【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は試料中の物質の分析方法に関するものであり、とりわけ臨床検査分野において利用される。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中の成分を免疫学的に測定する方法は一般に行われている。標識リガンドを用いる酵素免疫測定法や有色粒子標識リガンドを用いるイムノクロマト法は汎用されている。通常の酵素免疫測定法では一つの測定対象物に対して一つの測定が行なわれる。一方、イムノクロマト法では、複数の測定対象物を一つの分析装置で個々のシグナルとして測定している（特開２０００−２９２４２７）方法が開示されている。一つの分析装置で複数の分析対象物を同時に測定しうる方法として、２種類の希土類金属キレート標識リガンドを用いる遅延蛍光免疫測定法による２項目同時測定法が実用化されている。これらの方法は、いずれもそれぞれの測定対象物に対して得られたシグナルをそれぞれ個別に測定している。
【０００３】臨床検査においては、測定対象物の個々の測定値が必要であることは当然であるが、なかには２項目の測定値の比が重要な項目もある。このような場合にはそれぞれの項目を個々に測定して、それぞれの測定値から比を算出している。そのような例として、ペプシノゲンＩ（ＰＧＩ）とペプシノゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）の比や遊離の前立腺特異抗原（ｆ−ＰＳＡ）と総前立腺特異抗原（ｔ−ＰＳＡ）の比などがある。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−２９２４２７号
【特許文献２】
特表平３−５００２４９号
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、複数の測定項目の存在比を一回の測定において、簡便に知る方法、さらには個々の濃度をも同時に測定しうる方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、公知の標識リガンドを用いる免疫化学手法を改良して、２種以上の測定項目を同時もしくは同一装置内で測定し、測定対象物のお互いの存在比を簡便に求める方法、さらには、存在比と測定対象物の量を同時に測定しうる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明は以下の構成よりなる。
１、分析対象物と特異的に結合しうるリガンドを分析対象物のそれぞれに対応した標識物質で標識した標識リガンドを用いて、混在する２種の成分を同一の分析装置で分析する方法であって、該標識リガンドの相互作用により生じた信号を分析対象物の存在比に対応させることを特徴とする分析方法。
２、標識物質が有色粒子であり、標識リガンドの相互作用により生じた信号が色調の変化である上記１に記載の方法。
３、分析対象物と特異的に結合しうるリガンドを標識した標識リガンドを用いるイムノクロマト法による、混在する２種の成分を同一の分析装置で分析する方法であって、分析対象物の少なくとも一方の量をイムノクロマト法における反応量として算出しうる機能及び予め設定した分析対象物の存在比を反映する機能を有した分析方法。
４、分析方法がイムノクロマト法である前記１及び２に記載の方法。
５、標識リガンドが有色粒子で標識されたリガンドである前記３に記載の方法。
６、上記１〜５に記載の方法を用いる検査薬及びキット。
【０００８】本発明の実施態様の例を挙げて本発明を詳細に説明する。イムノクロマト法を応用して、目視的に信号を確認できる金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等の粒子状物質に抗原もしくは抗体を標識した標識リガンドを用いる方法を例示する。測定対象とする物質ＡとＢを測定する場合、物質Ａに対する抗体またはそのフラグメントを例えば青色粒子で標識し、一方物質Ｂに対する抗体またはそのフラグメントについては例えば黄色粒子で標識する。その標識リガンドを混合して、試料と反応させ、イムノクロマト法で測定する。反応物捕獲部位でそれぞれの測定対象物を捕獲し、反応ラインを観察することによって物質の存否を判定する。上記の標識粒子の例では、反応ラインの色調が青であれば物質Ａが大半であり、逆に黄色であれば物質Ｂが大半であることを示し、ＡとＢがほぼ同量であれば緑の反応ラインが出現する。このように、物質ＡとＢの存在比によって、出現する反応ラインの色調が変化することを利用して、その色調を観察することにより存在比を求めることができる。
【０００９】本発明の別の実施態様例として、物質ＡとＢの存在比および物質Ａ又はＢの少なくともどちらか一方の量を測定する方法が例示される。物質Ａに対する抗体又はそのフラグメント及び物質Ｂに対する抗体又はそのフラグメントを着色ラッテクスのような標識物で標識した標識リガンドを用いる。なお、この場合、標識物は同一物質であっても良いし、別の物質であっても良い。両方の物質に対する標識リガンドを反応させ、反応物捕獲部位でそれぞれの測定対象物を捕獲し、反応ラインを観察することによって物質の存否を判定する。この際、反応物捕獲部位は測定対象物の濃度あるいは量に応じて反応ラインの長さ、太さあるいは数の変化として対応し得るようにする。例えば物質ＡとＢの存在比が３：１であれば、ＡとＢのラインの長さ、太さあるいは数が３：１に対応し得るようにしておく。
また物質Ａの量を測定しうるように反応ラインの長さ、太さあるいは数によってその量も算出しうるように設計しておく。
【００１０】本発明は例えばペプシノゲンＩとＩＩ（ＰＧＩ、ＰＧＩＩ）の存在比およびその量又は濃度の測定、遊離の前立腺特異抗原又は前立腺特異抗原複合体と総前立腺特異抗原の存在比及びそれらの量又は濃度の測定に適用される。本発明はこれらの測定項目に限られることなく、少なくとも物質の存在比を測定することに意義を有する項目の測定に適用しうる。
【００１１】臨床的に意義のあるＰＧＩとＰＧＩＩの存在比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３：１で表１に示したように緑色になるように設計しておけば、緑色よりも青色が強くなればＰＧＩ／ＰＧＩＩ＞３であると判定でき、黄緑色になればＰＧＩ／ＰＧＩＩ＜３であると判定できる。ＰＧＩとＰＧＩＩの比は萎縮性胃炎、胃癌のスクリーニング検査として有用であり、現在ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以下である場合には胃癌の可能性があると意義付けられている。従って、本発明により精密測定をすることなく、簡便短時間に臨床判断が容易にできる。
