JP2004144752A - 金属層を用いた化学的アレイアセンブリとの結合 - Google Patents

Abstract

　【課題】　表面が変性された基体の製造方法の提供。この基体は金属層を含み、基体の表面に対し異なるアレイ特徴でもって結合された多数のプローブのアレイを製造するのに有用である。
　【解決手段】　表面に官能基が配置された基体を準備する。この表面はリンカー分子に接触され、リンカー分子の各々は、表面に配置された官能基との反応後にリンカー分子を表面に結合させる基を有する。この反応は、金属層を攻撃する反応物質を生成しない。アレイを製造するには、表面はプローブ又はプローブ前駆体と接触され、プローブ又はプローブ前駆体を表面に結合されたリンカー分子と結合させる。
【選択図】　図５

Description

　本発明は、診断、スクリーニング、形質発現分析、及びその他の用途に有用な、ポリヌクレオチドアレイ（例えばＤＮＡアレイ）の如きアレイに関する。

　以下の記述において、また本明細書全体を通じて、種々の文献が引用されることになるが、本出願に対しては、先行技術として認められる引用文献はない。

　ポリヌクレオチドアレイや蛋白質アレイ（例えばＤＮＡ又はＲＮＡアレイ）の如き化学的アレイは公知であり、また例えば診断ツールやスクリーニングツールとして使用されている。ポリヌクレオチドアレイは、基体上に所定の構成で配置された、通常は異なる配列を有するポリヌクレオチドの領域を含む。これらの領域（「特徴」と呼ぶ場合もある）は、基体上のそれぞれの位置（「アドレス」）に配置されている。アレイは、試料に曝露されると、ある観察結合パターンを示す。この結合パターンは、アレイを読み取る際に検出可能である。例えば、試料中の全てのポリヌクレオチド標的（例えばＤＮＡ）を適当なラベル（蛍光化合物のような）で標識し、試料に曝露した後、アレイ上の蛍光パターンを正確に観察することが可能である。異なる配列のポリヌクレオチドが所定の構成に従って正確に配置されていたものと仮定すると、観察結合パターンは、試料中の１つ又はより多くのポリヌクレオチド成分の存在及び／又は濃度を表すことになる。

　バイオポリマーアレイは、予め得られた（合成又は天然原料から）バイオポリマーを基体上に付着させるか、又はin situ合成法によって製造可能である。得られたバイオポリマーを付着させる方法には、特許文献１に記載のように、ピン又は毛細管を充填して表面に接触させること、或いは特許文献２及び３その他に記載のように、インクジェットヘッドのようなパルスジェットからの噴射により付着させること等がある。こうした付着方法は、１サイクルの付着によって特徴の各々を形成するものと考えることができる（即ち、予め得られたバイオポリマーを基体に付着させるサイクルは、各特徴毎に１つだけである）。in situ製造法の場合は、最終的な特徴を形成するため、パルスジェット又は他の手段によって、ある所与の標的位置に複数の異なる試薬の液滴が付着される（従って特徴のプローブは、アレイ基体上で合成される）。in situ製造法には、特許文献４に記載のような、ペプチドアレイを合成するための方法、及び特許文献３、５及びそれらの中で引用されている文献に記載のような、ポリヌクレオチドアレイを合成するための方法があり、またパルスジェットを用いて試薬を付着させることも可能である。ポリヌクレオチドアレイを製造するためのin situ法は一般に、特徴が形成されることになる多数の異なるアドレスのそれぞれにおいて、既知の化学反応によって支持体上のヌクレオシド試薬からポリヌクレオチドを形成するのに用いられるのと同じ、従来の反復手順に従う。この反復手順は、形成される特徴の各々における以下の（ａ）から（ｄ）の付着サイクルが多数回行われるものと考えることができる。即ち、（ａ）選択された活性化ヌクレオシド（単量体単位）をホスファイト結合によって、最初の反復では官能化された支持体に結合し、後続の反復では基体に結合されたヌクレオシド（即ち、ヌクレオシド変性基体）に結合する。（ｂ）任意選択的に、基体に結合されたヌクレオシド上の未反応ヒドロキシル基をブロックする（「キャッピング」と呼ぶ場合もある）。（ｃ）ステップ（ａ）のホスファイト結合を酸化して、ホスフェート結合を形成する。そして（ｄ）ステップ（ａ）での結合により基体に結合されているヌクレオシドから保護基を外して（「脱保護」）、同様のステップからなる次のサイクルのための反応部位を生じさせる。結合は、アレイのための特定の所望の特徴位置に、アクチベータ及びホスホアミダイトの液滴を付着させることによって行わせることができる。最後の脱保護ステップでは、窒素性塩基及びホスフェート基が、既知の条件下において、水酸化アンモニウム及び／又はメチルアミンを用いた処理によって同時に脱保護される。キャッピング、酸化、及び脱保護は、適切な試薬の層で基体全体を処理する（「フラッディング」）ことによって実施可能である。官能化された支持体（最初のサイクル）又は脱保護された結合ヌクレオシド（後続サイクル）によって、ステップ（ａ）で次に結合されるヌクレオシドとのホスファイト結合を形成するための結合（リンク）基が、基体結合部分に提供される。最後のヌクレオシド塩基の脱保護は、既知の仕方で別のフラッディング手順でもって、水酸化アンモニウムのようなアルカリ性条件を用いて達成可能である。従来は、単一のパルスジェットその他のディスペンサが、単一の単量体単位を付着させるために割り当てられている。

　ポリヌクレオチドを合成するための上述の化学反応は、例えば非特許文献１、２、３、及び４、特許文献６、７、８、９、及び１０その他に詳細に記載されている。ホスホアミダイト法及びホスファイトトリエステル法が最も広く用いられているが、他の手法として、ホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、及びＨ−ホスホネート法がある。基体は通常、最初に付着される単量体に結合するように官能化されている。こうしたリンク部分で基体を官能化するのに適した技法については、例えば非特許文献５に記載がある。アレイ製造の場合には、何れかの１サイクルの間に、基体上の異なるアドレスに異なる単量体及びアクチベータを付着させることによって、完成したアレイの異なる特徴が異なる所望のバイオポリマー配列を備えるようにすることができる。各サイクルについて、ポリヌクレオチドアレイのin situ製造の場合の従来の酸化、キャッピング、及び洗浄ステップのような、１つ又はより多くの中間ステップがさらに必要な場合がある（やはりこれらのステップは、フラッディング手順で実施可能である）。

　予め得られたバイオポリマーの付着、又はin situ法によるバイオポリマーアレイの製造に関するさらなる詳細については、特許文献３、１１、１２、及び１３に記載がある。予め得られたバイオポリマーの付着又はin situ法によってアレイを製造する場合一般に、アレイがこれから形成される、又は既に形成された基体表面上の各領域（「アレイ領域」）は、１つ又はより多くの試薬に完全に曝露される。例えば何れの方法でも、アレイ領域は多くの場合１つ又はより多くのリンカー組成物に曝露され、基体とバイオポリマー又はバイオモノマーの両方に結合する適切なリンカー層が表面上に形成される。in situ製造の場合には、アレイ領域はまた一般に、酸化試薬、脱ブロッキング試薬、及び任意選択的なキャッピング試薬に曝露される。同様に、特に予め得られたバイオポリマーの付着による製造の場合、適当なブロッキング試薬にアレイ領域を曝露して、特徴を備えていない表面上の位置が標的と非特異的に結合するのを阻止するのが望ましい。特に有用なリンカー組成物及び方法は、特許文献１４及び１５に開示されている。こうした方法は、トリクロロシラン官能基を用いて、シランを基体に結合させる。
米国特許第５，８０７，５２２号明細書 国際公開第９５／２５１１６号パンフレット 国際公開第９８／４１５３１号パンフレット 米国特許第５，４４９，７５４号明細書 米国特許第６，１８０，３５１号明細書 米国特許第４，４５８，０６６号明細書 米国特許第４，５００，７０７号明細書 米国特許第５，１５３，３１９号明細書 米国特許第５，８６９，６４３号明細書 欧州特許第０２９４１９６号明細書 米国特許第６，２４２、２６６号明細書 米国特許第６，２３２、０７２号明細書 米国特許第６，１７１，７９７号明細書 米国特許第６，３１９，６７４号明細書 米国特許第６，４４４，２６８号明細書 Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５年、第２３０号、ｐ．２８１−２８５ Ｉｔａｋｕｒａ他著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５３号、ｐ．３２３−３５６ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ他著、Ｎａｔｕｒｅ、１９８４年、第３１０号、ｐ．１０５−１１０ Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．著、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ．１００以下 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ．ａｎｄ　Ｅｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９２年、第１３号、ｐ．１００７−１０１７

