JP2004135554A

JP2004135554A - Microsatellite marker for detecting gene resistant to root-knot disease of cruciferous plant, and utilization thereof

Info

Publication number: JP2004135554A
Application number: JP2002302280A
Authority: JP
Inventors: Satoru Matsumoto; 松元　哲; Masashi Hirai; 平井　正志; Tsukasa Nunome; 布目　司; Hikari Tsukasaki; 塚崎　光; Keita Suwabe; 諏訪部　圭太; Miyuki Fujimura; 藤村　みゆき
Original assignee: National Agriculture and Bio Oriented Research Organization NARO
Current assignee: National Agriculture and Bio Oriented Research Organization NARO
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2002-10-16
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2022-10-16
Also published as: JP4366494B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a microsatellite marker linked to a new QTL resistant to root-knot disease in a cruciferous plant, and to provide a method for effectively selecting a root-knot disease-resistant plant individual with the marker. <P>SOLUTION: Markers exhibiting polymorphism between susceptible plant individuals and resistant plant individuals were selected from many microsatellite markers. A phenotype separation pattern to the pathogenic bacteria of the root-knot disease and the polymorphism distribution of markers were examined using resistant individual-mated progeny group with the susceptible plant individuals. It was consequently found that four markers were linked to root-knot-resistant QTL resistant to the root-knot disease. Thereby, an individual having a new gene resistant to the root-knot disease can be identified by detecting a DNA fragment having the microsatellite marker. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アブラナ科植物の根こぶ病抵抗性個体の選抜に用いるＤＮＡマーカー及び選抜法に関するものである。詳しくは特定のマイクロサテライト遺伝子座を検出しうる合成オリゴヌクレオチド並びに合成オリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ分析によって、根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物を識別し、根こぶ病抵抗性個体を選抜する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
根こぶ病はアブラナ科野菜における最も重要な土壌病害の１つである。根こぶ病に罹病した根には、特徴的なこぶが形成され、栄養分や水分の吸収が阻害され、最終的には生育阻害、収量減を引き起こす。根こぶ病菌は休眠胞子の形で土壌中に長期間生育が可能であり、一旦発生すると防除が甚だ困難である。そのため、抵抗性品種の利用が本病害の回避に極めて効果的と言える。しかし、根こぶ病菌に対する抵抗性は多因子（量的形質；　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｔｒａｉｔ　ｌｏｃｉ，　ＱＴＬ）による遺伝を示す。そのため、抵抗性の育種素材を用い、交配による経済品種育成を試みる場合、形質の集積が困難で、かつ長期に渡る。本ＱＴＬの主動遺伝子に連鎖するＤＮＡ断片は同定されているが（非特許文献１参照）、このＤＮＡ断片はヘテロ接合体を識別できない優性マーカーであるため、抵抗性個体の選抜に用いるＤＮＡマーカーとしては必ずしも有効ではなかった。また根こぶ病菌には複数に分化したレースに対応した抵抗性、すなわち実用レベルでの抵抗性を発現させるまでには至っていない。したがって、本病害の抵抗性に関わる他のＱＴＬの同定が抵抗性品種開発の上で強く望まれていた。
【０００３】
一方、育種現場においては、形質に連鎖したＤＮＡマーカーの利用が、作業の効率化において非常に有効である。ＤＮＡマーカーには、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）、ＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ　ｓｉｔｅｓ）、マイクロサテライト（ＳＳＲ；　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ）マーカーなどが知られているが、ＲＦＬＰ、ＳＳＲマーカーのみが共優性マーカーであり、他は優性マーカーである。ダブルハプロイド系統を用いて、ブラシカ・ラパの根こぶ病抵抗性遺伝子に連鎖する優性マーカーであるＲＡＰＤマーカーについては、既に知られている（特許文献１参照）。共優性マーカーは、供試個体の遺伝子型（ホモ／ヘテロ）の判別が可能で、育種における導入形質の固定に非常に有効である。しかし、ＲＦＬＰマーカーは、純度の高いＤＮＡを単離する必要があり、また、その後の分析も煩雑であるなど、労働時間さらには設備等におけるコスト面からも問題が多い。一方、ＳＳＲマーカーは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）ベースのマーカーであることから、純度の高いＤＮＡは必要とせず、また、操作が極めて簡便で、高度な設備も必要としない。さらに、運用コストも低く抑えることが可能であることから、育種現場で利用しうるマーカーとしては現時点で最も優れていると言える。しかしながら、根こぶ病抵抗性遺伝子と連鎖したＳＳＲマーカーが開発された例はない。
【０００４】
【特許文献１】
特許第２７３０６７０号公報
【０００５】
【非特許文献１】
Ｋｕｇｉｎｕｋｉら著，　「Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ」，　１９９７年，　Ｖｏｌ．９８，　ｐ．１４９−１５４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アブラナ科植物における根こぶ病抵抗性の新規ＱＴＬに連鎖するマイクロサテライトマーカーを提供し、このマーカーを用いた根こぶ病抵抗性個体の効率的な選抜方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、２〜数塩基の短いヌクレオチド単位の繰り返し配列よりなるマイクロサテライト配列に着目し、ハクサイのゲノムＤＮＡから数多くのマイクロサテライト配列を単離した。これらマイクロサテライト配列の両側の塩基配列を利用することで、それぞれのマイクロサテライト遺伝子座を特異的に増幅できるマーカーに変換した。さらに、これらマーカーから罹病性個体と抵抗性個体との間で多型性を示すマーカーをまず選抜し、次いで、罹病性個体との抵抗性個体交配後代集団を用い、本病原菌に対する表現型の分離パターンと、マーカーの多型分布を調査した。その結果、ＢＲＭＳ０８８（配列番号：１）、ＢＲＭＳ１７３（配列番号：２）、ＢＲＭＳ０９６（配列番号：３）とＢＲＭＳ１００（配列番号：４）のマーカーが、飼料用カブ（系統名：Ｓｉｌｏｇａ）由来の抵抗性親Ｇ００４に由来する根こぶ病抵抗性ＱＴＬの２つと連鎖していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は配列番号：１、２、３および４に記載したマイクロサテライト配列を増幅しうる合成オリゴヌクレオチド配列、例えば、配列番号：５〜１２を提供すると共に、アブラナ科植物より抽出したＤＮＡを鋳型とし、当該合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅されたマイクロサテライト配列の長さの差異（多型）を調査することにより抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体を選抜する方法に関し、より具体的には、
〔１〕　配列番号：１〜４のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡ、
〔２〕　以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のマイクロサテライト配列を含むＤＮＡ、
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列において、５５〜９６位のマイクロサテライト配列
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列において、１５０〜１６４位または２２７〜２４１位のマイクロサテライト配列
（ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列において、４６８〜５３０位のマイクロサテライト配列
（ｄ）配列番号：４に記載の塩基配列において、１７９〜２２６位のマイクロサテライト配列