【００１２】本発明のもう一つの実施態様においては、ＰＧＩの濃度（量）とＰＧＩ／ＰＧＩＩ比の同時測定が可能である、例えば観察部位での発色が３つ目の部位までくればＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍｌ以上であるように設定しておき、一方ＰＧＩＩの方はＰＧＩの３分の１の感度に設定しておくと、臨床検体を測定したとき、ＰＧＩの発色を観察するだけで、ＰＧＩが７０ｎｇ／ｍｌ以上か以下かを判定できる。そして同時にＰＧＩＩの部位を観察することによって、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以上であるかどうかを判定できる。すなわち、ＰＧＩとＰＧＩＩの発色部位の数が同数であればＰＧＩ／ＰＧＩＩが３であり、ＰＧＩの数がＰＧＩＩよりも多ければ存在比が３以上であることがわかる。逆にＰＧＩＩの方が多ければＰＧＩ／ＰＧＩＩの比率は３以下であると判定できる（図３及び図４〜図４−６）。
【００１３】
【実施例】本発明の実施例を以下に示す。
【実施例１】ペプシノゲンＩ（ＰＧＩ）に対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．７Ｇ３、日本医学臨床検査研究所製）を青色着色ラテックス（粒径０．３５μｍ）に感作させ、標識抗ＰＧＩ抗体を調製した。調製した標識抗ＰＧＩ抗体はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、ＢＳＡ含有リン酸緩衝液中に分散させた。ペプシノゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）に対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．２Ｄ５、日本医学臨床検査研究所製）も黄色着色ラテックス（粒径０．３５μｍ）に感作させ、同様に標識抗ＰＧＩＩ抗体を調製した。両標識抗体を等量混合したものを標識抗体保持パッドに浸漬して、標識抗体保持パッドを調製した。
イムノクロマト用のニトロセルロースメンブラン上にペプシノゲンＩ（ＰＧＩ）に対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．２Ｆ５、日本医学臨床検査研究所製．）とペプシノゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）に対するモノクローナル抗体（． クローンＮｏ．１０Ｅ１１、日本医学臨床検査研究所製）の等量混合物を、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ社製のドッティングマシンを用いて反応物捕獲ラインを作成した。
これらの部材を組み合わせて図１に示すようなイムノクロマト法の装置を調製した。
【００１４】
【実施例２】精製したＰＧＩ抗原とＰＧＩＩ抗原をそれぞれ混合した試料を実施例１で調製した装置で分析した。その結果を表１に示した。またそのときの反応模式図を図２に示した。ＰＧＩとＰＧＩＩの存在比によって、反応ラインの色調が変化して観察され、予め色調と存在比の関係を求めておくことにより測定試料中の物質の存在比を求めることが可能であることがわかった。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【実施例３】ＰＧＩＩに対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．２Ｄ５、日本医学臨床検査研究所製）を実施例１で用いたＰＧＩ抗体を標識したものと同じ青色ラテックスで標識した。ＰＧＩ標識抗体とＰＧＩＩ標識抗体をそれぞれ別々に標識粒子保持パッドに保持させたものを用いて、図３に示すような複数の観察部位を有するイムノクロマト装置を調製した。本装置では、ＰＧＩ観察部位での発色が左から３つ目の部位までくればその濃度が７０ｎｇ／ｍｌ以上であるように設定しており、一方ＰＧＩＩの方はＰＧＩの約３分の１の感度に設定した。本装置を用いて以下に示す検体を測定した。その結果を表２に示した。
検体１；ＰＧＩ＝７５ｎｇ／ｍｌ， ＰＧＩＩ＝２０ｎｇ／ｍｌ
検体２；ＰＧＩ＝７５ｎｇ／ｍｌ， ＰＧＩＩ＝３５ｎｇ／ｍｌ
検体３；ＰＧＩ＝５５ｎｇ／ｍｌ， ＰＧＩＩ＝２０ｎｇ／ｍｌ
【００１７】
【表２】
【００１８】以上の結果、本発明の装置を用いてＰＧＩの濃度とＰＧＩとＰＧＩＩの存在比の両方が同時に測定できることがわかり、臨床応用に有用であることが判った。
【００１９】
【発明の効果】
本発明により、試料中に存在している複数の測定項目の存在比を一回の測定において、簡便に測定し、かつ同時に個々の濃度をも測定しうる方法が提供できる。
【００２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ測定用イムノクロマト法の構築図である。
【図２】反応結果を着色パターンで表した図である。
【図３】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ及びＰＧＩの量を同時測定するイムノクロマト装置の一例の図ある。
【図４】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ≒３、ＰＧＩ＜７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−２】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ≒３、ＰＧＩ≧７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−３】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＞３、ＰＧＩ＜７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−４】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＞３、ＰＧＩ≧７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−５】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＜３、ＰＧＩ＜７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−６】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＜３、ＰＧＩ≧７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【符号の説明】
１、試料添加パッド
２、標識パッド（抗ＰＧＩ抗体標識着色粒子及び抗ＰＧＩＩ抗体標識着色粒子保持部）
３、展開メンブラン