　アレイ製造において、利用可能なポリヌクレオチドの量は通常極めて少なく、また高価である。加えて、試験に利用可能な試料の量も通常は極めて少なく、従ってアレイ上の多数の異なるプローブによって同じ試料を同時に試験するのが望ましい。こうした条件は、多数の極めて小さく、間隔が密な特徴を備えたアレイの使用を必要とする。例えば、調査光に応答して特徴から放射される光を検出することによってアレイを読み取る場合、特徴から検出される全光信号は極めて弱い可能性がある。この場合に重要なのは、検出される光の強度が、特徴の組成（結合した任意の試料を含む）以外の要因によって影響されないことである。こうした外的な要因は、アレイの特徴から検出される信号を低減させ、またそのアレイについて、或いはアレイ相互の間で、特徴の組成と関係なしに検出信号の変動を生じさせる可能性がある。結果的に生じる検出信号の低減や変動のために、アレイからの結果を誤って解釈することになる可能性がある。

　本発明の目的は、従って、アレイ読み取り中に検出される信号に実質的な低減や外因的変動を生じさせないアレイ基体、及びこうした基体の製造方法を提供することにある。

　本発明者が認識したところでは、金属層を含むアレイ製造用の基体は、リンカー分子を基体表面上に結合する反応中に使用されるような化学的条件に影響されうる。リンカー分子の付着に際しての金属層における望ましくない化学反応、或いはその他の反応に起因する金属層の何らかの変化によって、アレイ内又は異なるアレイ相互間で、反射率が低下したり、反射率が不均一になったりする可能性がある。これは、アレイ特徴から検出される信号に悪影響を及ぼし、実験又は診断試験の結果について誤った解釈を生じさせる可能性がある。例えば、加水分解条件下でトリクロロシランを表面に配置（提示）されたヒドロキシル基と結合（リンク）させると塩酸が生じ、これが次いで、基体の金属層をエッチングする可能性がある。

　そこで本発明はその態様の１つにおいて、変性された表面を有する基体を製造する方法を提供するが、この基体は金属層を含んでいる。この方法は、表面に官能基（ヒドロキシル基のような）が配置された基体を設けるステップを含みうる。この表面はリンカー分子と接触され、リンカー分子の各々は、表面に配置された官能基との反応の後、リンカー分子を表面に結合させる（例えばシリルオキシ基と表面に配置されたヒドロキシル基との反応後にエーテル結合によって）基（シリルオキシ基の如き、例えばシリルエトキシドのようなシリルアルコキシド）を備える。この反応は、金属層を攻撃する反応物質を生じない（例えば酸を生じない）反応とすることができる。基体は、裏面層、表面が配置される表面層、及び裏面層と表面層の間に配置される金属層を含むことができる。表面又は裏面は透明であってよく、例えばプラスチック又はガラス、或いはその他の金属とすることが可能であるが、金属層は例えば、クロムからなる光反射層とすることができる。

　本発明はさらに、金属層を含む基体表面に対して異なるアレイ特徴でもって結合された、バイオポリマーのような多数のプローブのアレイを製造する方法をも提供する。この方法には、本発明の方法に従って表面が変性された基体を製造することが含まれる。この表面にはプローブ又はプローブ前駆体が接触され、このプローブ又はプローブ前駆体は、表面に結合したリンカー分子と結合してアレイが形成される。例えば核酸又はポリアミノ酸のような、種々のタイプのプローブを使用することができる。例えば、プローブがポリマーの場合、多数の異なる特徴位置の各々にプローブ前駆体を繰り返し接触させることからなるin situ合成によって、プローブをその場で表面に生成することができる。或いはまた、完全なプローブ（ポリマー又はそうでない）を表面に付着させることもできる。しかしながらいずれの場合も、表面に付着させられるプローブ又はプローブ前駆体が、接触後に表面結合リンカー分子と結合しないのであれば、最初にまず、リンカー分子の官能基をプローブ又はプローブ前駆体と反応性の官能基に転化させることが必要である。

　本発明の種々の態様によって、下記の及び／又はその他の有用な利点の１又はより多くをもたらすことが可能である。例えば、表面にリンカーを結合するために用いられる化学反応による金属層への悪影響を低減又は回避することが可能である。それにより、表面からの光の反射性が良好で、また均一な反射性を示す基体が得られる。

　理解の便宜に資するため、それが実際的である場合には、図中で共通する同一の要素を指定するために同じ参照番号を用いている。しかしながら図面は、必ずしも縮尺通りのものではない。

　本出願においては、逆の意図が明らかでない限り、以下の用語は下記の特性を表す。「バイオポリマー」とは、１つ又はより多くの種類の繰り返し単位からなるポリマーである。バイオポリマーは一般に、生物系に見出され、特に多糖類（炭水化物の如き）、ペプチド（この用語はポリペプチド、及び多糖類に付着しているか否かにかかわらず蛋白質を含むものとして用いる）、及びポリヌクレオチド、並びにアミノ酸類似体又は非アミノ酸群或いはヌクレオチド類似体又は非ヌクレオチド群から構成されるか、又はこれらを含む化合物のような、それらの類似体を含む。これには、在来の骨格が非天然又は合成骨格に置換されたポリヌクレオチド、及び在来の塩基の１つ又はより多くが、ワトソン−クリック型の水素結合相互作用に関与することが可能な基（天然又は合成）に置換された核酸（又はその合成又は天然類似体）が含まれる。ポリヌクレオチドには、一本鎖又は多重鎖構成が含まれ、その場合に１つ又はより多くの鎖が互いに完全に整列しており、又は整列していない。「ヌクレオチド」とは、ホスフェート基、炭素数５の糖、及び窒素を含む塩基を有する核酸のサブユニット、並びにポリマーの形態で（ポリヌクレオチドとして）２つの天然ポリヌクレオチドの場合と同様の配列特異的な仕方で天然ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な、こうしたサブユニットの機能的類似体（合成か天然かにかかわらず）を表す。例えば「バイオポリマー」には、供給源に関係なく、米国特許第５，９４８、９０２号明細書及びそこに引用されている文献に記載の、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びＰＮＡその他のポリヌクレオチドが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に長さがヌクレオチド約１０から１００個分のヌクレオチド多量体を表し、一方「ポリヌクレオチド」は、任意の数のヌクレオチドを有するヌクレオチド多量体を含む。「バイオモノマー」とは、同じ又は異なるバイオモノマーと結合してバイオポリマーを形成可能な単一の単位（例えば、一方又は双方が除去可能な保護基を有しうる２つの結合基を備えた、単一のアミノ酸又はヌクレオチド）を表している。バイオモノマー流体又はバイオポリマー流体とは、それぞれ、バイオモノマー又はバイオポリマーを含む液体（一般には溶液）を表している。

