JP2004115434A

JP2004115434A - Antidiabetic

Info

Publication number: JP2004115434A
Application number: JP2002281247A
Authority: JP
Inventors: Juichi Nakatsugawa; 中津川　重　一; Hiroaki Maeda; 前　田　浩　明
Original assignee: YAMATO YAKUHIN KK
Current assignee: YAMATO YAKUHIN KK
Priority date: 2002-09-26
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: JP4309108B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an antidiabetic lowering blood cholesterol levels or blood total cholesterol or triglyceride levels. <P>SOLUTION: This antidiabetic comprises Natto (fermented soybeans using Bacillus natto) kinase as the active ingredient. The Natto kinase is to be taken at 0.3-3 mg a day per adult. The antidiabetic, because of being capable of lowering blood cholesterol levels or blood total cholesterol(T-CHO) or triglyceride(TG) levels by oral administration, can be used as a drug for treating diabetes. The antidiabetic, because of being a food product extracted from Natto, has no side effects, and is highly safe. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナットウキナーゼを有効成分として含有する糖尿病治療薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、納豆は日本の伝統的な食品の一つで、古来より心臓と血管の疾病における民間薬、或いは、疲労回復や脚気の治療薬として利用されてきた。
また、近年では、納豆菌が生産する線溶酵素が強力な血栓溶解作用があることも発表されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
従って、この様な納豆菌によって生産されて単離したナットウキナーゼ含有加工食品が血栓溶解作用や血栓形成阻害作用を有していることも明らかにされている（例えば、特許文献３参照）。
この様にナットウキナーゼには血栓溶解作用や血栓形成阻害作用があることが知られていることから、虚血性心疾患（心筋梗塞）や脳梗塞の血栓症の予防食品としてナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）が市販されており、この様なナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）の摂取量として成人１人当たり２５０〜５００ｍｇであることが推奨されている（例えば、非特許文献１参照）。
一方、枯草菌菌体の培養物が水溶性ビタミンＫ誘導体を含有し、この培養物が骨粗鬆症の予防及び治療剤として有用であることも提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平１−１８０８３４号公報（第１−５頁）
【特許文献２】
特開平８−２０８５１２号公報（第１−５頁）
【特許文献３】
特開２００１−３５２９２９号公報（第２頁）
【特許文献４】
特開２００１−１３６９５９号公報（第１−１９頁）
【非特許文献１】
「ナットウ菌培養ろ液乾燥物　ＮＫＣＰ　ナットウキナーゼコンパウンド」大和薬品株式会社製カタログ
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記のナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）は、成人１日当たり２５０〜５００ｍｇの摂取量にて摂取させると、ナットウキナーゼによる血栓溶解作用によって虚血性心疾患（心筋梗塞）や脳梗塞等の血栓症の予防に有効であるが、それ以上の過剰量（５倍量）を直接十二指腸に投与しても、出血が認められなく、血液凝固系においても顕著な症状を誘発しないこと（ラットによる試験）が明記されているだけで、糖尿病の治療については何ら示唆もされていない。
また、上記ナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）中の純粋なナットウキナーゼの含有量は、１００ｇ当たり約１２ｍｇであることから、上記成人１人当たり２５０〜５００ｍｇの量で摂取すれば、純粋なナットウキナーゼの摂取量としては成人１日当たり０．０３〜０．０６ｍｇに相当する量で摂取していることになる。
【０００５】
一方、上記骨粗鬆症の予防及び治療剤として使用する場合には、成人１日当たり１〜５０ｍｇの量で１回〜数回に分けて培養物を摂取することにより、骨粗鬆症の予防及び治療剤としての効果が発現することが明記されている。
従って、ナットウキナーゼ含有培養物（粗精製品）を１〜５００ｍｇの摂取量で摂取すれば、血栓症の予防や骨粗鬆症の予防としての有効な効果を示すことが明らかにされているが、これら摂取量以上の量で摂取することについては、何ら報告や示唆もされていない。
また、この様な糖尿病治療効果が現れる程度の摂取量を納豆自体より食して得ようとするならば、数ｋｇから数十ｋｇの量を食さなければならず、栄養学上納豆自体のみを食するだけでは、蛋白質が過剰となり糖分や脂質が不足する等の栄養学的な弊害が生じてしまう等の問題点が発生する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記ナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）について更に鋭意研究を重ねた結果、市販の血栓症の予防食品としての摂取量の約５〜１０倍程度の摂取量とすることにより、糖尿病を治療することができるとの知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明の糖尿病治療薬は、ナットウキナーゼを有効成分として含有すること、を特徴とするものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
［Ｉ］　糖尿病治療薬
（１）　有効成分
（Ａ）　ナットウキナーゼ
本発明の糖尿病治療薬として用いられるナットウキナーゼは、各種方法によって製造したものが使用できるが、特に、大豆を培地にして納豆菌を培養することにより得られる培養物を限外濾過膜等を用いて固形分を分離した後、濃縮し、乾燥することにより得られる固形成分よりなるナットウキナーゼ含有物（粗精製品）やその精製品を用いることが好ましい。
【０００８】
（ａ）　ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）上記大豆を培地にして納豆菌を培養することにより得られる納豆菌培養物より固形分を分離したナットウキナーゼ含有物（粗精製品）中には、主たる成分としてナットウキナーゼが１００ｇ当たり約１２ｍｇ含まれており、該ナットウキナーゼ以外にも、アミラーゼ、プロテアーゼ、リバーゼ等の酵素や、グルタミン酸のポリペプチド、フラクトースの重合体のフラクタン等が含有されているものである。
具体的には、上記納豆菌の培養物中に蓄積されているナットウキナーゼの量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件などによって変化するが、通常、培養物中に１０〜２０ｍｇ／１００ｇの割合で含有されている真空乾燥粉末である。
【０００９】
（ｂ）　ナットウキナーゼ精製品（ナットウキナーゼフラクション）
上記ナットウキナーゼ含有物（粗精製品）中にはナットウキナーゼが１００ｇ当たり約１２ｍｇしか含まれていないことから、高純度の、例えば１００倍以上に精製した、好ましくは２００〜１，０００倍に精製した、具体的には２０〜１００重量％の濃度に精製したナットウキナーゼ精製品（ナットウキナーゼフラクション）とすることもできる。
精製方法
上記高純度のナットウキナーゼ精製品（ナットウキナーゼフラクション）に精製する方法としては、通常行われている酵素の精製方法と同様に行うことができるが、特に、ナットウキナーゼ含有物をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で溶解させ、イオン交換樹脂に吸着させて、不純物を分離した後、再度Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で溶出させることにより精製したものであることが好ましい。
【００１０】
（ｃ）　性　状
上記ナットウキナーゼの物理化学的特性としては、分子量が２４，０００〜４０，０００、好ましくは３０，０００〜３６，０００（２５７アミノ酸残基）、等電点が好ましくは８．６±０．３（ｓｖｅｎｓｓｏｎカラム法）、ｐＨ６〜１２の塩基性水溶液中で６０℃までの加熱に対して安定なものである。
【００１１】
（２）　摂取量
本発明における糖尿病治療用薬剤としての投与量は、症状の程度、患者の年齢、体重及び処置期間等によって異なり、正確な量は医師により決定されるものであるが、本薬剤を糖尿病治療用薬剤として投与する場合、通常、前記ナットウキナーゼの投与量換算で、成人１日当たり０．３〜３．０ｍｇ、好ましくは０．４〜２．０ｍｇ、特に好ましくは０．５〜１．０ｍｇを１回または数回に分けて投与する。
上記ナットウキナーゼ含有物の粗精製品（ナットウキナーゼコンパウンド）を用いる場合には、培養物の投与量換算で、成人に対し１日当り成人１日当たり２．５〜２５ｇ、好ましくは２．８〜２０ｇ、特に好ましくは３．０〜１８ｇを１回または数回に分けて投与する。
また、上記ナットウキナーゼ精製品（ナットウキナーゼフラクション）を用いる場合には、培養精製品の投与量換算で、成人に対し１日当り成人１日当たり１２．５〜１２５ｍｇ、好ましくは１４〜１００ｍｇ、特に好ましくは１５〜８０ｍｇを１回または数回に分けて投与する。
上記摂取量において、その量が少なすぎると本発明の糖尿病治療効果を発現することが低下する。また、その量が多すぎると血液凝固能が低下し過ぎる等の副作用が発現し易くなる傾向がある。
【００１２】
（３）　薬剤の形態
本発明の糖尿病治療用薬剤は経口投与され、本剤を血液中に投与しても効果を見出すことはできない。
従って、本発明の糖尿病治療用薬剤の形態としては、前記培養物を単体で、又は、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤等として患者に経口投与するのが一般的である。
これら糖尿病治療用薬剤の形態は、患者の年齢、性別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適宜選択されるが、後記食品中に配合したものであっても良い。
【００１３】
（４）　添加剤
本発明における糖尿病治療薬を錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤等の固形製剤とする場合には、前記培養物を、常法に従って適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成若しくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤又は希釈剤等と適宜混合して製造することができる。
また、錠剤等は、必要に応じて適当な被覆用基剤を用いて、糖衣、ゼラチン、腸溶被覆、フイルムコーティング等を施しても良い。
【００１４】
（５）　食品中への配合
上述した様に、前記ナットウキナーゼ含有物をそのまま混合したり、水に溶かしたりして、通常食することのできる食品や飲料中に含有させたものであっても良い。
【００１５】
［ＩＩ］　ナットウキナーゼの製造
（１）　納豆菌の培養
本発明の糖尿病治療用薬剤は、大豆を培地にして納豆菌を培養して得た培養物から固形成分を分離し、濃縮乾燥することにより得られるナットウキナーゼを有効成分として含有するものである。
【００１６】
（Ａ）　菌　体
本発明のナットウキナーゼを有効成分として含有する糖尿病治療薬を得るのに使用される納豆菌としては、安全性やナットウキナーゼの産生量等を考慮すると、枯草菌類（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する公知の納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｎａｔｔｏ）が使用される。
納豆菌としては、特に制限されないが、高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）、成瀬菌（株式会社成瀬醗酵化学研究所製、東京）、宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台）、朝日菌（株式会社朝日工業製、東京）、日東菌（株式会社日東薬品工業製、京都）、目黒菌（株式会社目黒研究所製、大阪）等の市販の納豆菌；及び雲南ＳＬ−００１菌等を挙げることができる。
なお、雲南ＳＬ−００１菌は、平成１１年５月７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７１３号で国際寄託された。
【００１７】
（Ｂ）　培地の調製
納豆菌の培養にて使用される培地としては、納豆菌を一般的に培養するのに用いられる公知の培地と同様の培地が使用される。
具体的には、例えば、オカラ、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料とした製油時に副生する大豆粕、味噌製造時の副産物である大豆の種皮等、納豆菌によって発酵できる材料を使用しても良い。
従って、各種培養成分を適宜混合することにより調製しても、或いは、市販の培地をそのまま使用しても、或いは、市販の培地に下記の炭素源、窒素源及び無機塩及びその他の栄養素等を補助成分として適宜添加した培地を使用しても良い。
この際、培地は、固体又は液体培地のいずれを使用しても良いが、生産性の観点から液体培地が好ましく、使用目的によって適宜選択され、また、使用する微生物が資化し得る栄養素を含有する培地であれば、合成培地又は天然培地のいずれであっても良い。
【００１８】
（ａ）　炭素源
本発明における納豆菌の培養に使用できる炭素源としては、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に生育し、ナットウキナーゼを効率良く産生できるものであれば特に制限されない。
具体的には、例えば、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉、α−澱粉、可溶性澱粉、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉及びデキストリン、グリセリン、ソルビトール、麦芽汁、グルコース等の炭水化物を挙げることができる。
これらの炭素源の中でも、ナットウキナーゼの産生の観点から、グルコース及び澱粉が好ましく使用される。これらの炭素源は、単独或いは２種以上の混合物の形態で使用することもできる。
【００１９】
（ｂ）　窒素源
