【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，化学物質の二次元分離機構及びその装置に関する。
【従来の技術】
【０００２】
数千種類以上の性質の似通った化学物質の混合物を個別の物質に分離する場合，一回の電気泳動やクロマトグラフィーなどでは分離性能に限界があるため，しばしば，分離条件や分離原理の異なる二つの分離方法を組み合わせた二次元分離法が用いられる。
【０００３】
二次元分離法の中で良く知られているのは，タンパク質混合物の分離を目的とした方法で，ゲルプレートを用い，等電点電気泳動とＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を組み合わせた二次元電気泳動法である。この他にも，多段の液体クロマトグラフィーや，マイクロチップを利用したミセル導電クロマトグラフィーと電気泳動の組み合わせによる疑似二次元分離法なども知られている。
【０００４】
しかし，上記の方法は，装置が大掛かりになる，あるいは，煩雑な操作が必要で再現性が低い，あるいは，目的に応じた分離方法の変更が容易ではないなどの問題点がある。また，疑似的な二次元分離法は，性質の似通ったタンパク質の分離などには分離の解像度を十分に高くすることが難しいという問題点もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，従来の技術の有する上記のような種々の問題点に鑑みてなされたものであり，その目的とするところは，新規な原理を用いた化学物質の二次元分離機構及びその装置を提供することで，さらに，目的に応じた分離条件・分離原理の変更が比較的容易である，再現性が高く，迅速で，自動化も容易に行うことのできる，二次元分離機構及びその装置を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために，本発明では，液体クロマトグラフィーによる分離と，電場を利用した分離を直列に接続した二次元分離機構及びその装置を提案する。
【０００７】
図１には，本発明の原理を説明するための概念説明図が示されている。本発明のうち請求項１に記載の発明は，液体クロマトグラフィーにより分離され，液体クロマトグラフィーのカラムから溶出した物質を，クロマトグラフィーのカラムに直列に接続され，流れと垂直な方向に電場を印加した流路Ａに導入し，流れと垂直な方向に分離する，というものである。
【０００８】
したがって，本発明のうち請求項１に記載の発明によれば，導入された化学物質の混合物は，一次元目のクロマトグラフィーによって分離されることにより個々に異なる時間で溶出し，二次元目で電気によって分離されることにより流れと垂直な方向に異なる位置で流出する。このことにより，時間と位置による二次元な分離を行うことができる。
【０００９】
なお，分離された物質の検出あるいは回収の場所は，図１に示すように，流路Ａの出口もしくはその近傍にあり，流れと垂直な線上に選ぶことできる。分析の方法としては，光学的検出，電気化学的検出，マススペクトロメトリー等を用いることができる。
【００１０】
また，この方法においては，クロマトグラフィー及び電気による分離に関して，いくつかの異なる原理を自由に選択することができる。クロマトグラフィーの例としては，ゲル濾過クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー，疎水クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー等を用いることができ，電気泳動の例としては，ゲル電気泳動，等電点電気泳動，ミセル導電クロマトグラフィー等を用いることができる。
【００１１】
また，本発明のうち請求項２に記載の発明は，流路Ａにおいて緩衝液等により流れと垂直な方向にｐＨの勾配を持たせたものである。
【００１２】
したがって，本発明のうち請求項２に記載の発明によれば，印加する電圧によって物質はその等電点に等しいｐＨの地点に移動するため，流路Ａにおいて等電点電気泳動を行うことが可能になる。この方法は，タンパク質の分離・分析おいて，特に有用である。
【００１３】
また，本発明のうち請求項３に記載の発明は，二次元目の電気による分離法をマイクロメートルからミリメートルのスケールで行うものである。
【００１４】
したがって，本発明のうち請求項３に記載の発明によれば，微少なスケールの効果により流路Ａにおける流れを安定的に層流に保つことができるため，二次元目に作成されたｐＨ勾配が安定に保持され，分離性能を向上させることができる。また，移動距離を短縮することができるため，僅かな電圧によっても迅速な分離が可能となる。
【００１５】
また，本発明のうち請求項４に記載の発明は，図１における流路Ａとして，マイクロチップ上に加工することによって作成したマイクロチャネルを用いる方法である。
【００１６】
したがって，本発明のうち請求項４に記載の発明によれば，流路Ａの幅，深さ，長さ，また印加電圧，滞留時間を正確にコントロールすることが可能となり，また，本発明のうち請求項３に記載の発明を容易に実現することが可能となる。
【００１７】
また，本発明のうち請求項５に記載の発明は，流路Ａと，クロマトグラフィーのカラムを同一のマイクロチップ上に加工する，というものである。
【００１８】