４、捕獲部位（抗ＰＧＩ抗体及び抗ＰＧＩＩ抗体固定部）
５、吸収パッド
６、ＰＧＩ単独の青色発色
７、ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＝３／１の緑色発色
８、ＰＧＩＩ単独の黄色発色
９、ＰＧＩ測定部
１０、ＰＧＩＩ測定部
１１、観察部位
１２、ライン状の反応部位
１３、円状の反応部位
１４、帯状の反応部位
１５、ＰＧＩ＝７０ｎｇ／ｍＬのライン[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for analyzing a substance in a sample, and is used particularly in a clinical test field.
[0002]
2. Description of the Related Art A method for immunologically measuring a component in a biological sample is generally used. Enzyme immunoassays using labeled ligands and immunochromatography using colored particle labeled ligands are widely used. In an ordinary enzyme immunoassay, one measurement is performed on one measurement object. On the other hand, in the immunochromatography method, a method is disclosed in which a plurality of measurement objects are measured as individual signals by one analyzer (JP-A-2000-292427). As a method capable of simultaneously measuring a plurality of analytes with one analyzer, a two-item simultaneous measurement method by delayed fluorescence immunoassay using two kinds of rare earth metal chelate-labeled ligands has been put to practical use. In each of these methods, a signal obtained for each measurement target is individually measured.
[0003] In clinical examinations, it is natural that individual measured values of an object to be measured are necessary, but there are some items in which the ratio of two measured values is important. In such a case, each item is measured individually, and the ratio is calculated from each measured value. Such examples include the ratio of pepsinogen I (PGI) to pepsinogen II (PGII) and the ratio of free prostate specific antigen (f-PSA) to total prostate specific antigen (t-PSA).
[0004]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-292427 [Patent Document 2]
Tokiohei 3-500249 [0005]
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for easily determining the abundance ratio of a plurality of measurement items in one measurement, and a method for simultaneously measuring individual concentrations.
[0006]
Means for Solving the Problems As a result of intensive studies, the present inventors have improved an immunochemical technique using a known labeled ligand and have measured two or more kinds of measurement items simultaneously or in the same apparatus. The present inventors have found a method for easily determining the abundance ratio of the objects to be measured and a method for simultaneously measuring the abundance ratio and the amount of the objects to be measured, and have completed the present invention.
[0007]
The present invention has the following configurations.
1. A method in which two types of mixed components are analyzed by the same analyzer using a labeled ligand in which a ligand capable of specifically binding to an analyte is labeled with a labeling substance corresponding to each of the analytes. A signal generated by the interaction of the labeled ligand with the abundance ratio of the analyte.
