplification reaction is performed using an oligonucleotide, and the amplification reaction substance is measured using a nucleic acid-specific binding substance, so that the genotype is clearly and easily determined I was able to.
[0043]
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a method that can clearly and easily detect a gene polymorphism in a sample nucleic acid. Since the method of the present invention does not require a complicated operation as in the conventional methods, results with good reproducibility were obtained quickly and easily.
[Sequence Listing]

[0044]

[0045]

Claims

In a method for detecting 2D6 * 5 which is deficient in human cytochrome P4502D6 gene by a PCR method comprising two steps of a denaturation step and an annealing and extension reaction step , an annealing step using an α-type thermostable polymerase The method is characterized in that the temperature of the is changed from high temperature to low temperature.