〔３〕　〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡをＰＣＲ法によって検出することを特徴とする、根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体の識別方法、
〔４〕　以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、〔３〕に記載の識別方法、
（ｉ）請求項１の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のマイクロサテライト配列を含むＤＮＡ領域を増幅する工程
（ｉｉ）増幅したＤＮＡをゲル上で分離する工程
（ｉｉｉ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔５〕　〔３〕または〔４〕記載の識別方法により、根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体を選抜する方法、
〔６〕　アブラナ科植物がハクサイである、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕　〔３〕〜〔６〕に記載の方法に使用されるＰＣＲプライマーであって、〔２〕の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のマイクロサテライト配列を含むＤＮＡ領域を増幅するための合成オリゴヌクレオチド、
〔８〕　配列番号：５〜１２のいずれかに記載の塩基配列からなる、〔７〕に記載の合成オリゴヌクレオチド、
〔９〕　〔７〕または〔８〕に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、アブラナ科植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって増幅されるＤＮＡ、
を、提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、まず、罹病性の　’はくさい中間母本農７号’　の展開葉よりＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで消化した。これをアガロースゲル電気泳動で分離後、２００ｂｐ−１０００ｂｐの断片を単離し、ベクター、ＺＡＰ　ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社）に連結し、ゲノムライブラリーを作製した。ディゴキシゲニン（ＤＩＧ、ロシュ社）標識した２塩基（ＧＡあるいはＧＴ）または３塩基（ＧＣＧ）の１５個の繰り返し配列をプローブとしてゲノミックライブラリーのスクリーニングを行い、マイクロサテライトクローンを単離した。これらクローンの塩基配列を決定後、得られた配列情報を基に各クローンあたり２種のマイクロサテライト特異的プライマーを設計した（以下マイクロサテライトマーカーと記載する場合あり）。これらマーカーのうち、’はくさい中間母本農７号’　のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにおいて、マイクロサテライト遺伝子座を増幅しうるマーカーをまず選抜した。次いで、罹病性親　’はくさい中間母本農７号’　および抵抗性親Ｇ００４の２種間でマイクロサテライト配列に多型が見出されるマーカーをさらに選抜した。
【００１０】
一方、罹病性親　’はくさい中間母本農７号’　および抵抗性親Ｇ００４を交雑し、そのＦ_２およびＦ_３世代の後代集団を得た。これらＦ_３後代において根こぶ病抵抗性検定を実施し、抵抗性の程度を指標化して評価し、この値をＦ_２世代各系統の評価値として還元した。さらにこれらＦ_２後代集団のＤＮＡを鋳型とし、上記で選抜されたマーカーを用いてＰＣＲを行い、Ｆ_２集団間における各マーカー（遺伝子型）の分離と抵抗性評価値とを比較した。その結果、配列表の配列番号：１、２、３および４を増幅しうるマイクロサテライトマーカー、ＢＲＭＳ０８８（配列番号：５，６）、ＢＲＭＳ１７３（配列番号：７，８）、ＢＲＭＳ０９６（配列番号：９，１０）およびＢＲＭＳ１００（配列番号：１１，１２）により分類された各系統の遺伝子型と抵抗性評価値との間に高い相関が見出された。従って、これらのマーカーは、根こぶ病抵抗性個体を効率的に選抜する際に非常に有効であることが判明した。これらマーカーを利用することにより、根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体を容易に識別することが可能である。
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明はまず、抵抗性遺伝子のＱＴＬに連鎖するマイクロサテライト配列を検出することを特徴とする、根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体の識別方法を提供する。
【００１３】
本発明の好ましい態様においては、抵抗性遺伝子のＱＴＬに連鎖するマイクロサテライト配列を含むＤＮＡの検出を行い、該マイクロサテライト配列の長さの差異に基づいて、根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体であるか否かの識別（判定）を行う。上記ＤＮＡの検出は、該ＤＮＡを増幅できる方法であれば特に制限されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、好適に実施することができる。ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ配列中のマイクロサテライト配列において、その配列の長さに差異が見られる場合、増幅されるＤＮＡ断片の長さにも差異が生じる。一般的に、この増幅ＤＮＡ断片長の差は、電気泳動によってバンドパターンの違いとして観察することができる。
【００１４】
本発明の上記「マイクロサテライト配列を含むＤＮＡ」としては、好ましくは、配列番号：１〜４のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、もしくは該塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。配列番号：１〜４に記載された配列は、それぞれ、以下に示すマイクロサテライト配列を含む。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列において、５５〜９６位のマイクロサテライト配列
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列において、１５０〜１６４位または２２７から２４１位のマイクロサテライト配列
（ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列において、４６８〜５３０位のマイクロサテライト配列
（ｄ）配列番号：４に記載の塩基配列において、１７９〜２２６位のマイクロサテライト配列
【００１５】
本発明においては、上記マイクロサテライト配列の長さの差異に基づいて根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体であるか否かの識別を行うことから、必ずしも、配列番号：１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ領域全体の検出を行わなくともよい。即ち、検出すべきＤＮＡ領域は、上記マイクロサテライト配列の長さを調べ得る程度の範囲のＤＮＡ領域であれば特に制限されない。従って、例えば、上記マイクロサテライト配列を含む配列番号：１〜４のいずれかに記載の塩基配列の部分断片ＤＮＡを検出することによっても、本発明の方法を実施することができる。尚、上記マイクロサテライト配列、および該配列を含む配列番号：１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを含むＤＮＡもまた本発明に含まれる。
【００１６】
本発明の上記識別方法における「ＰＣＲ」は、上記マイクロサテライト配列を含むＤＮＡを鋳型（テンプレート）として、該マイクロサテライト配列を増幅し得るプライマーセット（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いることにより、当業者においては容易に実施することができる。
【００１７】
また本発明は、本発明の識別方法に使用されるＰＣＲプライマーであって、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のマイクロサテライト配列を含むＤＮＡ領域を増幅するための合成オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１８】
本発明において使用されるマイクロサテライト配列を増幅し得るプライマーオリゴヌクレオチドの配列は、当業者においては、鋳型となるＤＮＡの配列情報に基づいて、適宜、設計することが可能である。より具体的には、下記のプライマーを好適に例示することができるが、これらのプライマーのみに特に限定されるものではない。下記で例示するプライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列において、例えば、５’末端側に数ベース程度の他の塩基への置換変異を有する、もしくは５’末端側に任意の塩基が付加されたオリゴヌクレオチドであっても、本発明のプライマーとして利用することが可能であるものと考えられる。従って本発明の合成オリゴヌクレオチドは、上記マイクロサテライト配列を増幅し得るプライマーであれば、下記の配列番号：５〜１２のいずれかに記載の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドに特に限定されない。配列番号：５〜１２のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは該配列において置換・付加等の変異を有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００１９】
・上記（ａ）マイクロサテライト配列増幅用プライマーセット
フォワードプライマー：　５’−　ｔａｔｃｇｇｔａｃｔ　ｇａｔｔｃｇｃｔｃｔ　ｔｃａａｃ　−３’（配列番号：５）
リバースプライマー：　５’−　ａｔｃｇｇｔｔｇｔｔ　ａｔｔｔｇａｇａｇｃ　ａｇａｔ　−３’（配列番号：６）・上記（ｂ）マイクロサテライト配列増幅用プライマーセット
フォワードプライマー：　５’−　ｇａｇｇａｔｇｃａｇ　ｔｔｇｃｔｇｔｔｇｔ　ｔ　−３’（配列番号：７）
リバースプライマー：　５’−　ｃｔｔｃｔｔｃｇａｔ　ｇｇａｔｔｃａａｇａ　ｇａａｃ（配列番号：８）