　「アレイ」には、逆の意図が明らかでない限り、関連する特定の１つ又は複数の化学部分（例えば、ポリヌクレオチド配列のようなバイオポリマー）を備えたアドレス指定可能な領域の、任意の１次元、２次元、又は３次元配置が含まれる。各領域は、基体が多孔質の場合、第３の次元に延びることが可能であるが、基体が無孔質の場合には、実質的な第３の次元（厚さ）は有しない。アレイは、異なる部分（例えば異なるポリヌクレオチド配列）からなる多数の領域を有し、そのアレイ上のある特定の所定位置（「アドレス」）にある領域（そのアレイの「特徴」又は「スポット」）が、ある特定の標的又はある特定クラスの標的を検出することになる（特徴がたまたま、その特徴の標的でないものを検出する場合もあるが）という意味で、「アドレス指定可能」である。アレイの特徴は一般に同種のものからなり、それらの特徴は必ずではないが一般に、介在する間隔によって分離されている。アレイの場合に「標的」とは、種々の領域で基体に結合されたプローブ（「標的プローブ」）によって検出される、移動相（一般に流体）の部分として参照される。しかしながら「標的」又は「標的プローブ」の一方は、もう一方によって評価されることになる（従っていずれか一方は、もう一方と結合することによって評価される、未知のポリヌクレオチド混合物である可能性がある）。「アレイレイアウト」又は「アレイ特性」とは、特徴の配置、特徴の１つ又はより多くの次元、又は所与の位置における化学的部分の識別又は機能の何らかの指標といった、アレイの１つ又はより多くの物理的、化学的、又は生物学的特性、或いはそのアレイをいかに取り扱うべきか（例えば、アレイを試料に曝露する条件、又は試料に曝露した後のアレイ読み取り規格又は対照）を表している。「ハイブリダイズ」及び「結合」は、ポリヌクレオチドに関し、交換可能に用いられる。

　「プラスチック」とは、高分子量の（例えば少なくとも１０００グラム／モル、又は少なくとも１００００又は１０００００グラム／モルの場合さえある）任意の合成有機ポリマーである。

　基体又は基体のウェブに関して、「可撓性」とは、基体を半径１．２５ｃｍ未満のローラの周囲で１８０度曲げることができることを表している。基体は、破損（例えば亀裂）又は塑性変形を生じることなく、何れの方向においても少なくとも１００回、繰り返しそのように曲げたり伸ばしたりすることが可能である。この曲げは、材料の弾性限界内でなければならない。可撓性に関する以上の試験は、２０℃の温度で実施される。

　「ウェブ」とは、幅を超える長さを有する、長く連続した基体材料片を表している。例えば、ウェブの長さ対幅比は少なくとも５／１、１０／１、５０／１、１００／１、２００／１、又は５００／１であるが、少なくとも１０００／１になる場合さえある。

　本明細書において、蛍光測定に関して「基準単位」とは、石英ガラスから得られる最大蛍光、又はホウケイ酸ガラスから得られる最大値の１／３を表している。本明細書において基準単位に関する蛍光測定は、別段の記載がない限り、５４７ｎｍから５９７ｎｍの積分蛍光発光エネルギであるが、これは５３２ｎｍの中心波長を有し半値幅が約５ｎｍである単色高圧キセノンランプ励起光源を用いて、厚さ１ｍｍの材料断片から得られる。全ての比率は、照射される材料の単位面積が同じであることを仮定している。以下の材料は、上記した基準材料として用いることが可能である（米国メリーランド州のＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）。石英ガラス−Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓａｍｐｌｅ　１９８、ホウケイ酸ガラス−Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　９３ａ。

　一つのものが別のものから「遠隔」にあると表される場合、これはそれら２つのものが、少なくとも異なる建物内にあり、また少なくとも１マイル（約１．６ｋｍ）、１０マイル（約１６ｋｍ）、或いは少なくとも１００マイル（約１６０ｋｍ）離れていることを表す。情報の「通信」とは、その情報を表すデータを電気信号として、適合する通信チャンネル（例えば私設又は公衆ネットワーク）を介して送信することを表している。ものの「転送」とは、物理的に移送するか又はその他（それが可能な場合）により、一つの場所から次の場所にそのものを到達させる任意の手段を表しており、少なくともデータの場合には、データを担持した媒体を物理的に搬送するか、又はデータを通信することを含んでいる。アレイ「アセンブリ」は、アレイと、そのアレイが付着された基体だけからなる場合もあるが、アセンブリが他の特徴（チャンバを備えたハウジングのような）を含むパッケージの形態をとることも可能である。「チャンバ」とは、取り囲まれた容積を表している（但し、チャンバは１つ又はより多くのポートを介してアクセス可能であってもよい）。また本出願全体を通じて、「前」、「後」、「上部」、「上方」、及び「下方」といった用語は、相対的な意味においてのみ用いられることが理解されよう。「流体」とは、本明細書では液体を表している。単数形で表記されたものに対する言及には、複数の同じものが存在する可能性も含まれている。「可能である」又はこれに類する表現は、任意性を表している。記述される方法は、列挙されている事象のとおりの順序で、或いは何らかの他の論理的に可能な順序で実施可能である。

　表面に結合された「結合（リンク）層」の厚みは２００オングストローム未満であってよく、１０オングストローム未満（又は８、６、又は、４オングストローム未満の厚み）とすることさえ可能である。こうした層は１０^４から１０^６単位／μ^２の、ポリヌクレオチド、蛋白質、ヌクレオシド、又はアミノ酸との最小結合親和性を備えることが可能である。本発明における層厚は、紫外線又はＸ線偏光解析法を用いて評価することが可能である。

　化学式に関して「基」とは、置換された基及び未置換の基の両者を含んでいる。置換基はどれも、所望の反応を妨げないように選択しなければならない。

　「低級アルキル基」とは、炭素数１から６のアルキル基であるが、恐らくは１個、２個、３個、又は４個の何れかの数の炭素原子を備えるだけである。

　「攻撃」されていない金属層という用語や、金属層を「攻撃しない」反応物質という用語、或いは類似の用語の意味するところは、ある方法中で、反応物質に対する基体の曝露が終了した後に、金属層が基体上での全体的な光パワー反射性（５３２ｎｍ又は６３３ｎｍで測定して）に関して、３０％を超える劣化を生じない（例えば、１０％を超える劣化、或いは５％又は２％を超える劣化さえ生じない）こと、或いはこうした全体的な光パワーの反射性が、その一様性に関して所定量以上低下しなかったことを意味する。一様性の条件は、５３２ｎｍ又は６３３ｎｍの中心波長を有するレーザ光（半値幅が約５ｎｍ）を用い、５Φｍ×５Φｍの大きさの検出ピクセルで反射光を測定することによって測定可能である。反応物質に曝露する前後で、検出ピクセルの８０％について測定された反射光強度の変化が５％未満（例えば２％又は１％未満）の場合は、一様性に低下がないものと分類することができる。反射性の何らかの変化を間接的に測定する方法の１つは、前方から基体を照射し（例えば前述した何れかの波長のレーザ光によって）、反射層の背後に位置する裏面層からの、測定される蛍光（例えば５４７ｎｍ又は５９７ｎｍ）における何らかの変化を前方から測定することである。これは、裏面層の蛍光性が強い場合（例えば裏面層がポリエーテルエーテルケトンの場合）にはうまく機能する。金属層が、反応物質に対する曝露によって攻撃されていない場合、蛍光のいかなる増大も、基体上の最後のアレイから測定される蛍光信号に干渉してはならない。特に、前述した大きさのピクセルの全体又は８０％からの蛍光の増大は、反応物質に対する曝露前のもとの基体に対して２％未満（例えば１％未満）が望ましく、理想的にはゼロである。こうした蛍光は、例えば本願の出願人であるカリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジー社製ＡＧＩＬＥＮＴ　ＡＲＲＡＹ　ＳＣＡＮＮＥＲのようなスキャナで測定可能である。他の蛍光分析装置もまた使用可能である。

