【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、精子数を測定するための精子数測定用試薬および精子数測定方法に関するものであり、更に詳細には、特に男性機能を測定するのに有用な精子数測定用試薬法と精子数測定方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年、環境ホルモンの影響で精子数の減少が報告されている。20年前に比べて精子数が半減しているとされている。しかしながら、この精子数を測定する適当な方法がなかった。
【0003】
したがって、本発明者等は、精子に含まれ、その精子数と比例するとされる乳酸脱水素酵素(LDH−C4)に注目して、これを測定することによって精子数を測定する精子数測定器具を始めて開発し、パワーチェッカー「ホタル」として発売してきた。しかしながら、このパワーチェッカー「ホタル」は、精液分取器と、3種類の試薬とからなり、用時にこれらの試薬を混合して測定しなければならなかった。しかも、その器具には、その取り扱い方が非常に面倒であるという欠点があった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、従来方法の欠点を解消して、用時に混合することなく精子数を簡単に測定することが出来る試薬と方法を鋭意研究した結果、精嚢由来で精液中に存在しかつ精子数と比例するとされる乳酸脱水素酵素に注目して、この乳酸脱水素酵素を測定することによって、用時に混合することなく、1種類の混合試薬からなる精子数測定用試薬を用いれば、この精子数測定用試薬に精液を混ぜるだけで非常に簡便に精子数を測定することができる精子数測定方法とを見出して、本発明を完成した。
従って、本発明は、複数の成分を混合した精子数測定用試薬と、この精子数測定用試薬に精液を混ぜることによって精子数を簡便に測定することが出来る精子数測定方法とを提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決する手段】
上記目的を達成するために、本発明は、別の態様として、精液中の乳酸脱水素酵素の量を測定することによって精子数を簡便に測定することが出来る1種類の試薬からなる精子数測定用試薬を提供する。
本発明に係る精子数測定用試薬は、乳酸塩と、酸化型NADと、ジアホラーゼと、テトラゾリウム塩と、pH緩衝剤とから構成されている。本発明の試薬は、これらの構成成分を1つの試薬として混合されたものである。
本発明に係る精子数測定用試薬の1つの好ましい態様としては、その精子数測定用試薬が全て固体からなることが好ましい。
また、本発明に係る精子数測定用試薬は、この試薬に精液が添加されたときのpHが、pH8以上、好ましくはpH8.3以上であるのがよい。
【0006】
本発明は、別の態様として、精液中の乳酸脱水素酵素の量を測定することによって精子数を簡便に測定することが出来る精子数測定方法を提供する。
本発明に係る精子数測定方法は、精嚢由来で精液中に存在し精子数と比例するとされる乳酸脱水素酵素の測定によって行なうものである。つまり、この方法は、精液中の乳酸脱水素酵素の量を、乳酸塩を基質としてピルビン酸を生成させ、酸化型NADから還元型NADを生じさせることによって測定することからなつている。こうして生じた還元型NADを利用して、還元型NADに依存してテトラゾリウム塩からジアホラーゼによってホルマザンを生じることによって、結果として乳酸脱水素酵素に比例して、つまり精子数に比例して強く発色することによって、精子数を測定することから構成されている。
本発明の方法において、その好ましい態様として、本発明に係る精子数測定用試薬を測定対象の精液に添加したときのpHは、pH8以上、好ましくはpH8.3以上にするのがよい。更に、乳酸を基質としてピルビン酸を生成させ、酸化型NADから還元型NADを生じさせる反応は、この条件下で行うのがよい。
【0007】
【発明の実施の態様】
本発明に係る精子数測定方法は、本発明に係る精子数測定用試薬を精液に添加して、乳酸塩を基質としてピルビン酸を生成させることによって、乳酸脱水素酵素に比例して、酸化型NADが還元型NADに還元される。このようにして生じた還元型NADを利用してかつ還元型NADに依存して、テトラゾリウム塩がジアホラーゼによってホルマザンを生成する。その結果として、乳酸脱水素酵素に比例して、つまり、精子数に比例して発色することになる。この発色強度を測定することによって、乳酸脱水素酵素の量、つまり、精子数を測定することができる。
また、本発明の方法においては、本発明の精子数測定用試薬は、精液を添加したときのpHが、pH8以上、好ましくはpH8.3以上になるのがよい。その上、この条件下で、本発明の測定方法を実施するのがよい。
更に、本発明においては、発色強度と、乳酸脱水素酵素の量、つまり、精子数との関連を示す標準比較図によって精子数を測定するようにすることができる。
【0008】
本発明に係る精子数測定用試薬は、乳酸塩と、酸化型NADと、ジアホラーゼと、テトラゾリウム塩と、精液を添加したとき弱アルカリを示すpH緩衝剤とから構成されている。この試薬は、これらの構成成分を1つの試薬として混合されたものがよい。
【0009】
本発明に係る精子数測定用試薬を構成する成分の1つである乳酸塩としては、例えば、乳酸亜鉛、乳酸カルシウムなどが挙げられるが、本発明において乳酸脱水素酵素の基質となりうるものであればいずれでもよい。かかる塩に限定されるものではなく、いずれの塩も使用することが出来る。また、本発明においては、精子数測定用試薬は全体として固体であるのが好ましいが、場合によっては、液体である乳酸自体も使用することが出来る。
