JP2004144728A - Method and reagent for measuring high mobility group protein hmg-1 and hmg-2 - Google Patents
Method and reagent for measuring high mobility group protein hmg-1 and hmg-2 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004144728A JP2004144728A JP2002349129A JP2002349129A JP2004144728A JP 2004144728 A JP2004144728 A JP 2004144728A JP 2002349129 A JP2002349129 A JP 2002349129A JP 2002349129 A JP2002349129 A JP 2002349129A JP 2004144728 A JP2004144728 A JP 2004144728A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hmg
- ion
- concentration
- antibody
- cation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるハイモビリティーグループプロテイン−１及び／又はハイモビリティーグループプロテイン−２の測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
ハイモビリティーグループプロテイン（Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（以下「ＨＭＧ」と略すことがある。）は、クロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質として１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保存性は極めて高い。また、核内ばかりではなく、細胞質内にも豊富に存在することが分かっている。生理作用ははっきりとは分かっていないが、ＨＭＧはＤＮＡと結合する際に二重螺旋構造を緩めることから、転写反応の際にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレオソーム弛緩因子として機能すると考えられている。
【０００３】
ＨＭＧには、いくつかの種類が存在する。例えば、ハイモビリティーグループプロテイン−１（ＨＭＧ−１）、ハイモビリティーグループプロテイン−２（ＨＭＧ−２）、ハイモビリティーグループプロテイン−３（ＨＭＧ−３）、ハイモビリティーグループプロテイン−８（ＨＭＧ−８）、ハイモビリティーグループプロテイン−１７（ＨＭＧ−１７）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（ＨＭＧ−Ｉ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｙ（ＨＭＧ−Ｙ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（Ｙ）（ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ））、ハイモビリティーグループプロテイン Ｉ−Ｃ（ＨＭＧ Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。
【０００４】
なお、本発明者らが、遺伝情報処理ソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社）を使用してアミノ酸配列の相同性の解析を行ったところ、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ウシのＨＭＧ−１の相同性は９８．６％であり、ブタのＨＭＧ−１の相同性は９９．１％であった。
また、同様に、ヒトのＨＭＧ−１に対し、ヒトのＨＭＧ−２の相同性は８１．２％であり、ウシのＨＭＧ−２の相同性は７２．３％であり、ブタのＨＭＧ−２の相同性は７９．４％であった。
【０００５】
ワングらは１９９９年に、遺伝子組み換え技術により調製したラットＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）のＨＭＧ−１の定量測定を行った。その結果、ワングらは、ＨＭＧ−１が敗血症のマーカーとなりうることを示した。そして、敗血症の患者において、生き残る患者と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨＭＧ−１を測定することによって可能であることを示した。即ち、ただ単に血液中でのＨＭＧ−１の存在を確認するだけではなく、精密に定量することの有用性が明らかにされた（非特許文献１参照。）。
【０００６】
なお、先に、ＨＭＧ−１の測定に用いる抗体、即ちＨＭＧ−１に結合する抗体については、パーキネンらや、レップらによって調製可能なことが示されていた（非特許文献２及び非特許文献３参照。）。
この抗体を用いてレップらはＨＭＧ−１に関して固相酵素免疫測定法（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が可能であることを述べている。〔なお、この固相酵素免疫測定法は、精製したＨＭＧ−１をマイクロプレート（マイクロタイタープレート）のウェルに固相化し、これに酵素標識したＨＭＧ−１に結合する抗体を接触させ、作用させて、ＨＭＧ−１に結合する抗体が精製したＨＭＧ−１に結合することを確かめたものである。〕
【０００７】
【非特許文献１】
Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行
【０００８】
【非特許文献２】
Ｊ．Ｐａｒｋｋｉｎｅｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻，２６号，１９７２６〜１９７３８頁，１９９３年発行
【０００９】
【非特許文献３】
Ｗ．Ａ．Ｌｅｐｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻，４号，４４９〜４６５頁，１９８９年発行
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、試料中に含まれるＨＭＧ−１の測定系を構築し、測定を行ってみたが、測定の感度が得られないことが分かった。
それは、測定により得られるシグナルの量が極めて小さいため、再現性が悪く、低濃度域の正確性に欠け、満足に測定できるものではなかった。
【００１１】
本発明の目的は、試料中に含まれるＨＭＧ−１、そしてこのＨＭＧ−１と相同性の高いＨＭＧ−２の測定に当たり、充分な測定感度を得ることが出来るようにし、その結果として、再現性がよく、低濃度域も正確に測定することができるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定方法及び測定試薬を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して検討を行った結果、ＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２とともに、陽イオン及び陰イオンを共存させることにより、測定感度を上昇させることが出来ることを見出し、詳細に検討を進め本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 試料中に含まれるハイモビリティーグループプロテイン−１及び／又はハイモビリティーグループプロテイン−２の測定において、ハイモビリティーグループプロテイン−１及び／又はハイモビリティーグループプロテイン−２とともに、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存させることを特徴とする、試料中に含まれるハイモビリティーグループプロテイン−１及び／又はハイモビリティーグループプロテイン−２の測定方法。
【００１４】
（２） 陽イオンがアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン又はアンモニウムイオンであり、陰イオンがハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又は無機化合物よりなる酸基である、前記（１）記載の測定方法。
【００１５】
（３） 陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が２２５ｍＭ以上となるような濃度で共存させることを特徴とする、前記（１）又は（２）記載の測定方法。
【００１６】
（４） 陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が４７５ｍＭ以上となるような濃度で共存させることを特徴とする、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の測定方法。
【００１７】
（５） 試料中に含まれるハイモビリティーグループプロテイン−１及び／又はハイモビリティーグループプロテイン−２の測定試薬において、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で含有させることを特徴とする、試料中に含まれるハイモビリティーグループプロテイン−１及び／又はハイモビリティーグループプロテイン−２の測定試薬。
【００１８】
（６） 陽イオンがアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン又はアンモニウムイオンであり、陰イオンがハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又は無機化合物よりなる酸基である、前記（５）記載の測定試薬。
【００１９】
（７） 陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が２２５ｍＭ以上となるような濃度で含有させることを特徴とする、前記（５）又は（６）記載の測定試薬。
【００２０】
（８） 陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が４７５ｍＭ以上となるような濃度で含有させることを特徴とする、前記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の測定試薬。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
（１）発明の基本要件
本発明の、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定方法では、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定において、ＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２とともに、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存させることが必須である。
【００２３】
また、本発明の、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定試薬では、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定試薬において、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で含有させることが必須である。
【００２４】
以上のことにより、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定に当たり、測定感度を上昇させることができる。
【００２５】
なお、「陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存（又は含有）させること」について、以下具体的に例示し説明する。
【００２６】
例えば、陽イオンとしてナトリウムイオンを、陰イオンとして塩素イオンを共存（又は含有）させる場合には、イオンの価数はそれぞれ「＋１」、「−１」であり、イオンの価数の絶対値はいずれも「１」であるので、ナトリウムイオン及び塩素イオンとも各々１５０ｍＭ以上のモル濃度で共存（又は含有）させる。
【００２７】
また、陽イオンとしてナトリウムイオンを、陰イオンとして硫酸イオンを共存（又は含有）させる場合には、ナトリウムイオンの価数は「＋１」、硫酸イオンの価数は「−２」であるので、イオンの価数の絶対値はそれぞれ「１」、「２」である。よって、ナトリウムイオンは１５０ｍＭ以上のモル濃度で、そして硫酸イオンは７５ｍＭ以上のモル濃度で共存（又は含有）させる。
【００２８】
そして、陽イオンとしてマグネシウムイオンを、陰イオンとして硫酸イオンを共存（又は含有）させる場合には、イオンの価数はそれぞれ「＋２」、「−２」であり、イオンの価数の絶対値はいずれも「２」であるので、マグネシウムイオン及び硫酸イオンとも各々７５ｍＭ以上のモル濃度で共存（又は含有）させる。
【００２９】
（２）陽イオン及び陰イオンの濃度
本発明では、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存（又は含有）させる。
【００３０】
そして、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が２２５ｍＭ以上となるような濃度で共存（又は含有）させることが、測定感度をより上昇させることができるため好ましい。
【００３１】
同じ理由により、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が４７５ｍＭ以上となるような濃度で共存（又は含有）させることが更に好ましい。
【００３２】
そして、特に、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が４７５ｍＭ〜８２５ｍＭとなるような濃度範囲内で共存（又は含有）させることが好ましい。
【００３３】
なお、陽イオン及び陰イオンが各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ未満となるような濃度で共存（又は含有）させた場合は、測定感度を上昇させる効果が不充分であり適当ではない。
【００３４】
また、陽イオン及び陰イオンを各々共存（又は含有）させる濃度の上限は、特に限定されないものの、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が２，０００ｍＭを超えると測定感度が低下する場合もあるので、各々２，０００ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００３５】
なお、前記の陽イオン及び陰イオンを共存（又は含有）させる濃度であるが、陽イオン及び陰イオンの各々が前記の規定の濃度以上であれば、それぞれが異なる濃度であってもよい。
【００３６】
（３）陽イオン及び陰イオン
本発明において共存（又は含有）させる陽イオン及び陰イオンについて、以下説明を行う。
【００３７】
▲１▼ 陽イオン
前記の陽イオン及び陰イオンにおける陽イオンは、正の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
【００３８】
この陽イオンとしては、１価の陽イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陽イオンであってもよい。
【００３９】
そして、この陽イオンとしては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の陽イオン等を挙げることができる。
【００４０】
この金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、又はその他の金属イオン等を挙げることができる。
【００４１】
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。
【００４２】
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、又はバリウムイオン等を挙げることができる。
【００４３】
遷移金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は銅イオン等を挙げることができる。
【００４４】
その他の金属イオンとしては、例えば、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。
【００４５】
アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。
【００４６】
その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
【００４７】
なお、この陽イオンとしては、１価の陽イオンが好ましい。
そして、この１価の陽イオンとしては、アルカリ金属イオンが好ましい。特に、ナトリウムイオンが好ましい。
【００４８】
なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４９】
▲２▼ 陰イオン
前記の陽イオン及び陰イオンにおける陰イオンは、負の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
【００５０】
この陰イオンとしては、１価の陰イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陰イオンであってもよい。
【００５１】
そして、この陰イオンとしては、例えば、ハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。
【００５２】
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。
【００５３】
有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。