したがって，本発明のうち請求項５に記載の発明によれば，二次元分離機構のための装置を，正確に，かつ容易に作成することが可能となり，また，クロマトグラフィーと電気による分離法の間のデッドスペースを小さくすることが可能となるため，より性能の高い二次元分離を行うことが可能となる。
【００１９】
また，本発明のうち請求項６に記載の発明は，本発明のうち請求項５に記載の，クロマトグラフィーのカラムと流路Ａのみならず，試料導入構造あるいは溶出液の組成を調整するための液体を混合するための構造を同一のマイクロチップに加工する，というものである。
【００２０】
したがって，本発明のうち請求項６に記載の発明によれば，二次元分離に必要な装置を全て同一のマイクロチップに加工することで，操作の統合が可能となり，再現性の良い分離方法が可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下，添付の図面に基づいて，本発明による化学物質の二次元分離機構の実施の形態を詳細に説明するものとする。
【００２２】
図２（ａ）（ｂ）には，本発明による二次元分離機構の実施の形態を備えたマイクロチップが示されており，図２（ａ）は図２（ｂ）におけるＡ矢視図であり，図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。
【００２３】
このマイクロチップ１０は，イオン交換クロマトグラフィーと等電点電気泳動による二次元分離を行うためのマイクロチップであり，例えば，ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの高分子（ポリマー）材料によって形成された，２枚の平板状の基板１１と１２により形成されている。
【００２４】
そして，基板１１の下面１１ａと基板１２の上面１２ａには，それぞれ深さの異なるマイクロチャネルが形成されており，その深さは例えば，それぞれ１０μｍ，１５０μｍ程度である。
【００２５】
ポート１３，１４は，それぞれ異なるイオン濃度をもつ緩衝液の入口であり，それぞれの流量を変化させ，マイクロミキサー１５を通過させることにより，クロマトグラフィーにおける溶離液のイオン濃度に勾配を持たせることが可能になる。
【００２６】
ポート１６はクロマトグラフィー担体とサンプルの入口であり，ここから導入された担体は，フリット構造１８において，その深さが担体の直径よりも小さいために堰き止められ，クロマトグラフィーのカラム１７に長さ数ｍｍ程度充填される。なお，クロマトグラフィー担体としては，例えばファルマシア社製ＳＯＵＲＣＥＴＭ３０Ｑアニオン交換ビーズなどを用いることができる。
【００２７】
ポート１９，２０，２１，２２はそれぞれ異なるｐＨをもつ緩衝液の入口であり，二次元目の等電点電気泳動のための流路２３内に，流れと垂直な方向にｐＨ勾配を持たせることができる。
【００２８】
なお，流路２３のサイズは，例えば幅１０００μｍ，深さ１５０μｍ，長さ１５ｍｍであり，この中での滞留時間を約４５秒程度にした場合，流れは乱れることなく安定に層流を保つため，ｐＨ勾配は乱れることなく維持される。
【００２９】
２４，２５は電極であり，例えば，幅０．５ｍｍ，長さ１．５ｍｍのＰｄ板などを用いることができる。
【００３０】
２６，２７のポートは，外部電源と電極を結ぶためのポートであり，導電性カーボンペーストなどを充填することができる。
【００３１】
２８は観察する位置を線状に示したものであり，この線上において，光学的検出などを行うことができる。
【００３２】
ポート２９は，マイクロチップに導入された緩衝液やサンプル溶液などの出口である。
【００３３】
以上の構成において，上記したマイクロチップ１０を用いた二次元分離機構について，タンパク質の分離を例に取って説明する。
【００３４】
まず，あらかじめタンパク質の吸着を防ぐために，酸素プラズマによる処理を施し，引き続いて，クロマトグラフィーのカラム１７に，クロマトグラフィーの担体を導入しておく。
【００３５】
次に，ポート１３，１４から，イオン濃度が異なり，ｐＨが同じ緩衝液をそれぞれ一定の流量になるように導入し，同時に，ポート１９，２０，２１，２２からｐＨが異なる液体をそれぞれ一定の流量になるように導入する。この時，電極２４を正極，電極２５を負極とする場合には，導入する緩衝液のｐＨは，低い順に，２０＜１９＜１３＝１４＜２１＜２２である。
【００３６】
次に，サンプル溶液をポート１６から導入し，タンパク質をクロマトグラフィーのカラム１７中の担体に吸着させる。なお，ポート１６は，サンプル導入時以外には，緩衝液が漏れ出ることを防ぐために閉鎖する。
【００３７】
ポート１３，１４から導入する緩衝液の流量の比率を，段階的に変化させることで，クロマトグラフィーのカラム１７における緩衝液のイオン濃度を変化させると共に，電極２４，２５の間に電圧を印加する。
【００３８】
検出ポイント２８付近を経時的に顕微鏡とＣＣＤカメラなどを用いて観察することで，一次元目をクロマトグラフィーでの溶出時間，二次元目を検出ポイント２８に沿った位置としたタンパク質の二次元分離を検出する。
【００３９】
実際に，上記の二次元分離機構において，蛍光標識されたタンパク質ＢＳＡとＩｇＧを，数分程度で，二次元的に分離することに成功している。
【００４０】
【発明の効果】
本発明は，以上説明したような機構に基づいているため，目的に応じた分離方法の選択が可能であるという優れた効果を奏する。
【００４１】