　本明細書において記述される何れの方法においても、ステップは列挙されている順番に、又は論理的に可能な任意の他の順番で実施可能である。本出願において引用された全ての特許及び他の参考文献の内容は、それらの文献における定義が本出願の定義と矛盾する場合を除いて（その場合は本出願の定義が優先する）、番号その他の参照によって本出願に取り込まれたものとする。

　まず図１から３を参照すると、本発明の方法はアレイアセンブリを生成することが可能であり、これは例えば、細長い可撓性ウェブ（又はリボン）１０の形態をなすことが可能な基体を含む。ウェブ１０はその表面１１ａに沿って配置され、アレイ間領域１７によって分離された１つ又はより多くのアレイ１２を担持する。ウェブ１０の裏面１１ｂにはアレイ１２はない。ウェブ１０上のアレイは、試行用サンプル、基準試料、これらの組合せ、或いはポリヌクレオチド、蛋白質、多糖類等の既知の混合物など、何れであるかに関係なく、あらゆる種類の試料を試験できるように設計されている（その場合アレイは、評価すべき未知の配列を担持する特徴から構成することが可能である）。図１には４つのアレイ１２しか示されていないが、ウェブ１０及びそれに使用される実施態様は、少なくとも５、１０、２０、５０、又は１００といった（或いは少なくとも５００、１０００、又は少なくとも３０００の場合さえある）、任意の所望数のアレイ１２を使用可能であることが理解されよう。こうした数のアレイは一般に、ウェブ１０の長手方向に端と端を突き合わせて配置される。アレイ１２を収容するために、ウェブ１０は少なくとも１００ｃｍ（或いは少なくとも２００又は５００ｃｍ）の長さにすることができ、又は１ｍを超える（或いは２、５、又は１０ｍを超えるか、又は１００ｍを超える）長さで、例えば１００ｃｍ未満の幅とするか、或いは５０、３０、１０、５、又は１ｃｍ未満の幅とすることさえ可能である。ウェブ１０の幅方向に配置されるアレイは１つだけであるが、より多くとすることも可能である（例えば２又は３）。従って一般に、ウェブ１０に沿って長手方向に配置されるアレイ１２の数と、幅方向に配置されるアレイの数の比は、少なくとも１０／１、２０／１、５０／１、１００／１などであり得るが、少なくとも５００／１又は少なくとも１０００／１とすることさえ可能である。意図する用途に応じて、任意の又は全てのアレイ１２を相互に同じか、又は異なるものとすることが可能であり、また各々はバイオポリマーの多数のスポット又は特徴１６をポリヌクレオチドの形態で含む。典型的なアレイは、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、又は１万を超える特徴を含むことが可能であり、或いは１０万を超える特徴を含むことさえ可能である。特徴１６は、全てを異なるものとすることもできるし、或いは、一部又は全部を同じものとすることも可能である。アレイ１２が在来のin situ方式によって形成される場合、又は上述のように、インクジェットタイプのヘッドのようなパルスジェットを用いて、特徴の各々について試薬の１つの液滴を各サイクルで付着させることにより、予め得られた部分（化学成分）を付着させることによって形成される場合、一般には（本質的なものではないが）、ポリヌクレオチドがないアレイ（特徴）間領域１７が生じることになる。しかし、特徴間領域１７の大きさ及び形状は種々でありうることが理解されよう。またアレイ１２を互いに分離させるスペースが必要ではないことも理解されよう。各々の特徴は、所定のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド混合物の可能性もある）を担持している。通常のように、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔは通常のヌクレオチドを表す。Ｌ（特に図３を参照）は、表面及び最初のヌクレオチドに共有結合したリンカー分子を表している。

　ウェブ１０はまた、表面１１ａに沿って両側の端縁に余白部分１３ａ、１３ｂを備えており、その一方の余白部分１３ａに沿って、バーコード３５６の形態をとる識別子が設けられている。バーコード３５６の代わりに、他の光学的又は磁気的識別子のような識別子を用いることも可能であり、これらは後述する情報を備える。各識別子は、関連するアレイ１２に隣接して配置されている。しかし、こうである必然性はなく、バーコード３５６ａのように識別子は他のどこにでも配置可能である。さらに、１つより多いアレイ１２に関連した単一の識別子を設けることも可能であり、そうした識別子の１つ又はより多くを、ウェブ１０の先端又は後端（何れも図示せず）に設けることが可能である。余白部分１３ｂに沿って、アライメント（整列）用の基準マーク１５を設けることも可能であり、各基準マーク１５は後述する目的のために、対応する隣接アレイ１２に関連付けられている。或いはまたバーコード３５６は、裏面１１ｂの余白部分１３ａ、１３ｂの一方又は両方に沿って配置することも可能である。後述するように、裏面１１ｂは、表面１１ａよりも容易にマーキングを施すことが可能な（印刷又はレーザ融除によって）プラスチックのベース層とすることができるため、これは有利になる可能性がある。ウェブ１０は例えば、少なくとも１００ｃｍの長さとすることもできるし、或いは少なくとも０．５ｍの長さ、又は少なくとも１、２、５、又は１０ｍの長さで、少なくとも３ｍｍの幅、又は少なくとも５ｍｍ、又は１、２、５、又は１０ｃｍの幅とすることさえ可能である。

　図２及び図３には、アレイ１２の理想的な特徴１６が例示されている。そこでは形成される実際の特徴が標的（又は「目標」）特徴と同じであり、各特徴１６は形状、大きさ、及び組成が均一で、また特徴の間隔は規則的である。こうしたアレイを液滴付着法で製造する場合、各特徴のための試薬の全ての液滴が均一な形状を有し、また標的特徴位置に正確に付着されることが必要になる。実際には、製造中における固定誤差及びランダム誤差のために、こうした理想的な結果を得ることは困難である。

