JP2001305137A - Method for immobilization and measurement of specific complex - Google Patents

Method for immobilization and measurement of specific complex

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JP2001305137A JP2000118848A JP2000118848A JP2001305137A JP 2001305137 A JP2001305137 A JP 2001305137A JP 2000118848 A JP2000118848 A JP 2000118848A JP 2000118848 A JP2000118848 A JP 2000118848A JP 2001305137 A JP2001305137 A JP 2001305137A
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Inventor
Eiji Ishikawa
榮治 石川
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Eiji Ishikawa
Sumitomo Pharmaceut Co Ltd
住友製薬株式会社
榮治 石川
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method wherein, after a complex which contains a substance to be measured is formed in a reaction solution, the complex is bonded to an insoluble carrier with good efficiency so as to be measured and to provide a method wherein a complex which is formed once in a carrier is dissociated with good efficiency. SOLUTION: A substance which has an activity to form the complex specifically to the substance to be measured and to which a specific electrostatic group is introduced in advance is reacted with the substance, to be measured, in a solution to be inspected. The complex is formed in the solution. By an electrostatic action which uses an electric charge by the introduced electrostatic group, the complex is bonded to the insoluble carrier so as to be measured. In addition, the surface of a carrier in which a complex is formed via an electrostatic substance is brought into contact with a high-ionic-strength solution, and the complex is dissociated into the solution. As compared with a capturing method or a dissociating method using an intermolecular action by van der Waals in conventional cases, a reaction efficiency is enhanced, a serum interference is suppressed in a capturing reaction, and the reaction time is shortened in a dissociating reaction. This invention can be adapted to an existing ultrahigh-sensitivity measuring technique.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、被検液中の測定対象物質の検出に有用な測定対象物質の固定化方法及び測定方法に関する。 The present invention relates to relates to immobilization methods and measurement methods useful analyte for the detection of the target substance in the test solution. より詳細には、被検液中のタンパク、 More specifically, the protein in the test solution,
ハプテン、抗体などの免疫学的測定法あるいは核酸のハイブリダイゼーションアッセイ、およびそのための測定用試薬、測定用キットに関する。 Hapten, immunoassays or nucleic acid hybridization assays, such as an antibody, and measuring reagent therefor relates to a measurement kit.

【0002】 [0002]

【従来の技術】抗原、抗体や核酸、ホルモンなど微量生体成分の量を測定するのに、測定対象物質と特異的に結合する物質が被覆された不溶性の担体(以下固相ともいう)に測定対象物質を結合させ測定する方法は、高感度で特異性が高く、従前より様々な物質の測定に応用されている。 BACKGROUND ART antigens, antibodies and nucleic acids, to measure the amount of trace biological components such as hormones, measurement analyte that specifically binds to the insoluble material is coated carrier (hereinafter also referred to as solid phase) methods of measuring bound target substance, highly specific with high sensitivity has been applied to the measurement of various substances than before. 最も普遍的に用いられている測定系は、固相の表面に抗原物質あるいは抗体が被覆されており、被検液中の特異的抗体あるいは抗原物質と固相上で反応させて測定する免疫学的測定法であり、石川と加藤によるラット肝オルニチンδ−アミノトランスフェラーゼの測定〔スカンジナヴィアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Scand. J. Immunol.)、第8巻(補冊7)、第43-55 Most commonly measured system used is antigenic substance or an antibody on the surface of the solid phase is coated, immunological measuring by reacting with specific antibodies or antigenic substance and the solid phase in a test fluid manner a measurement, the measurement of rat liver ornithine δ- aminotransferase by Ishikawa and Kato [Scandinavium Vian journal of Immunology (Scand. J. Immunol.), Vol. 8 (Hosaku 7), the 43-55
頁(1978)〕など古くから数多くの報告がなされている。 Page (1978)] a number of reports from ancient times, such as have been made.

【0003】また、固相に核酸(ポリヌクレオチド)が被覆されており、被検液中の相補的な配列をもつ核酸と固相上で特異的にハイブリッドを形成させて測定する方法もよく用いられる手法である。 [0003] In addition, a nucleic acid to a solid phase (polynucleotide) is coated, often used a method of measuring specifically to form a hybrid on nucleic acid and solid phase having a complementary sequence in a test fluid it is a technique. 例えば、ヴァータネン(Vi For example, Vatanen (Vi
rtanen)らによる尿中のサイトメガロウィルスの測定〔ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.)第20巻、第1083-1088頁(19 rtanen) measurement of cytomegalovirus in urine by et al. [Journal of Clinical Microbiology (J. Clin. Microbiol.) Vol. 20, pp. 1083-1088 (19
84)などが報告されている。 84) and the like have been reported. さらに、受容体で被覆された固相に被検液中のリガンドを結合させて測定する方法〔ガルゴスキー(Gargosky)ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー(J. Endcrinol.)、第127巻、第383- Furthermore, by binding ligand in the test solution to a solid phase coated with receptor method of measuring [Garugosuki (Gargosky) et al., Journal of Endocrinology (J. Endcrinol.), 127 pp. The 383-
390頁(1990)〕やレクチン分子が被覆された固相に糖鎖物質を結合させて測定する方法〔永田ら、テューマー・バイオロジー(Tumour Biol.)、第12巻、第35-44頁(1991)〕などが報告されている。 Pp 390 (1990)] and a method of lectin molecules measured by binding a sugar chain substance to a solid phase coated [Nagata et al., Teyuma Biology (Tumor Biol.), Vol. 12, pp 35-44 ( such as 1991)] it has been reported.

【0004】また、測定対象物質を含む特異的複合体を固相に結合させて測定する方法を更に改良し、抗原物質あるいは抗体を超高感度に測定しうる方法として、免疫複合体転移測定法という技術が本発明者らによって開発されている〔日本特許第2606722号、同2657672号、E.Ishika Further, as a method for the specific complex is bound to a solid phase further improve the method of measurement, can measure antigenic substance or an antibody to the ultra-sensitive, including a measurement substance, immune complex transfer assay [Japanese Patent No. 2606722, which has been developed by the art the present inventors that, the 2,657,672 Patent, E.Ishika
wa, "Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay"; wa, "Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay";
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecul Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecul
ar Biology, vol.27,(1999), Ed.: S.Pillai and PCv ar Biology, vol.27, (1999), Ed .: S.Pillai and PCv
an der Vliet, Elsevier, Amsterdam〕。 an der Vliet, Elsevier, Amsterdam]. この技術は、 This technology,
測定対象物質を2種類以上の固相間で移動させたのち、 After the analyte is moved between two or more solid phase,
固相上の免疫複合体を測定することを特徴とする。 And measuring the immune complex on the solid phase. すなわち、測定対象物質を含む免疫複合体を (1)固相へ結合させ、(2)特異的に固相から解離させ、(3)更に別の固相に再結合させる、という工程を経ることによって被検液に含まれる夾雑物質が除かれ、測定系の非特異的信号の原因が減少する結果、検出感度が著しく向上することが知られている。 That is, measuring the immune complex containing the target substance (1) is bound to a solid phase, (2) specifically dissociated from the solid phase, (3) further re-attached to another solid phase, going through the steps of the contaminants contained in the sample liquid is removed, due to reduced results of non-specific signal of the measurement system, it is known that detection sensitivity is significantly improved. さらに、本発明者らは、上記免疫複合体転移測定法の変法として、測定対象物質を含む免疫複合体を固相から解離させた後、液相中で免疫複合体の測定を行う方法も開発している〔特開平2-198361号〕。 Furthermore, the present inventors have found that a variation of the above immune complex transfer assay, after dissociation of immune complexes containing the analyte from the solid phase, a method for measuring the immune complex in the liquid phase have developed [JP-A-2-198361]. この方法は、別の固相を用いる方法に比べて検出感度は若干低下する場合はあるものの、迅速かつ簡便に高感度測定が可能である。 This method, although the case where the detection sensitivity is somewhat lower in comparison with the method of using the alternative solid phase is, it is possible to rapidly and simply sensitive measurement.

【0005】これらの測定対象物質と特異的に結合する物質を用いる測定方法においては、一般的に反応液相中で生じた複合体を固定化して、あるいは固相表面上で生成した複合体を測定する。 [0005] In the measurement methods of using these analyte substance specifically binding to the general reaction phase in the resulting composite immobilized or complex produced on the solid phase surface Measure. 前者では、通常、液相中の複合体を固定化する際に別途結合系を介在させることが多い。 In the former, usually, it is often to interpose an additional bond system when fixing the complex in the liquid phase. 例えば、測定すべき抗体物質と特異的に結合する抗原物質にあらかじめビオチンが導入されており、液相で形成された免疫複合体をアビジン化固相に結合させて測定する方法〔特開昭63-229368〕や同じく測定すべき抗体物質と特異的に結合する抗原物質にあらかじめDNP For example, has been introduced beforehand biotin antibody substances specifically binding to the antigen substance to be measured, a method of measuring by binding the immune complexes formed in the liquid phase to the avidinated solid phase [JP 63 -229,368] and also advance DNP antibody substance specifically binding to the antigen substance to be measured
(ジニトロフェニル基)が導入されており、液相で形成された免疫複合体を抗DNP−BSA抗体不溶化固相に結合させて測定する方法〔特開平1-312464〕などが報告されている。 (Dinitrophenyl group) is introduced, and a method for measuring the immune complex formed in the liquid phase by binding to the anti-DNP-BSA antibody insolubilized solid phase [Hei 1-312464] have been reported. このような複合体の固定化のために使われる結合系は、ビオチン−アビジン系やDNP−抗DNP Binding system used for immobilization of such complexes, biotin - avidin system or DNP- anti-DNP
抗体系のようなアフィニティーペアであり、ファン・デル・ワールス力に基づく分子間力により結合するものである。 An affinity pair, such as an antibody-based, is to bound by intermolecular force based on the van der Waals forces.

【0006】一方、生化学の分野では、静電力(クーロン力)を介した結合、即ち、イオン結合も、核酸あるいは免疫複合体と固相の結合に用いられる。 On the other hand, in the field of biochemistry, coupling via an electrostatic force (Coulomb force), i.e., ionic bonding is also used to bind the nucleic acid or immune complex and a solid phase. この分子間力は距離の2乗に逆比例した相互作用を及ぼすため、イオン結合反応はアフィニティ結合より迅速に行われる。 The intermolecular forces to exert the inverse proportional to interact to the square of the distance, ionic bonding reaction occurs rapidly than affinity binding. しかし、アフィニティ結合よりは、特異性が小さい(電荷の有るものは何でも結合する結果、夾雑物質の影響を受けやすい)、比較的結合が弱い(複合体の電荷が小さいと解離しやすい)という特性があり、これまで、本技術分野において、測定対象物質を含む複合体の固定化に用いられることは無かった。 However, from the affinity binding specificity is small (the result of binding whatever having the charge, susceptible to contaminants), characteristic of a relatively binding is weak (easily dissociates charge of the complex is small) There are, to date, in the art, it was not used for immobilization of a complex comprising a measurement substance.