【００５４】
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、ピロ亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、ピロ亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。
【００５５】
なお、この陰イオンとしては、１価の陰イオンが好ましい。
そして、この１価の陰イオンとしては、ハロゲンイオンが好ましい。特に、塩素イオンが好ましい。
【００５６】
また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５７】
▲３▼ 陽イオン及び陰イオン
試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定方法において、ＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２とともに、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存させる方法であるが、陽イオン及び陰イオンを各々ＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２とともに、前記の濃度において共存させることができればいかなる方法でもよい。
【００５８】
例えば、試料と、前記陽イオンを含む化合物と、前記陰イオンを含む化合物とを別々に混合して、陽イオン及び陰イオンを各々ＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２とともに共存させてもよい。
【００５９】
また、試料と、前記陽イオンと前記陰イオンの両方を含む化合物とを混合して、陽イオン及び陰イオンを各々ＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２とともに共存させてもよい。
【００６０】
そしてその結果として、前記陽イオン及び前記陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存させられればよい。
【００６１】
また、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定試薬において、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で含有させる方法であるが、陽イオン及び陰イオンを各々、前記の濃度において含有させることができればいかなる方法でもよい。
【００６２】
例えば、前記陽イオンを含む化合物と、前記陰イオンを含む化合物を別々に添加して、前記測定試薬中に前記陽イオン及び前記陰イオンを含有させて、前記測定試薬を調製してもよい。
【００６３】
また、前記陽イオンと前記陰イオンの両方を含む化合物を添加して、前記測定試薬中に前記陽イオン及び前記陰イオンを含有させて、前記測定試薬を調製してもよい。
【００６４】
そしてその結果として、前記陽イオン及び前記陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で含有させられればよい。
【００６５】
なお、前記の陽イオンと陰イオンの両方を含む化合物としては、例えば、この陽イオン及び陰イオンよりなる塩等を挙げることができる。
【００６６】
（４）測定対象物質
本発明の測定方法及び測定試薬における測定対象物質は、ハイモビリティーグループプロテイン−１（ＨＭＧ−１）、及び／又はハイモビリティーグループプロテイン−２（ＨＭＧ−２）である。
【００６７】
このＨＭＧ−１又はＨＭＧ−２としては、例えば、ヒト由来のもの、ウシ由来のもの、ブタ由来のもの、ウサギ由来のもの、ラット由来のもの、又はマウス由来のもの等を挙げることができる。更に、これらの遺伝子組み換え体由来のもの等を挙げることができる。
【００６８】
（５）試料
本発明において、試料とは、前記のＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２が存在する可能性があり、かつそのＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
【００６９】
例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト若しくは動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；そして、植物の抽出液等を挙げることができる。
【００７０】
（６）測定方法
▲１▼ 総論
本発明の、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定方法において、その測定原理は、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の存在の有無、又は含有量（濃度）を測定することができるものであれば、いかなるものであってもよい。
例えば、免疫学的測定方法等を挙げることができる。
【００７１】
▲２▼ 免疫学的測定方法
本発明の測定方法においては、その測定原理として、ＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２に特異的に結合する抗体を用いて測定を行う免疫学的測定方法が好ましいものである。
【００７２】
この免疫学的測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された「測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法」、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００７３】
そして、前記の免疫学的測定方法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定方法を適用することができる。
また、本発明の測定方法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００７４】
▲３▼ 標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明の測定方法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができる。
【００７５】
サンドイッチ法により実施する場合を例に取り以下説明を行う。
試料中に含まれるＨＭＧ−１を測定する場合には、固相化抗体及び標識抗体の両方の抗体とも、ＨＭＧ−１に結合することができる抗体である必要がある。
また、試料中に含まれるＨＭＧ−２を測定する場合には、固相化抗体及び標識抗体の両方の抗体とも、ＨＭＧ−２に結合することができる抗体である必要がある。
そして、試料中に含まれるＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２を測定する場合には、固相化抗体及び標識抗体の両方の抗体とも、ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２に結合することができる抗体である必要がある。
【００７６】
前記測定方法に用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
【００７７】
固相化抗体は、前記の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００７８】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
【００７９】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００８０】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００８１】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
【００８２】
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
【００８３】
また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００８４】
前記の抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００８５】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【００８６】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ＨＭＧ−１＝標識抗体」（又は「固相担体＝固相化抗体＝ＨＭＧ−２＝標識抗体」）の複合体を形成させる。
【００８７】
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−１」（又は「固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−２」）を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれていたＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の量（濃度）を測定することができる。
【００８８】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
【００８９】
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。
【００９０】
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量（発光強度）を測定する。
【００９１】
▲４▼ 凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明の測定方法を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００９２】
抗体を固相担体に感作させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
【００９３】
抗体を固相担体に感作させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００９４】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
【００９５】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００９６】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００９７】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ＨＭＧ−１又はＨＭＧ−２）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【００９８】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の濃度、抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【００９９】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された抗体と試料中に含まれていたＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、抗体を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の抗体を固相化させたラテックス粒子を測定試薬に含ませる。
【０１００】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【０１０１】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【０１０２】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【０１０３】
（７）測定試薬
▲１▼ 総論
本発明の、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定試薬は、前述した本発明の測定方法に使用することができるものである。
従って、本発明の測定試薬の測定原理、使用方法等については、前述した本発明の測定方法と同様である。
【０１０４】
▲２▼ その他の試薬成分
本発明の測定試薬において、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
【０１０５】
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０１０６】
また、本発明の測定試薬には、前記の抗体を固相化した固相担体、前記の抗体を感作した固相担体、及び／又は前記の抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインもしくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤なとの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１０７】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油もしくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩もしくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１０８】
▲３▼ 測定試薬の構成
本発明の測定試薬は、そのもの単独にて、試料中のＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定に使用することができる。
そして、そのもの単独にて、販売することができる。
また、本発明の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、試料中のＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定に使用することもできる。
そして、他の試薬と組み合わせて、販売することもできる。
【０１０９】
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【０１１０】
そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の測定試薬を第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様々な組合せにて使用、及び販売を行うことができる。
【０１１１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に説明する。
なお、本発明は、これらにより限定されるものではない。
【０１１２】
〔実施例１〕（陽イオン及び陰イオンの濃度を変えてのヒトＨＭＧ−１の測定）陽イオン及び陰イオンの濃度を変え、発光免疫測定法によりヒトＨＭＧ−１の測定を行った。
【０１１３】
１．測定試薬
▲１▼ パーオキシダーゼ標識抗体
参考例２で調製した、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２に結合する抗体にパーオキシダーゼを結合させたパーオキシダーゼ標識抗体を、発光免疫測定法のサンドイッチ法における酵素標識抗体として使用した。
【０１１４】
▲２▼ マイクロプレート固相化抗体
参考例３で調製した、ヒトＨＭＧ−１に結合しヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体をマイクロプレートの各ウェルに固相化したマイクロプレート固相化抗体を、発光免疫測定法のサンドイッチ法における固相化抗体として使用した。
【０１１５】
▲３▼ 希釈試薬
試料の希釈試薬を、各々下記の通り調製した。
【０１１６】
〔Ａ〕 塩化ナトリウム濃度がそれぞれ下のものである１００ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ７．０）。
（イ） ０ｍＭ
（ロ） ３００ｍＭ
（ハ） ５００ｍＭ
（ニ） ８００ｍＭ
（ホ） １，０００ｍＭ
（ヘ） １，５００ｍＭ
（ト） ２，０００ｍＭ
【０１１７】
〔Ｂ〕 塩化ナトリウム濃度がそれぞれ下のものである１００ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ８．０）。
（イ） ０ｍＭ
（ロ） ３００ｍＭ
（ハ） ５００ｍＭ
（ニ） ８００ｍＭ
（ホ） １，０００ｍＭ
（ヘ） １，５００ｍＭ
（ト） ２，０００ｍＭ
【０１１８】
〔Ｃ〕 塩化ナトリウム濃度がそれぞれ下のものである１００ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ９．０）。
（イ） ０ｍＭ
（ロ） ３００ｍＭ
（ハ） ５００ｍＭ
（ニ） ８００ｍＭ
（ホ） １，０００ｍＭ
（ヘ） １，５００ｍＭ
（ト） ２，０００ｍＭ
【０１１９】
〔Ｄ〕 塩化ナトリウム濃度がそれぞれ下のものである１００ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ１０．０）。
（イ） ０ｍＭ
（ロ） ３００ｍＭ
（ハ） ５００ｍＭ
（ニ） ８００ｍＭ
（ホ） １，０００ｍＭ
（ヘ） １，５００ｍＭ
（ト） ２，０００ｍＭ
【０１２０】
※ 塩化ナトリウムのナトリウムイオンの価数は「＋１」であり、塩素イオンの価数は「−１」であって、イオンの価数の絶対値はそれぞれ「１」であるので、上記の各希釈試薬におけるナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値は、それぞれモル濃度の通りである。
【０１２１】
▲４▼ 洗浄液