　図３から明らかなように、ウェブ１０は幾つかの異なる層を備えることができる。ベース層又は裏面層１４ａは最大厚を有し、例えばポリオレフィンフィルム（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテンの如き）、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、任意のフルオロカーボンポリマー、又は他の適合する熱可塑性可撓性ポリマーフィルムといったプラスチックの如き、可撓性材料から構成可能である。ベース層１４ａの材料は最適には、ウェブ１０が用いられる条件下で、安定した寸法的、機械的、及び化学的特性をもたらすように選択される。例えばポリヌクレオチドアレイの場合、ウェブ１０は、水性環境下で長時間（例えば１２時間）にわたり、高温（例えば６０℃）に曝露される。こうした条件に曝露されると、ポリエステル又はアラミドのフィルムは、膨張又は劣化しやすい。アレイ１２の種類、及び層１４ａが曝露されることになる条件が選択されたならば、多くの既知のポリマーフィルム特性を参考にして、こうした条件下で寸法的、機械的、及び化学的安定性が得られるように、裏面層１４ａを選択することが可能である。こうした既知のものには例えば、Ｈｏ−Ｍｉｎｇ　Ｔｏｎｇ及びＬｕｕ　Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ編「Ｎｅｗ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　Ｔｈｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｆｉｌｍｓ」ＩＳＢＮ：０−４７１−６２３４６−６、Ｗ．Ｊ．Ｆｅａｓｔ、Ｈ．Ｓ．Ｍｕｎｒｏ及びＲ．Ｗ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ編「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｕｒｆａｃｅｓ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ　ＩＩ」ＩＳＢＮ：０−４７１−９３４５６−９、Ｔｉｍ　Ｈ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ編「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ―Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｏｉｃ　Ｒｅａｌｉｔｙ」ＩＳＢＮ：０−４７１−９８７２４−７、ポリマー特性検索用データベースであるＥｌｌｉｓの「Ｐｏｌｙｍｅｒｓ−Ａ　Ｐｒｏｐｅｔｙ　Ｄａｔａｂａｓｅ」英国Ｂｒｙａｎ　Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＩＳＢＮ／ＩＳＳＮ：０８４９３１０５５５、Ｉｒｖｉｎ，Ｉ　Ｒｕｂｉｎ編「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、「Ｍｏｄｅｒｎ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」、「Ｐｌａｓｔｉｃｓ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」、「Ｂｏｅｄｅｋｅｒ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｐｌａｓｔｉｃｓ」、［ｏｎ　ｌｉｎｅ］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｂｅｏｄｅｋｅｒ．ｃｏｍ／ｍｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ＞、［ｏｎ　ｌｉｎｅ］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／Ｋｎｏｖｅｌ．ｃｏｍ＞などがある。裏面層１４ａは一般に１μｍを超え（又は５μｍを超え）、５００μｍ未満の（或いは１００、５０、２５、又は１５μｍ未満の場合さえある）厚みを備えている。しかし裏面層１４ａは、可撓性が必要ではない場合は、シリカ又はガラスのような硬質材料とすることもできる。

　ウェブ１０には、ガラス又はシリカ層１４ｄであってよい透明表面層１４ｄ、及び裏面層１４ａと表面層１４ｄの間の反射金属層１４ｃも含まれている。反射層１４ｃは、真空蒸着、プラズマエンハンスド化学蒸着その他の手段によって、裏面層１４ａ又は任意選択的な中間結合層１４ｂに堆積されたクロム又は他の適切な金属フィルムとすることが可能である。結合層１４ｂは、使用される場合、用いられる厚さにおいて可撓性で、裏面層１４ａと金属層１４ｃの両方に結合する任意の適当な材料でよい。反射コーティングを施したプラスチックフィルムは周知であり、市販されている。表面層１４ｄは、スパッタリング、プラズマエンハンスド化学蒸着、その他の同様の技法によって、反射層１４ｃに堆積させてよい。例えば、ミネソタ州ノースフィールドのＳｈｅｌｄａｈｌ社（ＷＷＷサイトｓｈｅｌｄａｈｌ．ｃｏｍを参照）、及びカリフォルニア州サンディエゴのＧｅｎｅｒａｌ　Ａｔｏｍｉｃ社（ＷＷＷサイトｇａ．ｃｏｍ）といった幾つかの製造業者は、金属及びガラス層でコーティングされたフィルムを市販している。表面層１４ｄは、例えば１、１０、又は１００ｎｍを超え、１０００、７００、又は４００ｎｍ未満の任意の適切な厚みを備えうるが、一般には読み取り時にアレイ特徴の照射に用いられる光の波長の約１／４、又はその値の奇数倍の厚みを備える。可撓性が望まれる状況で、ウェブ１０がもはや可撓性でなくなるほど層が厚くならないという条件で、例えば４０から２００ｎｍ、又は６０から１２０ｎｍ（或いは８０から１００ｎｍの場合さえある）、或いはこれらの厚み範囲の何れかの奇数倍（例えば３００ｎｍを使用しうる）である。Ｄｏｒｓｅｌらの「Ｍｕｌｔｉ−Ｆｅａｔｕｒｅｄ　Ａｒｒａｙｓ　Ｗｉｔｈ　Ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ　Ｃｏａｔｉｎｇ」と題する米国特許出願公開第２００２０１３２２６１　Ａ１号公報に記載のような適切な厚み（調査光の波長の約１／４といった）の表面層１４ｄを選択することは、当該Ａ１号公報、及び米国特許第６，００８，８９２号明細書に記載のように、干渉による強め合いの結果として、表面における調査光のパワー及び検出信号を増大させる上で有利になる可能性がある。

　金属層１４ｃ及び結合層１４ｂの各々は、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２００ｎｍ、５０ｎｍ未満の厚み、或いは２０、１０、５、又は１ｎｍ未満の厚みを備えることさえ可能である（いずれにせよ、例えば０．１ｎｍ又は０．５ｎｍを超える）。ある実施態様では、結合層１４ｂは１０ｎｍである。特に金属層１４ｃは、アレイの読み取り中に特徴の照射に用いられる光の波長に対して不透明となるような厚みを選択可能である。表面層１４ｄは特に、上記米国特許出願公開第２００２０１３２２６１　Ａ１号公報に記載のようにして選択された厚み及び透明性を備えることが可能であり、一方金属層１４ｃはやはりこのＡ１号公報に記載の、照射光に関連した反射率要件を満たすものでよい。例えば金属層１４ｃは、入射光の少なくとも１０％、或いは少なくとも２０％、５０％、８０％、又は少なくとも９０％を反射してよく、さらには入射光（例えば５３２ｎｍ又は６３３ｎｍの照射光）の少なくとも９５％を反射することさえ可能である。前述のように、本明細書で引用した上記公報及び他の参考文献の内容は、ここでの参照によって本出願に取り入れられる。しかしながら表面層１４ｄ及び反射層１４ｃは、必ずしもそれらの要件を満たさねばならない訳ではない。

　上記した構成のウェブ１０の場合、表面１４ｄを用いることによって、その層がなければ可能ではなかったであろう化学反応（例えばリンカー分子の付着）の使用が可能になる（例えばリンカー分子の反射層１４ｃへの付着）。さらに、金属層１４ｃを用いると、上述した米国特許出願公開第２００２０１３２２６１　Ａ１号公報に記載の有用な特性がもたらされうるだけでなく、プラスチック製裏面層１４ａの望ましくない光学特性（例えば望ましくない蛍光、また入射光エネルギを吸収するプラスチックウェブの場合には、過熱及び基体の溶融の可能性）を回避することも可能になる。これによって、強い蛍光及び／又は入射光の多量の吸収を生じる可能性のある材料からなる裏面層１４ａの使用が可能になる。例えば裏面層１４ａは、少なくとも５又は１０基準単位の蛍光を有することができ（或いは少なくとも２０、５０、１００、又は２００基準単位の場合さえある）、及び／又はアレイ１２の読み取りに用いられる照射光（例えば、５３２ｎｍ又は６３３ｎｍの光）の少なくとも５％、１０％、２０％、又は５０％の吸収（或いは少なくとも７０％、９０％、又は９５％の吸収の場合さえある）を行いうる。

　次に図４を参照すると、基体にリンカー分子を付着させるための既知の方法が示されている。この方法では、不飽和基とトリクロロシラン官能基の両方を備えたリンカー分子が、表面に配置されたヒドロキシル基（ガラス又はシリカの表面のヒドロキシル基でありうる）に曝露される。結合の後、不飽和基のヒドロホウ素化に続く塩基性過酸化物溶液中での酸化の結果、末端ヒドロキシル基が生じる。これはその後、アレイの製造に際して、表面に付着された活性化ホスホアミダイトと接触して反応し、共有結合する。しかしながら、図４の方法の最初のステップ（リンカー分子の結合）の結果、塩酸が生成される。これは金属層１４ｃを攻撃すると考えられ、表面層１４ｄの存在にもかかわらず、反射性の不規則な層を生じる。

