JP2004105118A - 新規なラクトコッカス属乳酸菌及びその培養物 - Google Patents
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Abstract
【課題】高度の耐熱性及び幅広いpH安定性を有し、食品変敗菌や口腔内感染症の原因菌にも有効で、食品の品質を向上させるほか、オーラルケア商品にも利用され、食品の変敗菌やオーラルケア商品に有効な新規な微生物から得られた抗菌物質を提供する。
【解決手段】寄託番号、FERM P−18996号として寄託されているラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規微生物及びこの微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物であり、この抗菌物質は39及び35のアミノ酸からなる2種のポリペプチドである。
【選択図】 なし
【解決手段】寄託番号、FERM P−18996号として寄託されているラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規微生物及びこの微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物であり、この抗菌物質は39及び35のアミノ酸からなる2種のポリペプチドである。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明が属する技術分野】
本発明は乳酸菌、ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規な微生物、及びこれが産生する食品の変性、腐敗防止或いはオーラルケアに効果を有する抗菌物質を含有する培養物に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、食品の保存方法としては添加物、熱、放射線、高圧処理などが行われている。近時、天然物志向、すなわち、より天然に近いもの或いは各々の食品素材本来の食感、味、香りに近い食品を求める消費者が増加している。その結果、食品の低塩化、低温殺菌化が進み、食品の保存が困難な状況となってきていることから、安全で品質に影響せず、しかも安価な食品保存方法の開発が望まれている。
【0003】
一方、乳酸飲料、醤油、味噌、酒、漬物などの伝統的醗酵食品は保存性が高いことが知られているが、その原因の一つとして乳酸菌の働きが注目されている。近年の研究より乳酸菌はpHを低下させて雑菌の繁殖を抑制する他、ある種の乳酸菌は抗菌性ペプチドを産生することが判明している。この抗菌物質或いはこの種の乳酸菌の培養物を食品に添加することにより、温和な条件で食品の変成を防止することができる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
抗菌性ペプチドはヒトの消化酵素で分解されることから、安全な抗菌物質として期待されているが、その反面、耐熱性・pH安定性に問題があり、現実的に実用的な抗菌性ペプチドは少ない。
本発明者らは、耐熱性、pH安定性の高い抗菌性ペプチドを開発すべく、野菜等から抗菌性ペプチド産生能を有する乳酸菌の探索を行った。その結果、新規な抗菌性ペプチドを産生する乳酸菌を分離することに成功した。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明の構成は、寄託番号、FERM P−18996号として寄託されているラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規微生物及びこの微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物であり、この抗菌物質は40弱のアミノ酸からなる2種のポリペプチドである。
【0006】
本発明にかかる菌が産生する抗菌性ペプチドはそのアミノ酸配列から新規物質であることが判明した。本物質は高度の耐熱性を有し、広いpH領域で有効であり、特異な抗菌スペクトルを有する。食品に使用する場合には主に培養物を用いる。ここで、培養物とは培養液、培養液上清及び培養液精製物、更にこれを粉末化したものを包含する。培養物は抗菌物質を含有し、一定の力価を有する製品にして提供することができる。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明の新規微生物はFERM P−18996号として寄託してあり、標準条件で培養して単球菌であり、グラム陽性、カタラーゼ陰性、非運動性、非胞子形成性であり、L−乳酸対糖収率90%以上に達する。
本発明で得られる抗菌物質は100℃、10分間以上加熱しても抗菌活性が低下せず、耐熱性を有し、pH2〜11の広い範囲で安定である。
【0008】
【実施例】
実施例1(菌の諸性質)