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を調製し、洗浄液とした。
【０１２２】
▲５▼ パーオキシダーゼ基質液
ＰＳ−１試薬（ルミノゲン社製）を、パーオキシダーゼ基質液として用いた。
【０１２３】
２．試料
▲１▼ 参考例１において調製したヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、生理食塩水（１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液）で充分に透析した。
この透析後の前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。
そして、この前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、生理食塩水（１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液）で希釈して、前記ヒトＨＭＧ−１濃度が１０ｎｇ／ｍＬの試料を調製した。
【０１２４】
▲２▼ 前記▲１▼と同様にして、ヒトＨＭＧ−１濃度が１００ｎｇ／ｍＬの試料を調製した。
【０１２５】
３．発光免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
▲１▼ 前記２の▲１▼で調製した試料（ヒトＨＭＧ−１濃度が１０ｎｇ／ｍＬである１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液）の５００μＬを、前記１の▲３▼の希釈試薬（計２８種類）の各々の５００μＬと混合して、計２８種類の混合液を調製した。
【０１２６】
なお、この混合液中のナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値は、それぞれのモル濃度の通りであって、以下の通りである。
【０１２７】
〔Ａ〕 ５０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ７．０）。
（イ） ７５ｍＭ
（ロ） ２２５ｍＭ
（ハ） ３２５ｍＭ
（ニ） ４７５ｍＭ
（ホ） ５７５ｍＭ
（ヘ） ８２５ｍＭ
（ト） １，０７５ｍＭ
【０１２８】
〔Ｂ〕 ５０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ８．０）。
（イ） ７５ｍＭ
（ロ） ２２５ｍＭ
（ハ） ３２５ｍＭ
（ニ） ４７５ｍＭ
（ホ） ５７５ｍＭ
（ヘ） ８２５ｍＭ
（ト） １，０７５ｍＭ
【０１２９】
〔Ｃ〕 ５０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ９．０）。
（イ） ７５ｍＭ
（ロ） ２２５ｍＭ
（ハ） ３２５ｍＭ
（ニ） ４７５ｍＭ
（ホ） ５７５ｍＭ
（ヘ） ８２５ｍＭ
（ト） １，０７５ｍＭ
【０１３０】
〔Ｄ〕 ５０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ１０．０）。
（イ） ７５ｍＭ
（ロ） ２２５ｍＭ
（ハ） ３２５ｍＭ
（ニ） ４７５ｍＭ
（ホ） ５７５ｍＭ
（ヘ） ８２５ｍＭ
（ト） １，０７５ｍＭ
【０１３１】
▲２▼ 前記▲１▼で調製した混合液（計２８種類）の各々を、前記１の▲２▼のマイクロプレート固相化抗体のそれぞれのウェルに１００μＬ添加して、３７℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化された抗体と試料に含まれていたヒトＨＭＧ−１との抗原抗体反応を行わせた。
【０１３２】
なお、この抗原抗体反応の際のナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値は、希釈されていないので、上記の通りである。
【０１３３】
▲３▼ 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の▲４▼の洗浄液で洗浄した。
【０１３４】
▲４▼ 前記１の▲１▼のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。
次にこれを、前記▲３▼の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。
これにより、マイクロプレートに固相化した抗体に結合したヒトＨＭＧ−１に、パーオキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。
【０１３５】
▲５▼ その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の▲４▼の洗浄液で洗浄した。
【０１３６】
▲６▼ 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、前記１の▲５▼のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。そして、室温で反応させた。
【０１３７】
▲７▼ 前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１０分後に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェル中の溶液の発光強度を、発光マイクロプレートリーダー〔ＣＴ９０００Ｄ〕（ダイアヤトロン社製）により測定した。
【０１３８】
▲８▼ 前記２の▲２▼で調製した試料（ヒトＨＭＧ−１濃度が１００ｎｇ／ｍＬである１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液）について、前記▲１▼〜▲７▼の通りに操作を行い測定を行った。
【０１３９】
▲９▼ 以上の操作により得られた、前記の各測定値を表１及び図１〜図４に示した。
なお、表及び図１〜図４に示した各々の測定値（相対発光強度）は、生理食塩水（１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液）を試料とした場合の測定値（相対発光強度）を盲検値として差し引いたものの値を示した。
【０１４０】
【表１】
この表１における数値は測定値（相対発光強度）であり、そして括弧内の数値はナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が７５ｍＭの場合の測定値（相対発光強度）で他の濃度における測定値（相対発光強度）を除したときの百分率を示す。
【０１４２】
図において、図１はｐＨがｐＨ７．０の場合の測定結果を示し、図２はｐＨ８．０の場合の測定結果を示し、図３はｐＨ９．０の場合の測定結果を示し、そして、図４はｐＨ１０．０の場合の測定結果を示す。
【０１４３】
これらの図において、横軸は混合液中におけるナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値（すなわち、抗原抗体反応系におけるナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値）である。また、縦軸は、相対発光強度である。
【０１４４】
４．まとめ
表１及び図１〜図４より、ｐＨがいずれの場合においても、ヒトＨＭＧ−１と共存するナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が、それぞれ７５ｍＭのときには、測定により得られるシグナルの量（相対発光強度）が極めて小さく、感度が得られていないことが分かる。
【０１４５】
これに対して、いずれのｐＨの場合においても、ヒトＨＭＧ−１と共存するナトリウムイオン及び塩素イオンの各々のモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が、それぞれ１５０ｍＭ以上においては測定により得られるシグナルの量（相対発光強度）が増加し感度が高くなっており、更に２２５ｍＭ以上においてはシグナルの量（相対発光強度）がより多く高感度化されていることが分かる。特に、４７５ｍＭ〜８２５ｍＭの範囲においては、シグナルの量（相対発光強度）が多く更に高感度化されていることが分かる。
【０１４６】
これらのことより、試料中のＨＭＧ−１の測定において、ＨＭＧ−１とともに、陽イオン（ナトリウムイオン）及び陰イオン（塩素イオン）を各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存させることにより、測定により得られるシグナルの量を顕著に増加させることができ、これにより充分な測定感度を得ることができ、低濃度域も正確に測定することができることが確かめられた。
【０１４７】
〔参考例１〕（ヒト細胞よりのヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の調製）
ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を調製した。
【０１４８】
▲１▼ まず、ＲＰＭＩ１６４０にて培養したヒト細胞（ＨＬ６０細胞）の培養液の上清の３Ｌを、約２５０ｍＬに濃縮した。
【０１４９】
▲２▼ 次に、終濃度が２００ｍＭとなるように、塩化ナトリウムを添加した。
【０１５０】
▲３▼ これを遠心分離機で遠心分離を行い（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）、その上清を分取して、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過を行った。
【０１５１】
▲４▼ この濾液を、ハイトラップ・ヘパリン・カラム（アマシャムファルマシア社製）に通した。
【０１５２】
▲５▼ このカラムに、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を流して洗った。
【０１５３】
▲６▼ 次に、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）において、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭから２，０００ｍＭまでのグラジエントをかけて前記カラムより溶出させた。
【０１５４】
▲７▼ 前記の各溶出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を同定した。
この画分は、塩化ナトリウム濃度が５００ｍＭから１，０００ｍＭにあるときに溶出した画分であった。
【０１５５】
▲８▼ 前記▲７▼のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５のカラムに通した。
そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
【０１５６】
▲９▼ ここで溶出した各画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１を含む画分、及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を各々同定した。
【０１５７】
以上の操作により、ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトＨＭＧ−１を調製し、また、ヒトＨＭＧ−２をも調製した
【０１５８】
〔参考例２〕（パーオキシダーゼ標識抗体の調製）
ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（モノクローナル抗体）にパーオキシダーゼを標識化して、パーオキシダーゼ標識抗体を調製した。
【０１５９】
（１）パーオキシダーゼへのマレイミド基の導入
パーオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）４ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．３ｍＬに溶解後、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルホン酸の１．０ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの６０μＬに溶解したものを添加して、３０℃で６０分間反応させた。
その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一夜透析を行った。
以上の操作により、前記のパーオキシダーゼに、マレイミド基を導入した。
【０１６０】
（２）抗体へのチオール基の導入
ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（モノクローナル抗体）〔自家調製品〕を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する０．１Ｍリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．５）の０．５ｍＬに、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸の０．６ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの１０μＬに溶解したものを添加して、室温で３０分間反応させた。
【０１６１】
その後これに、０．１ＭのＥＤＴＡの２０μＬ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍのヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ添加して、３０℃で５分間放置した。
【０１６２】
次にこれを、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５のカラムに通し、単純ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、過剰のＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸を取り除き、抗体画分を集めた。
以上の操作により、前記のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（モノクローナル抗体）に、チオール基を導入した。
【０１６３】
（３）標識抗体の調製
前記（１）で調製したマレイミド基を導入したパーオキシダーゼ及び前記（２）で調製したチオール基を導入した抗体を一対一で混合し、３０℃で２０時間反応させて、前記抗体へのパーオキシダーゼの導入（標識化）を行った。
【０１６４】
その後これを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４のカラムに通し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。
このゲル濾過クロマトグラフィーの各画分を、１０％ポリアクリルアミド電気泳動にかけて確認を行い、未結合のパーオキシダーゼが混入しないように、パーオキシダーゼが結合した抗体の画分だけを集めた。
【０１６５】
このパーオキシダーゼが結合した抗体の画分を濃縮して、パーオキシダーゼが結合した抗体、即ちパーオキシダーゼ標識抗体を得た。
そして、このパーオキシダーゼ標識抗体を含む溶液のタンパク質濃度を測定した。
【０１６６】
〔参考例３〕（マイクロプレート固相化抗体）
ヒトＨＭＧ−１に結合しヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（ポリクローナル抗体）をマイクロプレートに固相化して、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
【０１６７】
（１） ヒトＨＭＧ−１に結合しヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（ポリクローナル抗体）〔ベクトンデッキンソン社販売〕を、リン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により１５μｇ／ｍＬとした後、９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、前記抗体を前記マイクロプレートの各ウェルに吸着させ、固相化した。
【０１６８】
（２） この抗体が固相化されたマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
【０１６９】
以上の操作により、ヒトＨＭＧ−１に結合しヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（ポリクローナル抗体）をマイクロプレートに固相化した、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
【０１７０】
【発明の効果】
本発明のＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定方法並びに測定試薬は、試料中に含まれるＨＭＧ−１及び／又はＨＭＧ−２の測定に当たり、多量のシグナルを得ることができ、高感度に測定を行えるものである。その結果として、再現性よく、そして、低濃度域も正確に測定することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨ７．０において陽イオン及び陰イオンの濃度を変えた場合のヒトＨＭＧ−１の測定値を示したグラフ。
【図２】ｐＨ８．０において陽イオン及び陰イオンの濃度を変えた場合のヒトＨＭＧ−１の測定値を示したグラフ。
【図３】ｐＨ９．０において陽イオン及び陰イオンの濃度を変えた場合のヒトＨＭＧ−１の測定値を示したグラフ。
【図４】ｐＨ１０．０において陽イオン及び陰イオンの濃度を変えた場合のヒトＨＭＧ−１の測定値を示したグラフ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a measuring method and a measuring reagent for high mobility group protein-1 and / or high mobility group protein-2 that can be markers for diseases such as sepsis.