また，本発明は，以上説明したような機構に基づいているため，再現性の向上，分析時間の短縮，操作の簡便化などの優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を説明するための概念説明図である。
【図２】本発明による二次元分離機構の実施の形態を備えたマイクロチップを示し，図２（ａ）は図２（ｂ）におけるＡ矢視図であり，図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。
【符号の説明】
１０ マイクロチップ
１１ 基板
１１ａ 基板１１下面
１２ 基板
１２ａ 基板１２上面
１３ ポート
１４ ポート
１５ ミキサー
１６ ポート
１７ カラム
１８ フリット構造
１９ ポート
２０ ポート
２１ ポート
２２ ポート
２３ 流路
２４ 電極
２５ 電極
２６ ポート
２７ ポート
２８ 検出ポイント
２９ ポート[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a two-dimensional separation mechanism for chemical substances and an apparatus therefor.
[Prior art]
[0002]
When a mixture of thousands or more of similar chemical substances is separated into individual substances, separation performance is often limited by single electrophoresis or chromatography. A two-dimensional separation method combining two separation methods is used.
[0003]
A well-known two-dimensional separation method is a method for separating protein mixtures, which uses gel plates and combines isoelectric focusing and SDS polyacrylamide electrophoresis. It is. In addition, a multi-stage liquid chromatography, a quasi two-dimensional separation method using a combination of micelle conduction chromatography using a microchip and electrophoresis, and the like are also known.
[0004]
However, the above-mentioned method has problems that the apparatus becomes large-scale, complicated operations are required, the reproducibility is low, and it is not easy to change the separation method according to the purpose. In addition, the pseudo two-dimensional separation method has a problem that it is difficult to sufficiently increase the resolution of separation for separation of proteins having similar properties.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned various problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a two-dimensional chemical substance separation mechanism and a device using a novel principle. In addition, the provision of a two-dimensional separation mechanism and its equipment, which makes it easy to change the separation conditions and separation principle according to the purpose, has high reproducibility, is quick, and can be easily automated. To provide.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention proposes a two-dimensional separation mechanism in which separation by liquid chromatography and separation using an electric field are connected in series, and an apparatus therefor.