菌の同定を行うため16S リボゾームDNAの塩基配列の相同性解析及び糖の醗酵性(バイオメリックス社:AP150CHLキット使用)を確認した。その結果、ラクトコッカス・ラクティスと99%一致したことなどから本菌はラクトコッカス・ラクティスに属することが判明した。しかし、16S リボゾームDNAの相同性解析で100%の相同性を示さなかったことと、本菌が産生する特殊な抗菌物質がこれまでに知られているラクトコッカス・ラクティスが産生する抗菌物質(ナイシン、ラクティシン481、ラクトストレプシン、ラクトコッシンG等)といずれも異なる性質を示すことから、本菌株は公知の菌とは異なる新規な菌株であると考えられる。
【0009】
本菌の糖資化性について表1、表2に示した。資化性がある糖は+、資化性がない糖は−とした。
【0010】
【表1】
【0011】
【表2】
【0012】
実施例2(抗菌スペクトル)
(1)培養物の調製
本発明微生物をMRS broth(OXOID社製)に接種して30℃・18時間培養し、10000 rpm、20分間遠心分離を行い、菌体を除去した後の上清を抗菌性の培養物として使用した。
(2)試験方法及び結果
MRS agar(OXOID社製)の平板培地上に供試菌株を1%接種したLactobacili agar(Difco社製)を分注して重層した平板培地を作成した。上記培養液上清を2の1乗、2乗、3乗と順次2の乗数倍希釈して10μlずつ重層平板培地上に滴下し、供試菌株の最適温度にて培養を行い、生育阻止円が見られたものを抗菌活性ありと判定した。試験結果を表3に示した。抗菌活性があるものを+、ないものを−とした。
【0013】
【表3】
【0014】
表3より、本発明培養物は、食品の変敗や口腔内感染症の原因であるストレプトコッカス属に効果があるほか、ラクトコッカス・ラクティスに特異的に有効であることから心内膜炎やウシ乳房炎の治療に利用できることが判明した。
また、抗菌物質ナイシンを産生するラクトコッカス、ラクティスにも抗菌活性を示したことから、交叉免疫がないことが判明した。このことより、本発明抗菌物質はナイシンとは異なる作用機作をもつことが考えられる。
【0015】
実施例3(耐熱性試験)
培養液上清を加熱処理し、抗菌活性の有無について確認を行った。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス サブスピーシーズ ラクティスATCC 19435T を用い、実施例2の試験方法に準じて上清の活性について検討した。その結果、100℃、10分間加熱した上清は未加熱の上清と同等の抗菌活性を示した。この事実より、本発明の抗菌物質は熱に対して非常に安定であることが判明した。
【0016】
実施例4(pH安定性試験)
培養液上清を塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてpH2〜11に調整し、抗菌活性の有無について確認を行った。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス サブスピーシーズ ラクティスATCC 19435T を用い、実施例2の試験方法に準じて上清の活性について検討した。その結果、pH2から11の領域で抗菌活性を発現した。この結果より、本発明培養物は幅広いpH範囲で安定して使用できることが判明した。
【0017】
実施例5(酵素分解性試験)
培養液の上清に下記要領で酵素を添加し、30℃及び37℃で6時間反応させた後、抗菌活性の有無を確認した。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス サブスピーシーズ ラクティスATCC 19435T を用い、実施例2の抗菌スペクトルの試験方法に準じて上清の活性について検討した。α−キモトリプシン及びトリプシンは30℃で試験を行い、フィチン、アクチナーゼE、パパイン及びプロティナーゼKは37℃で試験を行った。その結果すべての酵素処理試料が活性を失っていた。酵素を添加しないコントロールは30℃、37℃共に活性であった。この事実より、本発明培養物中の抗菌物質は蛋白質或いはペプチドの構造を有するものと判断することができた。
【0018】
実施例6(抗菌ペプチドの配列決定)
抗菌物質の同定のために培養上清から抗菌ペプチドの精製を行った。すなわち、培養液上清に対し3倍量のアセトンを加えて蛋白質を変成・沈殿させた後、真空乾燥によりアセトンを除去し沈殿物を得た。抗菌物質を含むタンパク沈殿物をリン酸緩衝液で希釈した後、陽イオン交換樹脂(SP−Sephalose)に通して粗精製を行い、更に高活性の画分を逆相HPLCにかけたところ、2つの活性画分が得られた。
そこで2つの活性画分の抗菌物質をα、βとし、各々の分子量をMALDI−TOF MS( Perseptive Biosystems 社製)にて測定したところ、抗菌物質αは4,261Da 、抗菌物質βは4,019Da であることが判明した。更にエドマン分解により各抗菌物質のアミノ酸配列を確認したところ抗菌物質αは配列表の配列番号1、抗菌物質βは配列表の配列番号2に示す通りの配列が決定した。
【0019】