・上記（ｃ）マイクロサテライト配列増幅用プライマーセット
フォワードプライマー：　５’−　ａｇｔｃｇａｇａｔｃ　ｔｃｇｔｔｃｇｔｇｔ　ｃｔｃｃｃ　−３’（配列番号：９）
リバースプライマー：　５’−　ｔｇａａｇａａｇｇａ　ｔｔｇａａｇｃｔｇｔ　ｔｇｔｔｇ　−３’（配列番号：１０）
・上記（ｄ）マイクロサテライト配列増幅用プライマーセット
フォワードプライマー：　５’−　ｃｔｃｔｔｇａｇａａ　ｔｃａｇａｇａｇａｇ　ａｔｔａｃ　−３’（配列番号：１１）
リバースプライマー：　５’−　ｇａｔｃｔｔｃａｔｔ　ａｔａｔｔｃａｔｃｔ　ｃｔｃｔｃ　−３’（配列番号：１２）
【００２０】
本発明の上記オリゴヌクレオチドは、当業者においては、通常、市販されたオリゴヌクレオチド合成機もしくは合成オリゴヌクレオチド受託サービスを利用して容易に取得することが可能である。
【００２１】
さらに、本発明の上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、アブラナ科植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって増幅されるＤＮＡもまた、本発明に含まれる。
【００２２】
本発明の好ましい態様においては、例えば、以下のようにして実施される。まず、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のマイクロサテライト配列を含むＤＮＡ領域を増幅し（工程（Ａ））、次いで、増幅したＤＮＡをゲル上で分離し（工程（Ｂ））、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較を行う（工程（Ｃ））。
【００２３】
上記工程（Ａ）においては、好ましくは、まず被検アブラナ科植物からＤＮＡ試料の調製（ＤＮＡの抽出）を行う。ＤＮＡ試料の調製は、例えば、被検植物の葉、根、種子、カルス、葉鞘、培養細胞等を用いて行うことができるが、これらに特に限定されない。これらの植物体もしくは植物細胞からのＤＮＡの抽出は、当業者においては一般的に公知の方法、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８，　ｐ．４３２１−４３２５，　１９８０）等によって行うことができる。また、ＤＮＡの抽出処理を行わず、例えば、直接細胞破砕液等を用いてＰＣＲを行い、本発明の識別方法を実施することも可能である。
【００２４】
本発明におけるＰＣＲは、当業者においては、その反応条件等について実験または経験によって最適な条件を適宜選択して実施することが可能である。通常、ＰＣＲは、反応液および耐熱性ポリメラーゼを含む市販の試薬キット、および市販のＰＣＲ装置等を利用して、簡便に実施することができる。
【００２５】
工程（Ｂ）における、ＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡのゲル上での分離は、通常、電気泳動によって行うことができる。電気泳動によるＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の分離は、当業者においては、ゲルの組成、電圧、泳動時間等を適宜判断して簡便に実施することができる。
【００２６】
工程（Ｃ）においては、通常、予めサイズが既知のＤＮＡ断片（例えば、サイズマーカー）を対照として、分離されたＤＮＡ断片のサイズを測定する。使用したプライマーの種類、および測定されたＤＮＡサイズを基に、増幅されたＤＮＡにおけるマイクロサテライト配列の有無もしくは該マイクロサテライト配列の長さを検出することができる。
【００２７】
また、上記工程（Ｂ）および（Ｃ）においては、以下のような方法によって実施することも可能である。まず、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させ、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。次いで、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；　一本鎖高次構造多型）法が挙げられる。
【００２８】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法においては、二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。例えば、マイクロサテライト配列の長さの差異によっても一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化を生じ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することにより増幅されたＤＮＡ断片に存在するマイクロサテライト配列の長さを検出することができる。また、増幅産物に多型を生じるような制限酵素認識部位がある場合は、ＰＣＲ法によって増幅し、その増幅産物を制限酵素で処理した後、電気泳動を行う方法（例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）によっても、本発明を実施することができる。多くの品種・系統を取り扱う場合、必ずしも長さによる多型が生じないことも考えられることから、この場合は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を好適に用いて、本発明の方法を実施することができる。
【００２９】
また、増幅ＤＮＡ断片のバンドの数を基に、被検植物個体が根こぶ病抵抗性遺伝子をヘテロあるいはホモとして有するかどうかについて評価することが可能である。通常、上記工程においてバンドが１本検出される場合には、「ホモ」と判定され、バンドが２本検出される場合には「ヘテロ」と判定される。
【００３０】
本発明においては、被検植物ＤＮＡにおける検出されたマイクロサテライト配列の長さが、上記（ａ）〜（ｄ）のマイクロサテライト配列の長さと同じ場合に、被検植物は根こぶ病に対する抵抗性遺伝子（遺伝子座）を有するものと判定される。例えば、配列番号：５に記載の塩基配列からなるフォワードプライマー、および配列番号：６に記載の塩基配列からなるリバースプライマーを使用して、本発明の識別方法を実施した場合、上記（ａ）に記載のマイクロサテライト配列と同一の長さのマイクロサテライト配列が検出された場合、被検植物は、根こぶ病抵抗性遺伝子（遺伝子座）を有するものと判定される。
【００３１】
本発明において根こぶ病抵抗性遺伝子を有するか否かの識別が可能なアブラナ科植物としては、例えば、ハクサイ、カブ等を挙げることができる。また、本発明の方法を実施するのに好ましい品種としては、例えば、飼料用カブ系統名Ｓｉｌｏｇａ（シロガ）由来の系統および品種等を挙げることができる。
【００３２】
また本発明は、本発明の識別方法により、根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体を選抜する方法を提供する。本方法により根こぶ病抵抗性遺伝子を有するアブラナ科植物個体を効率的かつ簡便に選抜することが可能である。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３４】
［実施例１］　アブラナ科植物根こぶ病の新規ＱＴＬを識別するためのマイクロサテライトマーカーの同定
罹病性親　’はくさい中間母本農７号’　に抵抗性親Ｇ００４を交雑し、そのＦ_１の自殖によって得られたＦ_２系統について、ＢＲＭＳ０８８、ＢＲＭＳ１７３、ＢＲＭＳ０９６およびＢＲＭＳ１００マーカーの分離を調査した。Ｆ_２の自殖により得られたＦ_３個体について、根こぶ病抵抗性の評価を行い、抵抗性親由来のＤＮＡマーカーを有しない個体の抵抗性程度を検定した。
【００３５】
抵抗性の評価には、２種類の根こぶ病菌、すなわち安濃菌と和歌山菌を用いた。直径９ｃｍのピートポットに根こぶ病菌を混入した園芸培土を入れて、独立したＦ_２系統を自家受粉し得られたＦ_３の種子を１系統ずつ、５〜８個を１つのピートポットに播種した。播種後、それぞれのピートポットを２０，０００ルックス１６時間明期、８時間暗期、気温２５度に調節された室内で管理した。播種から６週間後、根におけるこぶの発生程度により抵抗性程度を指標化した。指標化した数字は０，１，２，３であり、無病徴（抵抗性強）は０で、支根に１個の根こぶが発生する症状を１、支根に２個以上の根こぶが連続的に発生する症状を２、主根に根こぶが発生する症状を３で最も抵抗性が弱いことを示す（図１）。１系統について２個の反復を設け、検定試験を行った。植物体の根こぶ病発生程度を指標化し、１ピートポット毎に播種したＦ_３５〜８個体の値を平均しＦ_２の解析とした。
【００３６】
マーカー分離は以下のように実施した。Ｆ_２後代各系統の葉よりＤＮＡを常法、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８，　ｐ４３２１−４３２５，　１９８０）により抽出した。このＤＮＡ　２ｎｇを鋳型として、２００μＭ　ｄＮＴＰｓ、２．５ｐｍｏｌ　オリゴヌクレオチドプライマー（４種類、配列番号：５および６、あるいは７および８、あるいは９および１０、あるいは１１および１２）および１　ｕｎｉｔ　ｒＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を加え、１０μｌの反応液とし、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステムズ社）によりＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃１分後、９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分のＰＣＲサイクルを３５回繰り返し、伸長反応の補足のため７２℃で４分間とした。なお、ＢＲＭＳ１００のプライマーセットの場合には、アニーリング温度を６０℃から５０℃に変更した。
【００３７】
増幅産物は０．５ｍｇ／ｌ　のエチジウムブロミドを含む２．５％アガロースゲルにより分離、分析した。罹病性親に由来する断片長はそれぞれＢＲＭＳ０８８マーカーが２４３ｂｐ、ＢＲＭＳ１７３が２４４ｂｐ、ＢＲＭＳ０９６マーカーが１８９ｂｐ、ＢＲＭＳ１００マーカーが１２８ｂｐであるが、抵抗性親に由来するものはこれらとは異なる断片長であるため、抵抗性親と罹病性親を確認できる（図２および図３）。遺伝子型がホモである個体での増幅産物はどちらかの親由来の一種類で、一本のバンドとして検出され、ヘテロ個体は両親由来の２種類の増幅産物が２本のバンドとして検出される。表１に各ＤＮＡマーカーの遺伝様式を示した。
【００３８】
【表１】