【0007】 [0007]

【発明が解決しようとする課題】前述のビオチン−アビジン系やDNP−抗DNP抗体系のようなアフィニティー結合は、ファン・デル・ワールス力に基づく分子間力で結合するが、この力は一般に両物質が非常に近接した状態では強い相互作用を示す一方、両物質が少しでも離れた状態では距離の6乗に逆比例してその相互作用が減弱する。 [SUMMARY OF THE INVENTION] The foregoing biotin - affinity binding, such as avidin system or DNP- anti-DNP antibody system binds with intermolecular force based on Van der Waals forces, this force is generally both while exhibiting a strong interaction in the state of a substance very close, their interaction in inverse proportion to the sixth power of the distance in a state in which both substances is separated even slightly attenuates. 従って、この結合は複合体の濃度が低く、夾雑物質が大量に共存する溶液中では、反応効率が悪く、固定化に時間がかかる傾向にある。 Therefore, the coupling has a low concentration of the complex in the solution contaminants coexist in large amounts, the reaction efficiency is low, it tends to take a long time to immobilization. また、いったん結合したものを解離させる場合も効率が悪くなる。 Also, the efficiency is poor even when dissociating what once bound. イムノアッセイやハイブリダイゼーションアッセイにおいて、より迅速かつ効率的に測定対象物質を含む複合体を固定化し、あるいは解離して測定する方法が望まれていた。 In immunoassays or hybridization assays to immobilized complexes comprising more quickly and efficiently analyte, or a method of measuring dissociated it has been desired.
本発明の目的は、被検液由来の測定対象物質の効率的な固定化方法、及び測定方法(測定用試薬、測定用キット)の提供である。 An object of the present invention is the provision of efficient method of immobilizing the analyte from a test solution, and measuring method (measuring reagent, assay kit).

【0008】 [0008]

【課題を解決するための手段】本発明者は、イムノアッセイや核酸のハイブリダイゼーションアッセイのように、測定対象物質と特異的結合物質との複合体を固定化する測定方法において、特異的結合物質にあらかじめ特定の帯電性基を導入しておき、その帯電性基の示す電荷と静電的結合を起こすような電荷をもつ固相とを適当な条件下で反応させることにより、被検液由来の夾雑物質の干渉をほとんど受けずに複合体を効率良く固相に結合させ得ることを見出し、本発明に至った。 The present inventors SUMMARY OF THE INVENTION, as hybridization assays immunoassays and nucleic acid, in the measurement method for immobilizing a complex of the analyte and the specific binding substance, to specific binding substances leave introducing a specific charge groups in advance, by reacting the solid phase and having a charge that causes a charge and electrostatically bonded indicated by the charged groups under suitable conditions, from the test liquid It found that the interference of contaminants with little receiving may be attached the complex to efficiently solid phase, leading to the present invention. 更に、免疫複合体転移測定法等における免疫複合体の固相への捕捉及び当該固相からの解離反応においても、本発明の原理の適用に成功した。 Further, even in the dissociation reaction from capture and the solid phase to the solid phase of immune complexes in the immune complex transfer assay, and the like, and succeeded in the application of the principles of the present invention.

【0009】すなわち、本発明は、下記の特徴を有するものである。 Accordingly, the present invention has the following characteristics. [1] 測定すべき物質(測定対象物質)及びそれと特異的に結合する物質(特異的結合物質)から得られる複合体を不溶性の担体に捕捉し固定化する方法であって、下記工程(A)または(A')を含むことを特徴とする、測定対象物質の固定化方法。 [1] Materials to (target substance) and composites derived therefrom substance specifically binding to (specific binding substance) and a method for immobilizing capture the insoluble carrier measurements, the following steps (A ) or (characterized in that it comprises a a '), method of immobilizing the target substance. (A):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)と測定対象物質から、正または負に荷電した複合体(帯電複合体)を形成させ、これを固定化反応溶液中で、負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に捕捉する工程。 (A): a positive or negative analyte chargeable groups introduced specific binding substance (charging specific binding agent), positively or negatively charged complexes (charge complex) to form a, this in immobilization reaction solution, the process of capturing the carrier (charging solid phase) of negatively or positively charged insoluble. (A'):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)を負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に結合させ、これに固定化反応溶液中で、測定対象物質を捕捉する工程 [2] 特異的結合物質が、抗原、抗体または核酸プローブである[1]の固定化方法。 (A '): positive or negative chargeable groups introduced specific binding substances (charged specific binding substance) negatively or positively charged insoluble carrier (charging solid phase) to be bound, immobilized reaction thereto in solution, analyte step of capturing [2] specific binding substances to, antigens, the method for immobilizing an antibody or nucleic acid probe [1]. [3] 帯電特異的結合物質が、強塩基性(pKbが9以上)または強酸性(pKaが4以下)である[1]または [3] charged specific binding substance is a strongly basic (pKb 9 or more) or strongly acidic (pKa of 4 or less) [1] or
[2]の固定化方法。 Immobilization method of [2]. [4] 帯電固相が、強塩基性(pKbが9以上)または強酸性(pKaが4以下)である[1]〜[3]の固定化方法。 [4] charged solid phase, strongly basic (pKb 9 or more) or strongly acidic (pKa of 4 or less) [1] a method for immobilizing to [3]. [5] 特異的結合物質が有する正または負の荷電を示す帯電性基が、スルホン酸基であり、帯電固相が、DEAE [5] charging groups exhibiting a positive or negative charge specific binding substance has is a sulfonic acid group, charged solid phase, DEAE
(ジエチルアミノエチル)基を有し、固定化反応溶液がpH6〜8、イオン強度0.2〜0.8である[1]〜[4] Has a (diethylaminoethyl) group, the immobilization reaction solution pH 6-8, an ionic strength 0.2 to 0.8 [1] to [4]
の固定化方法。 The method of immobilizing. [6] [1]〜[5]の固定化方法にて捕捉された帯電複合体を当該複合体に導入された標識により測定する測定対象物質の測定方法。 [6] [1] to [5] Measurement method of the measurement target substance trapped charged complexes by immobilization method by means of a label introduced into the complex. [7] 測定対象物質と特異的結合物質を含む複合体を少なくとも一回、不溶性の担体上に形成および解離させる工程を含む測定方法であって、下記工程(A)と(B)、 [7] the analyte and specific binding agent at least once a complex comprising a, there is provided a measuring method comprising the step of formation and dissociation on insoluble carrier, the following steps and (A) (B),
または(A')と(B)を含むことを特徴とする測定対象物質の測定方法。 Or (A ') and the measurement method of the analyte, characterized in that it comprises a (B). (A):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)と測定対象物質から、正または負に荷電した複合体(帯電複合体)を形成させ、これを固定化反応溶液中で、負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に捕捉する工程。 (A): a positive or negative analyte chargeable groups introduced specific binding substance (charging specific binding agent), positively or negatively charged complexes (charge complex) to form a, this in immobilization reaction solution, the process of capturing the carrier (charging solid phase) of negatively or positively charged insoluble. (A'):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)を負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に結合させ、これに固定化反応溶液中で、測定対象物質を捕捉する工程。 (A '): positive or negative chargeable groups introduced specific binding substances (charged specific binding substance) negatively or positively charged insoluble carrier (charging solid phase) to be bound, immobilized reaction thereto in a solution, the step of capturing the analyte. (B):工程(A)または工程(A')の後、帯電固相から帯電複合体を解離させる工程。 (B): Step (A) or after steps (A '), dissociating the charged complex from charging the solid phase. [8] イオン強度が0.5〜3の電解質溶液(解離反応溶液)中で帯電複合体を帯電固相から解離させる工程(B)を含むことを特徴とする[7]記載の測定方法。 [8] Measurement methods [7], wherein the containing an electrolyte solution of ionic strength 0.5 to 3 dissociating the charged complexes (dissociation reaction solution) in the charging the solid phase (B). [9] 解離反応溶液が1.0〜2.0mol/Lの塩化ナトリウム溶液である[8]記載の測定方法。 [9] dissociation reaction solution is sodium chloride solution 1.0~2.0mol / L [8] the measuring method described. [10] 解離された帯電複合体を当該複合体に導入された標識により測定する[7]記載の測定方法。 [10] Dissociated charged complexes by means of a label introduced into the complex [7] the measuring method described. [11] 工程(B)の後、帯電複合体を別の固相に再結合させる工程(C)を含む[7]記載の測定方法。 [11] Step after (B), the measuring method of [7], further comprising a step (C) for recombining charge complex to another solid phase. [12] 別の固相が帯電固相である[11]記載の測定方法。 [12] Another solid phase is charged solid phase [11] Measurement method according. [13] [1]〜[5]記載の固定化方法または[6]〜[12]記載の測定方法を行うための帯電特異的結合物質または間接的帯電特異的結合物質を含む試薬。 [13] [1] to [5] immobilization methods or [6] to [12] charged specific binding agent or reagent that contains a indirect charging specific binding agent for performing the measuring method according according. [14] [6]〜[12]記載の測定を行うための測定キット。 [14] [6] to [12] Measurement kit for performing the measurements described.

【0010】以下、本発明における用語の意味あるいは定義について説明する。 [0010] The following describes the meaning or definition of a term in the present invention. 「測定すべき物質(測定対象物質)」とは、本発明の測定法で定量しうる生理活性物質を意味し、これまで、タンパク質のイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼーションなど、固相測定法において測定され得た物質であれば特に限定されない。 A "substance to be determined (analyte)" means a physiologically active substance capable of quantitatively by measuring method of the present invention, so far, such as proteins of immunoassays or nucleic acid hybridization, it is measured in solid phase assays obtained if the material is not particularly limited. 例えば、抗原、抗体、核酸(DNA、RNA)、糖質、脂質およびリガンドなどである。 For example, antigens, antibodies, nucleic acids (DNA, RNA), and the like carbohydrates, lipids and the ligand. 抗原物質としては、例えば、HI The antigenic material, for example, HI
Vのコア抗原やHBVの表面抗原のようなウイルス抗原、インスリンや成長ホルモン(GH)のような蛋白性ホルモン類、C−反応性蛋白(CRP)やフィブリン分解物のような血漿蛋白類、α−フェトプロテイン(AF Plasma protein, such as viral antigens, proteinaceous hormones such as insulin and growth hormone (GH), C-reactive protein (CRP) or fibrin degradation products, such as surface antigens core antigen and HBV of V, alpha - fetoprotein (AF
P)や癌胎児性抗原(CEA)のような腫瘍マーカー類あるいはチロキシンやバソプレッシンのようなハプテン類等が挙げられる。 Haptens such as a tumor marker such or thyroxine and vasopressin, such as P) and carcinoembryonic antigen (CEA), and the like. また、抗体としては、抗HIV抗体や抗HBV抗体のような抗ウィルス抗体、抗核抗体や抗サイログロブリン抗体のような自己抗体、抗インターフェロン抗体や抗成長ホルモン抗体のような抗蛋白製剤抗体あるいはアレルゲン特異IgE等が挙げられる。 As the antibody, an anti-virus antibodies, such as anti-HIV antibody or anti-HBV antibodies, autoantibodies, anti-protein preparation antibodies or allergens such as anti-interferon antibody or an anti-growth hormone antibodies such as antinuclear antibodies and anti-thyroglobulin antibodies specific IgE, and the like. 一方、核酸としては、フェニルケトン尿症や家族性アミロイドポリニューロパチーのような遺伝子疾患のDNA、 On the other hand, the nucleic acids, DNA genetic diseases such as phenylketonuria and familial amyloid polyneuropathy,
HIVや結核菌のような病原体のRNAまたはDNA、 RNA or DNA of pathogens such as HIV and tuberculosis,
神経芽細胞腫のN−mycやバーキットリンパ腫のC− Of neuroblastoma N-myc and of Burkitt's lymphoma C-
mycのような癌遺伝子のDNA等が挙げられる。 DNA such as oncogenes, such as myc and the like. さらに、糖質としては糖化ヘモグロビンA1Cやヒアルロン酸等が、脂質としてはリポ蛋白(a)等が挙げられる。 Further, as the sugar or the like glycated hemoglobin A1C and hyaluronic acid, lipoprotein (a), and the like as lipids.
その他リガンドとしては、1,25-ジヒドロキシビタミンD 等が挙げられる。 Other ligands, 1,25-dihydroxyvitamin D 3, and the like.