2種類の抗菌物質α、βについて抗菌ペプチドの相同性を検討した結果、ラクトコッカス・ラクティス LMG 2081が産生するラクトコッシンG−α、β(Jon Nissen−Meyer et al:J.Bacteriol. ,Vol. 174, P.5686−5692, Sept. 1992)及びエンテロコッカス・ファエカリス BFE 1071が産生するエンテロシン1071A、1071B(E.Ballia et al.:Appl.Environ.Microbiol.,Vol.66, p.1298−1304, Apr. 2000) に近いものの、本抗菌ペプチドはいずれの分子量、アミノ酸配列とも一致せず、新規物質であることが判明した。本抗菌物質と既知物質の相違部分を表4及び表5に示した。
【0020】
【表4】
【0021】
【表5】
【0022】
【発明の効果】
本発明の新規抗菌ペプチドは、高度の耐熱性及び幅広いpH安定性を有し、食品変敗菌や口腔内感染症の原因菌にも抗菌効果を示す。このことより、本発明菌産生物は食品の品質を向上させるほか、オーラルケア商品にも利用される。また、乳酸菌由来の抗菌ペプチドの多くは他の抗菌成分との併用による強力な日もち向上剤の開発も期待できる。
更に心内膜炎やウシ乳房炎などの治療にも有効であり、医薬品としても利用できる。本発明の抗菌ペプチドは乳酸菌由来であることから安全性が高く、現代の消費者ニーズに適合した食品、オーラルケア商品、医薬品の提供を可能にする。
【配列表】
【発明が属する技術分野】
本発明は乳酸菌、ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規な微生物、及びこれが産生する食品の変性、腐敗防止或いはオーラルケアに効果を有する抗菌物質を含有する培養物に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、食品の保存方法としては添加物、熱、放射線、高圧処理などが行われている。近時、天然物志向、すなわち、より天然に近いもの或いは各々の食品素材本来の食感、味、香りに近い食品を求める消費者が増加している。その結果、食品の低塩化、低温殺菌化が進み、食品の保存が困難な状況となってきていることから、安全で品質に影響せず、しかも安価な食品保存方法の開発が望まれている。
【0003】
一方、乳酸飲料、醤油、味噌、酒、漬物などの伝統的醗酵食品は保存性が高いことが知られているが、その原因の一つとして乳酸菌の働きが注目されている。近年の研究より乳酸菌はpHを低下させて雑菌の繁殖を抑制する他、ある種の乳酸菌は抗菌性ペプチドを産生することが判明している。この抗菌物質或いはこの種の乳酸菌の培養物を食品に添加することにより、温和な条件で食品の変成を防止することができる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
抗菌性ペプチドはヒトの消化酵素で分解されることから、安全な抗菌物質として期待されているが、その反面、耐熱性・pH安定性に問題があり、現実的に実用的な抗菌性ペプチドは少ない。
本発明者らは、耐熱性、pH安定性の高い抗菌性ペプチドを開発すべく、野菜等から抗菌性ペプチド産生能を有する乳酸菌の探索を行った。その結果、新規な抗菌性ペプチドを産生する乳酸菌を分離することに成功した。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明の構成は、寄託番号、FERM P−18996号として寄託されているラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規微生物及びこの微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物であり、この抗菌物質は40弱のアミノ酸からなる2種のポリペプチドである。
【0006】
本発明にかかる菌が産生する抗菌性ペプチドはそのアミノ酸配列から新規物質であることが判明した。本物質は高度の耐熱性を有し、広いpH領域で有効であり、特異な抗菌スペクトルを有する。食品に使用する場合には主に培養物を用いる。ここで、培養物とは培養液、培養液上清及び培養液精製物、更にこれを粉末化したものを包含する。培養物は抗菌物質を含有し、一定の力価を有する製品にして提供することができる。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明の新規微生物はFERM P−18996号として寄託してあり、標準条件で培養して単球菌であり、グラム陽性、カタラーゼ陰性、非運動性、非胞子形成性であり、L−乳酸対糖収率90%以上に達する。
本発明で得られる抗菌物質は100℃、10分間以上加熱しても抗菌活性が低下せず、耐熱性を有し、pH2〜11の広い範囲で安定である。
【0008】
【実施例】
実施例1(菌の諸性質)
菌の同定を行うため16S リボゾームDNAの塩基配列の相同性解析及び糖の醗酵性(バイオメリックス社:AP150CHLキット使用)を確認した。その結果、ラクトコッカス・ラクティスと99%一致したことなどから本菌はラクトコッカス・ラクティスに属することが判明した。しかし、16S リボゾームDNAの相同性解析で100%の相同性を示さなかったことと、本菌が産生する特殊な抗菌物質がこれまでに知られているラクトコッカス・ラクティスが産生する抗菌物質(ナイシン、ラクティシン481、ラクトストレプシン、ラクトコッシンG等)といずれも異なる性質を示すことから、本菌株は公知の菌とは異なる新規な菌株であると考えられる。