The present invention is useful in the field of life science such as clinical examination, clinical pathology, immunology and medicine, and in the field of chemistry such as analytical chemistry.
[0002]
[Prior art]
High Mobility Group Protein (hereinafter sometimes abbreviated as "HMG") was discovered in 1964 as a large amount of non-histone protein contained in chromatin structure and is universally included in all higher animals and plants It has a very high degree of conservation of primary structure among tribes. It has also been found that it exists not only in the nucleus but also in the cytoplasm. Although the physiological effect is not clearly understood, HMG relaxes the double helix structure when binding to DNA, so that the transcriptional activity is increased by changing the higher order structure of DNA to the optimal structure during the transcription reaction. It is thought to function as a very wide range of transcriptional promoters and nucleosome relaxing factors.
[0003]
There are several types of HMG. For example, high mobility group protein-1 (HMG-1), high mobility group protein-2 (HMG-2), high mobility group protein-3 (HMG-3), high mobility group protein-8 (HMG-8), High Mobility Group Protein-17 (HMG-17), High Mobility Group Protein-I (HMG-I), High Mobility Group Protein-Y (HMG-Y), High Mobility Group Protein-I (Y) (HMG-I ( Y)), high mobility group protein IC (HMG IC) and the like.
[0004]
In addition, when the present inventors analyzed the homology of amino acid sequences using genetic information processing software “GENETYX” (Software Development), bovine HMG-1 was compared with human HMG-1. Was 98.6% and porcine HMG-1 homology was 99.1%.
Similarly, human HMG-2 has a homology of 81.2%, bovine HMG-2 has a homology of 72.3%, and porcine HMG-2. The homology of was 99.4%.
[0005]
In 1999, Wang et al. Performed the first quantitative measurement of serum (in blood) HMG-1 by Western blotting using a polyclonal antibody prepared using rat HMG-1 itself prepared by gene recombination technology as an immunogen. It was. As a result, Wang et al. Showed that HMG-1 can be a marker for sepsis. And, it was shown that it is possible to accurately measure HMG-1 in blood in order to discriminate between surviving patients and patients dying among septic patients. That is, the usefulness of not only confirming the presence of HMG-1 in blood but also precise quantification was clarified (see Non-Patent Document 1).
[0006]
It has been previously shown that antibodies used for measurement of HMG-1, that is, antibodies that bind to HMG-1, can be prepared by Perkinen et al. And Rep et al. (Non-Patent Document 2 and Non-Patent Documents). 3).
Using this antibody, Rep et al. State that Solid-phase Enzyme Immunoassay is possible for HMG-1. [In this solid-phase enzyme immunoassay, purified HMG-1 is immobilized on a well of a microplate (microtiter plate), and an antibody that binds to enzyme-labeled HMG-1 is brought into contact therewith to act. Thus, it was confirmed that the antibody that binds to HMG-1 binds to purified HMG-1. ]
[0007]
[Non-Patent Document 1]
H. Wang et al., SCIENCE, 285, 9, 248-251, published 1999
[0008]
[Non-Patent Document 2]
J. et al. Parkinen et al., The Journal of Biological Chemistry, 268, 26, 19726-19738, published in 1993.
[0009]
[Non-Patent Document 3]
W. A. Lepp et al., Journal of Immunoassay, Vol. 10, No. 4, pp. 449-465, published in 1989
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The inventors of the present invention constructed a measurement system for HMG-1 contained in the sample and measured it, but found that the sensitivity of the measurement could not be obtained.
Since the amount of signal obtained by the measurement was extremely small, the reproducibility was poor, the accuracy in the low concentration range was lacking, and the measurement was not satisfactory.
[0011]
The object of the present invention is to make it possible to obtain sufficient measurement sensitivity in measuring HMG-1 contained in a sample and HMG-2 having high homology with this HMG-1, and as a result, reproducibility. It is desirable to provide a method and a reagent for measuring HMG-1 and / or HMG-2 that can accurately measure a low concentration range.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
As a result of investigations aimed at solving the above-mentioned problems, the present inventors can increase measurement sensitivity by coexisting cations and anions together with HMG-1 and / or HMG-2. As a result, the present invention has been completed.
[0013]
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) In measurement of high mobility group protein-1 and / or high mobility group protein-2 contained in a sample, together with high mobility group protein-1 and / or high mobility group protein-2, cations and anions are added. Each of the high mobility group protein-1 and / or high concentration contained in the sample is characterized by coexisting at a concentration such that a value obtained by multiplying the respective molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 150 mM or more. Method for measuring mobility group protein-2.
[0014]
(2) The cation is an alkali metal ion, an alkaline earth metal ion, a transition metal ion or an ammonium ion, and the anion is a halogen ion, an acid group made of an organic compound, or an acid group made of an inorganic compound ( 1) The measuring method as described.
[0015]
(3) The cation and the anion are allowed to coexist at a concentration such that a value obtained by multiplying the respective molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 225 mM or more. 2) The measuring method as described.
[0016]
(4) The above (1) to (1), wherein the cation and the anion are allowed to coexist at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 475 mM or more. The measurement method according to any one of 3).
[0017]
(5) In the measurement reagent for high mobility group protein-1 and / or high mobility group protein-2 contained in the sample, each cation and anion are multiplied by the absolute value of the valence of the ion, respectively. A reagent for measuring high mobility group protein-1 and / or high mobility group protein-2 contained in a sample, wherein the reagent is contained at a concentration such that the measured value is 150 mM or more.
[0018]
(6) The cation is an alkali metal ion, an alkaline earth metal ion, a transition metal ion or an ammonium ion, and the anion is a halogen ion, an acid group composed of an organic compound, or an acid group composed of an inorganic compound. 5) The measuring reagent according to the above.
[0019]
(7) The cation and the anion are each contained in a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 225 mM or more. 6) The measuring reagent according to the above.
[0020]
(8) Each of the cation and the anion is contained at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 475 mM or more. 7) The measuring reagent according to any one of 7).
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0022]
(1) Basic requirements of the invention
In the method for measuring HMG-1 and / or HMG-2 contained in a sample of the present invention, in the measurement of HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample, HMG-1 and / or HMG-2 In addition, it is essential that the cation and the anion coexist at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 150 mM or more.
[0023]
Further, in the measurement reagent for HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample of the present invention, the cation and the anion are used in the measurement reagent for HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample. In each case, it is essential that each molar concentration is contained at a concentration such that a value obtained by multiplying the absolute value of the valence of ions becomes 150 mM or more.
[0024]
As described above, the measurement sensitivity can be increased in measuring HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample.
[0025]
In addition, “specifically coexisting (or containing) a cation and an anion each at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 150 mM or more” will be specifically described below. Illustrated and described.
[0026]
For example, when sodium ions are used as cations and chlorine ions as anions are present (or contained), the valences of the ions are “+1” and “−1”, respectively, and the absolute value of the valence of the ions is Since both are “1”, both sodium ion and chlorine ion are allowed to coexist (or contain) at a molar concentration of 150 mM or more.
[0027]
In addition, when sodium ions are present (or contained) as cations and sulfate ions as anions, the valence of sodium ions is “+1” and the valence of sulfate ions is “−2”. The absolute values of the valences are “1” and “2”, respectively. Therefore, sodium ions are allowed to coexist (or contain) at a molar concentration of 150 mM or more, and sulfate ions at a molar concentration of 75 mM or more.
[0028]
When magnesium ions are used as cations and sulfate ions as anions are present (or contained), the valences of the ions are “+2” and “−2”, respectively, and the absolute value of the valence of the ions is Since both are “2”, both magnesium ion and sulfate ion are allowed to coexist (or contain) at a molar concentration of 75 mM or more.
[0029]
(2) Cation and anion concentrations
In the present invention, the cation and the anion are allowed to coexist (or contain) at a concentration such that a value obtained by multiplying the respective molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 150 mM or more.
[0030]
Then, coexistence (or inclusion) of each cation and anion at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 225 mM or more further increases the measurement sensitivity. This is preferable.
[0031]
For the same reason, it is more preferable to coexist (or contain) the cation and the anion at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 475 mM or more.
[0032]
In particular, it is preferable to coexist (or contain) the cation and the anion within a concentration range in which a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 475 mM to 825 mM.
[0033]
In addition, when a cation and an anion coexist (contain) at a concentration such that a value obtained by multiplying the respective molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is less than 150 mM, the measurement sensitivity is increased. The effect is insufficient and not suitable.
[0034]
In addition, the upper limit of the concentration at which each cation and anion coexist (or contain) is not particularly limited, but if the value obtained by multiplying the respective molar concentration by the absolute value of the valence of the ion exceeds 2,000 mM, the measurement sensitivity In some cases, it is preferable to set the concentration to 2,000 mM or less.
[0035]
In addition, although it is the density | concentration which the said cation and an anion coexist (or contains), as long as each of a cation and an anion is more than the said normal density | concentration, each may be a different density | concentration.
[0036]
(3) Cation and anion
The cation and the anion coexisting (or contained) in the present invention will be described below.