　一方図５には、金属層１４ｃを有する、図３に例示の基体１０の変性された表面を生成するために、本発明で用いられる方法が示されている。図５では、トリエトキシシラン官能基を有するリンカー分子が、基体の表面１１ａと接触される。各リンカー分子のエトキシ基の少なくとも１つは、層１４ｄの表面に配置されたヒドロキシル基（ガラス又は二酸化珪素の層１４ｄ上に存在するヒドロキシル基の如き）と反応し、反応後、エーテル結合を介して、リンカー分子を表面１１ａに共有結合させる。図４の方法とは異なり、基体の金属層を攻撃する反応物質が生成されない（具体的には酸が生じない）ことに着目されたい。次に、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　Ｌｉｇａｎｄ　Ａｒｒａｙｓ」と題する２００２年３月２５日出願の米国特許出願第１０／１０６６８５号に記載のようにして、例えばメタノール中のＮａＯＨを用いて、アルカリ条件下でアセテート基を加水分解してヒドロキシル基を脱離させることができる。

　表面層１４ｄの存在にもかかわらず金属層を攻撃する、図４の方法によって生じる酸の作用については、以下の２例による結果を比較することで明らかにすることができる。

　例１では、ポリエーテルエーテルケトンの裏面層、厚さ１００ｎｍのシリカ（ＳｉＯ_２）からなる表面層、及び厚さ２００ｎｍの中間反射クロム層から構成される基体の表面には、次の手順に従って、結合したリンカー分子が備えられる。
ａ）９８％のデシルトリエトキシシランと２％の１１−トリエトキシシリルウンデシルアセテートの溶液４ｍｌ（２〜６ｍｌの範囲）を、１００ｍｌのトルエン中で一晩撹拌する。トルエン中には予め、１ｍｌ当たり約４００マイクログラム（３００〜４５０μｇ／ｍｌの範囲）の水が溶解されている。
ｂ）次いで基体の表面を室温で２時間にわたってａ）の溶液で処理し、その時間の後に、まずトルエン、次にメタノール、最後に水で洗浄する。
ｃ）堆積されるホスホアミダイトプローブ前駆体を表面上のリンカー分子へと接触に際して結合させるために、以下の手順を用いて、アセテート官能基は反応性官能基に転化される。即ちアセテート基は次いで、室温で５分間にわたり、アルコール溶液中において、０．２Ｎのナトリウムメトキシド（又は他のアルコキシド）で加水分解される。この結果、ヒドロキシル基で終端された単層が得られる。加水分解の代替法には、（Ａ）例えば水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのようなアルカリの水溶液、又は（Ｂ）酸の水溶液で、アセテート基を５０℃で１時間にわたり処理するステップがある。しかしながら、アルコール溶液とは異なり、水溶液は、シロキシル結合を極めて容易に加水分解する傾向があるため、即ち−Ｏ−Ｓｉ結合を開裂する傾向があるため、注意が必要である。また、希酸溶液は可撓性基体を攻撃するが、それを阻止できるのは、保護層であるシラン単層の一体性が完全な場合だけである。従って第一には、アルコール溶液を利用するのがよい。

　最初のヌクレオシドホスホアミダイトが基体上に堆積され、末端ヒドロキシル基との反応を通じて、リンカー分子と結合される。次いで、結果として得られた基体の表面を４０倍（図８）及び１０倍（図９）で写真撮影した。基体はその光の反射において比較的一様であるが、これは反応物質による攻撃の結果としての欠陥が、金属層に殆どないことを示している点に留意されたい。

　これに対して例２においては、図４に示す方法を用いることによって生じる酸の影響が示される。この例の場合、デシルトリエトキシシランがデシルトリクロロシランに置換され、１１−トリエトキシシリルウンデシルアセテートがウンデセニルクロロシランと置換される（米国特許第６，４４４，２６８号明細書に開示のように）点を除き、例１の手順のａ）及びｂ）が繰り返される。例１の場合と同様に、得られた表面を４０倍（図６）及び１０倍（図７）で写真撮影した。この例２の場合には、ステップａ）及びｂ）によって得られる表面の質が、図６及び図７で見られるように極めて悪いので、ホスホアミダイトは表面に曝露されなかった。

　図６と図８、及び図７と図９を比較すると、表面層１４ｄが存在するにもかかわらず、金属層を攻撃する反応物質が生成されない本発明の方法を用いると、金属層を攻撃する反応物質が生じてしまう方法を用いる場合よりも、表面全体にわたって光の反射がより一様な基体が得られることが看取されよう。

　本発明の方法によって基体表面を調製する場合、リンカー分子を表面に結合し、反応の結果やはり酸を生成することのない、他の基を用いることが可能である。例えば、表面に配置されたヒドロキシル基との反応後に、エーテル結合によってリンカー分子を表面に結合する、何らかのシロキシ基を備えるリンカー分子を用いることが一般に可能である。「シロキシル」基は、以下の式の基を意味する。

　　　　　−Ｓｉ−Ｏ−　　　　　　　　　　　　　（１）
ここで、Ｓｉは２つのＨに結合してもよく、或いは１つ又は２つの他の基で置換されてもよい。ＯはＨと結合されない。例えば式（１）の基は、Ｓｉと結合されたヒドロカルビルオキシ基を有してよく、次の式からなることができる。

　　　　　（Ｒ^２）_ｍ−（Ｌ）_ｎ−Ｓｉ−ＯＲ^ｐ　　　 （２）
ここで、Ｒ^ｐはアルキル基（例えば低級アルキル基）のようなヒドロカルビル基であり、Ｌはリンカー成分を表し、ｎは０又は１である。従ってリンカーは存在してもしなくともよい。Ｒ^２は、接触に際して、堆積されるプローブ又はプローブ前駆体（ヌクレオシドホスホアミダイトのような）を結合させる反応性官能基、又はこうした反応性官能基に転化可能なリンカー官能基を表している。存在する場合、Ｌは一般にＣ_１−Ｃ_２４ヒドロカルビレン結合基、例えばＣ_１０−Ｃ_１８アルキレンである。式（２）のＳｉには１つ、２つ、又は３つのＲ^ｐ基が存在しうる。１つより多くが存在する場合には、それらが相互に同じでも異なっていてもよい。例えば式（２）には、式−Ｓｉ（ＯＲ^ｐ）_３のトリアルコキシ基が含まれうるが、この場合にＲ^ｐは何れかが相互に同じ又は異なるアルキル基でありうる（例えば、各Ｒ^ｐはエチル基のような低級アルキル基であり得るが、その場合に前述の基はトリエトキシとなる）。

　既述のように、式（２）のＳｉは２つのＨを結合可能であり、その何れか一方を置換基（低級アルキル又はアルコキシの如き）によって置換してもよい。式（２）のＲ^２は、リンカー分子と基体表面の結合を不当に妨げないように選択しなければならない。例えばＲ^２はカルボン酸エステル官能基でよく、これは結合すると、式（２）のリンカー分子によって、表面に対して下記式の結合基（リンク）が与えられる。

　　　　　−Ｓｉ−（Ｌ）_ｎ−Ｒ^２　　　　　　　　　（３）
ここで、Ｒ^２は加水分解可能なカルボン酸エステル基である。もちろん、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙが脱離基でなければ、得られる表面部分は実際には、−ＳｉＲ^ｘＲ^ｙ−（Ｌ）_ｎＲ^２基となるが、出願人は式（３）のより一般的な表現−Ｓｉ−（Ｌ）_ｎ−Ｒ^２によってそれを包含することを意図している。