【0009】
本菌の糖資化性について表1、表2に示した。資化性がある糖は+、資化性がない糖は−とした。
【0010】
【表1】
【0011】
【表2】
【0012】
実施例2(抗菌スペクトル)
(1)培養物の調製
本発明微生物をMRS broth(OXOID社製)に接種して30℃・18時間培養し、10000 rpm、20分間遠心分離を行い、菌体を除去した後の上清を抗菌性の培養物として使用した。
(2)試験方法及び結果
MRS agar(OXOID社製)の平板培地上に供試菌株を1%接種したLactobacili agar(Difco社製)を分注して重層した平板培地を作成した。上記培養液上清を2の1乗、2乗、3乗と順次2の乗数倍希釈して10μlずつ重層平板培地上に滴下し、供試菌株の最適温度にて培養を行い、生育阻止円が見られたものを抗菌活性ありと判定した。試験結果を表3に示した。抗菌活性があるものを+、ないものを−とした。
【0013】
【表3】
【0014】
表3より、本発明培養物は、食品の変敗や口腔内感染症の原因であるストレプトコッカス属に効果があるほか、ラクトコッカス・ラクティスに特異的に有効であることから心内膜炎やウシ乳房炎の治療に利用できることが判明した。
また、抗菌物質ナイシンを産生するラクトコッカス、ラクティスにも抗菌活性を示したことから、交叉免疫がないことが判明した。このことより、本発明抗菌物質はナイシンとは異なる作用機作をもつことが考えられる。
【0015】
実施例3(耐熱性試験)
培養液上清を加熱処理し、抗菌活性の有無について確認を行った。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス サブスピーシーズ ラクティスATCC 19435T を用い、実施例2の試験方法に準じて上清の活性について検討した。その結果、100℃、10分間加熱した上清は未加熱の上清と同等の抗菌活性を示した。この事実より、本発明の抗菌物質は熱に対して非常に安定であることが判明した。
【0016】
実施例4(pH安定性試験)
培養液上清を塩酸及び水酸化ナトリウムを用いてpH2〜11に調整し、抗菌活性の有無について確認を行った。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス サブスピーシーズ ラクティスATCC 19435T を用い、実施例2の試験方法に準じて上清の活性について検討した。その結果、pH2から11の領域で抗菌活性を発現した。この結果より、本発明培養物は幅広いpH範囲で安定して使用できることが判明した。
【0017】
実施例5(酵素分解性試験)
培養液の上清に下記要領で酵素を添加し、30℃及び37℃で6時間反応させた後、抗菌活性の有無を確認した。
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス サブスピーシーズ ラクティスATCC 19435T を用い、実施例2の抗菌スペクトルの試験方法に準じて上清の活性について検討した。α−キモトリプシン及びトリプシンは30℃で試験を行い、フィチン、アクチナーゼE、パパイン及びプロティナーゼKは37℃で試験を行った。その結果すべての酵素処理試料が活性を失っていた。酵素を添加しないコントロールは30℃、37℃共に活性であった。この事実より、本発明培養物中の抗菌物質は蛋白質或いはペプチドの構造を有するものと判断することができた。
【0018】
実施例6(抗菌ペプチドの配列決定)
抗菌物質の同定のために培養上清から抗菌ペプチドの精製を行った。すなわち、培養液上清に対し3倍量のアセトンを加えて蛋白質を変成・沈殿させた後、真空乾燥によりアセトンを除去し沈殿物を得た。抗菌物質を含むタンパク沈殿物をリン酸緩衝液で希釈した後、陽イオン交換樹脂(SP−Sephalose)に通して粗精製を行い、更に高活性の画分を逆相HPLCにかけたところ、2つの活性画分が得られた。
そこで2つの活性画分の抗菌物質をα、βとし、各々の分子量をMALDI−TOF MS( Perseptive Biosystems 社製)にて測定したところ、抗菌物質αは4,261Da 、抗菌物質βは4,019Da であることが判明した。更にエドマン分解により各抗菌物質のアミノ酸配列を確認したところ抗菌物質αは配列表の配列番号1、抗菌物質βは配列表の配列番号2に示す通りの配列が決定した。
【0019】
2種類の抗菌物質α、βについて抗菌ペプチドの相同性を検討した結果、ラクトコッカス・ラクティス LMG 2081が産生するラクトコッシンG−α、β(Jon Nissen−Meyer et al:J.Bacteriol. ,Vol. 174, P.5686−5692, Sept. 1992)及びエンテロコッカス・ファエカリス BFE 1071が産生するエンテロシン1071A、1071B(E.Ballia et al.:Appl.Environ.Microbiol.,Vol.66, p.1298−1304, Apr. 2000) に近いものの、本抗菌ペプチドはいずれの分子量、アミノ酸配列とも一致せず、新規物質であることが判明した。本抗菌物質と既知物質の相違部分を表4及び表5に示した。