[0007]
FIG. 1 is a conceptual explanatory diagram for explaining the principle of the present invention. According to the first aspect of the present invention, a substance separated by liquid chromatography and eluted from a liquid chromatography column is connected in series to the chromatography column, and an electric field is applied in a direction perpendicular to the flow. Is introduced into the flow path A and separated in a direction perpendicular to the flow.
[0008]
Therefore, according to the first aspect of the present invention, the mixture of the introduced chemical substances is eluted at different times by being separated by the first-dimensional chromatography, and is eluted at different times. By being separated by electricity, it flows out at a different position in the direction perpendicular to the flow. This allows two-dimensional separation by time and position.
[0009]
As shown in FIG. 1, the location for detecting or collecting the separated substance is at or near the outlet of the flow channel A, and can be selected on a line perpendicular to the flow. As a method of analysis, optical detection, electrochemical detection, mass spectrometry and the like can be used.
[0010]
Also, in this method, several different principles can be freely selected with regard to chromatography and electrical separation. Examples of chromatography include gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and the like. Examples of electrophoresis include gel electrophoresis, isoelectric point Electrophoresis, micellar conductivity chromatography and the like can be used.
[0011]
According to the second aspect of the present invention, a pH gradient is provided in the channel A in a direction perpendicular to the flow by a buffer solution or the like.
[0012]
Therefore, according to the second aspect of the present invention, the substance moves to the point of pH equal to its isoelectric point by the applied voltage, so that the isoelectric focusing in the channel A can be performed. Will be possible. This method is particularly useful for separating and analyzing proteins.
[0013]
According to a third aspect of the present invention, the second-dimensional electric separation method is performed on a scale from micrometers to millimeters.
[0014]
Therefore, according to the third aspect of the present invention, since the flow in the flow path A can be stably maintained in a laminar flow due to the effect of the minute scale, the pH gradient formed in the second dimension can be maintained. Is stably maintained, and the separation performance can be improved. Further, since the moving distance can be shortened, quick separation is possible even with a small voltage.
[0015]
The invention according to claim 4 of the present invention is a method using a microchannel created by processing on a microchip as the flow channel A in FIG.
[0016]
Therefore, according to the fourth aspect of the present invention, the width, depth, and length of the flow path A, the applied voltage, and the residence time can be accurately controlled. Of these, the invention described in claim 3 can be easily realized.
[0017]
The invention according to claim 5 of the present invention is that the channel A and the chromatography column are processed on the same microchip.
[0018]
Therefore, according to the fifth aspect of the present invention, a device for a two-dimensional separation mechanism can be accurately and easily prepared, and the separation method using chromatography and electricity can be used. Since the dead space between them can be reduced, two-dimensional separation with higher performance can be performed.
[0019]
The invention according to claim 6 of the present invention is for adjusting not only the chromatography column and the flow path A but also the sample introduction structure or the composition of the eluate according to claim 5 of the present invention. The structure for mixing the liquids is processed into the same microchip.
[0020]
Therefore, according to the sixth aspect of the present invention, by integrating all the devices required for two-dimensional separation into the same microchip, the operation can be integrated, and a separation method with good reproducibility can be realized. It becomes possible.
[0021]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of a two-dimensional chemical substance separation mechanism according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
[0022]
2 (a) and 2 (b) show a microchip provided with an embodiment of a two-dimensional separation mechanism according to the present invention, and FIG. 2 (a) is a view taken in the direction of arrow A in FIG. 2 (b). FIG. 2B is a sectional view taken along line BB in FIG. 2A.
[0023]
The microchip 10 is a microchip for performing two-dimensional separation by ion exchange chromatography and isoelectric focusing, and is formed of, for example, a polymer material such as PDMS (polydimethylsiloxane). It is formed by two flat substrates 11 and 12.
[0024]
Microchannels having different depths are formed on the lower surface 11a of the substrate 11 and the upper surface 12a of the substrate 12, and the depths thereof are, for example, about 10 μm and 150 μm, respectively.