本発明による納豆菌の培養において使用できる窒素源もまた、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に生育し、ナットウキナーゼを効率よく産生できるものであれば特に制限されない。
具体的には、例えば、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、酵母エキス、味液（大豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸及びコーンスティープリカー等の有機窒素化合物、及び、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物等が挙げられる。
これらの窒素源の中でも、ナットウキナーゼの産生の観点から、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）及び大豆粉末が好ましく使用することができる。これらの窒素源も、単独或いは２種以上の混合物の形態で使用することもできる。
【００２０】
（ｃ）　無機塩
本発明による納豆菌の培養に使用できる無機塩もまた、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に生育し、ナットウキナーゼを良好に産生でき得るものであれば特に制限されない。
具体的には、例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することもできる。
【００２１】
（Ｂ）　培養条件
本発明において、納豆菌の培養は、従来公知の方法と同様にして行われ、その際の培養条件としては、使用する菌株、培地の組成及び培養法によって適宜選択され、使用する菌株が増殖しナットウキナーゼを効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。
培養温度は、通常、２０〜４５℃、好ましくは３７〜４２℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、通常、６．０〜９．５、好ましくは７．０〜８．５である。
【００２２】
（２）　納豆菌の分離
本発明の方法によって培養された納豆菌の培養物の固形成分を、濾過や限外濾過や遠心分離等の既知の方法により集菌し、濾液を濃縮する。
【００２３】
（３）　乾　燥
そして、これを凍結乾燥、風乾、真空熱乾燥等の公知の方法により乾燥することにより、粉体として得ることができる。
得られた粉体はナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）として、そのまま糖尿病治療薬として摂取することもできる。
【００２４】
（４）　精　製
上記粉体状のナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）を、更に精製することにより高純度のナットウキナーゼ精製品（ナットウキナーゼフラクション）とすることもできる。
具体的には、粉体状のナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解させて、２５重量％硫安を用いて分画し、遠心分離して、沈殿物を除去した後、その液状物をイオン交換樹脂に吸着させ、その上澄み液を除去した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液により溶出させることにより約２００〜１，０００倍程度の高純度のナットウキナーゼ精製品（ナットウキナーゼフラクション）に精製することができる。
また、更に精製して、更なる高純度のナットウキナーゼ精製品とすることもできる。
【００２５】
［ＩＩＩ］　納豆菌培養物の濾液乾燥物の構成成分
（１）　ナットウキナーゼ
上記大豆を培地にして納豆菌を培養することにより得られる納豆菌培養物の濾液乾燥物は、主たる成分としてナットウキナーゼが含有されている。
具体的には、上記納豆菌の培養物の濾液乾燥物中に蓄積されているナットウキナーゼの量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件等によって変化するが、通常、１０〜２００ｍｇ／１００ｇの真空熱乾燥菌体である。
【００２６】
（２）　その他の成分
上記ナットウキナーゼ以外にも、アミラーゼ、プロテアーゼ、リバーゼ等の酵素が０．００２〜０．００５重量％含まれていたり、グルタミン酸のポリペプチドが０．５〜１．５重量％含まれていたり、フラクトースの重合体のフラクタンが０．５〜１．５重量％含まれていたりするものである。
【００２７】
【実施例】
以下に示す実施例及び比較例によって、本発明を更に具体的に説明する。
［Ｉ］　評価方法
実施例及び比較例によって得られたものは、以下に示す評価方法によって評価した。
（１）　実験動物及び飼育条件
７週齢の雄性ＫＫ−Ａｙマウス（ＩＩ型糖尿病モデル）及びＳＴＺ処理マウス（Ｉ型糖尿病モデル）を日本ＳＬＣ（株）から購入し、室温２２±２℃、１２時間明暗サイクルのＳＰＦ動物実験施設で飼育した。餌（日本クレア（株）製、商品名：ＣＥ−２）及び水は自由摂取として、１週間の予備飼育後、実験に供した。
【００２８】
（２）　ＫＫ−Ａｙマウス及びＳＴＺ処理マウスに対する影響
予備飼育終了後、３時間絶食時の血糖値が２００ｍｇ／ｄｌ以上のマウスを実験に使用した。これらのマウスを血糖値の平均値が等しくなる様に２群に分け、ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）を水に溶解し、１ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙを２１日間連続経口投与した。
対照群には水を投与した。血糖値は１週間に１度、３時間絶食状態で、眼光静脈りゅうから採血を行い測定した。実験最終日、投与３時間後に血糖値を測定した後、マウスは麻酔科において開腹し、心臓採血を行った。
副睾丸上皮脂質を摘出後、液体窒素で保存した。
尚、投与は絶食を午前１１時から１２時とし、その３時間後、採血を行い血糖値を測定した。
【００２９】
（３）　糖負荷試験
ナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）を３週間連続投与したマウスを１８時間絶食させた後、ナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）を水に溶解し、１ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙにて経口投与を行い、その３０分後、グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ）を経口投与して、その３０分後、６０分後、１２０分後の血糖値を測定した。
【００３０】
（４）　インスリン負荷試験
上記糖負荷試験による方法に準じて行い、グルコース溶液の投与でなく、インスリン（０．５Ｕ／ｋｇ）を腹腔内投与した。
【００３１】
（５）　血糖値及び血清脂質の測定
血糖値の測定は、（株）三和化学研究所製小型血糖測定器グルテストエース（ＧＴ−１６４０）を用いて測定し、血清インスリン値はワンステップ酵素免疫測定法（和光純薬（株）製のグランザイムインスリンＥＩＡテスト）により測定した。
血中トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、低比重リボ蛋白（ＬＤＬ）及び高密度リボ蛋白（ＨＤＬ）については（株）三菱化学ビーシーエルに測定を委託した。
【００３２】
（６）　ＲＴ−ＰＣＲ
マウスより摘出した脂肪組織を１００ｍｇよりＴＲＩＺＯＬ試薬を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。各臓器より抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡから５μｇを用いてＴ−ｐｒｉｍｅｄ　ｆｉｒｓｔ　ｓｔａｎｄ　ｋｉｔによりｃＤＮＡ化を行い、ＲＴ−ＰＣＲ法により各因子を特異的に増幅するプライマー対を用いてβ−Ａｃｔｉｎを基準として発現量を検討した。
【００３３】
［ＩＩ］　実施例及び比較例
［ナットーキナーゼの調製］
（１）　納豆菌コロニーの培養
納豆菌（高橋菌）を純水に加えて攪拌することにより懸濁状態にした後、これを標準寒天培地（ニッスイ製）を用いてシャーレに作製した平板培地に少量を加え（接種し）、３７℃で２４時間培養して上記平板培地上に納豆菌コロニーを得る。
【００３４】
（２）　培養液の調製
一方、原料であるグルコース１ｇと粉末状大豆タンパク質（日清コスモフーズ（株）製，商品名：ソルピーＮＹ）４ｇからなる液体培地２００ｍｌを内容積５００ｍｌの三角フラスコ内に作製し、オートクレーブを用いて１２０℃の状態に３０分間保持して上記三角フラスコ内を滅菌する。
上記粉末状大豆タンパク質は、大豆より精製したものである。なお、原料として、大豆を粉砕する等して得られる大豆の粉末を用いるようにしても良い。
この後、平板培地上に培養した納豆菌コロニーより、白金線の輪の径が２ｍｍの白金耳で納豆菌を１回採取し、採取した納豆菌を上記三角フラスコ内の液体培地に接種する。
次いで、納豆菌を接種した液体培地が収容されている三角フラスコを、４０℃に保持したまま密閉せずに２日間回転振盪させて、三角フラスコ内の液体培地を培養する。
【００３５】
（３）　培　養
また、内容積が３０リットルのジャーファーメンターに、グルコース１００ｇ、粉末大豆タンパク質４００ｇ、及び、可溶性澱粉（敷島スターチ（株）製ＳＦ−４００）からなる液体培地２０リットルを作製し、これらを滅菌したものを用意する。
加えて、上記三角フラスコ内に培養した納豆菌培養液２００ｍｌを、ジャーファーメンター内の液体培地に加え、４２℃に加温した状態でバブリングしながら攪拌する状態を２日間保持して培養する。
同様のものを３つ作製し、約５０リットルの大豆タンパク質培養液を得る。
【００３６】
（４）　納豆菌の分離
次に、得られた大豆タンパク質培養液より納豆菌および不純物を遠心分離により除去した後、硫酸アンモニウムを１モル添加する。この硫酸アンモニウムの添加により、発酵液中に分散している種々の酵素等のタンパク質性の高分子化合物を含むタンパク質を疎水化して凝集し易い状態とする。
また、硫酸アンモニウムの添加により新たに不溶物が形成されるが、これら不溶物は、ガラス繊維濾紙で濾過する。
【００３７】
（５）　凝　集
次いで、不溶物を濾過した濾液に、１モルの硫酸アンモニウム溶液で平衡化した疎水クロマトグラフィー用樹脂（東ソー（株）製、商品名：ブチルートヨパール６５０Ｍ）を浸漬し、樹脂上に疎水化した高分子化合物を凝集（添着）させる。
【００３８】
（６）　濃　縮
次に、上記樹脂上を０．１モル濃度の炭酸水素アンモニウム水溶液に浸漬し、樹脂に添着した高分子化合物を溶出させることで、大豆タンパク質培養液を濃縮した濃縮培養液４０リットルを得る。
【００３９】
（７）　限外濾過
次に、プレッブスケールＭ．Ｗ．１万の限外濾過膜を用いて限外濾過することで低分子物質を分離し、上記濃縮培養液４０リットルを１０リットルになるまで濃縮する。
限外濾過することで、限外濾過膜により濃縮された濃縮物に純水１０リットルを加えて２０リットルとし、再度、上記限外濾過することにより低分子物質を分離して、再び、１０リットルになるまで濃縮する操作を３回繰り返し、大豆タンパク質培養液を濃縮した濃縮培養液から、ほとんどの低分子物質を除去した大豆タンパク質発酵物溶液を得る。
【００４０】
限外濾過
上記限外濾過は、一般にコロイド粒子の様な微細な粒子を分散媒より分離するために行われることから、それに用いられる限外濾過膜は、布や素焼きの多孔板に付けたコロジオン膜やホルマリンで硬化させたゼラチン膜や珪酸膜やセロハン膜等が用いられ、加圧下でコロイド溶液をこれらの膜を通して濾過する。
膜の目の大きさを加減するにはコロジオンではアルコール、エーテルの混合溶媒に対する濃度、乾燥条件等の調節、セロハンでは塩類水溶液中に浸す際の膨張度の調節、又は、膜を通してコロジオン溶液を濾過し、コロジオンを膜に沈着させることにより行うことができる。
【００４１】
濾過により分離されるもの
限外濾過により濾過されるものとしては、納豆特有の臭いの主な成分は、ジメチルピラジン（分子量１０８．１４），トリメチルピラジン（分子量１２２．１７），テトラメチルピラジン（分子量１２６．２０），２−メチル酪酸（分子量１０２．１３），イソ吉草酸（分子量１０２．１３），アンモニア（分子量１７．０３）などの低分子化合物である。
また、納豆に含まれているビタミンＫ_２は、分子量が６４９の炭化水素化合物である。一方、ナットウキナーゼを始めとする酵素などのタンパク質は、分子量数万以上の高分子化合物である。
したがって、前述した限外濾過による低分子物質の除去により、大豆タンパク質培養液中から、納豆特有の上記臭いの成分やビタミンＫ_２等の低分子物質が、ほぼ除去された状態となる。
納豆に含まれているビタミンＫ_２は、心筋梗塞等の心臓病に対して用いられる拮抗剤「ワーファリン」（医薬品）の効果を抑制するという問題がある。
しかしながら、本実施の形態によれば、ビタミンＫ_２が除去されるので、この問題を解消することが可能になる。
【００４２】
（８）　乾　燥
最後に、上記限外濾過により低分子物質が除去された大豆タンパク質発酵物溶液に、賦形剤として乳糖２キログラムを加えて凍結乾燥すれば、大豆タンパク質発酵物粉末（加工食品）約２．１ｋｇが得られる。
【００４３】
（９）　臭気試験
納豆が苦手で食べられない被検者二人による、本実施の形態による大豆タンパク質発酵物粉末の臭いの有無を確認を行ったところ、被検者二人とも納豆臭を感じることはなかった。
【００４４】
（１０）　精　製
上記粉体状のナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）１０ｇを３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）５００ｍｌに溶解させて、２５重量％飽和硫安１６６ｍｌを加えて１５分間攪拌し、１５分間放置した後、回転数１１０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、分画して、沈殿物を除去した後、その液状物にイオン交換樹脂（東ソー（株）製「Ｂｕｔｙｌ　トヨパール」）５０ｍｌ（３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、２５重量％飽和硫安、ｐＨ９．０）を加えて２時間攪拌してイオン交換樹脂に吸着させ、再び回転数３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、その上澄み液を除去した後、３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、２５重量％飽和硫安、ｐＨ９．０で洗浄し、再び回転数３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、その上澄み液を除去した後、３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０により溶出させることにより精製したナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）を調製した。
【００４５】
［糖尿病治療効果］
実施例１及び比較例１
上記ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）をＳＴＺ処理マウス（Ｉ型糖尿病モデル）に対して１日当たり２００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇの摂取量にて２１日間連続して経口投与した結果、表１に示す通り、血中グルコース濃度がナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）の用量依存的に減少した。
しかし、血中の総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）は、表１に示す通り、大きく増加した。
【００４６】
【表１】