【００３９】
抵抗性親（Ｇ００４）に由来するＤＮＡマーカーをｇ、罹病性親（ハクサイ中間母本農７号）に由来するＤＮＡマーカーをａで表した。すなわち、抵抗性親由来のマーカーをホモで有する場合をｇｇ、抵抗性親と罹病性親由来のマーカーを１個ずつへテロに有する場合をａｇ、罹病性親由来のマーカーをホモに有する場合をａａで表した。ＢＲＭＳ０８８、ＢＲＭＳ１７３マーカーの分離比が理論値１：２：１からはずれるものの、ＢＲＭＳ０９６と１００は理論値に合致した分離比を示し、これらのＤＮＡマーカーは後代に確実に遺伝することが明らかであった。表２にＢＲＭＳ０８８マーカーの遺伝子型を有する集団と安濃菌および和歌山菌に対する抵抗性程度（発病指数）との関係を、表３にＢＲＭＳ１７３マーカーの遺伝子型を有する集団と安濃菌および和歌山菌に対する抵抗性程度（発病指数）との関係を示した。
【００４０】
【表２】

【００４１】
【表３】

【００４２】
Ｆ_２集団９４系統を用いて、根こぶ病の接種検定を行ったところ、９４系統の発病指数の平均は、安濃菌で２．１８、和歌山菌で２．７３であった。９４系統の中で、抵抗性親由来のＢＲＭＳ０８８マーカーをヘテロに有する４７系統は１．８４で、さらにホモに有する９系統の平均は０．７４であった。
【００４３】
これらに対し、抵抗性由来のＢＲＭＳ０８８マーカーを有しない３８系統の発病指数の平均は、２．９４であった。また、抵抗性親由来のＢＲＭＳ１７３マーカーをヘテロに有する５０系統は１．８３で、さらにホモに有する８系統の平均は０．７４であった。
【００４４】
これらに対し、抵抗性由来のＢＲＭＳ０８８マーカーを有しない３６系統の発病指数の平均は、２．９９であり、ほぼすべての系統で根こぶ病菌による著しい被害を受けた。
【００４５】
実際栽培上は発病指数を２以下に抑えれば、経済栽培には支障がないと考えられるため、安濃菌に対しては抵抗性親由来のＢＲＭＳ０８８マーカーまたはＢＲＭＳ１７３を有する個体を選抜することで抵抗性の系統が得られることが明らかになった。ＢＲＭＳ０８８とＢＲＭＳ１７３はＫｕｇｉｎｕｋｉら（１９９７，　Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ　９８：　１４９−　１５４）によって考案された根こぶ病抵抗性用のＤＮＡマーカーＲＡ１２７５と連鎖関係にあり、２つのマーカーは同じ根こぶ病抵抗性のＱＴＬに連鎖していると考えられる。しかしＲＡ１２７５は優性マーカーであるため、抵抗性親由来のＤＮＡマーカーをホモに有する系統とヘテロに有する系統とを区別できない。９４系統の中で、発病指数が１未満の強度抵抗性個体の割合は、抵抗性親由来のＢＲＭＳ０８８マーカーをホモに有する９系統の中では７個体であるのに対し、ヘテロで有する系統では４７個体中４個体にすぎない。同様にＢＲＭＳ１７３マーカーでは、８系統中６個体で、ヘテロで有する系統では５０系統中５個体にすぎない。したがってＲＡ１２７５では強度抵抗性個体を高頻度で選抜することはできず、ＢＲＭＳ０８８またはＢＲＭＳ１７３を使用する優位性が確認できた。
【００４６】
一方、和歌山菌に対しては、抵抗性親由来のＢＲＭＳ０８８、ＢＲＭＳ１７３マーカーをホモに有しても発病指数が２．２８、２．３４であり、抵抗性の素材を選抜するには不十分であった。９４系統に別の集団２０系統を加えた合計１１４系統について和歌山菌についての抵抗性を調べた。表４および表５にＢＲＭＳ０８８とＢＲＭＳ０９６およびＢＲＭＳ１００の、表６および表７にＢＲＭＳ１７３とＢＲＭＳ０９６およびＢＲＭＳ１００マーカーの各遺伝子型を有する集団と和歌山菌に対する抵抗性程度（発病指数）との関係を示した。
【００４７】
【表４】