本発明の精子数測定用試薬には、乳酸塩は、一般には、0.05g〜1g、好ましくは0.1g〜0.5gの割合で含まれるのがよい。
【0010】
本発明の精子数測定用試薬において別の1つの成分として使用される酸化型NAD(ニコチンアミドアデニンジヌクレヲチド)としては、βーNADが好ましいが、ジアホラーゼ並びに乳酸脱水素酵素のいずれに対しても補酵素として作用しうるものであれば純度、由来等は問わず、いずれでも使用することが出来る。この発明においては、酸化型NADは、乳酸塩を基質として生成したピルビン酸によって、乳酸脱水素酵素に比例して、還元型NADに還元されることになる。本発明の精子数測定用試薬に含まれる酸化型NAD量は、一般には、0.1mg〜10mg、好ましくは0.3mg〜3mgであるのがよい。
【0011】
本発明の精子数測定用試薬に更に含まれているジアホラーゼは、酸化型NADが還元されて生成した還元型NADに依存して、テトラゾリウム塩からホルマザンを生じる作用を有しているものである。本発明において使用されるジアホラーゼは、上記作用を満たすものであれば、その由来は問わずいずれも使用することができる。
本発明の精子数測定用試薬には、ジアホラーゼは、0.1〜100単位、好ましくは0.3〜6単位の割合で含まれているのがよい。
【0012】
また、本発明の精子数測定用試薬に使用されるテトラゾリウム塩は、pーヨードニトロテトラゾリウムバイオレットが好ましいが、ジアホラーゼの基質となって還元型NADに依存して発色物質を生じるものであればいずれの化合物であってもよい。
本発明の精子数測定用試薬に含有されるテトラゾリウム塩の量は、1mg〜100mg、好ましくは5mg〜20mgであるのがよい。
【0013】
本発明に係る精子数測定用試薬は、精液を添加したときのpHを、pH8以上、好ましくはpH8.3以上になるように調整するのがよく、そのために、前もってpH緩衝剤が添加されているのがよい。したがって、pH緩衝剤としては、中性から弱アルカリ性の緩衝剤であるのがよく、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとクエン酸との混合物が好ましいが、精液を加えた状態で、中性から弱アルカリ性で緩衝作用を発揮するものであればいずれの試薬でもよい。また、特に水溶性の固体であって、リンゴ酸、コハク酸等などの固形有機酸を使用することもできる。
本発明において好ましいpH緩衝剤の1つである、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン/クエン酸の混合液の場合には、それぞれの使用量は、トリスヒドロキシアミノメタンが0.05〜1g、好ましくは0.1から0.3gであって、クエン酸量は、精液が添加されて水溶液となったときpHが8〜8.5の弱アルカリ性を示すように添加するのがよい。
【0014】
こうして得られた本発明に係る精子数測定用試薬は、一般的に固型状なので、保存形態もしくは商品の形態としては、例えば、粉末、顆粒、錠剤、スティック、ゼリー状等のいずれの形態でもよい。特に、ゼリー状の場合には、コンドームの頭部に塗布したり、貼り付けたりすることもできる。また、粉末、顆粒、錠剤、スティック等の形態の場合にも、コンドーム中に添加することによって使用することができる。
【0015】
本発明に係る精子数測定用試薬は、精液に接触されることによって、精液中に精子が十分に存在すれば、つまり、約1億個/ml程度の正常数の精子が存在していれば、約10から15分後にはバイオレットに発色する。一方、精子数が1000万個/ml以下と通常の1/10以下では殆ど発色しない。つまり、発色の強度は、精子数に一般的に直線的に比例するので、これによって精子数の概数を測定することができることになる。
【0016】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実験例
本発明に係る精子数測定用試薬を、下記成分を混合して調製した。なお、下記に示す量は、20回分の量である。
乳酸亜鉛を2gと、酸化型NADとしてβーNADを10mgと、ジアホラーゼを12単位と、テトラゾリウム塩としてpーヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを24mgと、弱アルカリ緩衝剤としてトリスヒドロキシメチルアミノメタン/クエン酸の混合物を、トリスヒドロキシアミノメタンを4g、クエン酸を2gほど磨り潰して混合した。この混合物を20個に分けた。
この混合物1個を、平均的な精子濃度(精子約1億個/ml)に該当する4000シグマ単位/mlの乳酸脱水素酵素に添加したところ、15分後にきれいなバイオレットに発色した。
【0017】
実施例1
実験例で使用した混合物1回分の量に、健常者の精液(精子約1億個/ml)を添加したところ、15分後にきれいなバイオレットに発色した。
【0018】
実施例2
実験例で使用した混合物1回分の量に、極端に精子数が少ない精液(精子数約100万/ml)を添加したところ、30分経過してもほとんど発色は認められなかった。
【0019】
【発明の効果】
従来の精子数測定方法では、3種類の試薬を用時に混合することが必要であって、取り扱いに不便であった。本発明に係る精子数測定方法ならびに精子数測定用試薬は、複数の成分を1種類に混合している上に、用時に混合することなしに、精液を接触させるまたは添加するだけで、精子数の概数を測定することができる極めて簡便な精子数測定方法ならびに精子数測定用試薬である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a sperm count measuring reagent and a sperm count measuring method for measuring sperm count, and more particularly to a sperm count measuring reagent and sperm count particularly useful for measuring male function. It relates to a measuring method.