　式（２）において、Ｒ^２は、酸又はアルカリの加水分解条件に曝露すると、ヒドロキシル官能基（−ＯＨ）を生じる、都合の良い加水分解可能な官能基とすることが可能である。即ちＲ^２は、任意の都合の良い、加水分解可能な酸又はアルカリ基である。多くの実施態様において、加水分解可能な酸又はアルカリ官能基は、加水分解によって遊離のカルボン酸を生じる基である。こうした実施態様の多くにおいて、加水分解可能な官能基はエステルである。従って多くの実施態様において、−Ｓｉ−（Ｌ）_ｎ−Ｒ^２表面基は、カルボン酸と長鎖アルコールのエステルであり（従ってそれらは、カルボン酸エステル官能基を含む）、ここで長鎖アルコールがＬであって、Ｓｉリンクを介して基体表面と共有結合する。別の見方をすると、−Ｓｉ−（Ｌ）_ｎ−Ｒ^２表面基は長鎖エステルとすることが可能であり、これらは加水分解可能であって、基体表面に結合された長鎖アルコールと遊離のカルボン酸、即ち、表面結合ヒドロキシル基及び遊離カルボン酸を生じる。

　上述の実施態様の多くにおいて、Ｒ^２は式Ｏ−（ＣＯ）−Ｒ^３を有することができるが、ここでＲ^３は多くの実施態様において、上に定義した低級アルキル基のようなアルキル基である。しかしＲ^３は、さらに詳細に後述するように、ヒドロキシル基を生じる官能基の酸加水分解を許容できないほど妨げない任意の基とすることが可能である。関心事となる具体的な基には、制限するわけではないが、アセチル、アルキル、アルケニル、アミノ、ベンジル、ヒドロキシル、ハロゲン等が含まれる。Ｒ^２の式がＯ−（ＣＯ）−Ｒ^３の場合、（Ｌ）_ｎは酸又はアルカリ加水分解後に、ヒドロキシル基によって終端されることになる。

　他の官能基をＲ^２に使用することも可能である。しかしながらＲ^２は、リンカー分子と基体表面の反応を不当に妨げないように選択しなければならない。例えば、リンカー分子が表面に配置されたヒドロキシル基と結合する場合、表面とのそうした結合に際して、リンカー分子上にヒドロキシル基が存在しないようにするのが最善である。Ｒ^２に関する他の官能基には、リンカー分子が表面に結合された後、参照によってその内容を本明細書に取り入れる、米国特許出願第６，２５８，４５４号明細書に記載のような方法を用いてヒドロキシル基に転化可能な、アルキレン基が含まれている。式（２）においてｍが０の場合は、プローブ又はプローブ前駆体に結合する反応性官能基は存在せず、その場合にＬ又はＳｉ（Ｌが存在しない場合）は、Ｈ又はアルキル基（例えば低級アルキル）のような比較的反応しにくい部分のみで終端される。こうした化合物は本発明の方法において、プローブ又はプローブ前駆体と結合する反応性官能基の密度を制御することが望ましい場合に使用可能である。特に、基体表面上の加水分解可能なＲ^２官能基の密度は、誘導体化組成物との反応後、式（２）の化合物の混合物であってそのうちの１つに反応性官能基Ｒ^２が存在しないものを含む化合物に基体表面を曝露することによって制御可能である。即ち、Ｒ^２が存在する式（２）の化合物（「第２シラン」）の割合が高くなると、Ｒ^２基の密度が高くなり、これに対してＲ^２基のない式（２）の化合物（「第１のシラン」）の割合が高くなると、Ｒ^２基の密度が低下する。最適には第１シランは誘導体化組成物の約０重量％〜９９．５重量％の範囲内、例えば誘導体化組成物の約９０重量％〜９９重量％の範囲内で存在し、他方第２シランはこれに対応して、誘導体化組成物の約０．５重量％〜１００重量％の範囲内、例えば組成物の約１重量％〜１０重量％の範囲内で存在する。

　多くの実施態様では、結果的に得られる官能化された基体の表面に、−Ｓｉ−Ｒ^１基とＳｉ−（Ｌ）_ｎ−Ｒ^２基の両者が含まれ、所定の比率で存在するが、この比率によって、表面エネルギーと官能基の密度の両方が決まる。換言すれば、基体の官能化された機能性表面は、加水分解可能な酸又はアルカリ官能基を示す。米国特許出願第６，２５８，４５４号明細書には、シランの混合物を含む組成物によって表面を誘導体化する一般的なプロセスに関するさらなる記述がある。そこに記載の手順は本発明において使用することが可能であるが、表面と結合すると酸を生成する基（トリクロロシラン基の如き）は、酸を生成しない官能基（上述したシリルオキシ基の如き）に置換される。式（２）のアルコキシシランは市販されており、或いは、例えば米国特許第４，４９１，６６９号明細書、米国特許第６，１５０，５５０号明細書に記載のような周知のプロセスによって得ることも可能である。

　本発明の方法によって製造された基体は、本発明の方法によるアレイの製造に使用可能である。この場合に基体は、アレイ上に堆積されることになるプローブ（例えば核酸又は蛋白質）、又はプローブ前駆体（ヌクレオシドホスホアミダイトの如き）と接触される。堆積されるプローブ又はプローブ前駆体は、表面と接触すると、表面に結合されたリンカー分子上の反応性官能基と共有結合する。このようにして、プローブ又はプローブ前駆体を含む液滴を付着させてアレイを製造することについては、例えば先の特許文献５、１１、１２、１３、米国特許第６，３２３，０４３号明細書、及び特開平２００１−２１５５号公報（英国特許第２３５５７１６号公報）並びにこれらに引用されている文献に、ある程度詳細な記載がある。既に述べたように、これらの文献の内容は、ここでの参照によって本明細書に取り込まれるものとする。本明細書で前述したように、他の液滴付着法を用いて製造することも可能である。また液滴付着法に代えて、米国特許第５，５９９，６９５号明細書、米国特許第５，７５３，７８８号明細書、米国特許第６，３２９，１４３号明細書に記載のように、フォトリソグラフィアレイ製造法を使用することも可能である。特に、こうした特許に記載のフォトリソグラフィ法によってアレイが製造される場合には、アレイ間領域が存在する必要はない。

　ユーザが本発明の方法によって製造されたアレイを受け取った後、アレイは一般に、試料（例えば蛍光で標識されたポリヌクレオチド又は蛋白質を含有する試料）に曝露され、既知のハイブリダイズ条件下で読み取られる。アレイの読み取りは、アレイを照射し、アレイの各特徴において多数の領域で結果的に得られる、蛍光の位置及び強度を読み取ることによって達成しうる。例えばこのために、本願の出願人であるカリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジー社製ＡＧＩＬＥＮＴ　ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ　ＳＣＡＮＮＥＲと同様のスキャナを使用することが可能である。他の適切な装置及び方法が、例えば米国特許第６，４０６，８４９号明細書に記載されている。しかしながら、アレイの読み取りは、前述のものとは異なる任意の他の方法又は装置によって行うことが可能であり、それには例えば、他の光学技法（例えば、化学発光又はエレクトロルミネセンスラベルの検出）を含みうる。読み取りと、それ続く本発明の方法によって得られる結果は、その形で使用することもできるし、或いはさらに処理を加えて、アレイから読み取られたパターンに基づいて結論を下すことで得られるような結果を生成することも可能である（特定の標的配列が試料中に存在していたか否か、又はパターンが、その試料を採取した生体における特定の状態を示しているか否かなど）。読み取り結果（さらに処理されるか否かにかかわらず）は、所望ならば遠隔地に送られ（例えば通信によって）、そこで受け取られてさらに使用（例えばさらなる処理）される場合もある。