2. The method according to the above 1, wherein the labeling substance is a colored particle, and the signal generated by the interaction of the labeling ligand is a change in color tone.
3. A method of analyzing two kinds of mixed components with the same analyzer by an immunochromatography method using a labeled ligand labeled with a ligand capable of specifically binding to an analyte, wherein at least one of the analytes is used. An analytical method having a function of calculating the amount as a reaction amount in an immunochromatography method and a function of reflecting a predetermined ratio of an analyte present.
4. The method according to the above 1 and 2, wherein the analysis method is an immunochromatography method.
5. The method according to the above 3, wherein the labeled ligand is a ligand labeled with colored particles.
6, a test agent and a kit using the method described in 1 to 5 above.
The present invention will be described in detail with reference to examples of embodiments of the present invention. A method using a labeled ligand in which an antigen or an antibody is labeled on a particulate substance such as a metal colloid particle or a colored latex particle which can visually confirm a signal by applying the immunochromatography method is exemplified. When the substances A and B to be measured are measured, an antibody against the substance A or a fragment thereof is labeled with, for example, blue particles, while an antibody against the substance B or a fragment thereof is labeled with, for example, yellow particles. The labeled ligand is mixed, reacted with a sample, and measured by immunochromatography. Each measurement target is captured at the reactant capturing site, and the presence or absence of the substance is determined by observing the reaction line. In the above-described example of the labeled particles, if the color tone of the reaction line is blue, most of the substance A is used, and if the color of the reaction line is yellow, the substance B is mostly used. A green reaction line appears. As described above, by utilizing the fact that the color tone of the appearing reaction line changes depending on the existence ratio of the substances A and B, the existence ratio can be obtained by observing the color tone.
As another embodiment of the present invention, a method for measuring the abundance ratio of substances A and B and the amount of at least one of substances A and B is exemplified. A labeled ligand in which an antibody to substance A or a fragment thereof and an antibody to substance B or a fragment thereof are labeled with a label such as colored latex is used. In this case, the label may be the same substance or another substance. By reacting the labeled ligands for both substances, the respective analytes are captured at the reactant capture site, and the presence or absence of the substance is determined by observing the reaction line. At this time, the reactant capturing site is adapted to be able to respond to a change in the length, thickness or number of the reaction line according to the concentration or amount of the measurement object. For example, if the abundance ratio between the substances A and B is 3: 1, the length, thickness or number of the lines A and B should correspond to 3: 1.
In addition, a design is made so that the amount of the substance A can be calculated based on the length, thickness or number of the reaction line so that the amount can be measured.
The present invention relates to, for example, the determination of the abundance ratio and the amount or concentration of pepsinogens I and II (PGI, PGII), the abundance ratio of free prostate-specific antigen or prostate-specific antigen complex and total prostate-specific antigen, and their amounts. Or it is applied to measurement of concentration. The present invention is not limited to these measurement items, and can be applied to measurement of at least items that are significant in measuring the abundance ratio of a substance.
If the ratio of clinically significant PGI to PGII (PGI / PGII) is designed to be 3: 1 and green as shown in Table 1, blue becomes stronger than green. If PGI / PGII> 3, it can be determined that PGI / PGII <3. The ratio of PGI to PGII is useful as a screening test for atrophic gastritis and gastric cancer, and it is currently considered that if PGI / PGII is 3 or less, there is a possibility of gastric cancer. Therefore, clinical judgment can be easily performed in a short time without performing precise measurement according to the present invention.
In another embodiment of the present invention, simultaneous measurement of the PGI concentration (amount) and the PGI / PGII ratio is possible. For example, if the color development at the observation site reaches the third site, the PGI concentration can be measured. If the concentration is set to be 70 ng / ml or more, and the sensitivity of PGII is set to one third of that of PGI, when a clinical sample is measured, only the color development of PGI can be observed. , PGI is 70 ng / ml or more. By observing the PGII site at the same time, it can be determined whether PGI / PGII is 3 or more. That is, if the number of coloring sites of PGI and PGII is the same, PGI / PGII is 3, and if the number of PGI is larger than PGII, the existence ratio is 3 or more. Conversely, if there is more PGII, it can be determined that the ratio of PGI / PGII is 3 or less (FIG. 3 and FIGS. 4 to 4-6).
[0013]
Embodiments of the present invention will be described below.