[0037]
▲ 1 cation
The cation in the cation and the anion is not particularly limited as long as it is an ion having a positive charge.
[0038]
The cation may be a monovalent cation or a divalent or higher valent cation.
[0039]
And as this cation, a metal ion, an ammonium ion, or another cation etc. can be mentioned, for example.
[0040]
Examples of the metal ions include alkali metal ions, alkaline earth metal ions, transition metal ions, and other metal ions.
[0041]
Examples of alkali metal ions include lithium ions, sodium ions, or potassium ions.
[0042]
Examples of the alkaline earth metal ion include beryllium ion, magnesium ion, calcium ion, barium ion, and the like.
[0043]
Examples of transition metal ions include manganese ions, iron ions, cobalt ions, nickel ions, or copper ions.
[0044]
Examples of other metal ions include zinc ions and aluminum ions.
[0045]
Examples of ammonium ions include primary ammonium ions, secondary ammonium ions, tertiary ammonium ions, and quaternary ammonium ions.
[0046]
As other cations, for example, carbon atoms, silicon atoms, boron atoms, nitrogen atoms (in cases other than ammonium ions), phosphorus atoms, sulfur atoms, etc. are positively charged atoms or atomic groups Can be mentioned.
Specific examples thereof include a choline ion in which a carbon atom has a positive charge.
[0047]
In addition, as this cation, a monovalent cation is preferable.
And as this monovalent cation, an alkali metal ion is preferable. In particular, sodium ion is preferable.
[0048]
In addition, as this cation, only one type may be used, or a plurality of types may be used simultaneously.
[0049]
▲ 2 ▼ Anion
The anion in the cation and the anion is not particularly limited as long as it is an ion having a negative charge.
[0050]
The anion may be a monovalent anion or a divalent or higher polyvalent anion.
[0051]
Examples of the anion include halogen ions, acid groups made of organic compounds, and acid groups made of other inorganic compounds.
[0052]
As a halogen ion, a fluorine ion, a chlorine ion, a bromine ion, an iodine ion etc. can be mentioned, for example.
[0053]
Examples of the acid group made of an organic compound include acetate ion, citrate ion, gluconate ion, or oxalate ion.
[0054]
Examples of acid groups composed of other inorganic compounds include sulfate ion, sulfite ion, pyrosulfite ion, dithionite ion, thiosulfite ion, nitrate ion, nitrite ion, hyponitrite ion, peroxonitrite ion, Examples include phosphate ion, phosphite ion, pyrophosphite ion, hypophosphite ion, diphosphate ion, borate ion, carbonate ion, cyanate ion, isocyanate ion, or silicate ion. it can.
[0055]
In addition, as this anion, a monovalent anion is preferable.
And as this monovalent anion, a halogen ion is preferable. In particular, a chlorine ion is preferable.
[0056]
Moreover, as this anion, only one type may be used, or a plurality of types may be used simultaneously.
[0057]
(3) Cation and anion
In the method for measuring HMG-1 and / or HMG-2 contained in a sample, together with HMG-1 and / or HMG-2, a cation and an anion are each absolute values of the valence of ions at their respective molar concentrations. Is a method of coexisting at a concentration such that the value multiplied by 150 mM or more, but any method can be used as long as a cation and an anion can coexist with HMG-1 and / or HMG-2 respectively at the above concentration. Good.
[0058]
For example, a sample, a compound containing the cation, and a compound containing the anion may be mixed separately so that the cation and the anion coexist with HMG-1 and / or HMG-2, respectively.
[0059]
Alternatively, a sample and a compound containing both the cation and the anion may be mixed so that the cation and the anion coexist with HMG-1 and / or HMG-2, respectively.
[0060]
As a result, the cation and the anion may be allowed to coexist at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 150 mM or more.
[0061]
Further, in the measurement reagent for HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample, a value obtained by multiplying each cation and anion by the absolute value of the valence of the ion is 150 mM or more. Although it is the method of making it contain in such a density | concentration, as long as a cation and an anion can each be contained in the said density | concentration, what kind of method may be sufficient.
[0062]
For example, the measurement reagent may be prepared by separately adding a compound containing the cation and a compound containing the anion so that the cation and the anion are contained in the measurement reagent.
[0063]
In addition, the measurement reagent may be prepared by adding a compound containing both the cation and the anion and adding the cation and the anion to the measurement reagent.
[0064]
As a result, each of the cation and the anion may be contained at a concentration such that a value obtained by multiplying each molar concentration by the absolute value of the valence of the ion is 150 mM or more.
[0065]
In addition, as a compound containing both the said cation and an anion, the salt etc. which consist of this cation and an anion can be mentioned, for example.
[0066]
(4) Substances to be measured
The measurement target substance in the measurement method and measurement reagent of the present invention is high mobility group protein-1 (HMG-1) and / or high mobility group protein-2 (HMG-2).
[0067]
Examples of this HMG-1 or HMG-2 include those derived from humans, those derived from cattle, those derived from pigs, those derived from rabbits, those derived from rats, and those derived from mice. Furthermore, the thing derived from these gene recombinants can be mentioned.
[0068]
(5) Sample
In the present invention, the sample may contain the above-mentioned HMG-1 and / or HMG-2, and the presence or absence of the HMG-1 and / or HMG-2, or the content (concentration) The one to be measured.
[0069]
For example, human or animal blood, serum, plasma, urine, semen, spinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid, or other body fluids; human or animal brain or other organs, hair, skin, nails, muscles, or Examples include extracts of nerve tissues and the like; human or animal fecal extracts or suspensions; cells or fungal extracts; and plant extracts.
[0070]
(6) Measuring method
(1) General
In the method for measuring HMG-1 and / or HMG-2 contained in a sample of the present invention, the measurement principle is the presence or absence of HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample, or the content thereof Any material can be used as long as it can measure (concentration).
For example, an immunological measurement method and the like can be mentioned.
[0071]
(2) Immunological measurement method
In the measurement method of the present invention, an immunological measurement method in which measurement is performed using an antibody that specifically binds to HMG-1 and / or HMG-2 is preferable.
[0072]
Examples of the immunological measurement method include enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay (LIA), enzyme antibody method, fluorescence Antibody method, immunochromatography method, immunoturbidimetric method, latex turbidimetric method, latex agglutination measurement method, erythrocyte agglutination method, particle agglutination method, JP-A-9-229936 and JP-A-10-132919 As described, “a specific binding substance to a measurement target substance (test substance) is immobilized and a particle having a surface coated with the carrier and a specific binding substance to the measurement target substance (test substance). "Measurement method using" or ELSA method (Enzyme-linked Ligandsorbent Assay) shown by Dahlbeack et al. (Th . Omb.Haemost, 79, pp. 767-772, 1998 issue; mention may be made of WO98 / 23963) and the like.
[0073]
In the immunological measurement method described above, the measurement method of the present invention can be applied to any method such as a sandwich method, a competitive method, or a homogeneous method (homogeneous method).
In addition, the measurement in the measurement method of the present invention may be performed by a method or using an apparatus such as an analyzer.
[0074]
(3) Immunological measurement method using labeled antibody
When the measurement method of the present invention is performed by an immunological measurement method using a labeled antibody such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay, a sandwich method or a competition method, etc. Can be performed.
[0075]
The following description will be given by taking the case of the sandwich method as an example.
When measuring HMG-1 contained in a sample, both the immobilized antibody and the labeled antibody must be antibodies capable of binding to HMG-1.
Further, when measuring HMG-2 contained in a sample, both the immobilized antibody and the labeled antibody must be antibodies capable of binding to HMG-2.
When measuring HMG-1 and HMG-2 contained in the sample, both the immobilized antibody and the labeled antibody are antibodies that can bind to HMG-1 and HMG-2. There is a need.
[0076]
As the solid phase carrier used in the measurement method, polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, A solid support in the form of a microcapsule, a bead, a microplate (microtiter plate), a test tube, a stick, or a test piece made of a material such as ceramics or a magnetic material can be used.
[0077]
A solid-phase antibody can be prepared by adsorbing and binding the above-described antibody and a solid phase carrier by a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof.
[0078]
In the case of physical adsorption, according to a known method, the antibody and the solid phase carrier are mixed and brought into contact with a solution such as a buffer solution, or the antibody dissolved in the buffer solution is brought into contact with the solid phase carrier, etc. It can be carried out.
[0079]
When the chemical binding method is used, the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue on Extraordinary Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications”, Clinical Pathology Publications, 1983; Japan Biochemical Society In accordance with known methods described in ed. “Shinsei Kagaku Kenkyu Ken 1 Protein IV”, published by Tokyo Kagaku Dojin, published in 1991, etc., the antibody and solid phase carrier are divalent cross-linking reagents such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide. It is possible to carry out the reaction by reacting with the amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group or hydroxyl group of the antibody and the solid phase carrier.
[0080]
Further, if it is necessary to carry out treatment to suppress non-specific reaction or spontaneous aggregation of the solid phase carrier, bovine serum albumin (BSA) is applied to the surface or inner wall surface of the solid phase carrier on which the antibody is immobilized. ), Treatment by known methods such as casein, gelatin, protein such as ovalbumin or its salt, surfactant or nonfat dry milk, etc., and blocking treatment (masking treatment) of the solid phase carrier May be.
[0081]
As the labeling substance, peroxidase (POD), alkaline phosphatase (ALP), β-galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, amylase, or the like can be used in the case of enzyme immunoassay.
[0082]
In the case of fluorescence immunoassay, fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate, dichlorotriazine isothiocyanate, or the like can be used. In the case of a radioimmunoassay, tritium, iodine 125, iodine 131, or the like can be used.
[0083]
In the luminescence immunoassay method, NADH-FMNH2-luciferase system, luminol-hydrogen peroxide-POD system, acridinium ester system or dioxetane compound system can be used.