[0002]
[Prior art]
In recent years, a decrease in sperm count has been reported due to the effects of environmental hormones. It is said that the number of sperm is halved compared to 20 years ago. However, there was no suitable method for measuring this sperm count.
[0003]
Therefore, the present inventors pay attention to lactate dehydrogenase (LDH-C4) which is contained in sperm and is considered to be proportional to the number of spermatozoa, and measure the number of spermatozoa by measuring this. Was developed for the first time and released as a power checker "Firefly". However, this power checker "Firefly" is composed of a semen fractionator and three types of reagents, and these reagents must be mixed and measured at the time of use. Moreover, the device has a drawback that its handling is very troublesome.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present inventors have solved the drawbacks of the conventional method, and as a result of intensive research on a reagent and a method capable of easily measuring the number of sperm without mixing at the time of use, the present inventors have found that there is a presence in the semen derived from the seminal vesicle. By focusing on lactate dehydrogenase, which is considered to be proportional to sperm count, and by measuring this lactate dehydrogenase, a sperm count measurement reagent consisting of a single mixed reagent can be used without mixing at the time of use. For example, the present inventors have found a method for measuring the number of spermatozoa which can very easily measure the number of spermatozoa simply by mixing semen with the reagent for measuring the number of spermatozoa, and completed the present invention.
Accordingly, the present invention provides a reagent for measuring sperm count in which a plurality of components are mixed, and a method for measuring sperm count that can easily measure sperm count by mixing semen with the reagent for measuring sperm count. With the goal.
[0005]
[Means to solve the problem]
In order to achieve the above object, as another aspect, the present invention provides a method for measuring the number of spermatozoa comprising one kind of reagent that can easily measure the number of spermatozoa by measuring the amount of lactate dehydrogenase in semen. Provide reagents for use.