【００４７】
これらの結果から、ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）はＩ型糖尿病において、血糖値を下げる効果はあるが、その分血中脂質を増加させてしまうとの現象が生じていることが理解できる。
また、上記ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）を４００ｍｇ／ｋｇの濃度に調製し、肝臓、脂肪、筋肉でのＧＬＵＴ４、ＨＳＤ−１、ＰＰＡＲ　γ、インシュリンレセプターの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって検討した結果、肝臓での遺伝子発現は変化していなかった。また、脂肪組織では、ＨＳＤ−１の発現がナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）投与によって減少した以外はほぼ同様であった。更に、筋肉では、ＰＰＡＲ　γの発現が減少し、インシュリンレセプターも減少傾向を見せた。
【００４８】
実施例２及び比較例２
ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）をＫＫ−Ａｙマウス（ＩＩ型糖尿病モデル）に対して１日当たり２００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇの摂取量にて２１日間連続して経口投与した結果、表２に示す通り、血中グルコース濃度が減少した。
更に、血中の総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）も、表２に示す通り減少した。
但し、体重増加は途中若干の違いは見られたものの、投与終了時点では差が見られなかった。
【００４９】
【表２】

【００５０】
これらの結果から、ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）にはＩＩ型糖尿病において血糖値を下げる効果があり、更にＩ型糖尿病の場合と異なり、血中脂質も減少させることができることが理解できる。
【００５１】
実施例３及び比較例３
高血糖状態の（２５０ｍｇ／ｄｌ前後）ＫＫ−Ａｙマウス（ＩＩ型糖尿病モデル）に対してナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）を１日当たり１ｍｇ／ｋｇの摂取量にて２１日間連続して経口投与した結果、血中グルコース濃度の上昇を抑制することができた。しかし、体重の増加にコントロール群との差を見ることができなかった。
また、投与期間中摂食量に顕著な差は見られなかったが、肝臓の重量は投与群の方が有意に少なくなっていた。
【００５２】
【表３】

【００５３】
実施例４及び比較例４
ナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）をＫＫ−Ａｙマウス（ＩＩ型糖尿病モデル）に対して２１日間連続して経口投与して糖負荷試験を行い、血中グルコース濃度を測定した。その結果を図１に示す。
図１の結果から、糖負荷開始３０分後から有意な血糖抑制作用が見られ、その効果は１２０分後まで継続していることが理解できる。
【００５４】
実施例５及び比較例５
ナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）をＫＫ−Ａｙマウス（ＩＩ型糖尿病モデル）に対して２１日間連続して経口投与した後、絶食後にインスリン溶液を腹腔内に投与してインスリン負荷試験を行い、血中グルコース濃度を測定した。その結果を図２に示す。
図２の結果から、糖負荷開始１８０分後においても血糖抑制効果が見られることが理解できる。
【００５５】
実施例６及び比較例６
ナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）をＫＫ−Ａｙマウス（ＩＩ型糖尿病モデル）に対して２１日間連続して経口投与した後、血中のインスリンや脂質の代謝をコントロール群と比較したところインスリン量に差はないが、総コレステロール量（Ｔ−ＣＨＯ）は有意に高く、その差はＨＤＬ（高密度リボ蛋白）コレステロールによるものであった。
一方、トリグリセリド（ＴＧ）は有意に低く、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）には大きな差が見られなかった。
【００５６】
【表４】

【００５７】
実施例７
ＫＫ−Ａｙマウス（ＩＩ型糖尿病モデル）より摘出した脂肪組織（副睾丸上皮質）における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで検討した。
ＵＣＰ−１（１型ミトコンドリア脱共役蛋白質）はナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）投与の有無に拘わらず発現が見られなかったが、ＵＣＰ−２（２型ミトコンドリア脱共役蛋白質）は元々あった発現が減少していた。
β_３−アドレノセプターは３匹中の２匹に発現が上昇している場合があった。また、グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ４）は発現が見られなくなり、１型　１１βヒドロキシステロイド脱水素酵素（１１βＨＳＤ−１）は発現の現象が見られた。
【００５８】
実施例８
［被験者］
空腹時血糖が１００〜１２５ｍｇ／ｄｌの正常高血糖者から境界型糖尿病者で血糖降下剤を投与されていない男性６名を選定した。
［ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）の投与］
１日６ｇ（毎食後２ｇ）２週間連続経日投与、投与期間中は過度な飲酒と納豆の摂取を禁じた。
【００５９】
［血糖値測定］
ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）の摂取前と摂取２週間後の空腹時血糖と高澱粉食（うどん、米飯、蛋白質１３．１ｇ、脂質２．５ｇ、炭水化物１３９．８ｇ、エネルギー６３４ｋｃａｌ）を１５分以内で全量を摂取させた３０分後の血糖値を測定した。測定は酵素電極法による自己血糖測定装置（バイエルメディカル（株）製「デキスターＺ」）で行った。
その結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】