[0084]
The above-mentioned method for binding an antibody to a labeling substance such as an enzyme is described in the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue on Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications”, Clinical Pathology Publications, 1983. In accordance with a known method described in “Shinsei Kagaku Kogaku Kenkyu 1 Protein IV” edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Kagaku Dojin, 1991, etc., the antibody and the labeling substance are divalent such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide. The cross-linking reagent can be mixed and brought into contact with each other to react with the amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group, hydroxyl group or the like of the antibody and the labeling substance.
[0085]
The operation method of the measurement is a known method or the like (edited by the Japanese Society of Clinical Pathology “Special Issue on Extraordinary Clinical Pathology No. 53 Immunoassay for Clinical Examination -Technology and Application”, published by Clinical Pathology, 1983; edited by Ishikawa Yuji et al. "Enzyme Immunoassay", 3rd edition, Medical School, published in 1987; edited by Kitagawa Tsuneki et al., "Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No.31 Enzyme Immunoassay", Kyoritsu Shuppan, published in 1987).
[0086]
For example, “solid phase carrier = solid phase antibody = HMG-1 = labeled antibody” by reacting the solid phase antibody with the sample and simultaneously reacting the labeled antibody or reacting the labeled antibody after washing (“ Alternatively, a complex of “solid phase carrier = solid phase antibody = HMG-2 = labeled antibody”) is formed.
[0087]
Then, the unbound labeled antibody is washed and separated, and the labeled antibody bound to the solid phase carrier via “solid phase antibody = human HMG-1” (or “solid phase antibody = human HMG-2”) The amount (concentration) of HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample can be measured from the amount or the amount of unbound labeled antibody.
[0088]
Specifically, in the case of an enzyme immunoassay, a substrate is reacted with an enzyme labeled with an antibody under the optimum conditions, and the amount of the enzyme reaction product is measured by an optical method or the like.
[0089]
In the case of the fluorescence immunoassay, the fluorescence intensity by the fluorescent substance label is measured, and in the case of the radioimmunoassay, the radiation dose by the radioactive substance label is measured.
[0090]
In the case of the luminescence immunoassay, the luminescence amount (luminescence intensity) by the luminescence reaction system is measured.
[0091]
(4) Immunological measurement method by agglutination method
The measurement method of the present invention can be used to generate immune complex aggregates such as immunoturbidimetry, latex turbidimetry, latex agglutination, erythrocyte agglutination, or particle agglutination. When the measurement is carried out by a manual method or by a visual measurement method, a phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, Good buffer, etc. can be used as a solvent. Reaction accelerators and nonspecific reaction inhibitors may be included.
[0092]
When the antibody is used after sensitizing a solid phase carrier, the solid phase carrier includes polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer. Polymer, vinyl acetate-acrylic acid copolymer, polyacrolein, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer, styrene-butadiene copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer Particles made of materials such as latex, gelatin, liposomes, microcapsules, erythrocytes, silica, alumina, carbon black, metal compounds, metals, ceramics or magnetic materials can be used.
[0093]
As a method for sensitizing an antibody to a solid phase carrier, a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof can be used.
[0094]
In the case of physical adsorption, according to a known method, the antibody and the solid phase carrier are mixed and brought into contact in a solution such as a buffer solution, or the antibody dissolved in the buffer solution or the like is brought into contact with the solid phase carrier, etc. It can be carried out.
[0095]
When the chemical binding method is used, the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue on Extraordinary Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications”, Clinical Pathology Publications, 1983; Japan Biochemical Society In accordance with known methods described in ed. “Shinsei Kagaku Kenkyu Ken 1 Protein IV”, published by Tokyo Kagaku Dojin, published in 1991, etc., the antibody and solid phase carrier are divalent cross-linking reagents such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide. It is possible to carry out the reaction by reacting with the amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group or hydroxyl group of the antibody and the solid phase carrier.
[0096]
Further, if it is necessary to carry out treatment to suppress non-specific reaction or spontaneous aggregation of the solid phase carrier, bovine serum albumin (BSA) is applied to the surface or inner wall surface of the solid phase carrier on which the antibody is immobilized. ), Treatment by known methods such as casein, gelatin, protein such as ovalbumin or its salt, surfactant or nonfat dry milk, etc., and blocking treatment (masking treatment) of the solid phase carrier May be.
[0097]
When the latex turbidimetry is used as the measurement principle, the particle size of the latex particles used as the solid phase carrier is not particularly limited, but the latex particles are measured via the substance to be measured (HMG-1 or HMG-2). For reasons such as the degree of bonding and formation of aggregates, and the ease of measurement of the generated aggregates, the average particle size of the latex particles is preferably 0.04 to 1 μm.
[0098]
When the latex turbidimetric method is used as the measurement principle, the concentration of the latex particles in which the antibody is solid-phased is included in the concentration of HMG-1 and / or HMG-2 in the sample, on the latex particle surface of the antibody. Since the optimum concentration differs depending on various conditions such as the distribution density in the sample, the particle size of the latex particles, and the mixing ratio of the sample and the measuring reagent, it cannot be generally stated.
[0099]
However, usually, during a measurement reaction in which a sample and a measurement reagent are mixed and an antigen-antibody reaction between the antibody immobilized on latex particles and HMG-1 and / or HMG-2 contained in the sample is performed. In general, the concentration of latex particles on which the antibody is immobilized is 0.005 to 1% (w / v) in the reaction mixture. Latex particles in which an antibody having such a concentration is immobilized is included in the measurement reagent.
[0100]
In addition, when the indirect agglutination reaction method such as latex agglutination reaction method, erythrocyte agglutination reaction method or particle agglutination reaction method is used as the measurement principle, the particle size of the particles used as the solid phase carrier is not particularly limited, but the average particle The diameter is preferably in the range of 0.01 to 100 μm, and more preferably in the range of 0.5 to 10 μm. And it is preferable that the specific gravity of these particle | grains exists in the range of 1-10, and it is more preferable that it exists in the range of 1-2.
[0101]
In addition, as a container used for the measurement when the indirect aggregation reaction method such as the latex agglutination reaction method, the red blood cell agglutination reaction method or the particle agglutination reaction method is used as a measurement principle, for example, glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, etc. And a test tube, a microplate (microtiter plate), a tray, and the like.
The bottom surface of the solution storage portion (such as a well of a microplate) of these containers preferably has a shape having an inclination from the center to the periphery of the bottom, such as U-type, V-type, or UV-type.
[0102]
The measuring operation can be performed by a known method or the like. For example, in the case of measuring by an optical method, the sample is reacted with the antibody or the antibody sensitized to the sample and the solid support, and the endpoint is measured. Transmitted light and scattered light are measured by the method or the rate method. Moreover, when measuring visually, in the said containers, such as a plate and a microplate, the antibody made to sensitize a sample and a solid-phase carrier is made to react, and the state of aggregation is visually determined.
In addition, you may measure using apparatuses, such as a microplate reader, instead of measuring visually.
[0103]
(7) Measuring reagent
(1) General
The measurement reagent for HMG-1 and / or HMG-2 contained in a sample of the present invention can be used in the above-described measurement method of the present invention.
Therefore, the measurement principle and method of use of the measurement reagent of the present invention are the same as the measurement method of the present invention described above.
[0104]
(2) Other reagent components
In the measurement reagent of the present invention, various aqueous solvents can be used as the solvent.
Examples of the aqueous solvent include purified water, physiological saline, and various buffer solutions such as Tris buffer, phosphate buffer, or phosphate buffered saline.
[0105]
About the pH of this buffer solution, an appropriate pH may be appropriately selected and used. Although there is no particular limitation, it is general to select and use a pH within the range of pH 3-12.
[0106]
In addition, the measurement reagent of the present invention includes a solid phase carrier on which the antibody is immobilized, a solid phase carrier on which the antibody is sensitized, and / or a label in which the antibody and a labeling substance such as an enzyme are bound. In addition to reagent components such as antibodies, proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or salts thereof; various salts; various sugars; skim milk powder; various animal sera such as normal rabbit serum; Various preservatives such as sodium phosphide or antibiotics; activating substances; reaction promoting substances; sensitivity increasing substances such as polyethylene glycol; nonspecific reaction inhibiting substances; or nonionic surfactants, amphoteric surfactants or anions One type or two or more types of various surfactants such as a surfactant may be appropriately contained.
And the density | concentration at the time of making these contain in a measuring reagent is although it does not specifically limit, 0.001 to 10% (W / V) is preferable, and 0.01 to 5% (W / V) is especially preferable. .
[0107]
Examples of the surfactant include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, Nonionic surfactants such as polyoxyethylene phytosterol, phytostanol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin; betaine acetate, etc. Amphoteric surfactants; or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or polyoxyethylene alkyl ether acetic acid Anionic surfactants, such as and the like.
[0108]
(3) Composition of measuring reagent
The measuring reagent of the present invention can be used alone for measuring HMG-1 and / or HMG-2 in a sample.
And it can be sold by itself.
Moreover, the measuring reagent of this invention can also be used for the measurement of HMG-1 and / or HMG-2 in a sample combining with another reagent.
And it can also be sold in combination with other reagents.
[0109]
Examples of the other reagents include buffers, sample diluents, reagent diluents, reagents containing labeling substances, reagents containing substances that generate signals such as color development, and signals related to color development. A reagent containing a substance, a reagent containing a substance for performing calibration (calibration), a reagent containing a substance for performing accuracy control, and the like can be given.
[0110]
The other reagent is the first reagent and the measurement reagent of the present invention is the second reagent, or the measurement reagent of the present invention is the first reagent and the other reagent is the second reagent. They can be used and sold in various combinations as appropriate.
[0111]
【Example】
The present invention will be further described below with reference to examples.
In addition, this invention is not limited by these.
[0112]
[Example 1] (Measurement of human HMG-1 with different concentrations of cation and anion) The concentration of cation and anion was changed, and human HMG-1 was measured by a luminescence immunoassay.