The reagent for measuring sperm count according to the present invention comprises lactate, oxidized NAD, diaphorase, tetrazolium salt, and a pH buffer. The reagent of the present invention is a mixture of these components as one reagent.
In one preferred embodiment of the reagent for measuring sperm count according to the present invention, it is preferable that the reagent for measuring sperm count be entirely solid.
In the reagent for measuring sperm count according to the present invention, the pH when semen is added to the reagent is preferably pH 8 or more, preferably pH 8.3 or more.
[0006]
The present invention provides, as another aspect, a method for measuring the number of spermatozoa, which can easily measure the number of spermatozoa by measuring the amount of lactate dehydrogenase in semen.
The method for measuring the number of spermatozoa according to the present invention is carried out by measuring lactate dehydrogenase which is derived from the seminal vesicle and is present in the semen and is proportional to the number of spermatozoa. That is, this method consists in measuring the amount of lactate dehydrogenase in semen by generating pyruvic acid using lactate as a substrate and generating reduced NAD from oxidized NAD. Utilizing the reduced NAD thus generated, the formazan is generated from the tetrazolium salt by diaphorase depending on the reduced NAD, and as a result, the color develops strongly in proportion to lactate dehydrogenase, that is, in proportion to the number of sperm. It consists of measuring the sperm count.
In a preferred embodiment of the method of the present invention, the pH when the sperm count measuring reagent according to the present invention is added to the semen to be measured is pH 8 or higher, preferably pH 8.3 or higher. Further, the reaction of generating pyruvic acid using lactic acid as a substrate and generating reduced NAD from oxidized NAD is preferably performed under these conditions.
[0007]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
The method for measuring sperm count according to the present invention is characterized in that the reagent for measuring sperm count according to the present invention is added to semen, and pyruvate is generated using lactate as a substrate. NAD is reduced to reduced NAD. Utilizing and depending on the reduced NAD thus produced, the tetrazolium salt forms formazan by diaphorase. As a result, the color develops in proportion to the lactate dehydrogenase, that is, in proportion to the sperm count. By measuring the color intensity, the amount of lactate dehydrogenase, that is, the number of sperm can be measured.
In the method of the present invention, the pH of the reagent for measuring sperm count of the present invention when semen is added is preferably pH 8 or more, preferably pH 8.3 or more. In addition, the measurement method of the present invention is preferably performed under these conditions.
Further, in the present invention, the number of spermatozoa can be measured by a standard comparison chart showing the relationship between the coloring intensity and the amount of lactate dehydrogenase, that is, the number of spermatozoa.
[0008]
The reagent for measuring sperm count according to the present invention comprises lactate, oxidized NAD, diaphorase, tetrazolium salt, and a pH buffer which shows a weak alkali when semen is added. This reagent is preferably a mixture of these components as one reagent.
[0009]
Lactate, which is one of the components constituting the reagent for measuring sperm count according to the present invention, includes, for example, zinc lactate, calcium lactate, etc., provided that it can be a substrate for lactate dehydrogenase in the present invention. Any may be used. It is not limited to such salts, and any salts can be used. In the present invention, the reagent for measuring sperm count is preferably solid as a whole, but in some cases, lactic acid itself, which is liquid, can also be used.
In the reagent for measuring sperm count of the present invention, lactate is generally contained at a ratio of 0.05 g to 1 g, preferably 0.1 g to 0.5 g.
[0010]
As the oxidized NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) used as another component in the reagent for measuring sperm count of the present invention, β-NAD is preferred, but it is preferred for diaphorase and lactate dehydrogenase. Can be used irrespective of purity, origin, etc., as long as they can act as a coenzyme. In the present invention, oxidized NAD is reduced to reduced NAD in proportion to lactate dehydrogenase by pyruvate generated using lactate as a substrate. The amount of oxidized NAD contained in the reagent for measuring sperm count of the present invention is generally 0.1 mg to 10 mg, preferably 0.3 mg to 3 mg.
[0011]
The diaphorase further contained in the reagent for measuring sperm count of the present invention has an action of generating formazan from a tetrazolium salt depending on reduced NAD generated by reduction of oxidized NAD. The diaphorase used in the present invention can be used regardless of its origin as long as it satisfies the above-mentioned effects.