[0025]
The ports 13 and 14 are inlets for buffer solutions having different ion concentrations, respectively. By changing the flow rates of the buffers and passing them through the micromixer 15, it is possible to give a gradient to the ion concentration of the eluent in the chromatography. Will be possible.
[0026]
The port 16 is an inlet for the chromatography carrier and the sample, and the carrier introduced therefrom is blocked in the frit structure 18 because its depth is smaller than the diameter of the carrier, and the length is added to the chromatography column 17. It is filled by several mm. In addition, as the chromatography carrier, for example, SOURCE ™ 30Q anion exchange beads manufactured by Pharmacia can be used.
[0027]
Ports 19, 20, 21, and 22 are inlets for buffer solutions having different pHs, and have a pH gradient in a direction perpendicular to the flow in a flow path 23 for the second-dimensional isoelectric focusing. be able to.
[0028]
The size of the flow path 23 is, for example, 1000 μm in width, 150 μm in depth, and 15 mm in length. When the residence time in the flow path is about 45 seconds, the flow is stably maintained without being disturbed. , The pH gradient is maintained without disturbance.
[0029]
Reference numerals 24 and 25 denote electrodes, for example, a Pd plate having a width of 0.5 mm and a length of 1.5 mm can be used.
[0030]
Ports 26 and 27 are ports for connecting electrodes to an external power supply, and can be filled with a conductive carbon paste or the like.
[0031]
Numeral 28 indicates a position to be observed in a linear shape, and optical detection or the like can be performed on this line.
[0032]
The port 29 is an outlet for a buffer solution or a sample solution introduced into the microchip.
[0033]
In the above configuration, a two-dimensional separation mechanism using the above-described microchip 10 will be described by taking protein separation as an example.
[0034]
First, a treatment with oxygen plasma is performed in advance to prevent protein adsorption, and subsequently, a chromatography carrier is introduced into the chromatography column 17.
[0035]
Next, buffer solutions having different ion concentrations and the same pH are introduced from ports 13 and 14 so as to have a constant flow rate, and at the same time, liquids having different pH values are introduced from ports 19, 20, 21 and 22 respectively. Introduce the flow rate. At this time, when the electrode 24 is a positive electrode and the electrode 25 is a negative electrode, the pH of the buffer solution to be introduced is 20 <19 <13 = 14 <21 <22 in ascending order.
[0036]
Next, the sample solution is introduced from the port 16 and the protein is adsorbed to the carrier in the chromatography column 17. The port 16 is closed to prevent the buffer solution from leaking except when the sample is introduced.
[0037]
By changing the flow rate ratio of the buffer solution introduced from the ports 13 and 14 stepwise, the ion concentration of the buffer solution in the chromatography column 17 is changed, and a voltage is applied between the electrodes 24 and 25. .
[0038]
By observing the vicinity of the detection point 28 over time using a microscope and a CCD camera, etc., two-dimensional separation of proteins with the elution time in chromatography as the first dimension and the position along the detection point 28 as the second dimension Is detected.
[0039]
In fact, the two-dimensional separation mechanism described above successfully succeeds in two-dimensionally separating the fluorescently labeled proteins BSA and IgG in a matter of minutes.
[0040]
【The invention's effect】
Since the present invention is based on the mechanism as described above, it has an excellent effect that a separation method can be selected according to the purpose.
[0041]
In addition, the present invention is based on the mechanism as described above, and thus has excellent effects such as improvement of reproducibility, reduction of analysis time, and simplification of operation.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual explanatory diagram for explaining the principle of the present invention.
2A and 2B show a microchip provided with an embodiment of a two-dimensional separation mechanism according to the present invention, wherein FIG. 2A is a view taken in the direction of arrow A in FIG. 2B, and FIG. It is sectional drawing by the BB line in (a).
[Explanation of symbols]
Reference Signs List 10 microchip 11 substrate 11a substrate 11 lower surface 12 substrate 12a substrate 12 upper surface 13 port 14 port 15 mixer 16 port 17 column 18 frit structure 19 port 20 port 21 port 22 port 23 flow path 24 electrode 25 electrode 26 port 27 port 28 detection point 29 ports