【００４８】
【表５】

【００４９】
【表６】

【００５０】
【表７】

【００５１】
全体の発病指数の平均は２．５６であり、抵抗性親由来のＤＮＡマーカーＢＲＭＳ０８８をヘテロでＢＲＭＳ０９６（またはＢＲＭＳ１００）をホモに有する２２系統は発病指数が２．０１となり、さらにＢＲＭＳ０８８とＢＲＭＳ０９６をホモに同時に有する７（ＢＲＭＳ１００では６）系統は発病指数が０．８０と著しく低下し、強度抵抗性を示した。
【００５２】
また抵抗性親由来のＢＲＭＳ０８８とＢＲＭＳ０９６の２つのマーカーを、両方もしくはどちらか一方を有しない５系統、つまりＢＲＭＳ０８８とＢＲＭＳ０９６の両方もしくはどちらかがａａタイプの発病指数は、それぞれ２．９４、２．９９、２．９１、２．９９、２．９８であった。
【００５３】
さらに抵抗性親由来のＤＮＡマーカーＢＲＭＳ１７３をヘテロでＢＲＭＳ０９６（またはＢＲＭＳ１００）をホモに有する２５系統は発病指数が２．００となり、さらにＢＲＭＳ１７３とＢＲＭＳ０９６をホモに同時に有する６（ＢＲＭＳ１００でも６）系統は発病指数が０．６４と著しく低下し、強度抵抗性を示した。
【００５４】
また抵抗性親由来のＢＲＭＳ１７３とＢＲＭＳ０９６の２つのマーカーを、両方もしくはどちらか一方を有しない４系統、つまりＢＲＭＳ０８８とＢＲＭＳ０９６の両方もしくはどちらかがａａタイプの発病指数は、それぞれ２．９４、２．９８、３．００、３．００、３．００であり、いずれも和歌山菌に対して罹病性であった。ＢＲＭＳ１００はＢＲＭＳ０９６と連鎖関係にあり、ＢＲＭＳ０９６とほぼ同じ効果を示した。以上のように抵抗性親由来のＢＲＭＳ０８８とＢＲＭＳ０９６またはＢＲＭＳ１００およびＢＲＭＳ１７３とＢＲＭＳ０９６またはＢＲＭＳ１００のＤＮＡマーカーをホモにもつ個体を選抜することによって、多犯性の和歌山菌に対して極めて選抜の効果が高かった。
【００５５】
これら４種のマーカーは、根こぶ病抵抗性主導遺伝子及び補足的に作用するＱＴＬに連鎖するものであり、かつ、アブラナ科植物の根こぶ病抵抗性の選抜マーカーとして極めて有効であることが示された。
【００５６】
なお本発明によるＤＮＡマーカーの選抜効果は、飼料用カブ系統名「Ｓｉｌｏｇａ」を由来とする系統を抵抗性親に用いた場合に有効である。「Ｓｉｌｏｇａ」を由来しない抵抗性親を用いた場合には、鎖長の異なるＤＮＡ断片が生じる場合がある。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、アブラナ科植物根こぶ病の新規ＱＴＬを識別するためのマイクロサテライトマーカーが提供され、単独または４つのマイクロサテライト遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、そのサイズを調べることで、抵抗性の強弱を簡便かつ精度高く判別することができる。この方法により抵抗性個体の選抜が容易になり、また、共優性マーカーの特性上、導入した抵抗性ＱＴＬの固定の判別が極めて容易になる。したがって、アブラナ科植物の根こぶ病抵抗性品種育成が大幅に効率化されることになる。
【００５８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】根こぶ病の発病程度を示した根の写真である。０：発病なし（抵抗性）、１、２、３：発病（罹病性）
【図２】各プライマーペアを用いてＰＣＲ後、増幅産物を２．５％アガロースゲルで分離した場合の泳動像（両側にＤＮＡマーカー、左より抵抗性親型、罹病性親型、ヘテロ型の各泳動パターン）写真である。
【図３】各プライマーペアを用いてＰＣＲ後、増幅産物を２．５％アガロースゲルで分離した場合の泳動像（両側にＤＮＡマーカー、左より抵抗性親型、罹病性親型、ヘテロ型の各泳動パターン）写真である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA marker used for selection of a clubroot resistant individual of a cruciferous plant and a selection method. More specifically, a synthetic oligonucleotide capable of detecting a specific microsatellite locus and a method for identifying a cruciferous plant having a clubroot resistance gene and selecting a clubroot resistant individual by DNA analysis using the synthetic oligonucleotide. About.
[0002]
[Prior art]
Clubroot is one of the most important soil diseases of cruciferous vegetables. Characteristic nodules are formed on roots infected with clubroot, inhibiting the absorption of nutrients and water, and eventually causing growth inhibition and yield reduction. The clubroot fungus can grow in the soil in the form of dormant spores for a long period of time, and once it occurs, it is extremely difficult to control it. Therefore, it can be said that the use of resistant varieties is extremely effective in avoiding this disease. However, resistance to clubroot disease indicates inheritance due to multiple factors (quantitative trait loci, QTL). Therefore, when trying to breed economic varieties by crossing using resistant breeding materials, it is difficult to accumulate traits for a long time. Although a DNA fragment linked to the main gene of this QTL has been identified (see Non-Patent Document 1), since this DNA fragment is a dominant marker that cannot identify a heterozygote, it is used as a DNA marker for selection of resistant individuals. Was not always effective. In addition, the resistance to clubroot fungi has not yet reached the level of resistance corresponding to a plurality of differentiated races, that is, resistance at a practical level. Therefore, identification of other QTLs involved in the resistance to this disease has been strongly desired in developing resistant varieties.
[0003]
On the other hand, in a breeding site, the use of a DNA marker linked to a trait is very effective in improving work efficiency. Examples of the DNA marker include RFLP (Restriction fragment length polymorphism), AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (Random sampled; However, only the RFLP and SSR markers are co-dominant markers, and the others are dominant markers. The RAPD marker which is a dominant marker linked to the clubroot resistance gene of Brassica rapa using a double haploid strain has already been known (see Patent Document 1). The co-dominant marker is capable of discriminating the genotype (homo / hetero) of a test individual, and is very effective in fixing the introduced trait in breeding. However, the RFLP marker has many problems in terms of working time and cost in equipment and the like, for example, it is necessary to isolate highly pure DNA, and the subsequent analysis is complicated. On the other hand, since the SSR marker is a PCR (polymerase chain reaction) based marker, it does not require highly pure DNA, and its operation is extremely simple and does not require sophisticated equipment. Furthermore, since the operation cost can be kept low, it can be said that it is the most excellent marker at present at the breeding site. However, there is no case where an SSR marker linked to a clubroot resistance gene has been developed.
[0004]
[Patent Document 1]
Japanese Patent No. 2730670
[0005]
[Non-patent document 1]
Kuginuki et al., "Euphytica", 1997, Vol. 98, p. 149-154
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a microsatellite marker linked to a novel QTL of clubroot resistance in cruciferous plants, and to provide a method for efficiently selecting a clubroot resistant individual using the marker. is there.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have focused on microsatellite sequences consisting of repeating sequences of short nucleotide units of 2 to several bases, and have isolated many microsatellite sequences from Chinese cabbage genomic DNA. By utilizing the base sequences on both sides of these microsatellite sequences, each microsatellite locus was converted into a marker that can be specifically amplified. Furthermore, a marker showing polymorphism between a diseased individual and a resistant individual is first selected from these markers, and then the phenotype of the present pathogen is separated using a progeny population of a resistant individual crossed with the diseased individual. The patterns and polymorphism distribution of the markers were investigated. As a result, the markers of BRMS088 (SEQ ID NO: 1), BRMS173 (SEQ ID NO: 2), BRMS096 (SEQ ID NO: 3) and BRMS100 (SEQ ID NO: 4) showed that the resistance from feed turnip (system name: Silloga) was The present inventors have found that they are linked to two clubroot-resistant QTLs derived from the sex parent G004, and have completed the present invention.
[0008]
The present invention provides synthetic oligonucleotide sequences capable of amplifying the microsatellite sequences described in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4, for example, SEQ ID NOs: 5 to 12, and uses DNA extracted from cruciferous plants as a template. A method for selecting a cruciferous plant individual having a resistance gene by investigating a difference (polymorphism) in the length of a microsatellite sequence amplified using the synthetic oligonucleotide, more specifically,
[1] a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4,
[2] a DNA comprising the microsatellite sequence according to any one of the following (a) to (d):
(A) The microsatellite sequence at positions 55 to 96 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(B) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, the microsatellite sequence at positions 150 to 164 or 227 to 241
(C) The microsatellite sequence at positions 468 to 530 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(D) The microsatellite sequence at positions 179 to 226 in the base sequence of SEQ ID NO: 4.
[3] a method for identifying a cruciferous plant individual having a clubroot resistance gene, which comprises detecting the DNA according to [1] or [2] by a PCR method;
[4] The identification method according to [3], including the following steps (i) to (iii):
(I) a step of amplifying a DNA region containing the microsatellite sequence according to any one of (a) to (d) of claim 1
(Ii) a step of separating the amplified DNA on a gel
(Iii) comparing the mobility of the separated DNA on a gel with a control
[5] a method for selecting a cruciferous plant individual having a clubroot resistance gene by the identification method according to [3] or [4],
[6] the method of any of [3] to [5], wherein the cruciferous plant is Chinese cabbage;
[7] A PCR primer used in the method according to [3] to [6], which amplifies a DNA region containing the microsatellite sequence according to any one of [2] to (a) to (d). A synthetic oligonucleotide for
[8] the synthetic oligonucleotide according to [7], comprising the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 5 to 12;
[9] a DNA amplified by a PCR method using the oligonucleotide of [7] or [8] as a primer and DNA extracted from a cruciferous plant as a template,
Is provided.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present inventors first extracted DNA from the developing leaves of the susceptible 'Hakusai middle mother's farming No. 7' and digested it with the restriction enzyme Sau3AI. After separating this by agarose gel electrophoresis, a 200 bp-1000 bp fragment was isolated and ligated to a vector, ZAP express (Stratagene) to prepare a genomic library. A genomic library was screened using 15 repeat sequences of 2 bases (GA or GT) or 3 bases (GCG) labeled with digoxigenin (DIG, Roche) as probes to isolate microsatellite clones. After determining the base sequences of these clones, two types of microsatellite-specific primers were designed for each clone based on the obtained sequence information (hereinafter sometimes referred to as microsatellite markers). Among these markers, a marker capable of amplifying the microsatellite locus was first selected by PCR using the DNA of 'Hakusai Nakamoto Nono 7' as a template. Next, a marker in which a polymorphism was found in the microsatellite sequence between the two types of the susceptible parent 'Hakusai Intermediate Mother Farm No. 7' and the resistant parent G004 was further selected.
[0010]
On the other hand, the susceptible parent 'Hakusai middle mother Honno 7' and the resistant parent G004 were crossed and ₂ And F ₃ The progeny population of the generation was obtained. These F ₃ In the progeny, a clubroot resistance test was performed, and the degree of resistance was indexed and evaluated. ₂ It was reduced as an evaluation value for each line of the generation. Furthermore, these F ₂ Using the DNA of the progeny population as a template and performing PCR using the markers selected above, F ₂ The separation of each marker (genotype) between groups and the resistance evaluation value were compared. As a result, microsatellite markers capable of amplifying SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4 in the sequence listing, BRMS088 (SEQ ID NOs: 5, 6), BRMS173 (SEQ ID NOs: 7, 8), BRMS096 (SEQ ID NO: 9) , 10) and BRMS100 (SEQ ID NOS: 11, 12), a high correlation was found between the genotype of each strain and the resistance evaluation value. Therefore, these markers were found to be very effective in efficiently selecting clubroot resistant individuals. By using these markers, cruciferous plants having the clubroot resistance gene can be easily identified.
[0011]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0012]
First, the present invention provides a method for identifying a cruciferous plant individual having a clubroot resistance gene, which comprises detecting a microsatellite sequence linked to QTL of the resistance gene.
[0013]
In a preferred embodiment of the present invention, DNA containing a microsatellite sequence linked to the QTL of the resistance gene is detected, and based on the difference in the length of the microsatellite sequence, the Brassicaceae family having a clubroot resistance gene is detected. The identification (judgment) of whether or not the individual is a plant is performed. The detection of the above DNA is not particularly limited as long as it can amplify the DNA, but it can be suitably carried out by a polymerase chain reaction (PCR) method. If the length of the microsatellite sequence in the DNA sequence used as a template for the PCR reaction differs, the length of the DNA fragment to be amplified also differs. Generally, this difference in amplified DNA fragment length can be observed as a difference in band pattern by electrophoresis.
[0014]
As the above-mentioned "DNA containing a microsatellite sequence" of the present invention, preferably, a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 or a DNA comprising the nucleotide sequence can be exemplified. The sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 4 include the following microsatellite sequences, respectively.
(A) The microsatellite sequence at positions 55 to 96 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(B) In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a microsatellite sequence at positions 150 to 164 or positions 227 to 241
(C) The microsatellite sequence at positions 468 to 530 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(D) The microsatellite sequence at positions 179 to 226 in the base sequence of SEQ ID NO: 4.
[0015]
In the present invention, identification of whether or not the individual is a cruciferous plant having a clubroot resistance gene is performed based on the difference in the length of the microsatellite sequence. It is not necessary to detect the entire DNA region described in any of them. That is, the DNA region to be detected is not particularly limited as long as it is a DNA region within a range in which the length of the microsatellite sequence can be checked. Therefore, for example, the method of the present invention can also be carried out by detecting a partial fragment DNA of the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 containing the microsatellite sequence. In addition, the microsatellite sequence, the DNA described in any of SEQ ID NOs: 1 to 4 including the sequence, and the DNA including the DNA are also included in the present invention.
[0016]
"PCR" in the above-described identification method of the present invention is carried out by using a primer set (forward primer and reverse primer) capable of amplifying the microsatellite sequence using DNA containing the microsatellite sequence as a template. Can be easily implemented.
[0017]
The present invention also provides a PCR primer used in the identification method of the present invention, which comprises a synthetic oligonucleotide for amplifying a DNA region containing a microsatellite sequence according to any one of the above (a) to (d). provide.
[0018]
The sequence of a primer oligonucleotide capable of amplifying a microsatellite sequence used in the present invention can be appropriately designed by those skilled in the art based on the sequence information of DNA serving as a template. More specifically, the following primers can be preferably exemplified, but the present invention is not particularly limited only to these primers. In the base sequence of the primer oligonucleotide exemplified below, for example, an oligonucleotide having a substitution mutation of about several bases at the 5 'end or an arbitrary base added to the 5' end. However, it is considered that it can be used as the primer of the present invention. Therefore, the synthetic oligonucleotide of the present invention is not particularly limited to a synthetic oligonucleotide having a base sequence described in any of the following SEQ ID NOS: 5 to 12, as long as it is a primer capable of amplifying the microsatellite sequence. Oligonucleotides containing the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 5 to 12, or oligonucleotides having mutations such as substitutions and additions in the sequence are also included in the present invention.
[0019]
・ Primer set for (a) microsatellite sequence amplification
Forward primer: 5′-tatcggtact gattcgctct tcaac-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: 5'-atcggttgttt atttgagagcagat-3 '(SEQ ID NO: 6) · The above (b) Primer set for amplifying microsatellite sequence
Forward primer: 5'- gaggatgcag ttgctgttgtt t-3 '(SEQ ID NO: 7)
Reverse primer: 5′-cttctttcgat ggattcaaga gaac (SEQ ID NO: 8)
-(C) Primer set for microsatellite sequence amplification
Forward primer: 5'-agtcgagatac tcgttcgtgt ctccc-3 '(SEQ ID NO: 9)
Reverse primer: 5'-tgaagaagga ttgaagctgttgtttg-3 '(SEQ ID NO: 10)
・ (D) Primer set for amplifying microsatellite sequence
Forward primer: 5'-ctcttgagaa tcagagagagattac-3 '(SEQ ID NO: 11)
Reverse primer: 5'-gactctcatt attcatct ctctc-3 '(SEQ ID NO: 12)
[0020]
The above-mentioned oligonucleotide of the present invention can be easily obtained by those skilled in the art, usually using a commercially available oligonucleotide synthesizer or a synthetic oligonucleotide contract service.
[0021]
Furthermore, the present invention also includes a DNA amplified by a PCR method using the oligonucleotide of the present invention as a primer and DNA extracted from a cruciferous plant as a template.
[0022]
In a preferred embodiment of the present invention, for example, it is carried out as follows. First, a DNA region containing the microsatellite sequence described in any of the above (a) to (d) is amplified (step (A)), and then the amplified DNA is separated on a gel (step (B)). Then, the mobility of the separated DNA on a gel is compared with a control (step (C)).