【００６１】
表５の結果から、空腹時の血糖値及び食後の血糖値の上昇はいずれもナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）の摂取により低下し、糖尿病の改善に効果を発揮することができると理解できる。
【００６２】
【発明の効果】
このような本発明の糖尿病治療薬は、経口投与することにより血中のグルコース濃度を減少させたり、血中の総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）やトリグリセリド（ＴＧ）を低下させることができるので、糖尿病治療用薬として使用することができる。
また、納豆から抽出した食品であることから、副作用が無く、極めて安全性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明実施例における糖負荷試験の結果を表す。
【図２】図２は、本発明実施例におけるインスリン負荷試験の結果を表す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a therapeutic agent for diabetes containing nattokinase as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Traditionally, natto is one of the traditional Japanese foods and has been used since ancient times as a folk medicine for heart and blood vessel diseases, or as a treatment for fatigue recovery and beriberi.
In recent years, it has also been announced that fibrinolytic enzymes produced by Bacillus natto have a strong thrombolytic action (see, for example, Patent Document 1 and Patent Document 2).
Therefore, it has also been clarified that the processed food containing nattokinase produced and isolated by such Bacillus natto has a thrombolytic action and a thrombus formation inhibitory action (see, for example, Patent Document 3).
Since nattokinase is known to have thrombolytic and thrombus formation-inhibiting effects, nattokinase-containing foods (crude products) are used as foods for preventing ischemic heart disease (myocardial infarction) and cerebral infarction thrombosis. ) Is commercially available, and it is recommended that the intake of such a nattokinase-containing food (crude product) be 250 to 500 mg per adult (for example, see Non-patent Document 1).
On the other hand, it has also been proposed that a culture of Bacillus subtilis contains a water-soluble vitamin K derivative, and that this culture is useful as an agent for preventing and treating osteoporosis (see, for example, Patent Document 4).
[0003]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 1-180834 (page 1-5)
[Patent Document 2]
JP-A-8-208512 (page 1-5)
[Patent Document 3]
JP 2001-352929 A (second page)
[Patent Document 4]
JP 2001-136959 A (page 1-19)
[Non-Patent Document 1]
“Dried natto culture filtrate NKCP nattokinase compound” catalog by Daiwa Pharmaceutical Co., Ltd.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, when the above nattokinase-containing food (crude product) is ingested at an intake of 250 to 500 mg per day for an adult, thrombosis such as ischemic heart disease (myocardial infarction) or cerebral infarction is caused by thrombolytic action of nattokinase. Although it is effective for the prevention of gastric cancer, it does not cause bleeding and induces significant symptoms in the blood coagulation system even when an excessive amount (5 times higher) is administered directly to the duodenum (test with rats) There is no suggestion about the treatment of diabetes.
In addition, since the content of pure nattokinase in the nattokinase-containing food (crude product) is about 12 mg per 100 g, the intake of pure nattokinase can be obtained at an amount of 250 to 500 mg per adult. As a result, it is taken in an amount equivalent to 0.03 to 0.06 mg per day for an adult.
[0005]
On the other hand, when used as an agent for the prevention and treatment of osteoporosis, the effect as an agent for the prevention and treatment of osteoporosis is obtained by ingesting the culture once to several times in an amount of 1 to 50 mg per day for an adult. Is expressed.
Therefore, it has been clarified that if a nattokinase-containing culture (crude product) is ingested at an intake of 1 to 500 mg, it exhibits an effective effect as prevention of thrombosis and osteoporosis. There is no report or suggestion about taking in the above amount.
In addition, if you want to get the amount of intake that shows such a therapeutic effect for diabetes from natto itself, you must eat several kilograms to several tens of kilograms. Eating alone causes problems such as nutritional problems such as excess protein and lack of sugar and lipid.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of further earnest research on the nattokinase-containing food (crude product), the present inventor has achieved an intake of about 5 to 10 times that of a commercially available food for preventing thrombosis. Based on the knowledge that can be treated, the present invention has been completed.
That is, the antidiabetic agent of the present invention is characterized by containing nattokinase as an active ingredient.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[I] Diabetes medicine
(1) Active ingredient
(A) Nattokinase
The nattokinase used as a therapeutic agent for diabetes according to the present invention can be produced by various methods. In particular, a culture obtained by cultivating Bacillus natto using soybean as a medium using an ultrafiltration membrane or the like. It is preferable to use a nattokinase-containing material (crude product) or a purified product thereof comprising a solid component obtained by separating and solidifying the solid content and drying.
[0008]
(A) Nattokinase-containing product (crude product: nattokinase compound) In the nattokinase-containing product (crude product) obtained by separating the solid content from the natto fungus culture obtained by culturing natto using the soybeans as a medium, The main component contains about 12 mg of nattokinase per 100 g, and in addition to the nattokinase, enzymes such as amylase, protease, ribose, glutamic acid polypeptide, fructose polymer fructan, etc. is there.
Specifically, the amount of nattokinase accumulated in the culture of Bacillus natto varies depending on the cells used, the type of culture medium, the culture conditions, and the like, but usually 10 to 20 mg / 100 g in the culture. It is a vacuum-dried powder contained at a ratio of
[0009]
(B) Nattokinase refined product (nattokinase fraction)
Since the nattokinase-containing product (crude product) contains only about 12 mg of nattokinase per 100 g, it has been purified to a high purity, for example, 100 times or more, preferably 200 to 1,000 times. Specifically, it can be a purified nattokinase product (nattokinase fraction) purified to a concentration of 20 to 100% by weight.
Purification method
As a method of purifying the purified nattokinase purified product (nattokinase fraction), it can be carried out in the same manner as the usual method for purifying enzymes. In particular, the nattokinase-containing product is dissolved in a Tris-HCl buffer. It is preferably purified by being adsorbed on an ion exchange resin to separate impurities and then eluted again with a Tris-HCl buffer.
[0010]
(C) Property
As the physicochemical properties of the nattokinase, the molecular weight is 24,000 to 40,000, preferably 30,000 to 36,000 (257 amino acid residues), and the isoelectric point is preferably 8.6 ± 0.3 ( svensson column method), which is stable to heating up to 60 ° C. in a basic aqueous solution of pH 6-12.
[0011]
(2) Intake
The dosage as a therapeutic drug for diabetes in the present invention varies depending on the degree of symptoms, the age, weight, treatment period, etc. of the patient, and the exact amount is determined by a doctor. In general, the above dose of nattokinase is usually 0.3 to 3.0 mg, preferably 0.4 to 2.0 mg, particularly preferably 0.5 to 1.0 mg once a day or Divide into several doses.
In the case of using the above crude product containing nattokinase (nattokinase compound), it is 2.5 to 25 g, preferably 2.8 to 20 g, particularly preferably 2.8 to 20 g, per day for an adult in terms of the dose of the culture. Administer 3.0-18g in one or several divided doses.
Moreover, when using the said nattokinase refined product (nattokinase fraction), it is 12.5 to 125 mg per day per day for adults, preferably 14 to 100 mg, particularly preferably 15 to 15 times per day, in terms of the dose of the cultured product. Administer 80 mg in one or several divided doses.
If the amount is too small, the effect of treating diabetes according to the present invention is reduced. On the other hand, if the amount is too large, side effects such as excessive reduction in blood coagulation ability tend to occur.
[0012]
(3) Drug form
The agent for treating diabetes of the present invention is orally administered, and no effect can be found even if this agent is administered into blood.
Therefore, as a form of the drug for treating diabetes of the present invention, the culture is used alone or as a tablet, pill, powder, powder, granule, syrup, liquid, suspension, emulsion, capsule, etc. It is common to administer to a patient orally.
The form of these drugs for treating diabetes is appropriately selected by a doctor according to the age, sex, constitution, symptom, treatment time, etc. of the patient, but may be formulated in foods described later.
[0013]
(4) Additive
When the antidiabetic agent in the present invention is a solid preparation such as a tablet, pill, powder, powder, granule or the like, the culture is treated with an appropriate additive such as lactose, sucrose, mannitol according to a conventional method. Corn starch, synthetic or natural gum, excipients such as crystalline cellulose, starch, cellulose derivatives, gum arabic, gelatin, polyvinylpyrrolidone and other binders, carboxymethylcellulose calcium, carboxymethylcellulose sodium, starch, Manufactured by appropriately mixing with disintegrants such as corn starch and sodium alginate, lubricants such as talc, magnesium stearate and sodium stearate, fillers or diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate, calcium phosphate and sodium phosphate be able to.