【0011】これらの測定対象物質は、生体由来の被検液(検体)中に存在し、本発明の固定化方法や診断方法で検出される。 [0011] These analyte is present in the test liquid derived from a living organism (subject), is detected by the immobilization methods and diagnostic methods of the present invention. 被検液としては、血清、血漿、唾液、尿、 The test fluid, serum, plasma, saliva, urine,
喀痰、髄液、リンパ液等の生体液あるいは細胞培養液、 Sputum, cerebrospinal fluid, biological fluid or cell culture, such as lymph,
抽出液、懸濁液など測定対象物質を含む各種緩衝液等が挙げられる。 Extract, and various buffers and the like containing the substance to be measured, such as suspensions. 当該分野で周知の概念であり、現在までに測定された検体であれば特に限定されない。 It is a well known concept in the art and is not particularly limited as long as the specimen measured to date.

【0012】「測定対象物質と特異的に複合体を形成する物質(特異的結合物質)」とは、測定対象物質に選択的に高い親和性を示す物質を意味する。 [0012] and "analyte specifically substances which form a complex (specific binding substance)" means a substance exhibiting selective high affinity to the target substance. 例えば、測定対象物質が抗原物質の場合は特異的抗体等が、抗体の場合は抗原または抗抗体等が、核酸の場合は相補的なヌクレオチド配列をもつDNAあるいはRNA等が、糖質の場合はレクチン等が、あるいはリガンドの場合はレセプター等が挙げられる。 For example, specific antibodies, etc. If the analyte is an antigen substance in the case of antibody-antigen or anti-antibody and the like, DNA or a RNA or the like having a complementary nucleotide sequence in the case of nucleic acid, in the case of carbohydrates lectin is, or in the case of ligands include receptor like. なお、本明細書の「特異的結合物質」とは、測定系に影響を与えないウシ血清アルブミン、抗体などの蛋白質(キャリアー)が結合あるいは非特異的な核酸配列が付加したものも含む概念である。 Note that the "specific binding agent" herein, bovine serum albumin which does not affect the measurement system, proteins such as antibodies (carriers) is in including the concept that binding or non-specific nucleic acid sequences are added is there. さらに、特異的結合物質には、後の工程で複合体の測定に用いるための標識やハプテン分子を導入しておいてもよい。 Furthermore, the specific binding agent, in a later step may be introduced into the label or hapten molecules for use in the measurement of the complex.

【0013】「正または負の帯電性基」とは、反応溶液中で電離して、正または負の荷電を示す物質を意味する。 [0013] as "positive or negative chargeable groups" is ionized in the reaction solution, it means a material showing a positive or negative charge. 例えば、正の帯電性基としては、アミノ基、アミノエチル基、グアニジル基が、負の帯電性基としては、スルホン酸基、カルボキシル基、カルボキシルメチル基、リン酸基等が挙げられる。 For example, positively charged groups, amino group, aminoethyl group, guanidyl group, the negative charge groups, a sulfonic acid group, carboxyl group, carboxymethyl group, a phosphoric acid group. また、分子内に様々な帯電性基を有するが分子全体として一定の電荷を示す蛋白質や核酸のような天然物質を用いてもかまわない。 Although having various charging groups may be used natural substances such as proteins and nucleic acids which shows a constant charge as the whole molecule in the molecule. そのような物質の例としては、溶液中で強い負の電荷を示すヒストン蛋白等が挙げられる。 Examples of such materials, histone proteins, and the like indicating a strong negative charge in solution. これら帯電性基は測定対象物質と下記の帯電特異的結合物質の反応を阻害しないものであればいかなる物質でもよいし、導入される電荷の量にも制限はない。 These chargeable groups may be any material as long as it does not inhibit the reaction of the analyte and charged specific binding substance below, it will not be limited to an amount of the introduced charge.

【0014】「帯電特異的結合物質」とは、特異的結合物質に正又は負の帯電性基を導入したものである。 [0014] By "charged specific binding substance", positive or the specific binding agent is obtained by introducing a negative charge groups. 正の帯電性基を導入した場合は、帯電特異的結合物質は、強塩基性(pKbが9.0以上)、負の帯電性基を導入した場合は強酸性(pKaが4.0以下)になるように調整されるのが好ましい。 If you introduce a positive charge groups, charged specific binding substances, strongly basic (pKb 9.0 or higher), as the case of introducing negative charge groups becomes strongly acidic (pKa of 4.0 or less) preferably adjusted. 例えば、負の帯電性の強いスルホン酸基を複数個導入する方法は、好適な方法の1つである。 For example, a method of introducing a plurality of negatively chargeable strong sulfonic acid is one suitable method. 特異的結合物質に特定の帯電性基を導入する方法は、特異的結合物質と測定対象物質の結合を阻害しない限り特に制限はない。 A method of introducing a specific charge group to a specific binding substance is not particularly limited so long as it does not inhibit the binding of the target substance and the specific binding substance. 帯電性基を特異的結合物質に直接導入してもよいし、あらかじめ他の物質に導入した後にその物質と特異的結合物質を結合させてもよい。 May be introduced directly to a specific binding agent charged groups, it may be bonded to the material and the specific binding substance after introducing in advance other materials. 直接導入する方法としては、特異的結合物質のもつアミノ基やカルボキシル基等の官能基を利用して共有結合的に反応させる方法等が挙げられる。 As a method for direct introduction, and a method of reacting covalently by utilizing the functional group such as an amino group or a carboxyl group possessed by the specific binding substances. 測定対象物質を含んで形成される複合体中のいずれかの成分と特異的に結合し且つ溶液中で正または負の帯電性基が導入された物質(以下、間接的帯電特異的結合物質)も本明細書における「帯電特異的結合物質」の一種である。 Any component that specifically binds to and in solution positive or negative chargeable groups introduced substances to be measured substances comprise complexes formed (hereinafter, indirect charging specific binding agent) it is also a kind of "charged specific binding agent" herein.

【0015】「不溶性担体」とは、反応液中の測定対象物質を結合させるための固相を意味し、イムノアッセイなど本発明の技術分野において周知の概念である。 [0015] The term "insoluble carrier", the measurement substance in the reaction solution refers to a solid phase for binding, it is a well known concept in the art, such as the present invention immunoassays. 通常使用される材質としては、ポリスチレン、ポリアクリル、ポリカーボネート、ポリメタクリエート、テフロンTM The material usually used, polystyrene, polyacrylic, polycarbonate, polymethacrylate cochleates, Teflon TM,
セルロース膜、紙、ガラス、アガロース、フェライト、 Cellulose film, paper, glass, agarose, ferrite,
ラテックス(天然ゴム)等が挙げられる。 Latex (natural rubber) and the like. 形状も特に限定されず、例えば、ビーズ、プレート、スティック、ゲル、樹脂、シート、カプセル等が挙げられる。 Shape is also not particularly limited, for example, beads, plates, sticks, gels, resins, sheet, capsule and the like. 被検液中の非特異物質の吸着を防ぐために、不溶性担体の表面処理を適宜行ってもかまわない。 To prevent adsorption of non-specific substances in a test fluid, it may be made necessary surface treatment of the insoluble carrier. この表面処理の例としては、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルク等によるコーティングが挙げられる。 Examples of the surface treatment, bovine serum albumin, gelatin, coating with skim milk and the like.

【0016】「負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)」とは、水溶液中で、正又は負に荷電する不溶性担体の総称であり、帯電特異的結合物質に導入された帯電性基(正又は負の帯電性基)と静電的相互作用するための帯電性を有するものである。 [0016] The term "negatively or positively charged insoluble carrier (charging solid phase)", in aqueous solution, is a general term for insoluble carrier to positively or negatively charged, introduced chargeability to charge specific binding substances and it has a chargeability to act electrostatic mutual groups (positive or negative chargeable groups). 帯電固相は、不溶性担体の樹脂自体が帯電していてもよいが、一般的には帯電性基で修飾された不溶性担体を用いる。 Charging the solid phase is insoluble carrier resin itself may be charged, typically using an insoluble carrier which is modified with a charged group. 市販のイオン交換用樹脂を用いれば、表面の電荷も均一でそのままで担体として使用できるので好適である。 The use of commercial ion exchange resins, charges on the surface is also uniform is suitable because it can be used as carriers in it. このようなイオン交換樹脂としては、陰イオン帯電担体としてはカルボキシルメチル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等を有するものが、陽イオン帯電担体としてはジエチルアミノエチル(DEAE)基、アミノ基、アミノエチル基、グアニジル基、ジメチルアミノプロピル基、(第4 Such ion exchange resins, anion charge Carriers carboxymethyl group, a sulfonic acid group, a carboxyl group, those having a phosphoric acid group and the like, diethylaminoethyl as the cation charge carriers (DEAE) group, an amino group , aminoethyl group, guanidyl group, dimethylaminopropyl group, (4
級)ポリエチルイミン基等を有するものが代表的である。 Those with grade) polyethylimine group are representative. また、担体上のアミノ基やカルボキシル基等を介して直接帯電性基を導入しても、いったんウシ血清アルブミンのようなキャリア物質を被覆した後に、この物質に帯電性基を導入しても良い。 Also, it is introduced directly chargeable group via an amino group or carboxyl group on the carrier or the like, once after coating the carrier material such as bovine serum albumin, may be introduced charged groups in the substance . N−サクシニミジルマレイミドカルボキシレート、N−サクシニミジルピリジルチオ−カルボキシレート等の介在物質(スペーサー)を介して間接的に導入する方法は反応性を高めるための好適な被覆法の一つである。 N- succinimidyl maleimide carboxylate, N- succinimidyl pyridylthio - carboxylate and a method of indirectly introduced via mediators (spacer) of one preferred coating methods for enhancing the reactivity is there.

【0017】「固定化反応溶液」とは、測定対象物質と帯電特異的結合物質との複合体(帯電複合体)を帯電固相に固定化するための反応溶液を意味する。 The "fixed reaction solution" means the reaction solution for immobilizing a complex of the analyte and the charging specific binding substance (charge complex) charged solid phase. 反応条件には特に制限は無く、反応液のpHとイオン強度については、 The reaction conditions is not particularly limited, the pH and ionic strength of the reaction solution,
適宜最適条件を求めることができる。 It can be determined as appropriate optimal conditions. しかし、先述のように被検液中には、通常、測定すべき物質の他に様々な電荷をもつ夾雑物質が共存しており、これら夾雑物質のもつ電荷が帯電特異的結合物質と固相との静電的結合に干渉する可能性が有る。 However, the test fluid as described above, usually, the other has contaminants coexist with various charges in the substance to be determined, the charge held by these contaminants is charged specific binding substance and a solid phase It can interfere with the electrostatic coupling with there. よって、夾雑物質の干渉(帯電固相への結合)を受けないためには、固定化反応溶液のイオン強度を帯電特異的結合物質と固相との静電的結合には影響しない範囲でできるだけ高く設定することが好ましい。 Therefore, in order not subject to interference contaminants (binding to the charging solid phase), only possible in a range that does not affect the electrostatic binding of the ionic strength of the immobilization reaction solution and the charge specific binding substance and a solid phase high it is preferable to set. 例えば、中性の固定化反応溶液(pH=6.0 For example, neutral immobilization reaction solution (pH = 6.0
〜8.0)を用いる場合には、pKa=4以下の帯電特異的結合物質とpKb=9以上の帯電固相を用いることが好ましく、その場合には、0.2〜0.8のイオン強度が好適である。 When using a 8.0), it is preferable to use a pKa = 4 or less of the charged specific binding substance and pKb = 9 or more charged solid phase, in which case the ionic strength of 0.2 to 0.8 is it is preferred. 0.3〜0.5MのNaClを含む緩衝液は特に好ましい固定化反応溶液である。 Buffer containing NaCl of 0.3~0.5M is particularly preferred immobilization reaction solution.