【0020】
【表4】
【0021】
【表5】
【0022】
【発明の効果】
本発明の新規抗菌ペプチドは、高度の耐熱性及び幅広いpH安定性を有し、食品変敗菌や口腔内感染症の原因菌にも抗菌効果を示す。このことより、本発明菌産生物は食品の品質を向上させるほか、オーラルケア商品にも利用される。また、乳酸菌由来の抗菌ペプチドの多くは他の抗菌成分との併用による強力な日もち向上剤の開発も期待できる。
更に心内膜炎やウシ乳房炎などの治療にも有効であり、医薬品としても利用できる。本発明の抗菌ペプチドは乳酸菌由来であることから安全性が高く、現代の消費者ニーズに適合した食品、オーラルケア商品、医薬品の提供を可能にする。
【配列表】
Claims (4)
- 寄託番号、FERM P−18996号として寄託されているラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規微生物。
- 寄託番号、FERM P−18996号として寄託されているラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)に属する新規微生物が産生する抗菌物質及び抗菌物質を含む培養物。
- 抗菌物質が2種のペプチドからなり、その1方のアミノ酸配列が、配列表の配列番号1であることを特徴とする請求項2記載の培養物。
- 抗菌物質が2種のペプチドからなり、その他方のアミノ酸配列が、配列表の配列番号2であることを特徴とする請求項2記載の培養物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002273979A JP2004105118A (ja) | 2002-09-19 | 2002-09-19 | 新規なラクトコッカス属乳酸菌及びその培養物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002273979A JP2004105118A (ja) | 2002-09-19 | 2002-09-19 | 新規なラクトコッカス属乳酸菌及びその培養物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004105118A true JP2004105118A (ja) | 2004-04-08 |
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ID=32270596
Family Applications (1)
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JP2002273979A Pending JP2004105118A (ja) | 2002-09-19 | 2002-09-19 | 新規なラクトコッカス属乳酸菌及びその培養物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2004105118A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7699825B2 (en) | 2006-07-24 | 2010-04-20 | The Procter & Gamble Company | Flexible absorbent article with improved body fit |
US8735646B2 (en) | 2004-03-31 | 2014-05-27 | The Procter & Gamble Company | Diaper with improved body fit |
-
2002
- 2002-09-19 JP JP2002273979A patent/JP2004105118A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8735646B2 (en) | 2004-03-31 | 2014-05-27 | The Procter & Gamble Company | Diaper with improved body fit |
US8231593B2 (en) | 2005-07-26 | 2012-07-31 | The Procter & Gamble Company | Flexible absorbent article with improved body fit |
US7699825B2 (en) | 2006-07-24 | 2010-04-20 | The Procter & Gamble Company | Flexible absorbent article with improved body fit |
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