Example 1 A monoclonal antibody against pepsinogen I (PGI) (clone No. 7G3, manufactured by Nippon Medical Laboratory) was sensitized to a blue colored latex (0.35 μm particle size) to prepare a labeled anti-PGI antibody. . The prepared labeled anti-PGI antibody was blocked with bovine serum albumin (BSA) and then dispersed in a phosphate buffer containing BSA. A monoclonal antibody against pepsinogen II (PGII) (clone No. 2D5, manufactured by Nippon Medical Laboratory) was also sensitized to a yellow-colored latex (particle size: 0.35 μm), and a labeled anti-PGII antibody was similarly prepared. A mixture of equal amounts of both labeled antibodies was immersed in a labeled antibody holding pad to prepare a labeled antibody holding pad.
Monoclonal antibody against pepsinogen I (PGI) (clone No. 2F5, manufactured by Nippon Medical Clinical Laboratory) and monoclonal antibody against pepsinogen II (PGII) (clone No. 10E11, nitrocellulose on nitrocellulose membrane for immunochromatography) An equal volume mixture (manufactured by Inspection Laboratory) was used to form a reactant capture line using a bio-dot company dotting machine.
By combining these members, an immunochromatographic apparatus as shown in FIG. 1 was prepared.
[0014]
Example 2 A sample prepared by mixing a purified PGI antigen and a PGII antigen was analyzed by the apparatus prepared in Example 1. The results are shown in Table 1. FIG. 2 shows a schematic diagram of the reaction at that time. The color tone of the reaction line changes and is observed depending on the abundance ratio of PGI and PGII, and it is found that the abundance ratio of the substance in the measurement sample can be obtained by obtaining the relationship between the hue and the abundance ratio in advance. Was.
[0015]
[Table 1]
[0016]
Example 3 A monoclonal antibody against PGII (clone No. 2D5, manufactured by Nippon Medical Laboratory) was labeled with the same blue latex as the PGI antibody used in Example 1. Using a PGI-labeled antibody and a PGII-labeled antibody separately held on labeled particle holding pads, an immunochromatography apparatus having a plurality of observation sites as shown in FIG. 3 was prepared. In this apparatus, if the color at the PGI observation site reaches the third site from the left, the concentration is set to be 70 ng / ml or more, while the PGII system is about one third of the PGI system. Sensitivity was set. The following samples were measured using this apparatus. The results are shown in Table 2.
Sample 1: PGI = 75 ng / ml, PGII = 20 ng / ml
Sample 2: PGI = 75 ng / ml, PGII = 35 ng / ml
Sample 3: PGI = 55 ng / ml, PGII = 20 ng / ml
[0017]
[Table 2]
As a result, it was found that both the concentration of PGI and the abundance ratio of PGI and PGII can be measured simultaneously using the apparatus of the present invention, which proved to be useful for clinical application.
[0019]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide a method in which the abundance ratio of a plurality of measurement items present in a sample can be easily measured in one measurement, and at the same time individual concentrations can be measured.
[0020]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a construction diagram of an immunochromatography method for PGI / PGII measurement.
FIG. 2 is a diagram showing a reaction result in a colored pattern.
FIG. 3 is a diagram of an example of an immunochromatographic apparatus for simultaneously measuring the amounts of PGI / PGII and PGI.
FIG. 4 is a view showing a reaction pattern when PGI / PGII ≒ 3 and PGI <70 ng / mL.
FIG. 4-2 is a diagram showing a reaction pattern when PGI / PGII ≒ 3 and PGI ≧ 70 ng / mL.
FIG. 4-3 is a diagram showing a reaction pattern when PGI / PGII> 3 and PGI <70 ng / mL.
FIG. 4-4 is a diagram showing a reaction pattern when PGI / PGII> 3 and PGI ≧ 70 ng / mL.
FIG. 4-5 is a diagram showing a reaction pattern when PGI / PGII <3 and PGI <70 ng / mL.
FIG. 4-6 is a diagram showing a reaction pattern when PGI / PGII <3 and PGI ≧ 70 ng / mL.
[Explanation of symbols]
1. Sample addition pad 2, Label pad (Anti-PGI antibody labeled colored particles and anti-PGII antibody labeled colored particle holding part)
3, deployment membrane 4, capture site (anti-PGI antibody and anti-PGII antibody fixed part)
5, absorption pad 6, blue color 7 of PGI only, green color 8 of PGI / PGII = 3/1, yellow color 9 of PGII only 9, PGI measurement unit 10, PGII measurement unit 11, observation site 12, line-like reaction Site 13, circular reaction site 14, band-shaped reaction site 15, PGI = 70 ng / mL line