【0018】「標識」とは、当該分野(生化学的測定方法) [0018] The term "label", the art (biochemical measurement method)
で用いられる標識を意味し、酵素、放射性物質、蛍光物質、発光物質、金属化合物等が挙げられる。 It means a label used in an enzyme, a radioactive substance, fluorescent substance, luminescent substance, a metal compound, and the like. 酵素としてはβ-D-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ等が、放射性物質としては125 I等が、蛍光物質としてはフルオレセインイソチオシアネート等が、発光物質としてはアクリジニウム塩、エクオリン等が、金属化合物としてはユーロピウム3+等が代表例である。 Enzymes beta-D-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase or the like, 125 I, etc. as the radioactive substance, fluorescein isothiocyanate, etc. As the fluorescent material, a luminescent substance acridinium salts, aequorin and the like, metal compound the europium 3+ is a representative example. これらの標識を蛋白質や核酸などの特異的結合物質に導入する手法は自体公知であり、当業者であれば容易に実施できる技術である。 Method of introducing these labels to specific binding substances such as proteins and nucleic acids are known per se, is a technique that can easily implemented by those skilled in the art.

【0019】「解離反応溶液」とは、測定対象物質と帯電特異的結合物質との複合体(帯電複合体)を帯電固相から解離させるための反応溶液を意味し、免疫複合体転移測定法など、いったん測定対象物質を含む複合体を固相から解離させる場合に用いられる。 [0019] The term "dissociation reaction solution" means the reaction solution to dissociate the complex of the analyte and the charging specific binding substance (charge complex) from the charging solid phase immune complex transfer assay etc., it is used in the case that the dissociating once a complex comprising a measurement substance from the solid phase. この解離反応溶液の組成に特に制限は無く、pHとイオン強度等、適宜最適条件を求めることができる。 In particular limitations on the composition of the dissociation reaction solution is not, can be determined pH and ionic strength, etc., as appropriate optimal conditions. 解離した溶液中の複合体量の測定を行う場合、固相から帯電複合体を解離させるのに十分な強さで且つ導入された標識の測定に影響を与えない範囲であればよく、また、解離させた免疫複合体を次の固相に結合させて測定する場合は、固相から帯電複合体を解離させるのに十分な強さで且つ複合体間の結合は解離させず、次の固相への結合反応にも影響を与えない範囲のイオン強度が選択されればよい。 When measuring the complex of the dissociated solution, as long as it does not affect the and the measurement of the introduced labeled strong enough to dissociate the charged complexes from the solid phase, also, when measuring the immune complexes were dissociated by binding to the next solid phase, and binding between the complex strong enough to dissociate the charged complexes from the solid phase without dissociation, the following solid ionic strength in the range that does not also affect the binding reaction to phases may be selected. 通常は、0.5 Usually, 0.5
〜3のイオン強度が選択される。 Ionic strength to 3 is selected. 1〜2MのNaClを含む緩衝液は、特に好ましい解離反応溶液である。 Buffer containing NaCl of 1~2M are particularly preferred dissociation solution. このほか、帯電特異的結合物質に導入された帯電性基が電荷を失うような塩基性あるいは酸性の緩衝液を用いて、系のpHを変え、複合体を解離させることも可能である。 In addition, by using introduced into charged specific binding substances were charged group is a buffer of a basic or acidic as lose charge, changing the pH of the system, it is also possible to dissociate the complex.

【0020】(方法の説明)以下に本発明の固定化方法を応用したサンドイッチ法イムノアッセイを例に解説する。 [0020] The sandwich method immunoassays which applies the immobilization method of the invention are described below (description of the method) commentaries on examples. (1)帯電特異的結合物質の調製 帯電特異的結合物質の調製は、一般的な蛋白質の修飾技術により行うことができる。 (1) Preparation of Preparation charged specific binding substance of the charge-specific binding substance may be carried out by qualified technical common proteins. 例えば、特異的結合物質のアミノ基やカルボキシル基、SH基等に直接あるいは、 For example, an amino group or carboxyl group of the specific binding substance, directly to the SH group or,
N−サクシニミジルマレイミドカルボキシレート、N− N- succinimidyl maleimide carboxylate, N-
サクシニミジルピリジルチオ−カルボキシレート等の介在物質(スペーサー)を介して、(スルホーL―チロシン) 4などのスルホン酸残基を有する物質を導入する。 Succinimidyl pyridylthio - via the carboxylate mediators (spacer), to introduce a substance having a sulfonate residue such as (Suruho L- tyrosine) 4.
このほか、遺伝子組換えの手法を用いることにより、特異的結合物質となるタンパク自体に帯電性のアミノ酸あるいは核酸残基を複数個付加して発現させることも可能である。 In addition, by using a technique of genetic recombination, it is also possible to express by a plurality adding chargeable amino acids or nucleic acid residues in the protein itself as a specific binding substance. この様にして調製した「帯電特異的結合タンパク」は、クロマトグラフィーや凍結乾燥等、適当な手法にて精製および保管でき、随時本発明の固定化方法および診断方法に用いることができる。 "Charged specific binding protein", prepared in this manner, chromatography and freeze-drying, etc., can be purified and stored at suitable technique can be used for immobilization and diagnostic methods of the present invention from time to time. また、帯電特異的結合物質を帯電固相と静電的に結合させたものを予め調製しておき、要事、測定対象物質と結合させることもできる(工程(A'))。 Moreover, those charged specific binding substance to the charged solid phase and electrostatically bound in advance prepared, toothpick, may also be coupled with analyte (step (A ')). このような態様で用いる「帯電特異的結合物質固定化担体」もイオン結合クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーの分野で自体公知の手法にて、製作および保管できる。 At a technique known per se in the field of "charged specific binding substance-immobilized carrier" also ionic bonds chromatography or affinity chromatography used in this manner, it can be manufactured and stored.

【0021】(2)帯電複合体の形成および固定化 測定対象物質を含む被検液、帯電固相および帯電特異的結合物質を固定化反応溶液中で反応させ、帯電複合体を帯電固相上に形成させる工程(A)または(A')は、 [0021] (2) charging complex test liquid form and containing immobilized target substance of charging solid phase and the charge specific binding agent is reacted with the immobilized reaction solution, the charged complexes charging solid phase the step (a) or (a ') to be formed on,
通常のイムノアッセイで繁用される固定化と同様の条件で行われる。 Is carried out under the same conditions as immobilization are frequently used in conventional immunoassays. 測定対象物質と結合させる帯電特異的結合物質の種類および数は特に限定されず、その後の形成された複合体と担体との結合様式に合わせて自由にその種類や数を選択すればよい。 Type and number of charged specific binding substance to bind with the target substance is not particularly limited, and may be freely select the type and number in accordance with the mode of binding and subsequent complexes formed and a carrier. 後述するように特異的標識物質を用いて形成された複合体を検出する系では測定対象物質1分子に対して帯電特異的結合物質は1分子で足りるし、凝集反応により複合体を検出するような系では、 It charged specific binding substance against the target substance 1 molecule in a system for detecting the complex formed with specific labeling substances as described later suffice 1 molecule, to detect the complex by agglutination in such a system,
測定対象物質1分子に対して通常複数の帯電特異的結合物質が結合するように調整される。 Usually a plurality of charging specific binding substance is adjusted so as to bind to analyte molecule.

【0022】(3)標識化 固相に結合された測定すべき物質を含む複合体の検出方法についても特に制限はなく、従来、物質の検出に使用されてきた方法を適応すればよい。 [0022] (3) it is not particularly limited method for detecting the complex comprising a substance to be measured bound to labeled solid phase, conventionally, may be adapted to methods that have been used for the detection of substances. なかでも、適当な標識化合物を用いて検出する方法は最もよく使用される方法である。 Among them, a method of detecting with a suitable label compound is a method most commonly used. 例えば、帯電特異的結合物質とは別に、測定すべき物質と特異的に複合体を形成する活性を有し且つあらかじめ標識化合物が導入された物質(特異的標識物質)を反応させることによって達成されてもよいし、また、測定対象物質と特異的複合体を形成する帯電特異的結合物質に、あらかじめ標識化合物を導入しておいてもよい。 For example, the charging specific binding substance separately, is accomplished by reacting the substance to be determined specifically and pre-labeled compound has an activity to form a complex is introduced material (specific labeling substance) it may be, also, the charging specific binding agent to form the analyte and specific complex, may be introduced into a pre-labeled compound. 測定対象物質と特異的標識物質とを反応させる場合、その反応は、測定対象物質と帯電特異的結合物質からなる複合体を担体に捕捉する前でも捕捉された後でも構わないが、操作の簡便性を考えると、反応溶液で同時に[帯電特異的結合物質−測定対象物質−特異的標識物質]なる複合体を形成させた後に担体に捕捉する方法がより好ましい。 If the reaction of the analyte and specific labeling substance, the reaction is may a complex consisting of analyte charged specific binding substance even after being captured even before the trapped carriers, simple operation Given the gender, simultaneously in the reaction solution method of capturing the carrier after forming the charge specific binding agent - - the target substance-specific labeling substance] becomes complex are more preferable.

【0023】(応用)本発明の固定化方法および測定方法は、原則的に、特異的結合反応を用いる生化学的測定全てに応用できる。 [0023] (Application) immobilization methods and measurement methods of the present invention, in principle, applicable to any biochemical measurement using a specific binding reaction. すなわち、本発明を使用する測定系は、特に限定されず、ホモジニアス系でもヘテロジニアス系でもよ。 That is, the measurement system using the present invention is not particularly limited, even in heterogeneous system in homogeneous systems. また、凝集法、サンドイッチ法イムノアッセイ(免疫複合体転移測定法を含む)、競合法イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイなど応用は多岐にわたる。 Also, agglutination method, (including the immune complex transfer assay) sandwich method immunoassays, competitive method immunoassays, nucleic acid hybridization assays such applications are manifold. また、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応) In addition, PCR (polymerase chain reaction)
などの遺伝子増幅方法において、プローブに帯電性基を導入し、遺伝子増幅後、帯電固相への固定化に用いることもできる。 In gene amplification methods, such as, by introducing a charged group into the probe, after gene amplification, it can be used for immobilization of the charging solid phase. (A)競合法 競合法に適用する場合、帯電特異的結合物質に対して測定すべき物質と競合する成分が測定系に添加される。 When applied to (A) competitive method competitive method, component competes with the substance to be measured to the charging specific binding substances are added to the measurement system. 例えば、被検液中の抗原物質を測定する場合、帯電性基が導入された抗体(帯電特異的結合物質)に対して、あらかじめ標識が導入された抗原物質と被検液中の抗原物質とを溶液中で競合反応させた後、得られた複合体を帯電固相に結合させて、その標識量を測定することにより被検液中の抗原物質量が算出される。 For example, when measuring the antigenic substance in the test solution for antibody chargeable group is introduced (charged specific binding agent), previously labeled is introduced and the antigen substance and the antigenic substance in a test fluid the after competitive reaction in solution, by combining the resulting complex charged solid phase, the antigenic substance amount in the test solution is calculated by measuring the labeled quantity.