In addition, tablets and the like may be coated with sugar coating, gelatin, enteric coating, film coating, etc. using an appropriate coating base as necessary.
[0014]
(5) Formulation in food
As described above, the nattokinase-containing material may be mixed as it is or dissolved in water and contained in foods and beverages that can be eaten normally.
[0015]
[II] Manufacture of nattokinase
(1) Culture of natto bacteria
The agent for treating diabetes of the present invention contains nattokinase obtained as an active ingredient by separating a solid component from a culture obtained by culturing natto using soybean as a culture medium and concentrating and drying the solid component.
[0016]
(A) Bacteria
As a Bacillus natto used for obtaining a therapeutic agent for diabetes containing the nattokinase of the present invention as an active ingredient, in consideration of safety, production amount of nattokinase, etc., a known Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) known Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) Bacillus subtilis natto) is used.
Although it does not restrict | limit especially as Bacillus natto, Takahashi bacillus (Yuzo Takahashi laboratory, Yamagata), Fungus Naruse (Naruse fermentation chemical laboratory, Tokyo), Miyagino bacillus (Miyagino natto factory, Sendai) Commercially available natto bacteria such as Asahi bacteria (Asahi Kogyo Co., Ltd., Tokyo), Nitto bacteria (Nitto Yakuhin Kogyo Co., Ltd., Kyoto), Meguro (Meguro Laboratories, Osaka); and Yunnan SL-001 Examples include bacteria.
In addition, Yunnan SL-001 bacteria was internationally deposited with the accession number FERM BP-6713 at the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry on May 7, 1999.
[0017]
(B) Preparation of medium
As a medium used in culture of Bacillus natto, a medium similar to a known medium used for culturing Bacillus natto is generally used.
Specifically, for example, okara, soybeans, soybean soup produced as a by-product during production of miso or natto, tofu cake produced as a by-product during production of tofu or fried soybeans, soybean meal produced as a by-product during oil production using soybean as a raw material, Materials that can be fermented by Bacillus natto, such as soybean seed coat, which is a by-product, may be used.
Therefore, it can be prepared by mixing various culture components as appropriate, or a commercially available medium can be used as it is, or the following carbon source, nitrogen source, inorganic salt and other nutrients can be added to the commercially available medium. A medium appropriately added as an auxiliary component may be used.
At this time, the medium may be either a solid or liquid medium, but is preferably a liquid medium from the viewpoint of productivity, and is appropriately selected depending on the purpose of use, and contains nutrients that can be assimilated by the microorganism to be used. As long as it is a medium, either a synthetic medium or a natural medium may be used.
[0018]
(A) Carbon source
The carbon source that can be used for culture of Bacillus natto in the present invention is not particularly limited as long as it varies depending on the species used and the strain used grows well and can efficiently produce nattokinase.
Specifically, for example, starch or its composition fraction, roasted dextrin, modified starch, starch derivative, physical treatment starch, α-starch, soluble starch, amylose, amylopectin, malto-oligosaccharide, cyclodextrin, pullulan, corn starch, Mention may be made of potato starch, sweet potato starch and carbohydrates such as dextrin, glycerin, sorbitol, wort and glucose.
Among these carbon sources, glucose and starch are preferably used from the viewpoint of production of nattokinase. These carbon sources can be used alone or in the form of a mixture of two or more.
[0019]
(B) Nitrogen source
The nitrogen source that can be used in the culture of Bacillus natto according to the present invention also varies depending on the species used, and is not particularly limited as long as the strain used grows well and can efficiently produce nattokinase.
Specifically, for example, meat extract, malt extract, peptone, soybean-derived polypeptone (for example, polypeptone-S), yeast extract, taste liquid (soy protein acid hydrolyzate), soybean powder, milk casein, casamino acid, Examples thereof include organic nitrogen compounds such as various amino acids and corn steep liquor, ammonium salts such as ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate, and ammonium chloride, nitrates such as sodium nitrate, and inorganic nitrogen compounds such as urea.
Among these nitrogen sources, soybean-derived polypeptone (for example, polypeptone-S) and soybean powder can be preferably used from the viewpoint of production of nattokinase. These nitrogen sources can also be used alone or in the form of a mixture of two or more.
[0020]
(C) Inorganic salt
The inorganic salt that can be used for cultivation of Bacillus natto according to the present invention is also not particularly limited as long as it varies depending on the species used and the strain used can grow well and produce nattokinase.
Specifically, for example, one or more selected from phosphates, hydrochlorides, sulfates, acetates and the like such as magnesium, manganese, calcium, sodium, potassium, copper, iron and zinc are used. You can also.
[0021]
(B) Culture conditions
In the present invention, Bacillus natto is cultured in the same manner as a conventionally known method, and the culture conditions at that time are appropriately selected according to the strain to be used, the composition of the medium and the culture method, and the strain to be used grows. It is not particularly limited as long as nattokinase can be efficiently produced.
The culture temperature is usually 20 to 45 ° C., preferably 37 to 42 ° C., and the pH of the medium suitable for the culture is usually 6.0 to 9.5, preferably 7.0 to 8.5. It is.
[0022]
(2) Separation of Bacillus natto
The solid components of the culture of Bacillus natto cultured by the method of the present invention are collected by a known method such as filtration, ultrafiltration or centrifugation, and the filtrate is concentrated.
[0023]
(3) Drying
And it can obtain as a powder by drying this by well-known methods, such as freeze-drying, air drying, and vacuum heat drying.
The obtained powder can be ingested as a nattokinase-containing substance (crude product: nattokinase compound) as it is as a therapeutic agent for diabetes.
[0024]
(4) Fine product
The powdered nattokinase-containing product (crude product: nattokinase compound) can be further purified to obtain a highly purified nattokinase purified product (nattokinase fraction).
Specifically, powdered nattokinase-containing material (crude product: nattokinase compound) is dissolved in Tris-HCl buffer, fractionated with 25% by weight ammonium sulfate, centrifuged, and the precipitate was removed. After removal, the liquid is adsorbed on an ion exchange resin, and the supernatant is removed, followed by elution with a Tris-HCl buffer to obtain a purified nattokinase purified product (nattokinase of about 200 to 1,000 times). (Fraction).
Further, it can be further purified to obtain a further purified nattokinase purified product.
[0025]
[III] Constituents of dried natto culture filtrate
(1) Nattokinase
The filtrate dried product of Bacillus natto culture obtained by culturing Bacillus natto using the soybean as a medium contains nattokinase as a main component.
Specifically, the amount of nattokinase accumulated in the filtrate dried product of the culture of Bacillus natto varies depending on the cells used, the type of culture medium, the culture conditions, and the like, but usually 10 to 200 mg / 100 g. It is a vacuum heat-dried microbial cell.
[0026]
(2) Other ingredients
In addition to the nattokinase, 0.002 to 0.005% by weight of an enzyme such as amylase, protease, or ribose, 0.5 to 1.5% by weight of a polypeptide of glutamic acid, or fructose A polymer fructan is contained in an amount of 0.5 to 1.5% by weight.
[0027]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples and comparative examples.
[I] Evaluation method
What was obtained by the Example and the comparative example was evaluated by the evaluation method shown below.
(1) Experimental animals and breeding conditions
Seven-week-old male KK-Ay mice (type II diabetes model) and STZ-treated mice (type I diabetes model) were purchased from Japan SLC Co., Ltd., SPF animal experiment facility at room temperature 22 ± 2 ° C, 12 hours light / dark cycle Reared in Feed (Nippon Claire Co., Ltd., trade name: CE-2) and water were used as free intake and subjected to the experiment after one week of preliminary breeding.
[0028]
(2) Effects on KK-Ay mice and STZ-treated mice
After the preliminary breeding, mice having a blood glucose level of 200 mg / dl or more at the time of fasting for 3 hours were used in the experiment. These mice were divided into two groups so that the average blood glucose levels were equal, nattokinase compound (crude product) was dissolved in water, and 1 mg / kg · day was orally administered continuously for 21 days.
Water was administered to the control group. The blood glucose level was measured once a week in a fasted state for 3 hours by collecting blood from an ophthalmic varices. On the last day of the experiment, 3 hours after administration, the blood glucose level was measured, and then the mouse was laparotomized in anesthesiology, and heart blood was collected.
After removing the testicular epithelial lipid, it was stored in liquid nitrogen.
The administration was fasted from 11:00 am to 12:00 am, and after 3 hours, blood was collected and blood glucose level was measured.