　もちろん、上述の特定の実施態様に対する修正が可能である。例えば、あるアレイパターンが望ましい場合、図１のアレイ１２の組織化された行及び列とは異なる、種々の幾何的配置のうちから任意のものを構成可能である。例えばアレイ１２は、基体表面上に延びる一連の曲線行（例えば、一連の同心円状又は半円状をなすスポット）でもって配置可能である。同様に、特徴１６のパターンも、図２の特徴の組織化された行及び列とは変えることができ、例えば基体表面上に延びる一連の曲線行（例えば、一連の同心円状又は半円状をなすスポット）等を含むようにできる。アレイ又はアレイ内の領域の不規則な配置さえも使用可能である。しかしながらユーザには、特徴の少なくとも幾つかの特性（例えば、特徴の組成、位置、大きさ、異なる試料との結合パターンの変化の意義に関する性能特性等の１つ又はより多く）を確認することが可能な何らかの手段（例えば、アレイ識別子による）が与えられねばならない。アレイの構成は、製造上、取り扱い上、及び使用上の考慮事項に従って選択することができる。上述したところと同様のやり方で、本発明の方法及び装置を用いて、種々の表面上に、他のバイオポリマー、ポリマー、又は他の化学部分によるアレイを製造し、使用することが可能である。従ってポリマーに対する言及は多くの場合、「化学部分（成分）」に対する言及に置き換えることが可能である。

　もちろん、上述した特定の実施態様に対して、さらに種々の修正を加えることが可能である。従って本発明は、以上に詳細に記述した特定の実施態様に制限されるものではない。

本発明の方法によって製造されうる如きアレイを多数担持した、ウェブ又はプレートの形態をなすアレイアセンブリを示す図である。 多数の理想的なスポット又は特徴を示す、図１の部分拡大図である。 図２の部分拡大説明図である。 トリクロロシランを使用して、金属層を有する基体の表面にリンカー分子を結合させる方法を示す。 本発明に従って、金属層を有する基体の表面にリンカー分子を結合させる方法を示す。 図４による方法を用いてリンカー分子が結合された、金属層を有する基体の表面の写真である。 図４による方法を用いてリンカー分子が結合された、金属層を有する基体の表面の写真である。 図５による本発明の方法を用いてリンカー分子が結合された、金属層を有する基体の表面の写真である。 図５による本発明の方法を用いてリンカー分子が結合された、金属層を有する基体の表面の写真である。

符号の説明

　１０　ウェブ
　１１ａ　表面
　１１ｂ　裏面
　１２　アレイ
　１４ａ　裏面層
　１４ｂ　結合層
　１４ｃ　金属層
　１４ｄ　表面層
　１６　特徴
　１７　アレイ間領域

Claims (27)

1. 　基体の表面に対し異なるアレイ特徴でもって結合された多数のプローブのアレイを製造する方法であって、前記基体が金属層を含むものにおいて、前記方法が、
   　（ａ）前記表面に官能基が配置されてなる前記基体を設け、
   　（ｂ）前記表面を、前記表面に配置された官能基との反応後にリンカー分子を前記表面に結合させる基を各々に有するリンカー分子と接触させ、前記反応が前記金属層を攻撃する反応物質を生成せず、及び
   　（ｃ）前記表面をプローブ又はプローブ前駆体と接触させて、前記プローブ又はプローブ前駆体を前記表面に結合されたリンカー分子と結合し、前記アレイを生成することからなる方法。
2. 　前記反応が酸を生成しない、請求項１に記載の方法。
3. 　基体の表面に対し異なるアレイ特徴でもって結合された多数のプローブのアレイを製造する方法であって、前記基体が金属層を含むものにおいて、前記方法が、
   　（ａ）前記表面にヒドロキシル基が配置されてなる前記基体を設け、
   　（ｂ）前記表面を、前記表面に配置されたヒドロキシル基との反応後にエーテル結合を介してリンカー分子を前記表面に結合させるシリルオキシ基を各々に有するリンカー分子と接触させ、及び
   　（ｃ）前記表面をプローブ又はプローブ前駆体と接触させて、前記プローブ又はプローブ前駆体を前記表面に結合されたリンカー分子と結合し、前記アレイを生成することからなる方法。
4. 　前記プローブが、多数の異なる特徴位置の各々をプローブ前駆体と繰り返し接触させることからなるin situ合成によって前記表面上に生成される、請求項３に記載の方法。
5. 　前記基体が、裏面層、前記表面が置かれる表面層、及び前記裏面層と前記表面層の間に位置する金属層を有する、請求項３に記載の方法。
6. 　前記表面層がガラスを含む、請求項５に記載の方法。
7. 　前記（ｂ）が、前記表面をアルカリ条件に置くことを含む、請求項５に記載の方法。
8. 　前記プローブがポリマーである、請求項３に記載の方法。
9. 　前記ポリマーが核酸である、請求項８に記載の方法。
10. 　前記ポリマーがペプチドである、請求項８に記載の方法。
11. 　前記金属層がクロムを含む、請求項３に記載の方法。
12. 　前記シリルオキシ基がシリルアルコキシドである、請求項３に記載の方法。
13. 　前記シリルアルコキシドがシリルエトキシドである、請求項３に記載の方法。
14. 　前記（ｃ）における前記プローブ又はプローブ前駆体が接触後、前記表面に結合されたリンカー分子と結合しない場合に、前記リンカー分子の官能基をプローブ又はプローブ前駆体と反応性の官能基に転化させることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
15. 　前記基体が、裏面層、前記表面が置かれる透明表面層、及び前記裏面層と前記表面層の間に位置する金属層を有する、請求項３に記載の方法。
16. 　請求項１の方法によって生成されたアレイを試料に曝露することからなる、アレイの使用方法。
17. 　前記アレイを読み取ることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 　請求項１７の方法によって得られた読み取り結果を遠隔地に送ることからなる方法。
19. 　請求項１７の方法によって得られた読み取り結果を表すデータを送信することからなる方法。
20. 　請求項１７の方法によって得られた読み取り結果を受信することからなる方法。
21. 　請求項１の方法によって生成されたアレイ。
22. 　表面が変性された基体を製造する方法であって、前記基体が金属層を含むものにおいて、前記方法が、
    　（ａ）前記表面に官能基が配置されてなる前記基体を設け、
    　（ｂ）前記表面を、前記表面に配置された官能基との反応後にリンカー分子を前記表面に結合させる基を各々に有するリンカー分子と接触させ、前記反応が前記金属層を攻撃する反応物質を生成しないことからなる方法。
23. 　前記反応が酸を生成しない、請求項２２に記載の方法。
24. 　表面が変性された基体を製造する方法であって、前記基体が金属層を含むものにおいて、前記方法が、
    　（ａ）前記表面にヒドロキシル基が配置されてなる前記基体を設け、
    　（ｂ）前記表面を、前記表面に配置されたヒドロキシル基との反応後にエーテル結合を介してリンカー分子を前記表面に結合させるシリルオキシ基を各々に有するリンカー分子と接触させることからなる方法。
25. 　前記基体が、裏面層、前記表面が置かれる表面層、及び前記裏面層と前記表面層の間に位置する金属層を有する、請求項２４に記載の方法。
26. 　前記表面層がガラスを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 　前記金属層がクロムを含む、請求項２４に記載の方法。