【0024】(B)凝集法 凝集法に適用する場合、測定対象物質に対して溶液中で複数の帯電特異的結合物質を結合させた後、あらかじめ表面を帯電特異的結合物質と静電気に結合する物質で被覆したラテックス等の微粒子を反応液に添加することにより、測定すべき物質量に応じた微粒子の凝集反応が惹起される。 [0024] (B) when applied to aggregation method aggregation method, after bonding a plurality of charging specific binding substance in solution relative to analyte, binds the advance surface charged specific binding substances and electrostatic by adding fine particles such as latex coated with substances to the reaction solution, agglutination of the microparticles in accordance with the amount of substance to be measured is induced. 形成された凝集量は、一般に反応液の濁度、 Is agglomerated amount, the turbidity of the general reaction,
吸光度、偏光度の変化等で観察される。 Absorbance is observed in the change in polarization degree, or the like.

【0025】(C)免疫複合体転移測定法及びその改良法 免疫複合体転移測定法に適用する場合には、免疫複合体を第1固相へ捕捉するまでのステップは、基本的にはこれまでに述べてきた方法と同様に、被検液中の測定対象物質に対して反応溶液中で[帯電特異的結合物質−測定対象物質−特異的標識物質]なる複合体を形成させた後に固相に捕捉させればよい。 [0025] When applied to (C) immune complex transfer assay and improved method immune complex transfer assay, steps from capturing the immune complexes to the first solid phase is basically this similar to the method has been described so far, in the reaction solution with respect to the measurement substance in a test liquid-solid after forming the charge-specific binding substance - specific labeling substance - the target substance] becomes complex it is sufficient to capture the phase. あるいは、別の方法として、あらかじめ担体表面上に静電的結合された帯電特異的結合物質に対して被検液中の測定対象物質および特異的標識物質を反応させて、固相表面上で[帯電特異的結合物質−測定対象物質−特異的標識物質]なる複合体を形成させてもよいし、さらには、一旦別の固相上で形成させた複合体[帯電特異的結合物質−測定対象物質−特異的標識物質]を解離させた後に捕捉しても構わない。 Alternatively, as another method, by reacting analyte and specific labeling substance in a test sample fluid to the charging specific binding substances electrostatically bonded in advance on the support surface, the solid surface in the charging specific binding substance - the target substance - may be to form specific labeling substance] becomes complex, furthermore, once complex formed on another solid phase charging specific binding substance - measured material - may be captured after dissociating specific labeling substance.
また、測定対象物質を含んで形成される複合体中のいずれかの成分と特異的に結合し且つ溶液中で正または負の荷電を示す帯電性基が導入された物質(間接的帯電特異的結合物質)をあらかじめ該帯電性基の持つ電荷を利用した静電気的作用を介して固相上に結合させておき、間接的帯電特異的結合物質を介して、測定対象物質を含む複合体を固相上に捕捉させてもよい。 Also, any component that specifically binds to and charged groups exhibiting a positive or negative charge in solution is introduced substance (indirect charging specific for complexes formed contain analyte through electrostatic action utilizing a charge having the binding substance) of advance the charged groups allowed to bind to the solid phase, via the indirect charging specific binding substances, solid complexes comprising analyte it may be trapped in the phase upper. このような間接的帯電特異的結合物質を用いる例としては、特異的結合物質にビオチンを導入しておき、測定対象物質と特異的結合物質で形成された複合体を、帯電性基を介してあらかじめ固相に結合させたアビジン(またはストレプトアビジン)で捕捉する方法、あるいは特異的結合物質にハプテンを導入しておき、形成された複合体を、帯電性基を介してあらかじめ固相に結合させた抗ハプテン抗体で捕捉する方法等が挙げられる。 As the example of using indirect charging specific binding substances, in advance by introducing biotin specific binding substance, a complex formed by the analyte and the specific binding substance via a chargeable group how to capture with avidin bound to advance the solid phase (or streptavidin) or leave introducing hapten specific binding agent, the complex formed, via a charging group is bound to advance the solid phase, method or the like to capture the like with anti-hapten antibody. また、この場合も、一旦別の固相上で形成させた、測定対象物質を含む複合体を解離させた後に、該複合体を間接的帯電特異的結合物質を介して固相上に捕捉させても構わない。 Also in this case, was once formed on another solid phase, after the complexes can be dissociated including the analyte, it is captured on the solid phase via the indirect charging specific binding substance complex and it may be.

【0026】その後、固相上に捕捉された免疫複合体は、その固相を適当なイオン強度をもつ溶液と接触させることにより速やかに解離させることができる。 [0026] Then, the captured immune complex on the solid phase can be dissociated rapidly by contacting a solution with the solid phase suitable ionic strength. このときのイオン強度は、解離した溶液中で複合体量の測定を行う場合は、固相から免疫複合体を解離させるのに十分な強さで且つ導入された標識の測定に影響を与えない範囲のイオン強度であればよく、また、解離させた免疫複合体を次の固相に結合させて測定する場合は、固相から免疫複合体を解離させるのに十分な強さで且つ複合体間の結合は解離させず、次の固相への結合反応にも影響を与えない範囲のイオン強度が選択されればよい。 Ionic strength at this time, when measuring the complex amount dissociated solution does not affect the and the measurement of the introduced labeled strong enough to dissociate the immune complexes from the solid phase It may be a ionic strength in the range, also when measuring the immune complexes were dissociated by binding to the next solid phase and conjugate strong enough to dissociate the immune complexes from the solid phase coupling between not dissociated, ionic strength in the range that does not also affect the binding reaction to the next solid phase may be selected. 通常は、0.5 Usually, 0.5
〜3.0のイオン強度が選択される。 Ionic strength of 3.0 is selected.

【0027】第1の固相から解離された免疫複合体を第2の固相に捕捉する方法は、従来の免疫複合体転移測定法で使用された方法を用いてもよいし、本発明の技術を再び適用してもよい。 The immune complexes were dissociated from the first solid phase method of capturing the second solid phase may be used methods used in conventional immune complex transfer assay, the present invention technology may also be applied again. 本発明の技術を再び適用する方法の例としては、第1固相からの解離に使用されたイオン強度下でも複合体中の帯電特異的結合物質と静電的相互作用を有するような第1固相よりもさらに強い電荷を持つ帯電性基が表面に被覆された固相を第2固相として用いる方法や第1固相から複合体を解離した溶液を希釈、ゲル濾過、透析などして、溶液のイオン強度を低くしてから第2固相と静電反応させる方法等が挙げられる。 Examples of how to apply the techniques of the present invention again, the like also have a charged specific binding substance and the electrostatic interaction in the complex under an ionic strength that is used to dissociate from the first solid phase 1 diluted solution dissociated complexes from the process or the first solid phase used charged groups is a solid phase coated on the surface with a stronger charge than solid phase as a second solid phase, gel filtration, and the like dialysis the method is a second solid phase and the electrostatic reaction after lowering the ionic strength of the solution, and the like. 固相から解離された複合体の溶液中での測定や、あるいは次の固相への結合させた後の測定については、従来免疫複合体転移測定法あるいはその改良法で用いられている方法を使用すればよい。 Dissociated from the solid phase and measurement in a solution of the complex, or a method for the measurement of after binding to the next solid phase used in the conventional immune complex transfer assay, or improved method thereof it may be used.

【0028】 [0028]

【実施例】以下、本発明の有用性を説明するために、実施例として血清中のHIV-1,p24抗原の固相捕捉後の測定、固相に捕捉されたHIV-1,p24抗原を含む免疫複合体の当該固相からの解離反応および固相に捕捉されたHIV-1,p24抗原を含む免疫複合体を当該固相から解離させて別の固相に転移させた後の測定を本発明法を用いて行い、従来技術と比較した例を示す。 EXAMPLES Hereinafter, in order to illustrate the utility of the present invention, after the solid phase capture of HIV-1, p24 antigen in serum as an example measurements, the HIV-1, p24 antigen captured on the solid phase the measurement after being transferred to another solid phase immune complexes containing the dissociation reaction and solid-HIV-1 trapped in phase, p24 antigen from the solid phase of the immune complexes were dissociated from the solid phase comprising It performed using the present invention method, an example of comparison with the prior art.

【0029】実施例1 本実施例では、本発明の特徴を直接的に示すために、被検液中のHIV-1,p24抗原の固相捕捉後の測定を本発明の方法により行った。 [0029] EXAMPLE 1 In this example, in order to show directly the characteristics of the present invention was performed by the method of the present invention the measurement after the solid phase capture of HIV-1, p24 antigen in a test fluid. 各物質の精製・調製の詳細、および実験手順の詳細は以下の通りである。 Details of purification and preparation of the material, and the details of the experimental procedure is as follows. 〔緩衝液〕本実験では、以下の緩衝液を主に使用した。 The [buffer] This experiment was mainly used the following buffer. 緩衝液A:0.01 mol/L リン酸ナトリウム緩衝液,pH7. Buffer A: 0.01 mol / L sodium phosphate buffer, pH 7.
0、 1 g/L ウシ血清アルブミン(フラクションV、インターゲン社、ニューヨーク)、1 mmol/L 塩化マグネシウム及び 1 g/L アジ化ナトリウム 0, 1 g / L bovine serum albumin (Fraction V, inter Gen Corp., New York), 1 mmol / L magnesium chloride and 1 g / L sodium azide

【0030】〔遺伝子組替えHIV-1,p24(rp2 [0030] [genetically modified HIV-1, p24 (rp2
4)の調製〕遺伝子組替えHIV-1,p24(rp2 4) were obtained in genetically modified HIV-1, p24 (rp2
4)は、遺伝子組替えHIV-1,p17を調製する公知の方法〔石川ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス(J. Clin. Lab. Anal.)、第1 4) a known method [Ishikawa et al to prepare the HIV-1, p17 recombinant gene, Journal of Clinical Laboratory Analysis (J. Clin. Lab. Anal.), First
2巻、第179-189頁(1998)〕に準じて、HIV-1単離株由来のDNAからポリメラーゼ鎖反応法(PCR法) 2, pp. 179-189 (1998)] in analogously, the polymerase chain reaction method from the DNA derived from HIV-1 isolates (PCR method)
で増幅させたp24DNA断片をプラスミドに導入し、 In the p24DNA fragments were amplified by introducing the plasmid,
マルトース結合蛋白(MBP)との融合蛋白質として大腸菌で発現させ、その後各種蛋白精製法を用いて精製した後に、ロッシュ社(バーゼル、スイス)のキットを用い、同社の操作手順に従って、ビオチニルXa因子によるrp24とMBPの切断およびストレプトアビジンカラムによるビオチニルXa因子の除去を行って調製した。 Expressed in E. coli as a fusion protein with maltose binding protein (MBP), after purification followed using various protein purification methods, using a kit Roche (Basel, Switzerland), according to the manufacturer's operating procedures, by biotinyl factor Xa performing removal of biotinyl factor Xa by the cutting and streptavidin columns rp24 and MBP was prepared. 精製したrp24の純度は電気泳動法にて確認した。 The purity of the purified rp24 was confirmed by electrophoresis.