[0113]
1. Reagent
(1) Peroxidase-labeled antibody
The peroxidase-labeled antibody prepared in Reference Example 2 in which peroxidase was bound to the antibody that binds to human HMG-1 and human HMG-2 was used as an enzyme-labeled antibody in the sandwich method of luminescence immunoassay.
[0114]
(2) Microplate immobilized antibody
The microplate-immobilized antibody prepared in Reference Example 3 in which the antibody that binds to human HMG-1 but not to human HMG-2 was immobilized on each well of the microplate was used in the sandwich method of luminescence immunoassay. Used as immobilized antibody.
[0115]
(3) Diluting reagent
Sample dilution reagents were each prepared as follows.
[0116]
[A] 100 mM Good buffer solution (pH 7.0) having a lower sodium chloride concentration.
(I) 0 mM
(B) 300 mM
(C) 500 mM
(D) 800 mM
(E) 1,000 mM
(F) 1,500 mM
(G) 2,000 mM
[0117]
[B] 100 mM Good buffer solution (pH 8.0) having a sodium chloride concentration below.
(I) 0 mM
(B) 300 mM
(C) 500 mM
(D) 800 mM
(E) 1,000 mM
(F) 1,500 mM
(G) 2,000 mM
[0118]
[C] 100 mM Good buffer solution (pH 9.0) having a sodium chloride concentration below.
(I) 0 mM
(B) 300 mM
(C) 500 mM
(D) 800 mM
(E) 1,000 mM
(F) 1,500 mM
(G) 2,000 mM
[0119]
[D] 100 mM Good buffer solution (pH 10.0) having a sodium chloride concentration below.
(I) 0 mM
(B) 300 mM
(C) 500 mM
(D) 800 mM
(E) 1,000 mM
(F) 1,500 mM
(G) 2,000 mM
[0120]
* Sodium ion valence of sodium chloride is “+1”, chloride ion valence is “−1”, and absolute value of ion valence is “1” respectively. Values obtained by multiplying each molar concentration of sodium ion and chlorine ion in the reagent by the absolute value of the valence of the ion are as shown in the molar concentration.
[0121]
(4) Cleaning solution
Phosphate buffered saline (pH 7.2) containing 0.05% Tween 20 (Tween 20) was prepared and used as a washing solution.
[0122]
(5) Peroxidase substrate solution
PS-1 reagent (manufactured by Luminogen) was used as a peroxidase substrate solution.
[0123]
2. sample
(1) The solution containing human HMG-1 prepared in Reference Example 1 was sufficiently dialyzed with physiological saline (150 mM sodium chloride aqueous solution).
The protein concentration of the solution containing the human HMG-1 after dialysis was determined by a protein assay (manufactured by Bio-Rad).
And the solution containing the said human HMG-1 was diluted with the physiological saline (150 mM sodium chloride aqueous solution), and the sample with the said human HMG-1 density | concentration of 10 ng / mL was prepared.
[0124]
(2) A sample with a human HMG-1 concentration of 100 ng / mL was prepared in the same manner as in (1) above.
[0125]
3. Measurement by luminescence immunoassay (sandwich method)
(1) 500 μL of the sample prepared in (2) (1) (150 mM sodium chloride aqueous solution having a human HMG-1 concentration of 10 ng / mL) is added to each of the dilution reagents (total 28 types) in (1) above. Were mixed with 500 μL of a total of 28 kinds of mixed solutions.
[0126]
The value obtained by multiplying the molar concentration of each of sodium ions and chlorine ions in the mixed solution by the absolute value of the valence of the ions is as follows, and is as follows.
[0127]
[A] 50 mM Good buffer (pH 7.0).
(I) 75 mM
(B) 225 mM
(C) 325 mM
(D) 475 mM
(E) 575 mM
(F) 825 mM
(G) 1,075 mM
[0128]
[B] 50 mM Good buffer (pH 8.0).
(I) 75 mM
(B) 225 mM
(C) 325 mM
(D) 475 mM
(E) 575 mM
(F) 825 mM
(G) 1,075 mM
[0129]
[C] 50 mM Good buffer (pH 9.0).
(I) 75 mM
(B) 225 mM
(C) 325 mM
(D) 475 mM
(E) 575 mM
(F) 825 mM
(G) 1,075 mM
[0130]
[D] 50 mM Good buffer (pH 10.0).
(I) 75 mM
(B) 225 mM
(C) 325 mM
(D) 475 mM
(E) 575 mM
(F) 825 mM
(G) 1,075 mM
[0131]
(2) Add 100 μL of each of the mixed solutions (total 28 types) prepared in (1) above to each well of the microplate immobilized antibody of (1) above, and let stand at 37 ° C. for 2 hours. Then, an antigen-antibody reaction between the antibody immobilized on the microplate and human HMG-1 contained in the sample was performed.
[0132]
Note that the value obtained by multiplying the molar concentration of each of sodium ions and chloride ions during the antigen-antibody reaction by the absolute value of the valence of the ions is not diluted and is as described above.
[0133]
(3) Next, each well of the microplate-immobilized antibody was washed with the washing solution of (1).
[0134]
(4) The peroxidase-labeled antibody of (1) above was diluted 1,000 times with phosphate buffered saline containing 3% BSA.
Next, 100 μL of each was added to each well of the microplate immobilized antibody subjected to the washing operation of (3) above, and then allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours.
As a result, a reaction of binding a peroxidase-labeled antibody to human HMG-1 bound to the antibody immobilized on the microplate was performed.
[0135]
(5) Thereafter, each well of the microplate-immobilized antibody was washed with the washing solution of (1).
[0136]
(6) Next, 100 μL of the peroxidase substrate solution of (1) above was added to each well of the microplate-immobilized antibody. And it was made to react at room temperature.
[0137]
(7) Ten minutes after the addition of the peroxidase substrate solution, the luminescence intensity of the solution in each well of the microplate immobilized antibody was measured with a luminescence microplate reader [CT9000D] (manufactured by Diatron). .
[0138]
(8) The sample prepared in (2) above (2) (150 mM sodium chloride aqueous solution having a human HMG-1 concentration of 100 ng / mL) was measured by performing the operations as described in (1) to (7) above. .
[0139]
(9) The measured values obtained by the above operation are shown in Table 1 and FIGS.
In addition, each measured value (relative luminescence intensity) shown in the table and FIGS. 1 to 4 is a blinded value of the measured value (relative luminescence intensity) when using physiological saline (150 mM sodium chloride aqueous solution) as a sample. The value of what was subtracted is shown.
[0140]
[Table 1]
The numerical values in Table 1 are measured values (relative luminescence intensity), and the numerical values in parentheses are measured when the molar concentration of each of sodium ions and chlorine ions is multiplied by the absolute value of the valence of the ion is 75 mM. It shows the percentage when the measured value (relative luminescence intensity) at other concentrations is divided by the value (relative luminescence intensity).
[0142]
In the figure, FIG. 1 shows the measurement results when the pH is 7.0, FIG. 2 shows the measurement results when the pH is 8.0, FIG. 3 shows the measurement results when the pH is 9.0, and FIG. 4 shows the measurement result at pH 10.0.
[0143]
In these figures, the horizontal axis represents the value obtained by multiplying the molar concentration of each of sodium ions and chloride ions in the mixed solution by the absolute value of the valence of the ions (that is, each of sodium ions and chloride ions in the antigen-antibody reaction system). The value obtained by multiplying the molar concentration by the absolute value of the valence of the ion). The vertical axis represents the relative light emission intensity.
[0144]
4). Summary
From Table 1 and FIG. 1 to FIG. 4, each pH is obtained by multiplying each molar concentration of sodium ion and chlorine ion coexisting with human HMG-1 by the absolute value of the valence of the ion. When the concentration is 75 mM, it can be seen that the amount of signal obtained by measurement (relative light emission intensity) is extremely small and no sensitivity is obtained.
[0145]
On the other hand, at any pH, the value obtained by multiplying the molar concentration of sodium ion and chloride ion coexisting with human HMG-1 by the absolute value of the valence of the ion is measured at 150 mM or more. It can be seen that the amount of signal (relative luminescence intensity) obtained by the above increases and the sensitivity is high, and that the amount of signal (relative luminescence intensity) is further increased at 225 mM or more. In particular, in the range of 475 mM to 825 mM, it can be seen that the amount of signal (relative luminescence intensity) is large and the sensitivity is further increased.
[0146]
From these, in the measurement of HMG-1 in the sample, each of the molar concentrations of cation (sodium ion) and anion (chlorine ion) together with HMG-1 is multiplied by the absolute value of the valence of the ion. By coexisting at a concentration such that the measured value is 150 mM or more, the amount of signal obtained by measurement can be remarkably increased, and thereby sufficient measurement sensitivity can be obtained, and the low concentration range can be accurately measured. It was confirmed that it could be measured.
[0147]
[Reference Example 1] (Preparation of human HMG-1 and human HMG-2 from human cells)
Human HMG-1 and human HMG-2 were prepared from human cells (HL60 cells).
[0148]
(1) First, 3 L of the supernatant of the culture solution of human cells (HL60 cells) cultured in RPMI 1640 was concentrated to about 250 mL.
[0149]
(2) Next, sodium chloride was added so that the final concentration was 200 mM.
[0150]
(3) This was centrifuged with a centrifuge (10,000 rpm, 30 minutes), and the supernatant was collected and filtered with a filter having a pore size of 0.45 μm.
[0151]
(4) The filtrate was passed through a high trap heparin column (manufactured by Amersham Pharmacia).
[0152]
(5) The column was washed with a 10 mM sodium phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 200 mM sodium chloride.
[0153]
(6) Next, a sodium phosphate buffer solution (pH 7.0) was eluted from the column with a sodium chloride concentration gradient of 200 mM to 2,000 mM.
[0154]
(7) Each eluted fraction was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, and fractions containing human HMG-1 and human HMG-2 were identified based on their mobility.
