JP2004141064A

JP2004141064A - Method for preserving cell and apparatus therefor

Info

Publication number: JP2004141064A
Application number: JP2002309700A
Authority: JP
Inventors: Yuka Agatahama; 阿潟浜　由香; Norihiko Hata; 幡多　徳彦; Masahiro Kinooka; 紀ノ岡　正博; Masahito Taya; 田谷　正仁
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Current assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Priority date: 2002-10-24
Filing date: 2002-10-24
Publication date: 2004-05-20
Anticipated expiration: 2022-10-24
Also published as: JP4230750B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To preserve cells while preventing cell damage. <P>SOLUTION: When mediums are changed, whether the used medium is replaced with the medium having the same glucose concentration as that of the used medium or the medium having glucose concentration different from that of the used medium is determined on the basis of the rotational speed of the cell aggregate until 13 days from the start of the culture. The medium is replaced with an ordinary medium on the 13rd day of the culture. Then ordinary cell culture is carried out. During the period to the 13rd day of the culture, when mediums are changed while selecting the glucose concentration so that the rotational speed of the cell aggregate is in the range of 50-100 deg/h, the rotational speed is generally in the range. When the rotational speed of the cell aggregate is in the range, cell growth ability is sufficiently slowed down while keeping cell activity. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養し、培養した細胞を治療のために患者に移植するとか医薬品等の毒性試験に利用するといったように、細胞培養技術が種々の領域で利用されるようになってきている。この細胞培養技術の分野では、細胞を培養して組織を構築するという組織生産について日程調整する必要があり、その日程調整を行う際に細胞を保存する必要が生じることがある。例えば、患者への移植について言えば、移植日程から逆算して組織生産を開始する時期を求め、その組織生産開始時期まで細胞の性能が変化しない状態でその細胞を保存しておくことが望ましい。通常、細胞の保存方法としては低温保存（特許文献１参照）や凍結保存（特許文献２又は３参照）が一般的に知られている。
【０００３】
【特許文献１】
特表平５−５０３９３０
【特許文献２】
特表平５−５００８００
【特許文献３】
特表平５−５０７７１５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの方法では温度変化による細胞ダメージを防ぐことが困難であった。このため、このような細胞ダメージを防止しつつ細胞を保存する方法の開発が望まれていたが、これまでのところ開発に至っていない。
【０００５】
本発明は、上述した問題点に鑑みなされたものであり、細胞ダメージを防止しつつ細胞を保存することができる細胞保存方法及びその装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発明の効果】
上述した目的を解決するため、本発明の第１は、細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存方法であって、
細胞保存液に細胞を浸漬させる浸漬工程と、
前記細胞保存液に浸漬中の細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定する回転速度測定工程と、
前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える保存液切換工程と
を含むものである。
【０００７】
この細胞保存方法では、細胞保存液中の細胞集合体の回転速度に基づいて細胞保存液の種類を切り換えていく。細胞集合体の回転速度は細胞増殖能に密接に関連するパラメータであるため、この細胞集合体の回転速度に基づいて例えば細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるように細胞保存液の種類を切り換えていくことができる。したがって、この細胞保存方法によれば、細胞ダメージを防止しつつ細胞を保存することができる。
【０００８】
ここで、「細胞保存液の種類を切り換える」とは、例えば、今まで使用していた細胞保存液とは異なる成分を含む細胞保存液に切り換えたり、今まで使用していた細胞保存液にも含まれていた成分であるがその成分の濃度が異なる細胞保存液に切り換えたりすることをいう。また、「細胞」は、どのような細胞であっても適用可能であるが、接着依存性細胞であることが好ましい。「接着依存性細胞」とは、まず培養容器の所定の面に直接接着するか又は細胞外マトリックスを介して間接的に接着し、次いでその接着面積が広がっていき、その後細胞分裂する細胞のことをいう。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【０００９】
本発明の細胞保存方法において、前記回転速度測定工程では、複数の細胞集合体の回転速度を測定し、前記評価工程では、前記複数の細胞集合体の回転速度の平均値に基づいて前記細胞培養液が細胞に与える影響を評価してもよい。こうすれば、１つの細胞集合体の回転速度を測定して細胞培養液を評価する場合に比べて、より適正な評価を下すことができる。
【００１０】
本発明の細胞保存方法において、前記回転速度測定工程では、前記細胞集合体を構成する２つの細胞の重心を結んだ直線が時間当りに回転した角度を前記細胞集合体の回転速度としてもよい。こうすれば、細胞集合体の回転速度を比較的簡単に求めることができる。
【００１１】
本発明の細胞保存方法において、前記浸漬工程では、細胞のエネルギ源を含有する前記細胞保存液に細胞を浸漬し、前記保存液切換工程では、前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記エネルギ源の濃度または量の異なる細胞保存液に切り換えてもよい。こうすれば、例えば、細胞増殖能に密接に関連するパラメータである細胞集合体の回転速度により細胞増殖能が低下傾向にあると判断されるときにはエネルギ源の濃度が高い細胞保存液に切り換えて細胞増殖能の低下を防止したり、細胞増殖能が上昇傾向にあると判断されるときにはエネルギ源の濃度が低い細胞保存液に切り換えて細胞増殖能を抑制したりすることにより適切に細胞を保存することができる。ここで、エネルギ源としては、例えばグルコースなどの糖質や、アミノ酸などが挙げられる。
【００１２】
本発明の細胞保存方法において、前記保存液切換工程では、細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるという回転速度域に前記細胞集合体の回転速度が入るように前記細胞保存液の種類を切り換えてもよい。このような回転速度域は、前記細胞保存液での細胞増殖能とその後通常培地に切り換えたあとの細胞増殖能とを測定することにより経験的に定めてもよい。例えば、細胞増殖能を比増殖速度又は倍加時間として求め、細胞保存液での比増殖速度が小さく（つまり倍加時間が長く）、その後通常培地に切り換えたあとの比増殖速度が大きい（つまり倍加時間が短い）という条件を満たす回転速度域としてもよい。このような回転速度域は、４０〜１２０ｄｅｇ／ｈに設定するのが好ましく、５０〜１００ｄｅｇ／ｈに設定するのが特に好ましい。回転速度が５０ｄｅｇ／ｈ特に４０ｄｅｇ／ｈを下回ると細胞増殖能が鈍化するものの細胞活性を維持しにくくなる傾向にあるため好ましくなく、１００ｄｅｇ／ｈ特に１２０ｄｅｇ／ｈを上回ると細胞増殖能が十分鈍化しなくなる傾向にあるため好ましくない。
【００１３】
本発明の第２は、細胞保存液に細胞を浸漬することにより該細胞を保存する細胞保存装置であって、
前記細胞保存液に浸漬している細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定する回転速度測定手段と、
前記細胞集合体の回転速度に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか又は前記細胞保存液の種類の切換を行う対応手段と
を備えたものである。
【００１４】
この細胞保存装置では、細胞保存液中の細胞集合体の回転速度に基づいて細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか細胞保存液の種類の切換を自動的に行う。細胞集合体の回転速度は細胞増殖能に密接に関連するパラメータであるため、この細胞集合体の回転速度に基づいて例えば細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるように細胞保存液の種類を切り換える旨を報知し（この場合、その報知を受けたオペレータが細胞保存液の種類の切換を行う）、又は細胞保存液の種類を自動的に切り換えていく。したがって、この細胞保存方法によれば、細胞へのダメージを防止しつつ細胞を保存することができる。
【００１５】
この細胞保存装置において、前記細胞保存液に浸漬している細胞を撮影する撮影手段と、前記撮影手段により撮影された画像から隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体を抽出する抽出手段とを備え、前記回転速度測定手段は、前記抽出手段により抽出された前記細胞集合体の回転速度を求めてもよい。こうすれば、撮影された画像を解析することにより細胞集合体の回転速度を比較的容易に求めることができる。
【００１６】
この細胞保存装置において、前記回転速度測定手段は、細胞のエネルギ源を含有する前記細胞保存液に浸漬している細胞のうち隣接した２つの細胞で構成される細胞集合体の回転速度を測定し、前記対応手段は、前記細胞集合体の回転速度に基づいて決定される前記エネルギ源の濃度を持つ細胞保存液に切り換える旨を報知するか又は自動的に切換を行ってもよい。対応手段が細胞を保存するのに適したエネルギ源の濃度または量の細胞保存液に切り換える旨を報知する場合には、オペレータがその報知にしたがって細胞保存液を切り換えることにより適切に細胞を保存でき、また、対応手段が細胞を保存するのに適したエネルギ源の濃度または量の細胞保存液に自動的に切り換える場合には、オペレータが細胞保存液の切換操作を行うことなく適切に細胞を保存できる。
【００１７】
本発明の細胞保存装置において、前記回転速度測定手段は、複数の細胞集合体の回転速度を測定し、前記対応手段は、前記複数の細胞集合体の回転速度の平均値に基づいて前記細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか又は前記細胞保存液の種類の切換を行ってもよい。また、前記回転速度測定手段は、前記細胞集合体を構成する２つの細胞の重心を結んだ直線が時間当りに回転する角度を前記細胞集合体の回転速度としてもよい。更に、対応手段は、細胞活性を維持しつつ細胞増殖能を鈍化させるという回転速度域に前記細胞集合体の回転速度が入るように前記細胞保存液の種類を切り換える旨を報知するか又は前記細胞保存液の種類の切換を行ってもよい。このような回転速度域は、前記培養液での細胞増殖能とその後通常培地に切り替えたあとの細胞増殖能とを測定することにより経験的に定めてもよく、例えば４０〜１２０ｄｅｇ／ｈ、好ましくは５０〜１００ｄｅｇ／ｈに設定してもよい。
【００１８】
【実施例】
１．使用培地
本実施例で使用した培地（細胞保存液）について説明する。グルコース濃度０ｍｏｌ／ｍ^３の培地としては、グルコースを添加していないグルコースフリー無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２特注培地、クラボウ社製）を用いた。また、グルコース濃度が６．０×１０^−３、６．０×１０^−２ｍｏｌ／ｍ^３の無血清培地としては、グルコースフリー無血清培地とグルコース濃度が３×１０^３ｍｏｌ／ｍ^３の溶液とを用いて濃度調整を行い作製した。更に、通常培地としては、無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２、クラボウ社製）を使用した。この通常培地のグルコース濃度は６．０ｍｏｌ／ｍ^３である。なお、便宜上、各培地を下記表１のように培地Ａ〜Ｄと称する。
【００１９】
【表１】

【００２０】
２．細胞観察装置
図１は細胞観察装置１０の概略構成を表す説明図である。この細胞観察装置１０は、後述する細胞濃度Ｘや細胞集合体の回転速度ωなどを算出するのに用いる装置であり、Ｔ型フラスコ２０を支持する支持台１１と、Ｔ型フラスコ２０を照らし出すＬＥＤランプ１３と、Ｔ型フラスコ２０の底面を撮影するＣＣＤカメラ１５と、これらを内包し所定温度を維持するインキュベータ１７と、ＣＣＤカメラ１５によって撮影した画像を解析する制御装置１９とを備えている。
【００２１】
支持台１１は、培地で培養された接着依存性細胞（以下単に細胞という）が底面に接着しているＴ型フラスコ２０を、その底面が下方に視覚的に露出した状態で支持している。即ち、支持台１１は、Ｔ型フラスコ２０の底面縁部のみを支持したり、Ｔ型フラスコ２０の底面部分に相当する箇所を透明部材としたりすることで、ＣＣＤカメラ１５による撮影が妨げられないように構成されている。ＬＥＤランプ１３は、支持台１１に支持されたＴ型フラスコ２０を上方から照らすことによりＴ型フラスコ２０内の個々の細胞をＴ型フラスコ２０の底面に投影させる。ＣＣＤカメラ１５は、Ｔ型フラスコ２０の底面を撮影できるようにＴ型フラスコ２０の下方に設置されている。このＣＣＤカメラ１５は、制御装置１９からの指令信号を受信すると、ＬＥＤランプ１３によって上方から照らされたＴ型フラスコ２０の下方から底面を撮影し、Ｔ型フラスコ２０内の個々の細胞がＴ型フラスコ２０の底面に投影された投影画像を得、その投影画像のデータを制御装置１９に送信する。また、ＣＣＤカメラ１５は、三次元ステージ１６に取り付けられ、上下・左右・前後に移動可能である。この三次元ステージ１６は制御装置１９からの指令信号によって作動して所定の位置にＣＣＤカメラ１５を位置決めする。インキュベータ１７は、支持台１１とＬＥＤランプ１３とＣＣＤカメラ１５とを内包した温度調節が可能なケースであり、５％ＣＯ_２含有エアを支持台１１に支持されているＴ型フラスコ２０に供給するラインとＴ型フラスコ２０からガスを排出するラインとを備えている。制御装置１９は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等で構成されている。この制御装置１９は、三次元ステージ１６に指令信号を出力してＣＣＤカメラ１５を所定の位置に位置決めしたあと、ＣＣＤカメラ１５に指令信号を出力して投影画像を撮影させ、その投影画像をＣＣＤカメラ１５から入力して画像解析処理を施し、画像解析処理後の投影画像に基づいて後述する細胞濃度Ｘや細胞集合体の回転速度ωや比増殖速度μを算出する。
【００２２】
３．グルコース濃度制限下及び通常培地切換後の増殖
３−１．Ｔ型フラスコへの細胞接種
細胞としてヒト乳腺上皮由来テロメアーゼ不死化細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１）を使用し、７５ｃｍ^２Ｔ型フラスコ中で通常培地である培地Ｄで培養し、コンフルエントに達した後フラスコ内部をリン酸緩衝溶液で２回洗浄後、トリプシン溶液を２ｍｌ滴下した。インキュベータ内で３７℃のもと、５分間インキュベートした後、細胞をフラスコ底面から剥離した。続いてトリプシンの作用を停止させるため、得られた細胞懸濁液に０．１％トリプシンインヒビターを２ｍｌ添加した。この細胞懸濁液を遠沈管に移し、室温にて１０００ｒｐｍで８分間遠心分離を行い、各酵素を除去した。これをグルコースフリー無血清培地（培地Ａ）で懸濁した。その後、トレパンブルー染色法により、この細胞懸濁液中の細胞を血球計算盤上に滴下し、顕微鏡観察下で細胞をカウントした。そして、細胞濃度が０．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように２５ｃｍ^２のＴ型フラスコに接種した。このとき、細胞懸濁液の接種量と培地Ａの培地量とが１０ｍｌとなるようにした。また、培地Ｂ〜Ｄについても同様にして同濃度の細胞懸濁液を含むＴ型フラスコを調製した。
【００２３】
３−２．細胞増殖
各Ｔ型フラスコを細胞観察装置１０のインキュベータ１７内で培養した。インキュベータ１７内のＴ型フラスコは、ＣＯ_２濃度５％の加湿空気で満たした状態とした。また、接種後３日目、５日目に新たに同じグルコース濃度の培地に交換し、接種後７日目に通常培地である培地Ｄに切り換え、その後９日目、１２日目に新たな通常培地（培地Ｄ）に交換した。なお、培地Ｄについては７日目までで培養を中止した。これらのＴ型フラスコでの培養において、接種後毎日、フラスコ底面の状態を細胞観察装置１０のＣＣＤカメラ１５を用いて画像撮影を行い、各フラスコごとに投影面積Ｓに占める細胞数ｎをカウントして細胞濃度（＝ｎ／Ｓ）を求めた。具体的には、１つのフラスコにつき３箇所で画像撮影を行い、その３箇所の細胞濃度の平均値をそのときの細胞濃度Ｘとした。このときの培養時間（日数）と細胞濃度Ｘとの関係を図２に示す。図２から明らかなように、グルコース濃度が低い培地Ａ〜Ｃで培養した場合には通常培地である培地Ｄで培養した場合に比べて細胞増殖能は鈍化したが、接種後７日目に通常培地（培地Ｄ）に切り換えたあとは良好な細胞増殖能を示した。このことから、グルコース濃度の低い培地に細胞を浸漬することにより細胞増殖能を鈍化させた状態で細胞を保存しておき、その後通常培地に切り換えることにより通常と同等の増殖能をもって細胞を増殖させることが可能なことが明らかになった。
【００２４】
４．グルコース濃度制限下における細胞の挙動
４−１．概要
細胞観察装置１０を用いて各培地で培養している個々の細胞を経時的に観察し、細胞を撮影した画像のうち２つの細胞が隣接した細胞集合体のみを抽出し、細胞集合体をなす両細胞の重心位置を結んだ直線が経時に伴い回転する角度を算出し、１時間あたりの回転角度を回転速度（ｄｅｇ／ｈ）として求め、使用培地のグルコース濃度と比増殖速度と細胞集合体の回転速度との関係を調べた。
【００２５】
４−２．画像撮影
上述した３−１と同様にして、各培地Ａ〜Ｃを用いてヒト乳腺上皮由来テロメアーゼ不死化細胞を細胞濃度が０．３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように２５ｃｍ^２のＴ型フラスコに接種し、培養した。培養日数は５日、７日、１３日、１９日とした。培養日数がＮ日（Ｎ＝５，７，１３，１９）のものは、常温でＮ日目までグルコース濃度制限培地である培地Ａ〜Ｃで培養し、培地交換を２日又は３日ごとに行い、Ｎ日目に通常培地である培地Ｄに切り換え、その培地切換の前２日間で１５分ごとに画像撮影を行い、また、培地切換の直後に１５分ごとに画像撮影を行った。
【００２６】
４−３．画像処理
細胞観察装置１０の制御装置１９は、Ｔ型フラスコ２０の底面の投影画像を２値化したあとクロージング処理やフィリングホール処理を施すことにより個々の細胞像を明確化した。ここで、２値化とは、ある閾値以下のグレイレベル値をもつピクセルを値１に設定しそれ以外のピクセルを値０に設定して画像を白と黒の２つの領域に区画分離する処理である。本実施例では、閾値として、ピクセルのグレイレベル値を横軸、ピクセル数を縦軸とするヒストグラムを作成し、ピクセル数のピークにおけるグレイレベル値を採用した（図３参照）。また、細胞及び細胞境界近辺ではグレイレベル値が局所的に変化して分散が大きいことに着目し、ピクセルのグレイレベル値の分散ヒストグラムを作成し（図４参照）、この分散ヒストグラムを分散が大きい領域と小さい領域に分け、分散が大きい領域つまり図４のａより右側の領域を細胞及び細胞境界近辺とみなし、この領域を上述した閾値を用いて２値化した。２値化後、最も大きな黒色体を細胞とみなし、その黒色体についてクロージング処理により小さな穴を埋めて境界の平滑化を行い、更にフィリングホール処理により孤立した穴を埋めることにより細胞像とした。
【００２７】
４−４．回転速度の測定
時刻ｔ１に得られた投影画像を画像処理した２値化画像から、図５に示すように２つの細胞像が隣接した細胞集合体のみを抽出し、細胞集合体をなす両細胞の重心位置を求め、両細胞の重心同士を直線で結び、これを時刻ｔ１における直線とした。その後、所定時間Δｔが経過した時刻ｔ２に得られた投影画像を画像処理した２値化画像から、先ほどと同じ細胞集合体について両細胞の重心同士を直線で結び、これを時刻ｔ２における直線とした。そして、時刻ｔ１における直線から時刻ｔ２における直線までの回転角度Δθを求め、その細胞集合体の回転速度Δθ／Δｔを求めた。なお、実際には投影画像中に含まれる複数の細胞集合体について個々の回転速度Δθ／Δｔを求め、それらの平均値を細胞集合体の回転速度ω［ｄｅｇ／ｈ］とした。また、Δｔは１時間とした。
【００２８】
４−５．比増殖速度
比増殖速度μは、下記数１により求めた。下記数１で、Ｘ（ｔ２）は時刻ｔ２における細胞濃度であり、Ｘ（ｔ１）は時刻ｔ１における細胞濃度あり、Δｔは時刻ｔ２と時刻ｔ１との時間間隔（本実施例では２日間）である。
【００２９】
【数１】

【００３０】
４−６．細胞の挙動
図６は、細胞集合体の回転速度ωとグルコース濃度制限下の比増殖速度μとグルコース濃度制限を解除して通常培養したとき（再増殖時ともいう）の比増殖速度μ’との関係を表すグラフである。図６のグラフにおいて、培養日数Ｎ日目（Ｎ＝５，７，１３，１９）のデータは、常温でＮ日目までグルコース濃度制限培地である培地Ａ〜Ｃで培養し、Ｎ日目に通常培地である培地Ｄに切り換え、その培地切換の直前に回転速度ωと比増殖速度μとを測定してそれをプロットし、培地切換の直後に比増殖速度μ’を測定して切換直前の回転速度ωと比増殖速度μ’をプロットしたものである。この図６から明らかなように、グルコース濃度制限下の比増殖速度μはいずれも通算培養日数が長いほどあるいは回転速度が小さいほど低くなる傾向にあった。また、細胞集合体の回転速度ωが図６に示した網掛け範囲（回転速度ωが５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲）に入るときには、グルコース濃度制限下では比増殖速度μが低く抑えられ細胞増殖能が鈍化している状態であるが、再増殖時には比増殖速度μ’が高く当初から通常培地で培養したときと同等の細胞増殖能を発揮することがわかった。
【００３１】
具体的には、グルコース濃度制限下での培養期間中つまり保存期間中を通して細胞集合体の回転速度ωが５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲に入るときには、その培養条件は細胞保存に適していると評価し、このときに用いた培地は細胞保存に適していると評価する。一方、細胞集合体の回転速度ωが５０ｄｅｇ／ｈ未満になったときには、その培養条件は細胞活性が十分維持されないため細胞保存に適さないと評価し、このときに用いた培地も細胞保存に適さないと評価する。また、細胞集合体の回転速度ωが１００ｄｅｇ／ｈを越えるときには、その培養条件は細胞増殖能を十分に鈍化させることはできないものの細胞活性は十分維持されると評価する。但し、回転速度ωが培養工程初期に１００ｄｅｇ／ｈを越えたとしても、その後５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲に入るときには、その培養工程初期にある程度細胞が増殖するものの、増殖後暫くするとその状態で維持されることになる。したがって、そのような保存の仕方が好ましい場合には、その培養条件も細胞を保存する条件として採用し得る。
【００３２】
５．細胞保存方法
５−１．培養開始前の操作
上述した３−１と同様にしてヒト乳腺上皮由来テロメアーゼ不死化細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１）を使用して細胞懸濁液を調製し、Ｔ型フラスコ内にこの細胞懸濁液とグルコース濃度が６．０×１０^−３ｍｏｌ／ｍ^３である培地Ｂとを用いて全体が１０ｍｌで細胞濃度が０．３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように調製したあと、細胞観察装置１０のインキュベータ１７内で培養した。インキュベータ１７内のＴ型フラスコ２０は、ＣＯ_２濃度５％の加湿空気で満たした状態とし、培養を開始した。
【００３３】
５−２　培養開始後の操作
１回目の培地交換は培養開始後１日目に行い、１回目の培地交換における細胞集合体の回転速度は培養開始後２日目に測定し、２回目の培地交換は培養開始後３日目に行い、２回目の培地交換における細胞集合体の回転速度は培養開始後４日目に測定し、その後同様にして培地交換の回数を重ねていった。つまり、ｎ回目（ｎ＝１，２，…，６）の培地交換は培養開始後（２ｎ−１）日目に行い、ｎ回目の培地交換における細胞集合体の回転速度は培養開始後２ｎ日目に測定した。そして、７回目の培地交換のとき（１３日目）に通常培地である培地Ｄに切り換え、その後、培養開始後１６日目に通常培地（培地Ｄ）で交換し、１８日目まで観察した。なお、通常培地に切り換えたあとは細胞集合体の回転速度を測定しなかった。
【００３４】
また、培地交換を行うとき、それまでと同じグルコース濃度の培地に交換するのか、それともそれまでと異なるグルコース濃度の培地に交換するのかは、細胞集合体の回転速度が５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲に収まるように決定した。具体的には、培地交換するに当たって、前回の細胞集合体の回転速度から前々回の細胞集合体の回転速度を減じた値Δωが負（Δω＜０）のときには、前回と比べて１０倍のグルコース濃度を持つ培地に切り換え、Δωがほぼゼロ（Δω≒０）のときには、前回と比べて５倍のグルコース濃度を持つ培地に切り換え、Δωが正（Δω＞０）のときには、前回と同じグルコース濃度を持つ培地に切り換えた。これをまとめると下記表２のとおりである。
【００３５】
【表２】

【００３６】
５−３．結果
以上のようにして培養１３日目まではグルコース濃度を制限した培地中で細胞を保存し、その後通常培地（培地Ｄ）でその細胞を培養したときの結果を図７のグラフに示す。なお、図７の培養日数を横軸、細胞濃度Ｘを縦軸とするグラフにおける黒丸に付されたアルファベットａ〜ｅは、それぞれグルコース濃度が６．０×１０^−３，６．０×１０^−２，６．０×１０^−１，３．０，６．０［ｍｏｌ／ｍ^３］の培地を使用したことを示す。図７から明らかなように、培養１３日目までは表２のように細胞集合体の回転速度ωに基づいて算出したグルコース濃度を持つ培地に交換することにより、細胞集合体の回転速度ωは概ね５０〜１００ｄｅｇ／ｈの範囲内に収まった。また、通常培地（培地Ｄ）に切り換えたあとは良好に細胞数が増加していった。このように細胞集合体の回転速度が５０〜１００ｄｅｇ／ｈに収まるようにグルコース濃度を選択することにより、細胞の活性を維持した状態で細胞増殖を鈍化させて良好に細胞を保存できること、換言すれば、細胞へのダメージを防止しつつ細胞を保存できることがわかった。
【００３７】
６．細胞保存装置
図８は細胞保存培養装置３０の概略説明図である。この細胞保存培養装置３０は、細胞観察装置１０に、グルコースフリー無血清培地（培地Ａ）を蓄えた第１タンク４１と、グルコース濃度が３×１０^３ｍｏｌ／ｍ^３の溶液を蓄えた第２タンク４２と、第１タンク４１内に蓄えられた液体が第１電磁弁４１ａを介して投入されると共に第２タンク４２内に蓄えられた液体が第２電磁弁４２ａを介して投入される濃度調整タンク４３と、濃度調整タンク４３からＴ型フラスコ２０へ培地供給ライン４４ａを介して培地を供給する培地供給ポンプ４４と、Ｔ型フラスコ２０内の培地を培地排出ライン４５ａを介して排出する培地排出ポンプ４５とを付加したものである。
【００３８】
次に、細胞保存培養装置３０を用いて細胞を保存したあと通常通り培養して増殖させるときの操作を説明する。ここでは、上述した５−２と同様の操作を細胞保存培養装置３０に実行させる場合を例に挙げて説明する。オペレータは、まず、上述した５−１と同様にして培養開始前の準備を行ったあと、インキュベータ１７内で培養を開始すると共に、制御装置１９に培養を開始した旨を入力する。すると、制御装置１９は、所定タイミングごと（例えば数分ごと）に保存培養プログラムを読み出して実行する。図９は保存培養プログラムのフローチャートである。このプログラムが開始されると、まず、予め定められた培地交換時期になったか否かを判定する（ステップＳ１００）。ここでは、培地交換時期は、上述した５−２と同様、培養開始後１，３，５，７，９，１１日目と定められており、培養を開始した旨の入力があったときに計時をスタートする内蔵タイマのカウント数によって判定される。ステップＳ１００で培地交換時期になったと判定されたときには今回の培地交換時期が初回又は２回目であるか、それとも３回目以降であるかを判定する（ステップＳ１１０）。そして、ステップＳ１１０で培地交換時期が初回又は２回目のときには、前々回と前回の細胞集合体の回転速度ωが未測定のため、グルコース濃度を当初と同じ値に決定する（ステップＳ１２０）。一方、ステップＳ１１０で培地交換時期が３回目以降のときには、前々回と前回の細胞集合体の回転速度ωが測定され記憶されているため、前回の回転速度ωから前々回の回転速度ωを減算した値Δωを算出し（ステップＳ１３０）、このΔωを表２に照らして今回のグルコース濃度を決定する（ステップＳ１４０）。この表２は制御装置１９の図示しないＨＤＤに記憶されている。そして、ステップＳ１２０又はステップＳ１４０でグルコース濃度を決定したあと、第１電磁弁４１ａ及び第２電磁弁４２ａを開閉制御して第１タンク４１及び第２タンク４２からそれぞれ所望量の培地を濃度調整タンク４３に流入させることにより、所望のグルコース濃度の培地を作製する（ステップＳ１５０）。続いて、培地排出ポンプ４５を駆動してＴ型フラスコ２０から今まで使用していた培地を培地排出ライン４５ａを介して排出する（ステップＳ１６０）。排出終了後、今度は培地供給ポンプ４４を駆動してＴ型フラスコ２０へ濃度調整タンク４３内の培地を培地供給ライン４４ａを介して供給し（ステップＳ１７０）、このプログラムを終了する。一方、ステップＳ１００で培地交換時期でないと判定されたときには、続いて回転速度測定時期か否かを判定する（ステップＳ１８０）。ここでは、回転速度測定時期は、上述した５−２と同様、培養開始後２，４，６，８，１０，１２日目と定められている。ステップＳ１８０で回転速度測定時期でないと判定されたときにはこのプログラムを終了し、一方、回転速度測定時期であると判定されたときには、ＣＣＤカメラ１５の投影画像を画像処理した２値化画像から細胞集合体の回転速度ωを算出し、これを所定の記憶領域（例えばＨＤＤ）に記憶し（ステップＳ１９０）、このプログラムを終了する。
【００３９】
以上の細胞保存培養装置３０によれば、図７と同様の結果が得られ、細胞集合体の回転速度ωが５０〜１００ｄｅｇ／ｈに収まるようにグルコース濃度を自動的に切り換えることにより、細胞活性を維持したまま細胞増殖能を鈍化させて良好に細胞を保存することができるうえ、オペレータが培地の切換操作を行う手間をかけることなく適切に細胞を保存できる。
【００４０】
なお、上述した細胞保存培養装置３０では、所望のグルコース濃度を持つ培地を濃度調整タンク４３に自動的に調整してＴ型フラスコ２０へ供給したが、濃度調整タンク４３を用いる代わりに、予めグルコース濃度の異なる培地を蓄えているタンクを多数用意しておき、所望のグルコース濃度に応じてそれらのうちのどのタンクからＴ型フラスコ２０へ培地を供給するかを決めるようにしてもよい。また、自動的に培地交換する代わりに、オペレータが培地交換を行ってもよく、その場合、制御装置１９が交換培地のグルコース濃度をディスプレイに表示したりスピーカから音声出力したりして報知を行い、この報知にしたがってオペレータが培地交換を行ってもよい。
【００４１】
また、上述の実施例では、培地交換時期を予め特定することで、細胞集合体の回転速度に基づいた培地成分の調製を行ったが、培地成分を固定し、培地交換時期を細胞集合体の回転速度に基づいて決定するようにしてもよい。具体的には、所定のタイミングごとに細胞集合体の回転速度を観察し、回転速度が所定閾値（例えば、５０ｄｅｇ／ｈ）を下回った時点で新たな培地に交換するプログラムなどが挙げられる。
【００４２】
以上、本発明の実施の形態や実施例について説明したが、本発明はこれらに何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞観察装置１０の概略構成を表す説明図である。
【図２】培養時間（日数）と細胞濃度との関係を表すグラフである。
【図３】ピクセルのグレイレベル値のヒストグラムである。
【図４】ピクセルのグレイレベル値の分散ヒストグラムである。
【図５】細胞集合体の回転速度の説明図である。
【図６】回転速度と比増殖速度との関係を表すグラフである。
【図７】グルコース濃度制限培地で保存したあと通常培地で増殖したときの様子を表すグラフである。
【図８】細胞保存培養装置３０の概略構成を表す説明図である。
【図９】保存培養プログラムのフローチャートである。
【符号の説明】
１０　細胞観察装置、１１　支持台、１３　ＬＥＤランプ、１５　ＣＣＤカメラ、１６　三次元ステージ、１７　インキュベータ、１９　制御装置、２０　Ｔ型フラスコ、４１　第１タンク、４２　第２タンク、４３　濃度調整タンク、４４培地供給ポンプ、４５　培地排出ポンプ。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell preservation method for preserving cells by immersing the cells in a cell preservation solution, and an apparatus therefor.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art In recent years, cell culture technology is used in various fields, such as culturing cells in vitro and transplanting the cultured cells into patients for treatment or using them for toxicity tests of pharmaceuticals and the like. It is becoming. In the field of cell culture technology, it is necessary to adjust the schedule for tissue production in which cells are cultured to construct a tissue, and it may be necessary to preserve the cells when the schedule is adjusted. For example, regarding transplantation to a patient, it is desirable to calculate the time to start tissue production by calculating backward from the transplantation schedule and store the cells in a state where the performance of the cells does not change until the time of the start of tissue production. In general, low-temperature storage (see Patent Document 1) and cryopreservation (see Patent Document 2 or 3) are generally known as methods for preserving cells.
[0003]
[Patent Document 1]
Tokuhyo Hei 5-503930
[Patent Document 2]
Tokuhyo Hei 5-500 800
[Patent Document 3]
Tokuhyo Hei 5-507715
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, it is difficult for these methods to prevent cell damage due to temperature changes. For this reason, development of a method of preserving cells while preventing such cell damage has been desired, but has not yet been developed.
[0005]
The present invention has been made in view of the above-described problems, and has as its object to provide a cell preservation method and a cell preservation method capable of preserving cells while preventing cell damage.
[0006]
Means for Solving the Problems, Embodiments of the Invention and Effects of the Invention
In order to solve the above-mentioned object, a first aspect of the present invention is a cell preservation method for preserving cells by immersing the cells in a cell preservation solution,
An immersion step of immersing the cells in a cell storage solution,
A rotation speed measurement step of measuring the rotation speed of a cell aggregate composed of two adjacent cells among the cells immersed in the cell storage solution,
A storage solution switching step of switching a type of the cell storage solution based on a rotation speed of the cell aggregate.
[0007]
In this cell preservation method, the type of cell preservation solution is switched based on the rotation speed of the cell aggregate in the cell preservation solution. Since the rotation speed of the cell aggregate is a parameter closely related to the cell proliferation ability, the type of the cell preservation solution may be set based on the rotation speed of the cell aggregate, for example, to slow down the cell proliferation ability while maintaining the cell activity. Can be switched. Therefore, according to this cell storage method, cells can be stored while preventing cell damage.
[0008]
Here, "switching the type of cell preservation solution" means, for example, switching to a cell preservation solution containing a component different from the cell preservation solution used up to now, or switching to a cell preservation solution used up to now. This refers to switching to a cell preservation solution that is a component contained but has a different concentration of the component. Further, the “cell” can be applied to any cell, but is preferably an adhesion-dependent cell. "Adhesion-dependent cells" refer to cells that first adhere directly to a given surface of a culture vessel or indirectly via an extracellular matrix, then expand their adhesion area, and then divide. Say. Examples include various cells collected from warm-blooded animals such as humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, horses, dogs, cats, monkeys, and the like. Examples of the cells of this warm-blooded animal include keratinocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, Muscle cells, adipocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells, stem cells or adhesion-dependent cancer cells of these cells Is mentioned. Also, embryonic stem cells can be used. Alternatively, foreign genes encoding erythropoietin, growth hormone, granulocyte colony stimulating factor, insulin, interferon, blood coagulation factors such as blood coagulation factor VIII, glucagon, tissue plasminogen activator, dopamine, oncogene, cancer suppressor gene, etc. Transformed cells constructed to introduce genes into the cells and express them forcedly or under specific conditions using various promoters may be used. Examples of the extracellular matrix include integrin, collagen, elastin, proteoglycan, glycosaminoglycan, glycoprotein, and the like.
[0009]
In the cell storage method of the present invention, in the rotation speed measurement step, the rotation speed of a plurality of cell aggregates is measured, and in the evaluation step, the cell culture is performed based on an average value of the rotation speeds of the plurality of cell aggregates. The effect of the liquid on the cells may be evaluated. In this case, a more appropriate evaluation can be made as compared with the case where the rotation speed of one cell aggregate is measured and the cell culture solution is evaluated.
[0010]
In the cell storage method of the present invention, in the rotation speed measuring step, an angle at which a straight line connecting the centers of gravity of two cells constituting the cell aggregate rotates per unit time may be set as the rotation speed of the cell aggregate. This makes it possible to relatively easily determine the rotation speed of the cell aggregate.
[0011]
In the cell preservation method of the present invention, in the immersion step, cells are immersed in the cell preservation solution containing a cell energy source, and in the preservation solution switching step, the energy source is determined based on a rotation speed of the cell aggregate. May be switched to a cell preservation solution having a different concentration or amount. In this way, for example, when it is determined that the cell proliferation ability tends to decrease due to the rotation speed of the cell aggregate, which is a parameter closely related to the cell proliferation ability, the concentration of the energy source is switched to a high cell preservation solution, and the cells are switched. Preserving cells appropriately by preventing a decrease in proliferation ability or, when it is judged that cell proliferation ability is on the rise, switching to a cell preservation solution with a lower energy source concentration and suppressing cell proliferation ability be able to. Here, examples of the energy source include saccharides such as glucose and amino acids.
[0012]
In the cell preservation method of the present invention, in the preservation solution switching step, the type of the cell preservation solution is set such that the rotation speed of the cell aggregate falls within a rotation speed range in which the cell proliferation ability is reduced while maintaining cell activity. You may switch. Such a rotation speed range may be empirically determined by measuring the cell growth ability in the cell preservation solution and the cell growth ability after switching to the normal medium. For example, the cell growth ability is determined as the specific growth rate or the doubling time, and the specific growth rate in the cell preservation solution is small (that is, the doubling time is long), and then the specific growth rate after switching to the normal medium is large (that is, the doubling time). May be shorter). Such a rotational speed range is preferably set to 40 to 120 deg / h, and particularly preferably set to 50 to 100 deg / h. If the rotation speed is less than 50 deg / h, especially 40 deg / h, the cell growth ability is slowed down, but the cell activity tends to be difficult to maintain, which is not preferable. It is not preferable because it tends to disappear.
[0013]
A second aspect of the present invention is a cell storage device that stores cells by immersing the cells in a cell storage solution,
Rotation speed measurement means for measuring the rotation speed of a cell aggregate composed of two adjacent cells among the cells immersed in the cell preservation solution,
Means for notifying that the type of the cell preservation solution is to be switched based on the rotation speed of the cell aggregate or switching the type of the cell preservation solution.
[0014]
In this cell storage device, the type of the cell storage solution is notified or the type of the cell storage solution is automatically switched based on the rotation speed of the cell aggregate in the cell storage solution. Since the rotation speed of the cell aggregate is a parameter closely related to the cell proliferation ability, the type of the cell preservation solution may be set based on the rotation speed of the cell aggregate, for example, to slow down the cell proliferation ability while maintaining the cell activity. (In this case, the operator receiving the notification switches the type of the cell storage solution) or automatically switches the type of the cell storage solution. Therefore, according to this cell storage method, cells can be stored while preventing damage to the cells.
[0015]
In this cell storage device, imaging means for imaging cells immersed in the cell storage solution, and extraction means for extracting a cell aggregate composed of two adjacent cells from an image captured by the imaging means And the rotation speed measurement means may determine the rotation speed of the cell aggregate extracted by the extraction means. By doing so, the rotational speed of the cell aggregate can be relatively easily determined by analyzing the captured image.
[0016]
In this cell storage device, the rotation speed measurement means measures a rotation speed of a cell aggregate composed of two adjacent cells among cells immersed in the cell storage solution containing a cell energy source. The response means may notify or switch automatically to switch to a cell storage solution having the concentration of the energy source determined based on the rotation speed of the cell aggregate. When the corresponding means notifies that the cell preservation solution is switched to a cell preservation solution having an energy source concentration or amount suitable for preserving cells, the operator can appropriately store the cells by switching the cell preservation solution according to the notification. Also, when the corresponding means automatically switches to a cell preservation solution having a concentration or amount of an energy source suitable for preserving the cells, the operator can appropriately store the cells without switching the cell preservation solution. it can.
[0017]
In the cell storage device of the present invention, the rotation speed measuring means measures a rotation speed of a plurality of cell aggregates, and the corresponding means stores the cell storage based on an average value of the rotation speeds of the plurality of cell aggregates. The user may be notified that the type of liquid is to be switched, or the type of the cell storage solution may be switched. Further, the rotation speed measuring means may use the angle at which a straight line connecting the centers of gravity of the two cells constituting the cell aggregate rotates per unit time as the rotation speed of the cell aggregate. Further, the responding means may notify that the type of the cell preservation solution is switched so that the rotation speed of the cell aggregate falls within a rotation speed range in which the cell proliferation ability is reduced while maintaining the cell activity, or The type of storage solution may be switched. Such a rotation speed range may be empirically determined by measuring the cell growth ability in the culture solution and the cell growth ability after switching to the normal medium, for example, 40 to 120 deg / h, preferably 40 to 120 deg / h. May be set to 50 to 100 deg / h.
[0018]
【Example】
1. Medium Used The medium (cell preservation solution) used in this example will be described. As a medium having a glucose concentration of 0 mol / m ^3, a glucose-free serum-free medium (HuMedia-KB2 custom-made medium, manufactured by Kurabo Industries) to which glucose was not added was used. The serum-free medium having a glucose concentration of 6.0 × 10 ⁻³ or 6.0 × 10 ⁻² mol / m ³ includes a glucose-free serum-free medium and a solution having a glucose concentration of 3 × 10 ³ mol / m ³ . Was used to adjust the concentration, thereby producing the film. Furthermore, a serum-free medium (HuMedia-KG2, manufactured by Kurabo Industries) was used as a normal medium. The glucose concentration of this normal medium is 6.0 mol / m ³ . In addition, each culture medium is called culture medium A to D as shown in Table 1 below for convenience.
[0019]
[Table 1]

[0020]
2. Cell Observation Device FIG. 1 is an explanatory diagram showing a schematic configuration of a cell observation device 10. The cell observation device 10 is a device used to calculate a cell concentration X, a rotation speed ω of a cell aggregate, and the like, which will be described later, and illuminates the support 11 that supports the T-type flask 20 and the T-type flask 20. An LED lamp 13, a CCD camera 15 for photographing the bottom surface of the T-shaped flask 20, an incubator 17 containing these and maintaining a predetermined temperature, and a control device 19 for analyzing an image photographed by the CCD camera 15 are provided. .
[0021]
The support 11 supports a T-shaped flask 20 to which adhesion-dependent cells (hereinafter simply referred to as cells) adhered to the bottom surface cultured in a medium are exposed with the bottom surface visually exposed downward. In other words, the support base 11 supports only the bottom edge of the T-flask 20 or makes the portion corresponding to the bottom of the T-flask 20 a transparent member, so that the imaging by the CCD camera 15 is not hindered. It is configured as follows. The LED lamp 13 projects individual cells in the T-shaped flask 20 onto the bottom surface of the T-shaped flask 20 by illuminating the T-shaped flask 20 supported by the support base 11 from above. The CCD camera 15 is installed below the T-shaped flask 20 so that the bottom of the T-shaped flask 20 can be photographed. When the CCD camera 15 receives the command signal from the control device 19, the CCD camera 15 photographs the bottom surface of the T-shaped flask 20 illuminated from above by the LED lamp 13, and the individual cells in the T-shaped flask 20 become T-shaped. A projection image projected on the bottom surface of the flask 20 is obtained, and data of the projection image is transmitted to the control device 19. The CCD camera 15 is attached to a three-dimensional stage 16 and is movable up and down, left and right, and back and forth. The three-dimensional stage 16 operates in response to a command signal from the control device 19 to position the CCD camera 15 at a predetermined position. The incubator 17 is a temperature-controllable case including the support 11, the LED lamp 13, and the CCD camera 15, and supplies air containing 5% CO ₂ to a T-shaped flask 20 supported by the support 11. A line and a line for discharging gas from the T-shaped flask 20 are provided. The control device 19 includes a known CPU, ROM, RAM, and the like. The controller 19 outputs a command signal to the three-dimensional stage 16 to position the CCD camera 15 at a predetermined position, and then outputs a command signal to the CCD camera 15 to shoot a projection image. The image analysis processing is performed by inputting from the camera 15, and a cell density X, a rotational speed ω, and a specific growth rate μ of the cell aggregate, which will be described later, are calculated based on the projected image after the image analysis processing.
[0022]
3. 3. Growth under glucose concentration limitation and normal medium switching 3-1. Using a human mammary epithelium-derived telomerase-immortalized cell (hTERT-HME1) as a cell inoculated cell into a T-type flask, cultured in a medium D, which is a normal medium, in a 75-cm ² T-type flask, and after reaching confluence, Was washed twice with a phosphate buffer solution, and 2 ml of a trypsin solution was added dropwise. After 5 minutes of incubation at 37 ° C. in an incubator, the cells were detached from the bottom of the flask. Subsequently, to stop the action of trypsin, 2 ml of 0.1% trypsin inhibitor was added to the obtained cell suspension. This cell suspension was transferred to a centrifuge tube, and centrifuged at room temperature for 8 minutes at 1000 rpm to remove each enzyme. This was suspended in a glucose-free serum-free medium (medium A). Thereafter, the cells in this cell suspension were dropped on a hemocytometer by the trepan blue staining method, and the cells were counted under microscopic observation. Then, a 25 cm ² T-shaped flask was inoculated so that the cell concentration became 0.5 × 10 ⁴ cells / cm ² . At this time, the inoculation amount of the cell suspension and the medium amount of the medium A were adjusted to 10 ml. In addition, T-type flasks containing the cell suspensions of the same concentration were similarly prepared for the mediums B to D.
[0023]
3-2. Cell Proliferation Each T-flask was cultured in the incubator 17 of the cell observation device 10. The T-shaped flask in the incubator 17 was filled with humidified air having a CO ₂ concentration of 5%. On the third and fifth days after the inoculation, the medium was replaced with a new medium having the same glucose concentration, and on the seventh day after the inoculation, the medium was switched to the medium D, which was the normal medium. The medium was replaced with a medium (medium D). The culture of the medium D was stopped by the 7th day. In the culture in these T-type flasks, every day after the inoculation, an image of the state of the bottom surface of the flask was taken using the CCD camera 15 of the cell observation device 10, and the number of cells n in the projected area S was counted for each flask. To determine the cell concentration (= n / S). Specifically, images were taken at three locations per flask, and the average of the cell concentrations at the three locations was taken as the cell concentration X at that time. FIG. 2 shows the relationship between the culture time (days) and the cell concentration X at this time. As is clear from FIG. 2, when cells were cultured in mediums A to C having a low glucose concentration, the cell growth ability slowed down compared to the case of culture in medium D, which is a normal medium. After switching to the medium (medium D), good cell growth ability was exhibited. From this, the cells are stored in a state in which the cell growth ability is slowed down by immersing the cells in a medium having a low glucose concentration, and then the cells are grown with the same growth ability as usual by switching to the normal medium. It turned out that it was possible.
[0024]
4. Behavior of cells under restriction of glucose concentration 4-1. The individual cells cultured in each medium are observed with the passage of time using the cell observation device 10, and only the cell aggregates in which two cells are adjacent are extracted from the photographed cells, and the cell aggregates are extracted. The angle at which the straight line connecting the positions of the centers of gravity of the two cells formed rotates with time is calculated, the rotation angle per hour is determined as the rotation speed (deg / h), the glucose concentration in the medium used, the specific growth rate, and the cell aggregation. The relationship with the rotational speed of the body was examined.
[0025]
4-2. Photographing In the same manner as in 3-1 described above, human mammary epithelium-derived telomerase-immortalized cells were cultured in each medium A to C at 25 cm ² T so that the cell concentration was 0.3 × 10 ⁴ cells / cm ^2. The flask was inoculated and cultured. The culturing days were 5, 7, 13, and 19 days. When the number of culture days is N days (N = 5, 7, 13, 19), the cells are cultured in mediums A to C, which are glucose concentration limiting medium, at ordinary temperature until day N, and the medium is replaced every two or three days. On day N, the medium was switched to the medium D, which is a normal medium. Images were taken every 15 minutes for two days before the medium was switched, and images were taken every 15 minutes immediately after the medium was switched.
[0026]
4-3. The control device 19 of the image processing cell observation device 10 clarified the individual cell images by performing a closing process and a filling hole process after binarizing the projected image of the bottom surface of the T-shaped flask 20. Here, binarization is a process of setting a pixel having a gray level value equal to or less than a certain threshold value to a value of 1 and setting other pixels to a value of 0 to partition an image into two regions of white and black. It is. In the present embodiment, a histogram having a gray level value of a pixel as a horizontal axis and a pixel number as a vertical axis is created as a threshold value, and a gray level value at a peak of the pixel number is adopted (see FIG. 3). Focusing on the fact that the gray level value locally changes near the cell and the cell boundary and the variance is large, a variance histogram of the gray level value of the pixel is created (see FIG. 4), and this variance histogram is represented by the large variance. The region was divided into a small region and a large region. A region with a large variance, that is, a region on the right side of FIG. 4A was regarded as a region near a cell and a cell boundary, and this region was binarized using the above-described threshold. After the binarization, the largest black body was regarded as a cell, and the black body was filled with small holes by closing processing to smooth the boundary, and further filled with isolated holes by filling hole processing to obtain a cell image.
[0027]
4-4. From the binarized image obtained by performing image processing on the projection image obtained at the rotation speed measurement time t1, only the cell aggregates in which two cell images are adjacent to each other are extracted as shown in FIG. And the center of gravity of both cells was connected by a straight line, and this was defined as a straight line at time t1. Thereafter, from the binarized image obtained by performing image processing on the projection image obtained at time t2 when the predetermined time Δt has elapsed, the center of gravity of both cells is connected with a straight line to the same cell aggregate as above, and this is connected to the straight line at time t2. did. Then, the rotation angle Δθ from the straight line at time t1 to the straight line at time t2 was determined, and the rotation speed Δθ / Δt of the cell aggregate was determined. In practice, individual rotation speeds Δθ / Δt were obtained for a plurality of cell aggregates included in the projection image, and the average value thereof was set as the rotation speed ω [deg / h] of the cell aggregates. At was one hour.
[0028]
4-5. Specific growth rate The specific growth rate μ was determined by the following equation (1). In the following equation 1, X (t2) is the cell concentration at time t2, X (t1) is the cell concentration at time t1, and Δt is the time interval between time t2 and time t1 (two days in this embodiment). is there.
[0029]
(Equation 1)

[0030]
4-6. FIG. 6 shows the rotational speed ω of the cell aggregate, the specific growth rate μ under the glucose concentration limitation, and the specific growth rate μ ′ of the normal culture (also referred to as regrowth) with the glucose concentration limitation released. 6 is a graph showing the relationship of. In the graph of FIG. 6, the data on the Nth day of culture (N = 5, 7, 13, 19) was obtained by culturing in mediums A to C, which is a glucose concentration-limited medium, at room temperature until the Nth day. The medium is switched to the medium D, which is a normal medium, and the rotation speed ω and the specific growth rate μ are measured immediately before the medium is switched, and the measured values are plotted. It is a plot of the rotation speed ω and the specific growth speed μ ′. As is clear from FIG. 6, the specific growth rate μ under the restriction of the glucose concentration tended to decrease as the total number of culture days increased or as the rotation rate decreased. When the rotation speed ω of the cell aggregate falls within the shaded range shown in FIG. 6 (the rotation speed ω is in the range of 50 to 100 deg / h), the specific growth rate μ is suppressed to a low value under the glucose concentration limitation, and the cell growth is suppressed. Although the ability was slowed down, it was found that the specific growth rate μ ′ was high at the time of regrowth, and the cell growth ability was the same as when cultured in a normal medium from the beginning.
[0031]
Specifically, when the rotational speed ω of the cell aggregate is in the range of 50 to 100 deg / h during the culture period under the glucose concentration limitation, that is, throughout the storage period, the culture condition is evaluated as being suitable for cell storage. However, the medium used at this time is evaluated as suitable for cell preservation. On the other hand, when the rotation speed ω of the cell aggregate is less than 50 deg / h, the culture condition is evaluated as not suitable for cell preservation because the cell activity is not sufficiently maintained, and the medium used at this time is also not suitable for cell preservation. Evaluate not. When the rotational speed ω of the cell aggregate exceeds 100 deg / h, it is evaluated that the culture conditions cannot sufficiently slow the cell growth ability, but the cell activity is sufficiently maintained. However, even if the rotation speed ω exceeds 100 deg / h in the early stage of the culturing process, if the rotation speed ω subsequently falls within the range of 50 to 100 deg / h, the cells will grow to some extent in the early stage of the culturing process. Will be maintained. Therefore, when such a preservation method is preferable, the culture conditions can be adopted as conditions for preserving the cells.
[0032]
5. Cell storage method 5-1. Operation before starting culture In the same manner as in 3-1 described above, a cell suspension was prepared using human mammary epithelium-derived telomerase-immortalized cells (hTERT-HME1), and this cell suspension was placed in a T-type flask. Using a medium B having a glucose concentration of 6.0 × 10 ⁻³ mol / m ³ and adjusting the total cell concentration to 0.3 × 10 ⁴ cells / cm ^{2 in} 10 ml, a cell observation device Cultured in 10 incubators 17. The T-type flask 20 in the incubator 17 was filled with humidified air having a CO ₂ concentration of 5%, and the culture was started.
[0033]
5-2 Operation after the start of culture The first medium exchange was performed on the first day after the start of the culture, and the rotation speed of the cell aggregate in the first medium exchange was measured on the second day after the start of the culture. The exchange was performed on the third day after the start of the culture, and the rotation speed of the cell aggregate in the second medium exchange was measured on the fourth day after the start of the culture, and the number of medium exchanges was repeated in the same manner. That is, the n-th (n = 1, 2,..., 6) medium exchange is performed on the (2n-1) day after the start of culture, and the rotation speed of the cell aggregate in the n-th medium exchange is 2n days after the start of culture. Measured by eye. Then, at the time of the seventh medium exchange (day 13), the medium was switched to the medium D, which is a normal medium. Thereafter, the medium was replaced with the normal medium (medium D) on the 16th day after the start of the culture, and observed until the 18th day. After switching to the normal medium, the rotational speed of the cell aggregate was not measured.
[0034]
When the medium is replaced, whether the medium is replaced with a medium having the same glucose concentration or a medium having a different glucose concentration is determined depending on whether the rotation speed of the cell aggregate is in the range of 50 to 100 deg / h. Decided to fit. Specifically, when replacing the medium, when the value Δω obtained by subtracting the rotational speed of the cell assembly two times before from the previous rotational speed of the cell aggregate is negative (Δω <0), the glucose is 10 times higher than the previous time. The medium is switched to a medium having a concentration. When Δω is almost zero (Δω ≒ 0), the medium is switched to a medium having a glucose concentration five times that of the previous time. When Δω is positive (Δω> 0), the glucose concentration is the same as the previous time. Was switched to a medium with. This is summarized in Table 2 below.
[0035]
[Table 2]

[0036]
5-3. Results As described above, the results obtained when the cells were stored in a medium in which the glucose concentration was restricted until day 13 of culture and then cultured in a normal medium (medium D) are shown in the graph of FIG. The letters a to e attached to black circles in the graph of FIG. 7 in which the number of days of culture is the horizontal axis and the cell concentration X is the vertical axis indicate glucose concentrations of 6.0 × 10 ⁻³ and 6.0 × 10 ^{− respectively. 2} , 6.0 × 10 ⁻¹ , 3.0, 6.0 [mol / m ³ ]. As is clear from FIG. 7, the rotation speed ω of the cell aggregate is changed by replacing the medium with the glucose concentration calculated based on the rotation speed ω of the cell aggregate as shown in Table 2 until the thirteenth day of the culture. It was generally within the range of 50 to 100 deg / h. After switching to the normal medium (medium D), the number of cells increased satisfactorily. By selecting the glucose concentration such that the rotation speed of the cell aggregate falls within the range of 50 to 100 deg / h, the cell growth can be slowed down while maintaining the activity of the cells, and the cells can be stored well, in other words. It was found that cells could be stored while preventing damage to the cells.
[0037]
6. Cell Storage Device FIG. 8 is a schematic explanatory view of the cell storage and culture device 30. The cell storage and culturing apparatus 30 includes a first tank 41 storing a glucose-free serum-free medium (medium A) and a second tank storing a solution having a glucose concentration of 3 × 10 ³ mol / m ^{3 in} the cell observation apparatus 10. The concentration at which the liquid stored in the tank 42 and the first tank 41 is supplied through the first electromagnetic valve 41a and the liquid stored in the second tank 42 is supplied through the second electromagnetic valve 42a. A regulating tank 43, a medium supply pump 44 for supplying a medium from the concentration adjusting tank 43 to the T-flask 20 via a medium supplying line 44a, and a medium for discharging the medium in the T-flask 20 via a medium discharging line 45a. A discharge pump 45 is added.
[0038]
Next, a description will be given of an operation in which cells are stored and cultured and grown as usual using the cell storage and culture device 30. Here, a case where the same operation as the above-described 5-2 is executed by the cell storage and culture device 30 will be described as an example. The operator first prepares for the start of the culture in the same manner as in 5-1 described above, and then starts the culture in the incubator 17 and inputs to the control device 19 that the culture has been started. Then, the control device 19 reads and executes the stored culture program at predetermined timings (for example, every several minutes). FIG. 9 is a flowchart of the storage culture program. When the program is started, first, it is determined whether or not a predetermined medium exchange time has come (step S100). Here, the medium exchange time is defined as the first, third, fifth, seventh, ninth and eleventh days after the start of the culture, similarly to 5-2 described above, and when there is an input indicating that the culture has started. Judgment is made based on the count number of the built-in timer that starts timing. If it is determined in step S100 that the medium replacement time has come, it is determined whether the current medium replacement time is the first time, the second time, or the third time or later (step S110). When the medium exchange time is the first time or the second time in step S110, the glucose concentration is determined to be the same as the initial value because the rotational speed ω of the cell aggregate before and after the previous time is not measured (step S120). On the other hand, when the medium exchange time is the third or later time in step S110, since the rotation speed ω of the cell aggregate before and after the previous time is measured and stored, the value obtained by subtracting the rotation speed ω of the previous rotation speed ω from the previous rotation speed ω is stored. Δω is calculated (Step S130), and the current glucose concentration is determined by comparing this Δω with Table 2 (Step S140). Table 2 is stored in the HDD (not shown) of the control device 19. Then, after determining the glucose concentration in step S120 or step S140, the first solenoid valve 41a and the second solenoid valve 42a are opened and closed to control the first tank 41 and the second tank 42 so that a desired amount of culture medium is respectively supplied from the concentration adjustment tank. By flowing the medium into the medium 43, a medium having a desired glucose concentration is prepared (step S150). Subsequently, the culture medium discharge pump 45 is driven to discharge the previously used culture medium from the T-shaped flask 20 via the culture medium discharge line 45a (Step S160). After the discharge is completed, the culture medium supply pump 44 is driven to supply the culture medium in the concentration adjusting tank 43 to the T-shaped flask 20 via the culture medium supply line 44a (step S170), and the program ends. On the other hand, when it is determined in step S100 that it is not the medium replacement time, it is subsequently determined whether or not it is the rotation speed measurement time (step S180). Here, the rotation speed measurement timing is set to the second, fourth, sixth, eighth, tenth, and twelfth days after the start of the culture, as in 5-2 described above. When it is determined in step S180 that it is not the rotation speed measurement time, the program is terminated. On the other hand, when it is determined that the rotation speed measurement time is reached, the cell aggregation is performed from the binarized image obtained by image-processing the projected image of the CCD camera 15. The rotation speed ω of the body is calculated and stored in a predetermined storage area (for example, HDD) (step S190), and this program ends.
[0039]
According to the cell preservation and culturing apparatus 30 described above, the same result as that of FIG. 7 is obtained, and the glucose concentration is automatically switched so that the rotation speed ω of the cell aggregate falls within 50 to 100 deg / h. In addition, the cell growth ability can be reduced and the cells can be stored well by maintaining the same, and the cells can be stored properly without the need for the operator to change the medium.
[0040]
In the cell storage and culturing device 30 described above, a medium having a desired glucose concentration is automatically adjusted in the concentration adjusting tank 43 and supplied to the T-type flask 20. Instead of using the concentration adjusting tank 43, glucose is adjusted in advance. A large number of tanks storing mediums having different concentrations may be prepared, and the tank from which the medium is supplied to the T-flask 20 may be determined according to the desired glucose concentration. Instead of automatically changing the medium, the operator may change the medium. In this case, the controller 19 displays the glucose concentration of the changed medium on a display or outputs a sound from a speaker to notify the user. The operator may replace the medium according to this notification.
[0041]
Further, in the above-described example, the medium exchange time was specified in advance, and the medium component was prepared based on the rotation speed of the cell assembly.However, the medium component was fixed, and the medium exchange time was changed for the cell assembly. The determination may be made based on the rotation speed. Specifically, there is a program for observing the rotation speed of the cell aggregate at a predetermined timing, and replacing the medium with a new medium when the rotation speed falls below a predetermined threshold (for example, 50 deg / h).
[0042]
The embodiments and examples of the present invention have been described above. However, the present invention is not limited to these, and may be implemented in various forms without departing from the technical scope of the present invention. Needless to say.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram illustrating a schematic configuration of a cell observation device 10.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between culture time (days) and cell concentration.
FIG. 3 is a histogram of gray level values of a pixel.
FIG. 4 is a variance histogram of gray level values of a pixel.
FIG. 5 is an explanatory diagram of a rotation speed of a cell aggregate.
FIG. 6 is a graph showing a relationship between a rotation speed and a specific growth speed.
FIG. 7 is a graph showing a state of growth in a normal medium after storage in a glucose concentration-limited medium.
FIG. 8 is an explanatory diagram showing a schematic configuration of a cell storage and culture device 30.
FIG. 9 is a flowchart of a storage culture program.
[Explanation of symbols]
Reference Signs List 10 cell observation device, 11 support stand, 13 LED lamp, 15 CCD camera, 16 three-dimensional stage, 17 incubator, 19 controller, 20 T-shaped flask, 41 first tank, 42 second tank, 43 concentration adjustment tank, 44 Medium supply pump, 45 Medium discharge pump.

Claims

A cell preservation method for preserving the cells by immersing the cells in a cell preservation solution,
An immersion step of immersing the cells in a cell storage solution,
A rotation speed measurement step of measuring the rotation speed of a cell aggregate composed of two adjacent cells among the cells immersed in the cell storage solution,
A storage solution switching step of switching a type of the cell storage solution based on a rotation speed of the cell aggregate.

In the rotation speed measurement step, the rotation speed of a plurality of cell aggregates is measured,
The cell storage method according to claim 1, wherein in the storage solution switching step, the type of the cell storage solution is switched based on an average value of the rotation speeds of the plurality of cell aggregates.

3. The cell storage according to claim 1, wherein in the rotation speed measurement step, an angle at which a straight line connecting the centers of gravity of two cells constituting the cell aggregate rotates per unit time is defined as the rotation speed of the cell aggregate. 4. Method.

In the immersion step, the cells are immersed in the cell preservation solution containing a cell energy source,
The cell storage method according to any one of claims 1 to 3, wherein in the storage solution switching step, the energy source is switched to a cell storage solution having a different concentration or amount based on a rotation speed of the cell aggregate.

5. The cell according to claim 4, wherein in the storage solution switching step, the type of the cell storage solution is switched so that the rotation speed of the cell aggregate falls within a rotation speed range in which the cell proliferation ability is reduced while maintaining cell activity. Preservation method.

The cell preservation method according to claim 5, wherein the rotation speed range is an area empirically determined by measuring a cell growth ability in the culture solution and a cell growth ability after switching to a normal medium.

The cell storage method according to claim 5, wherein the rotation speed range is 40 to 120 deg / h.

A cell storage device that stores the cells by immersing the cells in a cell storage solution,
Rotation speed measurement means for measuring the rotation speed of a cell aggregate composed of two adjacent cells among the cells immersed in the cell preservation solution,
A cell storage device comprising: means for notifying that the type of the cell storage solution is to be switched based on the rotation speed of the cell aggregate, or corresponding means for switching the type of the cell storage solution.

Imaging means for imaging cells immersed in the cell storage solution,
Extracting means for extracting a cell aggregate composed of two adjacent cells from an image taken by the photographing means,
The cell storage device according to claim 8, wherein the rotation speed measurement unit obtains a rotation speed of the cell aggregate extracted by the extraction unit.

The rotation speed measuring means measures the rotation speed of a cell aggregate composed of two adjacent cells among cells immersed in the cell preservation solution containing a cell energy source,
10. The method according to claim 8 or 9, wherein the corresponding unit notifies or switches automatically to switch to a cell storage solution having a concentration or an amount of the energy source determined based on a rotation speed of the cell aggregate. The cell storage device according to any one of the preceding claims.