【0031】〔L-アラニン-(スルホ-L-チロシン) −抗HIV-1,p24Fab'の調製〕抗HIV-1,p2 [0031] [L- alanine - (sulfo -L- tyrosine) 4 - anti-HIV-1, the preparation of P24Fab '] Anti HIV-1, p2
4ポリクローナル抗体は、既報〔橋田ら、ジャーナル・ 4 polyclonal antibody, previously reported [Hashida, et al., Journal
オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J. Clin. M Of Clinical Microbiology (J. Clin. M
icrobiol.)、第33巻、第298-303頁(1995)〕の方法でウサギをrp24により免疫して作成し、得られた抗血清より公知の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J. Clin. Microbio Icrobiol.), Vol. 33, pp. 298-303 (1995) rabbits by the method of] prepared by immunizing a RP 24, a known method from the antiserum obtained [Hashida et al., Journal of Clinical Micro Biology (J. Clin. Microbio
l.)、(1995)、(前出)〕でFab'を調製した。 l.), (1995), was prepared Fab 'in (supra)]. 続いて、抗HIV-1,p24Fab'、1.4 mg(30 nmo Subsequently, the anti-HIV-1, p24Fab ', 1.4 mg (30 nmo
l)とγ-マレイミド・ブチリル・L-アラニン-(スルホ l) and γ- maleimide-butyryl · L- alanine - (sulfo
-L-チロシン) (ペプチド研究所、大阪)、0.7mg(4 -L- tyrosine) 4 (Peptide Institute, Osaka), 0.7mg (4
20 nmol)を5 mmol/LのEDTAを含む0.1 mol/L リン酸ナトリウム緩衝液,pH6.0、0.7 mL中で室温にて1時間反応させ、0.1 mol/Lの塩化ナトリウムを含む0.1 mol 20 nmol) of 5 mmol / L 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing EDTA, and reacted for 1 hour at room temperature in pH6.0,0.7 mL, 0.1 mol of sodium chloride of 0.1 mol / L
/L リン酸ナトリウム緩衝液,pH7.0にてゲルろ過して調製した。 / L sodium phosphate buffer, was prepared by gel filtration at pH 7.0.

【0032】〔マウスモノクローナル抗HIV-1,p24 [0032] [mouse monoclonal anti-HIV-1, p24
Fab'−β-D-ガラクトシダーゼの調製〕マウス抗p Fab'-β-D- galactosidase of preparation] mouse anti-p
24モノクローナル抗体は、イノジェネティクス社(In 24 monoclonal antibody, Innogenetics, Inc. (In
nogenetics、ベルギー)から購入し、既報〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス(J. Clin. Lab. Anal.)、第10巻、第302-307頁(19 nogenetics, it was purchased from Belgium), previously reported [Hashida et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (J. Clin. Lab. Anal.), Vol. 10, pp. 302-307 (19
96)〕の方法により調製した。 It was prepared by the method of 96)].

【0033】〔β-D-ガラクトシダーゼの活性測定〕β-D- [0033] [β-D- galactosidase activity measurement] β-D-
ガラクトシダーゼの測定は、4-メチルウンベリフェリル Measurements of galactosidase, 4-methylumbelliferyl
-β-D-ガラクトシドを基質とする公知の方法〔今川ら、アンナルス・クリニカル・バイオケミストリー(An Known method [Imagawa et al. For a-beta-D-galactoside as a substrate, An'narusu Clinical Biochemistry (An
n. Clin. Biochem.)、第21巻、第310-317頁(1984)〕 n. Clin. Biochem.), Vol. 21, pp. 310-317 (1984)]
で反応させ、生成した4-メチルウンベリフェロンの蛍光強度を分光蛍光光度計(RF−510、島津製作所、京都)で測定した。 In reacted, splits the fluorescence intensity of the generated 4-methyl umbelliferone fluorescent photometer (RF-510, Shimadzu, Kyoto) was measured in. 蛍光値は、1×10 -8 mol/Lの4-メチルウンベリフェロンを含む0.1 mol/L グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液,pH10.3の示す蛍光強度を100として補正を行った。 Fluorescence values, 0.1 mol / L glycine containing 4-methylumbelliferone of 1 × 10 -8 mol / L - sodium hydroxide buffer solution, was corrected fluorescence intensity indicated by the pH10.3 as 100.

【0034】〔被検液中のHIV−1,p24抗原の測定〕 [0034] Measurement of HIV-1, p24 antigen in a test fluid]
0 amolあるいは500 amolのrp24抗原、100 fmolのL 0 amol or 500 amol rp24 antigen, of 100 fmol L
-アラニン-(スルホ-L-チロシン) −抗HIV-1, - alanine - (sulfo -L- tyrosine) 4 - anti-HIV-1,
p24Fab'および10 fmolのマウスモノクローナル抗HIV-1,p24Fab'−β-D-ガラクトシダーゼを含む緩衝液A(50μgの不活性β-D-ガラクトシダーゼ(ムテイン、ロッシュ社)、50μgの非特異マウスI P24Fab 'and 10 mouse monoclonal anti-HIV-1 in fmol, inactive beta-D-galactosidase (muteins of Buffer A (50 [mu] g containing p24Fab'-β-D- galactosidase, Roche), unspecific mouse I of 50 [mu] g
gG及び0.4 mol/L 塩化ナトリウムを含む)、100μL中にて、室温で3時間反応させた。 Including gG and 0.4 mol / L sodium chloride), C. in 100 [mu] L, and allowed to react for 3 hours at room temperature. 続いて、これをジエチルアミノエチル-セファロース(DEAE-Sepharose) Then, diethylaminoethyl this - Sepharose (DEAE-Sepharose)
イオン交換樹脂固相(ファルマシアLKB・バイオテクノロジー社、スウェーデン)と混合し、室温で5分間攪拌させた後、固相を0.4 mol/Lの塩化ナトリウムを含む緩衝液A、200μLで3回洗浄し 固相に結合したβ-D- Ion exchange resin solid (Pharmacia LKB · Biotechnology, Sweden) was mixed with and allowed to stir at room temperature for 5 minutes, solid phase buffer A, washed 3 times with 200μL containing sodium chloride of 0.4 mol / L β-D- bound to the solid phase
ガラクトシダーゼの活性を10分間反応で測定した。 The activity of galactosidase were measured at 10 min reaction. 固相は、0.4 mol/L 塩化ナトリウムおよび0.2 g/L アジ化ナトリウムを含む10 mmol/L リン酸ナトリウム緩衝液,p The solid phase, 0.4 mol / L sodium chloride and 10 mmol / L sodium phosphate buffer containing 0.2 g / L sodium azide, p
H7.0にて平衡化したDEAE-Sepharoseを同緩衝液にて10倍容に懸濁し、その30μLの遠心ペレットを用いた。 The DEAE-Sepharose equilibrated with H7.0 was suspended in 10 volumes of the same buffer, using a centrifugal pellet of 30 [mu] L. さらに、反応液中の52.5μLの緩衝液Aの代りに2.5 Further, 2.5 instead of Buffer A 52.5μL in the reaction solution
μLの5 mol/L 塩化ナトリウムと50μLの健常人血清を含む条件で同様の実験を行った。 A similar experiment was performed in conditions including a healthy human serum 5 mol / L sodium chloride and 50μL of [mu] L. 血清の添加無し、有りの各条件におけるrp24、0 amolと500amol含有時の固相に結合したβ-D-ガラクトシダーゼの活性測定値を表1に示す。 Without the addition of serum, the Rp24,0 amol and 500amol activity measurements of bound beta-D-galactosidase to a solid phase during inclusion in the condition there shown in Table 1.

【0035】比較例1 本比較例では、実施例1と同じく被検液中のHIV- [0035] In Comparative Example 1 In this comparative example, the same test solution as in Example 1 HIV-
1,p24の測定を従来の2,4-ジニトロフェニル基と抗 1, p24 measurements anti to the conventional 2,4-dinitrophenyl group
2,4-ジニトロフェニル基抗体の反応を利用して複合体を固相に捕捉する方法を用いて行った。 It was performed using the method for capturing the complex to the solid phase by utilizing the reaction of 2,4-dinitrophenyl group antibodies. 各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は実施例1に記載した通りである。 More details and experimental procedures purification and preparation of the material other than the following are as described in Example 1. 〔アフィニティー精製抗2,4-ジニトロフェニル基IgG [Affinity purified anti-2,4-dinitrophenyl group IgG
不溶化ポリスチレンボールの調製〕ウサギ抗2,4-ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン抗体(IgG)溶液を Insolubilized polystyrene Preparation of the ball] Rabbit anti 2,4-dinitrophenyl - bovine serum albumin antibody (IgG) solution
2,4-ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンカラムに吸着後、pH2.5で溶出する公知の方法〔河野ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス(J. Clin. Lab. Anal.)、第2巻、第209-214頁(198 2,4-dinitrophenyl - (... J. Clin Lab Anal) after adsorption to bovine serum albumin column, a known method [Kono et al., Eluting with pH 2.5, Journal of Clinical Laboratory Analysis, second winding, pp. 209-214 (198
8)〕でアフィニティー精製した抗2,4-ジニトロフェニル基IgGを既報〔石川および加藤、スカンジナヴィアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Scand. J. Immu Anti 2,4-dinitrophenyl group IgG affinity purified with 8)] previously reported [Ishikawa and Kato, Scandinavium Vian Journal of Immunology (Scand. J. Immu
nol.)、第8巻(補7)、第43-55頁(1978)〕の方法に従い、ポリスチレンボール(直径6.35 mm、イムノケミカル社、岡山)に不溶化した。 nol.), Vol. 8 (accessory 7), according to the method of pp. 43-55 (1978)], polystyrene balls (diameter 6.35 mm, immuno-Chemical Co., Ltd., was insoluble in Okayama). 用いた溶液のIgG濃度は10μg/mLであった。 IgG concentration of the solution used was 10 [mu] g / mL.

【0036】〔2,4-ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗HIV-1,p2 [0036] [2,4-dinitrophenyl - biotinyl - bovine serum albumin - affinity purified anti-HIV-1, p2
4Fab'の調製〕アフィニティー精製抗HIV-1, Preparation of 4 FAb '] Affinity purified anti-HIV-1,
p24Fab'に、2,4-ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミンを反応させる公知の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス(1996)、(前出)〕で、2,4-ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗HIV-1,p24Fab'を調製した。 The P24Fab ', 2,4-dinitrophenyl - biotinyl - known method of reacting bovine serum albumin [Hashida et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (1996), supra], the 2,4 dinitrophenyl - biotinyl - bovine serum albumin - was prepared affinity purified anti-HIV-1, p24Fab '.

【0037】〔被検液中のHIV−1,p24抗原の測定〕 [0037] Measurement of HIV-1, p24 antigen in a test fluid]
0 amolあるいは500 amolのrp24抗原、50μgの不活性β-D-ガラクトシダーゼ、100 fmolの2,4-ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗HIV-1,p24Fab'、10 fmolのマウスモノクローナル抗HIV-1,p24Fab'−β-D 0 amol or 500 amol RP 24 antigen, 50 [mu] g of inert beta-D-galactosidase, the 100 fmol 2,4-dinitrophenyl - biotinyl - bovine serum albumin - affinity purified anti-HIV-1, p24Fab ', 10 fmol mouse monoclonal anti-HIV-1, p24Fab'-β-D
-ガラクトシダーゼおよび0.1 mol/Lの塩化ナトリウムをそれぞれ含む緩衝液A、90μLと非特異ウサギ血清10μL - galactosidase and 0.1 mol / L buffer A containing sodium chloride respectively, 90 [mu] L and nonspecific rabbit serum 10μL
を、13.3×54 mmのテストチューブに添加し、室温で3 It was added to test tubes of 13.3 × 54 mm, 3 at room temperature
時間反応させた。 It was time reaction. 続いて、同テストチューブにアフィニティー精製抗2,4-ジニトロフェニル基IgG不溶化ポリスチレンボール固相1個を添加し、振とうしながら室温で30分反応させた後、固相を0.1 mol/L塩化 ナトリウムを含む緩衝液A、2 mLで2回洗浄し 固相に結合したβ- Subsequently, the addition of one affinity-purified anti-2,4-dinitrophenyl group IgG insolubilized polystyrene ball solid phase in the test tube and allowed to react for 30 minutes at room temperature with shaking, solid phase 0.1 mol / L chloride washed twice with buffer a, 2 mL containing sodium bound to the solid phase β-
D-ガラクトシダーゼの活性を10分間反応で測定した。 Of D- galactosidase activity was measured at 10 min reaction.
さらに、同様の実験を反応液中に50μLの健常人血清を含む条件で行った。 Furthermore, it was carried out in conditions, including healthy individuals sera 50μL reaction solution in similar experiments. 血清の添加無し、有りの各条件におけるrp24、0 amolと500 amol含有時の固相に結合したβ-D-ガラクトシダーゼの活性測定値を実施例1の結果とあわせて表1に示す。 Without the addition of serum, the Rp24,0 amol and 500 amol activity measurements of bound beta-D-galactosidase to a solid phase during content in each condition of there together with the results of Example 1 shown in Table 1. 従来法で血清共存サンプルを測定した場合(比較例1)、血清を含まないサンプルに対し反応効率は45%に低下する。 When measuring serum coexistence samples by the conventional method (Comparative Example 1), the reaction efficiency to the sample without serum is reduced to 45%. 一方、本発明方法では、血清による反応効率低下は認められなかった(実施例1:反応効率100%)。 On the other hand, in the present invention method, the reaction efficiency decreases by serum was observed (Example 1: Reaction Efficiency 100%).