[0023]
In the above step (A), preferably, first, a DNA sample is prepared (DNA extraction) from the test cruciferous plant. The preparation of the DNA sample can be performed using, for example, leaves, roots, seeds, calli, leaf sheaths, cultured cells, and the like of the test plant, but is not particularly limited thereto. Extraction of DNA from these plants or plant cells is generally known to those skilled in the art, for example, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method (Murray and Thompson, Nucleic Acids Research 8, p. 4321-4325). , 1980). In addition, it is also possible to perform the identification method of the present invention by directly performing PCR using a cell lysate or the like without performing the DNA extraction treatment.
[0024]
The PCR in the present invention can be performed by those skilled in the art by appropriately selecting optimal conditions for the reaction conditions and the like based on experiments or experiences. Usually, PCR can be easily performed using a commercially available reagent kit containing a reaction solution and a thermostable polymerase, a commercially available PCR device, and the like.
[0025]
In the step (B), the separation of the DNA as a PCR amplification product on a gel can be usually performed by electrophoresis. Separation of a PCR-amplified DNA fragment by electrophoresis can be easily performed by those skilled in the art by appropriately determining the gel composition, voltage, migration time, and the like.
[0026]
In the step (C), the size of the separated DNA fragment is usually measured using a DNA fragment of a known size in advance (eg, a size marker) as a control. Based on the type of primer used and the measured DNA size, the presence or absence of the microsatellite sequence or the length of the microsatellite sequence in the amplified DNA can be detected.
[0027]
Further, the above steps (B) and (C) can be carried out by the following method. First, the amplified DNA is dissociated into single strands, and the dissociated single-stranded DNAs are separated on a non-denaturing gel. The mobility of the separated single-stranded DNA on the gel is then compared with a control. Examples of the method include a PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method.
[0028]
In the PCR-SSCP method, when a double-stranded DNA fragment is dissociated into single strands, each strand forms a unique higher-order structure depending on its base sequence. When the dissociated DNA strand is subjected to electrophoresis in a polyacrylamide gel containing no denaturing agent, the single-stranded DNA having the same length and complementary moves to a different position according to the difference in the respective higher-order structures. For example, the higher-order structure of the single-stranded DNA is changed by the difference in the length of the microsatellite sequence, and shows different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, the length of the microsatellite sequence present in the amplified DNA fragment can be detected by detecting the change in the mobility. In addition, when the amplification product has a restriction enzyme recognition site that causes a polymorphism, the amplification product is amplified by a PCR method, the amplification product is treated with a restriction enzyme, and then electrophoresis is performed (for example, a PCR-RFLP method). The present invention can also be carried out by the method. When dealing with many varieties / lines, it is conceivable that polymorphism due to length does not always occur. In this case, the method of the present invention can be carried out by suitably using the PCR-RFLP method.
[0029]
Further, based on the number of bands of the amplified DNA fragment, it is possible to evaluate whether or not the test plant individual has a clubroot resistance gene as a heterozygous or homozygous one. Usually, when one band is detected in the above step, it is determined to be “homo”, and when two bands are detected, it is determined to be “hetero”.
[0030]
In the present invention, when the length of the detected microsatellite sequence in the test plant DNA is the same as the length of the microsatellite sequence described in (a) to (d) above, the test plant is resistant to clubroot. It is determined to have a gene (locus). For example, when the identification method of the present invention is carried out using a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6, If a microsatellite sequence having the same length as the described microsatellite sequence is detected, the test plant is determined to have a clubroot resistance gene (locus).
[0031]
In the present invention, examples of cruciferous plants that can be identified as having a clubroot resistance gene include Chinese cabbage and turnip. Also, preferred varieties for carrying out the method of the present invention include, for example, strains and varieties derived from feed turnip line name Silloga.
[0032]
The present invention also provides a method for selecting a cruciferous plant individual having a clubroot resistance gene by the identification method of the present invention. By this method, it is possible to efficiently and easily select a cruciferous plant individual having the clubroot resistance gene.
[0033]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0034]
[Example 1] Identification of a microsatellite marker for identifying a novel QTL of cruciferous plant clubroot
Crossing resistant parent G004 with susceptible parent 'Hakusai middle mother Honno 7' ₁ F obtained by selfing ₂ Strains were examined for segregation of BRMS088, BRMS173, BRMS096 and BRMS100 markers. F ₂ F obtained by selfing ₃ Individuals were evaluated for clubroot resistance, and the degree of resistance of individuals without a DNA marker derived from the resistant parent was tested.
[0035]
Two types of clubroot fungi, namely Anno and Wakayama, were used for the evaluation of resistance. Put horticultural soil mixed with clubroot fungus into a 9 cm diameter peat pot, ₂ F obtained by self-pollinating the strain ₃ 5 to 8 seeds per line were sown in one peat pot. After sowing, each peat pot was managed in a room controlled at 20,000 lux, 16 hours light, 8 hours dark, and 25 ° C temperature. Six weeks after sowing, the degree of resistance was indexed based on the occurrence of bumps on the roots. The indexed numbers are 0, 1, 2, 3; no symptom (strong resistance) is 0; The symptom that occurs continuously is 2 and the symptom that a root bulge occurs is 3 and the resistance is the weakest (FIG. 1). Two lines were provided for one line, and a verification test was performed. Using the degree of root-knot disease occurrence of plants as an index, F seeded per pete pot ₃ Average the values of 5 to 8 individuals and F ₂ Analysis.
[0036]
Marker separation was performed as follows. F ₂ DNA was extracted from the leaves of each progeny line by a conventional method, for example, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method (Murray and Thompson, Nucleic Acids Research 8, p4321-4325, 1980). Using 2 ng of this DNA as a template, 200 μM dNTPs, 2.5 pmol oligonucleotide primers (4 types, SEQ ID NOS: 5 and 6, or 7 and 8, 9 and 10, or 11 and 12), and 1 unit rTaq polymerase (Takara) ) Was added to prepare a 10 μl reaction solution, and PCR was performed using GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems). The reaction conditions were as follows: PCR cycles were repeated 35 times at 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute, followed by 4 minutes at 72 ° C to supplement the extension reaction. In the case of the BRMS100 primer set, the annealing temperature was changed from 60 ° C to 50 ° C.
[0037]
The amplification products were separated and analyzed on a 2.5% agarose gel containing 0.5 mg / l ethidium bromide. The fragment lengths derived from the affected parent are 243 bp for the BRMS088 marker, 244 bp for the BRMS173, 189 bp for the BRMS096 marker, and 128 bp for the BRMS100 marker, respectively, since those derived from the resistant parent have different fragment lengths. Resistant and susceptible parents can be identified (FIGS. 2 and 3). Amplification products in individuals with homozygous genotypes are of one type from either parent and are detected as one band, and in hetero individuals, two types of amplification products from parents are detected as two bands . Table 1 shows the inheritance pattern of each DNA marker.
[0038]
[Table 1]

[0039]
The DNA marker derived from the resistant parent (G004) was represented by g, and the DNA marker derived from the susceptible parent (Chinese cabbage intermediate mother No. 7) was represented by a. That is, the case where the marker derived from the resistant parent is homozygous, the case where the marker derived from the resistant parent and the marker derived from the susceptible parent are heterozygously ag, the case where the marker derived from the diseased parent is homozygous. aa. Although the separation ratio of BRMS088 and BRMS173 deviates from the theoretical value of 1: 2: 1, BRMS096 and BRMS100 show a separation ratio that matches the theoretical value, and it is clear that these DNA markers are reliably inherited in progeny. . Table 2 shows the relationship between the population having the BRMS088 marker genotype and the degree of resistance (incidence index) to Anno and Wakayama fungi. Table 3 shows the population having the BRMS173 marker genotype and the resistance to the Anno and Wakayama fungi. The relationship with the degree (disease index) was shown.
[0040]
[Table 2]

[0041]
[Table 3]

[0042]
F ₂ When the inoculation test for clubroot disease was performed using 94 lines of the population, the average disease index of the 94 lines was 2.18 for Anno bacteria and 2.73 for Wakayama bacteria. Among the 94 lines, 47 lines heterozygously carrying the BRMS088 marker derived from the resistant parent were 1.84, and the average of 9 lines homozygous was 0.74.
[0043]
In contrast, the mean disease index of 38 lines without the resistance-derived BRMS088 marker was 2.94. In addition, the number of 50 lines having a BRMS173 marker heterozygously derived from a resistant parent was 1.83, and the average of 8 lines having a homozygous BRMS173 marker was 0.74.
[0044]
In contrast, the mean disease index of 36 lines without the resistance-derived BRMS088 marker was 2.99, and almost all lines were significantly damaged by the clubroot fungus.
[0045]
Actually, if the disease index is suppressed to 2 or less in economical cultivation, it is considered that economic cultivation will not be hindered. Therefore, resistance to Anno bacteria is selected by selecting individuals having the BRMS088 marker or BRMS173 derived from the resistant parent. It was found that sex lines could be obtained. BRMS088 and BRMS173 are linked to a DNA marker RA1275 for clubroot resistance devised by Kuginuki et al. (1997, Euphytica 98: 149-154), and the two markers are linked to the same clubroot-resistant QTL. it seems to do. However, since RA1275 is a dominant marker, it is not possible to distinguish between a line homologous to a DNA marker derived from a resistant parent and a line heterologous to the DNA marker. Among the 94 lines, the ratio of the strongly resistant individuals having an onset index of less than 1 was 7 individuals among the 9 lines homozygously having the BRMS088 marker derived from the resistant parent, whereas the ratio was 47 individuals among the lines having the heterozygous BRMS088 marker. Only four of the individuals. Similarly, the BRMS173 marker has only 6 individuals out of 8 lines, and the heterozygous line has only 5 individuals out of 50 lines. Therefore, it was not possible to select strength-resistant individuals with RA1275 at high frequency, and the superiority of using BRMS088 or BRMS173 was confirmed.
[0046]
On the other hand, against Wakayama fungi, the onset index is 2.28, 2.34 even when the BRMS088 and BRMS173 markers derived from the resistant parent are homozygous, which is insufficient for selecting resistant materials. there were. The resistance to Wakayama fungi was examined for a total of 114 strains obtained by adding another 20 strains to 94 strains. Tables 4 and 5 show the relationship between BRMS088, BRMS096, and BRMS100, and BRMS173, BRMS096, and BRMS100 marker genotypes and the degree of resistance to Wakayama fungi (disease index).
[0047]
[Table 4]

[0048]
[Table 5]

[0049]
[Table 6]

[0050]
[Table 7]

[0051]
The average of the overall disease index is 2.56. The 22 lines having the heterozygous DNA marker BRMS088 derived from the resistant parent and having the homologous BRMS096 (or BRMS100) have a disease index of 2.01, and the homozygous BRMS088 and BRMS096 are homozygous. 7 (6 in BRMS100) had a significantly reduced disease index of 0.80, indicating strength resistance.
[0052]
In addition, five lines that do not have both or one of the two markers BRMS088 and BRMS096 derived from the resistant parent, that is, the disease index of aa type in which both or either of BRMS088 and BRMS096 are aa-type are 2.94, 2. 99, 2.91, 2.99, 2.98.
[0053]
Furthermore, the 25 strains having the heterozygous DNA marker BRMS173 derived from the resistant parent and having the homologous BRMS096 (or BRMS100) have an onset index of 2.00, and the 6 strains having the homozygous homozygous BRMS173 and BRMS096 (even 6 the BRMS100) are diseased. The index was significantly reduced to 0.64, indicating strength resistance.
[0054]
In addition, the four markers without BRMS173 and / or BRMS096 derived from the resistant parent, ie, the aa-type onset index of 2.94, 2.A, for both or one of BRMS088 and BRMS096. 98, 3.00, 3.00, and 3.00, all of which were susceptible to Wakayama bacteria. BRMS100 was linked to BRMS096 and showed almost the same effect as BRMS096. As described above, by selecting individuals having homozygous DNA markers of BRMS088 and BRMS096 or BRMS100 and BRMS173 and BRMS096 or BRMS100 derived from the resistant parent, the effect of the selection was extremely high for the polygenic Wakayama fungus. .
[0055]
These four markers are linked to the clubroot resistance-initiating gene and the complementarily acting QTL, and have been shown to be extremely effective as selection markers for clubroot resistance in cruciferous plants. Was done.
[0056]
The effect of selecting a DNA marker according to the present invention is effective when a strain derived from the turnip line name “Siloga” for feed is used as a resistant parent. When a resistant parent not derived from "Siloga" is used, DNA fragments having different chain lengths may be generated.
[0057]
【The invention's effect】
According to the present invention, a microsatellite marker for identifying a novel QTL of cruciferous clubroot is provided. Amplification of a single or four microsatellite loci by PCR, and the size thereof is examined to determine the strength of resistance. Can be easily and accurately determined. This method facilitates selection of resistant individuals and, due to the characteristics of the co-dominant marker, makes it extremely easy to determine whether the introduced resistant QTL is fixed. Therefore, the breeding of clubroot resistant varieties of cruciferous plants will be greatly improved.
[0058]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a photograph of a root showing the onset of clubroot. 0: no disease (resistance), 1, 2, 3: disease (susceptibility)
[FIG. 2] Electrophoresis images of amplified products separated on a 2.5% agarose gel after PCR using each primer pair (DNA markers on both sides, resistant parent type, diseased parent type, hetero type from left) Each electrophoresis pattern) is a photograph.
FIG. 3 shows electrophoresis images of amplified products separated on a 2.5% agarose gel after PCR using each primer pair (DNA markers on both sides, resistant parent type, diseased parent type, hetero type from left) Each electrophoresis pattern) is a photograph.

Claims

A DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4.

A DNA comprising the microsatellite sequence according to any one of the following (a) to (d):
(A) the microsatellite sequence at positions 55 to 96 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1; (b) the microsatellite sequence at positions 150 to 164 or 227 to 241 in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 ( c) The microsatellite sequence at positions 468 to 530 in the base sequence described in SEQ ID NO: 3 (d) The microsatellite sequence at positions 179 to 226 in the base sequence described in SEQ ID NO: 4

A method for identifying a cruciferous plant individual having a clubroot resistance gene, wherein the DNA according to claim 1 or 2 is detected by a PCR method.

The identification method according to claim 3, comprising the following steps (i) to (iii).
(I) a step of amplifying a DNA region containing the microsatellite sequence according to any one of (a) to (d) of claim 1; (ii) a step of separating the amplified DNA on a gel; (iii) a separated DNA Of comparing the mobility of the gel on a gel with a control

A method for selecting a cruciferous plant individual having a clubroot resistance gene by the identification method according to claim 3 or 4.

The method according to any one of claims 3 to 5, wherein the cruciferous plant is Chinese cabbage.

A synthetic primer for amplifying a DNA region containing the microsatellite sequence according to any one of claims 2 to 6, which is a PCR primer used in the method according to claims 3 to 6. nucleotide.

The synthetic oligonucleotide according to claim 7, consisting of the base sequence of any of SEQ ID NOs: 5 to 12.

A DNA amplified by a PCR method using the oligonucleotide according to claim 7 or 8 as a primer and DNA extracted from a cruciferous plant as a template.