This fraction was a fraction eluted when the sodium chloride concentration was 500 mM to 1,000 mM.
[0155]
(8) The fraction containing human HMG-1 and human HMG-2 in (7) above was applied to a CM-Sephadex C25 column equilibrated with 7.5 mM sodium borate buffer (pH 9.0). I passed.
After that, elution was performed with 7.5 mM sodium borate buffer (pH 9.0) containing 200 mM sodium chloride, and cation exchange chromatography was performed.
[0156]
(9) Each fraction eluted here was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, and the fraction containing human HMG-1 and the fraction containing human HMG-2 were identified from their mobility.
[0157]
By the above operation, human HMG-1 was prepared from human cells (HL60 cells), and human HMG-2 was also prepared.
[0158]
[Reference Example 2] (Preparation of peroxidase-labeled antibody)
Peroxidase was labeled on an antibody (monoclonal antibody) that binds to human HMG-1 and human HMG-2 to prepare a peroxidase-labeled antibody.
[0159]
(1) Introduction of maleimide group into peroxidase
After dissolving 4 mg of peroxidase (derived from horseradish) in 0.3 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), 1 of N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxanoic acid A solution prepared by dissolving 0 mg in 60 μL of N, N′-dimethylformamide was added and reacted at 30 ° C. for 60 minutes.
Thereafter, dialysis was performed overnight with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0).
Through the above operation, a maleimide group was introduced into the peroxidase.
[0160]
(2) Introduction of thiol group into antibody
To 0.5 mL of 0.1 M phosphate buffer solution (pH 6.5) containing an antibody (monoclonal antibody) [autologous preparation] that binds to human HMG-1 and human HMG-2 at a concentration of 10 mg / mL A solution prepared by dissolving 0.6 mg of S-acetylmercaptosuccinic anhydride in 10 μL of N, N′-dimethylformamide was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
[0161]
Thereafter, 20 μL of 0.1 M EDTA, 0.1 mL of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0), and 0.1 mL of 1 M hydroxylamine hydrochloride (pH 7.0) were added thereto. And left at 30 ° C. for 5 minutes.
[0162]
This was then passed through a Sephadex G-25 column that had been equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA and subjected to simple gel filtration chromatography. The acetylmercaptosuccinic anhydride was removed and the antibody fraction was collected.
Through the above operation, a thiol group was introduced into the antibody (monoclonal antibody) that binds to the human HMG-1 and human HMG-2.
[0163]
(3) Preparation of labeled antibody
The peroxidase introduced with the maleimide group prepared in the above (1) and the antibody introduced with the thiol group prepared in the above (2) were mixed one-on-one and reacted at 30 ° C. for 20 hours to produce peroxidase to the antibody. Was introduced (labeled).
[0164]
This was then passed through a column of Ultragel AcA34 that had been equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) and subjected to gel filtration chromatography.
Each fraction of the gel filtration chromatography was confirmed by 10% polyacrylamide electrophoresis, and only the fraction of the antibody bound with peroxidase was collected so that unbound peroxidase was not mixed.
[0165]
The antibody fraction bound to peroxidase was concentrated to obtain a peroxidase-bound antibody, that is, a peroxidase-labeled antibody.
And the protein concentration of the solution containing this peroxidase labeled antibody was measured.
[0166]
[Reference Example 3] (Microplate immobilized antibody)
An antibody (polyclonal antibody) that binds to human HMG-1 but does not bind to human HMG-2 was immobilized on a microplate to prepare a microplate-immobilized antibody.
[0167]
(1) An antibody that binds to human HMG-1 but does not bind to human HMG-2 (polyclonal antibody) (sold by Becton Dickinson) was washed with phosphate buffered saline (5.59 mM disodium hydrogen phosphate, 1. After being adjusted to 15 μg / mL with 47 mM potassium dihydrogen phosphate, 137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride (pH 7.2), 100 μL per well was added to a 96-well microplate (manufactured by NUNK) at 37 ° C. The antibody was adsorbed to each well of the microplate and allowed to immobilize.
[0168]
(2) This antibody-immobilized microplate was washed with a washing solution (phosphate buffered saline (pH 7.2) containing 0.05% Tween 20) and then 10 mM containing 1% BSA. Potassium dihydrogen phosphate-dipotassium hydrogen phosphate buffer (pH 7.2) was added in an amount of 300 μL per well, allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours for blocking, and then washed again with a washing solution.
[0169]
Through the above operation, a microplate-immobilized antibody was prepared by immobilizing an antibody (polyclonal antibody) that bound to human HMG-1 but not human HMG-2 on a microplate.
[0170]
【The invention's effect】
The method for measuring HMG-1 and / or HMG-2 and the measuring reagent of the present invention can obtain a large amount of signal when measuring HMG-1 and / or HMG-2 contained in a sample, and have high sensitivity. It can be measured. As a result, it is possible to accurately measure a low concentration range with good reproducibility.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing measured values of human HMG-1 when cation and anion concentrations are changed at pH 7.0.
FIG. 2 is a graph showing measured values of human HMG-1 when the cation and anion concentrations are changed at pH 8.0.
FIG. 3 is a graph showing measured values of human HMG-1 when the cation and anion concentrations are changed at pH 9.0.
FIG. 4 is a graph showing measured values of human HMG-1 when the cation and anion concentrations are changed at pH 10.0.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002349129A JP4261889B2 (en) | 2002-10-24 | 2002-10-24 | Method and reagent for measuring HMG-1 and HMG-2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002349129A JP4261889B2 (en) | 2002-10-24 | 2002-10-24 | Method and reagent for measuring HMG-1 and HMG-2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004144728A true JP2004144728A (en) | 2004-05-20 |
| JP4261889B2 JP4261889B2 (en) | 2009-04-30 |
Family
ID=32463004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002349129A Expired - Lifetime JP4261889B2 (en) | 2002-10-24 | 2002-10-24 | Method and reagent for measuring HMG-1 and HMG-2 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4261889B2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008525806A (en) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | インテル・コーポレーション | Protein profiling by thiolation |
| WO2018221544A1 (en) * | 2017-05-31 | 2018-12-06 | 協和メデックス株式会社 | Measurement method for fibroblast growth factor–23, measurement reagent, and measurement kit |
| JP7425459B2 (en) | 2019-10-11 | 2024-01-31 | 株式会社シノテスト | Stabilized HMGB1-containing solution |
-
2002
- 2002-10-24 JP JP2002349129A patent/JP4261889B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008525806A (en) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | インテル・コーポレーション | Protein profiling by thiolation |
| WO2018221544A1 (en) * | 2017-05-31 | 2018-12-06 | 協和メデックス株式会社 | Measurement method for fibroblast growth factor–23, measurement reagent, and measurement kit |
| JPWO2018221544A1 (en) * | 2017-05-31 | 2020-04-02 | 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 | Measurement method, measurement reagent and measurement kit for fibroblast growth factor-23 |
| JP2022058732A (en) * | 2017-05-31 | 2022-04-12 | ミナリスメディカル株式会社 | Method for measuring fibroblast growth factor-23, measurement reagent and measuring kit |
| JP7296875B2 (en) | 2017-05-31 | 2023-06-23 | ミナリスメディカル株式会社 | METHOD FOR MEASURING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-23, MEASUREMENT REAGENT, AND MEASUREMENT KIT |
| JP7425459B2 (en) | 2019-10-11 | 2024-01-31 | 株式会社シノテスト | Stabilized HMGB1-containing solution |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4261889B2 (en) | 2009-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10634681B2 (en) | Method for measuring cardiac troponin | |
| US20090088334A1 (en) | Method of high sensitive immunoassay | |
| JPH0562302B2 (en) | ||
| JPH0560759A (en) | Manufacture of biological active reagent originating in polymer containing succinimide and analytic element containing said reagent and application thereof | |
| JP6320651B2 (en) | Test substance detection method and test substance detection reagent kit | |
| JP2021533384A (en) | How to detect biomarkers | |
| JP2023017986A (en) | Direct immunoassay measurement of autoantibodies | |
| KR101974230B1 (en) | Method for inhibiting non-specific reaction in pivka-ii measurement reagent | |
| JP5786188B2 (en) | Reagent for measuring C-reactive protein in sample, measuring method, and method for expanding measuring range | |
| Schwenk et al. | Antibody suspension bead arrays | |
| JP4261889B2 (en) | Method and reagent for measuring HMG-1 and HMG-2 | |
| WO2014147873A1 (en) | Antibody that binds specifically with hmgb1 decomposition product, and method and reagent for assaying hmgb1 decomposition product | |
| JP4273311B2 (en) | Method and reagent for measuring substance to be measured in sample | |
| US20090087923A1 (en) | Method of high sensitive immunoassay | |
| JP2651438B2 (en) | Enzyme-labeled antibody-sensitized latex and enzyme immunoassay using the same | |
| JP4585708B2 (en) | Method and reagent for measuring substance forming complex | |
| Birgersson et al. | Bead-Based and Multiplexed Immunoassays for Protein Profiling via Sequential Affinity Capture | |
| JP4302798B2 (en) | Method for preparing ligand binding surface | |
| JPH0346565A (en) | Enzyme immunoassay utilizing magnetic material | |
| JP2004239880A (en) | Human hmg-1 standard substance comprising recombinant and measuring method of human hmg-1 in specimen by using the same | |
| JP2001305137A (en) | Method for immobilization and measurement of specific complex | |
| JP2009085702A (en) | Immunoreaction reagent | |
| JP2020148557A (en) | Method for measuring hmgb1 in sample and measurement reagent | |
| JPH11304801A (en) | Autoantibody detecting method by indirect antigen immobilization | |
| Bayer et al. | Immunochemical applications of avidin-biotin technology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051007 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070713 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070806 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071008 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20071008 |
|
| A072 | Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A072 Effective date: 20080311 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080722 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080827 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090113 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090206 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4261889 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140220 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |