JP2004129605A - クルーズトリパノソーマのフラビン蛋白質とそれを用いた駆虫薬スクリーニング方法と診断薬 - Google Patents

Abstract

【課題】シャーガス病の病原体であるクルーズトリパノソーマの駆虫薬をスクリーニングし、シャーガス病感染を診断する方法を提供する。
【解決手段】クルーズトリパノソーマに特異的なフラビン蛋白質ＴｃＯＹＥを用いて、クルーズトリパノソーマに有効な駆虫薬をスクリーニングする。さらに、ＴｃＯＹＥの遺伝子配列や抗体を用いて、クルーズトリパノソーマ感染を診断する。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、現在有効な治療法の無いクルーズトリパノソーマ感染症（シャーガス病）に対する、有効な駆虫薬の開発と簡便で特異性の高い診断法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、シャーガス病の病原体であるクルーズトリパノソーマに存在するフラビン蛋白質ＴｃＯＹＥ、および、その遺伝子組換え蛋白質を利用して、クルーズトリパノソーマに有効な駆虫薬を開発し、その薬効物質の代謝速度（分解活性）を試験する方法に関するものである。さらに、ＴｃＯＹＥの遺伝子配列や抗体を用いて、クルーズトリパノソーマ感染を簡便、且つ、特異的に診断する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
シャーガス病は、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）による寄生虫感染病である（世界保健機構，　Ｗｅｅｋｌｙ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．　Ｒｅｓ．　６５：　２５７−２６４，　１９９０；Ｃｏｕｒａ　Ｊ．　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，　１８：１７１−１７６，　２００２；　Ｔｅｉｘｅｉｒａ，　Ｍ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，　１８：２６２−２６８，　２００２）。この原虫はヒト以外にもイヌ、ネコ、アルマジロなど種々の動物に感染しており、アメリカ合衆国の多くの州、および中南米全域に分布している。ヒトの感染は主としてテキサス以南にみられ、中南米１８カ国で報告されている。患者総数は１，６００万〜１，８００万人と概算され、毎年２１，０００人が死亡し、３０万人の新たな患者が発生している。そして、２００万〜３００万人の慢性期の感染患者が存在し、感染の危険性地域に住む人口は１億２０００万人にのぼる。
【０００３】
ヒトの血中に存在するクルーズトリパノソーマは、大きなキネトプラストを持ち１８〜２２μｍの体長でＣ字型に彎曲した虫体の錐鞭毛期型であり、分裂や増殖はしない。ところが、筋肉、肝臓、脾臓、心臓などの細胞内では、直径２〜４μｍのやや楕円形で大きなキネトプラストを有する無鞭毛期型となり、２分裂で増殖する。この無鞭毛期型は上鞭毛期型や前鞭毛期型にもなるが最終的には錐鞭毛期型になる。これが媒介者のサシガメに吸われると、その体内で無鞭毛期型を経て発育終末トリパノソーマ型となり糞の中に現れる。昆虫の体内で発育するのに約１０日を要する。
【０００４】
媒介者となるサシガメは比較的大きな昆虫で多くの種類が知られているが、アルゼンチンなど南米の南部に分布するＴｒｉａｔｏｍａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、南米の北部および中米に分布するＲｈｏｄｎｉｕｓ　ｐｒｏｌｉｘｕｓ、ブラジルのアカモンサシガメ　（Ｐａｎｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｍｅｇｉｓｔｕｓ）などの種が重要である。これらの昆虫に刺されると激しい痛痒があり、ヒトが刺し口を掻くとき、皮膚上に排出した昆虫の糞の中のトリパノソーマが傷口にすり込まれて感染する。サシガメは人家内に出没し、夜間吸血する。雌雄の成虫、若虫、幼虫とも媒介者となる。
【０００５】
昆虫に刺されてクルーズトリパノソーマに感染すると、その部位にｃｈａｇｏｍａと呼ばれる赤い瘤ができる。その後１〜２週間の潜伏期を経て発病する。急性症状は普通小児にみられる。高熱、発疹、リンパ節炎、肝脾腫大、顔面とくに片側性のＲｏｍａｎａ徴候という眼瞼浮腫、心筋炎、髄膜脳炎などを起こし、２〜４週間の経過で死亡する例もある。急性期を脱した小児は慢性紀に移行するが、成人は初めから慢性の経過をとることが多い。慢性期の主症状は心筋炎、心肥大、巨大結腸などである。
【０００６】
シャーガス病の診断は、上記の特徴的な諸症状に注意することから始まり、血液やリンパ節穿刺などの塗抹・ギムザ染色標本を用いた原虫の形態学的検出、合成培地などを用いた原虫培養検査法、採取材料をラットやマウスなどに注射しその体内で増殖させる動物接種法、無感染サシガメに患者の血液を吸わせ２週間後に昆虫の腸管内で増殖した原虫を検索する媒介体診断法、あるいは、皮内反応、補体結合反応、蛍光抗体法などの免疫学的診断法が広く用いられている。しかし、いずれの方法も熟練を要し、操作が煩雑であり、感度や特異性の点で問題がある。
【０００７】
シャーガス病の治療にはニフルティモックスやベンズニダゾールが用いられてきた（非特許文献１〜３参照）。しかし、これらの薬剤は、感染初期のみに有効であり（非特許文献４参照）、その作用点も活性酸素などのラジカルが関与することが示唆されている以外は不明である（Ｂｏｖｅｒｉｓ，　Ａ．　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．，１７５：４３１−４３９，　１９７８；　Ｂｏｖｅｒｉｓ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｍｐ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　６１Ｃ：３２８−３２９，　１９７８；　Ｄｏｃａｍｐｏ，　Ｒ．　＆　Ｓｔｏｐｐａｎｉ，　Ａ．　Ｏ．，　Ａｒｃｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，　１９７：３１７−３２１，　１９７９；　Ｖｉｏｄｅ，　Ｃ．　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　５７：５４９−５５７，　１９９９）。しかも、副作用が強く、発ガン性を持つ。そして、抗マラリア薬であるプリマキンも多少効果があるとされているが、他のトリパノソーマ症やリーシュマニア症に有効な薬剤はシャーガス病には無効であり、クルーズトリパノソーマに対するワクチンは開発されていない。つまり、現在、シャーガス病に真に有効な医薬剤は皆無である。従って、シャーガス病に対する薬剤開発のための新たな標的分子の探索が世界的に求められている（世界保健機構，　ＴＤＲ　ｎｅｗｓ　６７：　１５　，　２００２）。
【０００８】
一方、我々は、マラリア原虫やアフリカ睡眠病の病原体であるブルーシトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｉ）などの寄生性原虫が、睡眠誘発作用や血管拡張作用、免疫抑制作用を持つプロスタグランジン（ＰＧ）をアラキドン酸から生合成する代謝系を持ち、これらの原虫のＰＧ合成系は哺乳類の酵素（シクロオキシゲナーゼ）の阻害剤には反応しないこと、さらに、これらの原虫が宿主における寄生感染を持続させるためにＰＧを利用している可能性を報告してきた（Ｋｕｂａｔａ　Ｂ．　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１８８：　１１９７−１２０２，　１９９８；　Ｋｕｂａｔａ　Ｂ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９２：　１３２７−１３３７，　２０００）。そして、ブルーシトリパノソーマの可溶性画分から、各種のＰＧの共通前駆体であるプロスタグランジンＨ_２（ＰＧＨ_２）をプロスタグランジンＦ_{２ α}（ＰＧＦ_{２ α}）に還元するトリパノソーマＰＧＦ合成酵素（ＴｂＰＧＦＳ）を精製して、その遺伝子とｃＤＮＡをクローニングして、ＴｂＰＧＦＳがアルドケト還元酵素遺伝子族に属することを証明した（Ｋｕｂａｔａ　Ｂ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９２：　１３２７−１３３７，　２０００）。しかし、細胞内寄生体をつくるクルーズトリパノソーマが、感染経路が異なり分類学的にも異なるマラリア原虫やブルーシトリパノソーマと同様に、ＰＧ生合成系を持つか否かは不明であった。
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｏｃａｍｐｏ，　Ｒ．　＆　Ｍｏｒｅｎｏ，　Ｓ．　Ｎ．　Ｓ．，　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　４５巻、ｐ２４７１−２４７６，　１９８６年
【非特許文献２】Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，　Ｇ．　Ｂ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５巻、ｐ５３７４−５３７８，　１９８８年
【非特許文献３】Ｄｏｃａｍｐｏ，　Ｒ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，　７３巻、ｐ１−２７，　１９９０年
【非特許文献４】Ｂｒａｇａ　Ｍ．　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｒｅｖ．　Ｉｎｓｔ．　Ｍｅｄ．　ｔｒｏｐ．　Ｓ．　Ｐａｕｌｏ，　４２巻、ｐ１５７−１６１，　２０００年
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はシャーガス病に対する薬剤開発の新たな標的分子を提供し、クルーズトリパノソーマ感染症の治療薬のスクリーニング法や診断薬を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために鋭意研究を行ない、次のような知見を得たことに基いて本発明を完成させた。
１）クルーズトリパノソーマもプロスタグランジン（ＰＧ）をアラキドン酸から生合成する代謝系を持ち、この原虫のＰＧ合成系は哺乳類の酵素（シクロオキシゲナーゼ）の阻害剤で阻害されない。クルーズトリパノソーマもブルーシトリパノソーマと同様に宿主における寄生感染を持続させるためにＰＧを利用している可能性が高い。
２）クルーズトリパノソーマの可溶性画分に、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下にＰＧＨ_２をＰＧＦ_{２ α}に還元する酵素活性が存在し、その活性はトリパノソーマＰＧＦ合成酵素（ＴｂＰＧＦＳ）に対する抗体で吸収されない。この酵素活性は、ブルーシトリパノソーマやリーシュマニアなどの他の寄生原虫、および、ヒトを含む哺乳動物には存在せず、クルーズトリパノソーマに特異的な酵素活性であると考えられる。
３）クルーズトリパノソーマ可溶性画分より均一に精製したＰＧＨ_２−ＰＧＦ_{２ α}還元酵素は、当モルのＦＭＮを含むフラビン蛋白質である。
４）その蛋白質のｃＤＮＡは、１，１４０塩基対の蛋白質翻訳領域を持ち、３７９アミノ酸残基からなる分子量４２，２６０の蛋白質をコードしている。
５）その予想アミノ酸配列に基づく相同性検索から、この酵素は、動物には存在しない旧黄色酵素（Ｏｌｄ　ｙｅｌｌｏｗ　ｅｎｚｙｍｅ、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ）遺伝子族に属する。従って、この酵素をＴｃＯＹＥと命名した。
６）得られたｃＤＮＡを用いて大腸菌で発現させ大量精製した遺伝子組換え型のＴｃＯＹＥは、クルーズトリパノソーマの可溶性画分より精製した酵素と同程度の比活性のＰＧＨ_２−ＰＧＦ_{２ α}還元酵素活性を示し、嫌気性条件下で、過酸化水素や過酸化ブチル、さらに、メナディオン、ベータ・ラパコン、ニフルティモックス、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドなどのトリパノソーマに対して致死性の化合物の還元反応を触媒する。
７）ＴｃＯＹＥは、メナディオンやベータ・ラパコンなどのナフトキノン化合物を１電子還元してセミキノンラジカルに変換する。一方、ニフルティモックス、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドを基質とする場合は２電子還元を行なってラジカルは産生しない。
８）ＴｃＯＹＥに対するポリクローナル抗体は、クルーズトリパノソーマの可溶性画分に存在するＰＧＨ_２−ＰＧＦ_{２ α}還元酵素活性、メナディオン、ベータ・ラパコン、ニフルティモックス、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドなどの化合物の還元酵素活性を、ほぼ完全に免疫沈降させる。
【００１２】
ＴｃＯＹＥは、ブルーシトリパノソーマやリーシュマニアなどの他の寄生原虫、および、ヒトを含む哺乳動物には存在しないので、クルーズトリパノソーマに特異的な駆虫剤の開発の良い標的になる。そして、遺伝子組換え型のＴｃＯＹＥを用いた酵素反応によるスクリーニングでは、１電子還元を受けてラジカルを発生させる化合物はクルーズトリパノソーマに対する駆虫効果が期待され、２電子還元を受ける化合物はクルーズトリパノソーマにより容易に分解されることが予想できる。
さらに、ＴｃＯＹＥに対する抗体を用いた免疫学的な手法や、ＴｃＯＹＥ遺伝子のヌクレオチド配列を利用したＲＴ−ＰＣＲ法などの分子生物学的な手法を用いたＴｃＯＹＥ蛋白質と遺伝子の検出は、クルーズトリパノソーマ感染症に対する特異性の高い簡便な診断法の開発に応用できる。
【００１３】
本発明は先ず、クルーズトリパノソーマに由来する、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下にプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_{２ α}に還元する酵素活性を有するフラビン蛋白質（ＴｃＯＹＥ）に関する。
本発明はまた、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の組換え蛋白質に関する。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質（以下で「ＴｃＯＹＥ変異体」と呼ぶことがある）、
（ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の断片からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質（以下で「ＴｃＯＹＥ断片」と呼ぶことがある）。
【００１４】
この蛋白質（ＴｃＯＹＥ）は以下のような性質を有する。
（１）当モルのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含み、分子量は約４２０００である。
（２）ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの存在下にＰＧＨ_２をＰＧＦ_{２ α}に還元する酵素活性を有する。
（３）過酸化水素、過酸化ブチル、メナディオン、ベータ・ラパコン、４−ニトロキノリン−４−オキシド、ニフルティモックス、フェナジンメソサルフェイト（５−メチル−フェナジウム・メチル・サルフェイト）、メヴィノリン（２β，６α−ジメチル−８α−（２−メチル−１−オキソブトキシ）−メヴィニックアシドラクトン）、１２−オキソ・フィトディエノイックアシッド（４−オキソ−５β−（２Ｚ−ペンテニル）−２−シクロペンテン−１β−オクタノイックアシド）、９−オキソ−１０Ｅ，　１２Ｚ−オクタデカディエノイックアシッド、エコナゾル（１−〔２−（［４−クロロフェニル］メトキシ）−２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル−１Ｈ−イミダゾール）〕等も還元する
（４）還元は基質が１電子還元を受けラジカルを発生する場合、及び２電子還元を受けラジカルを発生しない場合がある。
（５）ＰＧＨ_２をＰＧＦ_{２ α}に還元するその酵素活性は抗ＴｃＯＹＥ抗体で完全に吸収される。
（６）ＰＧＨ_２をＰＧＦ_{２ α}に還元するその酵素活性は抗ＴｂＰＧＦＳ抗体で吸収されない。
【００１５】
本発明者はクルーズトリパノソーマから蛋白質ＴｃＯＹＥをコードするｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。該ｃＤＮＡは配列番号１の塩基配列を有する。従ってＴｃＯＹＥは配列番号２の推定アミノ酸配列を有する。
この蛋白質（ＴｃＯＹＥ）はクルーズトリパノソーマから単離することにより製造することもできるが、遺伝子組換え技術を用いて製造することが好ましい。
【００１６】
本発明の蛋白質の製造に原核生物を用い得る。本発明の蛋白質の製造に適した原核生物としては、大腸菌Ｋ１２株２９４等の大腸菌、枯草菌等のバチルス属、Ｓａｌｍｏｎｅｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　及び　Ｓｅｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ等の腸内細菌、種々のシュードモナス属、及びストレプトマイセス属等を挙げることができる。
【００１７】
原核生物での遺伝子の発現を制御するのに適当なプロモーター配列としては、βラクタマーゼ、ラクトース系、アルカリホスファターゼ、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系等がある。ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターもまた適する。一般的にその塩基配列が公知の他の細菌性プロモーターも必要ないずれかの制限部位を提供するリンカー又はアダプターを用いて本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに連結し得る。
本明細書で用いる「遺伝子」という用語は、核酸配列を有し、上に記載した配列を有するいずれかの分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを言う。
【００１８】
本発明は、本発明による核酸分子を有するベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子操作で従来用いられる他のベクターにも関する。当業者に周知の方法を用いて様々なプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）　Ｎ．Ｙ．　及び　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｎ．Ｙ．　（１９８９），　（１９９４）　に記載の技術を参照。本発明に従い好ましく用いられるプラスミド及びベクターには当業者に周知のものが含まれる。
【００１９】
好ましい態様では、ベクター中に存在する核酸分子を原核又は真核細胞中で遺伝子を発現させることができるコントロール配列に結合する。
「コントロール配列」という用語は、それらが結合するコード配列を発現させるに必要な制御ＤＮＡ配列を言う。そのようなコントロール配列の性質は、宿主生物により異なる。原核生物では、コントロール配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物ではコントロール配列は一般にプロモーター、ターミネーター及びある場合にはトランスアクチベーター又は転写因子を含む。「コントロール配列」という用語は最小でもその存在が発現に必要なすべての成分を含むことを意図し、更なる有用な成分をも含んでもよい。
「作動可能に結合した」という用語は、該成分がそれらの意図され方法で作用することを可能にする関係にある位置を言う。コード配列に「作動可能に結合した」コントロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合する条件下で達成されるような方法で結合される。コントロール配列がプロモーターである場合には、２本鎖核酸が好ましく用いられることは当業者に自明である。
従って本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択した宿主細胞を形質転換し、選択した宿主細胞中でコード配列を発現させるため用いることができる構築物である。発現ベクターは例えばクローニング、バイナリーベクター又はインテグレイティングベクターであり得る。発現は好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核及び／又は真核細胞中での発現を確実にする調節要素は当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは通常転写の開始を確実にするプロモーター、及び場合により転写の終了及び転写物の安定化を保証するポリＡシグナルを通常含む。一般的に用いられるプロモーターは、ポリユビキチンプロモーター、及びアクチンプロモーターである。更なる調節要素は転写エンハンサーを含みうる。原核宿主細胞での発現を可能にする可能な調節要素は、例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるＰ_Ｌ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターであり、真核宿主細胞での発現を可能にする調節要素の例は、酵母におけるＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター。哺乳動物及び他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−，ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハサー又はグロビンイントロンであるＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１，ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）等の適当な発現ベクターが当業者に知られている。該タンパク質を発現させるのに用い得る別の発現システムは昆虫システムである。そのようなシステムの１つにおいて、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて　Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　細胞又は　Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅ中で外来遺伝子を発現させる。本発明の遺伝子のコード配列をポリヘドリン遺伝子等のウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置いてもよい。該コード配列を首尾よく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子が非活性になり、コートタンパク質を欠いた組換えウイルスが得られるであろう。その組換えウイルスを用いて、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　細胞又は　Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａに感染させ、その中で本発明のタンパク質を発現させる（Ｓｍｉｔｈ，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　４６　（１９８３），　５８４；　Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９１　（１９９４），　３２２４−３２２７）。有利には本発明の上記ベクターは選択可能なマーカーを含む。
【００２０】
本発明はさらに核酸配列が宿主細胞にとって外来である、上記のベクター又は本発明の遺伝子を含む宿主細胞に関する。
「外来」とは核酸分子が宿主細胞に関して異種であるか（これは異なった遺伝的背景を有する細胞又は生物に由来することを意味する）、或いは宿主細胞に関しては同種であるが、該核酸分子の天然に存在する対応物と異なる遺伝的環境にあることを意味する。これは、核酸分子が宿主細胞に関して同種であるなら、それは該宿主細胞のゲノムの天然の位置にはないこと、特に異なる遺伝子に取り囲まれていることを意味する。この場合、核酸分子はそれ自身のプロモーターの支配下にあるか、又は異種のプロモーターの支配下にあってもよい。宿主細胞中に存在する本発明によるベクター又は遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよく、染色体外にある形で保持されていてもよい。これに関し、本発明の遺伝子はホモロガスな組換えにより変異体遺伝子を回復し、又は創出するのに用いてもよい（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ編，　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｓｌｌｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ，　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　（１９９４））。
従って、本発明は本発明のベクター又は遺伝子を含む宿主細胞に関する。
宿主細胞は（古）細菌、昆虫、菌類、植物、又は動物細胞等のいずれの原核又は真核細胞でありうる。好ましい菌類細胞は、例えば　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　属の細胞、特に　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　の細胞である。
「原核」と言う用語は、本発明の蛋白質の発現のためにＤＮＡ又はＲＮＡで形質転換又はトランスフェクトされ得るすべての細菌を含むことを意図する。原核宿主は、例えばＥ．　ｃｏｌｉ、　Ｓ．　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、及び　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　等のグラム陽性及びグラム陰性細菌を含み得る。「真核」と言う用語は、酵母、高等植物、昆虫、そして好ましくは哺乳動物細胞を含むことを意味する。組換え製造方法に用いる宿主によって、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はグリコシル化されるかもしれないし、グリコシル化されないかもしれない。本発明の蛋白質は、最初のメチオニンアミノ酸残基を有していても、有していなくてもよい。当業者に一般的に知られたいずれかの技術を用いて本発明の遺伝子を用いて宿主を形質転換又はトランスフェクトすることができる。更に、融合し、機能的に結合した遺伝子の調製方法及びそれらを例えば哺乳動物及び細菌中で発現させる方法は当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ，　１９８９）。
【００２１】
本発明はまた以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質をコードする遺伝子に関する。
（ａ）クルーズトリパノソーマに由来する、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの存在下にプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_{２ α}に還元する酵素活性を有するフラビン蛋白質ＴｃＯＹＥ
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
（ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の断片からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質
１態様によれば配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡよりなる。遺伝コードの縮重により多数の塩基配列が存在しうる。
【００２２】
本発明はさらに、
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質、又は
（ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の断片からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質、
に対する抗体にも関する。
【００２３】
これらの蛋白質を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。
本発明の配列に対応する蛋白質に対して生成される抗体は、蛋白質を動物に直接注入することにより、または蛋白質を動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。そのようにして得られた抗ＴｃＯＹＥ抗体は、ＴｃＯＹＥの自体に結合し、ＰＧＨ_２−ＰＧＦ_２α還元酵素活性を完全に吸収する。この方法では、蛋白質の断片のみをコードする配列さえも、完全な天然の蛋白質を結合する抗体を製造するのに使用することができる。
モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７−９６頁において）が含まれる。
【００２４】
本発明はクルーズトリパノソーマ感染の駆虫薬のスクリーニング方法であって、
（ｉ）蛋白質ＴｃＯＹＥ及びプロスタグランジンＨ_２を準備し、
（ｉｉ）ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ存在下にこれらと候補化合物を接触させ、
（ｉｉｉ）プロスタグランジンＨ_２のプロスタグランジンＦ_２αへの還元が阻害されるか否かを調べる、
ことを含む方法に関する。
【００２５】
反応は例えば以下のように行う。好気的条件下での反応は、ＮＡＤＰＨ産生系（１００μＭ　ＮＡＤＰ，　１００　μＭグルコース６リン酸，　１　ｕｎｉｔのグルコース６リン酸脱水素酵素）、ＴｃＯＹＥ、阻害剤を含む１００ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００　μＭ　［１−^１４Ｃ］ＰＧＨ_２溶液（２．０４Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ；アセトン、ＤＭＳＯあるいはジメチルエーテル・ジエチレングリコール溶液）１μｌを加え、３７℃２分間、反応を行なう。嫌気的条件下での反応は、反応液を５分間アルゴンガスで置換したのち、１００　μＭ　ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを加え、ＰＧＨ_２溶液１μｌを加えた後、アルゴンガス中で３７℃２分間、反応を行なう。
−２０℃に冷却した反応停止液（ジエチルエーテル：メタノール：２Ｍクエン酸（３０：４：１混液））２５０μｌと過剰量の無水硫酸ナトリウムを加えて反応を停止し、同時に、残った基質（［１−^１４Ｃ］ＰＧＨ_２）と酵素反応生成物（［１−^１４Ｃ］ＰＧＦ_{２ α}）をエーテルに抽出する。低温室内でエーテル層の一部（約５０μｌ）をシリカゲル薄層（メルク社製）に塗布し、−２０℃の冷凍庫内で薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ジエチルエーテル：メタノール：酢酸（９０：２：１混液））を行なう。展開後、イメージアナライザーＦＬ２０００（フジフォトフィルム）を用いて、薄層板のオートラジオグラフィーを取り、基質と生成物の比率を求めて酵素活性を計算する。
非標識ＰＧＨ_２を用いた場合には、反応後の基質と生成物をＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー；Ｗａｔｅｒｓ　Ａｌｌｉａｎｃｅ　ＬＣ−ＭＳ　ｓｙｓｔｅｍ，　２６９０　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｏｄｕｌｅ，　９９６　ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ，　ＺＱ４０００　ｍａｓｓ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ；　Ｉｎｅｒｔｓｉｌ−ＯＤＳ３　ｃｏｌｕｍｎ）を用いて分離定量を行ない、同様に、基質と生成物の比率を求めて酵素活性を計算する。
【００２６】
還元が阻害されるか否かは、阻害剤の存在下と非存在下で上記の酵素反応を行ない、阻害剤による反応速度の低下の有無を調べる。上記のようにクルーズトリパノソーマは宿主における寄生感染を持続させるためにプロスタグランジンを利用している可能性が高いのでＴｃＯＹＥの阻害剤はクルーズトリパノソーマの宿主における寄生感染を阻止するのに使用できる可能性がある。
【００２７】
本発明はまたクルーズトリパノソーマ感染の駆虫薬のスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ存在下にＴｃＯＹＥ蛋白質と候補化合物を接触させ、（ｉｉ）該候補化合物が該蛋白質による１電子還元によりラジカルを発生するか否かを測定する
ことを含む方法に関する。
【００２８】
ＴｃＯＹＥと基質候補化合物を含む１００ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを５分間アルゴンガスで置換して嫌気的条件にする。その後、反応液に１００　μＭ　ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを加え、３７℃の嫌気的条件下で反応を行ない、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度の減少で追跡する。
１電子還元によりラジカルを発生するか否かは次のようにして測定する。ＴｃＯＹＥと基質候補化合物を含む５ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌを５分間アルゴンガスで置換して嫌気的条件にする。その後、反応液に１０ｍＭ　ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを加え、２５℃あるいは３７度の嫌気的条件下で３分間の反応を行なう。その反応液の一部をＥｌｅｃｔｒｏｎ　ｓｐｉｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ測定装置（ＪＥＯＬ　Ｘ−ｂａｎｄ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で分析して、ラジカルの産生の有無を測定する。測定条件や分析方法は、以下の論文に記載されている。発生したラジカルは酸素と反応して、スーパーオキサイドアニオンラジカル（Ｍｏｒｅｎｏ　Ｓ．　Ｎ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５９：　６２９８−６３０５，　１９８４）を産生してクルーズトリパノソーマを殺虫すると考えられる。
【００２９】
本発明はさらにクルーズトリパノソーマ感染の診断方法であって、
（ｉ）検体又は検体抽出物を上記の抗ＴｃＯＹＥ抗体と接触させて、
（ｉｉ）抗原／抗体複合体が生成するか否かを測定する
ことを含む方法に関する。
【００３０】
検体としてはトリパノソーマ・クルージーが感染した可能性のある患者より採取した血液、筋肉組織の生検試料、脳脊髄液などの体液などを診断に用いることができる。「検体抽出物」とは上記検体から抽出した蛋白質、ＤＮＡ，又はＲＮＡ等をいう。
上記の検体を低浸透圧の緩衝液と反応させて、感染したトリパノソーマ・クルージーからＴｃＯＹＥを抽出する。その抽出液を抗ＴｃＯＹＥ抗体と反応させて、抗原抗体複合体が形成されるか否かを調べる。
又、組織切片や塗沫標本を抗ＴｃＯＹＥ抗体と反応させ、適当な蛍光物質または酵素標識二次抗体と反応させて、トリパノソーマ・クルージーの局在を可視化することもできる。
抗原／抗体複合体の検出には、通常のウェスタンブロット分析や、固定化抗体を用いたＥＬＩＳＡ、あるいは、ラテックス凝集法などを用いることができる。組織切片や塗沫標本での検出には、一般に多用されている免疫組織化学染色の方法（酵素抗体染色や蛍光抗体染色）を用いる。
【００３１】
本発明はさらに、クルーズトリパノソーマ感染の診断方法であって、
（ｉ）検体又は検体抽出物をＴｃＯＹＥをコードする遺伝子又はその断片と接触させ、
（ｉｉ）両者がハイブリダイズするか否かを調べる
ことを含む方法に関する。
【００３２】
上記の検体よりＤＮＡを抽出して、各種の制限酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ナイロン膜に転写する。その転写膜を、放射性同位元素やジゴキシゲニン標識したＴｃＯＹＥのｃＤＮＡ又はＲＮＡプローブと反応させ、プローブが結合する遺伝子の存在の有無を調べる（サザンブロット法）。或いは、上記の検体より抽出したＲＮＡを用いて、同様の方法により、ＴｃＯＹＥのｍＲＮＡの存在の有無を調べる（ノザンブロット法）。
組織切片や塗沫標本でのＴｃＯＹＥ遺伝子やｍＲＮＡの検出には、放射性同位元素やジゴキシゲニン標識したＴｃＯＹＥのｃＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いたｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いる。
【００３３】
本発明はさらに、クルーズトリパノソーマ感染の診断方法であって、
（ｉ）検体から回収したＤＮＡ、あるいは検体中のｍＲＮＡから逆転写酵素により合成したｃＤＮＡを準備し、
（ｉｉ）このＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１のＴｃＯＹＥのｃＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列をセンスプライマーとアンチセンスプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を行い、
（ｉｉｉ）ＴｃＯＹＥのｃＤＮＡが増幅されるか否かを調べる、
ことを含む方法に関する。
【００３４】
例えば、ＴｃＯＹＥのｃＤＮＡに含まれるセンスプライマー（例えば、５’−ＡＴＧＧＣＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣ−３’）（配列番号８）とアンチセンスプライマー（例えば、５’−ＴＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＣＧＴＣＧＧＧＴＡ−３’）　（配列番号９）を使用して、トリパノソーマ・クルージーが感染した少量の全血、筋肉組織、脳脊髄液などの体液から回収したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、ＴｃＯＹＥのｃＤＮＡが増幅されるか否かを調べる。ＰＣＲ法の条件は、例えば、ＤＮＡ変性９５℃５分の反応を１サイクル、増幅反応としてＤＮＡ変性９５℃１分、プライマーの結合５６℃３０秒、ＤＮＡポリメラーゼのよる伸長反応７２℃１分の反応を３０サイクル行う。
【００３５】
以下に本発明を実施例により更に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではないことは勿論である。
【実施例】
【００３６】
実施例 １
クルーズトリパノソーマに存在するプロスタグランジン合成系
昆虫体内での増殖型（エピマスチゴート）のクルーズトリパノソーマＹ_ＮＩＨ株（国立感染症研究所（東京都新宿区戸山１−２３−１）より入手）は、常法（Ｎｏｚａｋｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７６：６５１６−６５２３，　２００１）により合成培地を用いて培養した。得られた原虫を低浸透圧処理により破壊し、アラキドン酸と反応させた後、産生されるＰＧを有機溶媒で抽出し、ＨＰＬＣにより分離精製した後、市販の測定キットを用いて定量する（Ｋｕｂａｔａ　Ｂ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１８８：　１１９７−１２０２，　１９９８）と、クルーズトリパノソーマの粗抽出液は、ＰＧＤ_２、ＰＧＥ_２、ＰＧＦ_{２ α}を活発に産生することがわかった（図１参照）。これらのＰＧの産生は、１００℃Ｃ２０分の熱処理で完全に消失するが、哺乳類でのＰＧ産生を完全に抑制する３μＭアスピリンや４２μＭインドメタシンでは全く影響されない。
【００３７】
実施例２
クルーズトリパノソーマに存在するプロスタグランジン Ｈ _２ − Ｆ _{２ α} 還元酵素活性
４０μＭ［１−^１４Ｃ］−ＰＧＨ_２を、アルゴンガス置換を行なった０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、嫌気条件下に５００　μＭ　ＮＡＤＰＨと共に３７℃、２分間反応させる。クルーズトリパノソーマの可溶性画分を加えると、ＰＧＨ_２はほぼ全てＰＧＦ_{２ α}に変換される（図２参照）。しかし、熱変性させたクルーズトリパノソーマの可溶性画分を用いたり、ＮＡＤＰＨを加えないと、この変換反応は起こらない。
【００３８】
実施例 ３
クルーズトリパノソーマに存在するプロスタグランジン Ｈ _２ − Ｆ _{２ α} 還元酵素の精製と部分アミノ酸配列の決定
クルーズトリパノソーマの可溶性画分を硫安分画にかけ２０〜８０％飽和硫安画分を回収した。そして、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｈｉｌｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇ　カラム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で分画する。活性画分を分子量３，０００のカットオフ値のセントリコン濃縮器（ミリポア社製）で濃縮し２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析した後、２Ｍ硫安を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した逆相カラムクロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ＰＨＥ　逆相カラム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む２Ｍから０Ｍへの硫安の逆勾配で溶出した。活性画分を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に透析した後、この緩衝液で平衡化したイオン交換樹脂カラム（ＨｉＰｒｅｐ　１６／６０　ＤＥＡＥ　イオン交換カラム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させ、０〜４００ｍＭＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。その活性画分を、再度、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｈｉｌｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇ　カラム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）にかけると、ＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素活性の収量が約１％、約１６３０倍の精製倍率で、約７００　ｎｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白質の比活性を示し、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動上、分子量４２，０００の位置に均一なバンドを示す精製酵素が得られる（図３と図４参照）。
精製されたＰＧＨ_２−ＰＧＦ_２α還元酵素は黄色の色素を結合している。その可視領域の吸収スペクトルは、酸化状態で３７９ｎｍと４６２ｎｍ付近に吸収極大を示す。そして、１００μＭのＮＡＤＰＨを加えて酵素を還元状態にすると、可視部の吸収スペクトルは消失する。つまり、本酵素はフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を、酵素１分子に対して１分子づつ結合しているフラビン蛋白質である（図５参照）。
その精製酵素をリジルエンドペプチダーゼで処理し（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２０３：１７３−１７９，　１９９２）、逆相クロマトグラフィーで分離すると３本のペプチドが回収され、次のアミノ酸配列が決定できた。
ペプチド−１　　　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ（配列番号３）
ペプチド−２　　　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　（配列番号４）
ペプチド−３　　　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　（配列番号５）
【００３９】
実施例４
ＴｃＯＹＥ の ｃＤＮＡ クローニングと大腸菌を用いた遺伝子組換え蛋白質の発現
得られた３本のペプチドのアミノ酸配列をＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースの中で検索すると、Ｕ３１２８２の登録番号の１，６８６塩基対の長さの遺伝子（Ｃａｔｍｕｌｌ，　Ｊ．ａｎｄ　Ｄｏｎｅｌｓｏｎ，　Ｊ．Ｅ．，　ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベース．　１９９５、クルーズトリパノソーマ細胞内感染型で発見された酵母の旧黄色酵素遺伝子のホモログ遺伝子、クルーズトリパノソーマの還元酵素と記載）の予想蛋白質翻訳領域の中に、２本のペプチドと、もう１本のペプチドの１アミノ酸残基が変化したペプチドが見つかった。
クルーズトリパノソーマの還元酵素の蛋白質翻訳領域のヌクレオチド配列から、５’−末端にＥｃｏＲＩ制限酵素配列を加えたセンス・プライマーとして
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号６）
を合成し、５’−末端にＸｈｏＩ制限酵素配列を加えたアンチセンス・プライマーとして、
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＣＧＴＣＧＧＧＴＡ−３’（配列番号７）
を合成した。
昆虫体内での増殖型のクルーズトリパノソーマより、塩酸グアニジン・フェノール法（ＩＳＯＧＥＮ溶液、ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴ−アダプター・プライマー（タカラ酒造社製）とアニーリングさせ、エビアン・ミエロブラストシス・ウイルス逆転写酵素（タカラ酒造社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。これに、上記のセンスとアンチセンスの合成プライマーを加えてＰＣＲ反応を行なうと、３７９アミノ酸残基からなる分子量４２，２６０の蛋白質翻訳領域を含むｃＤＮＡが増幅した（配列番号１及び２）。得られたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は６個所でＵ３１２８２と異なり、その内、１ヶ所はアミノ酸残基の変化を伴っている。そして、精製酵素を用いて決定した３本のペプチドのアミノ酸配列は、得られたｃＤＮＡの蛋白質翻訳領域に完全に含まれていた。
得られたｃＤＮＡをｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入して蛋白質発現ベクターを作製した。
大腸菌ＢＬ２１株をこのベクターを用いて形質転換させ、０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシルピラノシドの存在下に７時間培養すると、グルタチオン転移酵素との融合蛋白質として遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥが大腸菌の可溶性画分に発現される。その後、この大腸菌を超音波破砕して抽出液を回収し、グルタチオンアフィニティーカラム（グルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）にかけて、融合蛋白質を樹脂に吸着させ、洗浄後、カラム上でのスロンビン処理を行なって、遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥを回収した。以上の方法により、高純度の遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥを容易に大量精製することができた（図６参照）。
【００４０】
実施例 ５
遺伝子組換え型 ＴｃＯＹＥ による還元反応の基質特異性
精製した遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥのＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素活性は７６６ｎｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白質であり、クルーズトリパノソーマの可溶性画分より精製した標品と、ほぼ同じ比活性を示した。
アルゴン置換した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で５００μＭのＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨの存在下に遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥと反応させ、３４０ｎｍの吸収スペクトルの減少を測定して、様々な化合物に対する基質特異性を測定すると、ＴｃＯＹＥは過酸化水素や過酸化ブチルも還元した（図７参照）。さらに、ＴｃＯＹＥは、トリパノソーマに対する駆虫効果を示す各種のキノン化合物やニトロ誘導体化合物（メナディオン、ベータ・ラパコン、４−ニトロキノリン−４−オキシド、ニフルティモックス、フェナジンメソサルフェイト（５−メチル−フェナジウム・メチル・サルフェイト）、メヴィノリン（２β，６α−ジメチル−８α−（２−メチル−１−オキソブトキシ）−メヴィニックアシドラクトン）、１２−オキソ・フィトディエノイックアシッド（４−オキソ−５β−（２Ｚ−ペンテニル）−２−シクロペンテン−１β−オクタノイックアシド）、９−オキソ−１０Ｅ，　１２Ｚ−オクタデカディエノイックアシッド、エコナゾル（１−〔２−（［４−クロロフェニル］メトキシ）−２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル−１Ｈ−イミダゾール）〕も還元する。しかし、ベンズニダゾールやクリスタルバイオレット（エヌ−［４［ビス［４−（ジクロロフェニル）−２−（１Ｈ−イミダゾル−１−イルメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル−メトキシ］フェニル］ピペラジン］）は還元しなかった（図７参照）。
ＴｃＯＹＥによる反応産物の電子スピン共鳴スペクトルをＪＥＯＬ　Ｘ−バンドスペクトロメーター（日本電子社製）を用いて測定すると（Ｍｏｒｅｎｏ，　Ｓ．　Ｎ．　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５９：６２９８−６３０５，　１９８４）、メナディオンやベータ・ラパコンなどのナフトキノン化合物は１電子還元されセミキノンラジカルを産生することを示すシグナルが検出された。そして、発生したセミキノンラジカルは酸素と反応して、原虫を殺すスーパーオキサイドアニオンラジカルを産生した（図８参照）。一方、ニフルティモックス、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、メヴィノリンなどのニトロヘテロサイクル化合物を基質とする場合は２電子還元を受けラジカルの産生は検出されない。
ＴｃＯＹＥにより還元されるナフトキノン化合物やニトロヘテロサイクル化合物は、ＴｃＯＹＥによるＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素活性を用量依存的に阻害する。そして、ニフルティモックスによる阻害が最も強力であり、メナディオン、ベータ・ラパコン、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドによる阻害は弱い（図９参照）。
【００４１】
実施例 ６
抗 ＴｃＯＹＥ 抗体の製造
５　ｍＭ　トリス塩酸緩衝液　（ｐＨ　８．０）　に溶解した遺伝子組換えＴｃＯＹＥ　（３００μｇ）　抗原を同量のフロイント完全アジュバント（ディフコ製）を混ぜて乳化し、乳濁液を作製した。抗原乳濁液を、雌の日本白兎　Ｋｂ１　の肩部の２０箇所の皮下に投与して免疫した。その後、２週間おきに、４回、抗原を同量のフロイント不完全アジュバントで混ぜて乳化した乳濁液を、同量投与した。２回目の免疫４週間後、ウサギの耳静脈より採血した。血液を４℃で一晩静置して凝固させた後、遠心分離（１０００　Ｘ　ｇ、２０分間）により血清を回収した。血清をプロテインＡセファロースクロマトグラフィー（アマシャムファルマシアバイオテック社）により分離して、ＩｇＧ画分を精製した。
【００４２】
実施例７
抗 ＴｃＯＹＥ 抗体とそれを用いた薬物代謝活性の免疫吸収試験
精製した遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥをウサギに免疫して得た抗体は、クルーズトリパノソーマの粗抽出液を用いたウェスタンブロット分析において、ＴｃＯＹＥのみと免疫交差反応を示した。そして、ブルーシトリパノソーマやリーシュマニアの粗抽出液中に免疫交差反応を示す蛋白質は無く、ＴｂＰＧＦＳにも結合しない。逆に、遺伝子組換え型ＴｂＰＧＦＳをウサギに免疫して得た抗体は、ＴｃＯＹＥを認識せず、クルージトリパノソーマの粗抽出液中に免疫交差反応を示す蛋白質は無い（図１０参照）。
クルーズトリパノソーマの粗抽出液を用いた免疫吸収試験において、抗ＴｃＯＹＥ抗体はＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素活性をほぼ完全に吸収するが、抗ＴｂＰＧＦＳ抗体はその活性を全く変えない（図１１参照）。そして、ＴｃＯＹＥ抗体は、クルーズトリパノソーマの粗抽出液中のメナディオン、ベータ・ラパコン、ニフルティモックス、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドなどの化合物の還元酵素活性も、ほぼ完全に免疫沈降させた（図１２参照）。
以上の結果は、クルーズトリパノソーマの粗抽出液中のＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素活性とメナディオン、ベータ・ラパコン、ニフルティモックス、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドなどの化合物の還元酵素活性は、ほとんどがＴｃＯＹＥにより触媒されていることを示す。
【００４３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】クルーズトリパノソーマの粗抽出液によるプロスタグランジンの産生を示す。
【図２】シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるクルーズトリパノソーマ可溶性画分に存在するＮＡＤＰＨ存在下の［１−^１４Ｃ］−ＰＧＨ_２から１−^１４Ｃ］−ＰＧＦ_{２ α}への還元反応の検出を示す。
【図３】分子量４２，０００の位置に均一なバンドを示すクルーズトリパノソーマ精製酵素のＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動像を示す。
【図４】クルーズトリパノソーマに存在するプロスタグランジンＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素の各精製段階での酵素の収量と精製倍率を示す。
【図５】クルーズトリパノソーマから精製したＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素の酸化状態での可視部の吸収スペクトルを示す。
【図６】遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥの発現と各精製段階の標品のＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動像を示す。
【図７】遺伝子組換え型ＴｃＯＹＥによる還元反応の基質特異性を示す。
【図８】ＴｃＯＹＥによるナフトキノン化合物の１電子還元により産生するセミキノンラジカルと二次的に酸素と反応して発生するスーパーオキサイドアニオンラジカルの電子スピン共鳴スペクトルを示す。
【図９】ナフトキノン化合物やニトロヘテロサイクル化合物によるＴｃＯＹＥの　ＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素活性の阻害を示す。
【図１０】トリパノソーマの粗抽出液を用いたウェスタンブロット分析による抗ＴｃＯＹＥ抗体の特異性を示す。
【図１１】抗ＴｃＯＹＥ抗体によるクルーズトリパノソーマ可溶性画分中のＰＧＨ_２−Ｆ_{２ α}還元酵素活性の免疫吸収を示すシリカゲル薄層クロマトグラフィーを示す。
【図１２】抗ＴｃＯＹＥ抗体によるクルーズトリパノソーマの粗抽出液中のメナディオン、ベータ・ラパコン、ニフルティモックス、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドの還元酵素活性の免疫沈降を示す。

Claims (10)

1. クルーズトリパノソーマに由来する、プロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有するフラビン蛋白質（ＴｃＯＹＥ）。
2. 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の組換え蛋白質。
   （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
   （ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質
   （ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の断片からなり、かつプロスタグランジンＨ_２をプロスタグランジンＦ_２αに還元する酵素活性を有する蛋白質
3. 請求項１又は２に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
4. 配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡよりなる請求項３に記載の遺伝子。
5. 請求項１又は２に記載の蛋白質に対する抗体。
6. クルーズトリパノソーマ感染の駆虫薬のスクリーニング方法であって、
   （ｉ）請求項１又は２に記載の蛋白質及びプロスタグランジンＨ_２を準備し、
   （ｉｉ）ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ存在下にこれらと候補化合物を接触させ、
   （ｉｉｉ）プロスタグランジンＨ_２のプロスタグランジンＦ_２αへの還元が阻害されるか否かを調べる、
   ことを含む方法。
7. クルーズトリパノソーマ感染の駆虫薬のスクリーニング方法であって、
   （ｉ）ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの存在下に請求項１又は２に記載の蛋白質と候補化合物を接触させ、
   （ｉｉ）該化合物が該蛋白質による１電子還元によりラジカルを発生するか否かを測定する、
   ことを含む方法。
8. クルーズトリパノソーマ感染の診断方法であって、
   （ｉ）検体又は検体抽出物を請求項５に記載の抗体と接触させ、
   （ｉｉ）抗原／抗体複合体が生成するか否かを調べる、
   ことを含む方法。
9. クルーズトリパノソーマ感染の診断方法であって、
   （ｉ）検体又は検体抽出物を請求項３に記載の遺伝子又はその断片と接触させ、
   （ｉｉ）両者がハイブリダイズするか否かを調べる、
   ことを含む方法。
10. クルーズトリパノソーマ感染の診断方法であって、
    （ｉ）検体から回収したＤＮＡ、あるいは検体中のｍＲＮＡから逆転写酵素により合成したｃＤＮＡを準備し、
    （ｉｉ）このＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１のＴｃＯＹＥのｃＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列をセンスプライマーとアンチセンスプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を行い、
    （ｉｉｉ）ＴｃＯＹＥのｃＤＮＡが増幅されるか否かを調べる、
    ことを含む方法。

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