[0029]
(3) Sugar tolerance test
After fasting a mouse that had been continuously administered nattokinase fraction (200-fold purified product) for 3 weeks for 18 hours, the nattokinase fraction (200-fold purified product) was dissolved in water and administered orally at 1 mg / kg · day. After 30 minutes, a glucose solution (2 g / kg) was orally administered, and blood glucose levels were measured 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes later.
[0030]
(4) Insulin tolerance test
It was performed according to the above-described method by the glucose tolerance test, and insulin (0.5 U / kg) was administered intraperitoneally instead of administration of the glucose solution.
[0031]
(5) Measurement of blood glucose level and serum lipid
The blood glucose level is measured using a small blood glucose meter Glutest Ace (GT-1640) manufactured by Sanwa Chemical Laboratory, and the serum insulin level is measured by a one-step enzyme immunoassay (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). (Granzyme insulin EIA test).
For blood triglyceride (TG), total cholesterol (T-CHO), free fatty acid (FFA), low specific gravity riboprotein (LDL) and high density riboprotein (HDL), measurement was commissioned to Mitsubishi Chemical BSC. .
[0032]
(6) RT-PCR
Total RNA was extracted from 100 mg of adipose tissue extracted from mice using TRIZOL reagent. Using 5 μg of total RNA extracted from each organ, cDNA is converted to cDNA using T-primed first stand kit, and expression level based on β-Actin using a primer pair that specifically amplifies each factor by RT-PCR method It was investigated.
[0033]
[II] Examples and comparative examples
[Preparation of Nattokinase]
(1) Culture of Bacillus natto colonies
After adding natto (Takahashi) to pure water and stirring, add a small amount (inoculate) to a plate medium prepared in a petri dish using a standard agar medium (Nissui), Culture at 37 ° C. for 24 hours to obtain Bacillus natto colonies on the plate medium.
[0034]
(2) Preparation of culture solution
On the other hand, 200 ml of a liquid medium consisting of 1 g of glucose as a raw material and 4 g of powdered soy protein (Nisshin Cosmo Foods Co., Ltd., trade name: Solpy NY) was prepared in an Erlenmeyer flask having an internal volume of 500 ml, and then using an autoclave Hold the flask at 120 ° C for 30 minutes to sterilize the Erlenmeyer flask.
The powdered soy protein is purified from soybean. As a raw material, soybean powder obtained by pulverizing soybean may be used.
Thereafter, from the Bacillus natto colonies cultivated on the plate medium, Bacillus natto is collected once with a platinum loop having a diameter of a platinum wire ring of 2 mm, and the collected Bacillus natto is inoculated into the liquid medium in the Erlenmeyer flask.
Next, the Erlenmeyer flask in which the liquid medium inoculated with Bacillus natto is housed is rotated and shaken for two days without being sealed while being kept at 40 ° C., and the liquid medium in the Erlenmeyer flask is cultured.
[0035]
(3) Culture
Also, 20 liters of liquid medium consisting of 100 g of glucose, 400 g of powdered soy protein, and soluble starch (SF-400 manufactured by Shikishima Starch Co., Ltd.) was prepared in a jar fermenter having an internal volume of 30 liters, and these were sterilized. Prepare things.
In addition, 200 ml of the Bacillus natto culture solution cultured in the Erlenmeyer flask is added to the liquid medium in the jar fermenter, and cultured while being kept stirring for 2 days while bubbling in a state heated to 42 ° C.
Three similar ones are made to obtain about 50 liters of soy protein culture.
[0036]
(4) Separation of Bacillus natto
Next, after removing natto and impurities from the obtained soybean protein culture solution by centrifugation, 1 mol of ammonium sulfate is added. By the addition of ammonium sulfate, proteins containing proteinaceous polymer compounds such as various enzymes dispersed in the fermentation broth are made hydrophobic and easily aggregated.
Further, insoluble matters are newly formed by addition of ammonium sulfate, and these insoluble matters are filtered through glass fiber filter paper.
[0037]
(5) Collection
Next, a hydrophobic chromatography resin (trade name: Butyrute Yopal 650M, manufactured by Tosoh Corp.) equilibrated with 1 molar ammonium sulfate solution was immersed in the filtrate obtained by filtering insoluble matter, and the resin was hydrophobized. The polymer compound is aggregated (attached).
[0038]
(6) Condensed
Next, the top of the resin is immersed in a 0.1 molar aqueous ammonium hydrogen carbonate solution to elute the polymer compound adhering to the resin, thereby obtaining 40 liters of a concentrated culture solution in which the soybean protein culture solution is concentrated.
[0039]
(7) Ultrafiltration
Next, the preb scale M.I. W. The low molecular weight material is separated by ultrafiltration using a 10,000 ultrafiltration membrane, and 40 liters of the concentrated culture solution is concentrated to 10 liters.
By ultrafiltration, 10 liters of pure water is added to the concentrate concentrated by the ultrafiltration membrane to make 20 liters, and again by the ultrafiltration described above, low-molecular substances are separated and again 10 liters. The operation of concentrating until it becomes 3 times is repeated to obtain a soy protein fermented product solution from which most low-molecular substances have been removed from the concentrated culture solution obtained by concentrating the soy protein culture solution.
[0040]
Ultrafiltration
Since the ultrafiltration is generally performed to separate fine particles such as colloidal particles from the dispersion medium, the ultrafiltration membrane used for the ultrafiltration is a collodion membrane or formalin attached to a porous plate of cloth or unglazed ceramic. Gelatin film, silicic acid film, cellophane film, etc. hardened in step 1 are used, and colloidal solution is filtered through these films under pressure.
In order to adjust the size of the membrane, in the case of collodion, the concentration of alcohol and ether in the mixed solvent, adjustment of drying conditions, etc., in the case of cellophane, adjustment of the degree of swelling when immersed in an aqueous salt solution, or filtration of the collodion solution through the membrane However, it can be performed by depositing collodion on the membrane.
[0041]
What is separated by filtration
The main components of the odor unique to natto as filtered by ultrafiltration are dimethylpyrazine (molecular weight 108.14), trimethylpyrazine (molecular weight 122.17), tetramethylpyrazine (molecular weight 126.20), 2 -Low molecular weight compounds such as methylbutyric acid (molecular weight 102.13), isovaleric acid (molecular weight 102.13), and ammonia (molecular weight 17.03).
Vitamin K contained in natto₂Is a hydrocarbon compound having a molecular weight of 649. On the other hand, proteins such as nattokinase are high molecular compounds having a molecular weight of tens of thousands or more.
Therefore, by removing low molecular weight substances by ultrafiltration as described above, the odor components and vitamin K specific to natto are extracted from the soy protein culture solution.₂Such a low molecular substance is almost removed.
Vitamin K contained in natto₂Has a problem of suppressing the effect of the antagonist “warfarin” (medicine) used for heart diseases such as myocardial infarction.
However, according to this embodiment, vitamin K₂Since this is removed, this problem can be solved.
[0042]
(8) Drying
Finally, by adding 2 kilograms of lactose as an excipient to the soy protein fermented product solution from which low molecular weight substances have been removed by the ultrafiltration, freeze-dried soy protein fermented powder (processed food) of about 2.1 kg. Is obtained.
[0043]
(9) Odor test
Two subjects who were not good at eating natto checked whether or not the soy protein fermented powder according to the present embodiment had an odor, and neither of the subjects felt a natto odor.
[0044]
(10) Fine product
10 g of the above powdered nattokinase-containing material (crude product: nattokinase compound) is dissolved in 500 ml of 30 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), and 166 ml of 25 wt% saturated ammonium sulfate is added and stirred for 15 minutes. The mixture was allowed to stand for 15 minutes, centrifuged at 11,000 rpm for 30 minutes, fractionated to remove the precipitate, and then the liquid was added to an ion exchange resin (“Butyl Toyopearl” manufactured by Tosoh Corporation) 50 ml ( 30 mmol of Tris-HCl buffer solution, 25 wt% ammonium sulfate, pH 9.0) and stirred for 2 hours, adsorbed on the ion exchange resin, centrifuged again at 3000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed. After removal, wash with 30 mM Tris-HCl buffer, 25 wt% saturated ammonium sulfate, pH 9.0 and spin again Performed 3000 rpm, centrifuged for 5 minutes, the after supernatant was removed, Tris-HCl buffer 30 mM, was prepared purified nattokinase fraction (200-fold purified product) by eluting with pH 9.0.
[0045]
[Diabetes treatment effect]
Example 1 and Comparative Example 1
As a result of oral administration of the above nattokinase compound (crude product) to STZ-treated mice (type I diabetes model) at an intake of 200 mg / kg, 400 mg / kg and 600 mg / kg for 21 consecutive days, As shown in FIG. 1, blood glucose concentration decreased in a dose-dependent manner with nattokinase compound (crude product).
However, total cholesterol (T-CHO) and triglyceride (TG) in the blood greatly increased as shown in Table 1.
[0046]
[Table 1]

[0047]
From these results, it can be understood that nattokinase compound (crude product) has an effect of lowering blood glucose level in type I diabetes, but a phenomenon that blood lipids are increased accordingly.
In addition, the above nattokinase compound (crude product) was prepared at a concentration of 400 mg / kg, and gene expression of GLUT4, HSD-1, PPARγ, and insulin receptor in the liver, fat, and muscle was examined by RT-PCR. Gene expression in the liver was unchanged. In the adipose tissue, HSD-1 expression was almost the same except that it was decreased by administration of nattokinase compound (crude product). Furthermore, in muscle, the expression of PPARγ decreased and the insulin receptor also showed a decreasing trend.
[0048]
Example 2 and Comparative Example 2
As a result of oral administration of nattokinase compound (crude product) to KK-Ay mice (type II diabetes model) at 200 mg / kg and 600 mg / kg per day for 21 consecutive days, as shown in Table 2. , Blood glucose concentration decreased.
Furthermore, total cholesterol (T-CHO) and triglyceride (TG) in the blood decreased as shown in Table 2.
However, although there was a slight difference in weight gain, no difference was observed at the end of administration.
[0049]
[Table 2]

[0050]
From these results, it can be understood that nattokinase compound (crude product) has an effect of lowering blood glucose level in type II diabetes and can also reduce blood lipids unlike in type I diabetes.
[0051]
Example 3 and Comparative Example 3
The nattokinase fraction (200-fold purified product) was orally administered to hyperglycemic (around 250 mg / dl) KK-Ay mice (type II diabetes model) at an intake of 1 mg / kg per day for 21 consecutive days. As a result, an increase in blood glucose concentration could be suppressed. However, no difference from the control group in weight gain could be seen.
In addition, there was no significant difference in food intake during the administration period, but the liver weight was significantly less in the administration group.
[0052]
[Table 3]

[0053]
Example 4 and Comparative Example 4
The nattokinase fraction (200-fold purified product) was orally administered to KK-Ay mice (type II diabetes model) continuously for 21 days, a glucose tolerance test was performed, and blood glucose concentration was measured. The result is shown in FIG.
From the results of FIG. 1, it can be understood that a significant blood glucose suppression action is observed 30 minutes after the start of sugar loading, and the effect continues until 120 minutes.
[0054]
Example 5 and Comparative Example 5
The nattokinase fraction (200-fold purified product) was orally administered to KK-Ay mice (type II diabetes model) for 21 consecutive days, and then an insulin solution was administered intraperitoneally after fasting to conduct an insulin tolerance test. Medium glucose concentration was measured. The result is shown in FIG.
From the results of FIG. 2, it can be understood that the blood glucose suppression effect is also seen 180 minutes after the start of sugar loading.
[0055]
Example 6 and Comparative Example 6
The nattokinase fraction (200-fold purified product) was orally administered to KK-Ay mice (type II diabetes model) for 21 consecutive days, and the insulin and lipid metabolism in the blood were compared with the control group. Although there was no difference, the total cholesterol level (T-CHO) was significantly higher, and the difference was due to HDL (high density riboprotein) cholesterol.
On the other hand, triglyceride (TG) was significantly low, and no significant difference was observed in free fatty acid (FFA).
[0056]
[Table 4]

[0057]
Example 7
Gene expression in adipose tissue (cold testicular epithelium) isolated from KK-Ay mice (type II diabetes model) was examined by RT-PCR.
UCP-1 (type 1 mitochondrial uncoupling protein) was not expressed with or without administration of the nattokinase fraction (200-fold purified product), but UCP-2 (type 2 mitochondrial uncoupling protein) was originally expressed. Decreased.
β₃-Adrenoceptor may have increased expression in 2 out of 3 animals. In addition, expression of glucose transporter (GLUT4) was not observed, and expression of type 1 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11βHSD-1) was observed.
[0058]
Example 8
[subject]
Six men from normal hyperglycemia with fasting blood glucose of 100-125 mg / dl who were not borderline diabetic and were not administered hypoglycemic agents were selected.
[Administration of nattokinase compound (crude product)]
6 g per day (2 g after each meal) was administered daily for 2 weeks. Excessive alcohol consumption and natto intake were prohibited during the administration period.
[0059]
[Blood glucose measurement]
Fasting blood sugar and high starch diet (Udon, cooked rice, protein 13.1 g, lipid 2.5 g, carbohydrate 139.8 g, energy 634 kcal) before and after intake of nattokinase compound (crude product) within 15 minutes The blood glucose level was measured 30 minutes after the whole amount was consumed. The measurement was performed with an autoglycemic measuring device (“Dexter Z” manufactured by Bayer Medical Co., Ltd.) using an enzyme electrode method.
The results are shown in Table 5.
[0060]
[Table 5]

[0061]
From the results of Table 5, it can be understood that both the fasting blood glucose level and the postprandial blood glucose level decrease due to the intake of nattokinase compound (crude product) and can exert an effect on improvement of diabetes.
[0062]
【The invention's effect】
Since such a therapeutic agent for diabetes of the present invention can be administered orally to reduce blood glucose concentration or blood total cholesterol (T-CHO) or triglyceride (TG), diabetes It can be used as a therapeutic agent.
Moreover, since it is a food extracted from natto, it has no side effects and is extremely safe.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of a glucose tolerance test in Examples of the present invention.
FIG. 2 shows the results of an insulin tolerance test in the examples of the present invention.

Claims

A therapeutic agent for diabetes comprising nattokinase as an active ingredient.

The therapeutic agent for diabetes according to claim 1, wherein nattokinase is taken in an amount of 0.3 to 3 mg per day for an adult.

The therapeutic agent for diabetes according to claim 1 or 2, wherein nattokinase is orally administered.

The diabetes therapeutic agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the diabetes is type I diabetes and type II diabetes.

The therapeutic agent for diabetes according to any one of claims 1 to 4, wherein the nattokinase is a nattokinase-containing product obtained by culturing natto bacteria.

The antidiabetic agent according to claim 5, wherein the intake of the nattokinase-containing material is 2.5 to 25 g per day for an adult.

The therapeutic agent for diabetes according to any one of claims 1 to 4, wherein the nattokinase is obtained by adsorbing a nattokinase-containing product obtained by culturing natto bacteria onto an ion exchange resin and separating and purifying it.

The therapeutic agent for diabetes according to claim 7, wherein the intake of purified nattokinase is 12.5 to 125 mg per day for an adult.

Separation and purification of nattokinase is a product in which nattokinase-containing material is dissolved in Tris-HCl buffer, adsorbed on an ion exchange resin, separated from impurities, and then eluted again with Tris-HCl buffer. The therapeutic agent for diabetes according to claim 7.