【0038】 [0038]

【表1】 [Table 1]

【0039】実施例2 本実施例では、特定物質を超高感度に測定する技術である免疫複合体転移測定法〔E.Ishikawa, "Ultrasensitiv [0039] Example 2 In this example, a technique for measuring a specific substance in the ultra-sensitive immune complex transfer assay [E.Ishikawa, "Ultrasensitiv
e and Rapid Enzyme Immunoassay"; Laboratory Techni e and Rapid Enzyme Immunoassay "; Laboratory Techni
ques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.2 ques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.2
7,(1999), Ed.:S.Pillai and PCvan der Vliet, Else 7, (1999), Ed.:S.Pillai and PCvan der Vliet, Else
vier, Amsterdam,(前出)〕においても、本発明法の適用が有効であることを示すため、免疫複合体転移測定法によるHIV-1,p24抗原測定系において、免疫複合体を第一の固相に捕捉後、該固相から解離させる工程までを本発明法の技術を用いて行った。 vier, Amsterdam, (supra) also in], to indicate that application of the present invention method is effective, in HIV-1, p24 antigen assay system by immune complex transfer assay, the immune complexes first after capture the solid phase, the up step of dissociating from the solid phase was carried out using the technique of the present invention method. 各物質の精製・ Purification of each substance,
調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。 More details and experimental procedure for other than the following are as previously described. 〔L-アラニン-(スルホ-L-チロシン) −抗HIV- [L- alanine - (sulfo -L- tyrosine) 4 - anti-HIV-
1,p24Fab'、rp24抗原およびマウスモノクローナル抗HIV-1,p24Fab'−β-D-ガラクトシダーゼからなる複合体のDEAEイオン交換樹脂固相からの解離〕500 amolのrp24を用いて実施例1のβ-D-ガラクトシダーゼ活性測定前までと同様の操作を行い、DEAEイオン交換樹脂固相上に、L-アラニン- 1, p24Fab ', rp24 antigen and mouse monoclonal anti-HIV-1, p24Fab'-β-D- dissociation from the complex DEAE ion-exchange resin solid phase consisting of galactosidase] 500 Example using RP 24 of amol 1 beta -D- the same procedure as before galactosidase activity measurement, on DEAE ion-exchange resin solid phase, L- alanine -
(スルホ-L-チロシン) −抗HIV-1,p24Fa (Sulfo -L- tyrosine) 4 - anti-HIV-1, p24Fa
b'、rp24抗原およびマウスモノクローナル抗HI b ', RP 24 antigen and mouse monoclonal anti-HI
V-1,p24Fab'−β-D-ガラクトシダーゼからなる複合体を結合させた。 V-1, was coupled complex consisting p24Fab'-β-D- galactosidase. 続いて、同固相を2.0 mol/L Subsequently, the same solid phase 2.0 mol / L
の塩化ナトリウムを含む緩衝液A、100μL中に懸濁し、 Buffer A, and suspended in 100μL containing sodium chloride,
1分、3分及び5分間攪拌させた後に、溶液と固相を分離し、溶液に含まれる複合体中のβ-D-ガラクトシダーゼの活性を10分間反応で測定した。 1 minute, after allowed to stir for 3 minutes and 5 minutes to separate the solution and the solid phase, the beta-D-galactosidase activity in the complex contained in the solution was measured at 10 min reaction. そして、最初の固相に結合していた複合体中のβ-D-ガラクトシダーゼ活性と溶液中の複合体のβ-D-ガラクトシダーゼ活性から、 Then, from the first solid phase bound it has been in complex beta-D-galactosidase activity and the complex of beta-D-galactosidase activity in a solution,
最初固相に結合していた複合体のうち溶液中に解離された複合体の割合を求めた。 Was determined the ratio of the complex is dissociated in a solution within the first solid was bound to phase complex. それぞれのインキュベーション時間における解離の割合(%)を図1に示す。 Ratio of dissociation at each incubation time (%) shown in FIG.

【0040】比較例2 本比較例では、免疫複合体転移測定法によるHIV- [0040] In Comparative Example 2 Comparative Example, by immune complex transfer assay HIV-
1,p24抗原測定系において、免疫複合体を第一の固相に捕捉後、該固相から解離させる工程までを従来の2, 1, the p24 antigen assay system, after capturing the immune complexes to the first solid phase, the steps up to the step of dissociating from the solid phase prior 2,
4-ジニトロフェニル基と抗2,4-ジニトロフェニル基抗体の反応を利用して実施する方法を用いて行った。 It was performed using the method carried out by utilizing the reaction of 4-dinitrophenyl group and the anti-2,4-dinitrophenyl group antibodies. 各物質の精製・調製の詳細および実験手順の詳細は下記以外は先に記載した通りである。 More details and experimental procedures purification and preparation of the material other than the following are as previously described. 〔2,4-ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗HIV-1,p24Fa [2,4-dinitrophenyl - biotinyl - bovine serum albumin - affinity purified anti-HIV-1, p24Fa
b'、rp24抗原およびマウスモノクローナル抗HI b ', RP 24 antigen and mouse monoclonal anti-HI
V-1,p24Fab'−β-D-ガラクトシダーゼからなる複合体のアフィニティー精製抗2,4-ジニトロフェニル基IgG不溶化ポリスチレンボール固相からの解離〕 V-1, dissociation from p24Fab'-β-D- affinity purification of galactosidase consisting complex anti 2,4-dinitrophenyl group IgG insolubilized polystyrene ball solid phase]
500 amolのrp24を用いて比較例1のβ-D-ガラクトシダーゼ活性測定前までと同様の操作を行い、アフィニティー精製抗2,4-ジニトロフェニル基IgG不溶化ポリスチレンボール固相上に、2,4-ジニトロフェニル−ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製抗H The same procedure as before beta-D-galactosidase activity measured in Comparative Example 1 using a 500 RP 24 of amol, the affinity purified anti-2,4-dinitrophenyl group IgG insolubilized polystyrene ball solid phase, 2,4 dinitrophenyl - biotinyl - bovine serum albumin - affinity purified anti-H
IV-1,p24Fab'、rp24抗原およびマウスモノクローナル抗HIV-1,p24Fab'−β-D- IV-1, p24Fab ', rp24 antigen and mouse monoclonal anti-HIV-1, p24Fab'-β-D-
ガラクトシダーゼからなる複合体を結合させた。 It was coupled complex consisting galactosidase. 続いて、同固相を2 mMのεN-2,4-ジニトロフェニル-L-リジン及び0.1 mol/Lの塩化ナトリウムを含む緩衝液A、1 Subsequently, Buffer A by the same solid phase containing sodium chloride 2 mM of εN-2,4- dinitrophenyl -L- lysine and 0.1 mol / L, 1
50μL中で、2分、4分及び6分間振とうインキュベーションさせた後に溶液と固相を分離し、固相上に残った複合体中のβ-D-ガラクトシダーゼの活性を10分間反応で測定した。 In 50 [mu] L, 2 minutes, a solution and a solid phase was separated out after 4 minutes and 6 minutes shaking incubation remained on the solid phase a beta-D-galactosidase activity in the complex was measured at 10 min reaction . そして、最初の固相に結合していた複合体中のβ−D−ガラクトシダーゼ活性と固相上に残った複合体のβ-D-ガラクトシダーゼ活性から、実施例2と同様、最初固相に結合していた複合体のうち溶液中に解離された複合体の割合を求めた。 The coupling from the first solid in the complex was bound to the phase beta-D-galactosidase activity and a solid remaining on the phase of the complex beta-D-galactosidase activity, as in Example 2, the first solid phase It was determined the ratio of dissociated complex solution of the complex that was. それぞれのインキュベーション時間における解離の割合(%)を実施例2の結果と合わせて図1に示す。 Ratio of dissociation at each incubation time (%) together with the results of Example 2 shown in FIG. 帯電性基を用いる本発明の方法(実施例2)では、DNP―DNP抗体を用いた系より解離速度が増加しており、1分間のインキュベーションで90%近くの複合体が固相から解離された。 In the method of the present invention using a charging group (Example 2), and the dissociation rate than a system using the DNP-DNP antibody is increased, the complex of nearly 90% in incubation for 1 minute is dissociated from the solid phase It was. 免疫複合体転移法での複合体の解離工程が極めて迅速かつ効率的に行えることを示すものである。 Dissociation step of a complex immune complex transfer method is intended to indicate that performed very quickly and efficiently.

【0041】実施例3 本実施例では、本発明による血清の影響を受けない免疫複合体の固相への捕捉および免疫複合体の固相からの迅速な溶出が、特定物質の測定の超高感度化に有効であることを示すために、免疫複合体を第一の固相に捕捉後、 [0041] EXAMPLE 3 In this example, rapid dissolution of the solid phase capture and immune complexes to the solid phase of the immune complex that is not affected by the serum according to the present invention, ultra-high measurement of a specific substance to indicate that it is effective for sensitivity, after capturing the immune complexes to the first solid phase,
該固相から解離させて第二の固相に捕捉して、免疫複合体中の標識を測定するまでの工程を続けて行った。 To capture the second solid phase is dissociated from the solid phase and so now the process until the label is measured in the immune complex. 実施に必要な材料の調製、実験手順等の詳細は、下記以外は先に記載した通りである。 Preparation of materials required for implementation, the details of such experimental procedures, except the following is as previously described. 〔アフィニティー精製ヤギ(抗ウサギIgG)IgG不溶化ポリスチレンチューブの調製〕公知の方法〔河野ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス(1988)、(前出)〕によりアフィニティー精製したヤギ(抗ウサギIgG)IgGを250μg含む溶液、5 mLを用いて、公知の方法〔石川および加藤、スカンジナヴィアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、 [Affinity purified goat (anti-rabbit IgG) Preparation of IgG insolubilized polystyrene tubes] known method [Kono et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (1988), supra] goat affinity purified by (anti-rabbit IgG ) solution of IgG containing 250 [mu] g, using a 5 mL, a known method [Ishikawa and Kato, Scandinavium Vian journal of Immunology,
(1978)、(前出)〕によりポリスチレンチューブ(25 (1978), polystyrene tubes (25 by (supra)]
×100 mm)の内面に不溶化して調製した。 × prepared insolubilized on the inner surface of 100 mm).

【0042】〔被検液中のHIV-1,p24抗原の測定〕0 [0042] Measurement of HIV-1, p24 antigen in a test fluid] 0
amolあるいは500 amolのrp24を用いて、ヒト血清5 Using rp24 of amol or 500 amol, human serum 5
0μLの存在する条件下で、実施例2と同様の操作により、2.0 mol/L 塩化ナトリウムを含む緩衝液A、100μL In existing conditions of 0MyuL, in the same manner as in Example 2, 2.0 mol / L buffer A containing sodium chloride, 100 [mu] L
を用いて免疫複合体をDEAEイオン交換樹脂から解離させる工程を2分間実施した。 Immune complexes were performed step 2 minutes to dissociate from the DEAE ion-exchange resin used. 続いて、溶出液100μLを塩化ナトリウムを含まない緩衝液A、500μLおよび非特異マウスIgG、100μg/5.4μLと混合した後、アフィニティー精製ヤギ(抗ウサギIgG)IgG不溶化ポリスチレンチューブに添加し、チュープを回転させることにより、反応液をチューブ内面の抗体結合面全体と20分間反応させた。 Subsequently, the eluate 100μL of sodium chloride free buffer A, 500 [mu] L and unspecific mouse IgG, was mixed with 100μg / 5.4μL, was added to affinity purified goat (anti-rabbit IgG) IgG insolubilized polystyrene tubes, the Chupu by rotating, the reaction solution was reacted entire antibody binding surface of the tube inner surface and 20 minutes. 反応後、ポリスチレンチューブの内面を緩衝液A、5 mLで2回洗浄した後、チューブの内面に結合したβ-D-ガラクトシダーゼの活性を200分間反応で測定した。 After the reaction, it was washed twice an inner surface of polystyrene tubes with buffer A, 5 mL, was measured bound beta-D-galactosidase activity to the inner surface of the tube at 200 min reaction. 結果を実施例1の結果と合せて、表2に示す。 Results together with the results of Example 1 are shown in Table 2. 反応効率の良い本発明の固定化方法を応用した免疫複合体転移法(本発明の他の態様)では、バックグラウンド蛍光が殆どゼロになる一方(560→2.2)、総信号量は約半分弱に維持されている(12400→49 The reaction efficient immobilization methods immune complex transfer method which applies the present invention in (another aspect of the present invention), while the background fluorescence is almost zero (560 → 2.2), the total signal amount of about It is maintained at slightly less than half (12400 → 49
20)。 20). もともと夾雑物質存在下でも高い感度を提供できる免疫複合体転移法の特徴が総信号量の増加により更に十分に発揮されている(感度106倍向上)。 Features of the original immune complex transfer method that can provide high sensitivity even in the presence of contaminants is more fully exerted by the increase in total signal amount (sensitivity 106 times increase).

【0043】 [0043]

【表2】 [Table 2]

【0044】 [0044]

【発明の効果】上記実施例1〜3および比較例1、2によって、以下の3点が確認できた。 The above Examples 1-3 and Comparative Examples 1 and 2 according to the present invention, could be three points Verifying. (1)本願発明法における血清検体中での反応効率の向上効果 被検液中の測定すべき物質を含む複合体を固相上に形成させた後に、該固相上で複合体量を測定する方法において、本発明法を用いると、血清成分のような夾雑物質が大量に存在する条件下でも、従来技術のように非存在下条件に対して反応効率を減じることなく、反応用液中の測定すべき物質を含む複合体を非存在下条件と同様の効率で固相に捕捉でき、特異的信号量が増大することが確認された。 (1) after forming the solid phase complexes comprising the substance to be determined improvement the test fluid of the reaction efficiency in serum sample in the present invention method, complex determined amount on the solid phase a method of, using the present invention method, even under conditions in which contaminants, such as serum components present in large amounts, without reducing the reaction efficiency with respect to the absence conditions as in the prior art, reaction solution of the complex can be captured on a solid phase as efficiently as the absence conditions, including the substance to be determined, specific amount of signal is confirmed to be increased. (2)免疫複合体転移測定法における免疫複合体の第一固相からの解離速度向上効果 免疫複合体転移測定法において本発明法を用いると、上記(1)の効果に加えて、第一固相に捕捉された免疫複合体の解離の速度が、従来技術に比べて顕著に向上し、 (2) With the present invention method in the dissociation rate improving effect immune complex transfer assay from the first solid phase of immune complexes in the immune complex transfer assay, in addition to the effect of (1), first rate of dissociation of the trapped solid phase immune complexes, significantly improved compared to the prior art,
それゆえ免疫複合体転移測定法全体における反応時間を短縮できることが確認された。 It was confirmed that the reaction time can be shortened in the entire therefore immune complex transfer assay. (3)免疫複合体転移測定法における迅速な超高感度測定効果 免疫複合体転移測定法において本発明法を用いると、血清成分の干渉を受けずに且つ迅速な反応条件で、免疫複合体転移測定法の最大の特徴である超高感度測定が可能であることが確認された。 (3) With the present invention method in the rapid ultrasensitive measurements effectively immune complex transfer assay in the immune complex transfer assay, with and rapid reaction conditions without interference of serum components, immune complex transfer it is possible ultrasensitive measurements was confirmed that the greatest feature of the measurement method.

【0045】 [0045]

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】固相上に形成された、HIV−1,p24抗原を含む免疫複合体を固相から解離させる反応において、 [1] it is formed on the solid phase, in a reaction to dissociate from the solid phase immune complexes containing HIV-1, p24 antigen,
本発明技術と従来技術それぞれの反応時間と解離率の関係を示す図である。 It is a diagram showing the relationship of the present technique and the prior art each reaction time and the dissociation rate.

Claims (14)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】測定すべき物質(測定対象物質)及びそれと特異的に結合する物質(特異的結合物質)から得られる複合体を不溶性の担体に捕捉し固定化する方法であって、下記工程(A)または(A')を含むことを特徴とする、測定対象物質の固定化方法。 1. A substance to be (target substance) and composites derived therefrom substance specifically binding to (specific binding substance) and a method for immobilizing capture the insoluble carrier measurements, the following steps (a) or comprising the (a '), method of immobilizing the target substance. (A):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)と測定対象物質から、正または負に荷電した複合体(帯電複合体)を形成させ、これを固定化反応溶液中で、負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に捕捉する工程。 (A): a positive or negative analyte chargeable groups introduced specific binding substance (charging specific binding agent), positively or negatively charged complexes (charge complex) to form a, this in immobilization reaction solution, the process of capturing the carrier (charging solid phase) of negatively or positively charged insoluble. (A'):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)を負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に結合させ、これに固定化反応溶液中で、測定対象物質を捕捉する工程。 (A '): positive or negative chargeable groups introduced specific binding substances (charged specific binding substance) negatively or positively charged insoluble carrier (charging solid phase) to be bound, immobilized reaction thereto in a solution, the step of capturing the analyte.
  2. 【請求項2】特異的結合物質が、抗原、抗体または核酸プローブである請求項1の固定化方法。 2. A specific binding substances, antigens, immobilization method according to claim 1 which is an antibody or nucleic acid probe.
  3. 【請求項3】帯電特異的結合物質が、強塩基性(pKb 3. A charged specific binding substances, strongly basic (pKb
    が9以上)または強酸性(pKaが4以下)である請求項1または2の固定化方法。 There 9 or higher) or strongly acidic (claim 1 or 2 immobilization method having a pKa of 4 or less).
  4. 【請求項4】帯電固相が、強塩基性(pKbが9以上) 4. A charged solid phase, strongly basic (pKb 9 or more)
    または強酸性(pKaが4以下)である請求項1〜3の固定化方法。 Or immobilization method of claims 1 to 3 acidic (pKa of 4 or less).
  5. 【請求項5】特異的結合物質が有する正または負の荷電を示す帯電性基が、スルホン酸基であり、帯電固相が、 5. The chargeable groups exhibiting a positive or negative charge specific binding substance has is a sulfonic acid group, charged solid phase,
    DEAE(ジエチルアミノエチル)基を有し、固定化反応溶液がpH6〜8、イオン強度0.2〜0.8である請求項1〜4の固定化方法。 DEAE has a (diethylaminoethyl) group, the immobilization reaction solution pH 6-8, the immobilization method of claims 1 to 4 the ionic strength 0.2 to 0.8.
  6. 【請求項6】請求項1〜5の固定化方法にて捕捉された帯電複合体を当該複合体に導入された標識により測定する測定対象物質の測定方法。 6. A method of measuring the measurement target substance trapped charged complexes at a fixed method of claims 1 to 5 by means of a label introduced into the complex.
  7. 【請求項7】測定対象物質と特異的結合物質を含む複合体を少なくとも一回、不溶性の担体上に形成および解離させる工程を含む測定方法であって、下記工程(A)と(B)、または(A')と(B)を含むことを特徴とする測定対象物質の測定方法。 7. analyte and specific binding agent at least once a complex comprising a, there is provided a measuring method comprising the step of formation and dissociation on insoluble carrier, the following steps and (A) (B), or (a ') and the measurement method of the analyte, characterized in that it comprises a (B). (A):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)と測定対象物質から、正または負に荷電した複合体(帯電複合体)を形成させ、これを固定化反応溶液中で、負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に捕捉する工程。 (A): a positive or negative analyte chargeable groups introduced specific binding substance (charging specific binding agent), positively or negatively charged complexes (charge complex) to form a, this in immobilization reaction solution, the process of capturing the carrier (charging solid phase) of negatively or positively charged insoluble. (A'):正または負の帯電性基を導入した特異的結合物質(帯電特異的結合物質)を負または正に荷電した不溶性の担体(帯電固相)に結合させ、これに固定化反応溶液中で、測定対象物質を捕捉する工程。 (A '): positive or negative chargeable groups introduced specific binding substances (charged specific binding substance) negatively or positively charged insoluble carrier (charging solid phase) to be bound, immobilized reaction thereto in a solution, the step of capturing the analyte. (B):工程(A)または工程(A')の後、帯電固相から帯電複合体を解離させる工程。 (B): Step (A) or after steps (A '), dissociating the charged complex from charging the solid phase.
  8. 【請求項8】イオン強度が0.5〜3の電解質溶液(解離反応溶液)中で帯電複合体を帯電固相から解離させる工程(B)を含むことを特徴とする請求項7記載の測定方法。 8. Measurement of claim 7, wherein the ionic strength is characterized in that it comprises 0.5 to 3 of the electrolyte solution step of dissociating the charged complexes (dissociation reaction solution) in the charging the solid phase (B) Method.
  9. 【請求項9】解離反応溶液が1.0〜2.0mol/Lの塩化ナトリウム溶液である請求項8記載の測定方法。 9. A measuring method according to claim 8, wherein the dissociation reaction solution is sodium chloride solution 1.0~2.0mol / L.
  10. 【請求項10】解離された帯電複合体を当該複合体に導入された標識により測定する請求項7記載の測定方法。 10. A measuring method according to claim 7, wherein the dissociated charged complexes by means of a label introduced into the complex.
  11. 【請求項11】工程(B)の後、帯電複合体を別の固相に再結合させる工程(C)を含む請求項7記載の測定方法。 11. After the step (B), measurement method of claim 7, including a step (C) for recombining charge complex to another solid phase.
  12. 【請求項12】別の固相が帯電固相である請求項11記載の測定方法。 12. Another solid phase is charged solid phase according to claim 11 measuring method according.
  13. 【請求項13】請求項1〜5記載の固定化方法または6 13. A fixing method of claims 1 to 5, wherein or 6
    〜12記載の測定方法を行うための帯電特異的結合物質または間接的帯電特異的結合物質を含む試薬。 Reagents containing charged specific binding agent or indirectly charged specific binding agent for performing the method of measuring 12 wherein.
  14. 【請求項14】請求項6〜12記載の測定を行うための測定キット。 14. a measuring kit for the measurement of claims 6-12, wherein.
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