The reagent for measuring sperm count of the present invention contains diaphorase in a ratio of 0.1 to 100 units, preferably 0.3 to 6 units.
[0012]
Further, the tetrazolium salt used in the reagent for measuring sperm count of the present invention is preferably p-iodonitrotetrazolium violet, but any one that becomes a diaphorase substrate and produces a color-forming substance depending on reduced NAD can be used. May be a compound of the formula:
The amount of the tetrazolium salt contained in the reagent for measuring sperm count of the present invention is 1 mg to 100 mg, preferably 5 mg to 20 mg.
[0013]
The reagent for measuring sperm count according to the present invention is preferably adjusted so that the pH when semen is added is adjusted to pH 8 or higher, preferably pH 8.3 or higher. For this purpose, a pH buffer is added in advance. Good to be. Therefore, the pH buffer is preferably a neutral to weakly alkaline buffer, for example, a mixture of trishydroxymethylaminomethane and citric acid is preferable, but a neutral to weak buffer is added with semen. Any reagent may be used as long as it exhibits an alkaline buffering action. In addition, solid organic acids such as malic acid and succinic acid, which are water-soluble solids, can also be used.
In the case of a mixed solution of trishydroxymethylaminomethane / citric acid, which is one of the preferred pH buffers in the present invention, the amount of each used is 0.05 to 1 g of trishydroxyaminomethane, preferably, The amount of citric acid is 0.1 to 0.3 g, and the amount of citric acid is preferably added so that when the semen is added to form an aqueous solution, the pH is 8 to 8.5, indicating weak alkalinity.
[0014]
The reagent for measuring sperm count according to the present invention thus obtained is generally in a solid form, and thus, in a storage form or a commercial form, for example, in any form such as powder, granules, tablets, sticks, and jellies. Good. In particular, in the case of a jelly-like shape, it can be applied or affixed to the head of a condom. Also, powders, granules, tablets, sticks and the like can be used by adding them to condoms.
[0015]
The reagent for measuring sperm count according to the present invention can be used as long as the sperm is sufficiently present in the semen by contact with the semen, that is, the sperm has a normal number of about 100 million / ml. After about 10 to 15 minutes, a violet color develops. On the other hand, when the number of spermatozoa is 10,000,000 or less / ml, which is 1/10 or less of the ordinary number, almost no color is formed. That is, since the intensity of color development is generally linearly proportional to the number of spermatozoa, an approximate number of spermatozoa can be measured.
[0016]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Experimental Example A sperm count measuring reagent according to the present invention was prepared by mixing the following components. In addition, the amount shown below is an amount for 20 times.
2 g of zinc lactate, 10 mg of β-NAD as oxidized NAD, 12 units of diaphorase, 24 mg of p-iodonitrotetrazolium violet as a tetrazolium salt, and trishydroxymethylaminomethane / citric acid as a weak alkaline buffer The mixture was triturated with 4 g of trishydroxyaminomethane and 2 g of citric acid and mixed. This mixture was divided into 20 pieces.
One of this mixture was added to 4000 sigma units / ml lactate dehydrogenase corresponding to the average sperm concentration (approximately 100 million sperm / ml), and after 15 minutes, the color developed into a clear violet.
[0017]
Example 1
When the semen (about 100 million sperm / ml) of a healthy person was added to the amount of one mixture used in the experimental example, a clear violet color was formed after 15 minutes.
[0018]
Example 2
When sperm having an extremely small number of sperm (approximately 1 million sperm / ml) was added to the amount of one mixture used in the experimental example, almost no color development was observed even after 30 minutes.
[0019]
【The invention's effect】
In the conventional method for measuring sperm count, it is necessary to mix three types of reagents at the time of use, which is inconvenient to handle. The method for measuring sperm count and the reagent for measuring sperm count according to the present invention are characterized in that a plurality of components are mixed into one kind, and the sperm count is simply added by contacting or adding semen without mixing at the time of use. This is an extremely simple method for measuring the number of spermatozoa and a reagent for measuring the number of spermatozoa, which can measure the approximate number of sperm.